BR112012010707B1 - Anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, composição, e, uso do anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo - Google Patents

Abstract

COMPOSTO DE LIGAÇÃO, ÁCIDO NUCLEICO ISOLADO, VETOR DE EXPRESSÃO, CÉLULA HOSPEDEIRA, MÉTODOS PARA PRODUZIR UM POLIPEPTÍDEO E PARA SUPRIMIR UMA RESPOSTA IMUNE EM UM PACIENTE HUMANO, COMPOSIÇÃO, E, USO DO COMPOSTO DE LIGAÇÃO. A invenção diz respeito a compostos de ligação que ligam-se especificamente ao TSLP humano, bem como seus usos, por exemplo, no tratamento de distúrbios inflamatórios e resposta inflamatória alérgica.

Description

[001] Este pedido reivindica o benefício do pedido de patente condicional U. S. n° 61/297,008; depositado em 21 de janeiro de 2010 e pedido de patente condicional U. S. n° 61/258,051; depositado em 4 de novembro de 2009; cada um dos quais é incorporado neste por referência em sua totalidade.

CAMPO DA INVENÇÃO

[002] A presente invenção diz respeito, em geral, a um anticorpo específico de linfopoietina estromal tímica (TSLP) e usos destes, particularmente em distúrbios inflamatórios e inflamatório alérgico.

FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO

[003] O TSLP é uma citocina imune que induz as respostas de célula CD4+ T mediado por célula dendrítica com um DC de fenotipo pró- alogênico ativado por TSLP desempenha um papel crucial na indução e manutenção de Th2 inflamatório alérgico e respostas de mastócitos pela produção de citocinas pró-alergênicas, quimiocinas e moléculas coestuimuladoras que direcionam as células T simples T para tornarem-se células Th2, produzindo mediadores críticos de IL-4, IL-5 e IL-13 de inflamação alérgica. Super-expressão de TSLP em Dermatite Atópica (AtD), Síndrome de Netherton e Asma indicam um papel crucial desta citocina na patogênese destas doenças inflamatórias alérgicas. Isto é suportado por modelos animais em que a super-expressão de modelos animais em que a super-expressão transgênica de TSLP na pele ou pulmão bem como a remoção pelo alvejamento genético de reguladores negativos de TSLP resulta em doenças inflamatórias alérgicas que assemelha-se aproximamente à dermatite atópica humana ou asma. A presente invenção fornece anticorpos TSLP projetados e usos destes para o tratamento de distúrbios inflamatórios e, particularmente os distúrbios inflamatórios alérgicos, incluindo asma e dermatite atópica.

[004] A presente invenção evita os problemas de desamidação potential de anticorpos da técnica anterior. A desamidação de resíduos de Asn (N) é uma degradação comum de proteínas e isto pode impactar significantemente a estrutura e a função da proteína. Nos anticorpos, o Asn (N) localizado nos CDRs pode sofrer desamidação rapidamente e pode resultar em mudanças nas interações de anticorpo-antígeno e, portanto, representa um assunto sério durante o desenvolvimento de terapêuticos com base em anticorpo. Ver, por exemplo, Vlaska et al., Analytical Biochemistry 392:145-154 (2009). Desta maneira, é importante evitar estes problemas de desamidação potenciais em anticorpos que são pretendidos estarem desenvolvidos para o uso humano. Além disso, é importante evitar estes problemas sem mudar qualquer uma das características importantes (tal como afinidade de ligação) do anticorpo.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

[005] A presente invenção fornece um composto de ligação que liga especificamente o TSLP humano, que compreende pelo menos uma região variável de cadeia pesada de anticorpo ou um fragmento de ligação de TSLP deste, a dita região variável de cadeia pesada que compreende SEQ ID N°: 2

[006] A presente invenção também fornece um composto de ligação que liga especificamente o TSLP humano que compreende pelo menos uma região variável de cadeia pesada de anticorpo ou um fragmento de ligação de TSLP deste, a dita região variável de cadeia pesada que compreende pelo menos SEQ ID N°: 2 e SEQ ID N°: 1 ou SEQ ID N°: 2 e SEQ ID N°: 3.

[007] A presente invenção também fornece um composto de ligação que liga especificamente o TSLP humano que compreende pelo menos uma região variável de cadeia pesada de anticorpo ou um fragmento de ligação de TSLP deste, a dita região variável de cadeia pesada que compreende SEQ ID N°: 1, SEQ ID N°: 2 e SEQ ID N°: 3.

[008] Os compostos de ligação da invenção ainda podem compreender uma região variável de cadeia leve de anticorpo ou um fragmento de ligação de TSLP deste. Em uma forma de realização, a região variável de cadeia leve ou um fragmento de ligação de TSLP deste, compreende pelo menos uma sequência selecionada do grupo que consiste da SEQ ID N°: 4, 5 e 6. Em uma outra forma de realização, a região variável de cadeia leve ou seu fragmento de ligação de TSLP, compreende pelo menos duas sequências selecionadas do grupo que consiste da SEQ ID N°: 4, 5 e 6. Em outras formas de realização, a região variável de cadeia leve ou seu fragmento de ligação de TSLP, tem as três sequências apresentadas na SEQ ID N°: 4, 5 e 6.

[009] Em algumas formas de realização dos compostos de ligação descritos acima, todos ou substancialmente todos os remanescentes da região variável de cadeia pesada são todos ou substancialmente todos de uma região de Ig humano e todos ou substancialmente todos os remanescentes da região variável de cadeia leve são todos ou substancialmente todos de uma região de Ig humano. Nas formas de realização preferidas, o remanescente da região variável de cadeia pesada é a sequência de aminoácido de cadeia pesada humana e o remanescente da região variável de cadeia leve é sequência de aminoácido da cadeia leve humana.

[0010] A presente invenção também fornece um composto de ligação que liga especificamente o TSLP humano, que compreende: uma região variável de cadeia pesada que compreende uma sequência selecionada do grupo que consiste da: (i) SEQ ID N°: 7; (ii) SEQ ID N°: 7 ou uma variante que compreende até 3 resíduos de aminoácido modificados e (iii) uma sequência tendo pelo menos 97 % de homologia à SEQ ID N°: 7. Em uma forma de realização, a região variável de cadeia pesada compreende as sequências mostradas na SEQ ID N°: 7. Em algumas formas de realização, o composto de ligação da invenção ainda compreende a região variável de cadeia leve. Em uma forma de realização a região variável de cadeia leve compreende uma sequência selecionada do grupo que consiste da: (i) SEQ ID N°: 8; (ii) SEQ ID N°: 8 ou uma variante que compreende até 3 resíduos de aminoácido modificados e (iii) uma sequência tendo pelo menos 97 % de homologia à SEQ ID N°: 8. Em uma forma de realização, a região variável de cadeia leve compreende as sequências mostradas na SEQ ID N°: 8.

[0011] Em uma forma de realização preferida, o composto de ligação compreende uma região variável de cadeia pesada que compreende as sequências mostradas na SEQ ID N°: 7 e a região variável de cadeia leve que compreende as sequências mostradas na SEQ ID N°: 8.

[0012] Em algumas formas de realização, os compostos de ligação da invenção também compreendem uma região constante de cadeia pesada e/ou uma região constante de cadeia leve. Em algumas formas de realização, a região constante de cadeia pesada compreende uma região constante de cadeia pesada humana yl, y2, y3 ou y4ou uma variante desta. Em outras formas de realização, a região constante de cadeia leve compreende uma região constante de cadeia leve humana lambda ou capa.

[0013] Em algumas formas de realização, o composto de ligação da invenção é um anticorpo ou um fragmento de ligação de antígeno destes. Em várias formas de realização, o anticorpo ou fragmento deste da presente invenção é policlonal, monoclonal, quimérico, cino-izado, humanizado ou totalmente humano. Em uma forma de realização preferida, o anticorpo é um anticorpo humanizado ou um fragmento deste.

[0014] A presente invenção também considera que o fragmento de ligação é um fragmento de anticorpo selecionado do grupo que consiste de Fab, Fab’, Fab’-SH, Fv, scFv, F(ab’)2 e um diacorpo. A presente invenção também considera que o composto de ligação é um nanocorpo, um avímero ou um aptímero.

[0015] Em uma forma de realização, o composto de ligação é um anticorpo que compreende uma cadeia pesada que compreende SEQ ID N°: 11. Em uma forma de realização, o composto de ligação compreende uma cadeia pesada que compreende SEQ ID N°: 11 e uma cadeia leve que compreende SEQ ID N°: 12.

[0016] Em uma outra forma de realização preferida, o composto de ligação da invenção liga o TSLP humano e cino.

[0017] Em uma forma de realização, o composto de ligação da invenção pode ser expressado a partir do vetor de expressão depositado sob Depósito ATCC N° PTA-10482.

[0018] Em uma outra forma de realização, o composto de ligação da invenção compreende uma cadeia pesada e uma cadeia leve que podem ser expressadas a partir do vetor de expressão depositado sob Depósito ATCC N° PTA-10482. Em uma outra forma de realização, o composto de ligação da invenção compreende uma região variável de cadeia pesada e a região variável de cadeia leve que podem ser expressadas a partir do vetor de expressão depositado sob Depósito ATCC N° PTA-10482. Em uma outra forma de realização, o composto de ligação da invenção compreende as regiões de CDR- H1, CDR-H2 e CDR-H3 e as de CDR-L1, CDR-L2 e CDR-L3 do anticorpo expressado pelo vetor de expressão depositado sob Depósito ATCC N° PTA- 10482

[0019] Em uma outra forma de realização, o composto de ligação da invenção compreende uma cadeia pesada que pode ser expressada a partir do vetor de expressão depositado sob Depósito ATCC N° PTA- 10482. Em uma outra forma de realização, o composto de ligação da invenção compreende uma região variável de cadeia pesada que pode ser expressada a partir do vetor de expressão depositado sob Depósito ATCC N° PTA-10482. Em uma outra forma de realização, o composto de ligação da invenção compreende as regiões de CDR-H1, CDR-H2 e CDR-H3 do anticorpo expressado pelo vetor de expressão depositado sob Depósito ATCC N° PTA- 10482.

[0020] A presente invenção também fornece ácidos nucleicos isolados que codificam o composto de ligação da invenção. Em uma forma de realização, a invenção compreende um ácido nucleico que codifica uma região variável de cadeia pesada de um composto de ligação (por exemplo, um anticorpo ou fragmento de anticorpo) da invenção. Em uma outra forma de realização, a invenção compreende um ácido nucleico que codifica um composto de ligação que compreende uma região variável de cadeia pesada, em que a dita região variável de cadeia pesada compreende SEQ ID N°: 1, SEQ ID N°: 2 e SEQ ID N°: 3. Em uma outra forma de realização, a invenção compreende um ácido nucleico que codifica SEQ ID N°: 7. Em uma outra forma de realização, a invenção compreende um ácido nucleico que codifica SEQ ID N°: 2. Em uma forma de realização, a invenção compreende um ácido nucleico que codifica a região variável de cadeia pesada codificada pelo vetor de expressão depositado sob Depósito ATCC N° PTA-10482. A invenção também fornece vetores de expressão que compreendem os ácidos nucleicos da invenção operacionalmente ligados a sequências de controle que são reconhecidas por uma célula hospedeira quando a célula hospedeira é transfectada com o vetor. Em uma forma de realização, a invenção fornece o vetor de expressão depositado sob Depósito ATCC N° PTA-10482. Também são fornecidas células hospedeiras que compreendem estes vetores de expressão e métodos de usar estes vetores de expressão para a produção de polipeptídeos. Em uma forma de realização, a célula hospedeira compreende o vetor de expressão depositado sob Depósito ATCC N° PTA-10482. Os métodos de produzir polipeptídeo compreendem as etapas de: cultivar a célula hospedeira de meio em cultura sob as condições em que a sequência de ácido nucleico é expressada, desse modo para a produção de polipeptídeos que compreendem as regiões variáveis de cadeia leve e pesada e recuperação dos polipeptídeos da célula hospedeira ou meio de cultura. Em uma forma de realização, a invenção compreende um método de produzir um polipeptídeo que compreende as etapas de: cultivar uma célula hospedeira que compreende o vetor de expressão depositado sob Depósito ATCC N° PTA-10482 no meio de cultura sob condições em que o vetor é expressado, desse modo produzindo polipeptídeos que compreendem as regiões variáveis de cadeia leve e pesada e recuperação dos polipeptídeos da célula hospedeira ou meio de cultura.

[0021] A presente invenção abrange um método de suprimir uma resposta imune em um paciente humano que compreende administrar a um paciente em necessidade de um composto de ligação de acordo com a invenção que liga especificamente o TSLP humano, em uma quantidade eficaz para bloquear a atividade biológica de TSLP. A presente invenção também considera a administração de um agente imunossupressor ou anti- inflamatório adicional. Em uma forma de realização preferida, a resposta imune é asma. Em uma outra forma de realização preferida, a resposta imune é inflamação alérgica. Em uma outra forma de realização preferida, a inflamação alérgica é rinossinusite alérgica, asma alérgica, conjuntivite alérgica ou dermatite atópica. Em uma outra forma de realização preferida, a resposta imune é fibrose, doença intestinal inflamatória ou linfoma de Hodgkin. Em uma outra forma de realização preferida, o composto de ligação é administrado em combinação com outro agente imunomodulador.

[0022] O composto de ligação da presente invenção pode estar em uma composição que compreende o composto de ligação da invenção (por exemplo, um anticorpo ou um fragmento deste) em combinação de um carreador ou diluente farmaceuticamente aceitável. Em uma forma de realização adicional, a composição ainda compreende um agente imunossupressor ou anti-inflamatório.

[0023] Em várias formas de realização, a invenção diz respeito a medicamentos que compreendem o composto de ligação (por exemplo, um anticorpo ou fragmento deste) da presente invenção. Por exemplo, a invenção abrange o uso de um composto de ligação que liga especificamente o TSLP humano para a preparação de um medicamento para a supressão de uma resposta imune. A presente invenção abrange o uso de um composto de ligação que liga especificamente o TSLP humano (por exemplo, qualquer um dos compostos de ligação de acordo com a invenção) para a preparação de um medicamento para o tratamento da asma. A presente invenção abrange o uso de um composto de ligação que liga especificamente o TSLP humano para a preparação de um medicamento para o tratamento de um distúrbio inflamatório. Em uma forma de realização, o distúrbio inflamatório é um distúrbio inflamatório alérgico. Em uma forma de realização, o distúrbio inflamatório alérgico é rinossinusite alérgica, asma alérgica, conjuntivite alérgica ou dermatite alérgica. Em uma forma de realização preferida, o distúrbio inflamatório alérgico é asma alérgico. Em uma outra forma de realização preferida, o distúrbio inflamatório alérgico é dermatite alérgica. Por exemplo, os anticorpos e o fragmento da presente invenção podem ser usados para o tratamento de seres humanos.

BREVE DESCRIÇÃO DA FIGURA

[0024] Figura 1. Alinhamento da SEQ ID N°: 11 do presente pedido contra a SEQ ID N°: 14 do WO2008/076321.

DESCRIÇÃO DETALHADA

[0025] Como usado aqui, incluindo as reivindicações anexas, as formas singulares de palavras tais como “um”, “uma” e “o”, incluem suas referências plurais correspondentes a não ser que o contexto dite claramente o contrário. Todas as referências citadas aqui são incorporadas por referência, até certo ponto, como se cada publicação individual, pedido de patente ou patente, foi específica e individualmente indicado ser incorporado por referência.

I. Definições

[0026] “Ativação”, “estímulo” e “tratamento”, quando aplica- se a células ou a receptores podem ter o mesmo significado, por exemplo, ativação, estímulo ou tratamento de uma célula ou receptor com um ligando, a não ser indicado de outra maneira pelo contexto ou explicitamente. “Ligando” abrange os ligandos naturais ou sintéticos, por exemplo, citocinas, variantes de citocina, análogos, muteinas e composições de ligação derivados de anticorpo. “Ligando” também abrange moléculas pequenas, por exemplo, miméticos de peptina de citocinas e peptídeos de anticorpos. “Ativação” pode referir-se à ativação celular quando regulador por mecanismos internos bem como pelos fatores externos ou ambientais. “Resposta”, por exemplo, de uma célula, tecido, órgão ou organismo, abrange uma mudança em comportamento bioquímico ou fisiológico, por exemplo, concentração, densidade, adesão ou migração dentro de um compartimento biológico, taxa de expressão genética ou estado da diferenciação, quando a mudança está correlacionada com a ativação, estímulo ou tratamento ou com mecanismos internos ou com mecanismos internos tal como programação genética.

[0027] A “atividade” de uma molécula pode descrever ou referir-se à ligação da molécula a um ligando ou a um receptor, à atividade catalítica; à capacidade de estimular a expressão genética ou à sinalização genética, diferenciação ou maturação; à atividade antigênica, à modulação de atividade de outras moléculas e outros. “Atividade” também pode significar a atividade específica, por exemplo, [atividade catalítica]/[mg de proteína] ou [atividade imunológica]/[mg de proteína], concentração em um compartimento biológico ou semelhante.

[0028] “Administração” e “tratamento”, quando aplica-se a um animal, humano, indivíduo experimental, célula, tecido, órgão ou fluido biológico, refere-se ao contato de um agente farmacêutico, terapêutico, diagnóstico exógeno ou composição ao animal, ser humano, indivíduo, célula, tecido, órgão ou fluido biológico. “Administração” e “tratamento” pode referir-se, por exemplo, à pesquisa terapêutica, farmacocinética, diagnóstica, pesquisa e métodos experimentais. O tratamento de uma célula abrange o contato de um reagente à célula, bem como contato de um reagente a um fluido, onde o fluido está em contato com a célula. “Administração” e “tratamento” também significa tratamentos in vitro e ex vivo, por exemplo, de uma célula, por um reagente, diagnóstico, composição de ligação ou por uma outra célula. “Tratamento”, quando aplica-se a um ser humano, veterinária ou indivíduo de pesquisa, refere-se ao tratamento terapêutico, medidas profiláticas ou preventivas, para aplicações de pesquisa e de diagnóstico.

[0029] “Composto de ligação” refere-se a uma molécula que compreende uma ou mais sequências de aminoácido que ligam-se especificamente ao TSLP humano. Em uma forma de realização preferida, o composto de ligação é um anticorpo, preferivelmente um anticorpo isolado. Em uma outra forma de realização preferida, o composto de ligação compreende um fragmento de ligação de antígeno de um anticorpo.

[0030] “Composição de ligação” refere-se a um composto de ligação de TSLP em combinação com um estabilizante, excipiente, sal, tampão, solvente ou aditivo, capazes de ligar a um alvo.

[0031] O escopo da presente invenção também inclui complexos que compreendem qualquer anticorpo ou fragmento de ligação de antígeno deste da presente invenção complexado com o polipeptídeo TSLP ou um fragmento antigênico destes. Os complexos podem ser preparados pelo contato do anticorpo ou fragmento com o polipeptídeo TSLP ou fragmento de antígeno.

[0032] Como usado aqui, o termo “anticorpo” refere-se a qualquer forma de anticorpo ou fragmento deste que a atividade biológica desejada. Desta maneira, isto é usado no sentido mais amplo e especificamente abrange os anticorpos monoclonais (incluindo anticorpos monoclonais de comprimento total), anticorpos policlonais, anticorpos multiespecíficos (por exemplo, anticorpos biespecíficos) e fragmentos de anticorpo contanto que estes apresentam a atividade biológica desejada. “Anticorpo isolado” refere-se ao estado de purificação de um composto de ligação e em tal contexto significa que a molécula está substancialmente isenta de outras moléculas biológicas tais como ácidos nucleicos, proteínas, lipídeos, carboidratos ou outros materiais, tais como escombros celulares e meios de desenvolvimento. Em geral, o termo “isolado” não é pretendido para referir-se a uma ausência completa e tal material ou a uma ausência de água, tampões ou sais, a não ser que estes estejam presentes em quantidades que interferem substancialmente com o uso experimental ou terapêutico do composto de ligação como descrito aqui.

[0033] Um “fragmento Fab “ é compreendido de uma cadeia leve e o CH1 e as regiões variáveis de um cadeia pesada. A cadeia pesada de uma molécula Fab não pode formar uma ligação de bissulfeto com uma outra molécula de cadeia pesada.

[0034] Uma região “Fc” contém dois fragmentos de cadeia pesada que compreendem os domínios CH2 e CH3 de um anticorpo. Os dois fragmentos de cadeia pesada são mantidos juntos por duas ou mais ligações de bissulfeto e pelas integrações hidrofóbicas dos domínios CH3.

[0035] Um “fragmento Fab' “ contém uma cadeia leve e uma porção ou fragmento de uma cadeia pesada que contém o domínio de VH e o domínio CH1 e também a região entre os domínios CH1 e CH2, tal que uma ligação de bissulfeto intercadeia pode ser formada entre as duas cadeias pesadas de dois fragmentos Fab' para formar uma molécula F(ab')2.

[0036] Um “fragmento F(ab')2” contém duas cadeias leves e duas cadeias pesadas contendo uma porção da região constante entre os domínios CH1 e CH2, tal que uma ligação de bissulfeto intercadeia é formada entre as duas cadeias pesadas. Um fragmento F(ab')2, desta maneira, é composto de fragmentos Fab' que são mantidos juntos por uma ligação de bissulfeto entre as duas cadeias pesadas.

[0037] A “região Fv” compreende as regiões variáveis ato das cadeias leves quanto pesadas, mas precisa das regiões constantes.

[0038] Como usado aqui, o termo “fragmento de ligação de TSLP” ou “fragmento de ligação destes” abrange um fragmento ou um derivado de um anticorpo (ou uma outra substância de ligação) que ainda retém substancialmente sua atividade biolótica de inibir a atividade de TSLP. Portanto, o termo “fragmento de anticorpo” ou fragmento de ligação de TSLP refere-se a uma porção de um anticorpo de comprimento total, em geral, a ligação de antígeno ou sua região variável. Os exemplos de fragmentos de anticorpo incluem fragmentos de Fab, Fab', F(ab')2 e Fv; diacorpos; anticorpos lineares; moléculas de anticorpo de cadeia simples, por exemplo, sc-Fv; anticorpos de domínio e anticorpos multiespecíficos formados a partir de fragmentos de anticorpo. Tipicamente, um fragmento de ligação ou derivado retém pelo menos 10 % de sua atividade inibidora de TSLP. Preferivelmente, um fragmento de ligação ou derivado retém pelo menos 25 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 95 %, 99 % ou 100 % (ou mais) de sua atividade inibidora de TSLP, embora qualquer fragmento de ligação coma afinidade suficiente para exercer o efeito biológico desejado seja usado. Também é pretendido que o fragmento de ligação de TSLP pode incluir as substituições de aminoácido conservativo que não alteram substancialmente sua atividade biológica.

[0039] O termo “anticorpo monoclonal”, como usado aqui, refere-se a um anticorpo obtido a partir de uma população de anticorpos substancialmente homogêneos, isto é, os anticorpos individuais que compreendem a população são idênticos exceto para as mutações de ocorrência naturalmente possível que podem estar presentes em quantidades menores. Os anticorpos monoclonais são altamente específicos, sendo direcionados contra um epítopo antigênico simples. Em contraste, as preparações de anticorpo convencionais (policlonal) tipicamente incluem uma multitude de anticorpos direcionados contra (ou específicos para) epítopos diferentes. O modificador “monoclonal” indica o caráter do anticorpo como sendo obtido de uma população substancialmente homogênea de anticorpo e não deve ser construído como requerendo a produção do anticorpo por qualquer método particular. Por exemplo, os anticorpos monoclonais a serem usados de acordo com a presente invenção podem ser feitos pelo primeiro método de hibridoma descrito por Kohler et al., (1975) Nature 256: 495 ou pode ser feito pelos métodos de DNA recombinantes (ver, por exemplo, Patente U. S. N° 4,816,567). Os “anticorpos monoclonais” também podem ser isolados a partir das bibliotecas de anticorpo de fago usando-se as técnicas descritas em Clackson et al., (1991) Nature 352: 624-628 and Marks et al., (1991) J. Mol. Biol. 222: 581-597, por exemplo.

[0040] Os anticorpos monoclonais aqui, especificamente, incluem anticorpos “quiméricos” (imunoglobulinas) em que uma porção da cadeia pesada e/ou leve é idêntica ou homóloga a sequências correspondentes em anticorpos derivados de uma espécie particular ou que pertence a uma classe ou subclasse de anticorpo particular, enquanto o remanescente das cadeias é idêntico ou homólogo às sequências correspondentes em anticorpos derivados de uma outra espécie ou que pertence a uma outra classe ou subclasse de anticorpo, bem como os fragmentos de tais anticorpos, contanto que estes apresentam a atividade biológica desejada (Patente U. S. N° 4,816,567 e Morrison et al., (1984) Proc. Natl. Acad Sci. USA 81: 68516855).

[0041] Um “anticorpo de domínio” é um fragmento de imunoglobulina imunologicamente funcional contendo apenas a região variável de uma cadeia pesada ou a região variável de uma cadeia leve. Em alguns exemplos, duas ou mais regiões VH são covalentemente unido com um ligante de peptídeo para a criação de um anticorpo de domínio bivalente. As duas regiões VH de um anticorpo de domínio bivalente pode alvejar os mesmos antígenos ou diferentes.

[0042] Um “anticorpo bivalente” compreende dois locais de ligação de antígeno. Em alguns exemplos, os dois locais de ligação têm as mesmas especificidades de antígeno. Entretanto, os anticorpos bivalentes podem ser biespecíficos.

[0043] Como usado aqui, o termo anticorpo “Fv de cadeia simples” ou “scFv” refere-se a fragmentos de anticorpo que compreendem os domínios VH e VL de anticorpo, em que estes domínios estão presentes em uma cadeia de polipeptídeo simples. Em geral, o polipeptídeos Fv ainda compreende um ligante de polipeptídeo entre os domínios VH e VL que permitem que o sFv forme a estrutura desejada para a ligação de antígeno. Para uma revisão de sFv, ver Pluckthun (1994) THE PHARMACOLOGY OF MONOCLONAL ANTIBODIES, vol. 113, Rosenburg and Moore eds. Springer-Verlag, New York, pp. 269-315.

[0044] Os anticorpos monoclonais aqui, também incluem anticorpos de domínio simples camelizado. Ver, por exemplo, Muyldermans et al. (2001) Trends Biochem. Sci. 26:230; Reichmann et al. (1999) J. Immunol. Methods 231:25; WO 94/04678; WO 94/25591; Patente U. S. N° 6,005,079, que são incorporados aqui por referência em suas totalidades). Em uma forma de realização, a presente invenção fornece anticorpos de domínio simples que compreende dois domínios VH com modificações, tal que os anticorpos de domínio simples sejam formados.

[0045] Como usado aqui, o termo “diacorpos” refere-se a fragmentos de anticorpo pequenos com dois locais de ligação de antígenos, cujos fragmentos compreendem um domínio variável de cadeia pesada (VH) conectado a um domínio variável de cadeia leve (VL) na mesma cadeia de polipeptídeo (VH-VL ou VL-VH). Usando-se um ligante que é muito curto para permitir a formação de pares entre os dois domínios na mesma cadeia, os domínios são forçados a formar pares com os domínios complementares de uma outra cadeia e cria dois locais de ligação de antígeno. Os diacorpos são descritos mais totalmente em, por exemplo, EP 404,097; WO 93/11161 e Holliger et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6444-6448. Para uma revisão de variantes de anticorpo projetado, em geral, ver Holliger and Hudson (2005) Nat. Biotechnol. 23:1126-1136.

[0046] Como usado aqui, o termo “anticorpo humanizado” refere-se às formas de anticorpos que contêm sequências de anticorpos não humanos (por exemplo, murino) bem como anticorpos humanos. Tais anticorpos contém a sequência mínima derivada de imunoglobulina não humana. Em geral, o anticorpo humanizado compreenderá substancialmente todos de pelo menos um e tipicamente dois, domínios variáveis, em que todos ou substancialmente todos os arcos hipervariáveis correspondem àqueles de uma imunoglobulina não humana e todos ou substancialmente todas as regiões FR são aqueles de uma sequência de imunoglobulina. O anticorpo humanizado, opcionalmente, também compreenderá pelo menos uma porção de uma região constante de imunoglobulina (Fc), tipicamente aquele de uma imunoglobulina humana. O prefixo “h”, “hu” ou “hum” é adicionado às denominações de clone de anticorpo quando necessário para distinguir os anticorpos humanizados (por exemplo, “hu23B12”) de anticorpos de roedor parentais (por exemplo, rato 23B12 ou “r23B12”). As formas humanizadas de anticorpos de roedores em geral, compreenderão as mesmas sequência de CDR dos anticorpos de roedor parentais, embora certas substituições de aminoácido possam estar incluídas para aumentar a afinidade ou aumentar a estabilidade do anticorpo humanizado.

[0047] Os anticorpos da presente invenção também incluem anticorpos com regiões Fc modificadas (ou bloqueadas) para fornecer funções atuadoras. Ver, por exemplo, Patente U. S. N° 5,624,821; WO2003/086310; WO2005/120571; WO2006/0057702; Presta (2006) Adv. Drug Delivery Rev. 58:640-656. Tal modificação pode ser usada para intensificar ou suprimir várias reações do sistema imune, com efeitos benéficos possíveis no diagnóstico e terapia. As alterações da região Fc incluem mudanças de aminoácido (substituições, anulações e inserções), glicosilação ou desglicosilação e adição de Fc múltiplo. As mudanças ao Fc também pode alterar a vida média dos anticorpos m anticorpos terapêuticos e uma vida média mais longa deve resultar em dosagem menos frequente, com a conveniência aumentada concomitante e uso diminuído de material. Ver Presta (2005) J. Allergy Clin. Immunol.116:731 em 734-35.

[0048] O termo “anticorpo totalmente humano” refere-se a um anticorpo que compreende sequências de proteína de imunoglobulina humana apenas. Um anticorpo totalmente humano pode conter cadeias de carboidrato de murino se produzido em um camundongo, em uma célula de camundongo ou em um hibridoma derivado de uma célula de camundongo. Similarmente, “anticorpo de camundongo” refere-se a um anticorpo que compreende sequências de imunoglobulina de camundongo apenas.

[0049] Como usado aqui, o termo “região hipervariável” refere-se aos resíduos de aminoácido de um anticorpo que são responsáveis para a ligação de antígeno. A região hipervariável compreende resíduos de aminoácido de uma “região determinadora de complementaridade” ou “CDR” (por exemplo, resíduos 24-34 (CDRL1), 50-56 (CDRL2) e 89-97 (CDRL3) no domínio variável de cadeia leve e resíduos 31-35 (CDRH1), 50-65 (CDRH2) e 95-102 (CDRH3) no domínio variável de cadeia pesada; Kabat et al., (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md.) e/ou aqueles resíduos de um “arco hipervariável” (isto é, resíduos de 26-32 (L1), 50-52 (L2) e 91-96 (L3) no domínio variável de cadeia leve e 26-32 (H1), 53-55 (H2) e 96-101 (H3) no domínio variável de cadeia pesada; Chothia and Lesk, (1987) J. Mol. Biol. 196: 901-917). Como usado aqui, o termo “estrutura” ou resíduos de “FR” refere-se àqueles resíduos de domínio variável outros que não os resíduos de região hipervariável definidos aqui como resíduos de CDR. A numeração do resíduo acima, diz respeito ao sistema de numeração de Kabat e não corresponde necessariamente em detalhes à numeração de sequência na Listagem Sequência anexa.

[0050] “Ligação” refere-se a uma associação da composição de ligação com um alvo onde a associação resulta na redução no movimento Brownian normal da composição de ligação, nos casos onde a composição de ligação pode ser dissolvida ou colocada em suspensão na solução.

[0051] “Variantes conservativamente modificadas” ou “substituição conservativa” refere-se às substituições de aminoácidos que são conhecidas de habilidade nesta técnica e podem ser feitas, em geral, sem alterar a atividade biológica da molécula resultante. Aqueles de habilidade nesta técnica reconhecem que, em geral, as substituições de aminoácido simples em regiões não essenciais de um polipeptídeo não alteram substancialmente a atividade biológica (ver, por exemplo, Watson, et al., Molecular Biology of the Gene, The Benjamin/Cummings Pub. Co., p. 224 (4th Edition 1987)). Tais substituições exemplares são preferivelmente feitas de acordo com aqueles apresentados na Tabela 1 como segue: Tabela 1 Substituições de Aminoácido Conservativas Exemplares

[0052] “Quantidade eficaz” abrange uma quantidade suficiente para melhorar ou prevenir um sinal da condição médica. A quantidade eficaz também significa uma quantidade suficiente para permitir ou facilitar o diagnóstico. Uma quantidade eficaz para um paciente particular ou paciente veterinário pode variar dependendo de fatores, tais como a condição sendo tratada, a saúde total do paciente, a via de método e dose de administração e a gravidade de efeitos colaterais (ver, por exemplo, Patente U. S. N° 5,888,530 concedido a Netti, et al.). Uma quantidade eficaz pode ser a dose máxima ou protocolo de dosagem que evita os efeitos colaterais significantes ou efeitos tóxicos. O efeito resultará em uma melhora de uma medida diagnóstica ou parâmetro por pelo menos 5 %, usualmente por pelo menos 10 %, mais usualmente pelo menos 20 %, mais usualmente pelo menos 30 %, preferivelmente pelo menos 40 %, more preferivelmente pelo menos 50 %, mais preferivelmente pelo menos 60 %, idealmente pelo menos 70 %, mais idealmente pelo menos 80 %, e mais idealmente pelo menos 90 %, onde 100 % é definido como o marâmetro de diagnóstico mostrado por um paciente normal (ver, por exemplo, Maynard, et al. (1996) A Handbook of SOPs for Good Clinical Practice, Interpharm Press, Boca Raton, FL; Dent (2001) Good Laboratory and Good Clinical Practice, Urch Publ., London, UK).

[0053] Como usado aqui, o termo “molécula de ácido nucleico isolada” refere-se a uma molécula de ácido nucleico que é identificada e separada de pelo menos uma molécula de ácido nucleico contaminante com a qual esta está comumente associada na fonte natural do ácido nucleico do anticorpo. Uma molécula de ácido nucleico isolada é outra que não na forma ou ajuste em que esta é encontrada na natureza. As moléculas de ácido nucleico isoladas, portanto, são distinguidas da molécula de ácido nucleico como existe nas células naturais. Entretanto, uma molécula de ácido nucleico isolada inclui uma molécula de ácido nucleico contido nas células que expressam comumente os anticorpos onde, por exemplo, a molécula de ácido nucleico está em um local cromossômico diferente daquele das células naturais.

[0054] As “sequências de controle” de expressão refere-se às sequências de DNA necessárias para a expressão de uma sequência codificadora operacionalmente ligada em um organismo hospedeiro particular. As sequências de controle que são adequados para procariotas, por exemplo, incluem um promotor, opcionalmente uma sequência promotora e um local de ligação de ribossomo. As células eucarióticas são conhecidas utilizar os promotores, sinais de poliadenilação e intesificadores.

[0055] Um ácido nucleico está “operacionalmente ligado” quando este é colocado em uma relação funcional com uma outra sequência de ácido nucleico. Por exemplo, o DNA para uma pré-sequência ou líder secretor está operacionalmente ligado ao DNA para um polipeptídeo se este for expressado como uma pré-proteína que participa na secreção do polipeptídeo; um promotor ou intensificador está operacionalmente ligado a uma sequência codificadora se esta afetar a transcrição da sequência ou um local de ligação de ribossomo está operacionalmente ligado a uma sequência codificadora se este for posicionado a fim de facilitar a tradução. Em geral, “operacionalmente ligado” significa que as sequência de DNA sendo ligadas são contíguas e, no caso de um líder de secreção, contíguo e na fase de leitura. Entretanto, os intensificadores não devem ser contíguos. A ligação é realizada pela ligação em locais de restrição convenientes. Se tais locais não existem, os adaptadores ou ligantes de oligonucleotídeos sintéticos são usados de acordo com a prática convencional.

[0056] Como usado aqui, as expressões “célula”, “linha celular” e “cultura celular” são usados de maneira intercambeável e todas as tais denominações incluem progênie. Desta maneira, as palavras “transformantes” e “células transformadas” incluem a célula individual primária e culturas derivadas destes sem relação quanto ao número de transferências. Também é entendido que toda a progênie não pode ser precisamente idêntica no teor de DNA, devido às mutações deliberadas ou inadvertidamente. A progênie mutante que tem a mesma função ou atividade biológica como avaliado na célula originalmente transformada está incluída. Quando as denominações distintas são pretendidas, estará claro a partir do contexto.

[0057] Como usado aqui, a “reação de cadeia de polimerase” ou “PCR” refere-se a um procedimento ou técnica em que as quantidades exatas de um pedaço específico de ácido nucleico, RNA e/ou DNA, são amplificados como descrito em, por exemplo, Patente U. S. N° 4,683,195. Em geral, a informação de sequência das extremidades da região de interesse ou além das necessidades estarem disponíveis, tal que os iniciadores de nucleotídeo podem ser projetados; estes iniciadores serão idênticos ou similares na sequências para opor os filamentos do padrão a ser amplificado. Os nucleotídeos de terminal 5’ dos dois iniciadores podem coincidir com as extremidades do material amplificado. O PCR pode ser usado para amplificar as sequências de RNA específicos, sequência de DNA específicas do DNA genômico total e cDNA transcrito a partir do RNA celular total, sequências de bacteriofago ou plasmídeo, etc. Ver, em geral, Mullis et al. (1987) Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 51:263; Erlich, ed., (1989) PCR TECHNOLOGY (Stockton Press, N.Y.) Como usado aqui, o PCR é considerado ser um, mas não o único, exemplo de um método de reação de polimerase de ácido nucleico para amplificar uma amostra de teste de ácido nucleico que compreende o uso de um ácido nucleico conhecido como um iniciador e uma polimerase de ácido nucleico para amplificar ou gerar um pedaço específico de ácido nucleico.

[0058] Como usado aqui, o termo “sequência de linha germinativa” refere-se a uma sequência de DNA de imunoglobulina não redisposta sequencias. Qualquer fonte adequada de DNA de imunoglobulina não redisposta pode ser usada.

[0059] “Inibidores” são compostos que diminuem, bloqueiam, evitam, atrasam, ativam, inativam, dessensibilizam ou sub-regulam, por exemplo, um gene, proteína, ligando, receptor ou célula. Um inibidor também pode ser definido como uma composição que reduz, bloqueia ou inativa uma atividade de constituição. Um “antagonista” é um composto que opõe as ações de um agonista. Um antagonista evita, reduz, inibe ou neutraliza a atividade de um agonista. Um antagonista também pode evitar, inibir ou reduzir a atividade constitutiva de um alvo, por exemplo, um receptor alvo, mesmo onde não houver agonista identificado.

[0060] Para examinar a extensão da inibição, por exemplo, amostras ou ensaios que compreendem uma dada, por exemplo, proteína, gene, célula ou organismo, são tratados com um agente ativador ou inibidor potencial e são comparados para controlar as amostras sem o agente. As amostras de controle, isto é, não tratadas no agente, são denominadas um valor de atividade relativa de 100 %. A inibição é atingida quando o valor de atividade ao controle é de cerca de 90 % ou menos, tipicamente 85 % ou menos, mais tipicamente 80 % ou menos, mais tipicamente 75 % ou menos, em geral 70 % ou menos, mais em geral 65 % ou menos, mais em geral 60 % ou menos, tipicamente 55 % ou menos, usualmente 50 % ou menos, mais usualmente 45 % ou menos, mais usualmente 40 % ou menos, preferivelmente 35 % ou menos, mais preferivelmente 30 % ou menos, ainda mais preferivelmente 25 % ou menos e mais preferivelmente menos do que 25 %.

[0061] Os pontos finais em inibição podem ser monitorados como seguem. A inibição e resposta ao tratamento, por exemplo, de uma célula, fluido fisiológico, tecido, órgão e paciente animal ou humano, podem ser monitorados por um ponto final. O ponto final pode compreender uma quantidade pré-determinada ou porcentagem de, por exemplo, um indício de inflamação, oncogenicidade, ou desgranulação celular ou secreção, tal como a liberação de uma citocina, oxigênio tóxico, ou uma protease. O ponto final pode compreender, por exemplo, uma quantidade pré-determinada de fluxo de íon ou transporte; migração celular; adesão celular; proliferação celular; potencial para metastase; diferenciação celular; e mudança no fenotipo, por exemplo, mudança na expressão do gene relacionado a inflamação, apoptose, transformação, ciclo celular, ou metastase (ver, por exemplo, Knight (2000) Ann. Clin. Lab. Sci. 30:145-158; Hood and Cheresh (2002) Nature Rev. Cancer 2:91-100; Timme, et al. (2003) Curr. Drug Targets 4:251-261; Robbins and Itzkowitz (2002) Med. Clin. North Am. 86:1467-1495; Grady and Markowitz (2002) Annu. Rev. Genomics Hum. Genet. 3:101-128; Bauer, et al. (2001) Glia 36:235-243; Stanimirovic and Satoh (2000) Brain Pathol. 10:113-126).

[0062] Um ponto final de inibição é geralmente 75 % do controle ou menos, preferivelmente 50 % do controle ou menos, mais preferivelmente 25 % do controle ou menos e mais preferivelmente 10 % do controle ou menos. Geralmente, um ponto final de ativação é pelo menos 150 % de controle, preferivelmente pelo menos duas vezes o controle, mais preferivelmente pelo menos quatro vezes o controle e mais preferivelmente pelo menos 10 vezes o controle.

[0063] “Especificamente” ou “seletivamente” liga-se, quando referido a um ligando/receptor, anticorpo/antígeno, ou outros pares de ligação, indicando uma reação de ligação que é determinativa da presença da proteína, por exemplo, TSLP, em uma população heterogênea de proteínas e/ou outros biológicos. Deste modo, sob condições projetadas, um ligando/antígeno especificado liga-se a um receptor/anticorpo particular e não liga-se em uma quantidade significante em outras proteínas presentes na amostra.

[0064] O anticorpo, ou composição de ligação derivada do local de ligação de antígeno de um anticorpo, o método considerado liga-se a seu antígeno com uma afinidade que é pelo menos dez vezes maior, mais preferivelmente pelo menos 20 vezes maior e mais preferivelmente pelo menos 50 vezes maior do que a afinidade com antígenos não relacionados. Em uma forma de realização preferida o anticorpo terá uma afinidade que é maior do que cerca de 109 litros/mol, como determinado, por exemplo, pela análise Scatchard (Munsen, et al. (1980) Analyt. Biochem. 107:220-239).

[0065] Como usado aqui, o termo “distúrbio inflamatório” refere-se a qualquer doença ou distúrbio caracterizado pela inflamação local em um local do dano ou infecção e inclui, sem limitação, inflamação alérgica, doença autoimune e outros distúrbios caracterizados pelo acúmulo de célula imune indesejado em um local do tecido local.

[0066] Como usado aqui, o termo “agente imunomodulador” refere-se aos agentes naturais ou sintéticos que suprimem ou modulam uma resposta imune. A resposta imune pode ser uma resposta humoral ou celular. Os agentes imunomoduladores abrangem agentes imunossupressivos ou anti- inflamatórios.

[0067] Os “agentes imunossupressivos,” “medicamentos imunossupressivos,” ou “imunossupressantes” como usado aqui são os terapêuticos que são usados na terapia imunossupresiva para inibir ou evitar a atividade do sistema imune. Clinicalmente estes são para evitar a rejeição dos órgãos transplantados e tecidos (por exemplo medula óssea, coração, rim, fígado) e/ou no tratamento das doenças autoimunes que são mais prováveis da origem autoimune (por exemplo artrite reumatóide, grave miastenia, eritematoso de lúpus sistêmico, colite ulcerativa, esclerose múltipla). Os medicamentos imunossupressivos podem ser classificados em quatro grupo: glicocorticóides citostáticos; anticorpos (incluindo modificadores de resposta biológico ou DMARDs); medicamentos que atuam em imunofilinas; outros medicamentos, incluindo agentes quimioterapêuticos conhecidos usados no tratamento de distúrbios proliferativos. Para a esclerose múltipla, em particular, os anticorpos da presente invenção podem ser administradas em conjunção com uma nova classe de terapêuticos semelhantes a proteína de ligação de mielina, conhecidos como copaxonas.

[0068] Os “agentes anti-inflamatórios” ou “medicamentos anti- inflamatórios”, é usado para representar tanto nos terapêuticos esteroidais quanto não esteroidais. Os esteróides, também conhecidos como corticoesteróides, são os medicamentos que assemelha-se a cortisol, um hormônio produzido naturalmente pelas glândulas adrenais. Os esteróides são usados como um tratamento principal para as certas condições inflamatórias, tal como: vasculite sistêmica (inflamação dos vasos sanguíneos); e Miosite (inflamação do músculo). Esteróides também devem ser usadas seletivamente para tratar as condições inflamatórias tal como: artrite reumatóide (artrite inflamatória crônica ocorre nas juntas em ambos locais do corpo); eritematoso de lupus sistêmico (uma doença generalizada causada pela função imune de sistema irregular); síndrome de Sjogren (distúrbio crônico que causa olhos secos e boca seca).

[0069] Os medicamentos anti-inflamatórios não esteroidais, usualmente abreviados aos NSAIDs, são medicamentos com efeitos analgésicos, antipiréticos e anti-inflamatórios - estes reduzem dor, febre e inflamação. O termo "não esteroidal" é usado para distinguir estes medicamentos a partir dos esteróides, que (entre uma ampla faixa de outros efeitos) tem um redutor de eicosanóide similar, ação anti-inflamatória. Os NSAIDs são geralmente indicados pelo alívio sintomático das seguintes condições: artrite reumatóide; osteoartrite; artropatia inflamatória (por exemplo, espondilite anquilosante, artrite psoriática, síndrome de Reiter); gota aguda; dismenorréia; dor óssea metastática; cor de cabeça e migraína; dor pós-operatória; dor branda-à-moderada devido a inflamação e dano do tecido; pirexia; e cólica renal. Os NSAIDs incluem salicilatos, ácidos arilalcnóicos, ácido 2-arilpropiônicos (profenos), ácidos N-arilantranílicos (ácidos fenâmicos), oxicamos, coxibs (inibidores COX-2 seletivos), sulfonanilidas, diclofenaco, diflunisal, etodolaco, fenoprofeno, flurbiprofeno, ibuprofeno, indometacina, quetoprofeno, quetorolaco, ácido mefenâmico, meloxicam, nabumetona, naproxen, oxaprozin, piroxicam, salsalato, sulindac ou tolmetina.

II. Geral

[0070] A presente invenção fornece os anticorpos anti-TSLP projetados e os usos destes para tratar distúrbios inflamatórios e inflamatório particularmente alérgico. Em uma forma de realização preferida, o distúrbio inflamatório é asma. Em uma forma de realização preferida, o distúrbio inflamatório alérgico é rinossinusite alérgica, asma alérgica, conjuntivite alérgica, ou dermatite alérgica. A presente invenção também fornece os anticorpos anti-TSLP para tratar a fibrose, a doença intestinal inflamatória ou linfoma de Hodgkin.

[0071] Como usado neste, o termo “TSLP” inclui as variantes, isoformas, homólogos, ortólogos e parálogos de TSLP. A sequência de aminoácido de TSLP humano é apresentado na SEQ ID N°: 4 da Publicação Internacional N°. WO00/17362.

III. Anticorpos específicos TSLP projetados da invenção

[0072] A invenção diz respeito aos anticorpos anti-TSLP projetados que compreendem as regiões CDR especificadas.

[0073] Os métodos para os anticorpos recombinantemente projetados foram descritos, por exemplo, de Boss et al. (Patente U.S. N°. 4.816.397), Cabilly et al. (Patente U.S. N°. 4.816.567), Law et al. (Publicação de Pedido de Patente Europeia 438 310) e Winter (Publicação do Pedido de Patente Europeia N°. 239400).

[0074] Os anticorpos projetados da invenção incluem aqueles em que as modificações foram feitas aos resíduos de estrutura dentro de VH e/ou VL, por exemplo para melhorar as propriedades do anticorpo. Tipicamente tais modificações de estrutura são feitas para diminuir a imunogenicidade do anticorpo. Por exemplo, um método é para "mutar" um ou mais resíduos de estrutura a sequência de linha germinativa correspondente. Mais especificamente, um anticorpo que tem mutação somática pode conter os resíduos de estrutura que difere-se a partir da sequência da linha germinativa no qual o anticorpo é derivado. Tais resíduos podem ser identificados em comparação das sequências de estrutura de anticorpo às sequências da linha germinativa no qual o anticorpo é derivado.

[0075] Outro tipo de modificação de estrutura envolve a mutação de um ou mais resíduos dentro da região de estrutura, ou ainda dentro de uma ou mais regiões CDR, para remover os epítopo de célula T portanto para reduzir a imunogenicidade potencial do anticorpo. Este método também é referido como "desimunização" e é descrito em detalhes adicionais na Publicação de Patente U.S. N°. 20030153043.

[0076] Além disso ou alternativamente às modificações feitas dentro da estrutura ou regiões CDR, os anticorpos da invenção podem ser projetados para incluir as modificações dentro da região Fc, tipicamente para alterar uma ou mais propriedades funcionais do anticorpo, tal como vida- média de soro, fixação de complemento, ligação receptora Fc e/ou citotoxicidade celular dependente de antígeno. Além disso, um anticorpo da invenção pode ser quimicamente modificado (por exemplo, uma ou mais porções químicas podem ser ligadas ao anticorpo) ou será modificado para alterar sua glicosilação, novamente para alterar uma ou mais propriedades funcionais do anticorpo. Cada uma destas formas de realização é descrita ainda em detalhes abaixo. A numeração dos resíduos na região Fc é aquele do índice EU de Kabat.

[0077] Em uma forma de realização, o anticorpo é um anticorpo isotipo IgG4 que compreende uma mutação de serina a prolina em uma posição correspondente a posição 228 (S228P; índice EU) na região de junta da região constante de cadeia pesada. Esta mutação foi relacionada para anular a heterogenecidade das pontes de bissulfeto de inter-cadeia pesada na região de junta (Angal et al. supra; posição 241 é baseado no sistema de numeração Kabat.

[0078] Em uma forma de realização, a região de junta de CH1 é modificada tal que o número dos resíduos de cisteína em uma região de junta é alterada, por exemplo, aumentada ou diminuída. Este método é descrito ainda na Patente U.S. N°. 5.677.425. Diversos resíduos de cisteína em uma região de junta de CH1 é alterado a, por exemplo, facilitar a reunião das cadeias pesadas e leves para aumentar ou diminuir a estabilidade do anticorpo.

[0079] Em uma outra forma de realização, a região Fc de junta de um anticorpo é mutado para diminuir a vida média biológica do anticorpo. Mais especificamente, uma ou mais mutações de aminoácidos são introduzidas na região de interface de domínio CH2-CH3 do fragmento de junta Fc tal que o anticorpo tem diminuído a ligação da proteína A Staphylococcyl (SpA) relativo à ligação SpA de domínio de junta Fc natural. Este método é descrito em mais detalhes na Patente U.S. N°. 6.165.745.

[0080] Em uma outra forma de realização, o anticorpo é modificada para aumentar sua vida-média biológica. Vários métodos são possíveis. Por exemplo, uma ou mais das seguintes mutações podem ser introduzidas: T252L, T254S, T256F, como descrito na Patente U.S. N°. 6.277.375. alternativamente, para aumentar a vida-média biológica, o anticorpo pode ser alterado dentro da região CH1 ou CL para conter um epítopo de ligação do receptor de salvamento retirado de dois arcos de um domínio CH2 de uma região Fc de um IgG, como descrito na Patente U.S. N°. 5.869.046 e 6.121.022.

[0081] Já em outras formas de realização, a região Fc é alterada pela substituição de pelo menos um resíduo de aminoácido com um resíduo de aminoácido diferente para alterar as funções efetivas do anticorpo. Por exemplo, um ou mais aminoácidos selecionados de resíduos de aminoácidos 234, 235, 236, 237, 297, 318, 320 e 322 podem ser substituídos com um resíduo de aminoácido diferente tal que o anticorpo tem uma afinidade alterada para um ligando efetivo, mas retém a capacidade de ligação de antígeno do anticorpo precursor. O ligando efetivo em que a afinidade é alterada pode ser, por exemplo, um receptor Fc ou o componente C1 de complemento. Este método é descrito em mais detalhes na Patente U.S. N°. 5.624.821 e 5.648.260.

[0082] Em outro exemplo, um ou mais aminoácidos selecionados de resíduos de aminoácidos 329, 331 e 322 podem ser substituídos com um resíduo de aminoácido diferente tal que o anticorpo tem ligação C1q alterada e/ou reduzida ou citotoxicidade dependente do complemento abolido (CDC). Este método é descrito em mais detalhes na Patente U.S. N°. 6.194.551.

[0083] Em outro exemplo, um ou mais resíduos de aminoácidos dentro das posições de aminoácidos 231 e 239 são alterados portanto para alterar a capacidade do anticorpo para fixar o complemento. Este método ainda é descrito na Publicação PCT WO 94/29351.

[0084] Já em outro exemplo, um região Fc é modificado para aumentar a capacidade do anticorpo para medir a citotoxicidade celular dependente de anticorpo (ADCC) e/ou para aumentar a afinidade do anticorpo por um receptor FCY pela modificação de um ou mais aminoácidos nas seguintes posições: 238, 239, 248, 249, 252, 254, 255, 256, 258, 265, 267, 268, 269, 270, 272, 276, 278, 280, 283, 285, 286, 289, 290, 292, 293, 294, 295, 296, 298, 301, 303, 305, 307, 309, 312, 315, 320, 322, 324, 326, 327, 329, 330, 331, 333, 334, 335, 337, 338, 340, 360, 373, 376, 378, 382, 388, 389, 398, 414, 416, 419, 430, 434, 435, 437, 438 ou 439. Este método ainda é descrito na Publicação PCT WO 00/42072. Além disso, os locais de ligação no IgG1 humano por FCYRI, FcyRII, FCYRIII e FcRn foram mapeados e as variantes com ligação melhorada foi descrito (ver Shields et al. (2001) J. Biol. Chem. 276:6591-6604). As mutações específicas nas posições 256, 290, 298, 333, 334 e 339 foram mostradas para melhorar a ligação a FCYRIII. Adicionalmente, os seguintes mutantes de combinação foram mostrados para melhorar a ligação FcyRIII: T256A/S298A, S298A/E333A, S298A/K224A e S298A/E333A/K334A.

[0085] Ainda em outra forma de realização, a glicosilação de um anticorpo é modificado ou alterado, para anular ou adicionar as porções de carboidrato aos anticorpos. Por exemplo, um anticorpo aglicosilado pode ser feito (isto é, o anticorpo necessita de glicosilação). A glicosilação pode ser alterada a, por exemplo, aumento da afinidade do anticorpo para antígeno. Tais modificações de carboidratos podem estar acompanhados por, por exemplo, alteração de um ou mais locais de glicosilação dentro da sequência de anticorpo. Por exemplo, uma ou mais substituições de aminoácidos podem ser feitos resultando na eliminação de um ou mais locais de glicosilação de estrutura de região variável para eliminar portanto a glicosilação naquele local. Tal glicosilação pode aumentar a afinidade do anticorpo para antígeno. Ver, por exemplo, Patente U.S. N°. 5.714.350 e 6.350.861.

[0086] Adicionalmente ou alternativamente, um anticorpo pode ser feito que tem um tipo alterado de glicosilação, tal como um anticorpo hipofucosilado tendo as quantidade reduzidas dos resíduos de fucosila ou um anticorpo tendo as estruturas GlcNac de bissecção aumentadas. Tais origens de glicosilação alteradas foram demonstradas para aumentar a capacidade de ADCC dos anticorpos. Tais modificações de carboidrato podem ser acompanhados por, por exemplo, expressar o anticorpo em uma célula hospedeira com o mecanismo de glicosilação alterada. As células com mecanismo de glicosilação alterado foram descritas na técnicas e podem ser usados as célula hospedeiras em que para expressar os anticorpos recombinantes da invenção para produzir por meio deste um anticorpo com glicosilação alterado. Por exemplo, as linhas celulares Ms704, Ms705 e Ms709 necessitam o gene de fucosiltransferase, FUT8 (α (1,6)- fucosiltransferase), tal que os anticorpos expressados nas linhas celulares Ms704, Ms705 e Ms709 necessitam de fucose em seus carboidrato. As linhas celulares Ms704, Ms705 e Ms709 FUT8-/- criadas pelo rompimento alvejado do gene FUT8 nas células CHO/DG44 usando dois vetores de substituição (ver Publicação da Patente U.S. N°. 20040110704 e Yamane-Ohnuki et al. (2004) Biotechnol Bioeng 87:614-22). Como outro exemplo, EP 1,176,195 descreve uma linha celular com um gene FUT8 funcionalmente interrompido, que codifica um fucosil transferase, tal que os anticorpos expressados em uma tal linha celular exibe a hipofucosilação pela redução ou eliminação da enzima α-1,6 relacionado a ligação. O EP 1.176.195 também descreve as linhas celulares que tem uma atividade de enzima baixa pela adição de fucose a N-acetilglucosamina que liga-se a uma região Fc do anticorpo ou não tem a atividade de enzima, por exemplo a linha celular YB2/0 de mieloma de rato (ATCC CRL 1662). Publicação PCT WO 03/035835 descreve uma variante da linha celular CHO, células Lec13, com capacidade reduzida para ligar a fucose aos carboidratos ligados a Asn(297), também resultando na hipofucosilação de anticorpos expressados naquela célula hospedeira (ver também Shields et al. (2002) J. Biol. Chem. 277:26733-26740). Os anticorpos com um perfil de glicosilação modificada também podem ser produzidos nos ovos de galinha, como descrito na Publicação PCT WO 06/089231. Alternativamente, os anticorpos com um perfil de glicosilação podem ser produzidos nas células vegetais, tal como Lemna. Publicação PCT WO 99/54342 descreve as linhas celulares projetadas para expressar a glicosil transferase de modificação de glicoproteína (por exemplo, β(1,4)-N- acetilglucosaminiltransferase III (GnTIII)) tal que os anticorpos expressados nas linhas celulares projetadas exibem as estruturas de bissecção de GlcNac aumentadas que resultam na atividade ADCC aumentada dos anticorpos (ver also Umana et al. (1999) Nat. Biotech. 17:176-180). Alternativamente, os resíduos de fucose do anticorpo podem ser clivados usando uma enzima de fucosidase; por exemplo, a fucosidase α-L-fucosidase remove os resíduos de fucosil a partir dos anticorpos (Tarentino et al. (1975) Biochem. 14:5516-23).

[0087] Outra modificação dos anticorpos neste que é considerada pela divulgação é pegilação. Um anticorpo pode ser peguilado a, por exemplo, aumento da vida média biológica (por exemplo, soro) do anticorpo. Para peguilar um anticorpo, o anticorpo, ou fragmento deste, tipicamente é reagido com polietileno glicol (PEG), tal como um éster reativo ou derivado de aldeído de PEG, sob as condições em que um ou mais grupos PEG tornam-se ligados ao anticorpo ou fragmento de anticorpo. Preferivelmente, a peguilação é realizada por intermédio de uma reação de acilação ou uma reação de alquilação com uma molécula PEG reativa (ou um polímero solúvel em água reativo por análogo). Como usado aqui, o termo "polietileno glicol" é pretendido abranger qualquer uma das formas de PEG que foram usadas para derivatizar outras proteínas, tal como mono (C1-C10) alcóxi - ou arilóxi-polietileno glicol ou polietileno glicol- maleimida. Em certas formas de realização, o anticorpo a ser peguilado é um anticorpo glicosilado. Os métodos para as proteínas de peguilação são conhecidas na técnica e podem ser aplicadas aos anticorpos da invenção. Ver, por exemplo, EP 0 154 316 e EP 0 401 384.

[0088] As variantes da sequência de aminoácido do anticorpo anti-TSLP humanizado da invenção podem ser preparadas pela introdução da mudanças de nucleotídeos apropriadas no DNA de anticorpo anti-TSLP humanizado, ou pela síntese de peptídeo. Tais variantes incluem, por exemplo, anulações de e/ou inserções em e/ou substituições de, resíduos dentro das sequências de aminoácidos mostradas para os anticorpos anti- TSLP humanizados divulgados e reivindicados neste. Qualquer combinação de anulação, inserção e substituição pode ser feita para atingir a construção final, contanto que os processos de construção final possuem as características desejadas. Como debatido acima, as mudanças de aminoácidos também podem alterar os processos pós-tradução do anticorpo anti-TSLP humanizado, tal como mudança do número ou posição de locais de glicosilação.

[0089] Um método útil para a identificação de certos resíduos ou regiões do polipeptídeo de anticorpo anti-TSLP humanizado que são localizações preferidas para a mutagênese é denominado "mutagênese de varredura de alanina," como descrito por Cunningham and Wells (1989) Science 244: 1081-1085. Aqui, um resíduo ou grupo de resíduos alvos são identificados (por exemplo, resíduos mudados tal como Arg, Asp, His, Lys e Glu) e substituídos por um aminoácido negativamente neutro (mais preferivelmente alanina ou polialanina) para afetar a interação dos aminoácidos com antígeno TSLP. Os resíduos de aminoácidos que demonstram a sensibilidade funcional às substituições então são refinadas pela introdução adicional ou outras variantes a, ou pelos locais de substituição. Deste modo, enquanto o local para a introdução de uma variação da sequência de aminoácido é pré-determinada, a natureza da mutação por si não necessita ser pré-determinado. Por exemplo, para analisar o desempenho de uma mutação em um local dado, varredura Ala ou mutagênese aleatória é conduzida no códon alvo ou região e as variantes de anticorpo anti-TSLP humanizado são avaliados pela atividade desejada.

[0090] As inserções da sequência de aminoácido incluem fusões de terminal amino- e/ou carboxila em comprimento de um resíduo aos polipeptídeos contendo cem ou mais resíduos, bem como inserções de intrassequência de resíduos de aminoácidos simples ou múltiplos. Exemplos de inserções terminais incluem anticorpo anti-TSLP humanizado com um resíduo de metionila de terminal N ou o anticorpo fundido a um rótulo de epítopo. Outras variantes insercionais da molécula de anticorpo anti-TSLP humanizada incluem a fusão ao terminal N- ou C- de anticorpo anti-TSLP humanizado de uma enzima ou um polipeptídeo que aumenta a vida-média do soro do anticorpo.

[0091] Outro tipo de variante é uma variante de substituição de aminoácido. Estas variantes tem pelo menos um resíduo de aminoácido na molécula de anticorpo anti-TSLP humanizado removido e um resíduo diferente inserido em seu local. Os locais de interesse maior para a mutagênese substitucional inclui os arcos hipervariáveis, mas alterações FR também são consideradas. Os resíduos de região hipervariável ou resíduos FR envolvidos de ligação de antígeno são geralmente substituídos em uma maneira relativamente conservativa.

[0092] Já outro tipo de variante de aminoácido é a substituição para fornecer a estabilidade química maior do anticorpo humanizado final.

[0093] Em certas formas de realização, será desejável mudar os aminoácidos contendo as cadeias secundárias expostas a outro resíduo de aminoácido a fim de fornecer a estabilidade química maior do anticorpo final, como seguem. Por exemplo, um resíduo de asparagina (Asn) pode ser mudado a Gln ou Ala para reduzir o potencial para a formação de isoaspartato em qualquer uma das sequências Asn-Gly dentro de um CDR. Um problema similar pode ocorrer em uma sequência de Asp-Gly. Reissner e Aswad (2003) Cell. Mol. Life Sci. 60:1281. A formação de isoaspartato pode debilitar ou completamente anular a ligação de um anticorpo ao seu antígeno alvo. Ver, Presta (2005) J. Allergy Clin. Immunol. 116:731 at 734. Em uma forma de realização, a asparagina é mudada a glutamina (Gln). Também pode ser desejável alterar um aminoácido adjacente a um resíduo de asparagina (Asn) ou glutamina (Gln) para reduzir a probabilidade de desamidação, que ocorre em taxas maiores quando os aminoácidos menores ocorrem adjacentes a asparagine ou glutamina. Ver, Bischoff & Kolbe (1994) J. Chromatog. 662:261. Além disso, qualquer resíduo de metionina (tipicamente solvente exposto ao Met) em CDRs podem ser mudados a Lys, Leu, Ala, ou Phe a fim de reduzir a possibilidade que o enxofre de metionina oxidariam, devendo reduzir a afinidade de ligação de antígeno e também contribuem para heterogenicidade molecular na preparação de anticorpo final. Id. Em uma forma de realização, a metionina é mudada a alanina (Ala). Adicionalmente, a fim de evitar ou minimizar as ligações de peptídeos Asn-Pro divisível potencial, pode ser desejável alterar quaisquer combinações Asn-Pro observadas em um CDR a Gln-Pro, Ala-Pro, ou Asn-Ala. Os anticorpos com tais substituições são subsequentemente avaliados para garantir que as substituições não diminuem a afinidade de ligação TSLP ou outra atividade biológica desejada aos níveis inaceitáveis. TABELA 2 Variantes CDR de estabilização exemplar

[0094] Além disso, os resíduos de metionina em CDRs de roedor podem ser mudados para reduzir a possibilidade que o enxofre de metionina deve oxidar, que pode reduzir afinidade de ligação de antígeno e também contribui a heterogenicidade molecular na preparação de anticorpo final. Id. Em uma forma de realização, a metionina é mudada a alanina (A). Os anticorpos com tais substituições são subsequentemente avaliados para garantir que as substituições não diminuem a afinidade de ligação TSLP aos níveis inaceitáveis.

[0095] As moléculas de ácido nucleico codifica as variantes da sequência de aminoácido do anticorpo específico TSLP humanizado são preparados por uma variedade de métodos conhecidos na técnica. Estes métodos incluem, mas não são limitados a, isolamento de uma fonte natural (no caso de variantes da sequência de aminoácido de ocorrência natural) ou preparação pela mutagênese mediada por oligonucleotídeo (ou direcionada ao local), mutagênese de PCR e mutagênese de cassete de uma variante de preparada precoce ou uma versão não variante de anticorpo anti-TSLP humanizado.

[0095] Comumente, as variantes da sequência de aminoácido do anticorpo anti-TSLP humanizado terá uma sequência de aminoácido tendo pelo menos 97 % de identidade da sequência de aminoácido com a sequência de aminoácidos de anticorpo humanizado original da cadeia leve e pesada mais preferivelmente pelo menos 98 %, mais preferivelmente pelo menos 99 %. Identidade ou homologia com relação a sua sequência é definida neste como a porcentagem dos resíduos de aminoácidos na sequência de candidato que são idênticos com os resíduos anti-TSLP humanizados, após o alinhamento das sequências e fendas de introdução, se necessário, para atingir a identidade da sequência percentual máxima e não considerando quaisquer substituições conservativas como parte da identidade da sequência. Nenhum do terminal N, terminal C, ou extensões internas, anulações, ou inserções na sequência de anticorpo deve ser construída como afetar a identidade da sequência ou homologia.

[0097] O anticorpo humanizado pode ser selecionado de qualquer classe de imunoglobulinas, incluindo IgM, IgG, IgD, IgA e IgE. Preferivelmente, o anticorpo é um anticorpo IgG. Qualquer isotipo de IgG pode ser usado, incluindo IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4. As variantes de isotipos IgG também são considerados. O anticorpo humanizado pode compreender as sequências de mais do que uma classe ou isotipo. A otimização das sequências de domínio constante necessário para gerar a atividade biológica desejada é prontamente atingido pela avaliação dos anticorpos nos ensaios biológicos descritos abaixo.

[0098] De outra maneira, a classe de cadeia leve pode ser usada nas composições e métodos neste. Especificamente, capa, lambda, ou variantes destes são úteis nas presentes composições e métodos.

[0099] Qualquer porção adequada das sequências CDR a partir do anticorpo não humano pode ser usada. As sequências CDR podem ser mutagenizados pela substituição, inserção ou anulação de pelo menos um resíduo tal que a sequência CDR é distinta a partir da sequência de anticorpo humana e não humana. É considerado que tais mutações devem ser mínimas. Tipicamente, pelo menos 95 % dos resíduos de anticorpo humanizado corresponderá aquele dos resíduos CDRs não humanos e mais preferivelmente maior do que 97 %.

[00100] Qualquer porção adequada das sequências FR a partir do anticorpo humano pode ser usada. As sequências FR pode ser mutagenizadas pela substituição, inserção ou anulação de pelo menos um resíduo tal que a sequência FR é distinta a partir da sequência de anticorpo humana e não humana utilizada. É considerado que as mutações devem ser mínimos. Tipicamente, pelo menos 75 % dos resíduos de anticorpos humanizados correspondem aqueles dos resíduos FR humanos, mais frequentemente 90 % e mais preferivelmente maior do que 95 %.

[00101] Os resíduos CDR e FR são determinados de acordo com a definição da sequência padrão de Kabat. Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, National Institutes of Health, Bethesda Md. (1987).

[00102] Em uma forma de realização preferida, uma composição de ligação de acordo com a invenção compreende, uma ou mais das seguintes sequências: • A sequência CDR-H1 GYIFTDYAMH (SEQ ID N°: 1). • A sequência CDR-H2 TFIPLLDTSDYAQKFQG (SEQ ID N°: 2). • A sequência CDR-H3 MGVTHSYVMDA (SEQ ID N°: 3). • A sequência CDR-L1 RASQPISISVH (SEQ ID N°: 4). • A sequência CDR-L2 FASQSIS (SEQ ID N°: 5). • A sequência CDR-L3 QQTFSLPYT (SEQ ID N°: 6). • A sequência de aminoácido de cadeia pesada variável mostrada na SEQ ID N°: 7. • A sequência de aminoácido de cadeia leve variável mostrada na SEQ ID N°: 8. • A sequência de ácido nucleico codifica a cadeia pesada variável mostrada na SEQ ID N°: 9. • A sequência de ácido nucleico codifica a cadeia leve variável mostrada na SEQ ID N°: 10. • A sequência de aminoácido de cadeia pesada mostrada na SEQ ID N°: 11. Esta sequência ainda pode compreender à seguinte sequência líder: MAVLGLLFCLVTFPSCVLS (SEQ ID N°: 15). • A sequência de aminoácido de cadeia leve mostrada na SEQ ID N°: 12. Esta sequência ainda pode compreender à seguinte sequência líder: MAPVQLLGLLVLFLPAMRC (SEQ ID N°: 16). • A sequência de ácido nucleico codifica a cadeia pesada é mostrada na SEQ ID N°: 13. Esta sequência ainda pode compreender a sequência que codifica uma sequência líder, preferivelmente à seguinte sequência líder: MAVLGLLFCLVTFPSCVLS (SEQ ID N°: 15). • A sequência de ácido nucleico codifica uma cadeia leve é mostrada na SEQ ID N°: 14. Esta sequência ainda pode compreender a sequência que codifica uma sequência líder, preferivelmente à seguinte sequência líder: MAPVQLLGLLVLFLPAMRC (SEQ ID N°: 16).

[00103] Por exemplo, a presente invenção inclui um anticorpo isolado ou fragmento de ligação de antígeno deste compreende uma imunoglobulina de cadeia leve compreende CDR-L1, CDR-L2 e CDR-L3 (como apresentado acima) e a imunoglobulina de cadeia pesada compreende CDR-H1, CDR-H2 e CDR-H3 (como apresentado acima). A presente invenção também inclui um anticorpo isolado ou fragmento de ligação de antígeno deste compreende uma região variável de imunoglobulina de cadeia leve compreende a sequência de aminoácido apresentada na SEQ ID N°: 8 ou 12 e uma região variável de imunoglobulina de cadeia pesada compreende a sequência de aminoácido apresentada na SEQ ID N°: 7 e 11 (por exemplo, SEQ ID N°: 7 em forma de pares com SEQ ID N°: 8; ou, SEQ ID N°: 11 em forma de pares com SEQ ID N°: 12). Um tal anticorpo ou fragmento pode, em uma forma de realização da invenção, ser ligado a um domínio constante de imunoglobulina tal como IgG (por exemplo, IgG1, IgG2, IgG3 ou IgG4). Uma composição farmacêutica deste, compreende o dito anticorpo ou fragmento e um carreador farmaceuticamente aceitável, é também parte da presente invenção.

[00104] Em algumas formas de realização, domínios constantes diferentes podem ser anexados as regiões VL e VH humanizadas fornecidos neste. Por exemplo, se um uso pretendido particular de um anticorpo (ou fragmento) da presente invenção foi denominado para funções efetuadas alteradas, um domínio constante de cadeia pesada outro do que IgG1 pode ser usado. Embora os anticorpos IgG1 fornecem para as vida média longa e para as funções efetivas, tal como ativação de complemento e citotoxicidade celular dependente de anticorpo, tais atividades não devem ser desejadas para todos os usos do anticorpo. Em tais exemplos um domínio constante IgG4, por exemplo, podem ser usado.

IV. Conjugados de anticorpo

[00105] Os compostos de ligação da invenção, por exemplo o anticorpo ou fragmentos de anticorpo da invenção, também podem ser conjugados a uma porção química. A porção química pode ser, inter alia, um polímero, um radionuclídeo ou um fator citotóxico. Preferivelmente a porção química é um polímero que aumenta a vida média da molécula de anticorpo no corpo de um paciente. Os polímeros adequados incluem, mas não são limitados a, polietileno glicol (PEG) (por exemplo, PEG com um peso molecular de 2kDa, 5 kDa, 10 kDa, 12kDa, 20 kDa, 30kDa ou 40kDa), dextrano e monometoxipolietileno glicol (mPEG). Lee, et al., (1999) (Bioconj. Chem. 10:973-981) divulga anticorpos de cadeia simples conjugado por PEG. Wen, et al., (2001) (Bioconj. Chem. 12:545-553) divulga os anticorpos de divulgação com PEG que é ligado a um quelante radiometal (ácido dietilenotriaminpentaacético (DTPA)).

[00106] Os anticorpos e fragmentos de anticorpo da invenção 99 90 111 32 14 também podem ser conjugados com rótulos tal como Tc, Y, In, P, C, 125 3 131 11 15 13 18 35 51 57 226 60 59 57 152 I, H, I, C, O, N, F, S, Cr, To, Ra, Co, Fe, Se, Eu, 67CU 217Ci 211At 212Pb 47Sc 109Pd 234Th e 40K 157Gd 55Mn 52Tr e 56Fe , , t, , c, , e , , n, r e e.

[00107] Os anticorpos e fragmentos de anticorpo da invenção também podem ser conjugados com rótulos fluorescentes e quimioluminescentes, incluindo fluoroforos tal como quelatos de terra rara, fluoresceína e seus derivados, rodamina e seus derivados, isotiocianato, ficoeritrina, ficocianina, aloficocianina, o-ftalaldeído, fluorescamina, 152Eu, dansila, umbeliferona, luciferina, rótulo luminal, rótulo isoluminal, um rótulo do éster acridínio aromático, um rótulo imidazol, um rótulo do sal acridímio, um rótulo do éster de oxalato, um rótulo de aequorin, 2,3- diidroftalazinadionas, biotina/avidina, rótulos de rotação e radicais livres estáveis.

[00108] As moléculas de anticorpos também podem ser conjugadas um fator citotóxico tal como toxina de difteria, cadeia A de exotoxina Pseudomonas aeruginosa, cadeia A de ricina, cadeia A de abrina, cadeia A de modecina, alfa-sarcina, proteínas Aleurites fordii e compostos (por exemplo, ácidos graxos), proteínas de diantina, proteínas de Phytoiacca americana PAPI, PAPII e PAP-S, inibidor de momordica charantia, curcin, crotina, inibidor saponaria officinalis, mitogelina, restrictocina, fenomicina e enomicina.

[00109] Qualquer método conhecido na técnica para a conjugação da molécula de anticorpos da invenção as várias porções podem ser utilizadas, incluindo estes métodos descritos por Hunter, et al., (1962) Nature 144:945; David, et al., (1974) Biochemistry 13:1014; Pain, et al., (1981) J. Immunol. Meth. 40:219; e Nygren, J., (1982) Histochem. and Cytochem. 30:407. Os métodos para a conjugação de anticorpos são convencionais e muito bem conhecidos na técnica.

[00110] Já em outras formas de realização, domínios constantes diferentes podem ser anexados as regiões VL e VH humanizadas derivados de CDRs fornecidos neste. Por exemplo, se um uso pretendido particular de um anticorpo (ou fragmento) da presente invenção foi denominado para as funções efetivas alteradas, um domínio constante de cadeia pesada outro do que IgG1 pode ser usado, ou IgG1/IgG4 híbrido pode ser utilizado.

[00111] Embora os anticorpos IgG1 fornecem para vida-média longa e para as funções efetivas, tal como ativação de complemento e citotoxicidade celular dependente de anticorpo, tais atividades não devem ser desejadas para todos os usos do anticorpo. Em tais exemplos um domínio constante IgG4, por exemplo, pode ser usado. Em hu Mab8D5, o domínio constante IgG4 difere-se a partir do domínio constante humano natural IgG4 (Acessão Swiss-Prot N°. P01861.1, a divulgação de que é portanto incorporado por referência) na posição 108, onde o Ser108 natural é substituído com Pro, a fim de evitar uma ligação de bissulfeto da intercadeia potencial entre Cys106 e Cys109 que deve interferir com formação de ligação de bissulfeto de intra-cadeia própria. Ver Angal et al. (1993) Mol. Imunol. 30:105.

V. Atividade biológica dos compostos de ligação da invenção

[00112] Os compostos de ligação tendo as características identificadas neste como sendo desejável em um anticorpo anti-TSLP humanizado pode ser avaliado pela atividade biológica inibidora in vitro ou pela afinidade de ligação adequada.

[00113] As afinidades de anticorpo (por exemplo por TSLP humano) pode ser determinado usando a análise padrão. Os anticorpos humanizados preferidos são aqueles que ligam-se ao TSLP humano com um valor KD de não mais do que cerca de 1x10-7 M; preferivelmente não mais do que cerca de 1x10-8 M; mais preferivelmente não mais do que cerca de 1x10-9 M; e mais preferivelmente não mais do que cerca de 1x10-10 M.

[00114] Os anticorpos e fragmentos destes úteis na presente composições e métodos são anticorpos e fragmentos biologicamente ativos. Como usado neste, o termo “biologicamente ativo” refere-se a um anticorpo ou fragmento de anticorpo que é capaz de ligar-se o desejado do epítopo antigênico e diretamente ou indiretamente exercendo um efeito biológico. Tipicamente, estes efeitos resultam a partir do dano de TSLP para ligar-se ao seu receptor. Em uma forma de realização, o anticorpo e os fragmentos deste úteis na presente composições e métodos inibem: proliferação induzida por hTSLP de uma linha celular Baf-3 transfectada com receptor hTSLP e IL- 7Ralfa; expressão de luciferase induzida por hTSLP a partir de uma linha celular Baf-3 transfectada com o receptor TSLP e um sistema repórter de luciferase; secreção TARC induzida por hTSLP a partir dos monócitos humanos primários isolados de PBMCs; e indução da diferenciação Th2.

[00115] Como usado neste, o termo “específico” refere-se à ligação seletiva do anticorpo ao epítopo de antígeno alvo. Os anticorpos podem ser testados pela especificidade da ligação em comparação com a ligação ao TSLP a ligação no antígeno irrelevante ou mistura de antígeno sob uma dada série de condições. Se o anticorpo liga-se ao TSLP pelo menos 10 e preferivelmente 20 ou 50 vezes mais do que ao antígeno irrelevante ou mistura de antígeno então é considerado ser específico. Um anticorpo que “especificamente liga-se” a TSLP não liga-se as proteínas que não compreendem as sequências derivadas por TSLP, isto é “especificidade” como usado neste relaciona a especificidade TSLP e qualquer não outra sequências que podem estar presentes na proteína em questão. Por exemplo, como usado neste, um anticorpo que “especificamente liga-se” ao TSLP tipicamente ligará a FLAG-h TSLP, que é uma proteína de fusão compreende TSLP e um rótulo de peptídeo FLAG®, mas não liga-se ao rótulo de peptídeo FLAG® sozinho ou quando é fundido a uma proteína outra do que TSLP.

VI. Composições farmacêuticas

[00116] Para preparar as composições farmacêuticas ou estéreis, o anticorpo ou fragmento deste é misturado com um carreador ou excipiente farmaceuticamente aceitável, ver, por exemplo, Remington's Pharmaceutical Sciences e U.S. Pharmacopeia: National Formulary, Mack Publishing Company, Easton, PA (1984). As formulações de agentes terapêuticos e diagnósticos podem ser preparados pela mistura com carreadores fisiologicamente aceitável, excipientes, ou estabilizadores na forma de, por exemplo, pós liofilizados, pastas, soluções aquosas ou suspensões (ver, por exemplo, Hardman, et al. (2001) Goodman and Gilman’s The Pharmacological Basis of Therapeutics, McGraw-Hill, New York, NY; Gennaro (2000) Remington: The Science and Practice of Pharmacy, Lippincott, Williams e Wilkins, New York, NY; Avis, et al. (eds.) (1993) Pharmaceutical Dosage Forms: Parenteral Medications, Marcel Dekker, NY; Lieberman, et al. (eds.) (1990) Pharmaceutical Dosage Forms: Tablets, Marcel Dekker, NY; Lieberman, et al. (eds.) (1990) Pharmaceutical Dosage Forms: Disperse Systems, Marcel Dekker, NY; Weiner and Kotkoskie (2000) Excipient Toxicity and Safety, Marcel Dekker, Inc., New York, NY).

[00117] A toxicidade e eficácia terapêutica das composições de anticorpo, administrada sozinha ou em combinação com um agente imunossupressor, pode ser determinado pelos procedimentos farmacêuticos padrão nas culturas celulares ou animais experimentais, por exemplo, pela determinação de LD50 (a dosagem letal a 50 % da população) e o ED50 (a dosagem terapeuticamente efetiva em 50 % da população). Uma razão de dosagem entre efeitos tóxicos e terapêuticos é o índice terapêutico e este pode ser expressado como a razão entre LD50 e ED50. Os anticorpos exibem os índices terapêuticos altos são preferidos. Os dados obtidos a partir destes estudos de animais e ensaios de cultura celular podem ser usados na formulação de uma faixa de dosagem para uso em humanos. A dosagem de tais compostos está preferivelmente dentro da faixa da circulação das concentrações que incluem o ED50 com menor ou nenhuma toxicidade. A dosagem pode variar dentro desta faixa dependendo da forma de dosagem utilizada e a vida de administração utilizada.

[00118] As vias adequadas de administração incluem administração parenteral, tal como administração intramuscular, intravenosa, ou subcutânea. A administração usada na composição farmacêutica ou para praticar o método da presente invenção pode ser realizado em uma variedade de maneiras convencionais, tal como ingestão oral, inalação, aplicação tópica ou injeção cutânea, subcutânea, intraperitoneal, parenteral, intra-arterial ou intravenosa. Em uma forma de realização, o composto de ligação da invenção é administrado intravenosamente. Em outra forma de realização, o composto de ligação da invenção é administrado subcutaneamente.

[00119] Alternativamente, um pode administrar o anticorpo em um local antes do que maneira sistêmica, por exemplo, pela injeção do anticorpo diretamente em uma junta artrítica ou lesão induzida por patógeno caracterizada pela imunopatologia, frequentemente em um depósito ou formulação de liberação sustentada. Além disso, um pode administrar o anticorpo em um sistema de liberação de medicamento alvejado, por exemplo, em um lipossomo revestido com um anticorpo específico por tecido, marcação, por exemplo, junta artrítica ou lesão induzida por patógeno caracterizada pela imunopatologia. Os lipossomos serão alvejados e absorvidos seletivamente pelo tecido atingido.

[00120] A seleção do regime de administração para um terapêutico depende de diversos fatores, incluindo o soro ou taxa de rotação de tecido da entidade, o nível de sintomas, a imunogenicidade da entidade e a acessabilidade das células alvos na matriz biológica. Preferivelmente, um regime de administração maximiza a quantidade do terapêutico liberado ao paciente que consiste com um nível aceitável dos efeitos colaterais. Consequentemente, a quantidade do biológico liberado depende da parte da entidade particular e a gravidade da condição sendo tratada. A orientação na seleção das dosagens apropriadas de anticorpos, citocinas e moléculas pequenas são disponíveis (ver, por exemplo, Wawrzynczak (1996) Antibody Therapy, Bios Scientific Pub. Ltd, Oxfordshire, UK; Kresina (ed.) (1991) Monoclonal Antibodies, Cytokines and Arthritis, Marcel Dekker, New York, NY; Bach (ed.) (1993) Monoclonal Antibodies and Peptide Therapy in Doença autoimunes, Marcel Dekker, New York, NY; Baert, et al. (2003) New Engl. J. Med. 348:601-608; Milgrom, et al. (1999) New Engl. J. Med. 341:1966-1973; Slamon, et al. (2001) New Engl. J. Med. 344:783-792; Beniaminovitz, et al. (2000) New Engl. J. Med. 342:613-619; Ghosh, et al. (2003) New Engl. J. Med. 348:24-32; Lipsky, et al. (2000) New Engl. J. Med. 343:1594-1602).

[00121] A determinação da dosagem apropriada é feita pelo clínico, por exemplo, usando parâmetros ou fatores conhecidos ou presumidos na técnica para afetar o tratamento ou predizer para afetar o tratamento. Geralmente, a dosagem inicia com uma quantidade algo menos do que a ótima dosagem e é aumentado por incrementos menores até o ótimo efeito ou desejado é atingido relativo em qualquer efeito secundário negativo. As medidas diagnósticas importantes incluem aqueles sintomas de, por exemplo, a inflamação ou nível de citocinas inflamatórias produzidas. Preferivelmente, um produto biológico que será usado é derivado das mesmas espécies como o animal alvejado para o tratamento, portanto minimizando uma resposta proliferativa inflamatória, autoimune, inflamatória ao reagente.

[00122] Os anticorpos, fragmentos de anticorpo e citocinas podem ser fornecidos pela infusão contínua, ou pelas dosagens em intervalos de, por exemplo, um dia, uma semana, ou 1-7 vezes por semana. As dosagens podem ser fornecidas intravenosamente, subcutaneamente, topicamente, oralmente, nasalmente, retalmente, intramuscular, intracerebralmente, intraespinalmente, ou pela inalação. Um protocolo de dosagem preferida é um envolvido na dosagem máxima ou frequência de dosagem que evita os efeitos colaterais indesejáveis significantes. Uma dosagem semanalmente total é geralmente pelo menos 0,05 μg/kg de peso corporal, mais geralmente pelo menos 0,2 μg/kg, mais geralmente pelo menos 0,5 μg/kg, tipicamente pelo menos 1 μg/kg, mais tipicamente pelo menos 10 μg/kg, mais tipicamente pelo menos 100 μg/kg, preferivelmente pelo menos 0,2 mg/kg, mais preferivelmente pelo menos 1,0 mg/kg, mais preferivelmente pelo menos 2,0 mg/kg, opcionalmente pelo menos 10 mg/kg, mais opcionalmente pelo menos 25 mg/kg e mais opcionalmente pelo menos 50 mg/kg (ver, por exemplo, Yang, et al. (2003) New Engl. J. Med. 349:427-434; Herold, et al. (2002) New Engl. J. Med. 346:1692- 1698; Liu, et al. (1999) J. Neurol. Neurosurg. Psych. 67:451-456; Portielji, et al. (20003) Cancer Immunol. Immunother. 52:133-144). A dosagem desejada de um terapêutico de molécula menor, por exemplo, um mimético peptídeo, produto natural, ou químico orgânico, é cerca do mesmo como para um anticorpo ou polipeptídeo, em uma base de mols/kg.

[00123] Como usado neste, “inibir” ou “tratar” ou “tratamento” inclui um adiamento do desenvolvimento dos sintomas associados com doença autoimune ou imunopatologia induzida por patogênio e/ou uma redução na gravidade de tais sintomas que serão ou são esperados para desenvolverem. Os termos ainda incluem o melhoramento dos sintomas de imunopatologia induzida por patogênio ou relacionado indesejado ou não controlado existente, evitando os sintomas adicionais e melhoramento ou evitando a causa subjacente de tais sintomas. Deste modo, os termos indicam que um resultado benéfico foi conferido em um paciente vertebrado com uma doença inflamatória.

[00124] Como usado neste, o termo “quantidade terapeuticamente efetiva” ou “quantidade efetiva” refere-se a uma quantidade de um anticorpo anti-TSLP ou fragmento deste, que quando administrado sozinho ou em combinação com um agente terapêutico adicional a uma célula, tecido, ou paciente é efetivo para evitar ou melhorar a doença autoimune ou imunopatologia induzida por patogênio associado a doença ou condição ou a progressão da doença. Uma dosagem terapeuticamente efetiva ainda refere-se à quantidade do composto suficiente para resultar no melhoramento de sintomas, por exemplo, tratamento, cura, prevenção ou melhoramento da condição clínica relevante, ou um aumento na taxa de tratamento, cura, prevenção ou melhoramento de tais condições. Quando aplicado em um a um ingrediente ativo individual sozinho, uma dosagem terapeuticamente efetiva refere-se aquela do ingrediente sozinho. Quando aplicado a uma combinação, a dosagem terapeuticamente efetiva refere-se as quantidades combinadas dos ingredientes ativos que resultam no efeito terapêutico, se administrado em combinação, periodicamente ou simultaneamente. Uma quantidade efetiva do terapêutico diminuirá os sintomas tipicamente por pelo menos 10 %; usualmente por pelo menos 20 %; preferivelmente pelo menos cerca de 30 %; mais preferivelmente pelo menos 40 % e mais preferivelmente por pelo menos 50 %.

[00125] Os métodos para a co-administração ou tratamento com um anticorpo ou fragmento anti-TSLP de ligação de antígeno deste da presente invenção e um segundo agente terapêutico, por exemplo, uma citocina, esteróide, agente quimioterapêutico, antibiótico, ou radiação (ou qualquer tal agente debatido neste) formam parte da presente invenção, ver, geralmente, por exemplo, Hardman, et al. (eds.) (2001) Goodman and Gilman’s The Pharmacological Basis of Therapeutics, 10° ed., McGraw-Hill, New York, NY; Poole and Peterson (eds.) (2001) Pharmacotherapeutics for Advanced Practice: A Practical Approach, Lippincott, Williams & Wilkins, Phila., PA; Chabner and Longo (eds.) (2001) Cancer Chemotherapy and Biotherapy, Lippincott, Williams & Wilkins, Phila., PA. Os anticorpos e fragmento de ligação de antígenos deste e composições farmacêuticas deste da invenção também podem conter os agentes imunossupressores ou imunomoduladores. Qualquer agente imunossupressor adequado pode ser utilizado, incluindo mas não limitado a agentes anti-inflamatórios, corticoesteróides, ciclosporina, tacrolimus (isto é, FK-506), sirolimus, interferons, receptores de citocinas sóluvel (por exemplo, sTNRF e sIL-1R), agentes que neutralizam a atividade de citocina (por exemplo, inflixmab, adalimumab, golimumab, etanercept), micofenolato mofetil, 15- desoxispergualin, talidomida, glatiramer, azatioprina, leflunomida, ciclofosfamida, metotrexato e outros. Os medicamentos anti-inflamatórios não esteroidais também podem ser fornecidos com um anticorpo ou fragmento de ligação de antígeno deste ou composição farmacêutica deste da presente invenção. A composição farmacêutica também pode ser utilizada com outras modalidades terapêuticas tal como fototerapia e radiação. O escopo da presente invenção inclui as composições que compreendem qualquer anticorpo ou fragmento de ligação de antígeno deste da presente invenção e qualquer segundo agente terapêutico (por exemplo, como debatido neste, por exemplo, em que o anticorpo ou fragmento é formulado separadamente a partir do segundo agente terapêutico ou em que estes são formulados juntos).

[00126] Os pacientes de busca, experimentais, ou típicos veterinários incluem macacos, cães, gatos, ratos, camundongos, coelhos, porquinho-da-índia, cavalos e humanos.

VII. Produção de anticorpo

[00127] Para a produção recombinante dos anticorpos da presente invenção, os ácidos nucleicos que codificam as duas cadeias são isolados e inseridos em um ou mais vetores replicáveis para a clonagem adicional (amplificação do DNA) ou pela expressão. O DNA codifica um anticorpo monoclonal é prontamente isolado e sequenciado usando procedimentos convencionais (por exemplo, pelo uso de sondas de oligonucleotídeo que são capazes de ligar-se especificamente aos genes que codificam uma cadeia leve e pesada do anticorpo). Muitos vetores são disponíveis. Os componentes de vetores geralmente incluem, mas não são limitados a, um ou mais dos seguintes: uma sequência de sinal, uma origem de replicação, um ou mais genes marcadores, um elemento intensificador, um promotor e uma sequência terminadora de transcrição. Em uma forma de realização, tanto a cadeia pesada quanto cadeia leve do anticorpo anti-TSLP humanizado da presente invenção são expressadas a partir do mesmo vetor, por exemplo um plasmídeo ou um vetor adenoviral.

[00128] Os anticorpos e fragmentos de ligação de antígenos deste da presente invenção podem ser produzidos por qualquer um dos métodos conhecidos na técnica. Em uma forma de realização, os anticorpos são expressados nas células de insetos e mamíferos na cultura, tal como células de ovário de hâmster chinês (CHO), células de rim embriônico humano (HEK) 293, células de mieloma de camundongo NSO, células do rim de hâmster filhote (BHK), células ovarianas Spodoptera frugiperda (Sf9). Em uma forma de realização da invenção, os anticorpos e fragmento de ligação de antígenos deste são produzidas nas células fúngicas tal como células Pichia, células Pichia pastoris, células Pichia flnlandica, células Pichia trehalophila, células Pichia koclamae, células Pichia membranaefaciens, células Pichia minuta (Ogataea minuta, Pichia lindneri), células Pichia opuntiae, células Pichia thermotolerans, células Pichia salictaria, células Pichia guercuum, células Pichia pijperi, células Pichia stiptis, células Pichia methanolica, células Saccharomyces cerevisiae, células Saccharomyces, células Hansβnula polymorpha, células Kluyveromyces, células Kluyveromyces lactis, células Candida albicans, células Aspergillus nidulans, células Aspergillus niger, células Aspergillus oryzae, células Trichoderma reesei, células Chrysosporium lucknowense, células Fusarium, células Fusaqum grammaum, células Fusarium venenatum ou células Neuraspora crassa.

[00129] Em uma forma de realização, anticorpos secretados de células CHO são recuperados e purificados pelos métodos de cromatografia padrão, tal como proteína A, troca de cátion, troca de ânion, interação hidrofóbica e cromatografia de hidroxiapatite. Os anticorpos resultantes são concentrados e armazenados em 20 mM de acetato de sódio, pH 5,5.

[00130] Em outra forma de realização, os anticorpos da presente invenção são produzidos em levedura de acordo com os métodos descritos no WO2005/040395. Brevemente, os vetores que codificam uma cadeia pesada ou leve individual de um anticorpo de interesse são introduzidas nas células haplóides de levedura diferentes, por exemplo tipos de união diferentes de Pichia pastoris de levedura, no qual as células haplóides de levedura são opcionalmente auxótrofos. As células de levedura haplóide transformadas então podem ser unidas ou fundidas para dar uma célula de levedura diplóide capazes de produzir tanto as cadeias leves e cadeias pesadas. A cepa diplóide é então capaz de secretar o anticorpo reunido e biologicamente ativo. Os níveis de expressão relativos de duas cadeias podem ser otimizados, por exemplo, pelo uso de vetores com número de cópia diferente, usando os promotores transcripcionais de forças diferentes, ou indução da expressão a partir dos promotores indutíveis conduzindo a transcrição dos genes que codificam um ou ambas.

[00131] Em uma forma de realização, as cadeias leves e pesadas respectivas do anticorpo anti-TSLP são introduzidas nas células haplóides de levedura para criar uma biblioteca de cepas de levedura haplóide de um tipo de união expressando uma pluralidade de cadeias leves e uma biblioteca de cepas de levedura haplóide de um tipo de união diferente que expressa uma pluralidade das cadeias pesadas. Estas bibliotecas de cepas haplóides podem ser unidas (ou fundidas como esferoplastos) para produzir uma série de células de levedura diplóide expressando uma biblioteca combinatorial de anticorpos que compreendem várias permutações possíveis das cadeias leves e pesadas. A biblioteca combinatorial dos anticorpos então podem ser avaliados para determinar se qualquer um dos anticorpos tem propriedades que são superiores (por exemplo afinidade maior por TSLP) aqueles dos anticorpos originais. Ver. por exemplo, WO2005/040395.

[00132] Em outra forma de realização, anticorpos da presente invenção são anticorpos de domínio humano em que as porções de um domínio variável de anticorpo são ligados em um polipeptídeo de peso molecular aproximadamente 13 kDa. Ver, por exemplo, Publicação de Patente U.S. N°. 2004/0110941. Tal domínio simples, os agente de peso molecular baixo fornece as numerosas vantagens em termos do bem-estar da síntese, estabilidade e via de administração.

VIII. Usos

[00133] A presente invenção fornece os métodos para o uso de anti-TSLP projetado para o tratamento e diagnóstico de doenças inflamatórias (por exemplo, em mamíferos tal como humanos).

[00134] Em uma forma de realização preferida, o distúrbio inflamatório é asma.

[00135] Em uma forma de realização preferida, o distúrbio inflamatório é um distúrbio inflamatório alérgico. Em uma forma de realização preferida, o distúrbio inflamatório alérgico é rinosinusite alérgica, asma alérgica, conjuntivite alérgica, ou dermatite atópica.

[00136] A presente invenção fornece os métodos para o uso de anti-TSLP projetado para o tratamento e diagnóstico de fibrose, doença inflamatório do intestino, linfoma de Hodgkin, infecções virais respiratórias ou outras infecções virais, artrite reumatóride, ou qualquer outro distúrbio caracterizado pela inflamação no local do dano.

[00137] O amplo escopo desta invenção é melhor entendido com a referência aos seguintes exemplos, que não são pretendidos limitar a invenção as formas de realização específicas.

[00138] Todas as citações neste são incorporadas neste por referência na mesma extensão como se cada publicação individual ou Pedido de Patente for especificamente e individualmente indicada ser incorporado por referência.

[00139] Muitas modificações e variações desta invenção podem ser feitas sem divergir a partir do seu espírito e escopo, como será aparente aquela pessoa habilitada na técnica. As formas de realização específicas descritas neste são oferecidas por meio do exemplo apenas e a invenção é limitada pelos termos das reivindicações anexas, junto com o escopo total dos equivalentes em que tais reivindicações são intituladas; e a invenção não é limitada pelas formas de realização específicas que foram apresentadas neste por meio do exemplo.

Exemplo 1 Métodos gerais

[00140] Os métodos padrão na biologia molecular são descritos (Maniatis et al. (1982) Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY; Sambrook and Russell (2001) Molecular Cloning, 3rd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY; Wu (1993) Recombinant DNA, Vol. 217, Academic Press, San Diego, CA). Os métodos padrão também aparecem em Ausbel et al. (2001) Current Protocols in Molecular Biology, Vols.1-4, John Wiley and Sons, Inc. New York, NY, que descrevem a clonagem nas células bacterianas e mutagênese de DNA (Vol. 1), clonagem nas células de mamíferos e leveduras (Vol. 2), glicoconjugados e expressão de proteína (Vol. 3) e bioinformática (Vol. 4).

[00141] Os métodos para a purificação de proteína incluindo imunoprecipitação, cromatografia, eletroforese, centrifugação e cristalização são descritos (Coligan et al. (2000) Current Protocols in Protein Science, Vol. 1, John Wiley and Sons, Inc., New York). A análise química, modificação química, modificação pós-tradução, produção de proteína de fusão, glicosilação de proteínas são descritas (ver, por exemplo, Coligan et al. (2000) Current Protocols in Protein Science, Vol. 2, John Wiley and Sons, Inc., New York; Ausubel et al. (2001) Current Protocols in Molecular Biology, Vol. 3, John Wiley and Sons, Inc., NY, NY, pp. 16.0.5-16.22.17; Sigma-Aldrich, Co. (2001) Products for Life Science Research, St. Louis, MO; pp. 45-89; Amersham Pharmacia Biotech (2001) BioDirectory, Piscataway, N.J., pp. 384-391). A produção, purificação e fragmentação de anticorpos policlonais e monoclonais são descritos (Coligan et al. (2001) Current Protcols in Immunology, Vol. 1, John Wiley and Sons, Inc., New York; Harlow and Lane (1999) Using Antibodies, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY; Harlow and Lane, supra). As técnicas padrões para a caracterização de interações de ligando/receptor são disponíveis (ver, por exemplo, Coligan et al. (2001) Current Protcols in Immunology, Vol. 4, John Wiley, Inc., New York).

[00142] Os anticorpos de cadeia simples e diacorpos são descritos (ver, por exemplo, Malecki et al. (2002) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 99:213-218; Conrath et al. (2001) J. Biol. Chem. 276:7346-7350; Desmyter et al. (2001) J. Biol. Chem. 276:26285-26290; Hudson and Kortt (1999) J. Immunol. Methods 231:177-189; e Patente U.S. N°. 4.946.778). Os anticorpos bifuncionais são fornecidos (ver, por exemplo, Mack, et al. (1995) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92:7021-7025; Carter (2001) J. Immunol. Methods 248:7-15; Volkel, et al. (2001) Protein Engineering 14:815-823; Segal, et al. (2001) J. Immunol. Methods 248:1-6; Brennan, et al. (1985) Science 229:81-83; Raso, et al. (1997) J. Biol. Chem. 272:27623; Morrison (1985) Science 229:12021207; Traunecker, et al. (1991) EMBO J. 10:3655-3659; e Patente U.S. N°. 5.932.448, 5.532.210 e 6.129.914).

[00143] Os anticorpos biespecíficos também são fornecidos (ver, por exemplo, Azzoni et al. (1998) J. Immunol. 161:3493; Kita et al. (1999) J. Immunol. 162:6901; Merchant et al. (2000) J. Biol. Chem. 74:9115; Pandey et al. (2000) J. Biol. Chem. 275:38633; Zheng et al. (2001) J. Biol Chem. 276:12999; Propst et al. (2000) J. Immunol. 165:2214; Long (1999) Ann. Rev. Immunol. 17:875).

[00144] Os anticorpos podem ser conjugados, por exemplo, as moléculas de medicamento pequeno, enzimas, lipossomos, polietileno glicol (PEG). Os anticorpos são úteis para terapêutico, diagnóstico, kit ou outros propósitos e incluem anticorpos ligados, por exemplo, aos pigmentos, radioisótopos, enzimas, ou metais, por exemplo, ouro coloidal (ver, por exemplo, Le Doussal et al. (1991) J. Immunol. 146:169-175; Gibellini et al. (1998) J. Immunol. 160:3891-3898; Hsing and Bishop (1999) J. Immunol. 162:2804-2811; Everts et al. (2002) J. Immunol. 168:883-889).

[00145] Os métodos para a citometria de fluxo, incluindo a classificação da célula ativada por fluorescência (FACS), são disponíveis (ver, por exemplo, Owens et al. (1994) Flow Cytometry Principles for Clinical Laboratory Practice, John Wiley and Sons, Hoboken, NJ; Givan (2001) Flow Cytometry, 2° ed.; Wiley-Liss, Hoboken, NJ; Shapiro (2003) Practical Flow Cytometry, John Wiley and Sons, Hoboken, NJ). Os reagentes fluorescentes adequados para a modificação de ácidos nucleicos, incluindo iniciadores de ácido nucleico e sondas, polipeptídeos e anticorpos, para o uso, por exemplo, como reagentes diagnósticos, são disponíveis (Molecular Probes (2003) Catalogue, Molecular Probes, Inc., Eugene, ou; Sigma-Aldrich (2003) Catalogue, St. Louis, MO).

[00146] Os métodos padrão de histologia do sistema imune são descritos (ver, por exemplo, Muller-Harmelink (ed.) (1986) Human Thymus: Histopathology and Pathology, Springer Verlag, New York, NY; Hiatt, et al. (2000) Color Atlas of Histology, Lippincott, Williams e Wilkins, Phila, PA; Louis, et al. (2002) Basic Histology:Text and Atlas, McGraw-Hill, New York, NY).

[00147] As embalagens de software e bancos de dados para a determinação, por exemplo, fragmentos antigênicos, sequências líderes, dobra de proteína, domínios funcionais, locais de glicosilação e alinhamentos de sequência, são disponíveis (ver, por exemplo, GenBank, Vector NTI® Suite (Informax, Inc, Bethesda, MD); GCG Wisconsin Package (Accelrys, Inc., San Diego, CA); DeCypher® (TimeLogic Corp., Crystal Bay, Nevada); Menne et al. (2000) Bioinformatics 16: 741-742; Menne et al. (2000) Bioinformatics Applications Note 16:741-742; Wren et al. (2002) Comput. Methods Programs Biomed. 68:177-181; von Heijne (1983) Eur. J. Biochem. 133:1721; von Heijne (1986) Nucleic Acids Res. 14:4683-4690).

Exemplo 2

[00148] Otimização da sequência de anticorpo anti-TSLP para evitar os problemas de desamidação

[00149] Um anticorpo humanizado que liga-se a TSLP humano e cino foi divulgado na Publicação de Patente Internacional WO2008/076321. Na análise adicional desta sequência, o inventor identifica que o CDR-H2 do anticorpo contém dois resíduos de asparagina (N) nas posições 61 e 63 da SEQ ID N°: 4 do WO2008/076321 que deve potencialmente desamidar e portanto interromper a estrutura do anticorpo potencialmente causando diversos problemas involuntários afetando a segurança e/ou eficácia do anticorpo. A fim de evitar estes problemas, os inventores criam um anticorpo melhorado que evita estes problemas de desamidação, já preservado a afinidade para TSLP humano e cino e ainda evita os problemas adicionais a imunogenicidade. Este anticorpo melhorado compreende a sequência de aminoácido de cadeia pesada variável da SEQ ID N°: 7. O CDR-H2 desta sequência de aminoácido corresponde a SEQ ID N°: 2.

[00150] A Figura 1 fornece um alinhamento da SEQ ID N°: 11 da aplicação presente contra a SEQ ID N°: 14 de WO2008/076321 (isto é, um alinhamento da cadeia pesada do anticorpo reivindicado neste e o anticorpo divulgado no WO2008/076321. Na figura 1, “sequência 1” corresponde a SEQ ID N°: 11 da aplicação presente e “sequência 2” corresponde a ID N°:14 de WO2008/076321. No anticorpo reivindicado neste, a asparagina (N) na posição na posição 61 da SEQ ID N°: 14 de WO2008/076321 foi mudada a alanina (A) e a asparagina na posição 63 da SEQ ID N°: 14 foi mudada a lisina (K). Estas mudanças foram feitas para evitar a desamidação potencial destes resíduos. Adicionalmente, a lisina (K) na posição 65 da SEQ ID N°: 4 de WO2008/076321 foi mudada a Glutamina (Q). Esta mudança foi feita para diminuir as mudanças da criação da imunogenicidade. Uma mudança adicional foi feita na posição 72 da SEQ ID N°: 14 do WO2008/076321, onde uma treonina (T) foi mudada a uma alanina (A). Esta mudança foi feita para melhorar a afinidade de ligação do anticorpo.

[00151] Foi surpreendentemente observado que as mudanças em CDR-H2 não substancialmente afetam a afinidade de ligação do anticorpo resultante.

[00152] Um vetor contendo os genes que codifica uma cadeia leve e pesada do anticorpo divulgado neste foi depositado com o ATCC, 10801 University Blvd., Manassas, VA 20110-2209, em 17 de Novembro de 2009 e recebido depósito ATCC N°. PTA-10482. Este depósito foi feito sob as condições fornecidas pelo Tratado de budapeste. A sequência de ácido nucleico codifica uma cadeia leve e pesada (incluindo peptídeos de sinal) são em um plasmídeo simples e ambos genes são expressados a partir do promotor de citomegalovírus humano (CMV). O plasmídeo também contém um gene resistente à ampicilina para a seleção nas células de mamíferos e um gene DHFR para a amplificação do gene.

Exemplo 3 Determinação do constante de dissociação de equilíbrio (KD) para o TSLP anti-humano humanizado usando tecnologia KinExA

[00153] A constante de dissociação de equilíbrio (KD) foi determinada usando o instrumento KinExA 3000 (Sapidyne Instruments Inc., www.sapidyne.com). O KinExA usa os princípios do método ensaio Kinetic Exclusion com base na medição da concentração do anticorpo não complexo em uma mistura de anticorpo, antígeno e complexo do antígeno de anticorpo. A concentração do anticorpo livre é medido pela mistura a um antígeno imobilizado de fase sólida por um período muito breve de tempo. Na prática, este é acompanhado para fluir partículas revestidas de antígeno da pasta da mistura de anticorpo de antígeno de fase de solução presa em um fluxo celular. Os dados gerados pelo instrumento são analisados usando o software de costume. As constantes de equilíbrio são calculadas usando uma teoria matemática com base nas seguintes suposições: 1. A ligação segue a equação de ligação reversível para equilíbrio: kon [Ab] [Ag] = koff[AbAg] 2. Anticorpo e antígeno liga-se 1:1 e anticorpo total igual ao complexo de anticorpo de antígeno mais livre de anticorpo. 3. Sinal de instrumento é linearizado relacionado a concentração de anticorpo livre. Materiais Anticorpos: • Anticorpo 1: anticorpo de rato parental 23B12 • Anticorpo 2: anti hu TSLP mAb 23B12 humanizado (compreende a cadeia pesada da SEQ ID N°: 14 e a cadeia leve da SEQ ID N°: 16 de WO2008/076321) • Anticorpo 3: anti hu TSLP mAb 23B12 humanizado (compreende a cadeia pesada da SEQ ID N°: 14 com uma mutação na posição 72 de T a A e a cadeia leve da SEQ ID N°: 16 do WO2008/076321 • Anticorpo 4: anti hu TSLP mAb 23B12 humanizado (compreende a cadeia pesada da SEQ ID N°: 11 e a cadeia leve da SEQ ID N°: 12 da aplicação presente) Antígenos: • TSLP recombinante humano Antígenos biotinilados: • TSLP humano Biotinilados Outros reagentes: • Partículas PMMA, 98 mícron (Sapidyne, Cat N°. 440198) • Neutravidina (Pierce, Cat N°. 31000) • IgG anti-rato de cabra conjugado por Cy5 (H+L) (Jackson Immunoresearch Laboratories Cat. N° 112-175-167, Lote 60306) • anti-HuIgG de cabra conjugado por Cy5 (H+L) (Jackson Immunoresearch Laboratories Cat. N°. 109-175-088, lote 49069 e lote 58552 ) Condições experimentais:

[00154] As partículas PMMA foram revestidas com TSLP humano biotinilado de acordo com o Sapidyne “Protocol for coating PMMA particles with biotinylated ligands having short ou nonexistent linker arms”. Todos os procedimentos experimentais foram feitos de acordo com um manual KinExA 3000. Todas as séries foram feitas em duplicatas. As seguintes condições foram usadas: Amostra de volume: 2 mL Amostra de taxa de fluxo: 0,25 mL/min Rótulo do volume: 1 mL Rótulo de taxa de fluxo: 0,25 mL/min Anticorpo conc.: 0,1 nM Conc. de antígeno maior: 10 nM Conc. de antígeno menor.: 10 pM

[00155] As diluições em duas séries seriais do antígeno foram preparadas e misturadas com o anticorpo na concentração da constante. A mistura foi incubada por 2 horas a 25° C para equilibrar. Tabela 3 Valores KD determinados por KinExa

Exemplo 4 Afinidade dos anticorpos para TSLP humano e cino

[00156] As atividades de ligação cinética de rato parental e vários anticorpos TSLP derivados humanizados anti-humano contra tanto o macaco cinomólgo (cino) TSLP quanto humano (hu) e foram medidos pela resonância de plasmon superfície usando um sistema BIAcore T100 (BIAcore AB, Upsalla, Sweden). Aproximadamente 100RUs de TSLP humano ou cino TSLP foram imobilizados por intermédio a química de ligação amina em um Sensor Chip CM5 (grau Research, BR-1006-68). Tampão HBS-EP (BR-1006-69) foi usado como o tampão de realização com uma taxa de fluxo de 30μL/min. Os anticorpos 23B12 de rato e humanizados nas concentrações variando de 0,82 a 600 nM foram injetadas nas superfícies hu ou cino TSLP em uma taxa de fluxo de 30μL/min. Seguindo cada ciclo de injeção da superfície CM5 chip foi regenerado usando uma série de soluções (10 mM de glicina pH 1,5 e 25 mM de NaOH respectivamente) em uma taxa de fluxo de 75μL/min.

[00157] Os sensogramas de ligação de subtração de fundamento foram usados para análise a constante taxa de associação (ka) e dissociação (kd) e constante de dissociação de equilíbrio KD. As séries dos dados resultantes foram ajustados com um modelo de analito bivalente usando o software BIAevaluation (versão 1.0). O KD determinado por vários anticorpos são mostrados na Tabela 4. Os resultados dos experimentos individuais são mostrados nas linhas separadas. Tabela 4 Análise BIAcore

* Este experimento particular usado TSLP adquirido de R&D e expressado em E. coli. Os outros experimentos foram conduzidos com TSLP expressado nas células HEK293. ** Estes experimentos foram conduzidos a 37° C. Todos os outros experimentos foram conduzidos em temperatura ambiente. Anticorpo 1: 23B12 anticorpo de rato parental Anticorpo 2: anti hu TSLP mAb 23B12 humanizado (compreende a cadeia pesada da SEQ ID N°: 14 e a cadeia leve da SEQ ID N°: 16 de WO2008/076321) Anticorpo 3: anti hu TSLP mAb 23B12 humanizado (compreende a cadeia pesada da SEQ ID N°: 14 com uma mutação na posição 72 de T a A; e a cadeia leve da SEQ ID N°: 16 de WO2008/076321) Anticorpo 4: anti hu TSLP mAb 23B12 humanizado (compreende a cadeia pesada da SEQ ID N°: 11 e a cadeia leve da SEQ ID N°: 12 da aplicação presente)

Exemplo 5 Bioensaio de proliferação para a avaliação da neutralização do anticorpo anti- TSLP

[00158] A capacidade de vários anticorpos anti-TSLP para neutralizar biologicamente TSLP humano e cino foi avaliado pela aplicação dos bioensaios de proliferação de termo curto que utilizam as células que expressam os receptores TSLP humano recombinante e cino. As células Ba/F3-TSLPR-IL7Ra trasnfectantes proliferam em resposta a TSLP e a resposta pode ser inibida pela neutralização do anticorpo anti-TSLP. Cada anticorpo foi titulado contra uma concentração de TSLP escolhidos dentro da região linear da curva de resposta de dosagem TSLP, platô próximo e acima o TSLP EC50. A proliferação, ou necessidade deste, é medido pelos meios colorimétricos usando Alamar Blue, um pigmento indicador de desenvolvimento com base na detecção da atividade metabólica. A capacidade de um anticorpo para neutralizar TSLP é avaliada por seu valor EC50, ou concentração de anticorpo que induz a inibição de metade máxima de proliferação TSLP.

[00159] Os transfectantes Ba/F3 são mantidos no meio RPMI- 1640, 10 % de soro de bezerro fetal, 50 μM de 2-mercaptoetanol, 2 mM de L- Glutamina, 50 μg/mL de penicilina-estreptomicina e 10 ng/mL de camundongo IL-3.

[00160] Os bioensaios de proliferação Ba/F3 são realizados no meio RPMI-1640, 10 % de soro bezerro fetal, 50 μM de 2-mercaptoetanol, 2 mM de L-Glutamina e 50 μg/mL de penicilina-estreptomicina.

[00161] O ensaio é realizado nas placas fundas planas de 96 reservatórios (Falcon 3072 ou similar). Todas as preparações dos reagentes e suspensões celulares utilizam o meio de bioensaio apropriado. O volume do ensaio é 150 μL por reservatório. As titulações de um anticorpo anti-TSLP são pré-incubadas com TSLP por 30-60 minutos em temperatura ambiente, durante o qual o tempo das células são preparados. As células são adicionadas as placas seguindo a pré-incubação de citocina-anticorpo. As placas de bioensaio são incubadas em uma câmara de cultura de tecido umidificada (37C, 5 % de CO2) por 40-48 horas. No final do tempo de cultura, Alamar Blue (Biosource Cat #DAL1100) é adicionado e deixado desenvolver por 8 a 12 horas. A absorbância é lida a 570 nm e 600 nm (leitor de microplaca VERSAmax, sondas moleculares) e um OD570-600 é obtida. As duplicatas ou triplicatas são recomendadas.

[00162] As células são usadas em um estado de desenvolvimento saudável, geralmente nas densidades de 3-8 x 105/mL. As células são contadas, granuladas, lavadas duas vezes no meio de bioensaio e recolocadas em suspensão na densidade apropriada pela colocação em placas.

[00163] O TSLP foi preparado para trabalhar a concentração e adicionar ao primeiro reservatório em 75 μL. As diluições em séries de 1:3 foram feitas pela titulação 25:50 μL em um meio de bioensaio cruzando os reservatórios, levando 50 μL/reservat0rio. As células foram recolocadas em suspensão a densidade apropriada pela colocação em placas de 100 μL por reservatório.

[00164] O anticorpo foi preparado para trabalhar a concentração e adicionar ao primeiro reservatório em 75 μL. As diluições em séries de 1:3 foram feitas pela titulação 25:50 μL em um meio de bioensaio cruzando os reservatórios, levando 50 μL/reservat0rio. TSLP na concentração apropriada foi adicionada a 50 μL por reservatório aos reservatórios contendo o anticorpo titulador. As células foram recolocadas em suspensão a densidade apropriada pela colocação em placas de 50 μL por reservatório e adicionada seguindo a pré-incubação de citocina-anticorpo.

[00165] Usando o software GraphPad Prism 3.0, a absorbância foi plotada contra a citocina ou concentração anticorpo e os valores EC50 foram determinados usando a regressão não linear (ajuste de curva) da resposta de dosagem sigmoidal.

[00166] Os resultados do ensaio são mostrados na Tabela 5. Os resultados dos experimentos individuais são mostrados nas linhas separadas. Tabela 5 Inibição da proliferação

* Este experimento particular usado TSLP adquirido de R&D e expressado em E. coli. Os outros experimentos foram conduzidos com TSLP expressados nas células HEK293. Anticorpo 1: 23B12 de anticorpo de rato parental Anticorpo 2: anti hu TSLP mAb 23B12 humanizado (compreende a cadeia pesada da SEQ ID N°: 14 e a cadeia leve da SEQ ID N°: 16 de WO2008/076321) Anticorpo 3: anti hu TSLP mAb 23B12 humanizado (compreende a cadeia pesada da SEQ ID N°: 14 com uma mutação na posição 72 de T a A; e a cadeia leve da SEQ ID N°: 16 de WO2008/076321) Anticorpo 4: anti hu TSLP mAb 23B12 humanizado (compreende a cadeia pesada da SEQ ID N°: 11 e a cadeia leve da SEQ ID N°: 12 da aplicação presente)

[00167] Um resumo dos resultados apresentados na Tabela 5 incluindo valores médios e SD (desvio padrão) é fornecido na Tabela 6. (apenas os valores obtidos usando TSLP expressados nas células HEK293 foram usados para calcular os valores fornecidos na Tabela 6.)

Exemplo 6 Neutralização da atividade de Anti-TSLP na produção TARC induzida por TSLP pelas células dendríticas primárias humanas

[00168] As células mononucleares sanguíneas periféricas (PBMCs) foram isoladas a partir dos revestimentos inflados obtidos de doadores sanguíneos saudáveis (Stanford Medical School Blood Center, Stanford, CA) pela centrifugação Ficoll e células dendríticas CD11c+ foram obtidas por MACS (Miltenyi Biotech, Auburn, CA) usando a seleção negativa seguida pela classificação da célula usando um FACS. As células negativas de linhagem (Lin-) foram obtidas pela anulação MACS das células T, células B, células NK, células sanguíneas vermelhas e forma de monócitos PBMC usando o CD3 mAb anti-humano de camundongo (OKT3, DNAX) e anti- CD16 mAb de camundongo e IgG anti-camundongo de cabra revestido por pérolas magnéticas (Miltenyi Biotech) e usando as pérolas magnéticas diretamente revestidas com anti-CD19, CD56 e CD14 mAbs (Miltenyi Biotech). Subsequentemente, as células Lin- foram tingidas com TC-anti-CD4 (Caltag, Burlingame, CA), PE-anti-CD11c e FITC-anti-CD3, -CD14, -CD19, -CD56, -CD16 e -CD20 (all BD Biosciences, San Diego, CA) e CD11c+ DC classificado em um Vantage FACsorter™ (BD Biosciences) em uma pureza de > 99 % das células CD11c+ CD4+ Lin-.

[00169] Os CD11c+ CD4+ DCs foram cultivados imediatamente após a classificação em RPMI (Mediatech, Herndon, VA) contendo 10 % de FCS e 1 % de piruvato (Mediatech), HEPES (Invitrogen, Grand Island, NY) e penicilina-estreptomicina (Mediatech). As células foram semeadas a 0,5 x 106/ml nas placas de 96 reservatórios de parte funda plana na presença do meio sozinho, TSLP (15 ng/ml, DNAX), ou em uma combinação de TSLP e a neutralização anti-TSLP mAb (clone 23B12) ou um anticorpo monoclonal anti-TSLPR ou um IgG2a de rato de controle de isotipo (sistemas R&D, Minneapolis, MN). Os sobrenadantes de cultura DC foram coletados após 24 horas de cultura, armazenados congelados a -20o C e analisados pelos níveis de proteína TARC por ELISA (sistemas R&D).

[00170] Os resultados são resumidos na Tabela 7. Os resultados dos experimentos individuais são mostrados nas linhas separadas.

* Estes experimentos usados TSLP adquiridos de R&D e expressados em E. coli. Os outros experimentos foram conduzidos com TSLP expressado nas células HEK293. Anticorpo 1: 23B12 anticorpo de rato parental Anticorpo 4: anti hu TSLP mAb 23B12 humanizado (compreende a cadeia pesada da SEQ ID N°: 11 e a cadeia leve da SEQ ID N°: 12 da aplicação presente)

[00171] Um resumo dos resultados apresentados na Tabela 7 incluindo valores médios e SD (desvio padrão) é fornecido na Tabela 8.

* Estes experimentos usados TSLP adquiridos de R&D e expressados em E. coli. Os outros experimentos foram conduzidos com TSLP expressados nas células HEK293.

Exemplo 7 Neutralização da atividade de anticorpos anti-TSLP em produção MDC induzida por TSLP pelos esplenócitos de macaco cinomólgo

[00172] As suspensões de esplenócito total foram preparados a partir do baço de Macaco cinomólgo pelo rompimento do tecido e passagem através da peneira de tecido de aço inoxidável de trama 50 (Bellco) seguido pela passagem através de um micrômetro 70 Nylon Cell strainer (BD Falcon). As suspensões celulares foram lavadas em DPBS pela centrifugação e os grânulos celulares foram recolocados em suspensão no tampão de líse ACK pré-aquecido a 37o C (BioWhittaker) para lisar as células sanguíneas vermelhas e incubadas por 5 minutos a 37o C. As células foram diluídas em DPBS, lavadas duas vezes e recolocadas em suspensão no meio de cultura.

[00173] Os esplenócitos foram cultivados em RPMI (Mediatech, Herndon, VA) contendo 10 % de FCS e 1 % de piruvato (Mediatech), HEPES (Invitrogen, Grand Island, NY) e estreptomicina- penicilina (Mediatech). As células foram semeadas a 1,0 x 106/ml em placas de 96 reservatórios com parte funda plana na presença do meio sozinho, TSLP (0,1 ng/ml), ou em uma combinação de TSLP e a neutralização de anti-TSLP mAb (Anticorpo 1 ou Anticorpo 4). Os sobrenadantes de cultura de esplenócito foram coletados após 120 horas de cultura, armazenados congelados a -20o C e analisados pelos níveis de proteína MDC por um MDC ELISA humano (sistemas R&D).

[00174] Os resultados são resumidos na Tabela 9. Os resultados dos experimentos individuais são mostrados nas linhas separadas.

Anticorpo 1: 23B12 anticorpo de rato parental Anticorpo 4: anti hu TSLP mAb 23B12 humanizado (compreende a cadeia pesada da SEQ ID N°: 11 e a cadeia leve da SEQ ID N°: 12 da aplicação presente)

[00175] Muitas modificações e variações desta invenção podem ser feitas sem divergir do espírito e escopo, como será evidente aquela pessoa habilitada na técnica. As formas de realização específicas descritas neste são oferecidas por meio apenas do exemplo e a invenção será limitada pelos termos das reivindicações anexas, junto com o escopo total de equivalentes em que tais reivindicações são intituladas e a invenção não será limitada pelas formas de realização específicas que foram apresentadas neste por meio do exemplo.

[00176] A referência das publicações ou documentos acima não são pretendidas como uma admissão que qualquer um dos precedentes são apropriadas na técnicas anterior ou constituem qualquer admissão como os conteúdos ou dados destas publicações ou documentos. As Patentes U.S. e outras publicações referenciadas neste são portanto incorporadas por referência. LISTAGEM DE SEQUÊNCIA

[00177] A presente invenção inclui qualquer polipeptídeo isolado ou ácido nucleico isolado incluindo qualquer um dos seguintes aminoácidos ou sequências de nucleotídeos, respectivamente:

Claims (10)

1. Anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo que se liga especificamente o TSLP humano, caracterizado pelo fato de que compreende: uma região variável de cadeia pesada que compreende: uma sequência CFR-H1 compreendendo SEQ ID NO:1, uma sequência de CDR- H2 que compreende SEQ ID N°: 2 e uma sequência compreendendo SEQ ID NO:3; e uma região variável de cadeia leve que compreende: uma sequência CDR-L1 compreendendo SEQ ID NO:4, uma sequência CDR-L2 compreendendo SEQ ID NO:5, e uma sequencia CDR-L3 compreendendo SEQ ID NO: 6.

2. Anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a região variável de cadeia pesada compreende a sequência de aminoácido da SEQ ID N°: 7.

3. Anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a região variável de cadeia pesada compreende a sequência de aminoácido da SEQ ID N°: 7 e a região variável de cadeia leve compreende a sequência de aminoácido da SEQ ID N°: 8.

4. Anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que é um anticorpo que compreende a SEQ ID N°: 11 e SEQ ID N° 12.

5. Anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que pode ser expresso a partir do vetor depositado sob o Depósito ATCC N° PTA-10482.

6. Anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado pelo fato de que o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo é um anticorpo humanizado ou um fragmento de ligação de TSLP do mesmo.

7. Anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1, 3 e 5 a 6, caracterizado pelo fato de que é um fragmento de anticorpo de ligação de TSLP selecionado a partir do grupo que consiste em Fab, Fab’, Fab’-SH, Fv, scFv, F(ab’)2 e um diacorpo.

8. Composição, caracterizada pelo fato de que compreende o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo como definido na reivindicação 1 a 7 em combinação com um carreador ou diluente farmaceuticamente aceitável.

9. Uso do anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo como definido na reivindicação 1 a 7, caracterizado pelo fato de ser para a manufatura de um medicamento para o tratamento de distúrbios inflamatórios, fibrose, doença inflamatória intestinal ou linfoma de Hodgkin.

10. Uso de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que o distúrbio inflamatório é rinossinusite alérgica, asma alérgica, conjuntivite alérgica ou dermatite atópica.

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