CN102782149B

CN102782149B - 经工程改造的抗-tslp抗体

Info

Publication number: CN102782149B
Application number: CN201080060560.6A
Authority: CN
Inventors: L.G.普雷斯塔
Original assignee: Schering Corp
Current assignee: Merck Sharp and Dohme BV
Priority date: 2009-11-04
Filing date: 2010-11-02
Publication date: 2014-11-12
Anticipated expiration: 2030-11-02
Also published as: US20140141012A1; JP2013509862A; EP2496707B1; CA2779384C; MY162511A; CA2779384A1; BR112012010707A2; MX2012005180A; CO6531489A2; EP2496707A1; EP3594356A1; JP2016175894A; CL2012001179A1; ECSP12011879A; CN102782149A; ES2784123T3; RU2012122816A; KR20120102623A; US20120219565A1; IL219204A0

Abstract

本发明涉及特异性地结合人TSLP的结合化合物及其用途，例如在治疗炎性障碍和变应性炎症应答中的用途。

Description

经工程改造的抗-TSLP抗体

本申请要求2010年1月21日提交的美国临时专利申请号61/297,008和2009年11月4日提交的美国临时专利申请号61/258,051的权益，它们每篇通过引用整体并入本文。

技术领域

本发明一般地涉及胸腺基质淋巴细胞生成素(TSLP)特异性的抗体及其用途，特别是在炎性障碍和变应性炎性障碍中的用途。

背景技术

TSLP是一种诱导树突细胞介导的CD4⁺T细胞应答的免疫细胞因子，其中由TSLP活化的前同种异体(proallogenic)表型树突细胞(DC)在变应性炎性Th2和肥大细胞应答的诱导和维持中起重要作用，这通过前变应原的(proallergenic)细胞因子、趋化因子和共刺激分子的生成而实现，它们指导原初T细胞变成Th2细胞，生成变应性炎症的IL-4、IL-5和IL-13关键介质。TSLP在特应性皮炎(AtD)、内瑟顿综合征和哮喘中的过表达，指示该细胞因子在这些变应性炎性疾病的发病机制中的重要作用。这得到动物模型的支持，在所述动物模型中，TSLP在皮肤或肺中的转基因过表达以及通过TSLP的负调节子的基因靶效应的去除会导致与人特应性皮炎或哮喘非常类似的变应性炎性疾病。本发明提供了经工程改造的TSLP抗体及其用于治疗炎性障碍、特别是变应性炎性障碍(包括哮喘和特应性皮炎)的用途。

本发明避免了现有技术抗体的潜在去酰胺化(deamidation)问题。Asn(N)残基的去酰胺化是蛋白质的常见降解，它可以显著影响蛋白质结构和功能。在抗体中，位于CDR中的Asn(N)可以快速地发生去酰胺化，且可以导致抗体-抗原相互作用的变化，并因此代表在基于抗体的治疗剂的开发过程中的一个严重问题。参见，例如，Vlaska等人，Analytical Biochemistry392：145-154(2009)。因而，重要的是，在意图开发用于人类使用的抗体中，避免这些潜在的去酰胺化问题。此外，重要的是，避免这些问题，并且不改变抗体的任何重要特征(诸如结合亲和力)。

发明内容

本发明提供了一种特异性地结合人TSLP的结合化合物，所述结合化合物包含至少一个抗体重链可变区或其TSLP结合片段，所述重链可变区包含SEQ ID NO：2。

本发明也提供了一种特异性地结合人TSLP的结合化合物，所述结合化合物包含至少一个抗体重链可变区或其TSLP结合片段，所述重链可变区至少包含SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：1，或者SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3。

本发明也提供了一种特异性地结合人TSLP的结合化合物，所述结合化合物包含至少一个抗体重链可变区或其TSLP结合片段，所述重链可变区包含SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3。

本发明的结合化合物可以另外包含一个抗体轻链可变区或其TSLP结合片段。在一个实施方案中，所述抗体轻链可变区或其TSLP结合片段包含至少一个选自下述的序列：SEQ ID NO：4、5和6。在另一个实施方案中，所述抗体轻链可变区或其TSLP结合片段包含至少2个选自下述的序列：SEQ ID NO：4、5和6。在其它实施方案中，所述抗体轻链可变区或其TSLP结合片段具有在SEQ ID NO：4、5和6中所述的3个序列。

在上述的结合化合物的一些实施方案中，重链可变区的全部或基本上全部剩余部分(remainder)完全是或基本上完全是人Ig区；轻链可变区的全部或基本上全部剩余部分完全是或基本上完全是人Ig区。在优选的实施方案中，重链可变区的剩余部分是人重链氨基酸序列，轻链可变区的剩余部分是人轻链氨基酸序列。

本发明也提供了一种特异性地结合人TSLP的结合化合物，所述结合化合物包含，包含选自下述的序列的重链可变区：(i)SEQ ID NO：7；(ii)SEQ ID NO：7或包含最多3个修饰的氨基酸残基的变体；和(iii)与SEQ ID NO：7具有至少97％同源性的序列。在一个实施方案中，所述重链可变区包含在SEQ ID NO：7中所示的序列。在一些实施方案中，本发明的结合化合物另外包含轻链可变区。在一个实施方案中，所述轻链可变区包含选自下述的序列：(i)SEQ ID NO：8；(ii)SEQ ID NO：8或包含最多3个修饰的氨基酸残基的变体；和(iii)与SEQ ID NO：8具有至少97％同源性的序列。在一个实施方案中，所述轻链可变区包含在SEQ ID NO：8中所示的序列。

在一个优选的实施方案中，所述结合化合物包含：包含在SEQ ID NO：7中所示的序列的重链可变区和包含在SEQ ID NO：8中所示的序列的轻链可变区。

在一些实施方案中，本发明的结合化合物还包含重链恒定区和/或轻链恒定区。在一些实施方案中，所述重链恒定区包含γ1、γ2、γ3或γ4人重链恒定区或其变体。在其它实施方案中，所述轻链恒定区包含λ或κ人轻链恒定区。

在一些实施方案中，本发明的结合化合物是抗体或其抗原结合片段。在不同的实施方案中，本发明的抗体或其片段是多克隆的、单克隆的、嵌合的、食蟹猴源化的(cynoized)、人源化的或全人的。在一个优选的实施方案中，所述抗体是人源化抗体或其片段。

本发明还设想到，所述结合片段是选自Fab、Fab’、Fab’-SH、Fv、scFv、F(ab’)₂和diabody的抗体片段。本发明还设想到，所述结合化合物是纳米抗体(nanobody)、亲和体(avimer)或适体(aptimer)。

在一个实施方案中，所述结合化合物是抗体，所述抗体含有包含SEQ ID NO：11的重链。在一个实施方案中，所述结合化合物含有包含SEQ ID NO：11的重链和包含SEQ ID NO：12的轻链。

在另一个优选的实施方案中，本发明的结合化合物结合人和食蟹猴TSLP。

在一个实施方案中，本发明的结合化合物可以由在ATCC保藏号PTA-10482下保藏的表达载体来表达。

在另一个实施方案中，本发明的结合化合物包含可以由在ATCC保藏号PTA-10482下保藏的表达载体来表达的重链和轻链。在另一个实施方案中，本发明的结合化合物包含可以由在ATCC保藏号PTA-10482下保藏的表达载体来表达的重链可变区和轻链可变区。在另一个实施方案中，本发明的结合化合物包含由在ATCC保藏号PTA-10482下保藏的表达载体表达的抗体的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3和CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3区。

在另一个实施方案中，本发明的结合化合物包含可以由在ATCC保藏号PTA-10482下保藏的表达载体来表达的重链。在另一个实施方案中，本发明的结合化合物包含可以由在ATCC保藏号PTA-10482下保藏的表达载体来表达的重链可变区。在另一个实施方案中，本发明的结合化合物包含由在ATCC保藏号PTA-10482下保藏的表达载体表达的抗体的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3区。

本发明也提供了分离的核酸，其编码本发明的结合化合物。在一个实施方案中，本发明包括一种核酸，所述核酸编码本发明的结合化合物(例如抗体或抗体片段)的重链可变区。在另一个实施方案中，本发明包括一种核酸，所述核酸编码一种包含重链可变区的结合化合物，其中所述重链可变区包含SEQ ID NO：1、 SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3。在另一个实施方案中，本发明包括一种核酸，所述核酸编码SEQ ID NO：7。在另一个实施方案中，本发明包括一种核酸，所述核酸编码SEQ ID NO：2。在一个实施方案中，本发明包括一种核酸，所述核酸编码重链可变区，所述重链可变区由在ATCC保藏号PTA-10482下保藏的表达载体编码。本发明也提供了表达载体，所述表达载体包含与控制序列可操作地相连的本发明的核酸，当用所述载体转染宿主细胞时，所述控制序列会被宿主细胞识别。在一个实施方案中，本发明提供了在ATCC保藏号PTA-10482下保藏的表达载体。还提供了包含这些表达载体的宿主细胞和使用这些表达载体来生产多肽的方法。在一个实施方案中，所述宿主细胞包含在ATCC保藏号PTA-10482下保藏的表达载体。所述生产多肽的方法包括下述步骤：在表达所述核酸序列的条件下，在培养基中培养所述宿主细胞，从而生产包含轻链和重链可变区的多肽；并从所述宿主细胞或培养基回收所述多肽。在一个实施方案中，本发明包括生产多肽的方法，所述方法包括下述步骤：在表达所述载体的条件下，在培养基中培养包含在ATCC保藏号PTA-10482下保藏的表达载体的宿主细胞，从而生产包含轻链和重链可变区的多肽；并从所述宿主细胞或培养基回收所述多肽。

本发明包括抑制人受试者中的免疫应答的方法，所述方法包括：以有效地阻断TSLP的生物活性的量，将特异性地结合人TSLP的根据本发明的结合化合物施用给有此需要的受试者。本发明还设想到，施用另外的免疫抑制剂或抗炎剂。在一个优选的实施方案中，所述免疫应答是哮喘。在另一个优选的实施方案中，所述免疫应答是变应性炎症。在另一个优选的实施方案中，所述变应性炎症是变应性鼻窦炎、变应性哮喘、变应性结膜炎或特应性皮炎。在另一个优选的实施方案中，所述免疫应答是纤维化、炎性肠病或霍奇金淋巴瘤。在另一个优选的实施方案中，将结合化合物与另一种免疫调节剂组合施用。

本发明的结合化合物可以是在组合物中，所述组合物包含与药学上可接受的载体或稀释剂组合的本发明的结合化合物(例如抗体或其片段)。在又一个实施方案中，所述组合物另外包含免疫抑制剂或抗炎剂。

在不同的实施方案中，本发明涉及包含本发明的结合化合物(例如抗体或其片段)的药物。例如，本发明包括特异性地结合人TSLP的结合化合物用于制备抑制免疫应答的药物的用途。本发明包括特异性地结合人TSLP的结合化合物(例如，根据本发明的任一种结合化合物)用于制备治疗哮喘的药物的用途。本发明包括特异性地结合人TSLP的结合化合物用于制备治疗炎性障碍的药物的用途。在一个实施方案中，所述炎性障碍是变应性炎性障碍。在一个实施方案中，所述变应性炎性障碍是变应性鼻窦炎、变应性哮喘、变应性结膜炎或特应性皮炎。在一个优选的实施方案中，所述变应性炎性障碍是变应性哮喘。在另一个优选的实施方案中，所述变应性炎性障碍是特应性皮炎。例如，本发明的抗体和片段可以用于治疗人。

附图说明

图1.本申请的SEQ ID NO：11与WO2008/076321的SEQ ID NO：14的比对。

具体实施方式

在本文及所附权利要求书中用到的词语的单数形式，诸如“一个”、“一种”和“所述”，包括它们的相应的复数指代，除非上下文另外清楚地指明。在本文中引述的所有参考文献都通过引用并入本文，其程度如同具体地且单独地指出每篇单独的出版物、专利申请或专利通过引用并入本文。

I.定义

“活化”、“刺激”和“治疗”当应用于细胞或受体时，可具有相同的含义，例如用配体对细胞或受体进行的活化、刺激或治疗，除非上下文另外指示或者明确地指示。“配体”包括天然的和合成的配体，例如细胞因子、细胞因子变体、类似物、突变蛋白和衍自抗体的结合组合物(binding composition)。“配体”还包括小分子，例如细胞因子的肽模拟物和抗体的肽模拟物。“活化”可指由内部机制调节的细胞活化，以及由外部或环境因素调节的细胞活化。例如，细胞、组织、器官或生物体的“应答”，包括生化或生理行为的变化，所述生化或生理行为是：例如，生物区室(compartment)中的浓度、密度、黏附或迁移，基因表达的速度，或者分化的状态，其中所述变化与活化、刺激或治疗相关，或者与内部机制如遗传编程相关。

分子的“活性”可描述或者指分子与配体或与受体的结合，指催化活性；指刺激基因表达或细胞信号传递、分化或成熟的能力；指抗原活性，指对其它分子的活性的调节，等等。“活性”也可指比活，例如[催化活性]/[mg蛋白质]或[免疫活性]/[mg蛋白质]，生物区室中的浓度，等等。

“施用”和“治疗”当应用于动物、人、实验受试者、细胞、组织、器官或生物流体时，指外源性的药物、治疗剂、诊断剂或组合物与所述动物、人、受试者、细胞、组织、器官或生物流体进行接触。“施用”和“治疗”可指例如治疗方法、药代动力学方法、诊断方法、研究方法和实验方法。细胞的治疗包括：使试剂(reagent)与细胞接触以及使试剂与流体接触，其中所述流体与所述细胞接触。“施用”和“治疗”还意指体外(in vitro)和离体(ex vivo)治疗，例如，用试剂、诊断剂、结合组合物或另一种细胞对一种细胞的体外和离体治疗。“治疗”当应用于人受试者、兽医受试者或研究受试者时，指医疗性治疗、预防性或防止性措施，指研究和诊断应用。

“结合化合物”指包含一个或多个特异性地结合人TSLP的氨基酸序列的分子。在一个优选的实施方案中，所述结合化合物是抗体，优选分离的抗体。在另一个优选的实施方案中，所述结合化合物包含抗体的抗原结合片段。

“结合组合物”指与稳定剂、赋形剂、盐、缓冲剂、溶剂或添加剂相组合的、能够结合靶标的TSLP结合化合物。

本发明的范围也包括复合物，其包含与TSLP多肽或其抗原片段络合的本发明的任意抗体或其抗原结合片段。通过使所述抗体或片段接触TSLP多肽或抗原片段，可以制备复合物。

本文所用的术语“抗体”指，能显示期望的生物活性的任何形式的抗体或其片段。因此，它以最广义的含义使用，具体覆盖单克隆抗体(包括全长单克隆抗体)、多克隆抗体、多特异性抗体(例如双特异性抗体)和抗体片段，只要它们能显示期望的生物活性。“分离的抗体”指结合化合物的纯化状态，且在这样的背景下，指基本上不含有其它生物分子(诸如核酸、蛋白、脂类、碳水化合物)或其它物质(诸如细胞碎片和生长培养基)的分子。通常，术语“分离的”无意表示完全没有这样的物质，也无意表示没有水、缓冲剂或盐，除非它们以实质上干扰本文所述的结合化合物的实验或治疗用途的量存在。

“Fab片段”包含1个轻链以及1个重链的CH1和可变区。Fab分子的重链不能与另一个重链分子形成二硫键。

“Fc”区含有2个重链片段，所述重链片段包含抗体的CH2和CH3结构域。所述2个重链片段通过2个或更多个二硫键且通过CH3结构域的疏水相互作用而保持在一起。

“Fab′片段”含有1个轻链以及一个重链的部分或片段，所述部分或片段含有VH结构域和CH1结构域以及在CH1和CH2结构域之间的区域，使得在2个Fab′片段的2个重链之间可以形成链间二硫键，以形成F(ab′)₂分子。

“F(ab′)₂片段”含有2个轻链和2个重链，所述重链含有在CH1和CH2结构域之间的恒定区的一部分，使得在2个重链之间形成链间二硫键。F(ab′)₂片段因而由2个Fab′片段组成，所述Fab′片段通过2个重链之间的二硫键保持在一起。

“Fv区”包含来自重链和轻链的可变区，但是缺少恒定区。

本文所用的术语“TSLP结合片段”或者“其结合片段”包括抗体的仍基本上保留它的抑制TSLP活性的生物活性的片段或衍生物(或其它结合物质)。因此，术语“抗体片段”或TSLP结合片段指全长抗体的一部分，通常是其抗原结合区或可变区。抗体片段的实例包括：Fab片段、Fab′片段、F(ab′)₂片段和Fv片段；diabody；线性抗体；单链抗体分子，例如sc-Fv；结构域抗体(domain antibody)；和从抗体片段形成的多特异性抗体。通常，结合片段或衍生物保留它的TSLP抑制活性的至少10％。优选地，结合片段或衍生物保留它的TSLP抑制活性的至少25％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、99％或100％(或更多)，尽管具有足够亲和力以发挥期望生物作用的任何结合片段也将是有用的。还认为，TSLP结合片段可包括不会实质上改变其生物活性的保守氨基酸置换。

本文所用的术语“单克隆抗体”指，获自基本上均一抗体的群体的抗体，即构成所述群体的各个抗体除了可能少量存在的天然突变外是相同的。单克隆抗体是高度特异性的，针对单个抗原表位。相反，常规(多克隆)抗体制品通常包括许多针对不同表位的(或对不同表位特异性的)抗体。修饰语“单克隆”表示，所述抗体是从基本上均一的抗体群体获得的特征，不能解释为要求通过任何特定的方法来生产所述抗体。例如，要根据本发明使用的单克隆抗体可通过由Kohler等人，(1975)Nature256：495首先描述的杂交瘤方法制备，或者可通过重组DNA方法制备(参见，例如，美国专利号4,816,567)。“单克隆抗体”还可用例如Clackson等人，(1991)Nature352：624-628和Marks等人，(1991)J.Mol.Biol.222：581-597中描述的技术，从噬菌体抗体文库中分离出。

本文的单克隆抗体具体地包括这样的“嵌合”抗体(免疫球蛋白)：其中重链和/或轻链的一部分与衍自特定物种或者属于特定抗体类(class)或亚类(subclass)的抗体中的相应序列相同或同源，而所述链的其余部分与衍自另一物种或属于另一抗体类或亚类的抗体中的相应序列相同或同源，且还具体地包括这种抗体的片段，只要它们显示期望的生物活性(美国专利号4,816,567；和Morrison等人，(1984)Proc.Natl.Acad Sci.USA81：6851-6855)。

“结构域抗体”是仅含重链的可变区或轻链的可变区的免疫功能性免疫球蛋白片段。在一些情况下，两个或更多个V_H区与肽接头共价连接，产生二价结构域抗体。二价结构域抗体的两个V_H区可靶向相同的或不同的抗原。

“二价抗体”包含两个抗原结合位点。在一些情况下，所述两个结合位点具有相同的抗原特异性。但是，二价抗体可以是双特异性的。

本文所用的术语“单链Fv”或“scFv”抗体，是指包含抗体的V_H结构域和V_L结构域的抗体片段，其中这些结构域以单一多肽链形式存在。通常，Fv多肽还包含V_H结构域和V_L结构域之间的多肽接头，所述接头使sFv能够形成期望的结构以进行抗原结合。有关sFv的综述，参见Pluckthun(1994)The Pharmacology of Monoclonal Antibodies，第113卷，Rosenburg和Moore编，Springer-Verlag，New York，第269-315页。

本文的单克隆抗体还包括骆驼源化单结构域抗体(camelized single domain antibody)。参见，例如，Muyldermans等人(2001)Trends Biochem.Sci.26：230；Reichmann 等人(1999)J.Immunol.Methods231：25；WO94/04678；WO94/25591；美国专利号6,005,079，它们通过引用整体并入本文)。在一个实施方案中，本发明提供了这样的单结构域抗体：其包含两个具有修饰的V_H结构域，所述修饰能使单结构域抗体得以形成。

本文所用的术语“diabody”指具有两个抗原结合位点的小抗体片段，所述片段在同一多肽链中包含重链可变结构域(V_H)和与之连接的轻链可变结构域(V_L)(V_H-V_L或V_L-V_H)。通过使用短得不能让同一链上的两个结构域之间发生配对的接头，各结构域被迫与另一条链的互补结构域发生配对，从而产生两个抗原结合位点。在例如EP404,097、WO93/11161和Holliger等人(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA90：6444-6448中，对diabody有更充分的描述。有关经工程改造的抗体变体的综述，通常参见Holliger和Hudson(2005)Nat.Biotechnol.23：1126-1136。

本文所用的术语“人源化抗体”指含有非人(例如鼠)抗体的序列以及人抗体的序列的抗体形式。这种抗体含有最小限度的衍自非人免疫球蛋白的序列。一般来说，人源化抗体会包含至少一个、通常两个可变结构域的基本上全部(substantially all)，其中超可变环的全部或基本上全部对应于非人免疫球蛋白的全部或基本上全部，而FR区的全部或基本上全部是人免疫球蛋白序列的全部或基本上全部。人源化抗体任选还会包含免疫球蛋白恒定区(Fc)的至少一部分，所述恒定区通常是人免疫球蛋白的恒定区。当有必要将人源化抗体(例如“hu23B12”)与亲本啮齿动物抗体(例如大鼠23B12或“r23B12”)加以区分时，在抗体克隆标号前加上前缀“h”、“hu”或“hum”。啮齿动物抗体的人源化形式，通常会包含亲本啮齿动物抗体的相同CDR序列，不过可包括某些氨基酸置换，以提高亲和力或增加人源化抗体的稳定性。

本发明的抗体还包括具有经修饰的(或经封闭的)Fc区以提供改变了的效应子功能的抗体。参见，例如，美国专利号5,624,821；WO2003/086310；WO2005/120571；WO2006/0057702；Presta(2006)Adv.DrugDelivery Rev.58：640-656。这种修饰可用来增强或抑制免疫系统的各种反应，在诊断和治疗中有可能有益的作用。Fc区的变更包括氨基酸变化(置换、缺失和插入)、糖基化或去糖基化，和加入多个Fc区。对Fc的变化还可改变治疗性抗体中的抗体的半衰期，而更长的半衰期会导致给药频率更少，伴随而来的是方便性的提高和材料耗费的减少。参见Presta(2005)J.Allergy Clin.Immunol.116：731第734-35页。

术语“全人抗体”指仅包含人免疫球蛋白序列的抗体。全人抗体如果是在小鼠中、在小鼠细胞中或在衍自小鼠细胞的杂交瘤中产生，那么可含有鼠碳水化合物链。类似地，“小鼠抗体”指仅包含小鼠免疫球蛋白序列的抗体。

本文所用的术语“超可变区”指抗体的负责抗原结合的氨基酸残基。超可变区包含来自“互补决定区”或“CDR”的氨基酸残基(例如轻链可变结构域中的残基24-34(CDRL1)、50-56(CDRL2)和89-97(CDRL3)和重链可变结构域中的残基31-35(CDRH1)、50-65(CDRH2)和95-102(CDRH3)；Kabat等人，(1991)Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版，Public Health Service，National Institutes of Health，Bethesda，Md.)，和/或来自“超可变环”的氨基酸残基(即轻链可变结构域中的残基26-32(L1)、50-52(L2)和91-96(L3)和重链可变结构域中的残基26-32(H1)、53-55(H2)和96-101(H3)；Chothia和Lesk，(1987)J.Mol.Biol.196：901-917)。本文所用的术语“构架”或“FR”残基，是指本文定义为CDR残基的超可变区残基之外的那些可变结构域残基。以上残基编号涉及Kabat编号系统，并不一定在细节上对应于本文所附序列表中的序列编号。

“结合”指结合组合物与靶标的缔合，其中在结合组合物可溶于或悬浮于溶液中的情况下，所述缔合导致结合组合物的正常布朗运动的减少。

“保守修饰的变体”或“保守置换”指本领域技术人员所知道的、通常可作出但又不会改变所产生的分子的生物活性的氨基酸置换。本领域技术人员认识到，一般来说，多肽的非必需区域中的单一氨基酸置换不会实质上改变生物活性(参见，例如，Watson等人，Molecular Biology of the Gene，The Benjamin/Cummings Pub.Co.，第224页(1987年第4版))。这种示例性的置换优选按照下表1所示的那些置换来作出：

表1

示例性的保守氨基酸置换

“有效量”包括足以改善或防止医学病症的征状或迹象的量。有效量还意指足以允许或便利诊断的量。特定患者或兽医受试者的有效量，可根据诸如以下的因素而变：所治疗的病症、患者的总体健康情况、给药方法途径和剂量及副作用的严重程度(参见，例如，授予Netti等人的美国专利号5,888,530)。有效量可以是避免显著副作用或毒性作用的最大剂量或投药方案。所述作用将导致诊断量度(measure)或参数提高至少5％，通常至少10％，更通常至少20％，最通常至少30％，优选至少40％，更优选至少50％，最优选至少60％，理想地至少70％，更理想地至少80％，最理想地至少90％，其中将100％定义为正常受试者表现出的诊断参数(参见，例如，Maynard等人(1996)AHandbook of SOPs for Good Clinical Practice，Interpharm Press，Boca Raton，FL；Dent(2001)Good Laboratory and Good Clinical Practice，Urch Publ.，London，UK)。

本文所用的术语“分离核酸分子”指从至少一个污染性核酸分子鉴定出和分离开来的核酸分子，在抗体核酸的天然来源中它与所述污染性核酸分子通常相结合在一起。分离核酸分子其所处的形式或环境(setting)不同于其在自然界中所处的形式或环境。分离核酸分子因此与天然细胞中所存在的核酸分子有区别。但是，分离核酸分子包括在平常表达抗体的细胞中包含的这样的核酸分子，所述核酸分子例如说其所处的染色体位置不同于正常细胞。

表达“控制序列”指可操作地连接的编码序列在特定宿主生物中的表达所必需的DNA序列。适合于例如说原核生物的控制序列，包括启动子，任选的操纵基因序列(operator sequence)，和核糖体结合位点。真核细胞已知能利用启动子、聚腺苷酸化信号和增强子。

某核酸当被安排与另一核酸序列发生功能关系时，则所述核酸“可操作地连接”。例如，前序列或分泌前导序列的DNA如果被表达成参与某多肽的分泌的前体蛋白质，则它与所述多肽的DNA可操作地连接；启动子或增强子如果影响到某编码序列的转录，则它与所述编码序列可操作地连接；或者核糖体结合位点如果被置于能促进某编码序列的翻译的位置，则它与所述编码序列可操作地连接。一般来说，“可操作地连接”意指被连接的各DNA序列是邻接的，在分泌前导序列的情况下，是邻接且处在阅读相位(reading phase)的。但是，各增强子不必是邻接的。连接(linking)是通过在方便的限制位点处进行连接反应(ligation)完成。如果不存在这样的位点，则按照常规做法使用合成的寡核苷酸衔接子(adaptor)或接头(linker)。

本文所用的词语“细胞”、“细胞系”和“细胞培养物”可互换使用，且所有这些称谓都包括后代。因此，词“转化子”和“转化细胞”包括受试者原代细胞和从中衍生的培养物，不管转移次数多少。还要理解到，由于故意或无意的突变，所有的后代可能不会在DNA含量上正好相同。本发明包括其功能或生物活性与原始转化细胞中筛查到的功能或生物活性相同的突变后代。如果要有分明的称谓，则从上下文将清楚知道。

本文所用的“聚合酶链反应”或“PCR”指据以扩增微量的特定一段核酸、RNA和/或DNA的程序或技术，如在美国专利号4,683,195中所述。通常，需要获得从目的区域的末端或末端之外起的序列信息，以便可设计出寡核苷酸引物；这些引物要在序列上与待扩增的模板的相对链相同或近似。两个引物的5′末端核苷酸可与被扩增材料的末端相一致。PCR可用来扩增特定RNA序列、总基因组DNA的特定DNA序列和从总细胞RNA转录的cDNA、噬菌体序列或质粒序列等。通常参见Mullis等人(1987)Cold Spring Harbor Symp.Quant.Biol.51：263；Erlich编，(1989)PCR Technology(Stockton Press，N.Y.)。本文所用的PCR被认为是用以扩增核酸试样的核酸聚合酶反应方法的一个实例，但不是唯一的实例，所述方法包括使用已知的核酸作为引物和核酸聚合酶来扩增或产生特定的一段核酸。

本文所用的术语“种系序列”指未重排(unrearranged)免疫球蛋白DNA序列中的某序列。任何合适来源的未重排免疫球蛋白DNA都可使用。

“抑制剂”是能减少、阻断、防止、延迟活化、失活、脱敏或下调例如基因、蛋白质、配体、受体或细胞的化合物。抑制剂还可定义为能减少、阻断或灭活组成型活性(constitutive activity)的组合物。“拮抗剂”是能对抗激动剂的作用的化合物。拮抗剂能防止、减少、抑制或中和激动剂的活性。拮抗剂还能防止、抑制或减少靶标如靶标受体的组成型活性，即使是在没有指明的激动剂的情况下。

为检验抑制程度，例如，将包含给定的(例如)蛋白质、基因、细胞或生物的样品或被化验物(assay)用潜在的活化性或抑制性物质进行处理，并与不加所述物质的对照样品进行比较。给对照样品即不用所述物质处理的样品分配100％的相对活性值。当活性值相对于对照为约90％或以下、通常85％或以下、更通常80％或以下、最通常75％或以下、一般70％或以下、更一般65％或以下、最一般60％或以下、通常55％或以下、常常50％或以下、更常常45％或以下、最常常40％或以下、优选35％或以下、更优选30％或以下、还更优选25％或以下、最优选小于25％时，则实现了抑制。

抑制的终点可如下进行监测。例如细胞、生理流体、组织、器官和动物或人受试者的抑制和治疗应答，可通过终点进行监测。终点可包含指示炎症、致癌性或者细胞脱粒或分泌情况的预定量或百分比的(例如)标记(indicia)，如细胞因子、毒性氧或蛋白酶的释放。终点可包含例如预定量的离子流动或运输；细胞迁移、细胞黏附；细胞增殖；转移潜力；细胞分化；和表型变化，例如与炎症、凋亡、转化、细胞周期或转移有关的基因的表达的变化(参见，例如，Knight(2000)Ann.Clin.Lab.Sci.30：145-158；Hood和Cheresh (2002)Nature Rev.Cancer 2：91-100；Timme，等人(2003)Curr.Drug Targets 4：25 1-261；Robbins和Itzkowitz(2002)Med.Clin.North Am.86：1 467-1 495；Grady和Markowitz(2002)Annu.Rev.Genomics Hum.Genet.3：101-128；Bauer，等人(2001)Glia 36：235-243；Stanimirovic和Satoh(2000)BrainPathol.10：113-126)。

抑制终点通常为对照的75％或更低，优选为对照的50％或更低，更优选为对照的25％或更低，最优选为对照的10％或更低。通常，活化终点为对照的至少150％，优选为对照的至少2倍，更优选为对照的至少4倍，最优选为对照的至少10倍。

当指配体/受体、抗体/抗原或其它结合对时，“特异性”或“选择性”结合表示，能确定蛋白质如TSLP在众多蛋白质和/或其它生物物质的不均一群体中的存在的结合反应。因此，在指明的条件下，指定的配体/抗原会结合特定的受体/抗体，而不会大量地结合样品中存在的其它蛋白质。

所设想的方法的抗体或者衍自抗体的抗原结合位点的结合组合物，能以其与非相关抗原的亲和力的至少10倍、更优选至少20倍、最优选至少50倍的亲和力来结合其抗原。在一个优选的实施方案中，由例如Scatchard分析(Munsen，等人(1980)Analyt.Biochem.107：220-239)测出，抗体会具有大于约10⁹升/mol的亲和力。

本文所用的术语“炎性障碍”指任何以损伤或感染部位的局部炎症为特征的疾病或障碍，包括、但不限于：变应性炎症、自身免疫疾病和其它以局部组织部位处不期望的免疫细胞集聚为特征的障碍。

本文所用的术语“免疫调节剂”指能抑制或调节免疫应答的天然或合成物质。免疫应答可以是体液应答或细胞应答。免疫调节剂包括免疫抑制剂或抗炎剂。

本文所用的“免疫抑制剂”、“免疫抑制药物”或“免疫抑制物”是可在免疫抑制疗法中用来抑制或防止免疫系统的活性的治疗剂。在临床上，它们用来防止移植器官和组织(例如骨髓、心脏、肾脏、肝脏)的排斥，和/或用来治疗自身免疫疾病或极可能有自身免疫起因的疾病(例如类风湿性关节炎、重症肌无力、系统性红斑狼疮、溃疡性结肠炎、多发性硬化)。免疫抑制药物可归为以下四类：糖皮质激素类细胞抑制剂；抗体(包括生物应答调节物或DMARDs)；作用于亲免蛋白的药物；其它药物，包括用于治疗增殖性障碍的已知化疗剂。具体地说，对于多发性硬化，可将本发明抗体与称为copaxone的新一类髓磷脂结合蛋白样治疗剂联合施用。

“抗炎剂”或“抗炎药物”用来表示类固醇类和非类固醇类治疗剂。类固醇也称皮质类固醇，是与皮质醇(由肾上腺天然产生的激素)非常相似的药物。对于某些炎性病症，如系统性血管炎(血管的炎症)和肌炎(肌肉的炎症)，类固醇被用作主要治疗药。类固醇还可有选择地用来治疗诸如以下炎性病症：类风湿性关节炎(在身体两侧关节中出现的慢性炎性关节炎)；系统性红斑狼疮(由异常免疫系统功能引起的全身性疾病)；舍格伦综合征(会引起干眼症和干口症的慢性失调)。

非类固醇类抗炎药(常简称NSAID)是具有镇痛、退热和抗炎作用的药物——它们会减少疼痛、发热和炎症。术语“非类固醇类”用来将这些药物与具有类似的类二十烷酸-抑制作用、抗炎作用(当然还有广泛的其它作用)的类固醇区分开来。NSAID通常适用于缓解以下病症的征状：类风湿性关节炎；骨关节炎；炎性关节病(例如强直性脊椎炎、银屑病关节炎、莱特尔氏综合征)；急性痛风；痛经；转移性骨痛；头痛和偏头痛；手术后疼痛；炎症和组织损伤所致的轻度至中度疼痛；热病；和肾绞痛。NSAID包括水杨酸盐类、芳基烷酸类、2-芳基丙酸类(profens)、N-芳基邻氨基苯甲酸类(芬那酸类)、昔康类、昔布类(选择性的COX-2抑制剂)、硫酰替苯胺类(sulphonanilides)、双氯芬酸、二氟尼柳、依托度酸、非诺洛芬、氟比洛芬、布洛芬、吲哚美辛、酮洛芬、酮咯酸、甲芬那酸、美洛昔康、萘丁美酮、萘普生、奥沙普秦、吡罗昔康、双水杨酯、舒林酸或托美丁。

II.概述

本发明提供了经工程改造的抗-TSLP抗体及其用于治疗炎性障碍、特别是变应性炎性障碍的用途。在一个优选的实施方案中，所述炎性障碍是哮喘。在一个优选的实施方案中，所述变应性炎性障碍是变应性鼻窦炎、变应性哮喘、变应性结膜炎或特应性皮炎。本发明还提供了经工程改造的抗-TSLP抗体，其用于治疗纤维化、炎性肠病或霍奇金淋巴瘤。

本文所用的术语“TSLP”包括TSLP的变体、同种型、同系物、直系同源物和旁系同源物。人TSLP的氨基酸序列如国际公开号WO00/17362的SEQ ID NO：4所示。

III.本发明的经工程改造的TSLP特异性的抗体

本发明涉及包含指定的CDR区的、经工程改造的抗-TSLP抗体。

对抗体进行重组工程改造的方法已有描述，例如Boss等人(美国专利号4,816,397)、Cabilly等人(美国专利号4,816,567)、Law等人(欧洲专利申请公开号438310)和Winter(欧洲专利申请公开号239400)。

本发明的经工程改造的抗体包括这样的抗体：其中已经对在VH和/或VL内的框架残基做出修饰，例如以提高所述抗体的性质。通常，做出这样的框架修饰，以降低抗体的免疫原性。例如，一个方案是，将一个或多个框架残基“回复突变”成对应的种系序列。更具体地，已经经历体细胞突变的抗体可以含有不同于所述抗体的来源种系序列的框架残基。通过对比抗体框架序列和所述抗体的来源种系序列，可以鉴定这样的残基。

另一类框架修饰包括：突变在框架区内或甚至在一个或多个CDR区内的一个或多个残基，以去除T细胞表位，从而降低所述抗体的潜在免疫原性。该方案也称作“去免疫”(“deimmunization”)，且更详细地描述在美国专利公开号20030153043中。

除了在框架区或CDR区内做出的修饰以外，或作为替代，可以工程改造本发明的抗体，以包括在Fc区内的修饰，通常是为了改变所述抗体的一种或多种功能性质，诸如血清半衰期、补体结合、Fc受体结合和/或抗原依赖性的细胞的细胞毒性。此外，可以化学修饰本发明的抗体(例如，可以将一个或多个化学部分连接至抗体上)，或进行修饰以改变它的糖基化，从而改变所述抗体的一种或多种功能性质。这些实施方案中的每一个更详细地描述在下面。在Fc区中的残基的编号是Kabat的欧洲索引的编号。

在一个实施方案中，所述抗体是IgG4同种型抗体，其包含在与重链恒定区的铰链区中的位置228相对应的位置处的丝氨酸至脯氨酸突变(S228P；欧洲索引)。已经报道，该突变会消除在铰链区中的重链间二硫键的异质性(Angal等人同上；位置241是基于Kabat编号系统)。

在一个实施方案中，修饰CH1的铰链区，从而改变(例如，增加或减少)在铰链区中的半胱氨酸残基的数目。该方案另外描述在美国专利号5,677,425中。例如，改变在CH1的铰链区中的半胱氨酸残基的数目，以便促进轻链和重链的装配，或增加或降低抗体的稳定性。

在另一个实施方案中，突变抗体的Fc铰链区，以降低所述抗体的生物半衰期。更具体地，将一个或多个氨基酸突变导入Fc-铰链片段的CH2-CH3结构域界面(interface)区中，使得所述抗体具有与天然Fc-铰链结构域SpA结合相比受损的葡萄球菌蛋白A(SpA)结合。该方案更详细地描述在美国专利号6,165,745中。

在另一个实施方案中，修饰所述抗体，以增加它的生物半衰期。多种方案是可行的。例如，可以导入一个或多个下述突变：T252L、T254S、T256F，如在美国专利号6,277,375中所述。或者，为了增加生物半衰期，可以在CH1或CL区内改变所述抗体，以含有补救受体(salvage receptor)结合表位，所述表位取自IgG的Fc区的CH2结构域的2 个环，如在美国专利号5,869,046和6,121,022中所述。

在其它实施方案中，通过用不同的氨基酸残基替代至少一个氨基酸残基来改变Fc区，以改变所述抗体的效应子功能。例如，可以用不同的氨基酸残基替代选自氨基酸残基234、235、236、237、297、318、320和322的一个或多个氨基酸，使得所述抗体具有改变的对效应配体的亲和力，但是保留亲本抗体的抗原结合能力。被改变对它的亲和力的效应配体可以是，例如，Fc受体或补体的C1组分。该方案更详细地描述在美国专利号5,624,821和5,648,260中。

在另一个实施例中，可以用不同的氨基酸残基替代选自氨基酸残基329、331和322的一个或多个氨基酸，使得所述抗体具有改变的C1q结合和/或减少的或消除的补体依赖性的细胞毒性(CDC)。该方案更详细地描述在美国专利号6,194,551中。

在另一个实施例中，改变在氨基酸位置231和239内的一个或多个氨基酸残基，从而改变抗体的固定补体的能力。该方案另外描述在PCT公开WO94/29351中。

在另一个实施例中，通过修饰在下述位置处的一个或多个氨基酸来修饰Fc区，以增加所述抗体的介导抗体依赖性的细胞的细胞毒性(ADCC)的能力，和/或以增加所述抗体对Fcγ受体的亲和力：238、239、248、249、252、254、255、256、258、265、267、268、269、270、272、276、278、280、283、285、286、289、290、292、293、294、295、296、298、301、303、305、307、309、312、315、320、322、324、326、327、329、330、331、333、334、335、337、338、340、360、373、376、378、382、388、389、398、414、416、419、430、434、435、437、438或439。该方案另外描述在PCT公开WO00/42072中。此外，已经绘制了在人IgG1上的与FcγR1、FcγRII、FcγRIII和FcRn的结合位点的图谱，并已经描述了具有提高的结合的变体(参见Shields等人(2001)J.Biol.Chem.276：6591-6604)。经证实，在位置256、290、298、333、334和339处的特异性突变会改善与FcγRIII的结合。另外，经证实，下述组合突变体会改善FcγRIII结合：T256A/S298A、S298A/E333A、S298A/K224A和S298A/E333A/K334A。

在另一个实施方案中，修饰或改变抗体的糖基化，以给抗体删除或添加碳水化合物部分。例如，可以制备去糖基化的抗体(即，所述抗体缺少糖基化)。例如，可以改变糖基化，以增加抗体对抗原的亲和力。例如，通过改变在抗体序列内的一个或多个糖基化位点，可以实现这样的碳水化合物修饰。例如，可以做出一个或多个氨基酸置换，它们导致一个或多个可变区框架糖基化位点的消除，从而消除在该位点处的糖基化。这样的去糖基化可以增加抗体对抗原的亲和力。参见，例如，美国专利号5,714,350和6,350,861。

额外地或替换地，可以制备具有改变的糖基化类型的抗体，诸如具有减少量的岩藻糖基残基的低岩藻糖基化的抗体，或具有增加的二等分(bisecting)GlcNac结构的抗体。已经证实，这样的改变的糖基化模式会增加抗体的ADCC能力。例如，通过在具有改变的糖基化机制的宿主细胞中表达抗体，可以实现这样的碳水化合物修饰。具有改变的糖基化机制的细胞已经在本领域有所描述，且可以用作宿主细胞，在其中表达本发明的重组抗体，从而生产具有改变的糖基化的抗体。例如，细胞系Ms704、Ms705和Ms709缺少岩藻糖基转移酶基因FUT8(α(1，6)-岩藻糖基转移酶)，所以在Ms704、Ms705和Ms709细胞系中表达的抗体在它们的碳水化合物上缺少岩藻糖。使用2种替换载体，通过CHO/DG44细胞中的FUT8基因的靶向断裂，建立Ms704、Ms705和Ms709FUT8-/-细胞系(参见美国专利公开号20040110704和Yamane-Ohnuki等人(2004)Biotechnol Bioeng87：614-22)。作为另一个实例，EP1,176,195描述了一种细胞系，所述细胞系具有功能上断裂的FUT8基因，该基因编码岩藻糖基转移酶，所以在这样的细胞系中表达的抗体表现出低岩藻糖基化(通过减少或消除α-1，6键相关酶)。EP1,176,195也描述了这样的细胞系：其具有较低的将岩藻糖添加到N-乙酰基葡糖胺(其结合抗体的Fc区)上的酶活性，或不具有该酶活性，例如大鼠骨髓瘤细胞系YB2/0(ATCC CRL1662)。PCT公开WO03/035835描述了一种变体CHO细胞系Lec13细胞，其具有减少的将岩藻糖连接至Asn(297)-连接的碳水化合物上的能力，也导致在该宿主细胞中表达的抗体的低岩藻糖基化(也参见Shields等人(2002)J.Biol.Chem.277：26733-26740)。也可以在鸡蛋中生产具有修饰的糖基化特性的抗体，如在PCT公开WO06/089231中所述。或者，可以在诸如浮萍属(Lemna)等植物细胞中生产具有修饰的糖基化特性的抗体。PCT公开WO99/54342描述了这样的细胞系：其经工程改造，以表达修饰糖蛋白的糖基转移酶(例如，β(1，4)-N-乙酰基葡糖胺基转移酶III(GnTIII))，使得在所述经工程改造的细胞系中表达的抗体表现出增加的二等分GlcNac结构，所述结构导致抗体的增加的ADCC活性(也参见Umana等人(1999)Nat.Biotech.17：176-180)。或者，使用岩藻糖苷酶，可以切掉抗体的岩藻糖残基；例如，岩藻糖苷酶α-L-岩藻糖苷酶会从抗体去除岩藻糖基残基(Tarentino等人(1975)Biochem.14：5516-23)。

本公开内容设想到的本文所述抗体的另一种修饰是聚乙二醇化。例如，可以将抗体聚乙二醇化，以增加抗体的生物(例如，血清)半衰期。为了将抗体聚乙二醇化，通常在使一个或多个PEG基团变成连接至抗体或抗体片段上的条件下，使抗体或其片段与聚乙二醇(PEG)(诸如PEG的反应性酯或醛衍生物)反应。优选地，通过与反应性PEG分子(或类似的反应性的水溶性的聚合物)的酰化反应或烷基化反应，进行聚乙二醇化。本文所用的术语“聚乙二醇”意图包括已经用于衍生化其它蛋白的任意PEG形式，诸如单(C1-C10)烷氧基-或芳氧基-聚乙二醇或聚乙二醇-马来酰亚胺。在某些实施方案中，要聚乙二醇化的抗体是糖基化的抗体。将蛋白聚乙二醇化的方法是本领域已知的，且可以用于本发明的抗体。参见，例如，EP 0 154 316和EP 0 401 384。

通过将适当的核苷酸变化导入到人源化抗-TSLP抗体DNA中，或者通过肽合成，可以制备本发明的人源化抗-TSLP抗体的氨基酸序列变体。这种变体包括例如本文公开的且要求保护的人源化抗-TSLP抗体显示的氨基酸序列内的残基的缺失和/或插入和/或置换。可以作出缺失、插入和置换的任何组合，以获得最终构建体，条件是，所述最终构建体具有期望的特性。如以上所讨论的，氨基酸变化还可改变人源化抗-TSLP抗体的翻译后加工，如改变糖基化位点的数目或位置。

用以鉴定人源化抗-TSLP抗体多肽的某些作为优选诱变位置的残基或区域的有用方法，称为“丙氨酸扫描诱变”，如Cunningham和Wells(1989)Science244：1081-1085所描述。这里，鉴定了某残基或靶标残基群(例如带电荷残基，如Arg、Asp、His、Lys和Glu)，并用中性或带负电荷的氨基酸(最优选丙氨酸或聚丙氨酸)替代，以影响氨基酸与TSLP抗原的相互作用。然后通过在或给置换位点导入更多的或其它的变体，将显示出对置换的功能敏感性的氨基酸残基进行改进。因此，虽然用于导入氨基酸序列变异的位点是预定的，但突变本身的特性不需要是预定的。例如，为分析给定位点处的突变的性能，在靶标密码子或区域处进行Ala扫描或随机诱变，并对所表达的人源化抗-TSLP抗体变体进行筛查以寻找期望的活性。

氨基酸序列插入包括氨基末端和/或羧基末端融合，其长度从1个残基到含有100个或更多个残基的多肽，还包括单个或多个氨基酸残基的序列内插入。末端插入的实例包括具有N末端甲硫氨酰基残基的人源化抗-TSLP抗体或者与表位标签融合的抗体。人源化抗-TSLP抗体分子的其它插入变体，包括能提高人源化抗-TSLP抗体血清半衰期的酶或多肽与所述抗体的N末端或C末端的融合。

另一类变体是氨基酸置换变体。这些变体去除了人源化抗-TSLP抗体分子中的至少一个氨基酸残基，并在其位置插入别的残基。进行置换诱变的最有意义的位点包括超可变环，但也设想到进行FR变更。参与抗原结合的超可变区残基或FR残基通常是以相对保守的方式进行置换。

又一类氨基酸变体是置换残基，以使最终人源化抗体具有更大的化学稳定性。

在某些实施方案中，希望将含有暴露的侧链的某些氨基酸改变成另一种氨基酸残基，以使最终抗体具有更大的化学稳定性，如下所述。例如，可以将天冬酰胺(Asn)残基改变成Gln或Ala，以减少在CDR内的任意Asn-Gly序列处形成异天冬氨酸的可能性。类似的问题可能存在于Asp-Gly序列处。Reissner和Aswad(2003)Cell.Mol.Life Sci.60：1281。异天冬氨酸形成可能削弱或完全消除抗体与其靶抗原的结合。参见，Presta (2005)J.Allergy Clin.Immunol.116：731，第734页。在一个实施方案中，将天冬酰胺改变成谷氨酰胺(Gin)。也可能希望改变邻近天冬酰胺(Asn)或谷氨酰胺(Gin)残基的氨基酸，以减少去酰胺化的可能性，当小氨基酸存在于天冬酰胺或谷氨酰胺附近时，所述去酰胺化以更大的几率发生。参见，Bischoff&Kolbe(1994)J.Chromatog.662：261。另外，可以将在CDR中的任意甲硫氨酸残基(通常是溶剂暴露的Met)改变成Lys、Leu、Ala或Phe，以便减少甲硫氨酸硫发生氧化的可能性，所述氧化会降低抗原结合亲和力，并也促进最终的抗体制品中的分子异质性。出处同上。在一个实施方案中，将甲硫氨酸改变成丙氨酸(Ala)。另外，为了预防或最小化潜在的易断裂的Asn-Pro肽键，可能希望将在CDR中存在的任意Asn-Pro组合改变成Gln-Pro、Ala-Pro或Asn-Ala。随后筛选具有这种置换的抗体，以确保所述置换不会降低TSLP结合亲和力或其它希望的生物活性至不可接受的水平。

表2

示例性的稳定化CDR变体

另外，可以改变啮齿动物CDR中的甲硫氨酸残基，以减少甲硫氨酸硫发生氧化的可能性，所述氧化会降低抗原结合亲和力，并也促进最终的抗体制品中的分子异质性。出处同上。在一个实施方案中，将甲硫氨酸改变成丙氨酸(A)。随后筛选具有这种置换的抗体，以确保所述置换不会降低TSLP结合亲和力至不可接受的水平。

编码人源化TSLP特异性抗体的氨基酸序列变体的核酸分子，是通过多种本领域知道的方法来制备。这些方法包括、但不限于：从天然来源分离(在天然存在的氨基酸序列变体的情况下)，或者通过对以前制备的人源化抗-TSLP抗体的变体形式或非变体形式的寡核苷酸介导(或位点定向)诱变、PCR诱变和盒式诱变来制备。

通常，人源化抗-TSLP抗体的氨基酸序列变体的氨基酸序列与重链或轻链的原始人源化抗体氨基酸序列具有至少97％氨基酸序列同一性，更优选至少98％、更优选至少99％。与这个序列的同一性或同源性，在本文中定义为，在比对序列并按需要引入空隙以达到最大序列同一性百分数以后，并且不将任何保守置换视作序列同一性的一部分，候选序列中与人源化抗-TSLP残基相同的氨基酸残基的百分数。在抗体序列的N末端、C末端或内部中的延伸、缺失或插入，都不应解释为影响序列同一性或同源性。

人源化抗体可从任何类别的免疫球蛋白选择，包括IgM、IgG、IgD、IgA和IgE在内。优选地，抗体是IgG抗体。可使用IgG的任何同种型，包括IgG₁、IgG₂、IgG₃和IgG₄在内。还设想到各IgG同种型的变体。人源化抗体可包含来自超过一个类别或同种型的序列。对必需恒定结构域序列进行优化以产生期望的生物活性，这可容易地通过按下文所述的生物学测定法筛查抗体来实现。

同样，任一类别的轻链也可用于本文所述的组合物和方法中。具体地说，κ轻链、λ轻链或它们的变体可用于本发明的组合物和方法中。

可使用来自非人抗体的CDR序列的任何合适部分。CDR序列可通过置换、插入或缺失至少一个残基来进行诱变，使得CDR序列不同于所采用的人和非人抗体序列。设想到，这种突变会是最小限度的。通常，至少95％的人源化抗体残基会对应于非人CDR残基，最优选地大于97％。

可使用来自人抗体的FR序列的任何合适部分。FR序列可通过置换、插入或缺失至少一个残基来进行诱变，使得FR序列不同于所采用的人和非人抗体序列。设想到，这种突变会是最小限度的。通常，至少75％的人源化抗体残基会对应于人FR残基，更通常90％，最优选95％以上。

CDR残基和FR残基按Kabat的标准序列定义来确定。Kabat等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest,National Institutes of Health,Bethesda Md.(1987)。

在一个优选的实施方案中，根据本发明的结合组合物包括一个或多个下述序列：

·CDR-H1序列GYIFTDYAMH(SEQ ID NO：1)。

·CDR-H2序列TFIPLLDTSDYAQKFQG(SEQ ID NO：2)。

·CDR-H3序列MGVTHSYVMDA(SEQ ID NO：3)。

·CDR-L1序列RASQPISISVH(SEQ ID NO：4)。

·CDR-L2序列FASQSIS(SEQ ID NO：5)。

·CDR-L3序列QQTFSLPYT(SEQ ID NO：6)。

·在SEQ ID NO：7中所示的可变重链氨基酸序列。

·在SEQ ID NO：8中所示的可变轻链氨基酸序列。

·编码在SEQ ID NO：9中所示的可变重链的核酸序列。

·编码在SEQ ID NO：10中所示的可变轻链的核酸序列。

·在SEQ ID NO：11中所示的重链氨基酸序列。该序列可以另外包含下述前导序列：MAVLGLLFCLVTFPSCVLS(SEQ ID NO：15)。

·在SEQ ID NO：12中所示的轻链氨基酸序列。该序列可以另外包含下述前导序列：MAPVQLLGLLVLFLPAMRC(SEQ ID NO：16)。

·编码在SEQ ID NO：13中所示的重链的核酸序列。该序列可以另外包含编码前导序列、优选下述前导序列的序列：MAVLGLLFCLVTFPSCVLS(SEQ ID NO：15)。

·编码在SEQ ID NO：14中所示的轻链的核酸序列。该序列可以另外包含编码前导序列、优选下述前导序列的序列：MAPVQLLGLLVLFLPAMRC(SEQ ID NO：16)。

例如，本发明包括分离的抗体或其抗原结合片段，其包含：含有CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3(如上所述)的轻链免疫球蛋白，和含有CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3(如上所述)的重链免疫球蛋白。本发明也包括分离的抗体或其抗原结合片段，其包含：含有在SEQ ID NO：8或12中所述的氨基酸序列的轻链免疫球蛋白可变区，和含有在SEQ ID NO：7和11中所述的氨基酸序列的重链免疫球蛋白可变区(例如，SEQ ID NO：7与SEQ ID NO：8配对，或者，SEQ ID NO：11与SEQ ID NO：12配对)。在本发明的一个实施方案中，这样的抗体或片段可以连接至免疫球蛋白恒定结构域诸如IgG(例如，IgG₁、IgG₂、IgG₃或IgG₄)上。包含所述抗体或片段和药学上可接受的载体的药物组合物，也是本发明的一部分。

在一些实施方案中，可将不同的恒定结构域附加到本文提供的人源化V_L区和V_H区上。例如，如果本发明抗体(或片段)的特定预定用途是产生(call for)改变的效应子功能，可使用IgG1之外的重链恒定结构域。尽管IgG1抗体能提供长半衰期和效应子功能，如补体激活和抗体依赖性的细胞的细胞毒性，但这些活性可能不是抗体的所有用途都需要的。在这种情况下，例如可使用IgG4恒定结构域。

IV.抗体缀合物

本发明的结合化合物，例如本发明的抗体或抗体片段，也可以缀合到化学部分上。除了别的以外，所述化学部分可以是聚合物、放射性核素或细胞毒性因子。优选地，所述化学部分是增加抗体分子在受试者体内的半衰期的聚合物。合适的聚合物包括、但不限于：聚乙二醇(PEG)(例如，分子量为2kDa、5kDa、10kDa、12kDa、20kDa、30kDa或40kDa的PEG)、葡聚糖和单甲氧基聚乙二醇(mPEG)。Lee等人(1999)(Bioconj.Chem.10：973-981)公开了PEG缀合的单链抗体。Wen等人(2001)(Bioconj.Chem.12：545-553)公开了用PEG缀合抗体，所述PEG连接在放射性金属螯合剂(二乙烯三胺五乙酸(DTPA))上。

也可以给本发明的抗体和抗体片段缀合标记，诸如⁹⁹Tc、⁹⁰y、¹¹¹In、³²P、¹⁴C、¹²⁵I、 ³H、¹³¹I、¹¹C、¹⁵O、¹³N、¹⁸F、³⁵S、⁵¹Cr、⁵⁷To、²²⁶Ra、⁶⁰Co、⁵⁹Fe、⁵⁷Se、¹⁵²Eu、⁶⁷CU、 ²¹⁷Ci、²¹¹At、²¹²Pb、⁴⁷Sc、¹⁰⁹Pd、²³⁴Th和⁴⁰K、¹⁵⁷Gd、⁵⁵Mn、⁵²Tr和⁵⁶Fe。

也可以给本发明的抗体和抗体片段缀合荧光的或化学发光的标记，包括荧光团诸如稀土螯合物、荧光素和它的衍生物、罗丹明和它的衍生物、异硫氰酸酯、藻红蛋白、藻蓝蛋白、别藻蓝蛋白、邻苯二醛、荧光胺、¹⁵²Eu、丹磺酰基、伞形酮、萤光素、鲁米诺标记、异鲁米诺标记、芳族吖啶酯标记、咪唑标记、吖啶鎓盐标记、草酸酯标记、水母荧光素标记、2，3-二氢酞嗪二酮、生物素/抗生物素蛋白、自旋标记和稳定的自由基。

所述抗体分子也可以缀合细胞毒性因子如白喉毒素、铜绿假单孢菌外毒素A链、蓖麻毒蛋白A链、相思豆毒蛋白A链、蒴莲根毒蛋白A链、α-八叠球菌素、油桐(Aleurites fordii)蛋白及化合物(如脂肪酸)、石竹素蛋白、Phytoiacca americana蛋白PAPI、PAPII和PAP-S、苦瓜(momordica charantia)抑制剂、麻疯树毒蛋白、巴豆毒蛋白、石碱草(saponaria officinalis)抑制剂、丝林霉素(mitogellin)、局限曲菌素、酚霉素和伊诺霉素。

可利用本领域已知的将本发明的抗体分子与不同的部分缀合的任何方法，包括在下述文献中描述的那些方法：Hunter，等人，(1962)Nature144：945；David，等人，(1974)Biochemistry13：1014；Pain，等人，(1981)J.Immunol.Meth.40：219；和Nygren，J.，(1982)Histochem.and Cytochem.30：407。缀合抗体的方法是本领域常规的且非常熟知的。

在其它实施方案中，可以将不同的恒定结构域附加至从本文提供的CDR衍生出的人源化的V_L和V_H区域上。例如，如果本发明抗体(或片段)的特定预定用途是产生改变的效应子功能，可使用IgG1之外的重链恒定结构域，或者可以使用杂种(hybrid)IgG1/IgG4。

另一种IgG1抗体会提供长半衰期和效应子功能，诸如补体活化和抗体依赖性的细胞的细胞毒性，这样的活性可能不是抗体的所有用途都需要的。在这种情况下，例如可使用IgG4恒定结构域。在hu Mab8D5中，IgG4恒定结构域在位置108处不同于天然的人IgG4 恒定结构域(Swiss-Prot登记号P01861.1，其公开内容通过引用并入本文)，其中用Pro替代天然的Ser108，以便防止在Cys106和Cys109之间的潜在链间二硫键，所述二硫键会干扰适当的链内二硫键形成。参见Angal等人(1993)Mol.Imunol.30：105。

V.本发明的结合化合物的生物活性

可以筛选具有本文鉴定为在人源化抗-TSLP抗体中合乎需要的特性的结合化合物的体外抑制性生物活性或者合适的结合亲和力。

抗体亲和力(例如对人TSLP)可用标准的分析来测定。优选的人源化抗体是以不超过约1x10^-7M、优选不超过约1x10^-8M、更优选不超过约1x10^-9M、最优选不超过约1x10^-10M的K_D值结合人TSLP的人源化抗体。

可用于本发明组合物和方法中的抗体及其片段是生物活性抗体和片段。本文所用的术语“生物活性的”指，能够结合期望的抗原表位并直接或间接发挥生物作用的抗体或抗体片段。通常，这些作用因TSLP不能与其受体结合而产生。在一个实施方案中，可用于本发明组合物和方法的抗体及其片段能抑制：转染有hTSLP受体和IL-7R α的Baf-3细胞系的hTSLP诱导的增殖；从转染有TSLP受体和萤光素酶报告物系统的Baf-3细胞系的hTSLP诱导的萤光素酶表达；从分离自PBMCs的人原代单核细胞的hTSLP诱导的TARC分泌；和Th2分化的诱导。

本文所用的术语“特异性”指抗体与靶标抗原表位的选择性结合。可通过在给定的一组条件下，将与TSLP的结合情况和与非相关抗原或抗原混合物的结合情况进行比较，来测试抗体的结合特异性。如果抗体结合TSLP是它结合非相关抗原或抗原混合物的至少10倍、优选20或50倍，则认为它是特异性的。“特异性地结合”TSLP的抗体不会结合不包含TSLP衍生序列的蛋白质，即本文所用的“特异性”与TSLP特异性有关，而不是与所涉及的蛋白质中可能存在的任何其它序列有关。例如，本文所用的“特异性地结合”TSLP的抗体通常会结合FLAG-h TSLP，后者是包含TSLP和蛋白标签的融合蛋白，但它不会结合单独的肽标签或者与TSLP之外的蛋白质融合的肽标签。

VI.药物组合物

为了制备药物组合物或无菌组合物，将抗体或其片段与药学上可接受的载体或赋形剂混合，参见，例如，Remington′sPharmaceutical Sciences和U.S.Pharmacopeia：National Formulary，Mack Publishing Company，Easton，PA(1984)。通过与生理上可接受的载体、赋形剂或稳定剂以例如低压冻干粉、浆液、水溶液或悬浮液的形式混合，可以制备治疗剂和诊断剂的制剂(参见，例如，Hardman，等人(200 1)Goodman and Gilman’sThe PharmacologicalBasis of Therapeutics，McGraw-Hill，New York，NY；Gennaro(2000)Remington：The Science and Practice of Pharmacy，Lippincott，Williams，和Wilkins，New York，NY；Avis，等人(编)(1993)Pharmaceutical Dosage Forms：Parenteral Medications，Marcel Dekker，NY；Lieberman，等人(编)(1990)Pharmaceutical Dosage Forms：Tablets，Marcel Dekker，NY；Lieberman，等人(编)(1990)Pharmaceutical Dosage Forms：Disperse Systems，Marcel Dekker，NY；Weiner和Kotkoskie(2000)Excipient Toxicity and Safety，Marcel Dekker，Inc.，New York，NY)。

单独施用或与免疫抑制剂组合施用的抗体组合物的毒性和治疗功效，可通过细胞培养或实验动物的标准药物程序来测定，例如用于测定LD₅₀(对50％的群体致死的剂量)和ED₅₀(在50％的群体中治疗上有效的剂量)。毒性作用和治疗作用之间的剂量比是治疗指数，它可以LD₅₀和ED₅₀之比表示。优选显示高治疗指数的抗体。从这些细胞培养测定和动物研究获得的数据可用于配制一系列用于人类的剂量。这些化合物的剂量优选落在包括ED₅₀的一系列循环浓度之内，且毒性极少或没有。取决于所采用的剂型和所应用的施用途径，剂量可在这个范围内变化。

合适的施用途径包括胃肠外施用，如肌肉内、静脉内或皮下施用。用于药物组合物或用以实施本发明方法的抗体的施用，可按多种常规方式执行，如口服摄入、吸入、局部应用或者皮肤、皮下、腹膜内、胃肠外、动脉内或静脉内注射。在一个实施方案中，静脉内施用本发明的结合化合物。在另一个实施方案中，皮下施用本发明的结合化合物。

或者，可以以局部方式而不是全身方式施用抗体，例如通过将抗体直接注射到关节或者以免疫病理学为特征的病原体诱发的伤口中来施用，这往往是以蓄池(depot)或持续释放制剂来施用。此外，可以在靶向药物递送系统中施用抗体，例如在被组织特异性抗体包被的脂质体中施用，以靶向例如关节或者以免疫病理学为特征的病原体诱发的伤口。脂质体会靶向受影响组织，并被所述组织选择性地吸收。

为某治疗剂选择给药方案取决于几个因素，包括治疗剂实体的血清或组织周转率、征状的程度、治疗剂实体的免疫原性以及生物基质中的靶细胞的可接近性。优选地，给药方案能使递送到患者的治疗剂的量最大，同时符合可接受的副作用水平。因此，所递送的生物药剂的量部分地取决于具体实体和所治疗的病症的严重性。可得到选择抗体、细胞因子和小分子的适当剂量的指导(参见，例如，Wawrzynczak(1996)Antibody Therapy，Bios Scientific Pub.Ltd，Oxfordshire，UK；Kresina(编)(1991)Monoclonal Antibodies，Cytokines and Arthritis，Marcel Dekker，New York，NY；Bach(编)(1993)Monoclonal Antibodies and Peptide Therapy inAutoimmune Diseases，Marcel Dekker，New York，NY；Baert等人(2003) New Engl.J.Med.348：601-608；Milgrom等人(1999)New Engl.J.Med.341：1966-1973；Slamon等人(2001)New Engl.J.Med.344：783-792；Beniaminovitz等人(2000)New Engl.J.Med.342：613-619；Ghosh等人(2003)New Engl.J.Med.348：24-32；Lipsky等人(2000)NewEngl.J.Med.343：1594-1602)。

适当剂量的确定，由临床医生例如使用本领域已知或怀疑会影响治疗或者预知会影响治疗的参数或因素来作出。一般来说，剂量从稍低于最佳剂量的量开始，之后少量递增，直到相对于任何负面副作用达到期望或最佳的效果。重要的诊断度量(measure)包括例如炎症的征状的度量或者所产生的炎性细胞因子的水平。优选地，所要使用的生物药剂衍自所要治疗的动物的同一物种，从而使对试剂的炎性应答、自身免疫应答或增殖应答减至最低。

抗体、抗体片段和细胞因子可通过连续输注来提供，或者通过在例如一天、一星期或每星期1-7次的时间间隔施用的各剂量来提供。各剂量可通过静脉内、皮下、局部、口服、鼻内、直肠内、肌肉内、大脑内、椎管内方式提供，或者通过吸入提供。优选的剂量方案是这样的方案：它涉及最大剂量或剂量频率，但能避免显著的不需要的副作用。每周总剂量一般为至少0.05μg/kg体重，更一般至少0.2μg/kg，最一般至少0.5μg/kg，通常至少1μg/kg，更通常至少10μg/kg，最通常至少100μg/kg，优选至少0.2mg/kg，更优选至少1.0mg/kg，最优选至少2.0mg/kg，理想地至少10mg/kg，更理想地至少25mg/kg，最理想地至少50mg/kg(参见，例如，Yang，等人(2003)New Engl.J.Med.349：427-434；Herold，等人(2002)New Engl.J.Med.346：1692-1698；Liu，等人(1999)J.Neurol.Neurosurg.Psych.67：451-456；Portielii，等人(20003)Cancer Immunol.Immunother.52：133-144)。小分子治疗剂(如肽模拟物、天然产物或有机化学品)的期望剂量，以摩尔/kg为单位，与抗体或多肽的剂量大约相同。

本文所用的“抑制”或“治疗”，包括与自身免疫疾病或病原体诱发的免疫病理有关的征状的发展的延缓，和/或会发展或预期要发展的这种征状的严重程度的减低。这些术语还包括改善现有的不受控制或有害的自身免疫相关或病原体诱发的免疫病理征状，防止另外的征状，和改善或防止这些征状的潜在原因。因此，这些术语表示有利的结果已赋予到具有炎性疾病的脊椎动物受试者。

本文所用的术语“治疗有效量”或“有效量”是指这样的抗-TSLP抗体或其片段的量：当单独地或与另外的治疗剂组合地施用给细胞、组织或受试者时，其可有效地防止或改善自身免疫疾病、或者病原体诱发的与疾病或病症有关的免疫病理学、或者疾病的进展。治疗有效剂量还指化合物的足以导致征状的改善的量，所述改善例如相关医学病症的治疗、康复、预防或改进，或者这种病症的治疗、康复、预防或改进的速度的提高。当应用于单独施用的单个活性成分时，治疗有效量仅指所述成分。当应用于组合时，治疗有效量指导致治疗效果的各活性成分的组合量，不管这些活性成分是组合施用、依序施用还是同时施用。治疗剂的有效量会使征状减少通常至少10％、常常至少20％、优选至少约30％、更优选至少40％、最优选至少50％。

共施用的方法或者用本发明的抗-TSLP抗体或其抗原结合片段和第二种治疗剂(例如，细胞因子、类固醇、化学治疗剂、抗生素或辐射，或本文讨论的任意这样的试剂)进行治疗的方法，形成本发明的一部分，通常，参见，例如，Hardman等人(编)(2001)Goodman and Gilman’sThe Pharmacological Basis of Therapeutics，第10版，McGraw-Hill，New York，NY；Poole和Peterson(编)(2001)Pharmacotherapeutics forAdvanced Practice：A Practical Approach，Lippincott，Williams&Wilkins，Phila.，PA；Chabner和Longo(编)(2001)Cancer Chemotherapy and Biotherapy，Lippincott，Williams&Wilkins，Phila.，PA。本发明的抗体和其抗原结合片段和药物组合物还可含有其它免疫抑制剂或免疫调节剂。可采用任何合适的免疫抑制剂，包括、但不限于：抗炎剂、皮质类固醇、环胞菌素、他克莫司(即FK-506)、西罗莫司、干扰素、可溶性细胞因子受体(例如，sTNRF和sIL-iR)、能中和细胞因子活性的药剂(例如英夫利昔单抗、阿达木单抗、戈利木单抗、依那西普)、吗替麦考酚酯、15-脱氧精胍菌素、沙利度胺、格拉替雷、硫唑嘌呤、来氟米特、环磷酰胺、甲氨蝶呤等。非类固醇类抗炎药也可以与本发明的抗体或其抗原结合片段或其药物组合物一起提供。所述药物组合物也可以与其它治疗模态(诸如光疗和辐射)一起使用。本发明的范围包括这样的组合物：所述组合物包含本发明的任意抗体或其抗原结合片段和任意第二种治疗剂(例如，如本文讨论的，例如，其中所述抗体或片段与第二种治疗剂分开配制，或其中它们一起配制)。

典型的兽医学受试者、实验受试者或研究受试者包括猴、狗、猫、大鼠、小鼠、兔、豚鼠、马和人。

VII.抗体生产

为了重组生产本发明的抗体，分离出编码2条链的核酸，并插入一个或多个可复制的载体中，用于进一步克隆(DNA的扩增)或用于表达。使用常规程序(例如通过使用能够与编码抗体的重链和轻链的基因特异性结合的寡核苷酸探针)易于分离并测序编码单克隆抗体的DNA。许多载体是可用的。载体组分一般包括、但不限于以下的一种或多种：信号序列、复制起点、一个或多个标记基因、增强子元件、启动子和转录终止序列。在一个实施方案中，本发明的人源化抗-TSLP抗体的轻链和重链这两者由相同载体(例如质粒或腺病毒载体)表达。

本发明的抗体和其抗原结合片段可以通过本领域已知的任何方法生产。在一个实施方案中，抗体在培养的哺乳动物或昆虫细胞中表达，例如中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、人胚肾(HEK)293细胞、小鼠骨髓瘤NSO细胞、幼仓鼠肾(BHK)细胞、草地夜蛾(Spodoptera frugiperda)卵巢(Sf9)细胞。在本发明的一个实施方案中，在真菌细胞中生产所述抗体和其抗原结合片段，所述真菌细胞是诸如毕赤酵母(Pichia)细胞、巴氏毕赤酵母(Pichia pastoris)细胞、芬兰毕赤酵母(Pichia finlandica)细胞、喜海藻糖毕赤酵母(Pichia trehalophila)细胞、Pichia koclamae细胞、膜醭毕赤酵母(Pichia membranaefaciens)细胞、Pichia minuta(Ogataea minuta、Pichia lindneri)细胞、Pichia opuntiae细胞、Pichia thermotolerans细胞、柳毕赤酵母(Pichia salictaria)细胞、Pichia guercuum细胞、皮杰普氏毕赤酵母(Pichiapijperi)细胞、具柄毕赤酵母(Pichia stiptis)细胞、甲醇毕赤酵母(Pichia methanolica)细胞、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)细胞、酵母属(Saccharomyces)细胞、多形汉逊酵母(Hansenula polymorpha)细胞、克鲁维酵母属(Kluyveromyces)细胞、乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis)细胞、白色假丝酵母菌(Candida albicans)细胞、构巢曲霉(Aspergillus nidulans)细胞、黑曲霉(Aspergillus niger)细胞、米曲霉(Aspergillus oryzae)细胞、里氏木霉(Trichoderma reesei)细胞、Chrysosporium lucknowense细胞、镰孢菌属(Fusarium)细胞、禾赤镰孢(Fusarium gramineum)细胞、镰孢霉(Fusarium venenatum)细胞或粗糙链孢霉(Neurospora crassa)细胞。

在一个实施方案中，由CHO细胞分泌的抗体被回收并通过标准层析法进行纯化，例如A蛋白、阳离子交换、阴离子交换、疏水作用和羟磷灰石层析。所获抗体被浓缩并贮存于20mM乙酸钠pH5.5中。

在又一个实施方案中，本发明的抗体根据WO2005/040395中所述方法在酵母中进行生产。简言之，将编码目标抗体的单独轻链或重链的载体引入不同的酵母单倍体细胞内，例如不同交配型的酵母巴氏毕赤酵母，所述酵母单倍体细胞任选地为互补营养缺陷体。转化的单倍体酵母细胞随后可以进行交配或融合，以产生能够生产重链和轻链这两者的二倍体酵母细胞。二倍体菌株随后能够分泌完全装配的和生物学活性的抗体。2条链的相对表达水平例如可如下优化：使用具有不同拷贝数的载体、使用不同强度的转录启动子或由驱动编码1条或2条链的基因转录的诱导型启动子诱导表达。

在一个实施方案中，将抗-TSLP抗体的各个重链和轻链引入酵母单倍体细胞内，以产生表达多条轻链的一种交配型的单倍体酵母菌株文库，和表达多条重链的不同交配型的单倍体酵母菌株文库。这些单倍体菌株文库可以进行交配(或融合为原生质球)，以生产表达包含轻链和重链的各种可能排列的抗体组合文库的一系列二倍体酵母细胞。随后可以筛选抗体组合文库，以确定任一个抗体是否具有优于(例如对TSLP的更高亲和力)原始抗体的性质。参见，例如，WO2005/040395。

在又一个实施方案中，本发明的抗体是其中抗体可变结构域的部分以分子量约13kDa的多肽连接的人结构结构域抗体。参见，例如，美国专利公开号2004/0110941。就合成的容易性、稳定性和给药途径而言，这样的单结构域、低分子量物质提供了众多优点。

VIII.用途

本发明提供了使用经工程改造的抗-TSLP来治疗和诊断炎性障碍(例如，在哺乳动物诸如人类中)的方法。

在一个优选的实施方案中，所述炎性障是哮喘。

在另一个优选的实施方案中，所述炎性障是变应性炎性障碍。在一个优选的实施方案中，所述变应性炎性障是变应性鼻窦炎、变应性哮喘、变应性结膜炎或特应性皮炎。

本发明提供了使用经工程改造的抗-TSLP来治疗和诊断以下病症的方法：纤维化、炎性肠病、霍奇金淋巴瘤、呼吸道病毒感染或其它病毒感染、类风湿性关节炎，或者以损伤部位的炎症为特征的任何其它障碍。

参考下面的实施例，会最好地理解本发明的宽广范围，所述实施例无意将本发明限制为具体实施方案。

本文所有的引述文献都通过引用并入本文，犹如每个单独的出版物或专利申请都具体地和单独地被指明通过引用并入本文。

本领域技术人员会明白，可不背离本发明的精神和范围，对本发明作出许多修改和变化。本文所描述各个具体实施方案仅以举例的方式给出，本发明要受所附权利要求书的条款以及这些权利要求的等同权利要求的全部范围所限定；本发明不受本文中以举例方式给出的具体实施方案的限定。

实施例1

一般方法

分子生物学的标准方法已有描述(Maniatis等，(1982)Molecular Cloning，ALaboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NY；Sambrook和Russell (2001)Molecular Cloning，第3版，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NY；Wu(1993)Recombinant DNA，第217卷，Academic Press，San Diego，CA)。标准方法还见于Ausbel等，(2001)Current Protocols in Molecular Biology，第1-4卷，John Wiley and Sons，Inc.New York，NY，其描述了在细菌细胞中克隆和DNA诱变(第1卷)、在哺乳动物细胞和酵母中克隆(第2卷)、复合糖和蛋白表达(第3卷)，以及生物信息学(第4卷)。

蛋白纯化的方法，包括免疫沉淀、层析、电泳、离心和结晶，已有描述(Coligan等，(2000)Current Protocols in Protein Science，第1卷，John Wiley and Sons，Inc.，New York)。描述了化学分析、化学修饰、翻译后修饰、融合蛋白的生产、蛋白糖基化(参见，例如，Coligan等人(2000)Current Protocols in ProteinScience，第2卷，John Wiley and Sons，Inc.，New York；Ausubel等，(2001)Current Protocols in Molecular Biology，第3卷，John Wiley and Sons，Inc.，NY，NY，第16.0.5-16.22.17页；Sigma-Aldrich，Co.(2001)Products for Life Science Research，St.Louis，MO；第45-89页；Amersham Pharmacia Biotech(2001)BioDirectory，Piscataway，N.J.，第384-391页)。多克隆抗体和单克隆抗体的生产、纯化和片段化已有描述(Coligan等人(2001)Current Protcols in Immunology，第1卷，John Wiley and Sons，Inc.，New York；Harlow和Lane(1999)UsingAntibodies，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NY；Harlow和Lane，出处同上)。用于表征配体/受体相互作用的标准技术是可用的(参见，例如，Coligan等人(2001)Current Protcols in Immunology，第4卷，John Wiley，Inc.，New York)。

描述了单链抗体和diabody(参见，例如，Malecki等人(2002)Proc.Natl.Acad.Sci.USA99：213-218；Conrath等人(2001)J.Biol.Chem.276：7346-7350；Desmyter等人(2001)J.Biol.Chem.276：26285-26290；Hudson和Kortt(1999)J.Immunol.Methods231：177-189；和美国专利号4,946,778)。提供了双功能抗体(参见，例如，Mack，等人(1995)Proc.Natl.Acad.Sci.USA92：7021-7025；Carter(2001)J.Immunol.Methods248：7-15；Volkel，等人(2001)Protein Engineering14：815-823；Segal，等人(2001)J.Immunol.Methods248：1-6；Brennan，等人(1985)Science229：81-83；Raso，等人(1997)J.Biol.Chem.272：27623；Morrison(1985)Science229：1202-1207；Traunecker，等人(1991)EMBO J.10：3655-3659；和美国专利号5,932,448、5,532,210和6,129,914)。

也提供了双特异性的抗体(参见，例如，Azzoni等人(1998)J.Immunol.161：3493；Kita等人(1999)J.Immunol.162：6901；Merchant等人(2000)J.Biol.Chem.74：9115；Pandey 等人(2000)J.Biol.Chem.275：38633；Zheng等人(2001)J.Biol Chem.276：12999；Propst等人(2000)J.Immunol.165：2214；Long(1999)Ann.Rev.Immunol.17：875)。

可以将抗体缀合到例如小药物分子、酶、脂质体、聚乙二醇(PEG)上。抗体可用于治疗、诊断、试剂盒或其它目的，并包括与例如染料、放射性同位素、酶或金属(例如，胶态金)偶联的抗体(参见，例如，Le Doussal等人(1991)J.Immunol.146：169-175；Gibellini 等人(1998)J.Immunol.160：3891-3898；Hsing和Bishop(1999)J.Immunol.162：2804-2811；Everts等人(2002)J.Immunol.168：883-889)。

用于流式细胞术的方法，包括荧光活化细胞分选术(FACS)，是可用的(参见，例如，Owens等人(1994)Flow Cytometry Principles for Clinical Laboratory Practice，John Wiley and Sons，Hoboken，NJ；Givan(2001)Flow Cytometry，第2版；Wiley-Liss，Hoboken，NJ；Shapiro(2003)Practical Flow Cytometry，John Wiley and Sons，Hoboken，NJ)。适用于修饰核酸(包括核酸引物和探针)、多肽和抗体(用作例如诊断试剂)的荧光试剂是可用的(Molecular Probes(2003)Catalogue，Molecular Probes，Inc.，Eugene，OR；Sigma-Aldrich (2003)Catalogue.St.Louis.MO)。

描述了免疫系统组织学的标准方法(参见，例如，Muller-Harmelink(编辑)(1986)Human Thymus.：Histopathology and Pathology，Springer Verlag，New York，NY；Hiatt等，(2000)Color Atlas of Histology，Lippincott，Williams和Wilkins，Phila，PA；Louis等，(2002)Basic Histology：Text andA tlas，McGraw-Hill，New York，NY)。

用于测定例如抗原片段、前导序列、蛋白折叠、功能结构域、糖基化位点和序列比对的软件包和数据库是可用的(参见，例如，GenBank，VectorSuite(Informax，Inc，Bethesda，MD)；GCG Wisconsin Package(Accelrys，Inc.，San Diego，CA)；(TimeLogic Corp.，Crystal Bay，Nevada)；Menne等，(2000)Bioinformatics16：741-742；Menne等，(2000)Bioinformatics Applications Note16：741-742；Wren等，(2002)Comput.Methods Programs Biomed.68：177-181；von Heijne(1983)Eur.J.Biochem.133：17-21；von Heijne(1986)NucleicAcidsRes.14：4683-4690)。

实施例2

优化抗-TSLP抗体序列以避免去酰胺化问题

在国际专利公开WO2008/076321中披露了结合人和食蟹猴TSLP的人源化抗体。在进一步分析该序列以后，发明人鉴别出，该抗体的CDR-H2含有在WO2008/076321的SEQ ID NO：4的位置61和63处的2个天冬酰胺(N)残基，它们潜在地可脱去酰胺基(deamidate)，并从而破坏抗体的结构，潜在地造成影响所述抗体的安全性和/或效力的严重意外问题。为了避免这些问题，发明人制备了改进的抗体，其避免了这些去酰胺化问题，并仍然保留对人和食蟹猴TSLP的亲和力，并且避免了与免疫原性有关的其它问题。这种改进的抗体包含SEQ ID NO：7的可变重链氨基酸序列。该氨基酸序列的CDR-H2对应着SEQ ID NO：2。

图1提供了本申请的SEQ ID NO：11与WO2008/076321的SEQ ID NO：14的比对(即，本文要求保护的抗体与在WO2008/076321中公开的抗体的重链的比对)。在图1中，“序列1”对应着本申请的SEQ ID NO：11，“序列2”对应着WO2008/076321的SEQ ID NO：14。在本文要求保护的抗体中，在WO2008/076321的SEQ ID NO：14的位置61处的天冬酰胺(N)被改变成丙氨酸(A)，在SEQ ID NO：14的位置63处的天冬酰胺被改变成赖氨酸(K)。做出这些变化，以避免这些残基的潜在去酰胺化。另外，在WO2008/076321的SEQ ID NO：4的位置65处的赖氨酸(K)被改变成谷氨酰胺(Q)。做出该变化，以减少产生免疫原性的机会。在WO2008/076321的SEQ ID NO：14的位置72处做出其它变化，其中将苏氨酸(T)改变成丙氨酸(A)。做出该变化，以提高所述抗体的结合亲和力。

令人惊讶地发现，在CDR-H2中的变化基本上不会影响得到的抗体的结合亲和力。

于2009年11月17日，将含有编码本文公开的抗体的重链和轻链的基因的载体保藏在ATCC，10801University Blvd.，Manassas，VA20110-2209，并获得ATCC保藏号PTA-10482。在布达佩斯条约提供的条件下，做出该保藏。编码轻链和重链(包括信号肽)的核酸序列是在单个质粒中，且两个基因从人巨细胞病毒(CMV)启动子表达。所述质粒也含有氨苄西林抗性基因(用于在哺乳动物细胞中进行选择)和DHFR基因(用于基因扩增)。

实施例3

使用KinExA技术测定人源化抗-人TSLP的平衡解离常数(K_D)

使用KinExA3000仪器(Sapidyne Instruments Inc.，WWW.sapidyne.com)，测定平衡解离常数(K_D)。KinExA使用动态排除测定法(Kinetic Exclusion Assay method)的原理，其基于测量抗体、抗原和抗体-抗原复合物的混合物中未复合抗体的浓度。通过使混合物暴露于固相固定化的抗原非常短暂的时间段，测量游离抗体的浓度。在实践中，这通过使溶液相抗原-抗体混合物流经流动池中捕获的抗原包被的颗粒来完成。由该仪器产生的数据使用定制软件进行分析。使用数学理论基于下述假定计算平衡常数：

1.结合遵循关于平衡的可逆结合等式：

k_on[Ab][Ag]＝k_off[AbAg]

2.抗体和抗原1∶1结合，且总抗体等于抗原-抗体复合物加游离抗体

3.仪器信号与游离抗体浓度线性相关。

材料

抗体：

·抗体1：亲本大鼠抗体23B12

·抗体2：人源化的抗hu TSLP mAb23B12(包含WO2008/076321的SEQ ID NO：14的重链和SEQ ID NO：16的轻链)

·抗体3：人源化的抗hu TSLP mAb23B12(包含WO2008/076321的SEQ ID NO：14的重链(具有在位置72处从T至A的突变)和SEQ ID NO：16的轻链)

·抗体4：人源化的抗hu TSLP mAb23B12(包含本申请的SEQ ID NO：11的重链和SEQ ID NO：12的轻链)

抗原：

·重组人TSLP

生物素化的抗原：

·生物素化的人TSLP

其它试剂：

·PMMA颗粒，98微米(Sapidyne，目录号440198)

·中和亲和素(Neutravidin)(Pierce，目录号31000)

·Cy5缀合山羊抗-大鼠IgG(H+L)(Jackson Immunoresearch Laboratories目录号112-175-167，批号60306)

·Cy5缀合山羊抗-HuIgG(H+L)(Jackson Immunoresearch Laboratories目录号109-175-088，批号49069和批号58552)。

实验条件：

根据Sapidyne“用具有短接头臂或不存在接头臂的生物素化的配体包被PMMA颗粒的方案(Protocol for coating PMMA particles with biotinylated ligands having short or nonexistent linker arms)”，用生物素化的人TSLP包被PMMA颗粒。所有实验程序都按照KinExA3000手册进行。所有运行都一式两份进行。

使用以下条件：

样品体积：2mL

样品流速：0.25mL/min

标记体积：1mL

标记流速：0.25mL/min

抗体浓度：0.1nM

最高抗原浓度：10nM

最低抗原浓度：10pM。

制备了抗原的两倍系列稀释液，并与恒定浓度的抗体混合。将混合物在25℃温育2小时至平衡。

表3

通过KinExa测得的K_D值

实施例4

抗体对人和食蟹猴TSLP的亲和力

使用BIAcore T100系统(BIAcore AB，Upsalla，瑞典)，通过表面等离子体共振，测量亲本大鼠和不同的人源化的衍生的抗人TSLP抗体对人(hu)和食蟹猴(cyno)TSLP的动力学结合活性。通过胺偶联化学，将大约100RU的人TSLP或食蟹猴TSLP固定化到传感器芯片CM5(Sensor Chip CM5)(研究级，BR-1006-68)上。用HBS-EP缓冲液(BR-1006-69)作为运行缓冲液，流速为30μL/min。将0.82-600nM的不同浓度的大鼠和人源化23B12抗体，以30μL/min的流速注射到固定化的人或食蟹猴TSLP表面上。在每个注射循环后，用一系列溶液(分别为10mM甘氨酸pH1.5和25mM NaOH)以75μL/min的流速再生CM5芯片表面。

使用背景扣除结合传感图(background subtraction binding sensorgram)，分析结合速率常数(ka)和解离速率常数(kd)及平衡解离常数K_D。用BIAevaluation软件(版本1.0)，将所得的数据集与二价分析物模型(bivalent analyte model)拟合。在表4中显示了不同抗体的测得的K_D。在单独的行中显示了单个实验的结果。

表4

BIAcore分析

*该特定实验使用购自R&D、并在大肠杆菌中表达的TSLP。使用在HEK293细胞中表达的TSLP进行其它实验

**这些实验在37℃进行。所有其它实验在室温进行

抗体1：亲本大鼠抗体23B12

抗体2：人源化的抗hu TSLP mAb23B12(包含WO2008/076321的SEQ ID NO：14的重链和SEQ ID NO：16的轻链)

抗体3：人源化的抗hu TSLP mAb23B12(包含WO2008/076321的SEQ ID NO：14的重链(具有在位置72处从T至A的突变)和SEQ ID NO：16的轻链)

抗体4：人源化的抗hu TSLP mAb23B12(包含本申请的SEQ ID NO：11的重链和SEQ ID NO：12的轻链)。

实施例5

用于评估中和性抗-TSLP抗体的增殖生物测定法(Bioassay)

通过应用短期增殖生物测定法(其利用表达重组人和食蟹猴TSLP受体的细胞)，评估不同的抗-TSLP抗体在生物学上中和人和食蟹猴TSLP的能力。转染子Ba/F3-TSLPR-IL7Ra细胞响应于TSLP而增殖，所述响应可被中和性抗-TSLP抗体抑制。针对在TSLP剂量-应答曲线的线性区域中、平稳水平(plateau)附近和TSLP EC50以上选定的TSLP浓度，滴定每种抗体。用Alamar Blue，通过比色法测量是否有增殖，所述Alamar Blue是一种基于代谢活性的检测的生长指示染料。抗体的中和TSLP的能力通过其EC50值进行评估，或通过诱导TSLP增殖的半数最大抑制的抗体浓度进行评估。

Ba/F3转染子维持在RPMI-1640培养基，10％胎牛血清，50μM2-巯基乙醇，2mM L-谷氨酰胺，50μug/mL青霉素-链霉素和10ng/mL小鼠IL-3中。

Ba/F3增殖生物测定在RPMI-1640，10％胎牛血清，50μM2-巯基乙醇，2mM L-谷氨酰胺和50μg/mL青霉素-链霉素中进行。

测定是在96孔平底板(Falcon 3072或类似的板)中进行。各试剂和细胞悬浮液的所有制品都采用适当的生物测定培养基。测定体积为150μL/孔。将抗-TSLP抗体的各滴定液与TSLP在室温下预温育30-60分钟，期间制备细胞。在抗体-细胞因子预温育后，将细胞加到各板中。将各生物测定板在湿润的组织培养箱(37℃，5％CO₂)中温育40-48小时。在培养时间结束时，加入Alamar Blue(Biosource目录号DAL1100)并使其显色8-12小时。然后在570 nm和600 nm(VERSAmax微板读数器，Molecular Probes)处读取吸光度，获得OD_570-600。推荐进行两次重复或三次重复试验。

细胞是在健康的生长状态使用，通常密度为3-8 x 10⁵/mL。将细胞计数、沉淀、在生物测定培养基中洗涤两次，悬浮至适当的密度以待铺板。

制备TSLP至工作浓度，以75μL加到第一孔。如下进行1∶3系列稀释：取前一孔25μL加入后一孔50μL生物测定培养基，最终留下50μL/孔。将细胞悬浮至适当的密度，用于以100μL/孔铺板。

制备抗体至工作浓度，以75μL加到第一孔。如下进行1：3系列稀释：取前一孔25μL加入后一孔50μL生物测定培养基，最终留下50μL/孔。将适当浓度的TSLP以50μL/孔加到含有被滴定抗体的各孔中。将细胞悬浮至适当的密度，用于以50μL/孔铺板，在抗体-细胞因子预温育后加入。

使用GraphPad Prism 3.0软件，将吸光度对细胞因子或抗体浓度作图，用S形剂量应答的非线性回归(曲线拟合)测定EC50值。

测定结果显示在表5中。在单独的行中显示了单个实验的结果。

表5

增殖的抑制

抗体1：亲本大鼠抗体23B12

在表6中，提供了表5所示结果的总结，包括平均值和SD(标准差)(仅使用在HEK293细胞中表达的TSLP得到的值，用于计算在表6中提供的值)。

表6

实施例6

抗-TSLP对人原代树突细胞的TSLP诱导的TARC生产的中和活性

通过Ficoll离心，从获自健康血液供方(斯坦福医学院血液中心，斯坦福，加州)的血沉棕黄层分离出外周血单核细胞(PBMC)，通过用负选择进行MACS(Miltenyi Biotech，Auburn，CA)，然后用FACS进行细胞分选，得到CD11c+树突细胞。如下获得谱系阴性的(Lin^-)细胞：使用小鼠抗-人CD3mAb(OKT3，DNAX)和小鼠抗-CD16mAb和山羊抗-小鼠IgG包被的磁珠(Miltenyi Biotech)，和使用用抗-CD19、CD56和CD14mAb(Miltenyi Biotech)直接包被的磁珠，通过MACS将T细胞、B细胞、NK细胞、红血细胞和单核细胞从PBMC中排除。随后，用TC-抗-CD4(Caltag，Burlingame，CA)、PE-抗-CD11c和FITC-抗-CD3、-CD14、-CD19、-CD56、-CD16和-CD20(均获自BD Biosciences，San Diego，CA)对Lin^-细胞染色，并在Vantage FACsorter^TM(BD Biosciences)上将CD11c+DC分选至大于99％的CD11c⁺CD4⁺Lin^-细胞的纯度。

分选后，立即在含有10％FCS和1％丙酮酸盐(Mediatech)、HEPES(Invitrogen，Grand Island，NY)和青霉素-链霉素(Mediatech)的RPMI(Mediatech，Herndon，VA)中培养CD11c⁺CD4⁺DC。以0.5x10⁶/ml，将细胞接种在平底96孔板中，各板中存在单独的培养基、TSLP(15ng/ml，DNAX)，或者TSLP与中和性抗-TSLP mAb(克隆23B12)或抗- TSLPR单克隆抗体或同种型对照大鼠IgG2a(R&D Systems，Minneapolis，MN)的组合。培养24小时后，收集DC培养物上清液，在-20℃冷冻保藏，通过ELISA(R&D Systems)分析TARC蛋白水平。

结果总结在表7中。在单独的行中显示了单个实验的结果。

表7

*这些实验使用购自R&D、并在大肠杆菌中表达的TSLP。使用在HEK293细胞中表达的TSLP进行其它实验

抗体1：亲本大鼠抗体23B12

在表8中，提供了表7所示结果的总结，包括平均值和SD(标准差)。

表8

*这些实验使用购自R&D、并在大肠杆菌中表达的TSLP。使用在HEK293细胞中表达的TSLP进行其它实验。

实施例7

抗-TSLP抗体对食蟹猴脾细胞的TSLP诱导的MDC生产的中和活性

如下从食蟹猴脾制备总脾细胞悬浮液：破碎脾组织，并使它穿过50目不锈钢组织筛(Bellco)，随后穿过70微米尼龙细胞过滤网(BD Falcon)。通过离心，在DPBS中洗涤细胞悬浮液，并将细胞沉淀物重新悬浮于预热的37℃ACK裂解缓冲液(BioWhittaker)中，以裂解红血细胞，并在37℃温育5分钟。在DPBS中稀释细胞，洗涤2次，并重新悬浮于培养基中。

在含有10％FCS和1％丙酮酸盐(Mediatech)、HEPES(Invitrogen，Grand Island，NY)和青霉素-链霉素(Mediatech)的RPMI(Mediatech，Herndon，VA)中培养脾细胞。以1.0x10⁶/ml，将细胞接种在平底96孔板中，各板中存在单独的培养基、TSLP(0.1ng/ml)，或者TSLP与中和性抗-TSLP mAb(抗体1或抗体4)的组合。培养120小时后，收集脾细胞培养物上清液，在-20℃冷冻保藏，通过人MDC ELISA(R&D Systems)分析MDC蛋白水平。

结果总结在表9中。在单独的行中显示了单个实验的结果。

表9

抗体1：亲本大鼠抗体23B12

本领域技术人员会明白，可不背离本发明的精神和范围，对本发明作出许多修改和变化。本文所描述各个具体实施方案仅以举例的方式给出，本发明要受所附权利要求书的条款以及这些权利要求的等同权利要求的全部范围所限定；本发明并不能受本文中以举例方式给出的具体实施方案的限定。

对以上出版物或文献的引述，并不意在承认任何前述出版物或文献是相关现有技术，也不构成对这些出版物或文献的内容或日期的确认。本文参考的各件美国专利和其它出版物通过引用并入本文。

序列表

本发明包括任意分离的多肽或分离的核酸，它们分别包括下述氨基酸或核苷酸序列中的任一个：

序列表

<110> SCHERING CORPORATION

<120> 经工程改造的抗-TSLP抗体

<130> BP2009.7093

<140>

<141>

<150> 61/297,008

<151> 2010-01-21

<150> 61/258,051

<151> 2009-11-04

<160> 16

<170> PatentIn 3.5版

<210> 1

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> 来源

<223> /注="人工序列的描述: 合成的肽"

<400> 1

Gly Tyr Ile Phe Thr Asp Tyr Ala Met His

1 5 10

<210> 2

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> 来源

<223> /注="人工序列的描述: 合成的肽"

<400> 2

Thr Phe Ile Pro Leu Leu Asp Thr Ser Asp Tyr Ala Gln Lys Phe Gln

1 5 10 15

Gly

<210> 3

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> 来源

<223> /注="人工序列的描述: 合成的肽"

<400> 3

Met Gly Val Thr His Ser Tyr Val Met Asp Ala

1 5 10

<210> 4

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> 来源

<223> /注="人工序列的描述: 合成的肽"

<400> 4

Arg Ala Ser Gln Pro Ile Ser Ile Ser Val His

1 5 10

<210> 5

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> 来源

<223> /注="人工序列的描述: 合成的肽"

<400> 5

Phe Ala Ser Gln Ser Ile Ser

1 5

<210> 6

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> 来源

<223> /注="人工序列的描述: 合成的肽"

<400> 6

Gln Gln Thr Phe Ser Leu Pro Tyr Thr

1 5

<210> 7

<211> 120

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> 来源

<223> /注="人工序列的描述: 合成的多肽"

<400> 7

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ile Phe Thr Asp Tyr

20 25 30

Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Thr Phe Ile Pro Leu Leu Asp Thr Ser Asp Tyr Ala Gln Lys Phe

50 55 60

Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Ala Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Arg Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Met Gly Val Thr His Ser Tyr Val Met Asp Ala Trp Gly Gln

100 105 110

Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 8

<211> 109

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> 来源

<223> /注="人工序列的描述: 合成的多肽"

<400> 8

Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Pro Ile Ser Ile Ser

20 25 30

Val His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Phe Ala Ser Gln Ser Ile Ser Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Thr Phe Ser Leu Pro Tyr

85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr

100 105

<210> 9

<211> 360

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> 来源

<223> /注="人工序列的描述: 合成的多核苷酸"

<400> 9

caggtgcagc tggtgcagtc tggcgccgaa gtgaagaaac ctggcgcctc cgtgaaggtg 60

tcctgcaagg cctccggcta catcttcacc gactacgcca tgcactgggt ccgccaggct 120

ccaggacagg gcctggaatg gatgggcacc ttcatccctc tgctggacac ctctgactac 180

gcccagaaat tccagggcag agtgaccatg accgccgaca cctccacctc caccgcctac 240

atggaactgc ggtccctgag atccgacgac accgccgtgt actactgcgc ccggatgggc 300

gtgacacact cctacgtgat ggacgcttgg ggccagggca ccctggtcac cgtgtcctcc 360

<210> 10

<211> 327

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> 来源

<223> /注="人工序列的描述: 合成的多核苷酸"

<400> 10

gagatcgtgc tgacccagtc ccctggcacc ctgtctctgt ctcccggcga gagagccacc 60

ctgtcctgcc gggcctccca gcctatctcc atctccgtgc actggtatca gcagaagcca 120

ggacaggccc ctcggctgct gatctacttc gcttctcagt ctatctctgg catccctgac 180

cggttctccg gctctggctc cggcaccgac ttcaccctga ccatctcccg gctggaacct 240

gaggacttcg ccgtgtacta ctgccagcag accttctccc tgccttacac cttcggccag 300

ggcaccaagg tggagatcaa gcgtacg 327

<210> 11

<211> 450

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> 来源

<223> /注="人工序列的描述: 合成的多肽"

<400> 11

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ile Phe Thr Asp Tyr

20 25 30

Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Thr Phe Ile Pro Leu Leu Asp Thr Ser Asp Tyr Ala Gln Lys Phe

50 55 60

Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Ala Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Arg Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Met Gly Val Thr His Ser Tyr Val Met Asp Ala Trp Gly Gln

100 105 110

Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val

115 120 125

Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala

130 135 140

Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser

145 150 155 160

Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val

165 170 175

Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro

180 185 190

Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys

195 200 205

Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp

210 215 220

Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly

225 230 235 240

Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile

245 250 255

Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu

260 265 270

Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His

275 280 285

Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg

290 295 300

Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys

305 310 315 320

Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu

325 330 335

Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr

340 345 350

Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu

355 360 365

Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp

370 375 380

Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val

385 390 395 400

Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp

405 410 415

Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His

420 425 430

Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro

435 440 445

Gly Lys

450

<210> 12

<211> 214

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> 来源

<223> /注="人工序列的描述: 合成的多肽"

<400> 12

Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Pro Ile Ser Ile Ser

20 25 30

Val His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Phe Ala Ser Gln Ser Ile Ser Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Thr Phe Ser Leu Pro Tyr

85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala

100 105 110

Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly

115 120 125

Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala

130 135 140

Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln

145 150 155 160

Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser

165 170 175

Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr

180 185 190

Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser

195 200 205

Phe Asn Arg Gly Glu Cys

210

<210> 13

<211> 1350

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> 来源

<223> /注="人工序列的描述: 合成的多核苷酸"

<400> 13

caggtgcagc tggtgcagtc tggcgccgaa gtgaagaaac ctggcgcctc cgtgaaggtg 60

tcctgcaagg cctccggcta catcttcacc gactacgcca tgcactgggt ccgccaggct 120

ccaggacagg gcctggaatg gatgggcacc ttcatccctc tgctggacac ctctgactac 180

gcccagaaat tccagggcag agtgaccatg accgccgaca cctccacctc caccgcctac 240

atggaactgc ggtccctgag atccgacgac accgccgtgt actactgcgc ccggatgggc 300

gtgacacact cctacgtgat ggacgcttgg ggccagggca ccctggtcac cgtgtcctcc 360

gctagcacca agggcccttc cgtgttccct ctggcccctt cctccaagtc tacctctggc 420

ggcaccgctg ctctgggctg tctggtcaag gactacttcc ctgagcctgt gacagtctct 480

tggaactctg gcgccctgac ctccggcgtg cacaccttcc ctgccgtgct gcagtctagt 540

ggcctgtact ccctgtcctc cgtggtcaca gtgccttcat catccctggg cacccagacc 600

tacatctgca acgtgaacca caagccttcc aacaccaagg tggacaagaa ggtggagcct 660

aagtcctgcg acaagaccca cacctgtcct ccatgccctg cccctgagct gctgggcgga 720

ccctccgtgt tcctgttccc tcctaagcct aaggacaccc tgatgatctc ccggacccct 780

gaagtgacct gcgtggtggt ggacgtgtcc cacgaggacc cagaagtgaa gttcaattgg 840

tacgtggacg gcgtggaggt gcacaacgcc aagaccaagc ctcgggagga acagtacaac 900

tccacctacc gggtggtgtc cgtgctgacc gtgctgcacc aggactggct gaacggcaaa 960

gaatacaagt gcaaggtgtc caacaaggcc ctgcctgccc ctatcgaaaa gaccatctcc 1020

aaggccaagg gccagccaag agaacctcag gtgtacaccc tgcctccctc tcgggacgag 1080

ctgaccaaga accaggtgtc cctgacatgc ctggtcaagg gcttctaccc ttccgatatc 1140

gccgtggagt gggagtctaa cggccagcct gagaacaact acaagaccac ccctcctgtg 1200

ctggactccg acggctcctt cttcctgtac tccaagctga ccgtggacaa gtcccggtgg 1260

cagcagggca acgtgttctc ctgctccgtg atgcacgagg ccctgcacaa ccactacacc 1320

cagaagtccc tgtccctgtc tcctggcaag 1350

<210> 14

<211> 642

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> 来源

<223> /注="人工序列的描述: 合成的多核苷酸"

<400> 14

gagatcgtgc tgacccagtc ccctggcacc ctgtctctgt ctcccggcga gagagccacc 60

ctgtcctgcc gggcctccca gcctatctcc atctccgtgc actggtatca gcagaagcca 120

ggacaggccc ctcggctgct gatctacttc gcttctcagt ctatctctgg catccctgac 180

cggttctccg gctctggctc cggcaccgac ttcaccctga ccatctcccg gctggaacct 240

gaggacttcg ccgtgtacta ctgccagcag accttctccc tgccttacac cttcggccag 300

ggcaccaagg tggagatcaa gcgtacggtg gccgctcctt ccgtgttcat cttccctccc 360

tccgacgagc agctgaagtc cggcaccgcc tctgtcgtct gcctgctgaa caacttctac 420

cctcgggagg ccaaggtgca gtggaaggtg gacaacgccc tgcagtccgg caactcccag 480

gaatccgtca ccgagcagga ctccaaggac tctacctact ccctgtcctc caccctgacc 540

ctgtccaagg ccgactacga gaagcacaag gtgtacgcct gcgaagtgac ccaccagggc 600

ctgtcatctc cagtgactaa gtctttcaac cggggcgagt gc 642

<210> 15

<211> 19

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> 来源

<223> /注="人工序列的描述: 合成的肽"

<400> 15

Met Ala Val Leu Gly Leu Leu Phe Cys Leu Val Thr Phe Pro Ser Cys

1 5 10 15

Val Leu Ser

<210> 16

<211> 19

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> 来源

<223> /注="人工序列的描述: 合成的肽"

<400> 16

Met Ala Pro Val Gln Leu Leu Gly Leu Leu Val Leu Phe Leu Pro Ala

1 5 10 15

Met Arg Cys

Claims

1.一种特异性地结合人TSLP的抗体或其TSLP-结合片段，其中所述抗体包含：

重链可变区，所述重链可变区包含：由SEQ ID NO:1组成的CDR-H1序列、由SEQ ID NO:2组成的CDR-H2序列和由SEQ ID NO:3组成的CDR-H3序列；和

抗体轻链可变区，所述轻链可变区包含：由SEQ ID NO:4组成的CDR-L1序列、由SEQ ID NO:5组成的CDR-L2序列和由SEQ ID NO:6组成的CDR-L3序列，

其中所述TSLP-结合片段选自Fab、Fab’、Fab’-SH、Fv、scFv、F(ab’)₂和diabody。

2.根据权利要求1所述的抗体或其TSLP-结合片段，其中所述重链可变区由SEQ ID NO:7的氨基酸序列组成。

3.根据权利要求1所述的抗体或其TSLP-结合片段，其中所述轻链可变区由SEQ ID NO:8的氨基酸序列组成。

4.根据权利要求1所述的抗体或其TSLP-结合片段，其中所述重链可变区由SEQ ID NO:7的氨基酸序列组成，且所述轻链可变区由SEQ ID NO:8的氨基酸序列组成。

5.根据权利要求1所述的抗体或其TSLP-结合片段，其中所述抗体由SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:12组成。

6.根据权利要求1所述的抗体或其TSLP-结合片段，其中所述抗体可以由在ATCC保藏号PTA-10482下保藏的载体来表达。

7.根据权利要求1-6中任一项所述的抗体或其TSLP-结合片段，其中所述抗体或其TSLP-结合片段是人源化抗体或其TSLP-结合片段。

8.一种分离的核酸，其编码根据权利要求1-7中任一项所述的抗体或其TSLP-结合片段。

9.一种表达载体，其包含根据权利要求8所述的核酸。

10.一种宿主细胞，其包含根据权利要求9所述的表达载体。

11.一种生产多肽的方法，所述方法包括：

在表达所述核酸序列的条件下，在培养基中培养根据权利要求10所述的宿主细胞，从而生产包含轻链和重链可变区的多肽；和

从所述宿主细胞或培养基回收所述多肽。

12.一种组合物，其包含与药学上可接受的载体或稀释剂相组合的根据权利要求1-7中任一项所述的抗体或其TSLP-结合片段。

13.根据权利要求1-7中任一项所述的抗体或其TSLP结合片段用于制备药物的用途，所述药物用于抑制免疫应答。

14.在ATCC保藏号PTA-10482下保藏的表达载体。

15.一种宿主细胞，其包含根据权利要求14所述的表达载体。