KR101545795B1 - 치료학적 항체에 대한 조성물 및 사용 방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 BAFF 수용체 (BAFFR)에 특이적으로 결합하는 항체에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 발명은 생체내 B 세포 고갈 활성을 갖는 BAFFR 길항제인 항체, 및 B 세포의 사멸 또는 고갈에 의해 치료될 수 있는 병리학적 장애, 예컨대 전신 홍반성 루푸스 또는 류마티스양 관절염 또는 다른 자가면역 질환 또는 림프종, 백혈병 및 골수종을 치료하기 위한 상기 항체에 대한 조성물 및 사용 방법에 관한 것이다.

Description

치료학적 항체에 대한 조성물 및 사용 방법 {COMPOSITIONS AND METHODS OF USE FOR THERAPEUTIC ANTIBODIES}
본 발명은 BAFF 수용체 (BAFFR)에 특이적으로 결합하는 항체에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 발명은 생체내 B 세포 고갈 활성을 갖는 BAFFR 길항제인 특이적 항체, 및 B 세포의 사멸 또는 고갈에 의해 치료될 수 있는 병리학적 장애, 예컨대 전신 홍반성 루푸스 또는 류마티스양 관절염 또는 다른 자가면역 질환 또는 림프종, 백혈병 및 골수종을 치료하기 위한 상기 항체에 대한 조성물 및 사용 방법에 관한 것이다.
BAFFR (또한 BR3, TNFRSF13C 또는 CD268로 공지되어 있음)은 종양 괴사 인자 수용체 상위패밀리의 구성원이다. 이는 B-림프구 및 T-세포의 하위세트 상에서 우세하게 발현된다. BAFFR은, 다양한 세포 유형, 가장 두드러지게는 골수성 세포에 의해 발현될 수 있는, 종양 괴사 인자 패밀리 구성원인 BLyS (또한 BAFF, CD257, TALL-1, THANK, TNFSF13B, ZTNF4로 공지되어 있음)에 특이적으로 결합한다. 기능적으로, BLyS/BAFFR 리간드-수용체 쌍은 미성숙 이행 B-세포의 성숙, 및 이소형 부류 전환을 비롯한 성숙 B-세포의 생존, 이동 및 활성화에 결정적으로 연루된다. BLyS는 단독으로 작용하거나, 또는 B-세포 수용체 (BCR), 인터류킨-4, 인터류킨-21 또는 CD40 리간드와 협력하여 작용할 수 있다. 일부 T-세포 상의 BAFFR의 존재로 인해, BLyS는 T-세포 활성화를 위한 공동-자극 인자로서 작용할 수 있다. BLyS는 또한 B-세포, TACI 및 BCMA 상에서 발견되는 2개의 추가적 수용체에 결합할 수 있다.
마우스에서의 BLyS 또는 BAFFR의 과다발현은 전신 홍반성 루푸스 (SLE)의 통상적 특징을 갖는 전신성 자가면역성의 발생 및 B-세포 증식증을 유발한다. 또한, SLE의 동물 모델을 나타내는 질환이 있는 (NZBxNZW)F1 및 자가면역 MRL-lpr/lpr 마우스는 혈청 중 증가된 BLyS 농도를 가지며, BLyS 수준은 질환 진행과 관련된다. BLyS 수준의 증가는 또한 SLE, 류마티스양 관절염, 쇼그렌 증후군, 베게너 육아종증 및 B-세포 악성종양을 앓는 인간 환자에서 발견되었다. 게다가, 자가면역 질환, 예컨대 류마티스양 관절염 (예컨대, 콜라겐 유발성 관절염), SLE 및 다발성 경화증 (예컨대, 실험적 자가면역성 뇌척수염)의 동물 모델에서의 질환 표현형은 가용성 수용체 융합 단백질로의 BLyS 차단에 의해 부분적으로 복구될 수 있다. 유사하게, BAFFR:Fc 융합 단백질을 사용하는 치료는 B-세포 생존을 차단함으로써 만성 이식편-대-숙주 질환 (cGVHD)을 억제한다. 류마티스양 관절염 및 SLE 환자에서의 항-BLyS 항체를 차단하는 것에 대한 임상적 효능 데이터는 이들 자가면역 장애에서의 BLyS의 병원성 역할을 강조한다.
BLyS 유도된 신호전달은 또한 악성 B-세포의 생존에 연루되는 것으로 나타난다. B-CLL 세포의 아폽토시스는 재조합 BLyS 또는 APRIL의 부가에 의해 치유될 수 있다. 반대로, B-CLL 세포의 아폽토시스는 가용성 BAFFR 융합 단백질의 부가 또는 항-APRIL 항체에 의해 증가되며, 이는 BLyS 및 APRIL이 악성 B-세포에 대한 자가분비 성장 인자로서 작용할 수 있음을 나타낸다. BAFFR은 다발성 골수종 및 비-호지킨 림프종을 비롯한 다양한 질환이 있는 조직 상에서 발현된다. 이들 자가면역 질환에 대해 현재 이용가능한 치료제는, 질환을 치유하지 않으면서 질환의 징후 및 증상의 향상에 목적을 두는 심각한 부작용을 갖는 면역억제제 (질환-변경 약물)이다. 현재 SLE 및 RA에 사용되는 대부분의 코르티코스테로이드 유사 면역억제제, 시클로포스파미드, 메토트렉세이트 및 아자티오프린은, 이들이 면역계의 모든 효과기 암(arm)에 영향을 미치기 때문에 심각한 감염의 위험을 갖는 일반적인 소염 효과를 일으킨다. 따라서, SLE 및/또는 RA, 및 BLyS가 질환에 기여하는 것으로 여겨지는 다른 관련 자가면역 질환의 치료를 위한 조성물 및 방법 (예컨대, BAFFR 신호전달을 방해하는 작용제)에 대한 요구가 여전히 존재한다.
따라서, 한 측면에서, 본 발명은 BAFFR 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 것을 특징으로 하며, BAFFR 폴리펩티드 (서열 87)의 표적에 대한 항체의 항원-결합 부위를 포함하는, 항체 또는 기능적 단백질을 제공한다. 한 실시양태에서, 항체 또는 기능적 단백질은 인간 또는 낙타류(camelid) 기원을 갖는 포유류로부터 유래된 것이거나, 또는 인간화 항체이다. 특정 실시양태에서, 항-BAFFR 항체는 표적 단백질 BAFFR에 특이적이며 BAFFR 또는 BAFFR의 단편에 결합하는 항원-결합 영역을 갖는 것을 특징으로 한다.
한 실시양태에서, 본 발명에 따른 항체는 효능작용 활성이 없거나 낮은 BAFFR 길항제이다. 특정 실시양태에서, 항체 또는 기능 단편은 표적 단백질 BAFFR에 결합하고, BLyS가 BAFFR에 결합하는 것을 감소시키거나 억제한다. 관련 실시양태에서, 항체 또는 기능 단편은 BLyS 유도된 인간 B 세포 증식 및/또는 IgG1 생성을 억제한다.
또다른 실시양태에서, 본 발명에 따른 항체는 시험관내 및 생체내에서 B 세포를 감소시킨다. 보다 바람직하게는, 본 발명의 항체는 효능작용 활성이 없는 BAFFR 길항제이고, 시험관내 및 생체내에서 인간 B 세포를 고갈시킨다.
결합은 활성 (항체에 의한 길항작용 또는 효능작용)의 측정에 사용될 수 있는 하나 이상의 분석에 의해 측정될 수 있다. 바람직하게는, 분석은 BLyS 유도된 인간 B 세포 증식, IgG1 생성 및/또는 인간 B 세포 고갈 활성을 비롯한, BAFFR 상에서의 항체의 효과 중 하나 이상을 측정한다.
또다른 실시양태에서, 본 발명은 BAFFR의 BLyS 결합 영역에 특이적으로 결합하는 항체를 제공한다. 관련 실시양태에서, 본 발명은 BAFFR의 서열 87의 아미노산 17 내지 43 영역에 결합하는 항체를 제공하며, 예를 들어 이는 적어도
Figure 112013066581509-pat00001
(서열 88)에 결합한다.
또다른 특정 실시양태에 따라, 항체는 100nM 이하, 10nM 이하, 1nM 이하의 KD로 BAFFR에 결합하며, 약 10nM 이하, 1nM 이하 또는 100pM 이하의 IC50으로 BLyS 유도된 인간 B 세포 증식을 억제하고, 시험관내에서 10nM 이하, 1nM 이하 또는 100pM 이하의 EC50으로 B 세포를 고갈시킨다.
또다른 관련 실시양태에서, 항체는 생체내 혈액 및 조직에서 B 세포의 비율(％)을 비처리 대조군 동물과 비교하여 70％, 바람직하게는 80％, 보다 바람직하게는 90％까지 감소시킨다.
일부 특정 실시양태에서, 본 발명의 항체는 BAFFR 관련 단백질과 교차-반응하지 않고, 보다 특히 인간 TACI 또는 BCMA 수용체와 교차-반응하지 않는다.
또다른 관련 실시양태에서, 본 발명에 따른 항체는 항체 의존성 세포 독성 (ADCC) 활성을 갖는 완전 인간 또는 인간화 IgG1 항체이며, BAFFR의 서열 87의 아미노산 17 내지 43을 포함하는 영역, 예를 들어 적어도 다음 펩티드
Figure 112013066581509-pat00002
(서열 88)에 결합하고, 시험관내에서 10nM 이하, 1nM 이하 또는 100pM 이하의 EC50으로 B 세포를 고갈시킨다.
또다른 관련 실시양태에서, 본 발명에 따른 항체는 푸코실트랜스퍼라제 결핍 세포주, 예를 들어 푸코실트랜스퍼라제를 코딩하는 FUT8 유전자의 결핍 발현을 갖는 포유동물 세포주에서의 재조합 발현에 의해 생성된 인간 항체이며, 이에 따라 FUT8 유전자를 발현하는 야생형 세포에 비해 ADCC 활성이 증가된다.
본 발명은 BLyS가 BAFFR에 결합하는 것을 방해하거나, 감소시키거나, 억제하고, 시험관내 및 생체내에서 B 세포를 고갈시키는 단리된 항체, 특히 인간 또는 인간화 항체에 관한 것이다. 특정 실시양태에서, 본 발명의 항체는 특정 중쇄 및 경쇄 서열로부터 유래하고/거나 특정 구조적 특징, 예컨대 특정 아미노산 서열을 포함하는 CDR 부위를 포함한다. 본 발명은 단리된 항체, 상기 항체의 제조 방법, 상기 항체를 포함하는 면역접합체 및 다가 또는 다중특이적 분자, 및 본 발명의 항체, 면역접합체 또는 이중특이적 분자를 함유하는 제약 조성물을 제공한다. 본 발명은 또한 BLyS 및/또는 BAFFR의 존재와 연관된 장애 또는 질병의 지연, 예방, 발병의 예방, 또는 발생의 억제를 위해 BAFFR의 기능을 억제 (예컨대, 길항)하는데 항체를 사용하여, 예를 들면 BAFFR에 의해 매개되거나, 또는 B 세포의 사멸 또는 고갈에 의해 치료될 수 있는 병리학적 장애; 예를 들어, 자가면역 질환, 예컨대 전신 홍반성 루푸스 (SLE) 또는 류마티스양 관절염 (RA) 또는 B 세포 신생물, 예컨대 림프종, 백혈병 또는 골수종을 치료하는 방법에 관한 것이다. 따라서, 상기 항체, 항체 단편 또는 항원-결합 단백질에서 방지적, 예방적 용도, 또는 치료 방법의 일부를 발견할 수 있다.
도 1은 DBA/1 마우스 (MCOL37) 에서의 제0일에서의 면역화, 제21일에서의 부스터 및 -9일에서의 치료 개시 후의 콜라겐-유발성 관절염 (CIA)의 결과를 나타낸다. 사각형 기호는 200 ㎍/200 ㎕ (복강내, 주2회) (n=8)의 투여량에서의 항-BAFF Ab- MOR6743-mlgG2a에 대한 발 스코어링을 나타낸다. 삼각형 기호는 200 ㎍/200 ㎕ (복강내, 주2회) (n=7)의 투여량에서의 이소형 항 CSA-IgG2a 대조군에 대한 발 스코어링을 나타낸다. 통계: 던넷(Dunnett) 다중 비교 시험 (일원분산분석). 비히클 대조군과 비교 (p<0.05*,p<0.01**,p>0.05n.s.).
도 2는 3마리의 사이노몰구스(cynomolgous) 원숭이에서의 항-BAFFR (MOR06654) 항체의 20 mg/kg 정맥내 투여 후 CD20+ 및 CD40+ 말초 혈액 세포의 절대수를 나타낸다.
도 3a는 3마리의 사이노몰구스에서의 항-BAFFR (MOR06654) 항체의 20 ㎍/kg 정맥내 투여 후 CD20+ 및 CD40+ 말초 혈액 세포의 절대수를 나타낸다.
도 3b는 3마리의 사이노몰구스에서의 비-푸코실화 항-BAFFR (MOR06654) 항체의 20 ㎍/kg 정맥내 투여 후 CD20+ 및 CD40+ 말초 혈액 세포의 절대수를 나타낸다.
본 발명을 보다 용이하게 이해할 수 있도록, 먼저 특정 용어를 정의한다. 부가의 정의는 상세한 설명 전반에 걸쳐 제시된다
용어 "면역 반응"은 병원체가 침입한 인체, 병원체로 감염된 세포 또는 조직, 암성 세포, 또는 자가면역 또는 병리학적 염증의 경우 정상 인간 세포 또는 조직에 대한 선택적인 손상, 파괴 또는 감소를 초래하는, 예를 들어 림프구, 항원 제시 세포, 식세포, 과립구, 및 상기 세포 또는 간에 의해 생산되는 가용성 거대분자 (항체, 시토카인, 및 보체 포함)의 작용을 지칭한다.
"신호 변환 경로" 또는 "신호전달 활성"은 단백질-단백질 상호 작용, 예를 들어 수용체에 대한 성장 인자의 결합에 의해 일반적으로 개시되어, 신호를 세포의 한 부분으로부터 세포의 또 다른 부분으로 전송시켜 주는 생화학적 인과 관계를 지칭한다. 일반적으로, 전송은 신호 변환을 유발시키는 일련의 반응에서 하나 이상의 단백질 상의 하나 이상의 티로신, 세린 또는 트레오닌 잔기를 특이적으로 인산화시키는 것을 포함한다. 끝에서 두 번째 과정에는 전형적으로, 유전자 발현을 변화시켜 주는 핵 사건이 포함된다.
용어 BAFFR 또는 BAFF 수용체는 서열 87로 정의된 바와 같은 인간 BAFFR을 지칭한다. PCT 특허 공보 WO200004032 및 WO2006073941에서 항-BAFFR 항체에 관해 일반적으로 언급한다. WO2006073941에는 특이적 항-BAFFR 항체가 기재되어 있다.
용어 "항체"는 본원에서 칭할 때 전체 항체, 및 그의 임의의 항원 결합 단편 (즉, "항원 결합 부분") 또는 단일쇄를 포함한다. 자연 발생하는 "항체"는 디술피드 결합에 의해 상호연결된 적어도 2개의 중쇄 (H) 및 2개의 경쇄 (L)를 포함하는 당단백질이다. 각각의 중쇄는 중쇄 가변 영역 (이하, VH라 약칭함) 및 중쇄 불변 영역으로 이루어진다. 중쇄 불변 영역은 CH1, CH2 및 CH3의 3개의 도메인으로 이루어진다. 각각의 경쇄는 경쇄 가변 영역 (이하, VL이라 약칭함) 및 경쇄 불변 영역으로 이루어진다. 경쇄 불변 영역은 하나의 도메인 CL로 이루어진다. VH 및 VL 영역은 추가로 프레임워크 영역 (FR)으로 불리는 보다 보존된 영역이 산재되어 있는 상보성 결정 영역 (CDR)으로 불리는 초가변 영역으로 세분화될 수 있다. 각 VH 및 VL은 3개의 CDR과 4개의 FR로 구성되는데, 이들은 아미노 말단에서부터 카복시 말단까지 다음 순서로 배열된다: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. 중쇄 및 경쇄의 가변 영역은 항원과 상호 작용하는 결합 도메인을 함유한다. 항체의 불변 영역은 숙주 조직 또는 인자, 예를 들어 면역계의 각종 세포 (예컨대, 효과기 세포) 및 전통적 보체계의 제1 성분 (Clq)에 대한 면역글로불린의 결합을 매개할 수 있다.
용어 항체의 "항원-결합 부위" (또는 간단히 "항원 부위")는 본원에서 사용될 때 항원 (예를 들어, BAFFR의 부위)에 특이적으로 결합하는 능력을 보유하는 전장 항체, 또는 항체의 하나 이상의 단편을 지칭한다. 항체의 항원 결합 기능은 전장 항체의 단편에 의해 수행될 수 있는 것으로 밝혀졌다. 용어 항체의 "항원-결합 부위" 내에 포함되는 결합 단편의 예는 Fab 단편 (VL, VH, CL 및 CH1 도메인으로 이루어지는 1가 단편); F(ab)2 단편 (힌지 영역에서 디술피드 가교로 연결된 2개의 Fab 단편을 포함하는 2가 단편); VH 및 CH1 도메인으로 이루어지는 Fd 단편; 항체의 단일 암(arm)의 VL 및 VH 도메인으로 이루어지는 Fv 단편; VH 도메인으로 이루어지는 dAb 단편 (문헌 [Ward et al., 1989 Nature 341:544-546]); 및 단리된 상보성 결정 영역 (CDR)을 포함한다.
또한, Fv 단편의 2개의 도메인인 VL 및 VH는 별개의 유전자에 의해 코딩되지만, 이들은 이들을 단일 단백질 사슬로서 제조될 수 있도록 하는 합성 링커에 의해 재조합 방법을 이용하여 연결될 수 있고, 여기서 VL 및 VH 영역은 쌍을 이루어 1가 분자 (단일쇄 Fv (scFv)로 공지됨; 예를 들어, 문헌 ([Bird et al., 1988 Science 242:423-426]; 및 [Huston et al., 1988 Proc. Natl. Acad. Sci. 85:5879-5883]) 참조)를 형성한다. 그러한 단일쇄 항체는 또한 용어 항체의 "항원-결합 영역" 내에 포함되는 것으로 의도된다. 이들 항체 단편은 당업자에게 공지된 통상적인 기술을 사용하여 얻어지고, 단편은 동일한 방식에서 유용성을 위해 무손상 항체로서 스크리닝된다.
"단리된 항체"는 본원에서 사용할 때 상이한 항원 특이성을 갖는 다른 항체가 실질적으로 없는 항체를 지칭한다 (예를 들어, BAFFR에 특이적으로 결합하는 단리된 항체는 BAFFR 이외의 항원에 특이적으로 결합하는 항체가 실질적으로 없음). 그러나, BAFFR에 특이적으로 결합하는 단리된 항체는 다른 항원, 예를 들어 다른 종으로부터의 BAFFR 분자에 대한 교차 반응성을 지닐 수 있다. 더우기, 단리된 항체는 기타 세포성 물질 및/또는 화학물질이 실질적으로 없을 수 있다.
본원에 사용되는 용어 "모노클로날 항체" 또는 "모노클로날 항체 조성물"은 단일 분자 조성물의 항체 분자 제제를 지칭한다. 모노클로날 항체 조성물은 특정 에피토프에 대한 단일 결합 특이성과 친화성을 나타낸다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "인간 항체"에는 프레임워크 영역과 CDR 영역 둘 다가 인간 기원의 서열로부터 유래되는 가변 영역을 갖는 항체가 포함되는 것으로 의도된다. 또한, 항체가 불변 영역를 함유하는 경우에, 불변 영역은 또한 그러한 인간 서열, 예를 들어 인간 생식계열 서열, 또는 인간 생식계열 서열의 돌연변이된 버전, 또는 예를 들어 문헌 [Knappik, et al. (2000. J Mol Biol 296, 57-86)]에 기재된 바와 같이 인간 프레임워크 서열 분석으로부터 유래된 컨센서스 프레임워크 서열을 함유하는 항체로부터 유래된다.
면역글로불린 가변 도메인 (예컨대 CDR)의 구조 및 위치는 널리 공지되어 있는 넘버링 반응식, 예를 들어 카바트(Kabat) 넘버링 반응식, 초티아(Chothia) 넘버링 반응식, 카바트와 초티아의 조합 (AbM) 등을 이용하여 정의할 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Sequences of Proteins of Immunological Interest, U.S. Department of Health and Human Services (1991), eds.; Kabat et al.]; [Al Lazikani et al. (1997) J. Mol. Bio. 273:927 948] 참조).
본 발명의 인간 항체에는 인간 서열에 의해 코딩되지 않는 아미노산 잔기 (예를 들어, 시험관 내에서 무작위 또는 부위 특이적 돌연변이 유발, 또는 생체내 체세포 돌연변이에 의해 도입된 돌연변이)가 포함될 수 있다. 그러나, 본원에서 사용되는 용어 "인간 항체"가 다른 포유동물 종, 예를 들어 마우스의 생식계열로부터 유래된 CDR 서열이 인간 프레임워크 서열 상에 그라프팅된 항체를 포함하는 의도는 아니다.
용어 "인간 모노클로날 항체"는 프레임워크 및 CDR 영역이 둘 다 인간 서열로부터 유래되는 가변 영역을 갖는 단일 결합 특이성을 보이는 항체를 나타낸다. 한 실시양태에서, 인간 모노클로날 항체는 불멸화 세포와 융합된 인간 중쇄 트랜스진 및 경쇄 트랜스진을 포함하는 게놈을 갖는 트랜스제닉 비인간 동물, 예를 들어 트랜스제닉 마우스로부터 수득된 B 세포를 포함하는 하이브리도마에 의해 생성된다.
본원에서 사용되는 용어 "재조합 인간 항체"는 재조합 수단에 의해 제조, 발현, 생성 또는 단리된 모든 인간 항체, 예를 들어 인간 면역글로불린 유전자에 대한 트랜스제닉 또는 트랜스크로모좀 (transchromosomal) 동물 (예를 들어 마우스), 또는 이로부터 제조된 하이브리도마로부터 단리된 항체, 인간 항체를 발현하도록 형질전환된 숙주 세포, 예를 들어 이입세포 (transfectoma)로부터 단리된 항체, 조합형 재조합 인간 항체 라이브러리로부터 단리된 항체, 및 인간 면역글로불린 유전자 서열의 전부 또는 일부를 다른 DNA 서열에 스플라이싱하는 것을 포함하는 임의의 기타 수단에 의해 제조, 발현, 생성 또는 단리된 항체를 포함한다. 이러한 재조합 인간 항체는 프레임워크 영역과 CDR 영역이 인간 생식계열 면역글로불린 서열로부터 유래되는 가변 영역을 갖는다. 그러나, 특정 실시양태에서 상기 재조합 인간 항체를 대상으로 하여 시험관내 돌연변이 유발시킬 수 있으므로 (또는 인간 Ig 서열에 대해 트랜스제닉인 동물을 사용하는 경우에는, 생체내 체세포 돌연변이를 유발시킴), 재조합 항체의 VH 및 VL 영역의 아미노산 서열은, 인간 생식계열 VH 및 VL 서열로부터 유래되고 이와 관련되면서도, 생체 내에서 인간 항체 생식계열 레퍼토리 내에 천연상 존재하지 않을 수 있는 서열이다.
본원에서 사용될 때 "이소형"은 중쇄 불변 영역 유전자에 의해 제공되는 항체 부류 (예를 들어, IgM, IgE, IgG, 예컨대 IgG1 또는 IgG2)를 나타낸다.
"항원을 인식하는 항체" 및 "항원에 특이적인 항체"란 어구는 본원에서 "항원에 특이적으로 결합하는 항체"라는 용어와 상호교환가능하게 사용된다.
본원에서 사용할 때 "BAFFR 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는" 항체는 100nM 이하, 10nM 이하, 1nM 이하의 KD로 인간 BAFFR 폴리펩티드에 결합하는 항체를 지칭하도록 의도된다. "BAFFR 이외의 항원과 교차-반응하는" 항체는 0.5 x 10-8 M 이하, 5 x 10-9 M 이하, 또는 2 x 10-9 M 이하의 KD로 상기 항원에 결합하는 항체를 지칭하도록 의도된다. "특정 항원과 교차-반응하지 않는" 항체는 1.5 x 10-8 M 이상의 KD, 또는 (5 내지 10) x 10-8 M, 또는 1 x 10-7 M 이상의 KD로 상기 항원에 결합하는 항체를 지칭하도록 의도된다. 특정 실시양태에서, 항원과 교차-반응하지 않는 항체는 표준 결합 분석에서 이들 단백질에 대해 본질적으로 검출불가능한 결합을 나타낸다.
본원에서 사용될 때, 용어 "길항제 항체"는 인간 B 세포 분석, 예컨대 인간 B 세포 증식 분석 또는 인간 B 세포 IgG1 생성 분석에서 BLyS의 존재하에 BAFFR 유도된 신호전달 활성을 감소, 저하 및/또는 억제하는 항체를 지칭하도록 의도된다. 인간 B 세포 증식 분석 및 IgG1 생성 분석의 예는 하기 실시예에서 보다 상세히 기재된다. 일부 실시양태에서, 항체는 인간 B 세포 증식 분석에서 측정된 바와 같이 10nM 이하, 1nM 이하 또는 100pM 이하의 IC50으로 BLyS 유도된 활성을 감소, 저하 또는 억제한다. 일부 실시양태에서, 항체는 IgG1 생성 분석에서 측정된 바와 같이 10nM 이하, 1nM 이하 또는 100pM 이하의 IC50으로 BLyS 유도된 활성을 억제한다.
본원에서 사용될 때, "효능작용 활성이 없는" 항체는 세포-기반 분석, 예컨대 인간 B 세포 증식 분석에서 BLyS의 부재하에 BAFFR 매개 신호전달 활성을 유의하게 증가시키지 않는 항체를 지칭하도록 의도된다. 이러한 분석은 하기 실시예에 보다 상세히 기재된다.
본원에서 사용될 때, 시험관내에서 B 세포를 고갈시키는 항체는 인간 B 세포 고갈 분석 (ADCC)에서 측정된 바와 같이 10nM 이하의 EC50, 바람직하게는 1nM 이하의 EC50, 보다 바람직하게는 100pM 이하의 EC50으로 B 세포를 고갈시키는 항체를 지칭하도록 의도된다. 상기 분석은 하기 실시예에 보다 상세히 기재된다.
본원에서 사용될 때, 생체내에서 B 세포를 고갈시키는 항체는 B 세포의 형광 활성화 세포 분류 (FACS)에 의해 측정된 바와 같이 생체내 B 세포의 비율(％)을 70％, 바람직하게는 80％, 보다 바람직하게는 90％까지 감소시키는 항체를 지칭하도록 의도된다. 이러한 분석은 하기 실시예에 보다 상세히 기재된다.
본원에 사용된 용어 "K회합" 또는 "Ka"는 특정 항체-항원 상호작용의 회합 속도를 지칭하는 것인 반면, 본원에 사용된 용어 "K해리" 또는 "Kd"는 특정 항체-항원 상호작용의 해리 속도를 지칭하도록 의도된다. 용어 "KD"는 본원에서 사용할 때 해리 상수를 나타내도록 의도되고, 이는 Kd 대 Ka의 비 (즉 Kd/Ka)로부터 얻고 몰 농도 (M)로 표현된다. 항체에 대한 KD 값은 당업계에 널리 정립된 방법을 이용하여 측정할 수 있다. 항체의 KD를 측정하는 방법은 표면 플라즈몬 공명을 이용함으로써, 또는 바이오센서 시스템, 예를 들어 비아코어(Biacore, 등록상표) 시스템을 이용함으로써이다.
본원에서 사용될 때, 용어 "친화도"는 단일 항원성 부위에서 항체와 항원 사이의 상호작용의 강도를 나타낸다. 각각의 항원성 부위 내에서, 항체 "암(arm)"의 가변 영역은 약한 비-공유 힘을 통해 수많은 부위에서 항원과 상호작용하고; 상호작용이 더 많을수록, 친화도가 더 강하다.
본원에 사용된 용어 "결합력"은 항체-항원 복합체의 전체 안정성 또는 강도의 정보 척도를 나타낸다. 이는 항체 에피토프 친화도; 항원 및 항체 둘 다의 원자가; 및 상호작용 부분의 구조적 배열의 3가지 주요 인자에 의해 제어된다. 궁극적으로, 이들 인자는 항체의 특이성, 즉, 특정 항체가 정확한 항원 에피토프에 결합하는 가능성을 규정한다.
본원에 사용된 용어 "ADCC" 또는 "항체 의존성 세포 독성" 활성은 인간 B 세포 고갈 활성을 지칭한다. ADCC 활성은 상기 기재된 인간 B 세포 고갈 분석에 의해 측정될 수 있다.
보다 고결합력의 프로브를 얻기 위해서, 이량체 접합체 (FACS 마커에 커플링된 항체 단백질의 2개 분자)를 구성하여 FACS에 의해 저친화도 상호작용 (예를 들어, 생식계열 항체와의)이 보다 쉽게 검출되도록 할 수 있다. 또한, 항원 결합의 결합력을 증가시키는 다른 수단은 항-BAFFR 항체의 본원에 기재된 임의의 구조체의 이량체, 삼량체 또는 다량체를 생성하는 것을 포함한다. 그러한 다량체는 예를 들어, 천연 C→N-말단 결합을 모방함으로써 또는 그들의 불변 영역을 통해 함께 유지되는 항체 이량체를 모방함으로써 개별 모듈들 사이의 공유 결합을 통해 생성할 수 있다. Fc/Fc 계면 내로 공학처리된 결합은 공유 결합 또는 비-공유 결합일 수 있다. 또한, Fc 이외의 이량체화 또는 다량체화 파트너가 그러한 보다 고차의 구조를 생성하기 위해 BAFFR 하이브리드에서 사용될 수 있다. 예를 들어, 다량체화 도메인, 예를 들어 WO2004039841 (Borean)에 기재된 삼량체화 도메인 또는 공개된 특허 출원 WO98/18943에 기재된 오량체화 도메인을 사용하는 것이 가능하다.
본원에 사용된 용어 항체에 대한 "선택성"은 특정 표적 폴리펩티드에 결합하지만 밀접하게 관련된 폴리펩티드에는 결합하지 않는 항체를 지칭한다.
본원에 사용된 용어 항체에 대한 "고 친화도"는 표적 항원에 대해 1nM 이하의 KD를 갖는 항체를 지칭한다. 본원에 사용된 용어 "대상체"에는 임의의 인간 또는 비인간 동물이 포함된다.
용어 "비인간 동물"은 모든 척추동물, 예를 들어 포유동물 및 비-포유동물, 예를 들어 비인간 영장류, 양, 개, 고양이, 말, 소, 닭, 양서류 및 파충류 등을 포함한다.
본원에 사용된 용어 "최적화된"은 뉴클레오티드 서열이 생산 세포 또는 유기체, 일반적으로 진핵 세포, 예를 들어 피치아 (Pichia)의 세포 또는 트리코더마 (Trichoderma)의 세포, 차이니즈 햄스터 난소 세포 (CHO) 또는 인간 세포에서 바람직한 코돈을 사용하여 아미노산 서열을 코딩하도록 변경된 것을 의미한다. 최적화된 뉴클레오티드 서열은 출발 뉴클레오티드 서열에 의해 원래 코딩되는 아미노산 서열 ("모" 서열로서도 알려짐)을 완전히 또는 가능한 많이 보유하도록 공학처리된다. 최적화된 서열은 본원에서 CHO 포유동물 세포에 바람직한 코돈을 갖도록 공학처리되지만, 다른 진핵 세포에서의 이들 서열의 최적화된 발현이 또한 본원에서 고안된다. 최적화된 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩되는 아미노산 서열은 또한 최적화된 것으로 언급된다.
본 발명의 각종 국면이 다음 하위섹션에 추가로 상세히 기재되어 있다.
예를 들어 ELISA, 웨스턴 블롯 및 RIA를 비롯한 다양한 종의 BAFFR을 향한 항체의 결합 능력을 평가하기 위한 표준 분석이 당업계에 공지되어 있다. 적합한 분석이 실시예에 상세히 기재되어 있다. 항체의 결합 역학 (예를 들어, 결합 친화도)는 또한 당업계에 공지된 표준 분석에 의해, 예를 들어 비아코어 분석에 의해 평가할 수 있다. BAFFR의 기능적 특성 (예를 들어, 수용체 결합, 인간 B 세포 증식 또는 IgG 생산의 예방 또는 유도)에 대한 항체의 효과를 평가하기 위한 분석이 실시예에 보다 상세히 기재되어 있다.
따라서, 당업계에 공지된 방법 및 본원에 기재된 방법에 따라 측정된 바와 같은 하나 이상의 이들 BAFFR의 기능적 특성 (예를 들어, 생화학, 면역화학, 세포성, 생리학적 또는 다른 생물학적 활성 등)을 "억제하는" 항체는 항체의 부재 하에 (또는, 예를 들어 비관련 특이성의 대조군 항체가 존재할 때) 보이는 것에 비해 특정 활성의 통계적으로 유의하게 감소되는 것과 관련되는 것으로 이해될 것이다. BAFFR 활성을 억제하는 항체는 측정된 파라미터의 10％ 이상, 50％, 80％ 또는 90％ 이상으로 그러한 통계적으로 유의한 감소를 일으키고, 특정 실시양태에서, 본 발명의 항체는 BAFFR 기능적 활성을 95％, 98％ 또는 99％ 초과로 억제할 수 있다.
용어 "교차-차단", "교차-차단된" 및 "교차-차단성"은 표준 경쟁 결합 분석에서 다른 항체 또는 결합제가 BAFFR에 결합하는 것을 방해하는, 항체 또는 다른 결합제의 능력을 의미하며 본원에서 상호교환적으로 사용된다.
항체 또는 다른 결합제가 BAFFR에 대한 또 다른 항체 또는 결합 분자의 결합을 방해할 수 있는 능력 또는 정도, 및 이로써 본 발명에 따라 교차-차단하는 것으로 말해질 수 있는지 여부는 표준 경쟁 결합 분석을 이용하여 결정할 수 있다. 하나의 적합한 분석은 표면 플라즈몬 공명 기술을 이용하여 상호작용의 정도를 측정할 수 있는 비아코어 기술 (예를 들어 비아코어 3000 기기 (비아코어 (스웨덴 웁살라)를 사용함으로써)의 사용을 포함한다. 교차-차단을 측정하기 위한 다른 분석에서는 ELISA-기반 접근법을 사용한다.
두 방법에 대한 추가의 상세한 내용은 실시예에 제공한다.
본 발명에 따라, 본 발명에 따른 교차-차단 항체 또는 다른 결합제는, 항체 또는 결합제의 조합물 (혼합물)의 기록된 결합이 조합된 2개의 항체 또는 결합제의 최대 이론적 결합 (상기 규정된)의 80％ 내지 0.1％ (예를 들어 80％ 내지 4％), 구체적으로 최대 이론적 결합의 75％ 내지 0.1％ (예를 들어 75％ 내지 4％), 보다 구체적으로 70％ 내지 0.1％ (예를 들어 70％ 내지 4％), 보다 구체적으로 최대 이론적 결합의 65％ 내지 0.1％ (예를 들어 65％ 내지 4％)가 되도록 기재된 비아코어 교차-차단 분석에서 BAFFR에 결합한다.
용액상 항-BAFFR 항체가 용액상 항-BAFFR 항체의 부재 (즉, 양성 대조군 웰) 하에 얻은 BAFFR 검출 신호 (즉, 코팅된 항체에 의해 결합된 BAFFR의 양)에 비해 BAFFR 검출 신호의 60％ 내지 100％, 구체적으로 70％ 내지 100％, 보다 구체적으로 80％ 내지 100％의 감소를 일으킬 수 있는 경우, 항체는 실시예에 설명되는 바와 같은 ELISA 분석에서 교차-차단성으로 규정된다.
재조합 항체
본 발명의 항체는 실시예에 기재된 바와 같이 단리되고 구조적으로 특성화되는 인간 재조합 항체를 포함한다. 단리된 본 발명의 항체의 VH 아미노산 서열은 서열 50-56에서 나타난다. 단리된 본 발명의 항체의 VL 아미노산 서열은 서열 43-49에서 각각 나타난다. 본 발명의 항체의 바람직한 전장 경쇄 아미노산 서열의 예는 서열 71-74에서 나타난다. 본 발명의 항체의 바람직한 전장 중쇄 아미노산 서열의 예는 서열 75-78에서 각각 나타난다. 항체의 바람직한 전장 중쇄 및 경쇄 아미노산 서열의 다른 예에는, 2009년 4월 29일에 노바티스 파마 아게 (Novartis Pharma AG) (스위스 체하-4002 포룸 1)에 의해 DSMZ에 각각 기탁 번호 DSM22542 및 DSM22543으로 기탁된 플라스미드 pBW510 및 pBW512에 함유된 상응하는 DNA 서열에 의해 코딩되는 것들이 있다. 다른 본 발명의 항체에는 CDR 영역에서, 2009년 4월 29일에 노바티스 파마 아게 (스위스 체하-4002 포룸 1)에 의해 DSMZ에 각각 기탁 번호 DSM22542 및 DSM22543으로 기탁된 플라스미드 pBW510 및 pBW512의 상응하는 DNA 서열에 의해 코딩되는 CDR 영역을 포함하는 상기 기재된 서열에 나타낸 CDR 영역과 60, 70, 80, 90 또는 95％ 이상의 동일성을 갖는, 아미노산 결실, 삽입 또는 치환에 의해 돌연변이된 아미노산이 포함된다. 일부 실시양태에서, 이는 상기 기재된 서열에 나타낸 CDR 영역과 비교시에 CDR 영역에서 1, 2, 3, 4 또는 5개 이하의 아미노산이 아미노산 결실, 삽입 또는 치환에 의해 돌연변이된 돌연변이 아미노산 서열을 포함한다.
또한, 가변 중쇄 모 뉴클레오티드 서열은 서열 64에서 나타난다. 가변 경쇄 모 뉴클레오티드 서열은 서열 57에서 나타난다다. 포유동물 세포에서의 발현을 위해 최적화된 전장 경쇄 뉴클레오티드 서열은 서열 83-86에서 나타난다. 포유동물 세포에서의 발현을 위해 최적화된 전장 중쇄 뉴클레오티드 서열은 서열 79-82에서 나타난다. 본 발명의 다른 항체에는 상기 기재된 서열과 60, 70, 80, 90 또는 95％ 이상의 동일성을 갖는 돌연변이된 아미노산 또는 핵산이 포함된다. 일부 실시양태에서, 이는 상기 기재된 서열에 나타낸 가변 영역과 비교시에 가변 영역에서 1, 2, 3, 4 또는 5개 이하의 아미노산이 아미노산 결실, 삽입 또는 치환에 의해 돌연변이된 돌연변이 아미노산 서열을 포함한다.
각각의 이들 항체가 동일한 에피토프에 결합하고 몇몇 모 항체로부터 파생되었기 때문에, VH, VL, 전장 경쇄 및 전장 중쇄 서열 (뉴클레오티드 서열 및 아미노산 서열)은 "혼합 및 매칭"되어 본 발명의 다른 항-BAFFR 결합 분자를 생성할 수 있다. 이러한 "혼합 및 매칭"된 항체의 BAFFR 결합은 상기 및 실시예에 기재된 결합 분석 (예컨대, ELISA)을 이용하여 시험할 수 있다. 이들 사슬이 혼합 및 매칭되는 경우, 특정 VH/VL 쌍으로부터의 VH 서열은 구조적으로 유사한 VH 서열로 대체되어야 한다. 마찬가지로, 특정 전장 중쇄/전장 경쇄 쌍으로부터의 전장 중쇄 서열은 구조적으로 유사한 전장 중쇄 서열로 대체되어야 한다. 마찬가지로, 특정 VH/VL 쌍으로부터의 VL 서열은 구조적으로 유사한 VL 서열로 대체되어야 한다. 마찬가지로, 특정 전장 중쇄/전장 경쇄 쌍으로부터의 전장 경쇄 서열은 구조적으로 유사한 전장 경쇄 서열로 대체되어야 한다. 따라서, 한 측면에서, 본 발명은 서열 50-56으로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및 서열 43-49로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 가지며, BAFFR에 특이적으로 결합하는 단리된 재조합 항체 또는 그의 항원 결합 영역을 제공한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은
(i) 서열 75-78로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 전장 중쇄; 및 서열 71-74로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 전장 경쇄를 가지며, BAFFR에 특이적으로 결합하는 단리된 재조합 항체; 또는
(ii) 그의 항원 결합 부위를 포함하는 기능적 단백질
을 제공한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은
(i) 서열 79-82로 이루어진 군으로부터 선택되는, 포유동물 세포 내에서의 발현을 위해 최적화된 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩된 전장 중쇄; 및 서열 83-86으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 포유동물 세포에서의 발현을 위해 최적화된 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩된 전장 경쇄를 가지며, BAFFR에 특이적으로 결합하는 단리된 재조합 항체; 또는
(ii) 그의 항원 결합 부위를 포함하는 기능적 단백질
을 제공한다.
항체의 VH CDR1의 아미노산 서열은 서열 1-7에서 나타난다. 항체의 VH CDR2의 아미노산 서열은 서열 8-14에서 나타난다. 항체의 VH CDR3의 아미노산 서열은 서열 15-21에서 나타난다. 항체의 VL CDR1의 아미노산 서열은 서열 22-28에서 나타난다. 항체의 VL CDR2의 아미노산 서열을 서열 29-35에서 나타난다. 항체의 VL CDR3의 아미노산 서열은 서열 36-42에서 나타난다. 서열 1-42에 나타나는 CDR 영역은 카바트 시스템을 이용하여 서술된다 (문헌 [Kabat, E. A., et al., 1991 Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242]).
각각의 이들 항체가 BAFFR에 결합할 수 있고, 항원-결합 특이성이 주로 CDR1, 2 및 3 영역에 의해 제공되면, VH CDR1, 2 및 3 서열 및 VL CDR1, 2 및 3 서열은 "혼합 및 매칭"될 수 있으며 (즉, 상이한 항체로부터의 CDR이 혼합 및 매칭될 수 있음), VH CDR1, 2 및 3, 및 VL CDR1, 2 및 3을 함유하는 각각의 항체는 본 발명의 다른 항-BAFFR 결합 분자를 생성한다. 이러한 "혼합 및 매칭"된 항체의 BAFFR 결합을 상기 및 실시예에 기재된 결합 분석 (예컨대, ELISA)을 이용하여 시험할 수 있다. VH CDR 서열이 혼합 및 매칭되는 경우, 특정 VH 서열로부터의 CDR1, CDR2 및/또는 CDR3 서열을 구조적으로 유사한 CDR 서열(들)로 대체시켜야 한다. 마찬가지로, VL CDR 서열이 혼합 및 매칭되는 경우, 특정 VL 서열로부터의 CDR1, CDR2 및/또는 CDR3 서열을 구조적으로 유사한 CDR 서열(들)로 대체시켜야 한다. 신규한 VH 및 VL 서열이 하나 이상의 VH 및/또는 VL CDR 영역 서열을 본 발명의 모노클로날 항체에 대해 본원에 제시된 CDR 서열로부터의 구조적으로 유사한 서열로 치환함으로써 생성될 수 있음은 당업자에게 쉽게 명백해질 것이다.
일부 실시양태에서, 단리된 재조합 항체 또는 그의 항원 결합 영역은 서열 1-7로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR1; 서열 8-14로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR2; 서열 15-21로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR3; 서열 22-28로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR1; 서열 29-35로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR2; 및 서열 36-42로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR3을 갖고; 여기서, 항체는 BAFFR에 특이적으로 결합한다.
특정 실시양태에서, 항체는 서열 2의 중쇄 가변 영역 CDR1; 서열 9의 중쇄 가변 영역 CDR2; 서열 16의 중쇄 가변 영역 CDR3; 서열 23의 경쇄 가변 영역 CDR1; 서열 30의 경쇄 가변 영역 CDR2; 및 서열 37의 경쇄 가변 영역 CDR3을 포함한다.
특정 실시양태에서, 항체는 서열 3의 중쇄 가변 영역 CDR1; 서열 10의 중쇄 가변 영역 CDR2; 서열 17의 중쇄 가변 영역 CDR3; 서열 24의 경쇄 가변 영역 CDR1; 서열 31의 경쇄 가변 영역 CDR2; 및 서열 38의 경쇄 가변 영역 CDR3을 포함한다.
특정 실시양태에서, 항체는 서열 4의 중쇄 가변 영역 CDR1; 서열 11의 중쇄 가변 영역 CDR2; 서열 18의 중쇄 가변 영역 CDR3; 서열 25의 경쇄 가변 영역 CDR1; 서열 32의 경쇄 가변 영역 CDR2; 및 서열 39의 경쇄 가변 영역 CDR3을 포함한다.
특정 실시양태에서, 항체는 서열 5의 중쇄 가변 영역 CDR1; 서열 12의 중쇄 가변 영역 CDR2; 서열 19의 중쇄 가변 영역 CDR3; 서열 26의 경쇄 가변 영역 CDR1; 서열 33의 경쇄 가변 영역 CDR2; 및 서열 40의 경쇄 가변 영역 CDR3을 포함한다.
특정 실시양태에서, 항체는 서열 6의 중쇄 가변 영역 CDR1; 서열 13의 중쇄 가변 영역 CDR2; 서열 20의 중쇄 가변 영역 CDR3; 서열 27의 경쇄 가변 영역 CDR1; 서열 34의 경쇄 가변 영역 CDR2; 및 서열 41의 경쇄 가변 영역 CDR3을 포함한다.
특정 실시양태에서, 항체는 서열 7의 중쇄 가변 영역 CDR1; 서열 14의 중쇄 가변 영역 CDR2; 서열 21의 중쇄 가변 영역 CDR3; 서열 28의 경쇄 가변 영역 CDR1; 서열 35 경쇄 가변 영역 CDR2; 및 서열 42의 경쇄 가변 영역 CDR3을 포함한다.
본원에서 사용할 때, 인간 항체는, 항체의 가변 영역 또는 전장 사슬이 인간 생식계열 면역글로불린 유전자를 사용하는 시스템으로부터 얻어지는 경우에 특정 생식계열 서열"의 생성물"이거나 "그로부터 유도된" 중쇄 또는 경쇄 가변 영역, 또는 전장 중쇄 또는 경쇄를 포함한다. 이러한 시스템에는 인간 면역글로불린 유전자를 보유하고 있는 트랜스제닉 마우스를 관심있는 항원으로 면역화시키거나, 또는 파지 상에 디스플레이된 인간 면역글로불린 유전자 라이브러리를 관심있는 항원을 이용하여 스크리닝하는 것이 포함된다. 인간 생식계열 면역글로불린 서열"의 생성물"이거나 "그로부터 유도된" 인간 항체는 인간 항체의 아미노산 서열을 인간 생식계열 면역글로불린의 아미노산 서열 서열과 비교하고, 인간 항체의 서열에 가장 근접한 서열 [즉, 가장 큰 동일성(％)을 나타냄]인 인간 생식계열 면역글로불린 서열을 선별함으로써 확인할 수 있다. 특정 인간 생식계열 면역글로불린 서열"의 생성물"이거나 "그로부터 유도된" 인간 항체는 생식계열 서열에 비해, 예를 들어 자연 발생하는 체세포 돌연변이, 또는 부위-지정 돌연변이의 의도적인 도입으로 인한 아미노산 차이를 가질 수 있다. 그러나, 선별된 인간 항체는 전형적으로, 인간 생식계열 면역글로불린 유전자에 의해 코딩된 아미노산 서열에 대한 아미노산 서열 동일률이 90％ 이상이고, 기타 종의 생식계열 면역글로불린 아미노산 서열 (예컨대, 뮤린 생식계열 서열)과 비교시 인간 항체를 확인시켜 주는 아미노산 잔기를 함유하고 있다. 특정한 경우, 인간 항체는 생식계열 면역글로불린 유전자에 의해 코딩된 아미노산 서열에 대한 아미노산 서열 동일성이 60％, 70％, 80％, 90％ 이상 또는 95％ 이상, 또는 심지어 96％, 97％, 98％ 또는 99％ 이상일 수 있다. 전형적으로, 특정 인간 생식계열 서열로부터 유래된 인간 항체는 인간 생식계열 면역글로불린 유전자에 의해 코딩된 아미노산 서열과는 10개 이하의 아미노산 차이를 나타낼 것이다. 특정 경우, 인간 항체는 인간 생식계열 면역글로불린 유전자에 의해 코딩된 아미노산 서열과 5개 이하, 또는 심지어 4, 3, 2 또는 1개 이하의 아미노산 차이를 나타낼 수 있다.
상동성 항체
또 다른 실시양태에서, 본 발명의 항체는 본원에 기재된 항체의 아미노산 및 뉴클레오티드 서열에 상동성인 전장 중쇄 및 경쇄 아미노산 서열; 전장 중쇄 및 경쇄 뉴클레오티드 서열, 가변 영역 중쇄 및 경쇄 뉴클레오티드 서열, 또는 가변 영역 중쇄 및 경쇄 아미노산 서열을 갖고, 여기서 항체는 본 발명의 항-BAFFR 항체의 목적하는 기능적 특성을 보유한다.
예를 들어, 본 발명은 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 포함하는 단리된 재조합 항체 (또는 그의 항원 결합 부위를 포함하는 기능적 단백질)를 제공하며, 여기서: 중쇄 가변 영역은 서열 50-56으로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열에 대해 80％ 이상, 또는 90％ 이상 동일한 아미노산 서열을 포함하고; 경쇄 가변 영역은 서열 43-49로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열에 대해 80％ 이상, 또는 90％ 이상 동일한 아미노산 서열을 포함하며; 항체는 BAFFR에 특이적으로 결합하고, 항체는 하기 기능적 특성 중 하나 이상을 나타낸다: 이는 BLyS 유도된 B 세포 증식, 또는 BLyS 유도된 IgG1 생성을 억제하고, 시험관내 또는 생체내에서 B 세포를 고갈시킨다.
추가의 예에서, 본 발명은 전장 중쇄 및 전장 경쇄를 포함하는 단리된 재조합 항체 (또는 그의 항원 결합 부위를 포함하는 기능적 단백질)을 제공하며, 여기서: 전장 중쇄는 서열 75-78로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열에 대해 80％ 이상, 또는 90％ 이상 동일한 아미노산 서열을 포함하고; 전장 경쇄는 서열 71-74로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열에 대해 80％ 이상, 또는 90％ 이상 동일한 아미노산 서열을 포함하며; 항체는 BAFFR에 특이적으로 결합하고, 항체는 하기 기능적 특성 중 하나 이상을 나타낸다: 이는 BLyS 유도된 B 세포 증식, 또는 BLyS 유도된 IgG1 생성을 억제하고, 시험관내 또는 생체내에서 B 세포를 감소시킨다.
또 다른 예에서, 본 발명은 전장 중쇄 및 전장 경쇄를 포함하는 단리된 재조합 항체 (또는 그의 항원 결합 부위를 포함하는 기능적 단백질)을 제공하며, 여기서: 전장 중쇄는 서열 79-82로 이루어진 군으로부터 선택되는 뉴클레오티드 서열에 대해 80％ 이상, 또는 90％ 이상 동일한 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩되고; 전장 경쇄는 서열 83-86으로 이루어진 군으로부터 선택되는 뉴클레오티드 서열에 대해 80％ 이상, 또는 90％ 이상 동일한 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩되며; 항체는 BAFFR에 특이적으로 결합하고, 항체는 하기 기능적 특성 중 하나 이상을 나타낸다: 이는 BLyS 유도된 B 세포 증식, 또는 BLyS 유도된 IgG1 생성을 억제하고, 시험관내 또는 생체내에서 B 세포를 감소시킨다.
다양한 실시양태에서, 항체는 1개 이상, 2개 이상 또는 3개의 상기 논의된 기능적 특성을 나타낼 수 있다. 항체는 예를 들어 인간 항체, 인간화 항체 또는 키메라 항체일 수 있다. 바람직하게는, 항체는 완전 인간 IgG1 항체이다.
다른 실시양태에서, VH 및/또는 VL 아미노산 서열은 상기 제시된 서열에 대해 50％, 60％, 70％, 80％, 90％, 95％, 96％, 97％, 98％ 또는 99％ 동일할 수 있다. 다른 실시양태에서, VH 및/또는 VL 아미노산 서열은 1, 2, 3, 4 또는 5개 이하의 아미노산 위치에서의 아미노산 치환을 제외하고는 동일할 수 있다. 각각 서열 50-56 및 서열 43-49의 VH 및 VL 영역에 대해 높은 (즉, 80％ 이상) 동일성을 갖는 VH 및 VL 영역을 갖는 항체는 각각 서열 64-70 및 57-63을 코딩하는 핵산 분자의 돌연변이 유발 (예를 들어, 부위-지정 또는 PCR-매개 돌연변이 유발)에 이어, 본원에 기재된 기능적 분석을 이용하여 코딩된 변경 항체를 보유 기능 (즉, 상기 기재된 기능)에 대해 시험함으로써 얻을 수 있다.
다른 실시양태에서, 전장 중쇄 및/또는 전장 경쇄 아미노산 서열은 상기 기재된 서열에 대해 50％, 60％, 70％, 80％, 90％, 95％, 96％, 97％, 98％ 또는 99％ 동일할 수 있다. 각각 임의의 서열 75-78의 전장 중쇄 및 임의의 서열 71-74의 전장 경쇄에 대해 높은 (즉, 80％ 이상) 동일성을 갖는 전장 중쇄 및 전장 경쇄를 갖는 항체는 각각 서열 79-82 및 서열 83-86을 코딩하는 핵산 분자의 돌연변이 유발 (예를 들어, 부위-지정 또는 PCR-매개 돌연변이 유발)에 이어, 본원에 기재된 기능적 분석을 이용하여 코딩된 변경 항체를 보유 기능 (즉, 상기 기재된 기능)에 대해 시험함으로써 얻을 수 있다.
다른 실시양태에서, 전장 중쇄 및/또는 전장 경쇄 뉴클레오티드 서열은 상기 제시된 서열에 대해 60％, 70％, 80％, 90％, 95％, 96％, 97％, 98％ 또는 99％ 동일할 수 있다.
다른 실시양태에서, 중쇄 및/또는 경쇄 뉴클레오티드 서열의 가변 영역은 상기 제시된 서열에 대해 60％, 70％, 80％, 90％, 95％, 96％, 97％, 98％ 또는 99％ 동일할 수 있다.
본원에 사용된 두 서열 사이의 동일성 비율(％)은 2개의 서열의 최적 정렬을 위해 도입될 필요가 있는 갭의 수 및 각각의 갭의 길이를 고려한, 서열이 공유하는 동일한 위치의 수의 함수이며 (즉, 동일률(％) = 동일한 위치의 #/위치의 총 # × 100)다. 서열의 비교, 및 두 서열 간의 동일률(％)의 결정은 하기 기재되는 바와 같은 수학적 알고리즘을 이용하여 달성할 수 있다.
두 아미노산 서열 간의 동일률(％)은, PAM120 중량 잔기 표, 갭 길이 페널티 12 및 갭 페널티 4를 사용하여 ALIGN 프로그램 (버전 2.0) 내로 통합된 이. 메이어스(E. Meyers) 및 더블유.밀러(W. Miller)의 알고리즘 (문헌 [Comput. Appl. Biosci., 4:11-17, 1988])을 이용하여 측정할 수 있다. 또한, 2개의 아미노산 서열 간의 동일률(％)은 GCG 소프트웨어 패키지 (http://www.gcg.com에서 입수가능함) 내의 GAP 프로그램 내로 통합된 니들만(Needleman) 및 분쉬(Wunsch) (문헌 [J. Mol, Biol. 48:444-453, 1970]) 알고리즘을 이용하여, 블로섬(Blossom) 62 매트릭스 또는 PAM250 매트릭스, 및 갭 가중치 16, 14, 12, 10, 8, 6 또는 4, 및 길이 가중치 1, 2, 3, 4, 5 또는 6을 사용하여 측정할 수 있다.
보존적 변형을 갖는 항체
특정 실시양태에서, 본 발명의 항체는 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 갖고, 여기서 이들 CDR 서열 중 하나 이상은 본원에 기재된 항체 또는 그의 보존적 변형에 기반한 특정 아미노산 서열을 갖고, 항체는 본 발명의 항-BAFFR 항체의 목적하는 기능적 특성을 보유한다. 따라서, 본 발명은 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역으로 이루어진 단리된 재조합 항체, 또는 그의 항원 결합 부위를 포함하는 기능적 단백질을 제공하며, 여기서 중쇄 가변 영역 CDR1 아미노산 서열은 서열 1-7 및 그의 보존적 변형으로 이루어진 군으로부터 선택되고; 중쇄 가변 영역 CDR2 아미노산 서열은 서열 8-14 및 그의 보존적 변형으로 이루어진 군으로부터 선택되고; 중쇄 가변 영역 CDR3 아미노산 서열은 서열 15-21 및 그의 보존적 변형으로 이루어진 군으로부터 선택되고; 경쇄 가변 영역 CDR1 아미노산 서열은 서열 22-28 및 그의 보존적 변형으로 이루어진 군으로부터 선택되고; 경쇄 가변 영역 CDR2 아미노산 서열은 서열 29-35 및 그의 보존적 변형으로 이루어진 군으로부터 선택되고; 경쇄 가변 영역 CDR3 아미노산 서열은 서열 36-42 및 그의 보존적 변형으로 이루어진 군으로부터 선택되고; 항체는 BAFFR에 특이적으로 결합하고, 항체는 하기 기능적 특성 중 하나 이상을 나타낸다: 이는 BLyS 유도된 B 세포 증식, 또는 BLyS 유도된 IgG1 생성을 억제하고, 시험관내 또는 생체내에서 B 세포를 감소시킨다.
다양한 실시양태에서, 항체는 1개 이상, 2개 이상 또는 3개 이상의 상기 논의된 나열된 기능적 특성을 나타낼 수 있다. 그러한 항체는 예를 들어 인간 항체, 인간화 항체 또는 키메라 항체일 수 있다.
다른 실시양태에서, 포유동물 세포에서의 발현을 위해 최적화된 본 발명의 항체는 전장 중쇄 서열 및 전장 경쇄 서열을 갖고, 여기서 이들 서열 중 하나 이상은 본원에 기재된 항체 또는 그의 보존적 변형에 기반한 특정 아미노산 서열을 갖고, 항체는 본 발명의 항-BAFFR 항체의 목적하는 기능적 특성을 보유한다. 따라서, 본 발명은 전장 중쇄 및 전장 경쇄로 이루어진 포유동물 세포에서의 발현을 위해 최적화된 단리된 모노클로날 항체를 제공하며, 여기서 전장 중쇄는 서열 75-78 및 그의 보존적 변형으로부터 선택되는 아미노산 서열을 갖고; 전장 경쇄는 서열 71-74 및 그의 보존적 변형으로부터 선택되는 아미노산 서열을 갖고; 항체는 BAFFR에 특이적으로 결합하고, 항체는 하기 기능적 특성 중 하나 이상을 나타낸다: 이는 BLyS 유도된 B 세포 증식, 또는 BLyS 유도된 IgG1 생성을 억제하고, 시험관내 또는 생체내에서 B 세포를 감소시킨다.
다양한 실시양태에서, 항체는 1개 이상, 2개 이상 또는 3개 이상의 상기 논의된 나열된 기능적 특성을 나타낼 수 있다. 그러한 항체는 예를 들어 인간 항체, 인간화 항체 또는 키메라 항체일 수 있다.
본원에서 사용할 때, 용어 "보존적 서열 변형"은 아미노산 서열을 함유하는 항체의 결합 특성에 유의하게 영향을 미치거나 이를 변경시키지 않는 아미노산 변형을 지칭하도록 의도된다. 그러한 보존적 변형은 아미노산 치환, 부가 및 결실을 포함한다. 변형은 당업계에 공지된 표준 기술, 예를 들어 부위 지정 돌연변이 유발 및 PCR-매개 돌연변이 유발에 의하여 본 발명의 항체에 도입될 수 있다.
보존적 아미노산 치환은 아미노산 잔기를 유사한 측쇄를 갖는 아미노산 잔기로 대체시키는 것이다. 유사한 측쇄를 갖는 아미노산 잔기 패밀리는 당업계에 규정되어 있다. 이들 패밀리에는 염기성 측쇄를 갖는 아미노산 (예컨대, 리신, 아르기닌, 히스티딘), 산성 측쇄를 갖는 아미노산 (예컨대, 아스파르트산, 글루탐산), 전하를 띠지 않는 극성 측쇄를 갖는 아미노산 (예컨대, 글리신, 아스파라긴, 글루타민, 세린, 트레오닌, 티로신, 시스테인, 트립토판), 비극성 측쇄를 갖는 아미노산 (예컨대, 알라닌, 발린, 류신, 이소류신, 프롤린, 페닐알라닌, 메티오닌), 베타-분지된 측쇄를 갖는 아미노산 (예컨대, 트레오닌, 발린, 이소류신) 및 방향족 측쇄를 갖는 아미노산 (예컨대, 티로신, 페닐알라닌, 트립토판, 히스티딘)이 포함된다. 따라서 본 발명의 항체의 CDR 영역 내의 하나 이상의 아미노산 잔기는 동일한 측쇄 패밀리로부터 다른 아미노산 잔기로 대체될 수 있고, 변형된 항체는 본원에 기재된 기능 분석을 이용하여 보유 기능에 대해 시험될 수 있다.
본 발명의 항- BAFFR 항체와 동일한 에피토프에 결합하는 항체
또다른 실시양태에서, 본 발명은 본원에 기재된 본 발명의 다양한 특이적 항-BAFFR 항체와 동일한 에피토프에 결합하는 항체를 제공한다. BLyS 유도된 효과를 차단할 수 있는 실시예에 기재된 모든 항체는 높은 친화도로 BAFFR의 동일한 에피토프에 결합하며, 상기 에피토프는 서열 88의 아미노산으로 이루어진다.
따라서, 추가의 항체는 표준 BAFFR 결합 분석에서 본 발명의 다른 항체와 교차-경쟁하는 (예를 들어, 통계적으로 유의한 방식으로 결합을 경쟁적으로 억제하는) 그들의 능력에 기초하여 확인할 수 있다. 인간 BAFFR에 대한 본 발명의 항체의 결합을 억제하는 시험 항체의 능력은, 시험 항체가 인간 BAFFR에 대한 결합에 대해 상기 항체와 경쟁할 수 있음을 입증하고; 그러한 항체는 비-제한적인 이론에 따라 그가 경쟁하는 항체와 같이 인간 BAFFR 상의 동일한 또는 관련 (예를 들어, 구조적으로 유사한 또는 공간적으로 근접한) 에피토프에 결합한다. 따라서, 본 발명의 또 다른 측면에서 서열에 대해 본원에 개시된 항체와 동일한 항원에 결합하는 항체 및 그와 경쟁하는 항체를 제공한다. 특정 실시양태에서, 본 발명의 항체와 같이 인간 BAFFR 상의 동일한 에피토프에 결합하는 항체는 인간 재조합 항체이다. 이러한 인간 재조합 항체는 실시예에 기재된 바와 같이 제조하고 단리할 수 있다.
공학처리되고 변형된 항체
본 발명의 항체는 변형된 항체를 공학처리하기 위해 출발 물질로서 본원에 제시된 하나 이상의 VH 및/또는 VL 서열을 갖는 항체를 사용하여 추가로 제조될 수 있고, 상기 변형된 항체는 출발 항체로부터 변경된 특성을 가질 수 있다. 항체는 하나 또는 2개의 가변 영역 (즉, VH 및/또는 VL), 예를 들어 하나 이상의 CDR 영역 및/또는 하나 이상의 프레임워크 영역 내의 하나 이상의 잔기를 변형시킴으로써 공학처리될 수 있다. 추가로 또는 별법으로, 항체는 불변 영역(들) 내의 잔기들을 변형킴으로써 공학처리되어, 예를 들어 항체의 효과기 기능(들)을 변경시킬 수 있다.
수행될 수 있는 가변 영역 공학처리의 한 유형은 CDR 그라프팅이다. 항체는 주로 6개의 중쇄 및 경쇄 상보성 결정 영역 (CDR) 내에 위치하는 아미노산 잔기를 통하여 표적 항원과 우세하게 상호작용한다. 이러한 이유로 인해, CDR 내의 아미노산 서열은 CDR 외부의 서열 보다 개개 항체들 사이에서 보다 다양하다. CDR 서열은 대부분의 항체-항원 상호작용을 담당하기 때문에, 다양한 특성을 갖는 다양한 항체로부터의 프레임워크 서열 상에 그라프팅된 특정 천연발생 항체로부터의 CDR 서열을 포함하는 발현 벡터를 보강함으로써 특정 천연발생 항체의 특성을 모방하는 재조합 항체를 발현시키는 것이 가능하다 (예를 들어, 문헌 [Riechmann, L. et al., 1998 Nature 332:323-327]; [Jones, P. et al., 1986 Nature 321:522-525]; [Queen, C. et al., 1989 Proc. Natl. Acad. See. U.S.A. 86:10029-10033]; 미국 특허 번호 5,225,539 (Winter) 및 미국 특허 번호 5,530,101; 5,585,089; 5,693,762 및 6,180,370 (Queen et al.) 참조).
따라서, 본 발명의 또 다른 실시양태는 각각 서열 1-7로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 갖는 CDR1 서열; 서열 8-14로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 갖는 CDR2 서열; 서열 15-21로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 갖는 CDR3 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및 각각 서열 22-28로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 갖는 CDR1 서열; 서열 29-35로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 갖는 CDR2 서열; 및 서열 36-42로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 갖는 CDR3 서열을 갖는 경쇄 가변 영역을 포함하는, 단리된 모노클로날 항-BAFFR 항체, 또는 그의 항원 결합 부위를 포함하는 기능적 단백질에 관한 것이다. 따라서, 그러한 항체는 모노클로날 항체의 VH 및 VL CDR 서열을 함유하지만, 상기 항체와 상이한 프레임워크 서열을 함유할 수 있다.
이러한 프레임워크 서열은 생식계열 항체 유전자 서열을 포함하는 공개된 참고 문헌 또는 공개 DNA 데이터베이스로부터 수득할 수 있다. 예를 들어, 인간 중쇄 및 경쇄 가변 영역 유전자에 대한 생식계열 DNA 서열은 "VBase" 인간 생식계열 서열 데이터베이스 (인터넷 www.mrc-cpe.cam.ac.uk/vbase로부터 입수 가능함) 뿐만 아니라 문헌 [Kabat, E. A., et al., 1991 Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242]; [Tomlinson, I. M., et al., 1992 J. fol. Biol. 227:776-798]; 및 [Cox, J. P. L. et al., 1994 Eur. J Immunol. 24:827-836]에서 찾아볼 수 있다.
본 발명의 항체에 사용하기 위한 프레임워크 서열의 예는 본 발명의 선택된 항체에 의해 사용되는 프레임워크 서열, 예를 들어 본 발명의 모노클로날 항체에 의해 사용되는 컨센서스 서열 및/또는 프레임워크 서열에 구조적으로 유사한 것이다. VH CDR1, 2 및 3 서열, 및 VL CDR1, 2 및 3 서열을, 프레임워크 서열이 유래되는 생식계열 면역글로불린 유전자에서 발견되는 바와 동일한 서열을 갖는 프레임워크 영역 상으로 그라프팅시킬 수 있거나, 또는 CDR 서열을 생식계열 서열과 비교해서 하나 이상의 돌연변이를 함유하는 프레임워크 영역 상으로 그라프팅시킬 수 있다. 예를 들어, 특정의 경우에는 프레임워크 영역 내의 잔기를 돌연변이시켜 항체의 항원 결합 능력을 유지 또는 증강시키는 것이 유리한 것으로 밝혀졌다 (예를 들어, 미국 특허 번호 5,530,101; 5,585,089; 5,693,762 및 6,180,370 (Queen et al.) 참조].
또 다른 유형의 가변 영역 변형은 VH 및/또는 VL CDR1, CDR2 및/또는 CDR3 영역 내의 아미노산 잔기를 돌연변이시킴으로써, 관심의 대상이 되는 항체의 한 가지 이상 결합 특성 (예컨대 친화도)을 개선시키는 것이다 ("친화 돌연변이"로 공지됨). 부위-지정 돌연변이 유발 또는 PCR-매개 돌연변이 유발은 돌연변이(들)를 도입하기 위해 수행될 수 있고, 항체 결합에 대한 효과, 또는 관심의 대상이 되는 다른 기능적 특성은 본원에 기술되어 있는 것과 같이, 그리고 실시예에서 제공되는 것과 같이 시험관내 또는 생체내 분석으로 평가될 수 있다. 보존적 변형 (상기 논의된)이 도입될 수 있다. 돌연변이는 아미노산 치환, 부가 또는 결실일 수 있다. 더우기, 전형적으로는 CDR 영역 내의 1개, 2개, 3개, 4개 또는 5개 이하의 잔기를 변경시킨다.
따라서, 또다른 실시양태에서, 본 발명은 서열 1-7, 또는 서열 1-7과 비교하여 1, 2, 3, 4 또는 5개의 아미노산 치환, 결실 또는 부가를 갖는 아미노산 서열을 갖는 군으로부터 선택되는 아미노산 서열로 이루어진 VH CDR1 영역; 서열 8-14, 또는 서열 8-14와 비교하여 1, 2, 3, 4 또는 5개의 아미노산 치환, 결실 또는 부가를 갖는 아미노산 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 갖는 VH CDR2 영역; 서열 15-21, 또는 서열 15-21과 비교하여 1, 2, 3, 4 또는 5개의 아미노산 치환, 결실 또는 부가를 갖는 아미노산 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 갖는 VH CDR3 영역; 서열 22-28, 또는 서열 22-28과 비교하여 1, 2, 3, 4 또는 5개의 아미노산 치환, 결실 또는 부가를 갖는 아미노산 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 갖는 VL CDR1 영역; 서열 29-35, 또는 서열 29-35와 비교하여 1, 2, 3, 4 또는 5개의 아미노산 치환, 결실 또는 부가를 갖는 아미노산 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 갖는 VL CDR2 영역; 및 서열 36-42, 또는 서열 36-42와 비교하여 1, 2, 3, 4 또는 5개의 아미노산 치환, 결실 또는 부가를 갖는 아미노산 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 갖는 VL CDR3 영역을 갖는 중쇄 가변 영역으로 이루어진 단리된 항-BAFFR 모노클로날 항체, 또는 그의 항원 결합 부위를 포함하는 기능적 단백질을 제공한다.
항원-결합 도메인의 다른 프레임워크 또는 스캐폴드 내로의 그라프팅
생성된 폴리펩티드가 BAFFR에 특이적으로 결합하는 하나 이상의 하나의 결합 영역을 포함하는 한, 다양한 항체/면역글로불린 프레임워크 또는 스캐폴드를 사용할 수 있다. 이같은 프레임워크 또는 스캐폴드는 인간 면역글로불린의 5가지 주요 이디오타입, 또는 이의 단편 (예컨대 본원의 다른 곳에 기술된 것들)을 포함하고, 다른 동물 종 (바람직하게는 인간화 측면을 갖는)의 면역글로불린을 포함한다. 단일 중쇄 항체 예컨대 낙타류에서 확인된 것들이 이와 관련하여 특히 흥미롭다. 당업자에 의해 신규 프레임워크, 스캐폴드 및 단편이 계속 발견 및 발달된다.
한 측면에서, 본 발명은 본 발명의 CDR이 그 위로 그라프팅될 수 있는 비-면역글로불린 스캐폴드를 사용하여 비-면역글로불린계 항체를 생성하는 것에 관한 것이다. 서열 87의 표적 단백질에 대해 특이적인 결합 영역을 포함하는 한, 공지된 또는 미래의 비-면역글로불린 프레임워크 및 스캐폴드를 사용할 수 있다. 그러한 화합물은 본원에서 "표적-특이적 결합 영역을 포함하는 폴리펩티드"로서 알려져 있다. 비-면역글로불린 프레임워크의 예는 다음 섹션 (낙타류 항체 및 비-항체 스캐폴드)에서 추가로 설명한다.
낙타류 항체
신세계 구성원, 예를 들어 라마 종 [라마 파코스 (Lama paccos), 라마 글라마 (Lama glama) 및 라마 비쿠그나 (Lama vicugna)]를 비롯한 낙타 및 단봉 낙타 [카멜루스 박트리아누스 (Camelus bactrianus) 및 칼레루스 드로마데리우스 (Calelus dromaderius)] 패밀리의 구성원로부터 얻은 항체 단백질을 인간 대상체에 대해 크기, 구조적 복합도 및 항원성에 관하여 특성화하였다. 자연에서 발견되는 상기 패밀리의 포유동물로부터의 특정 IgG 항체는 경쇄가 결핍되고, 따라서 다른 동물로부터의 항체에 대한 2개의 중쇄 및 2개의 경쇄를 갖는 전형적인 4쇄 4차 구조와 구조상 구분된다 (PCT/EP93/02214 (WO 94/04678, 1994년 3월 3일 공개) 참조).
VHH로서 확인된 작은 단일 가변 도메인인 낙타류 항체의 영역은 "낙타류 나노바디 (nanobody)"로서 공지된 저분자량 항체-유래 단백질을 생성시키는, 표적에 대해 고친화도를 갖는 소단백질을 얻도록 유전 공학처리에 의해 얻을 수 있다. 미국 특허 번호 5,759,808 (1998년 6월 2일 등록); 또한 문헌 [Stijlemans, B. et al., 2004 J Biol Chem 279: 1256-1261]; [Dumoulin, M. et al., 2003 Nature 424: 783-788]; [Pleschberger, M. et al. 2003 Bioconjugate Chem 14: 440-448]; [Cortez-Retamozo, V. et al. 2002 Int J Cancer 89: 456-62]; 및 [Lauwereys, M. et al. 1998 EMBO J 17: 3512-3520]을 참조한다. 낙타류 항체 및 항체 단편의 공학처리된 라이브러리는 예를 들어 아블링스(Ablynx, 벨기에 겐트)로부터 상업적으로 입수가능하다. 비인간 기원의 기타 항체와 같이, 낙타류 항체의 아미노산 서열을 재조합적으로 변경시켜 인간 서열과 보다 근접하게 유사한 서열을 수득할 수 있는다 (즉, 나노바디를 "인간화"시킬 수 있음). 따라서, 인간에 대한 낙타류 항체의 천연상 낮은 항원성을 추가로 저하시킬 수 있다.
낙타류 나노바디는 분자량이 인간 IgG 분자의 대략 1/10이고, 상기 단백질은 단지 수 나노미터의 물리적 직경을 갖는다. 작은 크기의 하나의 중요성은 보다 큰 항체 단백질에 대해 기능적으로 보이지 않는 항원성 부위에 결합하는 낙타류 나노바디의 능력이고; 즉 낙타류 나노바디는 전통적인 면역학적 기술을 이용하여 달리 알 수 없는 항원을 검출하는 시약으로서 및 가능한 치료제로서 유용하다. 따라서, 작은 크기에 따른 또 다른 결과로서, 낙타류 나노바디는 표적 단백질의 홈 또는 좁은 갈라짐 내의 특이적 부위와 결합함으로써 억제할 수 있으므로, 전통적인 항체의 기능보다 전통적인 저 분자량 약물의 기능과 보다 밀접하게 유사한 능력으로 작용할 수 있다.
이러한 저 분자량과 조밀한 크기로 인해, 극도로 열 안정적이고, 극한 pH에 대해 안정적이며 단백질분해 소화에 대해서도 안정적이고, 낮은 항원성을 지닌 낙타류 나노바디가 또한 생성된다. 또 다른 결과는 낙타류 나노바디가 순환 시스템으로부터 조직 내로 용이하게 이동하고 심지어는 혈액-뇌 장벽을 가로지르며, 신경 조직에 영향을 미치는 장애를 치료할 수 있다는 것이다. 나노바디는 또한 혈액 뇌 장벽을 가로질러 약물 수송을 용이하게 할 수 있다. 2004년 8월 19일 공개된 미국 특허 출원 20040161738을 참조한다. 이들 특징은 인간에 대한 낮은 항원성과 조합되어 큰 치료 가능성을 나타낸다. 또한, 이들 분자는 원핵 세포, 예를 들어 이. 콜라이 (E. coli) 내에서 완전히 발현될 수 있고, 박테리오파지와 융합 단백질로서 발현되고, 기능적이다.
따라서, 본 발명의 특징은 BAFFR에 고친화도를 갖는 낙타류 항체 또는 나노바디이다. 본원의 특정 실시양태에서, 낙타류 항체 또는 나노바디는 낙타류 동물에게서 자연적으로 생성되는데, 즉 기타 항체에 대해 본원에 기재된 기술을 사용하여 BAFFR 또는 그의 펩티드 단편으로 면역화시킨 후 낙타류에 의해 생성된다. 별법으로, 항-BAFFR 낙타류 나노바디는 공학처리되는데, 즉 예를 들어 본원의 실시예에 기재된 바와 같이 표적으로서 BAFFR을 사용하는 패닝 (panning) 절차를 이용하여 적절하게 돌연변이시킨 낙타류 나노바디 단백질을 디스플레이하는 파지의 라이브러리로부터 선택함으로써 생산된다. 한 실시양태에서, 본원에 개시된 바와 같은 낙타류 프레임워크, 및 VH CDR1, CDR2 및/또는 CDR3 영역을 갖는 개시내용의 항체는 낙타화된다. 공학처리된 나노바디는 추가로 수여 대상 내의 반감기가 45분 내지 2주가 되도록 유전 공학처리함으로써 맞춤 생산될 수 있다. 특정 실시양태에서, 낙타류 항체 또는 나노바디는 예를 들어 PCT/EP93/02214에 기재된 바와 같이 본 발명의 인간 항체의 중쇄 또는 경쇄의 CDR 서열을 나노바디 또는 단일 도메인 항체 프레임워크 서열 내로 그라프팅함으로써 얻어진다.
비-항체 스캐폴드
공지된 비-면역글로불린 프레임워크 또는 스캐폴드에는 애드넥틴 (Adnectin) (피브로넥틴) (컴파운드 쎄라퓨틱스, 인크.(Compound Therapeutics, Inc.), 매사추세츠주 월담), 안키린 (몰레큘라 파트너스 아게(Molecular Partners AG), 스위스 취리히), 도메인 항체 (도만티스, 리미티드(Domantis, Ltd), 매사추세츠주 캠브리지) 및 애블링스 엔브이(Ablynx nv), 벨기에 즈비나아르데), 리포칼린 (안티칼린) (피에리스 프로테오랩 아게(Pieris Proteolab AG), 독일 프라이징), 소형 모듈 면역-의약품 (small modular immuno-pharmaceuticals) (트루비온 파마슈티칼스 인크.(Trubion Pharmaceuticals Inc.), 워싱톤주 시애틀), 맥시바디(Maxybody) (아비디아, 인크.(Avidia, Inc.), 캘리포니아주 마운틴 뷰), 단백질 A (아피바디 아게(Affibody AG), 스웨덴) 및 아필린 (감마-크리스탈린 또는 유비퀴틴) (스킬 프로테인즈 게엠베하(Scil Proteins GmbH), 독일 할레), 단백질 에피토프 모방체 (폴리포르 엘티디(Polyphor Ltd), 스위스 알슈빌)가 포함되나, 여기에 제한되지는 않는다.
(i) 피브로넥틴 스캐폴드
피브로넥틴 스캐폴드는 바람직하게는 피브로넥틴 유형 III 도메인 (예를 들어, 피브로넥틴 유형 III의 10번째 모듈 (10 Fn3 도메인))에 기반한다. 피브로넥틴 유형 III 도메인은 단백질의 코어를 형성하도록 서로에 대해 패킹된 2개의 베타 시트 사이에 분포된 7개 또는 8개의 베타 가닥을 갖고, 베타 가닥들을 서로 연결하고 용매 노출된 루프 (CDR과 유사)를 추가로 함유한다. 베타 시트 샌드위치의 각각의 가장자리에 3개 이상의 그러한 루프가 존재하고, 여기서 가장자리는 베타 가닥의 방향에 수직인 단백질의 경계이다 (US 6,818,418).
전체적인 폴드(fold)는 낙타 및 라마 IgG 내의 전체 항원 인식 단위를 포함하는, 중쇄의 가변 영역인 가장 작은 기능적 항체 단편의 것과 밀접하게 관련되지만, 이러한 피브로넥틴-기재 스캐폴드는 면역글로불린이 아니다. 이러한 구조로 인해, 비-면역글로불린 항체는 항체의 것과 본성 및 친화력이 유사한 항원 결합 성질을 모방한다. 이러한 스캐폴드는 생체 내에서의 항체의 친화력 돌연변이의 과정과 유사한 시험관 내에서의 루프 무작위화 및 셔플링(shuffling) 전략에서 사용될 수 있다. 이러한 피브로넥틴-기재 분자는 표준 클로닝 기술을 사용하여 분자의 루프 영역이 본 발명의 CDR로 대체될 수 있는 스캐폴드로 사용될 수 있다.
(ii) 안키린 - 분자 파트너
이 기술은 다양한 표적들에 대한 결합에 사용될 수 있는 가변 영역을 지니기 위해 안키린 유래 반복 모듈이 있는 단백질을 스캐폴드로 사용하는 것을 기초로 한다. 안키린 반복 모듈은 2개의 역-평행 α-헥릭스 및 β-턴(turn)으로 이루어지는 33개 아미노산 폴리펩티드이다. 가변 영역의 결합은 리보솜 디스플레이를 사용함으로써 대부분 최적화된다.
(iii) 맥시바디/아비머 - 아비디아(Avidia)
아비머는 천연 A-도메인 함유 단백질 예컨대 LRP-1로부터 유래된다. 이러한 도메인은 본래 단백질-단백질 상호작용에 대해 사용되고, 인간에서, 250개를 초과하는 단백질이 A-도메인을 구조적으로 기초로 한다. 아비머는 아미노산 링커를 통해 연결된 수많은 다양한 "A-도메인" 단량체들 (2-10개)로 구성된다. 예를 들어 20040175756; 20050053973; 20050048512; 및 20060008844에 기술된 방법을 사용하여 표적 항원에 결합할 수 있는 아비머가 생성될 수 있다.
(vi) 단백질 A - 애피바디(Affibody)
애피바디(등록상표) 친화력 리간드는 단백질 A의 IgG-결합 도메인들 중 하나의 스캐폴드를 기초로 하는 3-헬릭스 다발로 구성된 작고 단순한 단백질이다. 단백질 A는 스타필로코쿠스 아우레우스(Staphylococcus aureus) 박테리아로부터의 표면 단백질이다. 이러한 스캐폴드 도메인은 58개의 아미노산으로 구성되고, 이중 13개가 무작위화되어 다수의 리간드 변이체가 있는 애피바디(등록상표) 라이브러리가 생성된다 (예를 들어, 미국 5,831,012 참조). 애피바디(등록상표) 분자는 항체를 모방하고, 150 kDa인 항체의 분자량과 비교하여 이는 6 kDa의 분자량을 갖는다. 작은 크기에도 불구하고, 애피바디(등록상표) 분자의 결합 부위는 항체의 것과 유사하다.
(v) 안티칼린스(Anticalins) - 피에리스(Pieris)
안티칼린스(등록상표)는 피에리스 프로테오랩 아게(Pieris ProteoLab AG)사에 의해 개발된 상품이다. 이는 화학적으로 민감하거나 불용성인 화합물의 생리학적인 수송 또는 보관에 일반적으로 포함되는 작고 강한 단백질의 광범위한 군인 리포칼린으로부터 유래된다. 여러 천연 리포칼린이 인간 조직 또는 체액에서 발생한다.
단백질 구조는 초가변성 루프가 경직성 프레임워크의 상부에 있으면서, 면역글로불린을 연상시킨다. 그러나, 항체 또는 이의 재조합 단편과 대조적으로, 리포칼린은 아미노산 잔기 160개 내지 180개의 단일 폴리펩티드 사슬로 구성되어, 단일 면역글로불린 도메인보다 약간 더 크다.
결합 주머니를 이루는, 루프 4개의 셋트는 두드러진 구조적 유연성을 나타내고, 다양한 측쇄를 허용한다. 따라서, 상이한 형상의 규정된 표적 분자들을 높은 친화력 및 특이성으로 인식하기 위하여 독점적인 과정에서 결합 부위가 재성형될 수 있다.
리포칼린 패밀리의 한 단백질인, 피에리스 브라시카(Pieris Brassicae)의 빌린(bilin)-결합 단백질 (BBP)이 루프 4개의 셋트를 돌연변이유발시킴으로써 안티칼린을 개발하는데 사용되었다. "안티칼린"이 기술된 특허 출원의 한 예는 PCT WO 199916873이다.
(vi) 아필린(Affilin) - 실 프로테인스(Scil Proteins)
아필린(상표명) 분자는 단백질 및 소분자를 향한 특이적 친화도를 위해 설계된 작은 비-면역글로불린 단백질이다. 신규 애필린(상표명) 분자가 상이한 인간-유래 스캐폴드 단백질을 각각 기초로 하는 2개의 라이브러리로부터 매우 신속하게 선별될 수 있다.
애필린(상표명) 분자는 면역글로불린 단백질에 대해 어떠한 구조적 상동성도 나타내지 않는다. 실 프로테인스는 하나는 인간의 구조적 눈 렌즈 단백질인 감마 크리스탈린이고 다른 하나는 "유비퀴틴" 상위패밀리 단백질인 2개의 애필린(상표명) 스캐폴드를 사용한다. 양쪽 모두의 인간 스캐폴드는 매우 작고, 높은 온도 안정성을 나타내며, pH 변화 및 변성제에 대해 거의 내성을 갖는다. 이러한 높은 안정성은 주로 단백질의 확장된 베타 시트 구조로 인한 것이다. 감마 크리스탈린 유래 단백질의 예가 WO200104144에 기술되어 있고, "유비퀴틴-유사" 단백질의 예가 WO2004106368에 기술되어 있다.
(vii) 단백질 에피토프 모방체 (PEM)
PEM은 단백질-단백질 상호작용에 관여하는 주요 2차 구조인 단백질의 베타-헤어핀 2차 구조를 모방하는 중간 크기의 시클릭 펩티드-유사 분자 (MW 1-2 kDa)이다.
프레임워크 또는 Fc 공학처리
본 발명의 공학처리된 항체는 예를 들어 항체의 특성을 개선하기 위해 VH 및/또는 VL 내의 프레임워크 잔기에 대해 변형이 이루어진 것을 포함한다. 전형적으로, 이러한 프레임워크 변형은 항체의 면역원성을 감소시키기 위해 이루어진다. 예를 들어, 한 접근법은 1개 이상의 프레임워크 잔기를 상응하는 생식계열 서열로 "역돌연변이"시키는 것이다. 보다 구체적으로는, 체세포 돌연변이를 진행한 항체는 이러한 항체가 유래되는 생식계열 서열과는 상이한 프레임워크 잔기를 함유할 수 있다. 이러한 잔기는 항체 프레임워크 서열을 항체가 유래되는 생식계열 서열과 비교함으로써 확인할 수 있다. 프레임워크 영역 서열을 이의 생식계열 구조로 되돌리기 위해, 예를 들어 부위-지정 돌연변이유발 또는 PCR-매개 돌연변이유발에 의해, 체세포 돌연변이를 생식계열 서열로 "역행 돌연변이"시킬 수 있다. 이러한 "역돌연변이된" 항체가 또한 본 발명에 포괄된다.
또 다른 유형의 프레임워크 변형은 프레임워크 영역 내의 1개 이상의 잔기, 또는 심지어 하나 이상의 CDR 영역 내의 1개 이상의 잔기를 돌연변이시켜 T 세포-에피토프를 제거함으로써, 항체의 잠재적 면역원성을 저하시키는 것을 포함한다. 이러한 접근법은 "탈면역화(deimmunization)"로 또한 지칭되고, 미국 특허 공보 번호 20030153043 (Carr et al.)에 추가로 상세하게 기재되어 있다.
프레임워크 또는 CDR 영역 내에서 이루어진 변형 이외에도 또는 그 대안으로, 본 발명의 항체는 전형적으로 혈청 반감기, 보체 고정, Fc 수용체 결합 및/또는 항원-의존성 세포성 세포독성과 같은 항체의 하나 이상의 기능적 특성을 변경하기 위하여 Fc 영역 내에 변형을 포함하도록 공학처리될 수 있다. 더우기, 본 발명의 항체를 화학적으로 변형시킬 수 있거나 (예를 들어, 하나 이상의 화학적 부분을 항체에 부착시킬 수 있음), 또는 그의 글리코실화를 변경시켜 항체의 하나 이상의 기능적 특성을 다시 변경시키도록 변형시킬 수 있다. 이들 실시양태 각각이 다음에 추가로 상세히 기재된다. Fc 영역 내의 잔기 넘버링은 카바트의 EU 지수의 넘버링이다.
한 실시양태에서, CH1의 힌지 영역은 힌지 영역 내의 시스테인 잔기 수가 변경되도록, 예를 들어 증가되거나 감소되도록 변형시킨다. 이러한 접근법은 미국 특허 5,677,425 (Bodmer et al.)에 추가로 기재되어 있다. CH1의 힌지 영역 내의 시스테인 잔기 수는, 예를 들어 경쇄 및 중쇄의 어셈블리를 촉진시키거나 또는 항체의 안정성을 증가 또는 저하시키도록 변경된다.
또 다른 실시양태에서, 항체의 Fc 힌지 영역은 항체의 생물학적 반감기를 감소시키도록 돌연변이된다. 보다 구체적으로는, 1개 이상의 아미노산 돌연변이를 Fc-힌지 단편의 CH2-CH3 도메인 계면 영역 내로 도입하여, 항체가 미감작(native) Fc-힌지 도메인 스타필로코실 (Staphylococcyl) 단백질 A (SpA) 결합과 비교해서 손상된 SpA 결합을 지니도록 한다. 이러한 접근법은 미국 특허 번호 6,165,745 (Ward et al.)에 추가로 상세하게 기재되어 있다.
또 다른 실시양태에서, 항체는 그의 생물학적 반감기를 증가시키도록 변형된다. 각종 접근법이 가능하다. 예를 들어, 미국 특허 번호 6,277,375 (Ward)에 기재되어 있는 바와 같이, 돌연변이 T252L, T254S, T256F 중 하나 이상이 도입될 수 있다. 별법으로, 생물학적 반감기를 증가시키기 위해, 항체를 CH1 또는 CL 영역 내에서 변경시켜, IgG의 Fc 영역의 CH2 도메인의 2개 루프로부터 취한 재이용 (salvage) 수용체 결합 에피토프를 함유하도록 할 수 있다 [미국 특허 번호 5,869,046 및 6,121,022 (Presta et al.)에 기재된 바와 같음].
기타 실시양태에서, Fc 영역은 1개 이상의 아미노산 잔기를 상이한 아미노산 잔기로 대체시켜 항체의 효과기 기능을 변경시킴으로써 변경된다. 예를 들어, 항체가 효과기 리간드에 대한 변경된 친화성을 지니긴 하지만 모 항체의 항원-결합 능력을 보유하도록, 1개 이상의 아미노산을 상이한 아미노산 잔기로 대체시킬 수 있다. 친화성을 변경시킨 효과기 리간드는, 예를 들어 Fc 수용체 또는 보체의 C1 성분일 수 있다. 이러한 접근법은 미국 특허 번호 5,624,821 및 5,648,260 (Winter et al.)에 추가로 상세하게 기재되어 있다.
또 다른 실시양태에서, 항체가 변경된 C1q 결합 및/또는 저하되거나 파괴된 보체 의존성 세포독성 (CDC)을 지니도록, 아미노산 잔기 중에서 선택된 1개 이상의 아미노산을 상이한 아미노산 잔기로 대체시킬 수 있다. 이러한 접근법은 미국 특허 번호 6,194,551 (Idusogie et al.)에 추가로 상세하게 기재되어 있다.
또 다른 실시양태에서, 1개 이상의 아미노산 잔기를 변경시킴으로써 보체를 고정시키는 항체의 능력을 변경시킨다. 이러한 접근법은 PCT 공보 WO94/29351 (Bodmer et al.)에 추가로 상세하게 설명되어 있다.
또 다른 실시양태에서, Fc 영역은 1개 이상의 아미노산을 변형시킴으로써 Fcγ 수용체에 대한 항체의 친화도를 증가시키고/거나 항체 의존성 세포성 세포독성 (ADCC)을 매개하는 항체의 능력을 증가시키도록 변형된다. 이러한 접근법은 PCT 공보 WO 00/42072 (Presta)에 추가로 상세하게 설명되어 있다. 더우기, 인간 FcγRI, FcγRII, FcγRIII 및 FcRn에 대한 결합 부위를 맵핑하였고 개선된 결합을 갖는 변이체가 기재되었다 (문헌 [Shields, R.L. et al., 2001 J. Biol. Chen. 276:6591-6604] 참조).
또 다른 실시양태에서, 항체의 글리코실화가 변형된다. 예를 들어, 비글리코실화된 항체 (즉, 글리코실화 결핍 항체)가 생성될 수 있다. 글리코실화는 예를 들어 항원에 대한 항체의 친화도가 증가하도록 변경될 수 있다. 이러한 탄수화물 변형은 예를 들어 항체 서열 내의 하나 이상의 글리코실화 부위를 변경시킴으로써 달성될 수 있다. 예를 들어, 하나 이상의 가변 영역 프레임워크 글리코실화 부위를 제거하여 이 부위에서 글리코실화가 일어나지 않도록 만드는 하나 이상의 아미노산 치환이 일어날 수 있다. 이러한 비글리코실화는 항원에 대한 항체의 친화도를 증가시킬 수 있다. 상기 접근법은 미국 특허 번호 5,714,350 및 6,350,861 (Co et al.)에 추가로 상세히 기재되어 있다.
추가로 또는 별법으로, 글리코실화 유형이 변경된 항체, 예를 들어 푸코실 잔기 수가 감소되거나 없는 저푸코실화 또는 비푸코실화 항체, 또는 이분화 GlcNac 구조가 증가한 항체가 생성될 수 있다. 이와 같이 변경된 글리코실화 패턴이 항체의 ADCC 능력을 증가시키는 것으로 입증된 바 있다. 이러한 탄수화물 변형은 예를 들어, 변경된 글리코실화 기구를 갖는 숙주 세포 내에서 항체를 발현시킴으로써 이루어질 수 있다. 변경된 글리코실화 기구를 갖는 세포는 당업계에 기재되어 있으며, 본 발명의 재조합 항체를 발현시켜 글리코실화가 변경된 항체를 생산하는 숙주 세포로서 사용될 수 있다. 예를 들어, EP 1,176,195 (Hang et al.)에는 푸코실 트랜스퍼라제를 코딩하는, 기능상 붕괴된 FUT8 유전자를 갖는 세포주가 기재되어 있는데, 이로써 상기 세포주에서 발현된 항체는 저푸코실화를 나타내거나, 또는 푸코실 잔기가 없다. 따라서, 한 실시양태에서 본 발명의 항체는 저푸코실화 또는 비푸코실화 패턴을 나타내는 세포주, 예를 들어 푸코실트랜스퍼라제를 코딩하는 FUT8 유전자의 결핍 발현을 갖는 포유동물 세포주에서의 재조합 발현에 의해 생성된다. PCT 공보 WO 03/035835 (Presta)에는 Asn(297)-연결된 탄수화물에 푸코스를 부착시키는 능력이 감소된 변이체 CHO 세포주, Lecl3 세포가 기재되어 있고, 이는 또한 그 숙주 세포 내에서 발현된 항체의 저푸코실화를 일으킨다 (또한, 문헌 [Shields, R.L. et al., 2002 J. Biol. Chem. 277:26733-26740] 참조). PCT 공보 WO 99/54342 (Umana et al.)에는 당단백질-변형 글리코실 트랜스퍼라제 [예컨대, 베타(1,4)-N 아세틸글루코사미닐트랜스퍼라제 III (GnTIII)]를 발현하도록 공학처리된 세포주가 기재되어 있는데, 이와 같이 공학처리된 세포주에서 발현된 항체는 증가된 이분화 GlcNac 구조를 나타내어 항체의 ADCC 활성을 증가시킨다 (또한 문헌 [Umana et al., 1999 Nat. Biotech. 17:176-180] 참조). 문헌 [Eureka Therapeutics]에는 푸코실 잔기가 없는 변경된 포유동물 글리코실화 패턴을 갖는 항체를 생성할 수 있는 유전자 공학처리된 CHO 포유동물 세포가 기재되어 있다 (http://www.eurekainc.com/about_us/companyoverview.html). 별법으로, 본 발명의 항체는, 포유동물-유사 글리코실화 패턴을 위해 공학처리되고, 글리코실화 패턴으로서 항체 결핍 퓨코스를 생성할 수 있는 효모 또는 사상균에서 생성될 수 있다 (예를 들어, EP1297172B1 참조).
본 발명에 의해 고려되는 본원의 항체의 다른 변형으로서는 페길화 (pegylation)가 있다. 항체는, 예를 들어 항체의 생물학적 (예컨대, 혈청) 반감기를 증가시키도록 페길화될 수 있다. 항체를 페길화시키기 위해서는, 이러한 항체 또는 그의 단편을 전형적으로, 1개 이상의 폴리에틸렌 글리콜 (PEG) 기가 항체 또는 항체 단편에 부착되도록 하는 조건 하에 PEG, 예를 들어 PEG의 반응성 에스테르 또는 알데히드 유도체와 반응시킨다. 페길화는 반응성 PEG 분자 (또는 유사한 반응성 수용성 중합체)와의 알킬화 반응 또는 아실화 반응에 의해 수행할 수 있다. 본원에 사용된 바와 같은 용어 "폴리에틸렌 글리콜"은 기타 단백질, 예를 들어 모노 (C1-C10) 알콕시- 또는 아릴옥시-폴리에틸렌 글리콜 또는 폴리에틸렌 글리콜-말레이미드를 유도체화하기 위해 사용되어 온 모든 형태의 PEG를 포괄한다. 특정 실시양태에서, 페길화되는 항체는 비글리코실화 항체이다. 단백질을 페길화하는 방법은 당업계에 공지되어 있고, 본 발명의 항체에 적용할 수 있다. 예를 들어, EP 0 154 316 (Nishimura et al.) 및 EP 0 401 384 (Ishikawa et al.)를 참조한다.
본 발명에서 고려되는 항체의 다른 변형은 생성되는 분자의 반감기를 증가시키기 위해 혈청 단백질, 예를 들어 인간 혈청 알부민 또는 그의 단편에 대한, 적어도 본 발명의 항체의 항원-결합 영역의 접합 또는 단백질 융합이다. 상기 접근법은 예를 들어 EP0322094 (Ballance et al.)에 기재되어 있다.
다른 가능성은 생성되는 분자의 반감기를 증가시키기 위해 혈청 단백질, 예를 들어 인간 혈청 알부민에 결합할 수 있는 단백질에 대한, 적어도 본 발명의 항체의 항원-결합 영역의 융합이다. 상기 접근법은 예를 들어 EP0486525 (Nygren et al.)에 기재되어 있다.
변경된 항체의 공학처리 방법
상기 논의된 바와 같이, 본원에서 제시된 VH 및 VL 서열 또는 전장 중쇄 및 경쇄 서열을 갖는 항-BAFFR 항체는 전장 중쇄 및/또는 경쇄 서열, VH 및/또는 VL 서열, 또는 이들에 부착된 불변 영역(들)을 변형함으로써 새로운 항-BAFFR 항체를 생성하기 위해 사용될 수 있다. 따라서, 본 발명의 또 다른 측면에서, 본 발명의 항-BAFFR 항체의 구조 특징은 인간 BAFFR에 대한 결합 및 BAFFR의 하나 이상의 기능적 특성의 억제와 같은 본 발명의 항체의 적어도 하나의 기능적 특성 (예컨대, 길항작용 활성, B 세포 고갈 활성)을 보유하는 구조상 관련된 항-BAFFR 항체를 생성하기 위해 사용된다.
예를 들어, 본 발명의 항체의 하나 이상의 CDR 영역, 또는 그의 돌연변이는 공지의 프레임워크 영역 및/또는 다른 CDR과 재조합적으로 조합되어, 상기 논의된 바와 같은 본 발명의 추가의 재조합적으로-공학처리된 항-BAFFR 항체를 생성할 수 있다. 기타 유형의 변형에는 상기 섹션에 기재된 것들이 포함된다. 공학처리 방법에 대한 출발 물질은 본원에서 제공된 VH 및/또는 VL 서열들 중 1개 이상, 또는 그의 1개 이상의 CDR 영역이다. 공학처리된 항체를 생성시키기 위해, 본원에서 제공된 VH 및/또는 VL 서열들 중 1개 이상, 또는 그의 1개 이상의 CDR 영역을 갖는 항체를 실제로 제조할 (즉, 단백질로서 발현시킬) 필요는 없다. 오히려, 서열(들) 내에 함유된 정보를 출발 물질로서 사용하여 본래의 서열(들)로부터 유래된 "제2 세대" 서열(들)을 창출시킨 다음, 이러한 "제2 세대" 서열(들)을 단백질로서 제조 및 발현시킨다.
따라서, 또다른 실시양태에서, 본 발명은 서열 1-7로 이루어진 군으로부터 선택되는 CDR1 서열, 서열 8-14로 이루어진 군으로부터 선택되는 CDR2 서열 및/또는 서열 15-21로 이루어진 군으로부터 선택되는 CDR3 서열을 갖는 중쇄 가변 영역 항체 서열; 및 서열 22-28로 이루어진 군으로부터 선택되는 CDR1 서열, 서열 29-35로 이루어진 군으로부터 선택되는 CDR2 서열 및/또는 서열 36-42로 이루어진 군으로부터 선택되는 CDR3 서열을 갖는 경쇄 가변 영역 항체 서열로 이루어지는 항-BAFFR 항체를 제조하고; 중쇄 가변 영역 항체 서열 및/또는 경쇄 가변 영역 항체 서열 내의 하나 이상의 아미노산 잔기를 변경시켜 하나 이상의 변경된 항체 서열을 생성하고; 변경된 항체 서열을 단백질로서 발현시키는 방법을 제공한다.
따라서, 또 다른 실시양태에서, 본 발명은 서열 75-78의 군으로부터 선택되는 서열을 갖는 전장 중쇄 항체 서열; 및 71-74의 군으로부터 선택되는 서열을 갖는 전장 경쇄 항체 서열로 이루어지는 포유동물 세포에서의 발현을 위해 최적화된 항-BAFFR 항체를 제조하고; 전장 중쇄 항체 서열 및/또는 전장 경쇄 항체 서열 내의 하나 이상의 아미노산 잔기를 변경시켜 하나 이상의 변경된 항체 서열을 생성하고; 변경된 항체 서열을 단백질로서 발현시키는 방법을 제공한다.
변경된 항체 서열은 또한 서열 15-21 및 서열 36-42로 이루어진 군 중에서 선택되는 고정된 CDR3 서열 또는 US20050255552에 기재된 바와 같은 최소 필수 결합 결정인자, 및 CDR1 및 CDR2 서열 상의 다양성을 갖는 항체 라이브러리를 스크리닝함으로써 제조할 수 있다. 스크리닝은 항체 라이브러리로부터 항체를 스크리닝하기에 적절한 임의의 스크리닝 기술, 예를 들어 파지 디스플레이 기술에 따라 수행할 수 있다.
표준 분자 생물학 기술은 변경된 항체 서열을 제조하고 발현시는데 사용될 수 있다. 변경된 항체 서열(들)에 의해 코딩된 항체는, 인간 BAFFR에 특이적으로 결합하고/거나 BLyS 유도된 B 세포 증식, BLyS 유도된 B 또는 BLyS 유도된 IgG1 생성을 억제하고/거나 시험관내 또는 생체내에서 인간 B 세포를 고갈시키는 것을 포함하는 (이들로 한정되지는 않음) 본원에 기재된 항-BAFFR 항체의 기능적 특성 중 하나, 일부 또는 모두를 보유하는 것이다.
변경된 항체는 1개 이상, 2개 이상 또는 3개 이상의 상기 논의된 기능적 특성을 나타낼 수 있다.
변경된 항체의 기능적 특성은 당업계에 이용가능하고/하거나 본원에서 설명되는 표준 분석, 예를 들어 실시예에 제시되는 것 (예를 들어, ELISA)을 이용하여 평가할 수 있다.
본 발명의 항체의 공학처리 방법의 특정 실시양태에서, 돌연변이가 항-BAFFR 항체 코딩 서열의 일부 또는 전부를 따라 무작위로 또는 선택적으로 도입될 수 있고, 생성되는 변형된 항-BAFFR 항체는 결합 활성 및/또는 본원에서 설명되는 다른 기능적 특성에 대해 스크리닝될 수 있다. 돌연변이 방법은 당업계에 기재되어 있다. 예를 들어, PCT 공개 WO 02/092780 (Short)에서는 포화 돌연변이 유발, 합성 라이게이션 어셈블리, 또는 그의 조합을 이용하여 항체 돌연변이를 생성하고 스크리닝하는 방법을 기재하고 있다. 별법으로, PCT 공개 WO 03/074679 (Lazar et al.)에서는 항체의 물리화학적 특성을 최적화하기 위해 컴퓨터 스크리닝 방법을 사용하는 방법을 기재하고 있다.
본 발명의 항체를 코딩하는 핵산 분자
본 발명의 또 다른 측면은 본 발명의 항체를 코딩하는 핵산 분자에 관한 것이다. 포유동물 세포에서의 발현을 위해 최적화된 전장 경쇄 뉴클레오티드 서열의 예는 서열 83-86에서 나타난다. 포유동물 세포에서의 발현을 위해 최적화된 전장 중쇄 뉴클레오티드 서열의 예는 서열 79-82에서 나타난다.
이러한 핵산은 전세포, 세포 용해물에 제시될 수 있거나, 또는 부분적으로 정제되거나 실질적으로 정제된 형태의 핵산일 수 있다. 핵산은 알칼린/SDS 처리, CsCl 밴딩 (banding), 컬럼 크로마토그래피, 아가로스 겔 전기영동 및 당업계에 잘 알려져 있는 다른 방법을 비롯한 표준 기술에 의해 다른 세포성 성분 또는 다른 오염물, 예를 들어 다른 세포성 핵산 또는 단백질로부터 정제될 때 "단리되거나" 또는 "실질적으로 순수하게" 된다 (문헌 [F. Ausubel, et al., ed. 1987 Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing and Wiley Interscience, New York] 참조). 본 발명의 핵산은, 예를 들어 DNA 또는 RNA일 수 있고, 인트론성 서열을 함유하거나 함유하지 않을 수 있다. 특정 실시양태에서는, 핵산이 cDNA 분자이다. 핵산은 벡터 (예컨대, 파지 디스플레이 벡터) 또는 재조합 플라스미드 벡터에 제시될 수 있다.
본 발명의 핵산은 표준 분자 생물학 기술을 이용하여 얻을 수 있다. 하이브리도마 (예를 들어, 아래에 더욱 설명하는 바와 같이 인간 면역글로불린 유전자를 보유하는 트랜스제닉 마우스로부터 제조된 하이브리도마)에 의해 발현되는 항체의 경우, 하이브리도마에 의해 제조된 항체의 경쇄 및 중쇄를 코딩하는 cDNA는 표준 PCR 증폭 또는 cDNA 클로닝 기술에 의해 얻을 수 있다. 면역글로불린 유전자 라이브러리로부터 수득한 항체의 경우에는 (예를 들어, 파지 디스플레이 기술을 사용하는 경우), 항체를 코딩하는 핵산을 라이브러리의 구성원인 각종 파지 클론으로부터 회수할 수 있다.
일단 VH 및 VL 절편을 코딩하는 DNA 단편을 수득하게 되면, 이들 DNA 단편을 표준 재조합 DNA 기술에 의해 추가로 조작하여, 예를 들어 가변 영역 유전자를 전당 항체 사슬 유전자, Fab 단편 유전자 또는 scFv 유전자로 전환시킬 수 있다. 이들 조작에서는, VL- 또는 VH-코딩 DNA 단편을 또 다른 DNA 분자에 작동가능하게 연결시키거나, 또는 또 다른 단백질, 예를 들어 항체 불변 영역 또는 가요성 링커를 코딩하는 단편에 작동가능하게 연결시킨다. 이러한 맥락에서 사용된 바와 같은 용어 "작동가능하게 연결된"이란 2개 DNA 단편을 기능적 방식으로 연결시켜, 예를 들어 이러한 2개 DNA 단편에 의해 코딩된 아미노산 서열이 동일 프레임 내에서 유지되도록 하거나 또는 단백질이 목적하는 프로모터의 제어 하에 발현되도록 하는 것을 의미하도록 의도된다.
VH 영역을 코딩하는 단리된 DNA는 VH-코딩 DNA를 중쇄 불변 영역 (CH1, CH2 및 CH3)을 코딩하는 다른 DNA 분자에 작동가능하게 연결함으로써 전장 중쇄 유전자로 전환될 수 있다. 인간 중쇄 불변 영역 유전자의 서열은 당업계에 공지되어 있고 (예를 들어, 문헌 [Kabat, E. A., et al., 1991 Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242] 참조), 이들 영역을 포괄하는 DNA 단편은 표준 PCR 증폭에 의해 수득할 수 있다. 중쇄 불변 영역은 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA, IgE, IgM 또는 IgD 불변 영역일 수 있다. 일부 실시양태에서, 중쇄 불변 영역은 IgG1 이소형 중에서 선택된다. Fab 단편 중쇄 유전자에 대해, VH-코딩 DNA는 중쇄 CH1 불변 영역만을 코딩하는 다른 DNA 분자에 작동가능하게 연결될 수 있다.
VL 영역을 코딩하는 단리된 DNA는 경쇄 불변 영역 CL을 코딩하는 또 다른 DNA 분자에 VL-코딩 DNA를 작동가능하게 연결시킴으로써 전장 경쇄 유전자 (뿐만 아니라 Fab 경쇄 유전자)로 전환시킬 수 있다. 인간 경쇄 불변 영역 유전자의 서열은 당업계에 공지되어 있고 (예를 들어, 문헌 [Kabat, E.A. et al. 1991 Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242] 참조), 이들 영역을 포함하는 DNA 단편은 표준 PCR 증폭에 의해 얻을 수 있다. 경쇄 불변 영역은 카파 또는 람다 불변 영역일 수 있다.
scFv 유전자를 생성하기 위해서는, VH- 및 VL-코딩 DNA 단편을 가요성 링커, 예를 들어 아미노산 서열 (Gly4-Ser)3을 코딩하는 또 다른 단편에 작동가능하게 연결시켜, VH 및 VL 서열이 연속되는 단일쇄 단백질로서 발현될 수 있도록 하는데, VL 영역과 VH 영역은 가요성 링커에 의해 연결된다 (예를 들어, 문헌 [Bird et al., 1988 Science 242:423-426; Huston et al., 1988 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883; McCafferty et al., 1990 Nature 348:552-554] 참조).
본 발명의 모노클로날 항체의 생성
모노클로날 항체 (mAb)는 통상적인 모노클로날 항체 방법, 예를 들어 문헌 [Kohler and Milstein, 1975, Nature 256:495]의 표준 체세포 혼성화 기술을 비롯한 다양한 기술에 의해 생성될 수 있다. 모노클로날 항체를 생성하기 위한 많은 기술, 예를 들어 B 림프구의 바이러스성 또는 발암성 형질전환을 이용할 수 있다.
하이브리도마를 제조하기 위한 동물 시스템은 뮤린 시스템이다. 마우스에서 하이브리도마를 생성시키는 것은 널리 확립된 절차이다. 면역화 프로토콜 및 융합을 위해 면역화된 비장 세포를 단리하는 기술은 당업계에 공지되어 있다. 융합 파트너 (예컨대, 뮤린 골수종 세포) 및 융합 절차 또한 공지되어 있다.
본 발명의 키메라 또는 인간화 항체는 상기 설명된 바와 같이 제조된 뮤린 모노클로날 항체의 서열에 기초하여 제조할 수 있다. 중쇄 및 경쇄 면역글로불린을 코딩하는 DNA를 관심의 대상이 되는 뮤린 하이브리도마로부터 얻고, 비-뮤린 (예를 들어, 인간) 면역글로불린 서열을 함유하도록 공학처리할 수 있다. 예를 들어, 키메라 항체를 생성하기 위해서는 당업계에 공지된 방법을 사용하여 뮤린 가변 영역을 인간 불변 영역에 연결시킬 수 있다 (예를 들어, 미국 특허 번호 4,816,567 (Cabilly et al.) 참조). 인간화 항체를 생성하기 위해서는, 뮤린 CDR 영역을 당업계에 공지된 방법을 사용하여 인간 프레임워크 내로 삽입할 수 있다. 예를 들어, 미국 특허 번호 5225539 (Winter), 및 미국 특허 번호 5530101; 5585089; 5693762 및 6180370 (Queen et al.)을 참조한다.
특정 실시양태에서, 본 발명의 항체는 인간 모노클로날 항체이다. BAFFR에 직접 대항하는 상기 인간 모노클로날 항체는 마우스 면역계보다는 인간 면역계의 일부를 보유하는 트랜스제닉 또는 트랜스크로모좀 마우스를 사용하여 생성시킬 수 있다. 이들 트랜스제닉 및 트랜스크로모좀 마우스에는 본원에서 HuMAb 마우스 및 KM 마우스로서 각각 지칭된 마우스가 포함되고, 이는 본원에서 집합적으로 "인간 Ig 마우스"로서 지칭된다.
HuMAb 마우스(등록상표) (메다렉스 인코포레이티드(Medarex, Inc))는 내인성 μ및 κ 쇄 유전자자리를 불활성화시키는 표적화 돌연변이와 함께, 재배열되지 않은 인간 중쇄 (μ 및 γ) 및 κ 경쇄 면역글로불린 서열을 코딩하는 인간 면역글로불린 유전자 미니자리를 함유한다 (예를 들어, 문헌 [Lonberg, et al., 1994 Nature 368(6474): 856-859] 참조). 따라서, 마우스는 마우스 IgM 또는 κ 발현 저하를 나타내고, 면역화에 반응하여 도입된 인간 중쇄 및 경쇄 트랜스진은 부류 전환과 체세포 돌연변이를 진행하여 고 친화성 인간 IgGκ 모노클로날을 생성한다 (상기 문헌 [Lonberg, N. et al., 1994]; 검토: 문헌 [Lonberg, N., 1994 Handbook of Experimental Pharmacology 113:49-101]; [Lonberg, N. and Huszar, D., 1995 Intern. Rev. Immunol.13: 65-93] 및 [Harding, F. and Lonberg, N., 1995 Ann. N. Y. Acad. Sci. 764:536-546]). HuMAb 마우스의 제조 및 용도, 및 상기 마우스에 의해 수행된 게놈 변형이 문헌 [Taylor, L. et al., 1992 Nucleic Acids Research 20:6287-6295]; [Chen, J. et al., 1993 International Immunology 5: 647-656]; [Tuaillon et al., 1993 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:3720-3724]; [Choi et al., 1993 Nature Genetics 4:117-123]; [Chen, J. et al., 1993 EMBO J. 12: 821-830]; [Tuaillon et al., 1994 J. Immunol. 152:2912-2920]; [Taylor, L. et al., 1994 International Immunology 579-591]; 및 [Fishwild, D. et al., 1996 Nature Biotechnology 14: 845-851]에 추가로 기재되어 있다. 추가로, 미국 특허 번호 5,545,806; 5,569,825; 5,625,126; 5,633,425; 5,789,650; 5,877,397; 5,661,016; 5,814,318; 5,874,299; 및 5,770,429 (모두 Lonberg and Kay); 미국 특허 번호 5,545,807 (Surani et al.); PCT 공보 번호 WO 92103918, WO 93/12227, WO 94/25585, WO 97113852, WO 98/24884 및 WO 99/45962 (모두 Lonberg and Kay); 및 PCT 공보 번호 WO 01/14424 (Korman et al.)를 참조한다.
또 다른 실시양태에서, 본 발명의 인간 항체는 트랜스진 및 트랜스크로모좀 상에 인간 면역글로불린 서열을 보유하는 마우스, 예를 들어 인간 중쇄 트랜스진 및 인간 경쇄 트랜스크로모좀을 보유하는 마우스를 사용하여 생성시킬 수 있다. 그러한 마우스 (본원에서 "KM 마우스"로서 칭함)는 PCT 공보 WO 02/43478 (Ishida et al.)에 상세히 기재되어 있다.
인간 면역글로불린 유전자를 발현하는 추가의 또 다른 트랜스제닉 동물 시스템이 당업계에서 입수 가능하고, 이를 사용하여 본 발명의 항-BAFFR 항체를 생성시킬 수 있다. 예를 들어, 제노마우스(Xenomouse) (압제닉스, 인크. (Abgenix, Inc.))로서 칭하는 대안적인 트랜스제닉 시스템을 사용할 수 있다. 상기 마우스는 예를 들어, 미국 특허 번호 5,939,598; 6,075,181; 6,114,598; 6,150,584 및 6,162,963 (Kucherlapati et al.)에 기재되어 있다.
또한, 인간 면역글로불린 유전자를 발현하는 대안적인 트랜스크로모좀 동물 시스템이 당업계에서 이용가능하고, 본 발명의 항-BAFFR 항체를 생성하기 위해 사용할 수 있다. 예를 들어, 인간 중쇄 트랜스크로모좀 및 인간 경쇄 트랜스크로모좀 둘 다를 보유하고 있는 마우스 ("TC 마우스"로서 지칭됨)를 사용할 수 있고; 이러한 마우스는 문헌 [Tomizuka et al., 2000 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97:722-727]에 기재되어 있다. 더우기, 인간 중쇄 및 경쇄 트랜스크로모좀을 보유하고 있는 암소가 당업계에 보고되었고 (문헌 [Kuroiwa et al., 2002 Nature Biotechnology 20:889-894]), 이를 사용하여 본 발명의 항-BAFFR 항체를 생성시킬 수 있다.
본 발명의 인간 재조합 항체는 인간 면역글로불린 유전자의 라이브러리를 스크리닝하기 위한 파지 디스플레이 방법을 사용하여 제조할 수도 있다. 인간 항체를 단리하기 위한 그러한 파지 디스플레이 방법은 당업계에서 확립되거나 하기 실시예에서 설명된다. 예를 들면: 미국 특허 번호 5,223,409; 5,403,484; 및 5,571,698 (Ladner et al.); 미국 특허 번호 5,427,908 및 5,580,717 (Dower et al.); 미국 특허 번호 5,969,108 및 6,172,197 (McCafferty et al.); 및 미국 특허 번호 5,885,793; 6,521,404; 6,544,731; 6,555,313; 6,582,915 및 6,593,081 (Griffiths et al.)을 참조한다.
본 발명의 인간 모노클로날 항체는, 인간 면역 세포를 재구성시킨 바 있는 SCID 마우스를 사용하여 제조할 수도 있는데, 이로써 면역화시 인간 항체 반응이 발생할 수 있다. 예를 들어, 미국 특허 번호 5,476,996; 및 5,698,767 (Wilson et eal.)에 상기 마우스가 기재되어 있다.
인간 모노클로날 항체를 생산하는 하이브리도마의 생성
본 발명의 인간 모노클로날 항체를 생산하는 하이브리도마를 생성하기 위해, 면역화시킨 마우스로부터의 비장세포 및/또는 림프절 세포를 단리하고 적절한 불멸화 세포주, 예를 들어 마우스 골수종 세포주에 융합시킬 수 있다. 생성된 하이브리도마를 항원 특이적 항체 생산을 위해 스크리닝할 수 있다. 예를 들어, 면역화된 마우스로부터의 비장 림프구의 단일 세포 현탁액을, 50％ PEG를 이용하여 P3X63-Ag8.653 비분비성 마우스 골수종 세포 (ATCC, CRL 1580) 수의 1/6과 융합시킬 수 있다. 세포를 편평 바닥 마이크로타이터 플레이트 내에 약 2 x 145로 플레이팅한 후, 20％ 태아 클론 혈청, 18％ "653" 조건 배지, 5％ 오리겐 (IGEN), 4 mM L-글루타민, 1 mM 피루브산나트륨, 5 mM HEPES, 0.055 mM 2-머캅토에탄올, 50 유닛/ml 페니실린, 50 mg/ml 스트렙토마이신, 50 mg/ml 겐타마이신 및 1X HAT (시그마 (Sigma); HAT는 융합 24시간 후에 첨가)을 함유하는 선택 배지 내에서 2주 인큐베이이션한다. 대략 2주 후, HAT를 HT로 대체시킨 배지에서 세포를 배양할 수 있다. 이어서, 개개의 웰을 인간 모노클로날 IgM 및 IgG 항체에 대해 ELISA에 의해 스크리닝할 수 있다. 일단 광범한 하이브리도마 성장이 일어나면, 배지를 대체로 10-14일 후에 관찰할 수 있다. 항체 분비성 하이브리도마를 재플레이팅하고, 다시 스크리닝하고, 인간 IgG에 대해 여전히 양성인 경우에는, 모노클로날 항체를 제한 희석함으로써 적어도 2회 서브클로닝할 수 있다. 이어서, 안정한 서브클론을 시험관 내에서 배양하여 조직 배양 배지 중에 특성화를 위한 소량의 항체를 생성시킬 수 있다.
인간 모노클로날 항체를 정제하기 위해, 선별된 하이브리도마를 모노크로날 항체 정제를 위해 2 ℓ의 스피너-플라스크에서 성장시킬 수 있다. 상등액을 여과고, 농축시킨 후, 단백질 A-세파로스 (파마시아(Pharmacia), 뉴저지주 피스카타웨이)로 친화 크로마토그래피 처리할 수 있다. 용출된 IgG를 겔 전기영동 및 고 성능 액체 크로마토그래피로 확인하여 순도를 보장할 수 있다. 완충 용액을 PBS로 교환시키고, 흡광 계수 1.43을 사용하여 OD280에 의해 농도를 결정할 수 있다. 모노클로날 항체를 분취하고 -80℃에 보관할 수 있다.
모노클로날 항체를 생산하는 형질감염 세포의 생성
본 발명의 항체는 또한 예를 들어, 당업계에 잘 알려져 있는 재조합 DNA 기술 및 유전자 형질감염 방법의 조합을 이용하여 숙주 세포 이입세포에서 생산할 수 있다 (예를 들어, [Morrison, S. (1985) Science 229:1202]).
예를 들어, 항체 또는 그의 항체 단편을 발현시키기 위해, 부분 또는 전장 경쇄 및 중쇄를 코딩하는 DNA를 표준 분자 생물학 기술 (예를 들어, 관심있는 항체를 발현하는 하이브리도마를 사용하는 cDNA 클로닝 또는 PCR 증폭)에 의해 수득할 수 있고, 유전자가 전사 및 번역 제어 서열에 작동가능하게 연결되도록 DNA를 발현 벡터 내로 삽입할 수 있다. 본 문맥에서 용어 "작동가능하게 연결된"은 벡터 내의 전사 및 번역 제어 서열이 항체 유전자의 전사 및 번역을 조절하는 그들의 의도된 기능을 수행하도록, 항체 유전자가 벡터 내로 라이게이션되는 것을 의미하도록 의도된다. 발현 벡터 및 발현 제어 서열은 사용된 발현 숙주 세포와 상용성이 되도록 선택한다. 항체 경쇄 유전자 및 항체 중쇄 유전자는 별개의 벡터 내로 삽입될 수 있거나, 보다 전형적으로 두 유전자는 동일한 발현 벡터 내로 삽입된다. 항체 유전자를 표준 방법 (예를 들어, 항체 유전자 단편 및 벡터 상의 상보적 제한 부위의 라이게이션, 또는 제한 부위가 존재하지 않는 경우에는 둔단 라이게이션)에 의해 발현 벡터 내로 삽입한다. 본원에 기재된 항체의 경쇄 및 중쇄 가변 영역을 사용하여, 이들을 이미 목적하는 이소형의 중쇄 불변 영역과 경쇄 불변 영역을 코딩하는 발현 벡터 내로 삽입함으로써 모든 항체 이소형의 전당 항체 유전자를 생출시켜 VH 절편이 벡터 내의 CH 절편(들)에 작동가능하게 연결되고 VL 절편이 벡터 내의 CL 절편에 작동가능하게 연결되도록 한다. 부가적으로 또는 다르게는, 재조합 발현 벡터는 숙주 세포로부터 항체 사슬의 분비를 촉진시켜 주는 신호 펩티드를 코딩할 수 있다. 항체 사슬 유전자는 신호 펩티드가 동일 프레임 내에서 항체 사슬 유전자의 아미노 말단에 연결되도록 벡터 내로 클로닝될 수 있다. 신호 펩티드는 면역글로불린 신호 펩티드 또는 이종 신호 펩티드 (즉, 비-면역글로불린 단백질로부터의 신호 펩티드)일 수 있다.
항체 사슬 유전자 이외에도, 본 발명의 재조합 발현 벡터는 숙주 세포에서의 항체 사슬 유전자의 발현을 제어하는 조절 서열을 보유하고 있다. 용어 "조절 서열"은 항체 사슬 유전자의 전사 또는 번역을 제어하는 프로모터, 인핸서 및 다른 발현 제어 요소 (예를 들어, 폴리아데닐화 신호)를 포함하는 것으로 의도된다. 이러한 조절 서열은, 예를 들어 문헌 [Goeddel (Gene Expression Technology. Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA 1990)]에 기재되어 있다. 당업자는 조절 서열의 선택을 비롯한 발현 벡터의 설계가 형질전환될 숙주 세포의 선택, 바람직한 단백질 발현 수준 등과 같은 인자에 따라 달라질 수 있음을 인지할 것이다. 포유동물 숙주 세포 발현을 위한 조절 서열에는 포유동물 세포에서 높은 수준의 단백질 발현을 지시하는 바이러스 요소, 예컨대 사이토메갈로바이러스 (CMV) (예컨대 CMV 프로모터/인핸서), 원숭이 바이러스(Simian Virus) 40 (SV40), 아데노바이러스 (예를 들어, 아데노바이러스 주요 후기 프로모터 (AdMLP)) 및 폴리오마로부터 유래된 프로모터 및/또는 인핸서가 포함된다. 다르게는, 비-바이러스성 조절 서열, 예를 들어 유비퀴틴 프로모터 또는 P-글로빈 프로모터를 사용할 수 있다. 또한, SV40 조기 프로모터로부터의 서열 및 인간 T 세포 백혈병 바이러스 유형 1의 긴 말단 반복부를 함유하는 SRa 프로모터 시스템과 같은 조절 요소는 상이한 공급원으로부터의 서열로 이루어진다 (문헌 [Takebe, Y. et al., 1988 Mol. Cell. Biol. 8:466-472]).
항체 사슬 유전자 및 조절 서열에 추가로, 본 발명의 재조합 발현 벡터는 추가의 서열, 예를 들어 숙주 세포에서 벡터의 복제를 조절하는 서열 (예를 들어, 복제 기원) 및 선택가능한 마커 유전자를 보유할 수 있다. 선택가능한 마커 유전자는 벡터가 도입된 숙주 세포의 선택을 용이하게 한다 (예를 들어, 미국 특허 번호 4,399,216, 4,634,665 및 5,179,017 (모두 Axel et al.) 참조). 예를 들어, 전형적으로 선별성 마커 유전자는 벡터를 도입시킨 숙주 세포 상에서 약물 (예를 들어, G418, 히그로마이신 또는 메토트렉세이트)에 대한 내성을 부여해준다. 선별성 마커 유전자에는 디히드로폴레이트 리덕타제 (DHFR) 유전자 (메토트렉세이트 선별/증폭을 이용하여 dhfr- 숙주 세포에서 사용하기 위함) 및 neo 유전자 (G418 선별을 위함)가 포함된다.
경쇄 및 중쇄의 발현을 위해, 중쇄 및 경쇄를 코딩하는 발현 벡터(들)을 표준 기술에 의해 숙주 세포 내로 형질감염시킨다. 다양한 형태의 용어 "형질감염"은 원핵생물 또는 진핵생물 숙주 세포 내로 외인성 DNA의 도입을 위해 일반적으로 사용되는 매우 다양한 기술, 예를 들어 전기천공, 인산칼슘 침전, DEAE-덱스트란 형질감염 등을 포함하는 것으로 의도된다. 본 발명의 항체를 원핵 또는 진핵 숙주 세포에서 발현시키는 것이 이론상 가능하다. 항체를 진핵 세포, 특히 포유동물 숙주 세포에서 발현시키는 것이 논의되는데, 이는 이러한 진핵 세포, 특히 포유동물 세포가 적절하게 폴딩되고 면역학적으로 활성인 항체를 어셈블리하고 분비시키는 데에 원핵 세포 보다 더 적합하기 때문이다. 항체 유전자의 원핵 발현은 활성 항체의 고수율 생산을 위해 비효과적인 것으로 보고되었다 (문헌 [Boss, M.A. and Wood, C.R., 1985 Immunology Today 6:12-13]).
본 발명의 재조합 항체를 발현시키기 위한 포유동물 숙주 세포에는 차이니즈 햄스터 난소 (CHO 세포)가 포함된다 (문헌 [Urlaub and Chasin, 1980 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216-4220]에 기재된 dhfr- CHO 세포 포함, 예를 들어 문헌 [Kaufman and P.A. Sharp, 1982 Mol. Biol. 159:601-621]에 기재된 바와 같은 DH FR 선별성 마커와 함께 사용), NSO 골수종 세포, COS 세포 및 SP2 세포가 포함된다. 특히, NSO 골수종 세포와 함께 사용하는 경우, 또 다른 발현 시스템은 WO 87/04462, WO 89/01036 및 EP 338,841에 제시된 GS 유전자 발현 시스템이다. 한 실시양태에서, 본 발명의 재조합 항체의 발현을 위한 포유동물 숙주 세포는, 예를 들어 US6,946,292B2에 기재된 바와 같은 FUT8 유전자발현이 결핍된 포유동물 세포주를 포함한다. 항체 유전자를 코딩하는 재조합 발현 벡터가 포유동물 숙주 세포 내로 도입되는 경우, 숙주 세포 내에서 항체가 발현되거나 숙주 세포가 성장된 배양 배지 내로 항체를 분비하기에 충분한 시간 동안 숙주 세포를 배양함으로써 항체가 생산된다. 표준 단백질 정제 방법을 사용하여 항체를 배양 배지로부터 회수할 수 있다.
면역접합체
또 다른 측면에서, 본 발명은 치료 모이어티, 예를 들어 세포독소, 약물 (예컨대, 면역억제제) 또는 방사성독소에 접합된 항-BAFFR항체, 또는 이의 단편을 특징으로 한다. 이같은 접합체는 본원에서 "면역접합체"로 지칭된다. 1가지 이상의 세포독소를 포함하는 면역접합체는 "면역독소"로 지칭된다. 세포독소 또는 세포독성제에는 세포에게 해로운 (예를 들어, 사멸시키는) 모든 작용제가 포함된다. 예로는 탁손, 사이토칼라신 B, 그라미시딘 D, 에티듐 브로마이드, 에메틴, 미토마이신, 에토포시드, 테노포시드, 빈크리스틴, 빈블라스틴, t-콜히친, 독소루비신, 다우노루비신, 디히드록시 안트라신 디온, 미톡산트론, 미트라마이신, 악티노마이신 D, 1-데히드로테스토스테론, 글루코코르티코이드, 프로카인, 테트라카인, 리도카인, 프로프라놀롤 및 푸로마이신, 및 이의 유사체 또는 상동체가 포함된다. 치료제에는 또한, 예로써 항대사물질 (예컨대, 메토트렉세이트, 6-메르캅토퓨린, 6-티오구아닌, 시타라빈, 5-플루오르우라실 데카르바진), 알킬화제 (예컨대, 메클로레타민, 티오에파 클로람부실, 멜팔란, 카르무스틴 (BSNU)와 로무스틴 (CCNU), 시클로포스파미드, 부설판, 디브로모만니톨, 스트렙토조토신, 미토마이신 C, 및 시스-디클로로디아민 백금(II)(DDP) 시스플라틴, 안트라사이클린 (예컨대, 다우노루비신 (이전에 다우노마이신)과 독소루비신), 항생제 (예컨대, 닥티노마이신 (이전에 악티노마이신), 블레오마이신, 미트라마이신, 및 안트라마이신 (AMC)), 및 항-유사분열제 (예컨대, 빈크리스틴과 빈블라스틴)이 포함된다.
본 발명의 항체에 접합될 수 있는 치료 세포독소의 다른 예에는 듀오카르마이신, 칼리케아미신, 메이탄신과 아우리스타틴 및 이들의 유도체가 포함된다. 칼리키아마이신 항체 접합체의 예를 상업적으로 입수할 수 있다 [마일로타그(Mylotarg, 상표명); 와이어스-아이어스트(Wyeth-Ayerst)].
세포독소는 당업계에서 이용가능한 링커 기술을 이용하여 본 발명의 항체에 접합될 수 있다. 세포독소를 항체에 접합시키는데 사용된 링커 유형의 예로는 히드라존, 티오에테르, 에스테르, 디술피드 및 펩티드-함유 링커가 포함되지만, 이에 한정되지 않는다. 예를 들어 리소좀 구획 내의 낮은 pH에 의한 절단에 감수성이거나 또는 프로테아제, 예를 들어 종양 조직에서 우선적으로 발현되는 프로테아제, 예를 들어 카텝신 (예를 들어, 카텝신 B, C, D)에 의한 절단에 감수성인 링커가 선택될 수 있다.
세포독소의 유형, 링커, 및 치료제를 항체에 접합시키는 방법에 관한 추가적인 논의를 위해, 또한 문헌 [Saito, G. et al., 2003 Adv. Drug Deliv. Rev. 55:199-215]; [Trail, P.A. et al., 2003 Cancer Immunol. Immunother. 52:328-337]; [Payne, G., 2003 Cancer Cell 3:207-212]; [Allen, T.M., 2002 Nat. Rev. Cancer 2:750-763]; [Pastan, I. and Kreitman, R. J., 2002 Curr. Opin. Investig. Drugs 3:1089-1091]; [Senter, P.D. and Springer, C.J., 2001 Adv. Drug Deliv. Rev. 53:247-264]를 참조한다.
본 발명의 항체는 방사성면역접합체로도 지칭되는 세포독성 방사성약제를 생성하기 위하여 방사성 동위원소에 접합될 수도 있다. 진단적 또는 치료적 사용을 위하여 항체에 접합될 수 있는 방사성 동위원소의 예에는 요오드131, 인듐111, 이트륨90 및 루테튬177이 포함되지만 여기에 제한되지는 않는다. 방사성면역접합체를 제조하는 방법은 당업계에 확립되어 있다. 제발린 (Zevalin, 상표명) (DEC 파마슈티컬스(DEC Pharmaceuticals)) 및 벡사르 (Bexxar, 상표명) (코릭사 파마슈티컬즈(Corixa Pharmaceuticals))을 비롯한 방사성면역접합체의 예가 상업적으로 입수가능하고, 본 발명의 항체를 사용하여 방사성면역접합체를 제조하는데 유사한 방법을 이용할 수 있다.
본 발명의 항체 접합체는 소정의 생물학적 반응을 변화시키는데 이용될 수 있고, 약물 모이어티는 고전적인 화학 치료제에 한정하여 해석되어서는 안된다. 예를 들어, 약물 모이어티는 목적하는 생물학적 활성을 갖는 단백질 또는 폴리펩티드일 수 있다. 이같은 단백질에는, 예를 들어 효소적으로 활성인 독소, 또는 이의 활성 단편, 예컨대 아브린, 리신 A, 슈도모나스 외독소, 또는 디프테리아 독소; 단백질, 예컨대 종양 괴사 인자 또는 인터페론-γ; 또는 생물학적 반응 변형제, 예를 들어 림포카인, 인터루킨-1 ("IL-1"), 인터루킨-2 ("IL-2"), 인터루킨-6 ("IL-6"), 과립구 대식세포 콜로니 자극 인자 ("GM-CSF"), 과립구 콜로니 자극 인자 ("G-CSF"), 또는 기타 성장 인자가 포함될 수 있다.
이같은 치료 모이어티를 항체에 접합시키는 기술은 널리 공지되어 있고, 예를 들어, 문헌 [Amon et al., "Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs In Cancer Therapy", in Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy, Reisfeld et al. (eds.), pp. 243-56 (Alan R. Liss, Inc. 1985)]; [Hellstrom et al., "Antibodies For Drug Delivery", in Controlled Drug Delivery (2nd Ed.), Robinson et al. (eds.), pp. 623-53 (Marcel Dekker, Inc. 1987)]; [Thorpe, "Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy: A Review", in Monoclonal Antibodies '84: Biological And Clinical Applications, Pinchera et al. (eds.), pp. 475-506 (1985)]; ["Analysis, Results, And Future Prospective Of The Therapeutic Use Of Radiolabeled Antibody In Cancer Therapy", in Monoclonal Antibodies For Cancer Detection And Therapy, Baldwin et al. (eds.), pp. 303-16 (Academic Press 1985)] 및 [Thorpe et al., "The Preparation And Cytotoxic Properties Of Antibody-Toxin Conjugates", Inmunol. Rev., 62:119-58 (1982)]를 참조한다.
이중특이적 분자
또 다른 측면에서, 본 발명은 본 발명의 항-BAFFR 항체 또는 그의 단편을 포함하는 이중특이적 또는 다중특이적 분자를 특징으로 한다. 본 발명의 항체 또는 그의 항원-결합 영역은 유도체화되거나 다른 기능적 분자, 예를 들어 다른 펩티드 또는 단백질 (예를 들어, 다른 항체 또는 수용체에 대한 리간드)에 연결되어, 2개 이상의 상이한 결합 부위 또는 표적 분자에 결합하는 이중특이적 분자를 생성할 수 있다. 본 발명의 항체는 실제로 유도체화되거나 1개 초과의 다른 기능적 분자에 연결되어, 2개 초과의 상이한 결합 부위 및/또는 표적 분자에 결합하는 다중특이적 분자를 생성할 수 있고; 그러한 다중특이적 분자는 또한 본원에서 사용될 때 용어 "이중특이적 분자"에 포함되는 것으로 의도된다. 본 발명의 이중특이적 분자를 생성하기 위해, 본 발명의 항체는 하나 이상의 다른 결합 분자, 예를 들어 다른 항체, 항체 단편, 펩티드 또는 결합 모방체에 기능적으로 연결될 수 있어서 (예를 들어, 화학적 커플링, 유전자 융합, 비공유 회합 등에 의해), 이중특이적 분자가 생성된다.
따라서, 본 발명은 BAFFR에 대한 적어도 하나의 제1 결합 특이성과 제2 표적 에피토프에 대한 제2 결합 특이성을 갖는 이중특이적 분자를 포함한다. 예를 들어, 제2 표적 에피토프는 제1 표적 에피토프와 상이한 BAFFR의 또다른 에피토프이다. 또 다른 예는 적어도 하나가 BAFFR에 대한 제1 결합 특이성, 및 CD20 내의 에피토프에 대한 제2 결합 특이성을 갖는 이중특이적 분자이다.
추가로, 이중특이적 분자가 다중특이적인 발명에 대해, 분자는 제1 및 제2 표적 에피토프 이외에 제3 결합 특이성을 추가로 가질 수 있다.
한 실시양태에서, 본 발명의 이중특이적 분자는 결합 특이체로서 적어도 하나의 항체 또는 그의 항체 단편, 예를 들어, Fab, Fab', F(ab')2, Fv 또는 단일쇄 Fv를 포함한다. 항체는 또한, 경쇄 또는 중쇄 이량체, 또는 그의 모든 최소 단편, 예를 들어 Fv 또는 단일쇄 구조체 (그의 내용이 본원에 명백히 참조로 포함되는 미국 특허 번호 4,946,778 (Ladner et al.)에 기재된 바와 같음)일 수도 있다.
본 발명의 이중특이적 분자에 사용될 수 있는 다른 항체는 뮤린, 키메라 및 인간화 모노클로날 항체이다.
본 발명의 이중특이적 분자는 당업계에 공지된 방법을 사용하여 구성성분 결합 특이체를 접합시킴으로써 제조할 수 있다. 예를 들어, 이중특이적 분자의 각 결합 특이체를 개별적으로 생성시킨 후, 서로 접합시킬 수 있다. 결합 특이체가 단백질 또는 펩티드인 경우에는, 공유 접합을 위해 각종 커플링제 또는 가교 결합제를 사용할 수 있다. 가교결합제의 예는 단백질 A, 카르보디이미드, N-숙신이미딜-S-아세틸-티오아세테이트 (SATA), 5,5'-디티오비스(2-니트로벤조산) (DTNB), o-페닐렌디말레이미드 (oPDM), N-숙신이미딜-3-(2-피리딜디티오)프로피오네이트 (SPDP), 및 술포숙신이미딜 4-(N-말레이미도메틸)시클로헥산-1-카르복실레이트 (술포-SMCC)를 포함한다 (예를 들어, 문헌 ([Karpovsky et al., 1984 J. Exp. Med. 160:1686]; [Liu, MA et al., 1985 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:8648]) 참조). 다른 방법에는 문헌 [Paulus, 1985 Behring Ins. Mitt. No. 78,118-132]; [Brennan et al., 1985 Science 229:81-83] 및 [Glennie et al., 1987 J. Immunol. 139: 2367-2375]에 기재된 방법이 포함된다. 접합제는 SATA 및 술포-SMCC (둘 다 피어스 케미컬 코포레이션(Pierce Chemical Co., 일리노이주 록포드)로부터 입수 가능)이다.
결합 특이체가 항체인 경우에는, 이들을 두 중쇄의 C-말단 힌지 영역을 술프히드릴 결합에 의해 접합시킬 수 있다. 특정 실시양태에서, 힌지 영역은 접합 이전에 홀수의 술프히드릴 잔기, 예를 들어 1개의 술프히드릴 잔기를 함유하도록 변형된다.
별법으로, 결합 특이체 둘 다를 동일한 벡터에서 코딩할 수 있고, 동일한 숙주 세포에서 발현 및 어셈블리할 수 있다. 이 방법은 이중특이적 분자가 mAb x mAb, mAb x Fab, Fab x F(ab')2 또는 리간드 x Fab 융합 단백질인 경우에 특히 유용하다. 본 발명의 이중특이적 분자는 하나의 단일쇄 항체와 결합 결정기를 포함하는 단일쇄 분자, 또는 2개의 결합 결정기를 포함하는 단일쇄 이중특이적 분자일 수 있다. 이중특이적 분자는 2개 이상의 단일쇄 분자를 포함할 수 있다. 이중특이적 분자를 제조하는 방법은 예를 들어, 미국 특허 번호 5,260,203; 미국 특허 번호 5,455,030; 미국 특허 번호 4,881,175; 미국 특허 번호 5,132,405; 미국 특허 번호 5,091,513; 미국 특허 번호 5,476,786; 미국 특허 번호 5,013,653; 미국 특허 번호 5,258,498; 및 미국 특허 번호 5,482,858에 기재되어 있다.
그들의 특이적 표적에 대한 이중특이적 분자의 결합은, 예를 들어 효소 결합 면역흡착 검정 (ELISA), 방사선면역검정 (REA), FACS 분석, 생물학적 검정 (예컨대, 성장 억제) 또는 웨스턴 블롯 (Western Blot) 검정으로 확인할 수 있다. 이들 검정 각각은 일반적으로, 관심있는 복합체에 대해 특이적인 표지된 시약 (예컨대, 항체)를 이용함으로써 특별히 관심있는 단백질-항체 복합체의 존재를 검출한다.
다가 항체
또 다른 측면에서, 본 발명은 BAFFR에 결합하는 본 발명의 항체의 2개 이상의 동일하거나 상이한 항원 결합 부위를 포함하는 다가 항체를 제공한다. 한 실시양태에서, 다가 항체는 항체의 2, 3 또는 4개 이상의 항원-결합 부위를 제공한다. 항원 결합 부분들은 단백질 융합 또는 공유 또는 비-공유 연결을 통해 함께 연결될 수 있다. 별법으로, 연결 방법이 이중특이적 분자에 대해 기술되었다. 예를 들어, 본 발명의 항체를 본 발명의 항체의 불변 영역, 예를 들어 Fc 또는 힌지 영역에 결합하는 항체와 가교결합시킴으로써 4가 화합물을 얻을 수 있다.
제약 조성물
또 다른 측면에서, 본 발명에서는 제약상 허용되는 담체와 함께 제제화된, 본 발명의 모노클로날 항체, 또는 그의 항원-결합 부위(들) 중 하나 또는 이들의 조합물을 함유하는 조성물, 예를 들어 제약 조성물을 제공한다. 그러한 조성물은 본 발명의 (예를 들어, 2개 이상의 상이한) 항체, 또는 면역접합체 또는 이중특이적 분자 중 하나 또는 이들의 조합물을 포함할 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 제약 조성물은 표적 항원 상의 상이한 에피토프에 결합하거나 상보성 활성을 갖는 항체의 조합물을 포함할 수 있다.
본 발명의 제약 조성물은 또한 조합 요법으로, 즉, 다른 작용제와 조합되어 투여될 수 있다. 예를 들어, 조합 요법은 하나 이상의 다른 소염제 또는 또 다른 화학요법제, 예를 들어 세포독성제, 항암제 및 항증식제와 조합된 본 발명의 항-BAFFR 항체을 포함할 수 있다. 조합 요법에 사용할 수 있는 치료제의 예는 본 발명의 항체의 용도에 대한 아래 섹션에서 보다 상세히 설명한다.
본원에서 사용할 때, "제약상 허용되는 담체"는 생리학적으로 상용성인 임의의 모든 용매, 분산 매질, 코팅, 항균제 및 항진균제, 등장화제 및 흡수 지연제 등을 포함한다. 담체는 정맥내, 근육내, 피하, 비경구, 척수 또는 표피 투여 (예를 들어, 주사 또는 주입에 의함)하는 데에 적합해야 한다. 투여 경로에 따라, 활성 화합물, 즉, 항체, 면역접합체 또는 이중특이적 분자는 산 작용 및 화합물을 불활성화시킬 수 있는 다른 천연 조건으로부터 화합물을 보호하기 위해 물질 내에 코팅될 수 있다.
본 발명의 제약 화합물에는 하나 이상의 제약상 허용되는 염이 포함될 수 있다. "제약상 허용되는 염"은 모 화합물의 목적하는 생물학적 활성을 보유하고 있고 바람직하지 못한 어떠한 독성학적 효과도 제공하지 않는 염을 지칭한다 (예를 들어, 문헌 [Berge, S.M. et al., 1977 J. Pharm. Sci. 66:1-19] 참조). 이러한 염의 예에는 산 부가염 및 염기 부가 염이 포함된다. 산 부가염에는 무독성 무기 산, 예를 들어 염산, 질산, 인산, 황산, 브롬화수소산, 요오드화수소산, 아인산 등으로부터 유래된 염 뿐만 아니라 무독성 유기 산, 예를 들어 지방족 모노- 및 디-카르복실산, 페닐-치환된 알칸산, 히드록시 알칸산, 방향족 산, 지방족 및 방향족 술폰산으로부터 유래된 염 등이 포함된다. 염기 부가 염에는 알칼리 토금속, 예를 들어 나트륨, 칼륨, 마그네슘, 칼슘 등으로부터 유래된 염 뿐만 아니라 무독성 유기 아민, 예를 들어 N,N'-디벤질에틸렌디아민, N-메틸글루카민, 클로로프로카인, 콜린, 디에탄올아민, 에틸렌디아민, 프로카인 등으로부터 유래된 염이 포함된다.
본 발명의 제약 조성물은 또한, 제약상 허용되는 항산화제를 포함할 수 있다. 제약상 허용되는 항산화제의 예로는 수용성 항산화제, 예컨대 아스코르브산, 시스테인 히드로클로라이드, 중황산나트륨, 메타중아황산나트륨, 아황산나트륨 등; 지용성 항산화제, 예컨대 아스코르빌 팔미테이트, 부틸화된 히드록시아니솔 (BHA), 부틸화된 히드록시톨루엔 (BHT), 레시틴, 프로필 갈레이트, 알파-토코페롤 등; 및 금속 킬레이트제, 예컨대 시트르산, 에틸렌디아민 테트라아세트산 (EDTA), 소르비톨, 타르타르산, 인산 등이 포함된다.
본 발명의 제약 조성물에 사용될 수 있는 적합한 수성 및 비수성 담체의 예로는 물, 에탄올, 폴리올 (예컨대, 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜 등) 및 이들의 적합한 혼합물, 식물성 오일, 예컨대 올리브유, 및 주사용 유기 에스테르, 예컨대 에틸 올레에이트가 포함된다. 적절한 유동성은 예를 들어 코팅 물질, 예를 들어 레시틴의 사용에 의해, 분산액의 경우에 요구되는 입자 크기의 유지에 의해, 그리고 계면활성제의 사용에 의해 유지될 수 있다.
이들 조성물은 보존제, 습윤제, 유화제 및 분산제와 같은 보조제를 또한 함유할 수 있다. 미생물의 존재 예방은 상기한 멸균 절차에 의해 및 다양한 항균제 및 항진균제, 예를 들어 파라벤, 클로로부탄올, 페놀 소르브산 등의 도입에 의해 보장할 수 있다. 등장화제, 예를 들어 당, 염화나트륨 등을 조성물 내로 도입시키는 것이 요망될 수도 있다. 또한, 주사 가능한 제약 형태를 장기간 흡수시키는 것은 흡수를 지연시키는 작용제, 예를 들어 알루미늄 모노스테아레이트 및 젤라틴을 도입시킴으로써 수행할 수 있다.
제약상 허용되는 담체에는 멸균성 수성 용액 또는 분산액, 및 멸균성 주사용 용액 또는 분산액을 즉석 제조하기 위한 멸균성 분말이 포함된다. 제약상 활성 물질에 대해 상기 매질 및 작용제를 사용하는 것은 당업계에 공지되어 있다. 통상적인 매질 또는 작용제가 활성 화합물과 비상용성인 경우를 제외하고는, 본 발명의 제약 조성물에서의 그의 용도가 고려된다. 추가의 활성 화합물이 또한 조성물에 혼입될 수 있다.
치료 조성물은 전형적으로 제조 및 저장 조건하에 멸균성이고 안정해야만 한다. 조성물은 용액, 미소에멀션, 리포솜, 또는 고 약물 농도에 적합한 기타 정렬된 구조물로서 제제화될 수 있다. 담체는 예를 들어, 물, 에탄올, 폴리올 (예를 들어, 글리세롤, 프로필렌 글리콜 및 액체 폴리에틸렌 글리콜 등)을 함유하는 용매 또는 분산성 매질 및 이들의 적합한 혼합물일 수 있다. 적당한 유동성은, 예를 들어 코팅제 (예컨대, 레시틴)을 사용하고, 분산액의 경우에는 요구되는 입자 크기를 유지하며, 계면활성제를 사용함으로써 유지시킬 수 있다. 많은 경우에 있어, 조성물 내에 등장화제, 예를 들어 당, 다가 알콜, 예를 들어 만니톨, 솔비톨, 또는 염화나트륨을 포함할 수 있다. 주사 가능한 조성물을 장기간 흡수시키는 것은 조성물 내에 흡수를 지연시키는 작용제, 예를 들어 모노스테아레이트 염 및 젤라틴을 도입시킴으로써 수행할 수 있다.
안정한 단백질 (예컨대, 항체) 제제의 개발에 관한 검토는 문헌 [Cleland et al. (1993) Crit. Reviews. Ther. Drug Carrier Systems 10(4):307-377] 및 [Wei Wang (1999) Int. J. Pharmaceutics 185:129-88]에서 찾아볼 수 있다. 항체에 대한 추가의 제제 논의는, 예를 들어 문헌 [Daugherty and Mrsny (2006) Advanced Drug Delivery Reviews 58: 686-706]; US 6171586; US4618486; US20060286103; WO06044908; WO07095337; WO04016286; 문헌 [Colandene et al. (2007) J. Pharm. Sci 96:1598-1608]; [Schulman (2001) Am. J. Respir. Crit. Care Med. 164:S6-S11] 및 다른 공지된 참고문헌에서 찾아볼 수 있다.
피내 또는 피하 용도에 사용되는 용액 또는 현탁액에는 전형적으로 하기의 성분 중 하나 이상이 포함된다: 멸균 희석제 예컨대 주사용수, 염수 용액, 고정유, 폴리에틸렌 글리콜, 글리세린, 프로필렌 글리콜 또는 기타 합성 용매; 항균제 예컨대 벤질 알콜 또는 메틸 파라벤; 항산화제 예컨대 아스코르브산 또는 중아황산나트륨; 킬레이팅제 예컨대 에틸렌디아민테트라아세트산; 완충제 예컨대 아세테이트, 시트레이트 또는 포스페이트 및 등장성 조정제 예컨대 염화나트륨 또는 덱스트로스. pH는 산 또는 염기, 예컨대 염산 또는 수산화나트륨으로 조정될 수 있다. 이러한 제제를 유리 또는 플라스틱으로 제조된 앰풀, 1회용 주사기 또는 다중 용량 바이알 내에 넣을 수 있다.
멸균 주사가능한 용액은 요구량의 본 발명의 항체를, 필요에 따라 상기 열거된 성분들 중의 하나 또는 이들의 조합물과 함께 적당한 용매에 혼입시킨 후, 멸균 미세여과시킴으로써 제조할 수 있다. 일반적으로, 분산제는 활성 화합물을 기본 분산 매질과 상기 열거된 것 중에서 요구되는 기타 성분을 함유하는 멸균성 비히클 내로 혼입함으로써 제조한다. 멸균성 주사용 용액을 제조하기 위한 멸균성 분말의 경우, 제조 방법은 진공 건조 및 냉동-건조 (동결건조)인데, 이로써 앞서 멸균-여과시킨 그의 용액으로부터 임의의 추가 목적 성분이 활성 성분에 부가된 분말이 얻어진다.
치료 유효량의 본 발명의 항체를, 예를 들어 정맥내, 피부 또는 피하 주사에 의해 투여하는 경우, 결합제는 발열원-무함유의 비경구적으로 허용되는 수용액의 형태일 것이다. pH, 등장성, 안정성 등을 충분히 고려한 이러한 비경구적으로 허용되는 단백질 용액의 제제가 당업자들의 기술내에 있다. 정맥내, 피부 또는 피하 주사에 바람직한 제약 조성물은 결합제 이외에 등장성 비히클, 예컨대 염화나트륨 주사액, 링거 주사액, 덱스트로스 주사액, 및 덱스트로스와 염화나트륨 주사액, 락트산 링거 주사액, 또는 당업계에 공지된 다른 비히클을 함유해야 한다. 본 개시 내용의 제약 조성물(들)은 또한 안정화제, 보존제, 완충제, 항산화제 또는 당업자들에게 공지된 다른 첨가제를 함유할 수 있다.
담체 물질과 조합되어 단일 투여 형태를 생성할 수 있는 활성 성분의 양은 치료받는 대상, 및 특정 투여 방식에 따라 변할 것이다. 담체 물질과 조합되어 단일 투여 형태를 생성할 수 있는 활성 성분의 양은 일반적으로 치료 효과를 생성시키는 조성물의 양일 것이다. 일반적으로, 이러한 양은 제약상 허용되는 담체와 조합되는 활성 성분 (100％ 기준)의 약 0.01％ 내지 약 99％, 약 0.1％ 내지 약 70％, 또는 약 1％ 내지 약 30％의 범위일 것이다.
투여 요법은 목적하는 최적의 반응 (예를 들어, 치료 반응)을 제공하도록 조정한다. 예를 들어, 단일 볼루스를 투여할 수 있거나, 여러 분할 용량을 시간에 걸쳐 투여할 수 있거나, 또는 치료적 상황의 요건에 의해 나타나는 대로 용량을 비례적으로 감소 또는 증가시킬 수 있다. 비경구 조성물을 투여의 용이성 및 투여량의 균일성을 위해 투여 단위 형태로 제제화하는 것이 특히 유리하다. 본원에서 사용된 바와 같은 투여 단위 형태는 치료받고자 하는 대상체에 대한 단일 투여량으로서 적합한 물리적으로 독립된 단위를 지칭하고; 각 단위는 요구되는 제약 담체와 함께 목적하는 치료 효과를 제공하도록 계산된 예정량의 활성 화합물을 함유한다. 본 발명의 투여 단위 형태에 관한 상세사항은 활성 화합물의 독특한 특징 및 달성하고자 하는 특정 치료 효과, 및 개체에서 민감도를 치료하기 위해 상기 활성 화합물을 배합하는 분야에 있어 내재된 제한사항에 의해 지시되고 이에따라 직접적으로 달라진다.
항체의 투여에 대해, 투여량은 숙주 체중을 기준으로 약 0.0001 내지 100 ㎎, 더욱 일반적으로는 0.01 내지 5 ㎎ 범위이다. 예를 들어, 투여량은 0.3 mg/kg 체중, 1 mg/kg 체중, 3 mg/kg 체중, 5 mg/kg 체중 또는 10 mg/kg 체중, 또는 1 내지 10 mg/kg의 범위 이내일 수 있다. 예시적 치료 요법에는 1주 1회 투여, 2주 마다 1회 투여, 3주 마다 1회 투여, 4주 마다 1회 투여, 1개월에 1회 투여, 3개월 마다 1회 투여, 또는 3 내지 6개월 마다 1회 투여하는 것이 포함된다. 본 발명의 항-BAFFR 항체에 대한 투여 요법에는 1 mg/kg 체중 또는 3 mg/kg 체중으로 정맥내 투여하는것이 포함되고, 여기서 항체는 다음 투여 스케쥴 중 하나를 사용하여 주어진다: 6회 투여량에 대해 4주마다, 이어서 3개월마다; 3주마다; 3 mg/kg 체중으로 1회, 이어서 1 mg/kg 체중으로 3주마다.
일부 방법에서, 결합 특이성이 상이한 2가지 이상의 모노클로날 항체가 동시에 투여되고, 이러한 경우 투여되는 각각의 항체의 투여량은 지시된 범위 내에 속한다. 항체는 일반적으로 여러 번 투여된다. 단일 투여량들 간의 간격은, 예를 들어, 1주일, 1개월, 3개월, 또는 1년일 수 있다. 또한, 환자에서 표적 항원에 대한 항체의 혈액 수준을 측정함으로써 지시되는 바와 같이 간격이 불규칙적일 수 있다. 몇몇 방법에서, 투여량은 약 1-1000 ㎍/ml, 및 일부 방법에서 약 25-300 ㎍/ml의 혈장 항체 농도를 달성하도록 조정된다.
별법으로, 낮은 빈도로 투여하는 것이 요구되는 경우에는 항체를 지속 방출 제형으로서 투여할 수 있다. 투여량과 빈도는 환자 내에서의 항체의 반감기에 따라서 달라진다. 일반적으로, 인간 항체가 가장 긴 반감기를 나타내고, 그 다음으로 인간화 항체, 키메라 항체 및 비인간 항체 순이다. 투여량과 투여 빈도는 치료가 예방적인지 치료적인지에 따라서 달라질 수 있다. 예방적으로 적용하는 경우에는, 비교적 낮은 투여량을 장기간에 걸쳐 비교적 드문 간격으로 투여한다. 몇몇 환자는 그들의 나머지 일생 동안 지속적으로 치료받아야 한다. 치료적으로 적용하는 경우에는, 질환의 진행이 저하되거나 종결될 때까지, 또는 환자가 질환 증상의 부분적 또는 완전한 개선을 나타낼 때까지 비교적 높은 투여량을 비교적 짧은 간격으로 투여하는 것이 종종 요구된다. 그 후, 환자에게 예방적 요법제를 투여할 수 있다.
본 발명의 제약 조성물 내의 활성 성분의 실제 투여량 수준은 환자에게 독성이 없으면서 특정 환자, 조성물 및 투여 방식에 대해 목적하는 치료 반응을 달성하기 위해 효과적인 활성 성분의 양을 얻도록 변할 수 있다. 선택된 투여량 수준은 사용되는 본 발명의 특정 조성물의 활성 또는 그의 에스테르, 염 또는 아미드, 투여 경로, 투여 시간, 사용되는 특정 화합물의 분비 속도, 치료의 지속 기간, 사용되는 특정 조성물과 조합으로 사용되는 다른 약물, 화합물 및/또는 물질, 치료되는 환자의 연령, 성별, 체중, 상태, 일반적인 건강 및 이전의 의료력, 및 의학 분야에 잘 알려져 있는 유사한 인자를 포함하는 다양한 약동학 인자에 따라 달라될 것이다.
본 발명의 항-BAFFR 항체의 "치료 유효 투여량"은 질환 증상의 중증도의 감소, 질환 증상이 없는 기간의 빈도와 지속 기간의 증가, 또는 질환 고통으로 인한 장애 또는 무능력의 예방을 일으킬 수 있다.
본 발명의 조성물은 당업계에 공지된 각종 방법 중의 한 가지 이상을 사용하여 한 가지 이상의 투여 경로에 의해 투여할 수 있다. 당업자가 인지하는 바와 같이, 투여 경로 및/또는 방식은 목적하는 결과에 따라서 달라질 것이다. 본 발명의 항체에 대한 투여 경로는 예를 들어 주사 또는 주입에 의한 정맥내, 근육내, 피부내, 복강내, 피하, 척수 또는 다른 비경구 투여 경로를 포함한다. 본원에 사용된 바와 같은 어구 "비경구 투여"는 장내 및 국소 투여 이외의 투여 방식, 통상적으로 주사에 의한 투여를 의미하는데, 이에는 정맥내, 근육내, 동맥내, 경막내, 피막내, 안와내, 심장내, 피내, 복강내, 경기관, 피하, 표피하, 관절내, 피막하, 지주막하, 척수내, 경막외 및 흉골내 주사 및 주입이 포함되지만, 그에 제한되지 않는다.
별법으로, 본 발명의 항체는 비경구가 아닌 경로에 의해, 예를 들어 국소, 표피 또는 점막 투여 경로, 예를 들어, 비강내, 경구, 질, 직장, 설하 또는 국소로 투여할 수 있다.
활성 화합물은 임플란트, 경피 패치, 및 미세캡슐화 전달 시스템을 비롯한 제어 방출 제제와 같이 신속 방출로부터 화합물을 보호할 담체와 함께 제조될 수 있다. 생분해성, 생체 적합성 중합체, 예를 들어 에틸렌 비닐 아세테이트, 폴리무수물, 폴리글리콜산, 콜라겐, 폴리오르토에스테르, 및 폴리락트산을 사용할 수 있다. 이같은 제제의 제조를 위한 다수의 방법이 특허를 받았거나 또는 당업자에게 일반적으로 공지되어 있다. 예를 들어, 문헌 [Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems, J.R. Robinson, ed., Marcel Dekker, Inc., New York, 1978]을 참조한다.
치료 조성물은 당업계에 공지된 의료 기구를 이용하여 투여할 수 있다. 예를 들어, 한 실시양태에서, 본 발명의 치료 조성물은 무침 피하 주사 장치, 예를 들어 미국 특허 번호 5,399,163; 5,383,851; 5,312,335; 5,064,413; 4,941,880; 4,790,824 또는 4,596,556에 제시된 장치를 사용하여 투여할 수 있다. 본 발명에 유용한 널리 공지되어 있는 임플란트 및 모듈의 예는 제어된 속도로 약물을 분배하기 위한 이식가능한 미세-주입 펌프를 제시하는 미국 특허 번호 4,487,603; 피부를 통해 약물을 투여하기 위한 치료 장치를 제시하는 미국 특허 번호 4,486,194; 정확한 주입 속도로 약물을 전달하기 위한 약물 주입 펌프를 제시하는 미국 특허 번호 4,447,233; 연속적 약물 전달을 위한 가변 유동 이식가능 주입 장치를 제시하는 미국 특허 번호 4,447,224; 다챔버 구획을 갖는 삼투 약물 전달 시스템을 제시하는 미국 특허 번호 4,439,196; 및 삼투 약물 전달 시스템을 제시하는 미국 특허 번호 4,475,196을 포함한다. 다른 많은 그러한 임플란트, 전달 시스템 및 모듈이 당업자에게 공지되어 있다.
특정 실시양태에서, 본 발명의 인간 모노클로날 항체는 생체 내에서 적합한 분포를 보장하기 위해 제제화될 수 있다. 예를 들어, 혈액-뇌 장벽 (BBB)이 고도로 친수성인 많은 화합물을 배제시키고 있다. 본 발명의 치료 화합물이 (원하는 경우) BBB를 가로지르도록 보장하기 위해, 이들을 예를 들어, 리포솜 내에 제제화할 수 있다. 리포좀의 제조 방법에 대해서는, 예를 들어 미국 특허 4,522,811; 5,374,548; 및 5,399,331을 참조한다. 리포솜은 특이적 세포 또는 기관 내로 선택적으로 수송되므로, 표적화 약물 전달을 증강시켜 주는 하나 이상의 모이어티를 포함할 수 있다 (예를 들어, 문헌 [V.V. Ranade, 1989 J. Cline Pharmacol. 29:685] 참조). 예시적인 표적화 모이어티는 폴레이트 또는 비오틴 (예를 들어 미국 특허 5,416,016 (Low et al.) 참조); 만노시드 (문헌 [Umezawa et al., 1988 Biochem. Biophys. Res. Commun. 153:1038]); 항체 (문헌 [P.G. Bloeman et al., 1995 FEBS Lett. 357:140]; [M. Owais et al., 1995 Antimicrob. Agents Chernother. 39:180]); 계면활성제 단백질 A 수용체 (문헌 [Briscoe et al., 1995 Am. J. Physiol. 1233:134]); p120 (문헌 [Schreier et al., 1994 J. Biol. Chem. 269:9090])을 포함한다 (또한, 문헌 [K. Keinanen; M.L. Laukkanen, 1994 FEBS Lett. 346:123]; [J.J. Killion; I.J. Fidler, 1994 Immunomethods 4:273] 참조).
본 발명의 용도 및 방법
본 발명의 항체는 시험관내 및 생체내 진단 및 치료 효용성을 갖는다. 예를 들어, 이들 분자는 배양 중인 세포, 예를 들어 시험관내 또는 생체내 세포에게 투여하거나, 또는 생체내 대상체에게 투여하여 각종 장애를 치료, 예방 또는 진단할 수 있다. 용어 "대상체"는 본원에서 사용할 때 인간 또는 비인간 동물을 포함하도록 의도된다. 비인간 동물에는 모든 척추동물, 예를 들어, 포유동물과 비-포유동물, 예를 들어, 비인간 영장류, 양, 개, 고양이, 소, 말, 닭, 양서류와 파충류가 포함된다.
방법은 BAFFR-관련 장애 및/또는 자가면역 질환, 예를 들어 전신 홍반성 루푸스 또는 류마티스양 관절염의 치료, 예방 또는 진단에 특히 적합하다.
본 발명은 또한 치료 유효량의 본 발명의 항체를 포함하는 조성물을 투여하여 동물에서 B 세포를 감소시키는 방법, 바람직하게는 인간 B 세포를 감소시키거나 사멸시키는 방법을 제공한다.
본원에 사용된 "BAFFR-관련 장애"에는 비정상적 BLyS 수준과 연관된 질병 또는 이를 특징으로 하는 질병, 및/또는 B 세포의 감소 또는 사멸에 의해 치료될 수 있는 질환 또는 질병이 포함된다. 여기에는 염증 질병, 알레르기 및 알레르기성 질병, 과민 반응, 자가면역 질환, 중증 감염, 및 장기 또는 조직 이식 거부반응이 포함된다. 또한, 여기에는 B-세포 신생물이 포함된다.
예를 들어, 본 발명의 항체는 동종이식 거부반응 또는 이종이식 거부반응을 포함하여 심장, 폐, 조합 심장-폐, 간, 신장, 췌장, 피부 또는 각막 이식의 수용자의 치료를 위해, 그리고 골수 이식, 및 이식편-대-숙주 질환, 예컨대 장기 이식 연관 동맥경화증 이후의 이식편-대-숙주 질환의 예방을 위해 사용될 수 있다.
본 발명의 항체는, 자가면역 질환 및 염증성 질환, 특히 자가면역 성분, 예컨대 관절염 (예를 들어 류마티스양 관절염, 만성 진행성 관절염 (arthritis chronica progrediente) 및 변형 관절염) 및 류마티스 질환, 예컨대 골 손실, 염증성 통증과 관련된 염증성 질병 및 류마티스 질환, 척추관절증, 예컨대 강직성 척추염, 라이터 증후군, 반응성 관절염, 건선성 관절염 및 장병성 관절염, 과민증 (기도 과민증 및 피부 과민증 포함) 및 알레르기를 비롯한 병인을 갖는 염증성 질환의 치료, 예방 또는 개선에 유용하다. 본 발명의 항체를 사용할 수 있는 특정 자가면역 질환에는 자가면역성 혈액 장애 (예를 들어 용혈성 빈혈, 재생불량성 빈혈, 순적혈구 빈혈 및 특발성 혈소판감소증 포함), 후천성 A형 혈우병, 한랭 응집소 질환, 한냉글로불린혈증, 혈전성 혈소판감소성 자반증, 쇼그렌 증후군, 전신 홍반성 루푸스, 염증성 근육 장애, 다발성연골염, 피부 경화증, 항-호중구 세포질 항체-연관 혈관염, IgM 매개 신경병증, 안간대근경련 (opsoclonus myoclonus) 증후군, 베게너 육아종증, 피부근염, 만성 활성 간염, 중증 근무력증, 건선, 스티븐 존슨 증후군, 심상성 천포창, 낙엽상 천포창, 특발성 스프루, 자가면역성 염증성 장 질환 (예를 들어, 궤양성 대장염, 크론병 및 과민성 장 증후군 포함), 내분비 안병증, 그레이브병, 사르코이드증, 다발성 경화증, 시신경 척수염, 원발성 담즙성 간경변증, 소아 당뇨병 (진성 당뇨병 유형 I), 포도막염 (전방, 중간 및 후방, 뿐만 아니라 전체포도막염), 건조 각결막염 및 봄철 각결막염, 간질성 폐 섬유증, 건선성 관절염 및 사구체신염 (예를 들어 특발성 신증후군 또는 미소 변화 신병증을 비롯한 신증후군을 갖는 것 및 갖지 않는 것), 종양, 피부 및 각막의 염증성 질환, 근염, 골 이식물의 이완, 대사성 장애, 예컨대 아테롬성 동맥경화증, 당뇨병 및 이상지질혈증이 포함된다.
본 발명의 항체는 또한 천식, 기관지염, 진폐증, 폐 기종, 및 기도의 다른 폐쇄성 또는 염증성 질환의 치료, 예방 또는 완화에 유용하다.
본 발명의 항체는 또한 골 대사 질환, 예를 들어 골관절염, 골다공증 및 다른 염증성 관절염, 및 골 손실, 일반적으로 예를 들어 노화-관련 골 손실, 및 특히 치주 질환의 치료에 유용하다.
인간 말초 혈액 림프구 및 인간 B-세포주에 대한 BAFFR 결합이 BAFFR 폴리펩티드에 의해 매개되기 때문에, 본 발명의 항체는 또한 B-세포 신생물의 진단 또는 치료에 유용할 수 있다. 이러한 질환 및 질병의 예에는 B-세포 비-호지킨 림프종, 예컨대 소림프구성 림프종, 림프형질세포성 림프종, 외투 세포 림프종, 여포성 림프종, 점막-관련 림프양 조직 림프종, 미만성 대세포 림프종 및 버킷 림프종; 전구체 B-림프모구성 백혈병; 및 B-세포 만성 림프구성 백혈병 및 다발성 골수종이 포함되나, 이들로 한정되지는 않는다. 기타 B-세포 신생물이 본 발명의 범주 내에 포함된다.
본 발명의 항체는 단독 활성 성분으로서, 또는 다른 약물 (예를 들어, 보조제로서 또는 조합물로), 예를 들어 면역억제제, 면역 조절제, 또는 다른 소염제, 다른 세포독성제 또는 항암제 (예를 들어, 상기 언급한 질환의 치료 또는 예방용)와 함께 투여될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 항체는 DMARD, 예를 들면 골드(Gold) 염, 술파살라진, 항말라리아제, 메토트렉세이트, D-페니실라민, 아자티오프린, 마이코페놀산, 시클로스포린 A, 타크롤리무스, 시롤리무스, 미노사이클린, 레플루노미드, 글루코코르티코이드; 칼시뉴린 억제제, 예를 들어 시클로스포린 A 또는 FK 506; 림프구 재순환 조절제, 예를 들어 FTY720 및 FTY720 유사체; mTOR 억제제, 예를 들어 라파마이신, 40-O-(2-히드록시에틸)-라파마이신, CCI779, ABT578, AP23573 또는 TAFA-93; 면역 억제 특성을 갖는 아스코마이신, 예를 들어 ABT-281, ASM981 등; 코르티코스테로이드; 시클로-포스파미드; 아자티오프렌; 메토트렉세이트; 미조리빈; 마이코페놀산; 마이코페놀레이트 모페틸; 15-데옥시스페르구알린, 또는 그의 면역억제 동족체, 유사체 또는 유도체; 면역억제 모노클로날 항체, 예를 들어 백혈구 수용체, 예컨대 MHC, CD2, CD3, CD4, CD7, CD8, CD11a, CD25, CD28, CD40, CD45, CD52, CD58, CD80, CD86 또는 이들의 리간드에 대한 모노클로날 항체; 다른 면역 조절 화합물, 예를 들어 CTLA4 또는 그의 돌연변이체의 세포외 도메인의 적어도 일부를 갖는 재조합 결합 분자, 예를 들어 비-CTLA4 단백질 서열에 결합된 CTLA4 또는 그 돌연변이체의 적어도 세포외 일부를 가지는 재조합 결합 분자, 예를 들어 CTLA4Ig (예컨대, ATCC 68629로 지정) 또는 그의 돌연변이체, 예를 들어 LEA29Y; 부착 분자 억제제, 예를 들어 LFA-1 길항제, ICAM-1 또는 -3 길항제, VCAM-4 길항제 또는 VLA-4 길항제; 또는 화학요법제, 예를 들어 파클리탁셀, 겜시타빈, 시스플라티눔, 독소루비신 또는 5-플루오로우라실; 항 TNF 작용제, 예를 들어 TNF에 대한 모노클로날 항체, 예컨대 인플릭시마브, 아달리무마브, CDP870, 또는 TNF-RI 또는 TNF-RII에 대한 수용체 구축물, 예를 들어 에타네르셉트, PEG-TNF-RI; 전-염증성 사이토킨의 차단제, IL-1 차단제, 예를 들어 아나킨라 또는 IL-1 트랩, AAL160, ACZ 885, IL-6 차단제; 케모카인 차단제, 예컨대 프로테아제의 억제제 또는 활성화제, 예를 들어 메탈로프로테아제, 항-IL4 항체, 항-IL-15 항체, 항-IL-6 항체, 항-IL-21 항체, 항-IL-12 항체, 항p40 항체, 항-IL-17 항체, 항CD20 항체, NSAID, 예컨대 아스피린 또는 항감염제 (언급된 약제에 한정되지 않은 목록)와 조합하여 사용될 수 있다.
상기 내용에 따라, 본 발명은 하기 추가의 측면을 제공한다.
치료 유효량의 BAFFR 길항제, 예를 들어 본 발명의 항체, 및 하나 이상의 제2 약물 물질을 예를 들어 동시에 또는 순차적으로 공동 투여하는 것을 포함하고, 상기 제2 약물 물질이 예를 들어 상기 나타낸 것과 같은 면역-억제/면역조절, 소염 화학요법 또는 항-감염 약물인 상기 정의된 방법.
또는, 치료 유효량의 a) BAFFR 길항제, 예를 들어 본 발명의 항체 및 b) 예를 들어 상기 나타낸 것과 같은 면역 억제/면역 조절, 항-염증 화학요법 또는 항-감염 약물로부터 선택되는 하나 이상의 제2 물질을 포함하는 치료적 조합, 예를 들어 키트 (키트는 그의 투여를 위한 지시서를 포함할 수 있음).
본 발명의 항체가 다른 면역억제제/면역조절제, 항-염증 화학요법제 또는 항-감염 요법제와 함께 투여되는 경우에, 공동 투여된 조합 화합물의 투여량은 물론 사용되어지는 공동 약물의 유형, 예를 들어 그것이 DMARD, 항-TNF, IL-1 차단제 또는 다른 것인지의 여부, 사용되는 특정한 약물, 치료되어지는 질병 등에 .따라 달라질 것이다.
한 특정 실시양태에서, 본 발명의 항체는 또다른 B-세포 사멸 작용제, 즉 예를 들어 ADCC 활성을 갖는 CD20 표적화 항체, 예컨대 리툭시마브와 함께 투여될 수 있다.
다른 실시양태에서, 본 발명의 항체는 SLE 또는 RA를 앓는 환자 중에서 선택되며 BLyS의 비정상적 혈청 수준을 나타내는 환자 집단에게만 투여된다. 다른 실시양태에서, 본 발명의 항체는 항-BLyS 치료에 반응하는 환자의 군에서 선택되는 환자 집단에게만 투여된다. 항-BLyS 치료에 대해 반응할 가능성이 증가된 환자를 식별하는 바이오마커는 하기 중 임의의 것일 수 있으나, 여기에 한정되지는 않는다: 혈청 BLyS의 상승된 수준, 특정 B 세포 하위세트의 상승된 수준, 특정 유형의 자가-항체의 존재 또는 부재.
한 실시양태에서, 본 발명의 항체는 BAFFR의 수준, 또는 BAFFR을 함유하는 세포의 수준을 검출하는데 사용될 수 있다. 이는, 예를 들어 샘플 (예를 들어 시험관내 샘플) 및 대조군 샘플을 항체와 BAFFR 사이에 복합체의 형성을 허용하는 조건 하에 항-BAFFR 항체와 접촉시킴으로써 달성할 수 있다. 항체와 BAFFR 사이에 형성된 임의의 복합체는 샘플 및 대조군에서 검출되고 비교된다. 예를 들어, 당업계에 공지된 표준 검출 방법, 예를 들어 ELISA 및 유동 세포측정 분석이 본 발명의 조성물을 사용하여 수행될 수 있다.
따라서, 한 측면에서, 본 발명은 샘플 및 대조군 샘플을 BAFFR에 특이적으로 결합하는 본 발명의 항체 또는 그의 항원 결합 영역과, 항체 또는 그의 일부와 BAFFR 사이에 복합체의 형성을 허용하는 조건 하에 접촉시키는 것을 포함하는, 샘플 내에서 BAFFR (예를 들어, 인간 BAFFR 항원)의 존재를 검출하거나 BAFFR의 양을 측정하는 방법을 또한 제공한다. 이어서, 복합체의 형성을 검출하며, 여기서 대조군 샘플에 비한 샘플 사이의 복합체 형성의 차이가 샘플 내의 BAFFR의 존재를 나타낸다.
본 발명의 조성물 (예를 들어, 항체, 인간 항체 및 이중특이적 분자) 및 사용을 위한 설명서로 이루어지는 키트가 또한 본 발명의 범위에 포함된다. 키트는 한 가지 이상의 부가 시약, 또는 본 발명의 한 가지 이상의 부가 항체 (예를 들어, 제1 항체와 별개로 표적 항원 상의 에피토프에 결합하는 보충 활성을 지닌 항체)를 추가로 함유할 수 있다. 키트는 일반적으로 키트의 내용물의 의도된 용도를 나타내는 라벨을 포함한다. 용어 라벨은 키트 상에 또는 키트와 함께 공급되거나 달리 키트에 부속되는 임의의 기입 또는 기록물을 포함한다. 키트는 또한 환자가 상기 정의된 바와 같은 항-BAFFR 항체 치료에 반응하는 군에 속하는지 여부를 진단하기 위한 툴을 포함할 수 있다.
본 발명이 상세히 기재되긴 하였지만, 다음 실시예 및 청구의 범위에 의해 추가로 예시되는데, 이는 예시적이며 추가로 제한하는 의미가 아니다.
<도면의 간단한 설명>
도 1은 DBA/1 마우스 (MCOL37) 에서의 제0일에서의 면역화, 제21일에서의 부스터 및 -9일에서의 치료 개시 후의 콜라겐-유발성 관절염 (CIA)의 결과를 나타낸다. 사각형 기호는 200 ㎍/200 ㎕ (복강내, 주2회) (n=8)의 투여량에서의 항-BAFF Ab- MOR6743-mlgG2a에 대한 발 스코어링을 나타낸다. 삼각형 기호는 200 ㎍/200 ㎕ (복강내, 주2회) (n=7)의 투여량에서의 이소형 항 CSA-IgG2a 대조군에 대한 발 스코어링을 나타낸다. 통계: 던넷(Dunnett) 다중 비교 시험 (일원분산분석). 비히클 대조군과 비교 (p<0.05*,p<0.01**,p>0.05n.s.).
도 2는 3마리의 사이노몰구스(cynomolgous) 원숭이에서의 항-BAFFR (MOR06654) 항체의 20 mg/kg 정맥내 투여 후 CD20+ 및 CD40+ 말초 혈액 세포의 절대수를 나타낸다.
도 3a는 3마리의 사이노몰구스에서의 항-BAFFR (MOR06654) 항체의 20 ㎍/kg 정맥내 투여 후 CD20+ 및 CD40+ 말초 혈액 세포의 절대수를 나타낸다.
도 3b는 3마리의 사이노몰구스에서의 비-푸코실화 항-BAFFR (MOR06654) 항체의 20 ㎍/kg 정맥내 투여 후 CD20+ 및 CD40+ 말초 혈액 세포의 절대수를 나타낸다.
실험 부분
1. 스크리닝 분석
초기 패닝의 FACS 스크리닝
1차 주요 스크리닝, 예를 들어 파지 디스플레이 스크리닝으로부터의 BAFFR 결합 Fab 항체의 검출 및/또는 ELISA 양성 클론의 2차 스크리닝 과정에 대해 선택된 이. 콜라이(E. coli) 클론의 용해물을 하기와 같이 FACS로 스크리닝할 수 있었다.
각각의 세포주의 세포 (모 세포 또는 BAFFR로 형질감염된 세포)를 계수하고, PBS/3％ FCS/0.02％ NaN3 (FACS 완충액) 중 2x107 개 세포/ml로 조정하였다. 96-웰 둥근 바닥 플레이트에서, 2x105 개 세포를 최종 부피 100 ㎕의 FACS 완충액 중 Fab-함유 1박테리아 용해물 35 ㎕와 혼합하고, 진탕기 상에서 4℃에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 이어서, 세포를 FACS 완충액으로 1회 세척하고, FACS 완충액 중에 1:200으로 희석된 피코에리트린-접합된 염소 항-인간 IgG 2차 항체 중에 재현탁시켰다. 진탕기 상에서 4℃에서 1시간 동안 인큐베이션한 후, 세포를 다시 FACS 완충액으로 1회 세척하고, FACS 완충액 중에 재현탁시키고, 예를 들어 FACS어레이(FACSArray) 기기 (벡톤 딕킨슨(Becton Dickinson))에서의 세포의 형광 강도를 통해 세포 표면 결합을 측정하였다.
Fc 포획 ELISA
파지 디스플레이로부터의 풍부화 클론 중 BAFFR 결합 Fab 항체를 동정하기 위해, 선택된 이. 콜라이 클론의 용해물을 하기 설정의 Fc 포획 ELISA로 스크리닝하였다: 맥시소르프(Maxisorp) 384-웰 플레이트를 4℃에서 밤새 PBS 중에 희석한 20 ㎍/ml 염소 항-인간 IgG Fc로 코팅하였다. 다음날, 플레이트를 세척하고, 5％ MTBST로 차단하고, 실온에서 1시간 동안 5 ㎍/ml BAFFR:Fc (알렉시스(Alexis))와 함께 인큐베이션하였다. 동시에, 박테리아 용해물을 함유하는 Fab를 최종 농도 2.5％의 분유로 차단하였다. 이어서, 예비-차단된 박테리아 용해물을 플레이트 상에서 포획된 BAFFR:Fc에 첨가하였다. 후속으로, BAFFR:Fc 결합 Fab를 0.5％ MPBST 중에 1:5000으로 희석된 알칼리 포스파타제 접합된 염소 항-인간 IgG (Fab 특이적)와 함께 인큐베이션한 후 아토포스(AttoPhos) 형광 기질 (로슈 디아그노스틱스(Roche Diagnostics))을 첨가하여 검출하였다. 535 nm에서의 형광 방출을 테칸 스펙트라플루오르(TECAN Spectrafluor) 플레이트 판독기에서 430 nm에서의 여기와 함께 기록하였다.
Fab 포획 ELISA
파지 디스플레이로부터의 BAFFR 결합 Fab 항체를 검출하기 위해, 선택된 이. 콜라이 클론의 용해물을 하기 설정의 Fab 포획 ELISA로 스크리닝하였다: 맥시소르프 384-웰 플레이트를 4℃에서 밤새 PBS 중에 1:1000으로 희석된 양 항-인간 IgG, Fd 단편 특이적 항체로 코팅하였다. 다음날, 플레이트를 세척하고, 실온에서 1시간 동안 TBS/0.05％ 트윈(Tween)/5％ 분류 (5％ MTBST)로 차단하였다. 동시에, Fab 함유 박테리아 용해물을 최종 농도 2.5％의 분유로 차단하였다. 이어서, 예비-차단된 박테리아 용해물을 플레이트 상에 고정된 포획 항체에 첨가하였다. 후속으로, 포획된 HuCAL(등록상표)-Fab 단편을 1 ㎍/ml 비오티닐화된 BAFFR:Fc (PBST 중에 희석됨)에 결합시키고, 이를 2.5％ MPBST 중에 1:3000으로 희석된 알칼리 포스파타제 (자이맥스(Zymax))에 접합된 스트렙타비딘(Streptavidin)과 함께 인큐베이션 한 후, 아토포스 형광 기질 (로슈 디아그노스틱스)을 첨가하여 최종적으로 검출하였다. 535 nm에서의 형광 방출을 테칸 스펙트라플루오르 플레이트 판독기에서 430 nm에서의 여기와 함께 기록하였다.
BAFFR - BLyS 결합 ELISA
억제 항체를 직접 동정하기 위해, FLAG-태그가 부착된 Fab를 BAFFR - BLyS 결합 ELISA로 스크리닝하였다: 맥시소르프 96-웰 플레이트를 4℃에서 밤새 PBS 중 1 ㎍/ml hsBLyS로 코팅하였다. 다음날, 플레이트를 세척하고, 실온에서 1시간 이상 동안 PBS/2％ BSA로 차단하였다. 동시에, 박테리아 용해물을 함유하는 Fab를 최종 농도 2.5％의 BSA로 차단하였다. 예비-차단된 박테리아 용해물을 30분 동안 5 ㎍/ml 모노클로날 항-FLAG M2 항체와 함께 인큐베이션하여, 교차-결합에 의한 억제 활성을 증가시키고, 이어서 약간 진탕하면서 10 ng/ml 비오티닐화된 BAFFR:Fc (PBS/2％ BSA 중에 희석됨)를 추가로 30분 동안 실온에서 첨가하였다. 예비-인큐베이션한 용해물/비오-BAFFR:Fc 혼합물을 플레이트-결합 hsBLyS에 첨가하였다. 실온에서 30분 및 세척 후, BLyS 결합 비오-BAFFR:Fc를 PBS/2.5％ BSA 중에 1:3000으로 희석된 알칼리 포스파타제 (자이맥스)에 접합된 스트렙타비딘과 함께 인큐베이션한 후, 아토포스 형광 기질 (로슈 디아그노스틱스)을 첨가하여 검출하였다. 535 nm에서의 형광 방출을 테칸 스펙트라플루오르 플레이트 판독기에서 430 nm에서의 여기와 함께 기록하였다.
박테리아 용해물 대신에 정제 Fab를 사용한 경우, 항FLAG 교차 결합 단계를 생략하였다.
성숙 후 FACS 스크리닝
제2 성숙:
성숙으로부터의 결합제의 스크리닝을 위해, FACS 분석을 기재된 바와 같이 수행하였다 (하기 변경을 가짐): 최대 신호가 포화 미만이 될 때까지 선택된 이. 콜라이 클론의 용해물을 희석하였다. Raji 세포에 대한 결합에 대해 용해물을 분석하였다. 96-웰 당 5x104 개 세포를 다양하게 희석된 박테리아 용해물 100 ㎕와 혼합하였다. 세포-결합 Fab의 검출을 기재된 바와 같이 수행하였다. 클론을 그의 신호 강도에 따라 분류할 수 있었다.
2. 스크리닝 분석으로부터 동정된 항체의 친화도 측정
바이오베리스(BioVeris)를 이용하여 KD를 측정하기 위한 용액 평형 적정 (SET) 방법
기본적으로, 용액 중 친화도 측정을 문헌 [Friquet et al. (1985) J. Immunol. Meth. 77, 305-319] 및 [Haenel et al. (2005) Anal. Biochem. 339, 182-184])에 기재된 바와 같이 수행할 수 있었다. SET 방법의 민감도 및 정확도를 개선하기 위해, 방법을 통상적 ELISA로부터 ECL 기반 바이오베리스 기술로 이동시켰다. 1 mg/ml 염소-항-인간 (Fab)2 또는 염소-항-마우스 IgG, Fc 단편 특이적 항체 (디아노바(Dianova))를 제조업체의 지시서에 따라 BV-태그 (상표명) NHS-에스테르 (바이오베리스 유럽(Bioveris Europe), 영국 옥스포드셔 위트니)로 표지하였다. 실험을 폴리프로필렌 마이크로타이터 플레이트 및 분석 완충액으로서의 0.5％ BSA 및 0.02％ 트윈 20으로 보충된 PBS (pH 7.4)로 수행하였다. 비표지된 BAFFR:Fc를 2n 연속으로 희석하였다. 항원이 없는 웰을 사용하여 Smax 값을 결정하였다. 100 pM Fab (75 ㎕ 최종 부피 중 최종 농도)를 첨가한 후, 혼합물을 실온에서 2시간 동안 인큐베이션하였다. 후속으로, 항-인간 Fab에 대한 1:4000 또는 항-마우스 IgG에 대한 1:2000의 최종 희석액 중, 0.25 ㎍/ml 비오티닐화된 BAFFR:Fc 항원으로 코팅된 25 ㎕ 다이나비드(Dynabead) (0.4 mg/ml M-280 스트렙타비딘, 다이날(DYNAL), 함부르크) 및 BV-태그 표지된 검출 항체의 혼합물을 웰 당 첨가하였다. 에펜도르프(Eppendorf) 진탕기 (700 rpm) 상에서 실온에서 30분 동안 인큐베이션 한 후, 전기화학발광 신호를 M-384 시리즈(SERIES, 등록상표) 워크스테이션(Workstation) (바이오베리스 유럽)를 이용하여 검출하였다.
직접 코팅된 항원 상에서의 비아코어(Biacore) KD 측정
비아코어 3000 기기 (비아코어, 스웨덴 웁살라)를 이용하여 Fc-포획 BAFFR:Fc, 또는 공유 결합으로 고정된 BAFFR:Fc (알렉시스) 또는 BAFFR (페프로테크)에 결합하는 각각의 Fab의 연속 희석액을 사용하여 역학 상수 kon 및 koff를 측정하였다. 항원 또는 항-Fc 포획 항체의 공유결합 고정화를 위해, 표준 EDC-NHS 아민 커플링 화학을 이용하였다. 역학 측정은 PBS (136 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4, 1.76 mM KH2PO4 (pH 7.4)) 내에서 20 ㎕/분의 유속으로 1.5 내지 500 nM 범위의 Fab 농도 범위를 이용하여 수행하였다. 각각의 농도에 대한 주사 시간은 1분이었다 (이어서 3분 또는 15분의은 해리기). 재생을 위해, 글리신/HCl (pH 1.5)을 2회 주사하였다. 모든 센소그램은 BIA 평가 소프트웨어 3.1 (비아코어)를 사용하여 적합화시켰다.
10％ 인간 혈청의 존재하에 친화도를 측정하기 위해, 해동 후 단백질 응집물을 감소시키기 위해 사용 전에 멸균 여과된 (포어 크기 1.2 및 0.2 ㎛) 10％ 인간 혈청을 함유하는 PBS 중에서 역학 측정을 수행하였다.
BAFFR - BLyS 결합 분석 (경쟁 FACS)에서의 IC50 값의 측정
BAFFR - BLyS 결합 분석을 내인성 BAFFR를 발현하는 Raji 세포를 사용하여 수행하였다. BAFFR 특이적 Fab를 40 내지 0.001 nM 범위의 최종 희석액으로 사용하였다. 희석된 Fab를 진탕기 상에서 4℃에서 1시간 동안 96-웰 플레이트에서 웰 당 5x104 개의 Raji 세포로 인큐베이션하였다. 이어서, 비오티닐화된 hsBLyS를 최종 농도 25 ng/ml로 첨가하고, 세포를 진탕기 상에서 4℃에서 30분 동안 인큐베이션하였다. 세포를 FACS 완충액으로 2회 세척한 후, FACS 완충액 중에 1:200으로 희석된 피코에리트린-접합된 스트렙타비딘 (디아노바) 중에 재현탁시켰다. 진탕기 상에서 4℃에서 1시간 동안 염색을 수행하였다. 최종적으로 세포를 FACS 완충액으로 2회 세척하고, FACS 완충액 중에 재현탁시키고, 세포 표면 BAFFR에 결합된 BLyS를 FACS어레이 기기 (벡톤 딕킨슨)에서의 형광 세포측정을 통해 측정하였다.
BAFFR:Fc - BLyS 결합 분석 (경쟁 ELISA)에서의 IC50 값의 측정
96-웰 맥시소르프 플레이트를 4℃에서 밤새 인간 가용성 BLyS로 코팅하였다. 코팅 후, 웰을 PBS/0.05％ 트윈20 (PBST)으로 4회 세척한 후, 37℃에서 1시간 동안 1％ 소 혈청 알부민을 함유하는 PBST로 차단하고, 이어서 PBST를 사용하여 4단계 세척하였다. 비오티닐화된 인간 BAFFR:Fc 융합 단백질 (악소라(Axxora))을 20 ng/ml로 첨가하고, 항-BAFFR 항체의 상승 농도로 37℃에서 1시간 동안 포획하였다. 추가의 세척 라운드 후, 엑스트라비딘(ExtrAvidin)-알칼리 포스파타제 (시그마(Sigma))를 웰에 첨가하고, 37℃에서 30분 동안 인큐베이션하였다. 결합 포스파타제를 디에탄올아민 (시그마) 중 p-니트로페닐 포스페이트를 함유하는 용액을 첨가함으로써 검출하였다. 약 20분 후, 동일 부피의 2 N 수산화나트륨을 사용하여 발색 반응을 중지시키고, 405 nm에서 플레이트 판독기 (스펙트라맥스(SpectraMax) 190, 몰레큘라 디바이시즈(Molecular Devices)) 상에서 흡광도를 측정하였다.
BAFFR 펩티드 (미니BR3) - BLyS 결합 분석 (경쟁 ELISA)에서의 IC50 값의 측정
96-웰 맥시소르프 플레이트를 4℃에서 밤새 인간 가용성 BLyS로 코팅하였다. 코팅 후, 웰을 PBS/0.05％ 트윈20 (PBST)으로 4회 세척한 후, 37℃에서 1시간 동안 1％ 소 혈청 알부민을 함유하는 PBST로 차단하고, 이어서 PBST를 사용하여 4단계 세척하였다. 비오티닐화된 BAFFR 유도된 펩티드 (미니BR3, 피켐(PiCHEM), 오스트리아)를 20 ng/ml로 첨가하고, 항-BAFFR 항체의 상승 농도로 37℃에서 1시간 동안 포획하였다. 추가의 세척 라운드 후, 엑스트라비딘-알칼리 포스파타제 (시그마)를 웰에 첨가하고, 37℃에서 30분 동안 인큐베이션하였다. 결합 포스파타제를 디에탄올아민 (시그마) 중 p-니트로페닐 포스페이트를 함유하는 용액을 첨가함으로써 검출하였다. 약 20분 후, 동일 부피의 2 N 수산화나트륨을 사용하여 발색 반응을 중지시키고, 405 nm에서 플레이트 판독기 (스펙트라맥스 190, 몰레큘라 디바이시즈) 상에서 흡광도를 측정하였다.
사이노몰구스 BAFFR에 대한 교차-반응의 분석
사이노몰구스 BAFFR에 대한 Fab의 교차-반응을 사이노 BAFFR 형질감염된 HEK293T 세포 상에서 FACS 적정 분석으로 시험하였다. 최종 후보 Fab를 177 nM 내지 0.001 nM 범위의 희석에 사용하였다. 희석된 Fab를 진탕기 상에서 4℃에서 1시간 동안 웰 당 5x104 개의 세포로 96-웰 플레이트에서 인큐베이션하였다. 이어서, 세포를 FACS 완충액으로 2회 세척하고, FACS 완충액 중에 1:200으로 희석된 피코에리트린-접합된 염소 항-인간 IgG (디아노바) 중에 재현탁시켰다. 진탕기 상에서 4℃에서 1시간 동안 염색을 수행하였다. 최종적으로 세포를 FACS 완충액으로 2회 세척하고, Fab 결합을 FACS어레이 기기 (벡톤 딕킨슨)에서의 형광 세포측정을 통해 측정하였다.
BCMA 및 TACI에 대한 교차-반응의 분석
FACS
BCMA에 대한 Fab의 교차-반응을 BCMA 형질감염된 HEK293T 세포 상에서 FACS 적정 분석으로 시험하였다: Fab를 높게는 nM 또는 심지어 μM에서 pM 까지의 최종 농도로 사용하였다. 세포의 염색 및 Fab 결합의 검출을 기재한 바와 같이 수행하였다.
ELISA
384-웰 맥시소르프 플레이트를 염소 항-인간 IgG, Fc γ 단편 특이적 포획 항체로 4℃에서 밤새 코팅하였다. 코팅 후, 웰을 PBS/0.05％ 트윈20 (PBST)으로 2회 세척하고, 이어서 실온에서 1시간 동안 5％ 분유를 함유하는 PBST로 차단한 후, PBST를 사용하여 2단계 세척하였다. 재조합 BCMA 및 TACI Fc-융합 단백질을 첨가하고, 실온에서 1시간 동안 포획하였다. 이어서, 정제 및 희석된 BAFFR 특이적 Fab를 첨가하고, 플레이트를 실온에서 1시간 동안 인큐베션하였다. Fab를 검출하기 위해, 알칼리 포스파타제 (AP)-접합된 염소 항-인간 IgG (Fab 특이적)를 첨가하고, 플레이트를 실온에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 각각의 인큐베이션 단계 후, 웰을 PBST로 5회 세척하였다. AP-접합체의 검출을 위해, 아토포스 (로슈)를 제조사의 지시서에 따라 사용하였다. 테칸 스펙트라플루오르 플레이트 판독기를 이용하여 형광을 측정하였다.
3. 세포-기반 기능적 분석
인간 B-세포 증식의 BLyS 유도된 공동-자극
MACS B-세포 단리 키트 II (밀테니 바이오텍(Miltenyi Biotec))를 이용하여 다른 세포 유형을 고갈시킴으로써 비손상(Untouched) B-림프구를 말초 혈액 단핵 세포로부터 정제하였다. B-세포 증식을 유도하기 위해, 100 ㎕ (1 x105 개의 세포 함유)를 둥근-바닥 96-웰 플레이트에 5벌로 시딩하였다. 인간 가용성 BLyS를 항-인간 IgM 항체와 커플링된 0.35％ (vol/vol) 비드와 함께 3 ng/ml의 농도로 첨가하였다. 그의 억제 효능을 측정하기 위해, 다양한 농도의 항-BAFFR 항체를 다양한 농도에서 첨가하였다. 항-BAFFR 항체의 효능작용 특성의 측정을 위해, 항-인간 IgM 항체에 커플링된 0.35％ (vol/vol) 비드 및 상승 농도의 항-BAFFR 항체 (BLyS가 추가로 첨가되지 않음)로 세포를 유도하였다. 이어서, 세포를 3일 동안 배양하였다. 말미의 12시간 동안 1 μCi/웰의 삼중 티미딘을 첨가하였다. 세포를 필터 상에서 수확하고, 방사능 연관 세포를 섬광 계수기로 정량화하였다.
인간 B-세포 IgG1 생성의 BLyS 유도된 공동-자극
MACS B-세포 단리 키트 II (밀테니 바이오텍)를 이용하여 다른 세포 유형을 고갈시킴으로써 비손상 B-림프구를 말초 혈액 단핵 세포로부터 정제하였다. IgG1 합성을 유도하기 위해, 100 ㎕ (1 x105 개의 세포 함유)를 둥근-바닥 96-웰 플레이트에 5벌로 시딩하고, 3 ng/ml 인간 가용성 BLyS (100 ng/mL 인간 IL-21 (페프로 테크 인코포레이티드(Pepro Tech Inc.))과 함께)로 자극하였다. 그의 억제 효능을 측정하기 위해, 항-BAFFR 항체를 다양한 농도에서 첨가하였다. 항-BAFFR 항체의 효능작용 특성의 측정을 위해, 100 ng/mL 인간 IL-21 및 상승 농도의 항-BAFFR 항체 (BLyS가 추가로 첨가되지 않음)로 세포를 유도하였다. 세포를 9일 동안 배양하고, 상층액을 수집하였다. 효소 연결 면역-흡착제 분석 (ELISA)에 의해 세포 상층액에서 IgG1을 측정하였다.
항체 의존성 세포 독성 분석 (ADCC)
MACS B-세포 단리 키트 II (밀테니 바이오텍)를 이용하여 다른 세포 유형을 고갈시킴으로써 비손상 B-림프구를 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC)로부터 정제하였다. 유사하게, MACS 인간 NK 세포 단리 키트 (밀테니 바이오텍)를 이용하여 오토맥스(AutoMACs) 장치 상에서 음성 고갈에 의해 자가 자연 살해 (NK) 세포를 PBMC로부터 정제하였다. 상승 농도의 항-BAFFR 항체 (100 ㎕)를 V-형 96-웰 플레이트 (코닝(Corning))에서 20분 동안 배양 배지 50 ㎕ 중에서 1x104 개의 B-세포와 함께 인큐베이션하였다. 이어서, 50 ㎕ (1x105 개의 NK 세포 함유)를 첨가하고, 37℃에서 4시간 동안 인큐베이션하였다. 세포를 회전 침강시키고, 상층액 150 ㎕를 제거하였다. 세포를 재현탁시키고, 7-아미노 악티노마이신 D (7-AAD, 벡톤 딕킨슨)의 1:100 희석액 10 ㎕를 첨가하였다. 세포를 FACScalibur (벡톤 딕킨슨) 기기 상에서 계수하였다. 7-AAD 양성 세포의 데이터 분석을 셀퀘스트 프로(CellQuest Pro) 소프트웨어 (벡톤 딕킨슨)를 이용하여 수행하였다.
4. 생체내 기능적 분석
생체내 B 세포 고갈 분석
B 세포 수에 대한 항-BAFFR 항체의 고갈 효과를 하기와 같이 평가하였다.
a) B 세포 및 T 세포 표면 마커 (각각 CD3 및 CD19)에 대해 특이적인 형광 표지된 항체로 전혈 또는 단리된 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC)를 염색함으로써 혈액 림프구 구획에서의 B 세포의 상대수를 측정하였다. CD3 및 CD19 양성 세포의 상대 백분율을 유세포측정으로 정량화하였고, T 세포 대 B 세포의 비율의 증가에 의해 B 세포의 선택적 감소를 표현할 수 있었다.
b) 형광 표지된 항-CD19 항체를 제조업체의 지시서에 따라 트루카운트(TruCOUNT) 튜브 (카탈로그 번호 340334; 벡톤 딕킨슨, 캘리포니아주 산호세)와 함께 이용하여 유세포 측정에 의해 B 세포 절대수를 세포/㎕ 혈액으로서 측정하였다.
CIA 동물 모델 분석
콜라겐 유도된 관절염 (CIA)은 인간 질환의 다양한 측면을 반영하는 것으로 제안되어 왔다. CIA는 유전적으로 민감한 계통의 마우스를 면역보강제 중 유형 II 콜라겐으로 면역화시킴으로써 유도되며, 자가항체 생성을 비롯한 자가면역 반응에 의해 매개되고, 이어서 이는 유형 II 콜라겐 (CII)의 특정 영역에 결합한다. B- 및 T-림프구는 둘 다 CIA의 병인에 있어서 중요하다. 동물 모델의 관절 조직학은, 예컨대 활액막 과형성, 가장자리 미란 및 연골 표면 파괴 (병리생리학의 일부 특징임)의 측면에서 인간 질환과의 수많은 유사성을 갖는다.
0일째에 콜라겐 유형 II (C-II)로 면역화되고 이어서 21일째에 C-II로 부스터 처리된 후, DBA/1 마우스에서는 통상적으로 관절염의 심각한 증상이 발생하였다. 본 연구에서, 마우스에게 예방적 요법으로 마우스 당 항 BAFFR 항체 또는 이소형 대조군 항체 200 ug을 주 2회 복막내 처리하였다 (-10일에서 대략 36일). 질환 중증도의 지표로서 발 부종을 실험 전반에 걸쳐 모니터링하였다. 부종 효능이 관측된 경우, 실험의 말미에 발에 대해 조직학을 수행하였다. 지라, 혈액 및 림프절에서의 B 세포 감소를 세포 단리 및 FACS 분석에 의해 평가할 수 있었다. 항 콜라겐 항체에 대한 ELISA를 수행하여 항체 역가가 또한 억제되었는지를 조사하였다. 던넷 다중 비교 시험 (일원분산분석) 적용시 CIA 동물 모델이 부종에서 통계적으로 유의한 감소를 나타낸 경우, CIA 동물 모델에서 항체가 양호한 효능을 갖는 것으로 추정하였다. 이는 통상적으로 각 군의 동물들 사이에서 낮은 편차를 갖는 시간에 걸친 발 부종의 50％ 감소로 해석된다.
실시예:
하기 표에 본 발명의 항체의 구체적인 예의 상응하는 CDR에 대한 서열을 기재하였다. HCDR1, HCDR2 및 HCDR3은 항체의 중쇄의 CDR1, CDR2 및 CDR3을 나타내고, LCDR1, LCDR2 및 LCDR3은 항체의 경쇄의 CDR1, CDR2 및 CDR3을 나타낸다.
<표 1>
Figure 112013066581509-pat00003
실시예의 상세한 특성화
FACS에서의 인간 Fab 포맷의 본 발명의 항체의 EC50의 측정
Fab의 EC50을 형질감염된 HEK293 세포 상에서, 그리고 내인성 BAFFR을 발현하는 Raji 세포 상에서 FACS로 Fab 적정에 의해 측정하였다.
<표 2>
Figure 112013066581509-pat00004
HCDR3의 위치 110에서의 MOR07347에서 발견된 글루타민이 유리한 것으로 보여지므로, 상기 위치를 또한 교차-클론 MOR6743에 도입하여 항체 MOR07685를 생성하였다. 상기 항체는 MOR06743 및 MOR07347의 EC50 값과 유사한 EC50 값 (FACS 적정에서 측정)을 나타냈다.
BAFFR - BLyS 결합 분석 (FACS)에서의 Fab의 IC50 값의 측정
Raji 세포 상에서의 Fab 적정 (FACS)에 의한 BAFFR - BLyS 결합 억제 분석으로 인간 Fab 포맷에서의 본 발명의 항체의 IC50 값을 측정하였다. 이들 분석으로부터의 결과를 하기 표 3에 기재하였다.
<표 3>
Figure 112013066581509-pat00005
BAFFR - BLyS 결합 분석 (ELISA)에서의 항체의 IC50 값의 측정
인간 Fab 및 IgG2 포맷에서의 본 발명의 항체의 IC50 값을 경쟁적 ELISA (여기서, 항체를 적정하여 인간 가용성 BLyS 및 BAFFR (BAFFR:Fc 융합 단백질)의 세포외 도메인 사이에서의 상호작용을 억제함)로 측정하였다. IC50 값을 또한 유사한 경쟁적 ELISA (여기서, 본 발명의 항체를 적정하여, 인간 가용성 BLyS 분석에 대한 BAFFR 유도된 펩티드 (미니BR3)의 결합을 억제함)로 측정하였다.
이들 분석으로부터의 결과를 하기 표 4에 기재하였다.
<표 4>
Figure 112013066581509-pat00006
BCMA 및 TACI에 대한 교차-반응의 분석
BCMA 및 TACI는 BAFFR과 관련된 단백질이며, 또한 리간드 BLyS에 결합할 수 있다. 이들 두 단백질에 대한 원치 않는 교차-반응에 대해 Fab를 시험하였다. BCMA에 대한 결합제의 교차-반응을 재조합 단백질 상에서 ELISA로, 그리고 세포 표면 항원 상에서 FACS 분석으로 시험하였다.
ELISA에서 Fab를 항-인간 Fc 항체를 통해 맥시소르프 플레이트로 포획된 BAFFR:Fc 상에서 400 nM에서 0.005 nM까지 적정하였다. 오직 MOR07342 및 MOR07346만이 고 Fab 농도 (> 100 nM)에서 BCMA에 대한 약간의 교차-반응을 나타냈다. 반면, MOR06654, MOR07347, MOR07348, MOR07349는 배경 상에서 BCMA에 대한 결합을 나타내지 않았다. 1000-배 식별 인자가 모든 Fab에 의해 충족되었다.
FACS에서, 하기 Fab를 BCMA-형질감염된 HEK293 세포 상에서 분석하고, 1 μM에서 0.005 nM까지 적정하였다: MOR06654, MOR06743, MOR07342, MOR07347, MOR7348 및 MOR07349. 330 nM에서, MOR07342만이 상승된 결합 신호 (배경에 비해 2배)를 나타냈다. 다른 모든 시험 Fab는 상기 농도에서 신호를 나타내지 않았다. 1 μM의 Fab 농도에서, MOR06654, MOR06743 및 MOR07347은 배경에 비해 3 내지 4배의 신호를 나타냈다. MOR07342는 배경에 비해 20배의 신호로 BCMA-형질감염된 세포에 대한 결합을 나타냈다. MOR007348 및 MOR07349는 1 μM까지의 Fab 농도에서 전혀 BCMA에 결합하지 않았다.
기능적 B 세포 분석에서의 본 발명의 항체의 효능
BLyS 매개 공동-자극 B-세포 증식 분석에서의 항체의 효능 및 효능작용
1차 인간 혈액 유도된 B-세포를 항-IgM 항체 및 인간 가용성 BLyS로 자극하여, B-세포 증식을 유도하였다. 본 발명의 항체를 적정하여, BLyS의 공동-자극 효과를 차단하였다. 항체의 효능작용 (즉 BLyS-유사) 효과를 측정하기 위해, B-세포를 항-IgM 항체 단독으로 자극하였다. BAFFR 항체를 적정하여, B-세포 증식의 잠재적 증강을 측정하였다. 이들 분석으로부터의 결과를 상이한 BAFFR 항체 포맷 (인간 Fab, IgG2 및 IgG1)에 대해 하기 표 5에 나타냈다.
<표 5>
Figure 112013066581509-pat00007
BLyS 매개 공동-자극 B-세포 IgG1 생성 분석에서의 항체의 효능 및 효능작용
1차 인간 혈액 유도된 B-세포를 IL-21 및 인간 가용성 BLyS로 자극하여, IgG1 생성을 유도하였다. 본 발명의 항체를 적정하여, BLyS의 공동-자극 효과를 차단하였다. 항체의 효능제작용 (즉 BLyS-유사) 효과를 측정하기 위해, B-세포를 IL-21 단독으로 자극하였다. 항-BAFFR 항체를 적정하여, IgG1 분비의 잠재적 증강을 측정하였다. 이들 분석으로부터의 결과를 하기 표 6에 나타냈다.
<표 6>
Figure 112013066581509-pat00008
ADCC 분석에서의 B-세포 사멸을 유발하는 항체의 효능
상승 농도의 항-BAFFR 항체를 1차 인간 혈액 유도된 B-세포에 결합시킨 후, 자가 자연 살해 (NK) 세포를 첨가하여 사멸 반응을 유도하였다. 4시간 후, 아폽토시스성 세포의 수를 FACS로 계수하였다. 이들 분석으로부터의 결과를 IgG1 및 IgG2 항체 포맷에 대해 하기 표 7에 나타냈다.
<표 7>
Figure 112013066581509-pat00009
실시예 2: CIA 마우스 모델에서의 생체내 효능
완전 프로인트 보조제 중 소 유형 2 콜라겐으로 면역화시키기 9, 6 및 2일 전에 마우스를 200 ug/동물의 항 BAFFR 항체 (뮤린 IgG2a에 접합됨) 또는 이소형 대조군 항체로 처리하였다. 항체를 실험 전반에 걸쳐 (면역화 이후 35일까지) 항체를 200 ug/마우스로 주 2회 적용하였다. 면역화 후 21일째에 마우스를 포스페이트 완충 염수 중 소 유형 2 콜라겐으로 부스팅하였다. 부종을 부스팅 일로부터 매 2 내지 3일마다 평가하였다. 도 1에 나타낸 바와 같이, 항 BAFFR 항체는 그의 대조군 항 CSA 항체와 비교시 부종이 유의하게 감소하였다.
실시예 3: 사이노몰구스 원숭이에서의 말초 B 세포의 고갈
사이노몰구스 원숭이를 20 mg/kg (정맥내)의 투여량의 항-인간 BAFF-R 모노클로날 항체 MOR06654 (IgG1/k)로 4주마다 처리하였다. 혈액 중 B 세포 수를 FACS 분석에 의해 다양한 투여전 및 투여후 시점에서 측정하였다. 요컨대, 혈액 샘플을 트루 카운트(True Count) 튜브 (BD, 카탈로그 번호 340334)에서 형광-표지된 항-CD20 항체 (항-인간 CD20-PE, 클론 2H7, BD, 카탈로그 번호 555623) 또는 항-CD40 항체 (항-인간 CD40-APC, 클론 5C3, BD, 카탈로그 번호 555591)와 함께 인큐베이션하였다. 결과를 도 2에 나타냈다.
처리 원숭이에서 B 세포가 투여전 B 세포 수의 평균 33％까지 급속히 고갈되었다 (n=3). B 세포의 감소를 후속 투여량으로 유지하거나 증가시켰다. 평균 B 세포 감소는 56일째 (즉, 마지막 투여로부터 45일째)에 85％ (n=3)였다. B 세포 수의 점진적 증가가 56일째 이후 관측되었다.
결론적으로, 인간 항BAFF-R 항체로의 처리는 사이노몰구스 원숭이에서의 말초 B 세포의 신속하고 지속적인 감소를 유발하였다. 이러한 약역학 효과는 가역적이며, 순환으로부터의 항체의 제거 후 정상 B 세포 항상성을 회복시킨다.
실시예 4: 비-푸코실화된 항체를 사용한 강력하고 보다 지속적인 B 세포 고갈
2차 실험에서, 사이노몰구스 원숭이를 MOR06654 (IgG1) 또는 비-푸코실화된 변이체 MOR06654B의 단일 용량으로 처리하였다. 포텔리전트(Potelligent, 상표명) 세포주 (바이오와 인코포레이티드(Biowa, Inc.))를 사용하여 MOR06654B를 생성하였다. 이들 세포주는 푸코실트랜스퍼라제를 코딩하는 유전자에 대해 녹아웃된 CHO 포유동물 세포주였다. 상기 세포주에서 생성된 항체 (MOR06654B)는 푸코실화되지 않았다. 이번에는, 단일 용량은 오직 20 ㎍/kg (정맥내)이었다.
도 3에 나타낸 바와 같이, 20 ㎍/kg (정맥내) MOR06654로의 처리에 의한 B 세포의 한계치이지만 관측가능한 감소를 7일째에 관측하였다 (평균 감소 22％, n=3). 말초 B 세포의 감소는 항체 MOR06654B (퓨코스 결핌)에 대해 보다 뚜렷하고, 보다 지속적이었다. 감소는 57％ (n=3)에 도달했고, 단일 투여 28일 후에도 여전히 약 40％ (n=3)였다.
실시예 5: 본 발명의 BAFFR 결합 항체를 교차-차단하는 항체의 스크리닝
비아코어 교차-차단 분석
하기에 항체 또는 다른 결합제가 본 발명에 따른 항체를 교차-차단하는지 또는 교차-차단할 수 있는지 여부를 결정하기 위해 적합한 비아코어 분석을 일반적으로 기재하였다. 본원에 기재된 임의의 BAFFR 결합제와 함께 분석을 이용할 수 있음을 인지할 것이다.
비아코어 기기 (예를 들어 비아코어 3000)는 제조자의 권장사항에 일치하게 작동하였다.
BAFFR을 일상적으로 사용되는 아민 커플링 화학, 예를 들어 EDC-NHS 아민 커플링에 의해, 예를 들어 CM5 비아코어 칩에 커플링시켜 BAFFR-코팅된 표면을 생성할 수 있었다. 측정가능한 수준의 결합을 얻기 위해, 전형적으로는 200-800 공명 단위의 BAFFR을 칩에 커플링시킬 수 있었다 (상기 양은 측정가능한 수준의 결합을 제공하고, 동시에 사용되는 시험 시약의 농도에 의해 쉽게 포화가능함).
BAFFR을 비아코어 칩에 부착시키는 다른 방법은 "태그가 부착된" 버전의 BAFFR, 예를 들어 N-말단 또는 C-말단 His-태그가 부착된 BAFFR을 사용함에 의한 것이다. 상기 형식에서, 항-His 항체가 비아코어 칩에 커플링될 것이고, 이어서 His-태그가 부착된 BAFFR이 칩의 표면 위로 통과되어 항-His 항체에 의해 포획될 것이다.
서로 교차-차단하는 능력에 대해 평가할 2개의 항체를, 시험 혼합물을 생성하기에 적합한 완충액 내에서 결합 부위의 화학양론적 양으로, 예를 들어 1 대 1 몰비로 혼합하였다. 사용된 완충액은 전형적으로는 단백질 화학에서 통상적으로 사용되는 완충액, 예를 들어 PBS (136 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4, 1.76 mM KH2PO4 (pH 7.4))였다. 결합 부위를 기준으로 농도를 계산할 때, 항체의 분자량은 항체의 총 분자량을 그 항체 상의 표적 (즉, BAFFR) 결합 부위의 수로 나눈 값으로 가정하였다.
시험 혼합물 내의 각각의 항체의 농도는 비아코어 칩 상에 결합되는 BAFFR 분자 상에서 그 항체에 대한 결합 부위의 포화를 보장하기에 충분히 높아야 한다. 혼합물 내의 항체는 동일한 몰 농도 (결합 기초)이고, 그 농도는 전형적으로 1.0 mM 내지 1.5 mM (결합 부위 기초)일 것이다.
독립적으로 별개의 항체를 함유하는 별개의 용액을 또한 제조하였다. 이들 별개의 용액을 위해 사용된 완충액은 시험 혼합물에 대해 사용된 것과 동일한 농도의 동일한 완충액이어야 한다.
시험 혼합물을 BAFFR-코팅된 비아코어 칩 위로 통과시키고, 결합을 기록하였다. 그 후, 결합된 항체를 칩을 예를 들어 산, 예를 들어 30 mM HCl로 약 1분 동안 처리함으로써 제거하였다. 칩에 결합된 BAFFR 분자가 손상되지 않도록 하는 것이 중요하다.
이어서, 제1 항체 단독의 용액을 BAFFR-코팅된 표면 위로 통과시키고, 결합을 기록하였다. 그 후, 칩-결합 BAFFR을 손상시키지 않으면서 모든 결합 항체를 제거하기 위해 칩을, 예를 들어 상기 언급된 산 처리에 의해 처리하였다.
이어서, 제2 항체 단독의 용액을 BAFFR-코팅된 표면 위로 통과시키고, 결합의 양을 기록하였다.
최대 이론적 결합은 각각의 항체의 BAFFR에 대한 개별적인 결합의 합으로서 정의할 수 있다. 이어서, 이를 측정된 항체들의 혼합물의 실제 결합과 비교하였다. 실제 결합이 이론적 결합보다 더 낮으면, 2개의 항체는 서로 교차-차단성이다.
ELISA-기반 교차-차단 분석
항-BAFFR 항체 또는 다른 BAFFR 결합제의 교차-차단을 또한 ELISA 분석에 의해 검출할 수 있었다.
ELISA-분석의 일반적인 원리는 항-BAFFR 항체를 ELISA 플레이트의 웰 상에 코팅하는 것을 포함한다. 이어서, 과량의 제2의 잠재적으로 교차-차단성인 항-BAFFR 항체를 용액 (즉, ELISA 플레이트에 결합되지 않은 용액)에 첨가하였다. 이어서, 제한된 양의 BAFFR-Fc를 웰에 첨가하였다.
웰 상에 코팅된 항체 및 용액 내의 항체는 제한된 수의 BAFFR 분자의 결합에 대해 경쟁할 것이다. 이어서, 플레이트를 세척하여 코팅된 항체에 결합되지 않은 BAFFR을 제거하고, 또한 제2 용액상 항체, 뿐만 아니라 제2 용액상 항체와 BAFFR-Fc 사이에 형성되는 임의의 복합체를 제거하였다. 이어서, 적절한 BAFFR 검출 시약을 사용하여 결합 BAFFR의 양을 측정하였다. 코팅된 항체를 교차-차단할 수 있는 용액 내의 항체는 제2 용액상 항체의 부재 하에 코팅된 항체가 결합할 수 있는 BAFFR 분자의 수에 비해 코팅된 항체가 결합할 수 있는 BAFFR 분자의 수를 감소시킬 수 있을 것이다.
상기 분석을 Ab-X 및 Ab-Y로 불리는 2개의 항체에 대하여 하기에 추가로 보다 상세히 기재하였다. Ab-X가 고정되는 항체가 되도록 선택되는 경우, 이를 ELISA 플레이트의 웰 상에서 코팅하고, 그 후 플레이트를 적합한 차단 용액으로 차단시켜 후속적으로 첨가되는 시약의 비-특이적 결합을 최소화시켰다. 이어서, 웰당 Ab-Y BAFFR 결합 부위의 몰이 ELISA 플레이트의 코팅 동안 웰당 사용된 Ab-X BAFFR 결합 부위의 몰보다 10배 이상 높도록, 과량의 Ab-Y를 ELISA 플레이트에 첨가하였다. 이어서, 웰당 첨가되는 BAFFR-Fc의 몰이 각각의 웰을 코팅하기 위해 사용된 Ab-X BAFFR 결합 부위의 몰보다 적어도 25배 더 낮도록 BAFFR-Fc를 첨가하였다. 적합한 인큐베이션 기간 후에, ELISA 플레이트를 세척하고, BAFFR 검출 시약을 첨가하여 코팅된 항-BAFFR 항체 (이 경우에 Ab-X)가 특이적으로 결합하는 BAFFR의 양을 측정하였다. 분석에 대한 배경 신호는 코팅된 항체 (이 경우에 Ab-X), 제2 용액상 항체 (이 경우에 Ab-Y), BAFFR 완충액 단독 (즉, BAFFR 미함유) 및 BAFFR 검출 시약을 사용하여 웰에서 얻은 신호로서 정의하였다. 분석에 대한 양성 조절 신호는 코팅된 항체 (이 경우에 Ab-X), 제2 용액상 항체 완충액 단독 (즉, 제2 용액상 항체 미함유), BAFFR 및 BAFFR 검출 시약을 사용하여 웰에서 얻은 신호로서 정의하였다. ELISA 분석은 양성 대조군 신호가 배경 신호의 적어도 6배가 되도록 하는 방식으로 실행할 필요가 있다.
어떤 항체를 코팅 항체로서 사용하고, 어떤 항체를 제2 (경쟁자) 항체로서 사용할지의 선택에서 기인되는 임의의 인위적 결과 (예컨대, BAFFR에 대한 Ab-X 및 Ab-Y 사이에서 유의하게 다른 친화도)를 피하기 위해, 교차-차단 분석을 하기 두 포맷으로 수행할 필요가 있다: 1) 포맷 1은 Ab-X가 ELISA 플레이트 상에 코팅되는 항체이고, Ab-Y가 용액중의 경쟁자 항체인 경우이고, 2) 포맷 2는 Ab-Y가 ELISA 플레이트 상에 코팅되는 항체이고, Ab-X가 용액 중의 경쟁자 항체인 경우이다.
DSMZ DSM22542 20090429 DSMZ DSM22543 20090429
SEQUENCE LISTING <110> Novartis AG <120> BAFFR antagonists <130> 52752A <160> 88 <170> PatentIn version 3.2 <210> 1 <211> 12 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Gly Asp Ser Val Ser Ser Asn Ser Ala Ala Trp Gly 1 5 10 <210> 2 <211> 12 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Gly Asp Ser Val Ser Ser Asn Ser Ala Ala Trp Gly 1 5 10 <210> 3 <211> 12 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 3 Gly Asp Ser Val Ser Ser Asn Ser Ala Ala Trp Gly 1 5 10 <210> 4 <211> 12 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 4 Gly Asp Ser Val Ser Ser Asn Ser Ala Ala Trp Gly 1 5 10 <210> 5 <211> 12 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 5 Gly Asp Ser Val Ser Ser Asn Ser Ala Ala Trp Gly 1 5 10 <210> 6 <211> 12 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 6 Gly Asp Ser Val Ser Ser Asn Ser Ala Ala Trp Gly 1 5 10 <210> 7 <211> 12 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 7 Gly Asp Ser Val Ser Ser Asn Ser Ala Ala Trp Gly 1 5 10 <210> 8 <211> 18 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 8 Arg Ile Tyr Tyr Arg Ser Lys Trp Tyr Asn Asp Tyr Ala Val Ser Val 1 5 10 15 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gacctttggc 300 cagggtacga aagttgaaat taaacgtacg 330 <210> 59 <211> 330 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 59 gatatcgtgc tgacccagag cccggcgacc ctgagcctgt ctccgggcga acgtgcgacc 60 ctgagctgca gagcgagcca gtttatttct tcttcttatc tgtcttggta ccagcagaaa 120 ccaggtcaag caccgcgtct attaatttat ggttcttctt ctcgtgcaac tggggtcccg 180 gcgcgtttta gcggctctgg atccggcacg gattttaccc tgaccattag cagcctggaa 240 cctgaagact ttgcggtgta ttattgccag cagctttatt cttctcctat gacctttggc 300 cagggtacga aagttgaaat taaacgtacg 330 <210> 60 <211> 330 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 60 gatatcgtgc tgacccagag cccggcgacc ctgagcctgt ctccgggcga acgtgcgacc 60 ctgagctgca gagcgagcca gatgattgat cttcgttatc tgtcttggta ccagcagaaa 120 ccaggtcaag caccgcgtct attaatttat ggttcttctt ctcgtgcaac tggggtcccg 180 gcgcgtttta gcggctctgg atccggcacg gattttaccc tgaccattag cagcctggaa 240 cctgaagact ttgcggtgta ttattgccag cagttttatt cttctcctct tacctttggc 300 cagggtacga aagttgaaat taaacgtacg 330 <210> 61 <211> 330 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 61 gatatcgtgc tgacccagag cccggcgacc ctgagcctgt ctccgggcga acgtgcgacc 60 ctgagctgca gagcgagcca ggagattctt cctgagtatc tgtcttggta ccagcagaaa 120 ccaggtcaag caccgcgtct attaatttat ggttcttctt ctcgtgcaac tggggtcccg 180 gcgcgtttta gcggctctgg atccggcacg gattttaccc tgaccattag cagcctggaa 240 cctgaagact ttgcggtgta ttattgccag cagttttatt cttctcctct tacctttggc 300 cagggtacga aagttgaaat taaacgtacg 330 <210> 62 <211> 330 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 62 gatatcgtgc tgacccagag cccggcgacc ctgagcctgt ctccgggcga acgtgcgacc 60 ctgagctgca gagcgagcca gtggattgag gctggttatc tgtcttggta ccagcagaaa 120 ccaggtcaag caccgcgtct attaatttat ggttcttctt ctcgtgcaac tggggtcccg 180 gcgcgtttta gcggctctgg atccggcacg gattttaccc tgaccattag cagcctggaa 240 cctgaagact ttgcggtgta ttattgccag cagctttatt cttctcctat gacctttggc 300 cagggtacga aagttgaaat taaacgtacg 330 <210> 63 <211> 330 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 63 gatatcgtgc tgacccagag cccggcgacc ctgagcctgt ctccgggcga acgtgcgacc 60 ctgagctgca gagcgagcca gatgattgat cttcgttatc tgtcttggta ccagcagaaa 120 ccaggtcaag caccgcgtct attaatttat ggttcttctt ctcgtgcaac tggggtcccg 180 gcgcgtttta gcggctctgg atccggcacg gattttaccc tgaccattag cagcctggaa 240 cctgaagact ttgcggtgta ttattgccag cagttttatt cttctcctct tacctttggc 300 cagggtacga aagttgaaat taaacgtacg 330 <210> 64 <211> 372 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 64 caggtgcaat tgcaacagtc tggtccgggc ctggtgaaac cgagccaaac cctgagcctg 60 acctgtgcga tttccggaga tagcgtgagc tctaattctg ctgcttgggg ttggattcgc 120 cagtctcctg ggcgtggcct cgagtggctg ggccgtatct attatcgtag caagtggtat 180 aacgattatg cggtgagcgt gaaaagccgg attaccatca acccggatac ttcgaaaaac 240 cagtttagcc tgcaactgaa cagcgtgacc ccggaagata cggccgtgta ttattgcgcg 300 cgttatgatt gggttcctaa gattggtgtt tttgattctt ggggccaagg caccctggtg 360 acggttagct ca 372 <210> 65 <211> 372 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 65 caggtgcaat tgcaacagtc tggtccgggc ctggtgaaac cgagccaaac cctgagcctg 60 acctgtgcga tttccggaga tagcgtgagc tctaattctg ctgcttgggg ttggattcgc 120 cagtctcctg ggcgtggcct cgagtggctg ggccgtatct attatcgtag caagtggtat 180 aactcttatg cggtgagcgt gaaaagccgg attaccatca acccggatac ttcgaaaaac 240 cagtttagcc tgcaactgaa cagcgtgacc ccggaagata cggccgtgta ttattgcgcg 300 cgttatgatt gggttcctaa gattggtgtt tttgattctt ggggccaagg caccctggtg 360 acggttagct ca 372 <210> 66 <211> 372 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 66 caggtgcaat tgcaacagtc tggtccgggc ctggtgaaac cgagccaaac cctgagcctg 60 acctgtgcga tttccggaga tagcgtgagc tctaattctg ctgcttgggg ttggattcgc 120 cagtctcctg ggcgtggcct cgagtggctg ggccgtatct attatcgtag caagtggtat 180 aactcttatg cggtgagcgt gaaaagccgg attaccatca acccggatac ttcgaaaaac 240 cagtttagcc tgcaactgaa cagcgtgacc ccggaagata cggccgtgta ttattgcgcg 300 cgttatgatt gggttcctaa gattggtgtt tttgattctt ggggccaagg caccctggtg 360 acggttagct ca 372 <210> 67 <211> 372 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 67 caggtgcaat tgcaacagtc tggtccgggc ctggtgaaac cgagccaaac cctgagcctg 60 acctgtgcga tttccggaga tagcgtgagc tctaattctg ctgcttgggg ttggattcgc 120 cagtctcctg ggcgtggcct cgagtggctg ggccgtatct attatcgtag caagtggtat 180 aacaattatg cggtgagcgt gaaaagccgg attaccatca acccggatac ttcgaaaaac 240 cagtttagcc tgcaactgaa cagcgtgacc ccggaagata cggccgtgta ttattgcgcg 300 cgttataagt gggttcctaa gattggtgtt tttgattctt ggggccaagg caccctggtg 360 acggttagct ca 372 <210> 68 <211> 372 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 68 caggtgcaat tgcaacagtc tggtccgggc ctggtgaaac cgagccaaac cctgagcctg 60 acctgtgcga tttccggaga tagcgtgagc tctaattctg ctgcttgggg ttggattcgc 120 cagtctcctg ggcgtggcct cgagtggctg ggccgtatct attatcgtag caagtggtat 180 aactcttatg cggtgagcgt gaaaagccgg attaccatca acccggatac ttcgaaaaac 240 cagtttagcc tgcaactgaa cagcgtgacc ccggaagata cggccgtgta ttattgcgcg 300 cgttatcagt gggttcctaa gattggtgtt tttgattctt ggggccaagg caccctggtg 360 acggttagct ca 372 <210> 69 <211> 372 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 69 caggtgcaat tgcaacagtc tggtccgggc ctggtgaaac cgagccaaac cctgagcctg 60 acctgtgcga tttccggaga tagcgtgagc tctaattctg ctgcttgggg ttggattcgc 120 cagtctcctg ggcgtggcct cgagtggctg ggccgtatct attatcgtag caagtggtat 180 aactcttatg cggtgagcgt gaaaagccgg attaccatca acccggatac ttcgaaaaac 240 cagtttagcc tgcaactgaa cagcgtgacc ccggaagata cggccgtgta ttattgcgcg 300 cgttatgatt gggttcctaa gattggtgtt tttgatcttt ggggccaagg caccctggtg 360 acggttagct ca 372 <210> 70 <211> 372 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 70 caggtgcaat tgcaacagtc tggtccgggc ctggtgaaac cgagccaaac cctgagcctg 60 acctgtgcga tttccggaga tagcgtgagc tctaattctg ctgcttgggg ttggattcgc 120 cagtctcctg ggcgtggcct cgagtggctg ggccgtatct attatcgtag caagtggtgg 180 aacgattatg cggtgagcgt gaaaagccgg attaccatca acccggatac ttcgaaaaac 240 cagtttagcc tgcaactgaa cagcgtgacc ccggaagata cggccgtgta ttattgcgcg 300 cgttatgatt gggttcctaa gattggtgtt tttgatgggt ggggccaagg caccctggtg 360 acggttagct ca 372 <210> 71 <211> 215 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 71 Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Phe Ile Ser Ser Ser 20 25 30 Tyr Leu Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu 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gagcagtaca acagcaccta cagggtggtg tccgtgctga ccgtgctgca ccaggactgg 960 ctgaacggca aggaatacaa gtgcaaggtc tccaacaagg ccctgccagc ccccatcgaa 1020 aagaccatca gcaaggccaa gggccagcca cgggagcccc aggtgtacac cctgcccccc 1080 tcccgggagg agatgaccaa gaaccaggtg tccctgacct gtctggtgaa gggcttctac 1140 cccagcgaca tcgccgtgga gtgggagagc aacggccagc ccgagaacaa ctacaagacc 1200 acccccccag tgctggacag cgacggcagc ttcttcctgt acagcaagct gaccgtggac 1260 aagtccaggt ggcagcaggg caacgtgttc agctgcagcg tgatgcacga ggccctgcac 1320 aaccactaca cccagaagag cctgagcctg tcccccggca ag 1362 <210> 80 <211> 1362 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 80 caggtgcagc tgcagcagag cggcccaggc ctggtgaagc cctctcagac cctgagcctg 60 acctgcgcca tcagcggcga cagcgtgagc agcaacagcg ccgcctgggg ctggatcagg 120 cagagccccg gcaggggcct ggaatggctg ggcaggatct actataggtc caagtggtac 180 aacaactacg ccgtgagcgt gaagagcagg atcaccatca accccgacac cagcaagaac 240 cagttcagcc tgcagctcaa cagcgtgacc cccgaggaca ccgccgtgta ctactgcgcc 300 aggtacaagt gggtgcccaa gatcggcgtg ttcgacagct ggggccaggg caccctggtg 360 accgtgagca gcgctagcac caagggcccc agcgtgttcc ccctggcccc cagcagcaag 420 agcaccagcg gcggcacagc cgccctgggc tgcctggtga aggactactt ccccgagccc 480 gtgaccgtgt cctggaacag cggagccctg acctccggcg tgcacacctt ccccgccgtg 540 ctgcagagca gcggcctgta cagcctgtcc agcgtggtga cagtgcccag cagcagcctg 600 ggcacccaga cctacatctg caacgtgaac cacaagccca gcaacaccaa ggtggacaag 660 agagtggagc ccaagagctg cgacaagacc cacacctgcc ccccctgccc agccccagag 720 ctgctgggcg gaccctccgt gttcctgttc ccccccaagc ccaaggacac cctgatgatc 780 agcaggaccc ccgaggtgac ctgcgtggtg gtggacgtga gccacgagga cccagaggtg 840 aagttcaact ggtacgtgga cggcgtggag gtgcacaacg ccaagaccaa gcccagagag 900 gagcagtaca acagcaccta cagggtggtg tccgtgctga ccgtgctgca ccaggactgg 960 ctgaacggca aggaatacaa gtgcaaggtc tccaacaagg ccctgccagc ccccatcgaa 1020 aagaccatca gcaaggccaa gggccagcca cgggagcccc aggtgtacac cctgcccccc 1080 tcccgggagg agatgaccaa gaaccaggtg tccctgacct gtctggtgaa gggcttctac 1140 cccagcgaca tcgccgtgga gtgggagagc aacggccagc ccgagaacaa ctacaagacc 1200 acccccccag tgctggacag cgacggcagc ttcttcctgt acagcaagct gaccgtggac 1260 aagtccaggt ggcagcaggg caacgtgttc agctgcagcg tgatgcacga ggccctgcac 1320 aaccactaca cccagaagag cctgagcctg tcccccggca ag 1362 <210> 81 <211> 1362 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 81 caggtgcagc tgcagcagag cggcccaggc ctggtgaagc cctctcagac cctgagcctg 60 acctgcgcca tcagcggcga cagcgtgagc agcaacagcg ccgcctgggg ctggatcagg 120 cagagccccg gcaggggcct ggaatggctg ggcaggatct actataggtc caagtggtac 180 aacagctacg ccgtgagcgt gaagagcagg atcaccatca accccgacac cagcaagaac 240 cagttcagcc tgcagctcaa cagcgtgacc cccgaggaca ccgccgtgta ctactgcgcc 300 aggtatcagt gggtgcccaa gatcggcgtg ttcgacagct ggggccaggg caccctggtg 360 accgtgagca gcgctagcac caagggcccc agcgtgttcc ccctggcccc cagcagcaag 420 agcaccagcg gcggcacagc cgccctgggc tgcctggtga aggactactt ccccgagccc 480 gtgaccgtgt cctggaacag cggagccctg acctccggcg tgcacacctt ccccgccgtg 540 ctgcagagca gcggcctgta cagcctgtcc agcgtggtga cagtgcccag cagcagcctg 600 ggcacccaga cctacatctg caacgtgaac cacaagccca gcaacaccaa ggtggacaag 660 agagtggagc ccaagagctg cgacaagacc cacacctgcc ccccctgccc agccccagag 720 ctgctgggcg gaccctccgt gttcctgttc ccccccaagc ccaaggacac cctgatgatc 780 agcaggaccc ccgaggtgac ctgcgtggtg gtggacgtga gccacgagga cccagaggtg 840 aagttcaact ggtacgtgga cggcgtggag gtgcacaacg ccaagaccaa gcccagagag 900 gagcagtaca acagcaccta cagggtggtg tccgtgctga ccgtgctgca ccaggactgg 960 ctgaacggca aggaatacaa gtgcaaggtc tccaacaagg ccctgccagc ccccatcgaa 1020 aagaccatca gcaaggccaa gggccagcca cgggagcccc aggtgtacac cctgcccccc 1080 tcccgggagg agatgaccaa gaaccaggtg tccctgacct gtctggtgaa gggcttctac 1140 cccagcgaca tcgccgtgga gtgggagagc aacggccagc ccgagaacaa ctacaagacc 1200 acccccccag tgctggacag cgacggcagc ttcttcctgt acagcaagct gaccgtggac 1260 aagtccaggt ggcagcaggg caacgtgttc agctgcagcg tgatgcacga ggccctgcac 1320 aaccactaca cccagaagag cctgagcctg tcccccggca ag 1362 <210> 82 <211> 1362 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 82 caggtgcagc tgcagcagag cggcccaggc ctggtgaagc cctctcagac cctgagcctg 60 acctgcgcca tcagcggcga cagcgtgagc agcaacagcg ccgcctgggg ctggatcagg 120 cagagccccg gcaggggcct ggaatggctg ggcaggatct actataggtc caagtggtgg 180 aacgactacg ccgtgagcgt gaagagcagg atcaccatca accccgacac cagcaagaac 240 cagttcagcc tgcagctcaa cagcgtgacc cccgaggaca ccgccgtgta ctactgcgcc 300 agatatgact gggtgcccaa gatcggcgtg ttcgacggct ggggccaggg caccctggtg 360 accgtgagca gcgctagcac caagggcccc agcgtgttcc ccctggcccc cagcagcaag 420 agcaccagcg gcggcacagc cgccctgggc tgcctggtga aggactactt ccccgagccc 480 gtgaccgtgt cctggaacag cggagccctg acctccggcg tgcacacctt ccccgccgtg 540 ctgcagagca gcggcctgta cagcctgtcc agcgtggtga cagtgcccag cagcagcctg 600 ggcacccaga cctacatctg caacgtgaac cacaagccca gcaacaccaa ggtggacaag 660 agagtggagc ccaagagctg cgacaagacc cacacctgcc ccccctgccc agccccagag 720 ctgctgggcg gaccctccgt gttcctgttc ccccccaagc ccaaggacac cctgatgatc 780 agcaggaccc ccgaggtgac ctgcgtggtg gtggacgtga gccacgagga cccagaggtg 840 aagttcaact ggtacgtgga cggcgtggag gtgcacaacg ccaagaccaa gcccagagag 900 gagcagtaca acagcaccta cagggtggtg tccgtgctga ccgtgctgca ccaggactgg 960 ctgaacggca aggaatacaa gtgcaaggtc tccaacaagg ccctgccagc ccccatcgaa 1020 aagaccatca gcaaggccaa gggccagcca cgggagcccc aggtgtacac cctgcccccc 1080 tcccgggagg agatgaccaa gaaccaggtg tccctgacct gtctggtgaa gggcttctac 1140 cccagcgaca tcgccgtgga gtgggagagc aacggccagc ccgagaacaa ctacaagacc 1200 acccccccag tgctggacag cgacggcagc ttcttcctgt acagcaagct gaccgtggac 1260 aagtccaggt ggcagcaggg caacgtgttc agctgcagcg tgatgcacga ggccctgcac 1320 aaccactaca cccagaagag cctgagcctg tcccccggca ag 1362 <210> 83 <211> 645 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 83 gatatcgtgc tgacacagag ccccgccacc ctgagcctga gcccaggcga gagggccacc 60 ctgtcctgca gggccagcca gtttatcagc agcagctacc tgtcctggta tcagcagaag 120 cccggccagg cccctagact gctgatctac ggcagctcct ctcgggccac cggcgtgccc 180 gccaggttca gcggcagcgg ctccggcacc gacttcaccc tgacaatcag cagcctggag 240 cccgaggact tcgccgtgta ctactgccag cagctgtaca gctcacccat gaccttcggc 300 cagggcacca aggtggagat caagcgtacg gtggccgctc ccagcgtgtt catcttcccc 360 cccagcgacg agcagctgaa gagcggcacc gccagcgtgg tgtgcctgct gaacaacttc 420 tacccccggg aggccaaggt gcagtggaag gtggacaacg ccctgcagag cggcaacagc 480 caggagagcg tcaccgagca ggacagcaag gactccacct acagcctgag cagcaccctg 540 accctgagca aggccgacta cgagaagcat aaggtgtacg cctgcgaggt gacccaccag 600 ggcctgtcca gccccgtgac caagagcttc aacaggggcg agtgc 645 <210> 84 <211> 645 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 84 gacatcgtgc tgacacagag ccccgccacc ctgagcctga gcccaggcga gagggccacc 60 ctgtcctgta gggccagcca gatgatcgac ctgagatacc tgagctggta tcagcagaag 120 cccggccagg cccccaggct cctgatctac ggcagctcta gcagggctac cggcgtgccc 180 gccaggttca gcggcagcgg ctccggcacc gacttcaccc tgaccatctc aagcctggaa 240 cccgaggact tcgccgtgta ctactgccag cagttctaca gcagccccct gaccttcggc 300 cagggcacca aggtggagat caagcgtacg gtggccgctc ccagcgtgtt catcttcccc 360 cccagcgacg agcagctgaa gagcggcacc gccagcgtgg tgtgcctgct gaacaacttc 420 tacccccggg aggccaaggt gcagtggaag gtggacaacg ccctgcagag cggcaacagc 480 caggagagcg tcaccgagca ggacagcaag gactccacct acagcctgag cagcaccctg 540 accctgagca aggccgacta cgagaagcat aaggtgtacg cctgcgaggt gacccaccag 600 ggcctgtcca gccccgtgac caagagcttc aacaggggcg agtgc 645 <210> 85 <211> 645 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 85 gacatcgtgc tgacacagag ccccgccacc ctgagcctga gcccaggcga gagggccacc 60 ctgtcctgta gggccagcca ggaaatcctg cccgagtacc tgagctggta tcagcagaag 120 cccggccagg cccccaggct cctgatctac ggcagctcta gcagggctac cggcgtgccc 180 gccaggttca gcggcagcgg ctccggcacc gacttcaccc tgaccatctc aagcctggaa 240 cccgaggact tcgccgtgta ctactgccag cagttctaca gcagccccct gaccttcggc 300 cagggcacca aggtggagat caagcgtacg gtggccgctc ccagcgtgtt catcttcccc 360 cccagcgacg agcagctgaa gagcggcacc gccagcgtgg tgtgcctgct gaacaacttc 420 tacccccggg aggccaaggt gcagtggaag gtggacaacg ccctgcagag cggcaacagc 480 caggagagcg tcaccgagca ggacagcaag gactccacct acagcctgag cagcaccctg 540 accctgagca aggccgacta cgagaagcat aaggtgtacg cctgcgaggt gacccaccag 600 ggcctgtcca gccccgtgac caagagcttc aacaggggcg agtgc 645 <210> 86 <211> 645 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 86 gacatcgtgc tgacacagag ccccgccacc ctgagcctga gcccaggcga gagggccacc 60 ctgtcctgta gggccagcca gatgatcgac ctgagatacc tgagctggta tcagcagaag 120 cccggccagg cccccaggct cctgatctac ggcagctcta gcagggctac cggcgtgccc 180 gccaggttca gcggcagcgg ctccggcacc gacttcaccc tgaccatctc aagcctggaa 240 cccgaggact tcgccgtgta ctactgccag cagttctaca gcagccccct gaccttcggc 300 cagggcacca aggtggagat caagcgtacg gtggccgctc ccagcgtgtt catcttcccc 360 cccagcgacg agcagctgaa gagcggcacc gccagcgtgg tgtgcctgct gaacaacttc 420 tacccccggg aggccaaggt gcagtggaag gtggacaacg ccctgcagag cggcaacagc 480 caggagagcg tcaccgagca ggacagcaag gactccacct acagcctgag cagcaccctg 540 accctgagca aggccgacta cgagaagcat aaggtgtacg cctgcgaggt gacccaccag 600 ggcctgtcca gccccgtgac caagagcttc aacaggggcg agtgc 645 <210> 87 <211> 184 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 87 Met Arg Arg Gly Pro Arg Ser Leu Arg Gly Arg Asp Ala Pro Ala Pro 1 5 10 15 Thr Pro Cys Val Pro Ala Glu Cys Phe Asp Leu Leu Val Arg His Cys 20 25 30 Val Ala Cys Gly Leu Leu Arg Thr Pro Arg Pro Lys Pro Ala Gly Ala 35 40 45 Ser Ser Pro Ala Pro Arg Thr Ala Leu Gln Pro Gln Glu Ser Val Gly 50 55 60 Ala Gly Ala Gly Glu Ala Ala Leu Pro Leu Pro Gly Leu Leu Phe Gly 65 70 75 80 Ala Pro Ala Leu Leu Gly Leu Ala Leu Val Leu Ala Leu Val Leu Val 85 90 95 Gly Leu Val Ser Trp Arg Arg Arg Gln Arg Arg Leu Arg Gly Ala Ser 100 105 110 Ser Ala Glu Ala Pro Asp Gly Asp Lys Asp Ala Pro Glu Pro Leu Asp 115 120 125 Lys Val Ile Ile Leu Ser Pro Gly Ile Ser Asp Ala Thr Ala Pro Ala 130 135 140 Trp Pro Pro Pro Gly Glu Asp Pro Gly Thr Thr Pro Pro Gly His Ser 145 150 155 160 Val Pro Val Pro Ala Thr Glu Leu Gly Ser Thr Glu Leu Val Thr Thr 165 170 175 Lys Thr Ala Gly Pro Glu Gln Gln 180 <210> 88 <211> 24 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 88 Pro Thr Pro Cys Val Pro Ala Glu Cys Phe Asp Leu Leu Val Arg His 1 5 10 15 Cys Val Ala Cys Gly Leu Leu Arg 20

Claims (3)

  1. (a) 서열 2로 이루어진 중쇄 가변 영역 CDR1 아미노산 서열; 서열 9로 이루어진 중쇄 가변 영역 CDR2 아미노산 서열; 서열 16으로 이루어진 중쇄 가변 영역 CDR3 아미노산 서열; 서열 23으로 이루어진 경쇄 가변 영역 CDR1 아미노산 서열; 서열 30으로 이루어진 경쇄 가변 영역 CDR2 아미노산 서열; 및 서열 37로 이루어진 경쇄 가변 영역 CDR3 아미노산 서열을 포함하거나,
    (b) 서열 3으로 이루어진 중쇄 가변 영역 CDR1 아미노산 서열; 서열 10으로 이루어진 중쇄 가변 영역 CDR2 아미노산 서열; 서열 17로 이루어진 중쇄 가변 영역 CDR3 아미노산 서열; 서열 24로 이루어진 경쇄 가변 영역 CDR1 아미노산 서열; 서열 31로 이루어진 경쇄 가변 영역 CDR2 아미노산 서열; 및 서열 38로 이루어진 경쇄 가변 영역 CDR3 아미노산 서열을 포함하거나,
    (c) 서열 4로 이루어진 중쇄 가변 영역 CDR1 아미노산 서열; 서열 11로 이루어진 중쇄 가변 영역 CDR2 아미노산 서열; 서열 18로 이루어진 중쇄 가변 영역 CDR3 아미노산 서열; 서열 25로 이루어진 경쇄 가변 영역 CDR1 아미노산 서열; 서열 32로 이루어진 경쇄 가변 영역 CDR2 아미노산 서열; 및 서열 39로 이루어진 경쇄 가변 영역 CDR3 아미노산 서열을 포함하거나,
    (d) 서열 5로 이루어진 중쇄 가변 영역 CDR1 아미노산 서열; 서열 12로 이루어진 중쇄 가변 영역 CDR2 아미노산 서열; 서열 19로 이루어진 중쇄 가변 영역 CDR3 아미노산 서열; 서열 26으로 이루어진 경쇄 가변 영역 CDR1 아미노산 서열; 서열 33으로 이루어진 경쇄 가변 영역 CDR2 아미노산 서열; 및 서열 40으로 이루어진 경쇄 가변 영역 CDR3 아미노산 서열을 포함하거나,
    (e) 서열 6으로 이루어진 중쇄 가변 영역 CDR1 아미노산 서열; 서열 13으로 이루어진 중쇄 가변 영역 CDR2 아미노산 서열; 서열 20으로 이루어진 중쇄 가변 영역 CDR3 아미노산 서열; 서열 27로 이루어진 경쇄 가변 영역 CDR1 아미노산 서열; 서열 34로 이루어진 경쇄 가변 영역 CDR2 아미노산 서열; 및 서열 41로 이루어진 경쇄 가변 영역 CDR3 아미노산 서열을 포함하거나,
    (f) 서열 7로 이루어진 중쇄 가변 영역 CDR1 아미노산 서열; 서열 14로 이루어진 중쇄 가변 영역 CDR2 아미노산 서열; 서열 21로 이루어진 중쇄 가변 영역 CDR3 아미노산 서열; 서열 28로 이루어진 경쇄 가변 영역 CDR1 아미노산 서열; 서열 35로 이루어진 경쇄 가변 영역 CDR2 아미노산 서열; 및 서열 42로 이루어진 경쇄 가변 영역 CDR3 아미노산 서열을 포함하고,
    표적 BAFFR 폴리펩티드 (서열 87)에 100nM 이하의 KD로 결합하고 BLyS 유도된 인간 B 세포 증식을 10nM 이하의 IC50으로 억제하며 생체내 또는 시험관내에서 B 세포를 고갈시키는 것을 특징으로 하는, 표적 BAFFR 폴리펩티드 (서열 87)에 대한 항체의 항원-결합 부위를 포함하는 단리된 항체 또는 기능적 단백질을 포함하는, 류마티스양 관절염, 전신 홍반성 루푸스, 쇼그렌 증후군, 다발성 경화증, 심상성 천포창, 림프종, 백혈병 또는 골수종의 치료를 위한 제약 조성물.
  2. 제1항에 있어서, B-세포 비-호지킨 림프종의 치료를 위한 제약 조성물.
  3. 제2항에 있어서, B-세포 비-호지킨 림프종이 소림프구성 림프종, 림프형질세포성 림프종, 외투 세포 림프종, 여포성 림프종, 점막-관련 림프양 조직 림프종, 미만성 대세포 림프종, 버킷 림프종, 전구체 B-림프모구성 백혈병, B-세포 만성 림프구성 백혈병 또는 다발성 골수종인 제약 조성물.
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