CN102119174B - 使用治疗性抗体的组合物和方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及特异性结合BAFF受体(BAFFR)的抗体。本发明还尤其涉及作为具有在体内B细胞排除活性的BAFFR拮抗剂的抗体，以及使用所述抗体治疗病理性病症的组合物和方法，所述病理性病症可以通过杀死或排除B细胞来治疗，例如系统性红斑狼疮或类风湿性关节炎，或其它的自身免疫疾病或淋巴瘤、白血病和骨髓瘤。

Description

使用治疗性抗体的组合物和方法
本发明涉及特异性结合BAFF受体(BAFFR)的抗体。本发明还尤其涉及是具有在体内B细胞排除活性的BAFFR拮抗剂的特定抗体，以及使用所述抗体治疗病理性病症的组合物和方法，所述病理性病症可以通过杀死或排除B细胞来治疗，例如系统性红斑狼疮或类风湿性关节炎，或其它的自身免疫疾病或淋巴瘤、白血病和骨髓瘤。
BAFFR(也称为BR3、TNFRSF13C或CD268)是肿瘤坏死因子受体超家族的成员。它主要在B淋巴细胞和小部分T细胞上表达。BAFFR特异的结合肿瘤坏死因子家族成员BLyS(也称为BAFF、CD257、TALL-1、THANK、TNFSF13B、ZTNF4)，BLyS可以由多种不同的细胞类型表达，最令人注意的是由髓样细胞表达。功能性的，BLyS/BAFFR配体-受体对关键性的参与未成熟的过渡型B细胞的成熟，成熟B细胞的存活、迁移和激活，包括同种型类别的转换。BLyS可以单独作用，或与B细胞受体(BCR)、白介素4、白介素21或CD40配体协作。由于在一些T细胞上存在BAFFR，BLyS可以作为T细胞激活的共刺激因子发挥作用。BLyS还可以结合可见于B细胞、TACI和BCMA上的2种其它受体。
BLyS或BAFFR在小鼠中的过表达导致B细胞增生，和发生具有系统性红斑狼疮(SLE)的典型特征的系统性自身免疫。此外，患病的(NZBxNZW)F1和自身免疫的MRL-lpr/lpr小鼠(所述小鼠代表SLE的动物模型)，在血清中含有增加的BLyS浓度，且BLyS水平与疾病进程相关。增加的BLyS水平还可见于患SLE、类风湿性关节炎、舍格伦综合征(syndrome)、韦格纳肉芽肿(Wegener’s granulomatosis)和B细胞恶性肿瘤(malignancy)的人患者。此外，通过用可溶性受体融合蛋白进行BLyS阻断，可以部分逆转自身免疫疾病的动物模型中的疾病表型，所述自身免疫疾病例如类风湿性关节炎(如胶原诱导的关节炎)、SLE和多发性硬化(如实验性自身免疫的脑脊髓炎)。相似的，使用BAFFR:Fc融合蛋白的治疗通过阻断B细胞存活来抑制慢性移植物抗宿主病(cGVHD)。在类风湿性关节炎和SLE患者中使用阻断抗BLyS抗体的临床效果数据强调了BLyS在这些自身免疫病症中的病原性角色。
BLyS诱导的信号传导也表现出参与恶性B细胞的存活。通过添加重组BLyS或APRIL可以拯救B-CLL细胞的凋亡。相反，通过添加可溶性BAFFR融合蛋白或者通过抗APRIL抗体可以增强B-CLL细胞的凋亡，表示BLyS和APRIL可以作为自分泌生长因子作用于恶性B细胞。BAFFR在多种疾病组织上表达，包括多发性骨髓瘤和非霍奇金淋巴瘤。目前，这类自身免疫疾病的可用治疗是具有严重副作用的免疫抑制剂，所述免疫抑制剂不治愈疾病但目的是改善疾病的病征和症状(疾病修饰性药物)。大部分目前用于SLE和RA的免疫抑制剂，如皮质类固醇、环磷酰胺、甲氨蝶呤和硫唑嘌呤，导致普遍的抗炎症效应，由于影响免疫系统的所有效应器臂，故具有严重感染的风险。因此，仍然需要治疗SLE和/或RA和其它相关自身免疫疾病的组合物和方法，例如干扰BAFFR信号传导的活性剂，在所述信号传导中怀疑BLyS促进疾病。
因此，在一个方面，本发明提供了抗体或功能性蛋白质，其包含针对BAFFR多肽(SEQ ID NO：87)中的靶的所述抗体的抗原结合部分，特征是抗体或功能性蛋白质特异性的结合BAFFR多肽。在一个实施方案中，抗体或功能性蛋白质来自哺乳动物，具有例如人或骆驼(camelid)的来源，或者是人源化抗体。在特定的实施方案中，抗BAFFR抗体的特征是具有特异性针对靶蛋白BAFFR的抗原结合区，并结合BAFFR或BAFFR片段。
在一个实施方案中，根据本发明的抗体是不具有或具有低的激动活性(agonistic activity)的BAFFR拮抗剂。在一些实施方案中，抗体或功能性片段与靶蛋白BAFFR结合，并降低或抑制BLyS与BAFFR结合。在相关的实施方案中，抗体或功能性片段抑制BLyS诱导的人B细胞增殖和/或IgG1生产。
在另一个实施方案中，根据本发明的抗体在体内和体外排除B细胞。更优选的，本发明的抗体是不具有激动活性的BAFFR拮抗剂，并在体内和体外排除人B细胞。
可以通过一种或多种测定来确定结合，所述测定可用于通过抗体测量拮抗作用或激动作用的活性。优选的，测定测量抗体对BAFFR的至少一种作用，包括：BLyS诱导的人B细胞增殖、IgG1生产和/或人B细胞排除活性。
在另一个实施方案中，本发明提供了与BAFFR的BLyS结合区特异性结合的抗体。在相关的实施方案中，本发明提供了与SEQ ID NO：87的氨基酸17和43之间的BAFFR区结合的抗体，例如，它至少与PTPCVPAECFDLLVRHCVACGLLR(SEQ ID NO：88)结合。
根据另一个特定的实施方案，抗体以100nM或更低、10nM或更低、1nM或更低的KD结合BAFFR，并以约10nM或更低、1nM或更低、或100pM或更低的IC50抑制BLyS诱导的人B细胞增殖，和以10nM或更低、1nM或更低或100pM或更低的EC50在体外排除B细胞。
在另一个相关的实施方案中，在小鼠模型中，与未处理对照动物相比，抗体在体内降低血液和组织中的B细胞的百分比达70％，优选的80％，更优选的90％。
在一些特定的实施方案，本发明的抗体不与BAFFR相关蛋白交叉反应，更特定的不与人TACI或BCMA受体交叉反应。
在另一个相关的实施方案中，本发明的抗体是完全人IgG1抗体或人源化IgG1抗体，所述抗体具有抗体依赖性细胞毒作用(ADCC)活性，并与SEQ ID NO：87的氨基酸17和43之间包含的BAFFR区域结合，例如，至少与下列肽PTPCVPAECFDLLVRHCVACGLLR(SEQ ID NO：88)结合，并以10nM或更低、1nM或更低或100pM或更低的EC50在体外排除B细胞。
在另一个相关的实施方案中，本发明的抗体是通过在缺少岩藻糖基转移酶的细胞系中重组表达来生产的人抗体，例如缺乏表达编码岩藻糖基转移酶的FUT8基因的哺乳动物细胞系，从而与表达FUT8基因的野生型细胞相比，增加ADCC活性。
本发明涉及分离的抗体，特别是人的或人源化的抗体，所述抗体干扰、减少或抑制BLyS与BAFFR结合，并在体外和体内排除B细胞。在一些实施方案中，本发明的抗体源自特定的重链和轻链序列，和/或包含特定的结构特征，例如包含特定氨基酸序列的CDR区。本发明提供了分离的抗体，制造此类抗体的方法，包含此类抗体的免疫缀合物和多价或多特异性分子，以及含有本发明的抗体、免疫缀合物或双特异分子的药物组合物。本发明还涉及使用抗体抑制例如拮抗BAFFR的功能的方法，从而延迟、预防与BLyS和/或BAFFR的存在相关的病症或病况、阻止所述病症或病况的发作、或抑制所述病症或病况的发展，例如导致病原性病症的治疗，所述病原性病症是由BAFFR介导的或可以通过杀死或排除B细胞治疗的；例如自身免疫疾病如系统性红斑狼疮(SLE)或类风湿性关节炎(RA)或B细胞瘤，如淋巴瘤、白血病或骨髓瘤。因此，此类抗体、抗体片段或抗原结合蛋白可预防性的、阻止性的使用，或作为治疗方法的一部分使用。
为了更易于理解本发明，首先定义一些术语。在详述描述中列出其他定义。
术语“免疫应答”指例如淋巴细胞、抗原呈递细胞、吞噬细胞、粒细胞，和上述细胞或肝脏产生的可溶性大分子(包括抗体、细胞因子和补体)的作用，其导致选择性损害、破坏或从人体清除侵入性病原体、受病原体感染的细胞或组织、癌性细胞，或者(在自身免疫或病理炎症的情况下)正常人细胞或组织。
“信号转导途径”或“信号传导活性”指通常由蛋白质-蛋白质相互作用起始的生物化学因果关系，例如生长因子与受体的结合，导致信号从细胞的一部分传递到细胞的另一部分。一般而言，传递涉及在一系列反应中，对一个或多个蛋白质上的一个或多个酪氨酸、丝氨酸或苏氨酸残基的特异磷酸化，而导致信号转导。倒数第二个过程通常包括核事件，导致基因表达的改变。
术语BAFFR或BAFF受体指如SEQ ID NO：87定义的人BAFFR。PCT专利公开号WO200004032和WO2006073941一般性涉及抗BAFFR抗体。WO2006073941描述了特定的抗BAFFR抗体。
如本文中使用的，术语“抗体”包括完整的抗体及其任意的抗原结合片段(即“抗原结合部分”)或其单链。天然存在的“抗体”是包含由二硫键相互连接的至少2条重链(H)和2条轻链(L)的糖蛋白。每条重链包含重链可变区(本文中简写为VH)和重链恒定区。重链恒定区包含三个结构域：CH1、CH2和CH3。每条轻链包含轻链可变区(本文中简写为VL)和轻链恒定区。轻链恒定区包含一个结构域CL。可以将VH和VL进一步细分为高变区，称作互补决定区(CDR)，其散布着更保守的、称作构架区(FR)的区域。每个VH和VL由三个CDR和四个FR组成，它们从氨基末端到羧基末端以下面的顺序排列：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。重链和轻链的可变区含有与抗原相互作用的结合结构域。抗体的恒定区可以介导免疫球蛋白与宿主组织或因子的结合，所述组织或因子包括免疫系统的多种细胞(例如，效应细胞)和经典补体系统的第一组分(Clq)。
本文所用的术语抗体的“抗原结合部分”(或简单地“抗原部分”)指保留了与抗原(例如，BAFFR的一部分)特异性结合能力的全长抗体或抗体的一个或多个片段。已显示可以通过全长抗体的片段执行抗体的抗原结合功能。术语抗体的“抗原结合部分”内涵盖的结合片段的实例包括Fab片段、由VL、VH、CL和CH1结构域组成的单价片段；F(ab)2片段、包含通过二硫键在铰链区连接的两个Fab片段的二价片段；由VH和CH1结构域组成的Fd片段；由抗体的单臂的VL和VH结构域组成的Fv片段；由VH结构域组成的dAb片段(Ward等人，1989 Nature 341：544-546)；和分离的互补决定区(CDR)。
此外，尽管Fv片段的两个结构域VL和VH由单独的基因编码，但是它们可以用重组方法通过合成接头连接，所述接头使得它们成为一条蛋白质链，其中VL和VH区配对形成单价分子(称作单链Fv(scFv)；参见例如，Bird等人，1988 Science 242：423-426和Huston等人，1988 Proc.Natl.Acad.Sci.85：5879-5883)。此类单链抗体还意在被术语抗体的“抗原结合区域”涵盖。使用本领域技术人员已知的常规技术得到这些抗体片段，并且以与完整抗体相同的方式筛选所述片段的效用。
本文所用的“分离的抗体”指抗体，其基本上没有具有不同抗原特异性的其他抗体(例如，特异结合BAFFR的分离的抗体基本上无特异结合不同于BAFFR的抗原的抗体)。然而，特异结合BAFFR的分离的抗体可以与其他抗原具有交叉反应性，如来自其他物种的BAFFR分子。此外，分离的抗体可以基本上无其他细胞物质和/或化学品。
本文中使用的术语“单克隆抗体”或“单克隆抗体组合物”指单分子组合物的抗体分子的制品。单克隆抗体组合物表现出对特定表位的单一的结合特异性和亲和力。
本文中使用的术语“人抗体”意在包括具有这样的可变区的抗体，所述可变区的构架和CDR区都源自人来源的序列。此外，如果抗体含有恒定区，则恒定区也源自此类人序列，例如，人种系序列或人种系序列的突变版本，或者含有源自人构架序列分析的共同构架序列的抗体，例如如Knappik等人(2000.J Mol Biol 296，57-86)中描述的。
可以使用普遍已知的编号方案定义免疫球蛋白可变结构域(例如CDR)的结构和位置，例如Kabat编号方案、Chothia编号方案、Kabat和Chothia的组合(AbM)等(参见例如，Sequences of Proteins ofImmunological Interest，U.S.Department of Health and Human Services(1991)，编著Kabat等人；Al Lazikani等人，(1997)J.Mol.Bio.273：927948)。
本发明的人抗体可以包括不由人序列编码的氨基酸残基(例如，通过在体外随机或位点特异性诱变或通过体内体细胞突变导入的突变)。然而，如本文所用的，术语“人抗体”不意在包括这样的抗体，其中来自另一哺乳动物物种(如小鼠)的种系的CDR序列已经被嫁接到人构架序列上。
术语“人单克隆抗体”指显示出单结合特异性的抗体，所述抗体具有的可变区中的构架区和CDR区都来自人序列。在一个实施方案中，通过杂交瘤产生人单克隆抗体，杂交瘤包括从转基因非人动物(例如，转基因小鼠)获得的B细胞，其具有包含与永生细胞融合的人重链转基因和轻链转基因的基因组。
本文所用的术语“重组人抗体”包括通过重组手段制备、表达、产生或分离的所有人抗体，如从对于人免疫球蛋白基因为转基因或转染色体的动物(例如，小鼠)或从其制备的杂交瘤中分离的抗体，从被转化而表达人抗体的宿主细胞分离的抗体，例如，从转染瘤分离的抗体，从重组的组合人抗体文库分离的抗体，和通过涉及将人免疫球蛋白基因序列的全部或部分剪接成其他DNA序列的任何其他手段制备、表达、产生或分离的抗体。此类重组人抗体具有可变区，其中构架区和CDR区来自人种系免疫球蛋白序列。然而，在一些实施方案中，此类重组人抗体可以进行体外诱变(或者，当使用人Ig序列转基因的动物时，体内体细胞诱变)，并且从而重组抗体的VH和VL区的氨基酸序列是这样的序列，其尽管来自并且涉及人种系VH和VL序列，但是可以不天然在体内存在于人抗体种系所有组成成分。
本文所用的“同种型”指重链恒定区基因提供的抗体类别(例如IgM、IgE、IgG如IgG1或IgG2)。
短语“识别抗原的抗体”和“抗原特异性的抗体”在本文中与术语“特异性结合抗原的抗体”可互换使用。
本文所用的“特异性结合BAFFR多肽”的抗体意指以100nM或更低、10nM或更低、1nM或更低的KD结合人BAFFR多肽的抗体。“与不同于BAFFR的抗原交叉反应”的抗体意指以0.5x10-8M或更小、5x10-9M或更小，或2x10-9M或更小的KD结合该抗原的抗体。“不与特定抗原交叉反应”的抗体意指以1.5x10-8M或更大的KD，或以5-10x10-8M或1x10-7M或更大的KD与该抗原结合的抗体。在一些实施方案中，不与抗原交叉反应的此类抗体在标准结合测定中显示出对于这些蛋白质的基本上检测不到的结合。
如本文中使用的，术语“拮抗剂抗体”意指在存在BLyS的人B细胞测定中，降低、减少和/或抑制BAFFR诱导的信号传导活性的抗体，例如，人B细胞增殖测定或人B细胞IgG1生产测定。人B细胞增殖测定和IgG1生产测定的实例更详细的描述在下列实施例中。在一些实施方案中，如人B细胞增殖测定中测量的，抗体以10nM或更低、1nM或更低、或100pM或更低的IC50降低、减少或抑制BLyS诱导的活性。在一些实施方案中，如IgG1生产测定中测量的，抗体以10nM或更低、1nM或更低、或100pM或更低的IC50抑制BLyS诱导的活性。
如本文中使用的，“无激动活性”的抗体意指在基于细胞的测定中不存在BLyS的条件下，不显著增加BAFFR介导的信号传导活性的抗体，例如人B细胞增殖测定。此类测定更详细的描述在下列实施例中。
如本文中使用的，在体外排除B细胞的抗体意指以10nM或更低的EC50，优选的以1nM或更低的EC50，更优选的以100pM或更低的EC50排除B细胞的抗体，如在人B细胞排除测定(ADCC)中测量的。此类测定更详细的描述在下列实施例中。
如本文中使用的，在体内排除B细胞的抗体意指如B细胞的荧光激活细胞分选(FACS)中测量的，在体内降低B细胞的百分比达70％，优选的80％，更优选的90％的抗体。此类测定更详细的描述在下列实施例中。
本文所用的术语“Kassoc”或“Ka”意指特定的抗体-抗原相互作用的结合速率，而本文所用的术语“Kdis”或“KD，”意指特定的抗体-抗原相互作用的解离速率。如本文所用的，术语“KD”意指解离常数，其从Kd与Ka的比(即Kd/Ka)得到并且表示为摩尔浓度(M)。可以使用本领域成熟的方法测定抗体的KD值。用于测定抗体KD的方法是通过使用表面等离振子体共振，或者使用生物传感器系统，如系统。
本文所用的术语“亲和力”指在单个抗原位点上抗体和抗原之间相互作用的强度。在每一抗原位点，抗体“臂”的可变区通过弱的非共价力与抗原在多位点相互作用；相互作用越强，亲和力越强。
本文所用的术语“抗体亲抗源性”指抗体-抗原复合物全部的稳定性或强度的信息度量。它由三种主要因素调节：抗体表位亲和力；抗体和抗原的效价；以及相互作用部分的结构排列。最终这些因素限定抗体的特异性，即特定抗体结合到精确的抗原表位的可能性。
本文所用的术语“ADCC”或“抗体依赖性细胞毒作用”的活性指人B细胞排除活性。可以通过上述人B细胞排除测定来测量ADCC活性。
为获得更高抗体亲抗源性探针，可构建二聚缀合物(与FACS标记偶联的两个抗体蛋白质分子)，从而使得低亲和力相互作用(如与种系抗体)通过FACS更易检测到。此外，增加结合抗原的抗体亲抗源性的其他方法包括产生任何本文描述的抗BAFFR抗体的构建体的二聚体、三聚体或多聚体。可通过各个分子间的共价结合产生这类多聚体，例如，通过模拟天然C至N端结合或通过模拟经其恒定区保持在一起的抗体二聚物。设计进入Fc/Fc界面的键可以是共价的或非共价的。此外，在BAFFR杂化物中可使用不同于Fc的二聚化或多聚化伙伴蛋白(partner)以创建这种更有序的结构。例如，可以使用多聚化结构域，例如Borean(WO2004039841)中描述的三聚化结构域或公开的专利申请WO98/18943中描述的五聚化结构域。
如本文所用的，术语抗体的“选择性”指与一些靶多肽结合但不与密切相关的多肽结合的抗体。
如本文所用的，术语抗体的“高亲和力”指对靶抗原具有1nM或更小的KD的抗体。如本文所用的，术语“对象”包括任何的人或非人动物。
术语“非人动物”包括所有脊椎动物，例如，哺乳动物和非哺乳动物，如非人灵长类动物、羊、狗、猫、马、牛、鸡、两栖动物、爬行动物等。
本文所用的术语“优化的”意指核苷酸序列已改变为编码这样的氨基酸序列，所述氨基酸序列使用在生产细胞或生物体中优选的密码子，通常是真核细胞，例如毕赤酵母属(Pichia)细胞、木霉属(Trichoderma)细胞、中国仓鼠卵巢细胞(CHO)或人细胞。优化的核苷酸序列被改造成完全保留或尽可能多的保留由起始核苷酸序列最初编码的氨基酸序列，也称为“亲本”序列。本文中，将优化的序列改造成具有CHO哺乳动物细胞偏爱的密码子；然而，本文也预见这些序列在其他真核细胞中的优化表达。由优化的核苷酸序列编码的氨基酸序列也被称为优化的。
以下章节中进一步详细的描述了本发明的各个方面。
评估抗体与不同物种的BAFFR的结合能力的标准测定是本领域公知的，包括例如，ELISA、western印迹和RIA。合适的测定详细描述于实施例中。抗体的结合动力学(例如结合亲和力)也可通过本领域公知的标准测定来评估，例如通过Biacore分析。评估抗体对BAFFR的功能性质(例如，受体结合、阻止或诱导人B细胞增殖或IgG生产)的影响的测定进一步详细描述于实施例中。
因此，“抑制”一种或多种这类BAFFR功能性质(例如，生物化学活性、免疫化学活性、细胞活性、生理学活性或其他生物学活性等)的抗体，可以理解为相对于缺乏抗体的条件下(例如，或当存在无相关特异性的对照抗体时)所显示的，特定活性的统计学显著的降低，其中所述BAFFR功能性质是根据本领域公知的和本文描述的方法学测定的。抑制BAFFR活性的抗体影响这类统计学显著的降低至少10％的测量参数，至少50％、80％或90％，并且在某些实施方案中，本发明抗体可抑制大于95％、98％或99％的BAFFR功能性活性。
术语“交叉阻断”、“交叉阻断的”和“交叉阻断了”在本文中可互换的使用，意指在标准的竞争性结合测定中，抗体或其它结合剂干扰其它抗体或其它结合剂与BAFFR结合的能力。
可以利用标准的竞争结合测定，确定抗体或其它结合剂能够干扰另一种抗体或结合分子与BAFFR结合的能力或程度，从而确定所述抗体或其它结合剂是否可以认为是根据本发明交叉阻断的。一个合适的测定涉及使用Biacore技术(例如，通过使用Biacore 3000仪器(Biacore，Uppsala，Sweden))，这可以利用表面等离子共振技术，测量相互作用的程度。另一种用于测量交叉阻断的测定使用基于ELISA的方法。
实施例中给出了两种方法的进一步的细节。
根据本发明，在所描述的BIAcore交叉阻断测定中，根据本发明的交叉阻断抗体或其它结合剂与BAFFR结合，使得记录的抗体或结合剂的组合(混合物)的结合是在所组合的两种抗体或结合剂的最大理论结合的80％和0.1％之间(例如，80％至4％)，特别是在最大理论结合的75％和0.1％之间(例如，75％至4％)，更特别的是在最大理论结合的70％和0.1％之间(例如，70％至4％)，更特别的是在最大理论结合的65％和0.1％之间(例如，65％至4％)。
如果在如实施例描述的ELISA测定中，与在缺少溶液相的抗BAFFR抗体的条件下获得的BAFFR检测信号(即，阳性对照孔)相比，溶液相的抗BAFFR抗体能够导致BAFFR检测信号(即，包被的抗体结合的BAFFR的量)降低60％至100％，特别是70％至100％，更特别是80％至100％，则定义抗体是交叉阻断的。
重组抗体
本发明的抗体包括如实施例中所述进行分离和结构表征的人重组抗体。本发明的分离的抗体的VH氨基酸序列如SEQ ID NO：50-56所述。本发明的分离的抗体的VL氨基酸序列分别如SEQ ID NO：43-49所述。本发明的抗体的优选全长轻链氨基酸序列的实例如SEQ ID NO：71-74所示。本发明的抗体的优选的全长重链氨基酸序列的实例分别如SEQ ID NO：75-78所示。抗体的优选的全长重链和轻链氨基酸序列的其它实例是由质粒pBW510和pBW512中含有的相应DNA序列编码的，所述质粒pBW510和pBW512由诺瓦提斯医药公司，Forum 1，CH-4002巴塞尔，瑞士(Novartis Pharma AG，Forum 1，CH-4002 Basel，Switzerland)于2009年4月29日保藏在DSMZ，登录号分别为DSM22542和DSM22543。本发明的其它抗体包括通过氨基酸缺失、插入或取代被突变，但在CDR区仍与上述序列中描述的CDR区具有至少60、70、80、90或95百分比同一性的氨基酸，所述描述的CDR区包括由质粒pBW510和pBW512的相应DNA序列编码的CDR区，所述质粒pBW510和pBW512由诺瓦提斯医药公司，Forum 1，CH-4002巴塞尔，瑞士(Novartis Pharma AG，Forum 1，CH-4002 Basel，Switzerland)于2009年4月29日储藏在DSMZ，登录号分别为DSM22542和DSM22543。在一些实施方案中，包括突变氨基酸序列，当与上述序列中描述的CDR区相比时，所述突变氨基酸序列中的CDR区中不超过1、2、3、4或5个氨基酸被氨基酸缺失、插入或取代突变。
此外，可变重链亲本核苷酸序列显示在SEQ ID NO：64中。可变轻链亲本核苷酸序列显示在SEQ ID NO：57中。在哺乳动物细胞中就表达被优化的全长轻链核苷酸序列显示在SEQ ID NO：83-86中。在哺乳动物细胞中就表达被优化的全长重链核苷酸序列显示在SEQ ID NO：79-82中。本发明的其它抗体包括已被突变，但仍具有与上述序列至少60、70、80、90或95百分比同一性的氨基酸或核酸。在一些实施方案中，包括突变氨基酸序列，当与上述序列中描述的可变区相比时，所述突变氨基酸序列中不超过1、2、3、4或5个氨基酸被氨基酸缺失、插入或取代突变。
因为这些抗体的每一种都结合相同的表位，并且是相同的亲本抗体的后代，所以，可以将VH、VL序列、全长轻链和全长重链序列(核苷酸序列和氨基酸序列)“混合和匹配”以产生本发明的其他抗BAFFR结合分子。可以使用上述和实施例中所述的结合测定法(例如，ELISA)测试此类“混合和匹配的”抗体的BAFFR结合。当这些链被混合和匹配时，来自具体VH/VL配对的VH序列应该用结构上相似的VH序列置换。同样，来自具体全长重链/全长轻链配对的全长重链序列应该用结构上相似的全长重链序列置换。同样，来自具体VH/VL配对的VL序列应该用结构上相似的VL序列置换。同样，来自具体全长重链/全长轻链配对的全长轻链序列应该用结构上相似的全长轻链序列置换。因此，在一个方面，本发明提供了分离的重组抗体或其抗原结合区，其具有：包含选自SEQ ID NO：50-56的氨基酸序列的重链可变区；和包含选自SEQ ID NO：43-49的氨基酸序列的轻链可变区；其中抗体特异性的结合BAFFR。
在另一个方面，本发明提供：
(i)分离的重组抗体，其具有：包含选自SEQ ID NO：75-78的氨基酸序列的全长重链；和包含选自SEQ ID NO：71-74的氨基酸序列的全长轻链；其中抗体特异性的结合BAFFR，或
(ii)包含其抗原结合部分的功能性蛋白质。
在另一个方面，本发明提供：
(i)分离的重组抗体，其具有：由在哺乳动物细胞中就表达被优化的核苷酸序列编码的全长重链，所述核苷酸序列选自SEQ ID NO：79-82；和由在哺乳动物细胞中就表达被优化的核苷酸序列编码的全长轻链，所述核苷酸序列选自SEQ ID NO：83-86；其中抗体特异性的结合BAFFR；或
(ii)包含其抗原结合部分的功能性蛋白质。
抗体的VH CDR1的氨基酸序列显示在SEQ ID NO：1-7中。抗体的VHCDR2的氨基酸序列显示在SEQ ID NO：8-14中。抗体的VH CDR3的氨基酸序列显示在SEQ ID NO：15-21中。抗体的VL CDR1的氨基酸序列显示在SEQ ID NO：22-28中。抗体的VL CDR2的氨基酸序列显示在SEQ IDNO：29-35中。抗体的VL CDR3的氨基酸序列显示在SEQ ID NO：36-42中。使用Kabat系统(Kabat，E.A.等人，1991 Sequences of Proteins ofImmunological Interest，第五版，U.S.Department of Health and HumanServices，NIH Publication No.91-3242)描述SEQ ID NO：1-42所述的CDR区。
考虑到这些抗体的每一种可以结合BAFFR，并抗原结合特异性主要通过CDR1、2和3区提供，可以将VH CDR1、2和3序列与VL CDR1、2和3序列“混合和匹配”(即，来自不同抗体的CDR可以被混合和匹配，每个抗体含有VH CDR1、2和3和VL CDR1、2和3)以产生本发明的其他抗BAFFR结合分子。可以使用上文和实施例中描述的结合测定法(例如，ELISA)测试此类“混合和匹配的”抗体的BAFFR结合。当混合和匹配VHCDR序列时，来自具体VH序列的CDR1、CDR2和/或CDR3序列应该用结构上相似的CDR序列置换。同样，当混合和匹配VL CDR序列时，来自具体VL序列的CDR1、CDR2和/或CDR3序列应该用结构上相似的CDR序列置换。技术人员将容易显而易见的是，对于本发明的单克隆抗体，通过用来自本文所示CDR序列的结构上相似的序列替代一个或多个VH和/或VL CDR区序列，可以产生新的VH和VL序列。
在一些实施方案中，分离的重组抗体或其抗原结合部分具有：包含选自SEQ ID NO：1-7的氨基酸序列的重链可变区CDR1；包含选自SEQ IDNO：8-14的氨基酸序列的重链可变区CDR2；包含选自SEQ ID NO：15-21的氨基酸序列的重链可变区CDR3；包含选自SEQ ID NO：22-28的氨基酸序列的轻链可变区CDR1；包含选自SEQ ID NO：29-35的氨基酸序列的轻链可变区CDR2；以及包含选自SEQ ID NO：36-42的氨基酸序列的轻链可变区CDR3；其中该抗体特异性结合BAFFR。
在某个实施方案中，抗体包含：SEQ ID NO：2的重链可变区CDR1；SEQ ID NO：9的重链可变区CDR2；SEQ ID NO：16的重链可变区CDR3；SEQ ID NO：23的轻链可变区CDR1；SEQ ID NO：30的轻链可变区CDR2；以及SEQ ID NO：37的轻链可变区CDR3。
在某个实施方案中，抗体包含：SEQ ID NO：3的重链可变区CDR1；SEQ ID NO：10的重链可变区CDR2；SEQ ID NO：17的重链可变区CDR3；SEQ ID NO：24的轻链可变区CDR1；SEQ ID NO：31的轻链可变区CDR2；以及SEQ ID NO：38的轻链可变区CDR3。
在某个实施方案中，抗体包含：SEQ ID NO：4的重链可变区CDR1；SEQ ID NO：11的重链可变区CDR2；SEQ ID NO：18的重链可变区CDR3；SEQ ID NO：25的轻链可变区CDR1；SEQ ID NO：32的轻链可变区CDR2；以及SEQ ID NO：39的轻链可变区CDR3。
在某个实施方案中，抗体包含：SEQ ID NO：5的重链可变区CDR1；SEQ ID NO：12的重链可变区CDR2；SEQ ID NO：19的重链可变区CDR3；SEQ ID NO：26的轻链可变区CDR1；SEQ ID NO：33的轻链可变区CDR2；以及SEQ ID NO：40的轻链可变区CDR3。
在某个实施方案中，抗体包含：SEQ ID NO：6的重链可变区CDR1；SEQ ID NO：13的重链可变区CDR2；SEQ ID NO：20的重链可变区CDR3；SEQ ID NO：27的轻链可变区CDR1；SEQ ID NO：34的轻链可变区CDR2；以及SEQ ID NO：41的轻链可变区CDR3。
在某个实施方案中，抗体包含：SEQ ID NO：7的重链可变区CDR1；SEQ ID NO：14的重链可变区CDR2；SEQ ID NO：21的重链可变区CDR3；SEQ ID NO：28的轻链可变区CDR1；SEQ ID NO：35的轻链可变区CDR2；以及SEQ ID NO：42的轻链可变区CDR3。
如本文所用的，人抗体包含重链或轻链可变区，或者全长重链或轻链，如果抗体的可变区或全长链是从使用人种系免疫球蛋白基因的系统中得到的，那么所述可变区或全长链是特定种系序列的“产物”或“来自”该特定种系序列。此类系统包括用目的抗原免疫携带人免疫球蛋白基因的转基因小鼠，或者用目的抗原筛选在噬菌体上展示的人免疫球蛋白基因文库。为人种系免疫球蛋白序列的“产物”或者“来自”所述序列的人抗体可以如下鉴定：通过比较人抗体的氨基酸序列与人种系免疫球蛋白的氨基酸序列并选择序列中与人抗体的序列最接近(即，最大的％同一性)的人种系免疫球蛋白序列。为具体人种系免疫球蛋白序列的“产物”或者“来自”所述序列的人抗体可以由于例如天然存在的体细胞突变或者有意引入位点定向突变而与种系序列相比含有氨基酸差异。然而，所选的人抗体通常与人种系免疫球蛋白基因编码的氨基酸序列在氨基酸序列上至少90％同一并且含有这样的氨基酸残基，当与其他物种的种系免疫球蛋白氨基酸序列(例如，鼠种系序列)比较时，所述氨基酸残基将所述人抗体鉴定为人的。在一些情况中，人抗体可以在氨基酸序列上与种系免疫球蛋白基因编码的氨基酸序列至少60％、70％、80％、90％、或至少95％、或甚至至少96％、97％、98％、或99％同一。通常，来自具体人种系序列的人抗体将显示出与人种系免疫球蛋白基因编码的氨基酸序列不超过10个氨基酸差异。在一些情况中，人抗体可以显示出与种系免疫球蛋白基因编码的氨基酸序列不超过5个，或甚至不超过4、3、2或1个氨基酸差异。
同源抗体
在另一实施方案中，本发明的抗体具有全长重链和轻链氨基酸序列，全长重链和轻链核苷酸序列，可变区重链和轻链核苷酸序列，或可变区重链和轻链氨基酸序列，它们与本文所述抗体的氨基酸和核苷酸序列同源，并且其中所述抗体保留本发明的抗BAFFR抗体所希望的功能性质。
例如，本发明提供了分离的重组抗体(或包含其抗原结合部分的功能性蛋白)，其包括重链可变区和轻链可变区，其中：重链可变区包含与选自SEQ ID NO：50-56的氨基酸序列至少80％，或至少90％相同的氨基酸序列；轻链可变区包含与选自SEQ ID NO：43-49的氨基酸序列至少80％，或至少90％相同的氨基酸序列；抗体特异性的结合BAFFR，并且抗体显示至少一种以下功能性质：抗体抑制BLyS诱导的B细胞增殖，或BLyS诱导的IgG1生产，和它在体外或体内排除B细胞。
在另一实例中，本发明提供了分离的重组抗体(或包含其抗原结合部分的功能性蛋白)，其包括全长重链和全长轻链，其中：全长重链包含与选自SEQ ID NO：75-78的氨基酸序列至少80％，或至少90％相同的氨基酸序列；全长轻链包含与选自SEQ ID NO：71-74的氨基酸序列至少80％，或至少90％相同的氨基酸序列；该抗体特异性结合BAFFR，并且抗体显示至少一种以下功能性质：抗体抑制BLyS诱导的B细胞增殖，或BLyS诱导的IgG1生产，和它在体外或体内排除B细胞。
在另一实例中，本发明提供了分离的重组抗体(或包含其抗原结合部分的功能性蛋白)，其包括全长重链和全长轻链，其中：全长重链是由与选自SEQ ID NO：79-82的核苷酸序列至少80％，或至少90％相同的核苷酸序列编码的；全长轻链是由与选自SEQ ID NO：83-86的核苷酸序列至少80％，或至少90％相同的核苷酸序列编码的；该抗体特异性结合BAFFR，并且抗体显示至少一种以下功能性质：抗体抑制BLyS诱导的B细胞增殖，或BLyS诱导的IgG1生产，和它在体外或体内排除B细胞。
在多种实施方案中，抗体可以显示出上面讨论的功能性质的一种或多种、两种或多种，或三种。抗体可以是例如，人抗体、人源化抗体或嵌合抗体。抗体优选的是完全人IgG1抗体。
在其它实施方案中，VH和/或VL氨基酸序列可以与上述序列50％、60％、70％、80％、90％、95％、96％、98％或99％相同。在其它实施方案中，VH和/或VL氨基酸序列除了在不超过1、2、3、4或5个氨基酸位置上的氨基酸取代外，可以是相同的。可以分别通过诱变(例如，定点的或PCR-介导的诱变)编码SEQ ID NO：64-70和SEQ ID NO：57-63的核酸分子，然后利用本文所述的功能性测定来测试所编码的改变的抗体保留的功能(即，上述功能)，来获得具有这样的VH和VL区域的抗体，所述区域分别与SEQ ID NO：50-56和SEQ ID NO：43-49的VH和VL区域具有高的(即80％或更高)同一性。
在其它实施方案中，全长重链和/或全长轻链氨基酸序列可以与上述序列50％、60％、70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％或99％相同。可以分别通过诱变(例如，定点的或PCR-介导的诱变)编码SEQ ID NO：79-82和SEQ ID NO：83-86的核酸分子，然后利用本文所述的功能性测定来测试所编码的改变的抗体保留的功能(即，上述功能)，来获得具有这样的全长重链和全长轻链的抗体，所述全长重链和全长轻链分别与SEQ IDNO：75-78的任一条全长重链和SEQ ID NO：71-74的任一条全长轻链具有高的(即，80％或更高的)同一性。
在其它实施方案中，全长重链和/或全长轻链核苷酸序列可以与上述序列60％、70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％或99％相同。
在其它实施方案中，重链和/或轻链的可变区核苷酸序列可以与上述序列60％、70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％或99％相同。
如本文所用的，两个序列之间的同一性百分比是这两个序列共有的相同位置数目的函数(即，％同一性＝相同位置数#/位置总数#×100)，考虑缺口数、每个缺口的长度，它们需要被引入以进行两个序列的最佳比对。可以使用如下所述的数学算法完成序列的比较和两个序列之间百分比同一性的确定。
可以使用E.Meyers和W.Miller(Comput.Appl.Biosci.，4：11-17，1988)的算法，使用PAM120权重残基表、缺口长度罚分12和缺口罚分4，确定两个氨基酸序列之间的百分比同一性，该算法已经被结合到ALIGN程序(版本2.0)中。此外，可以使用整合到GCG软件包(可以在http://www.gcg.com得到)的GAP程序的Needleman和Wunsch(J.Mol，Biol.48：444-453，1970)算法，使用Blossom 62矩阵或PAM250矩阵，和缺口权重16、14、12、10、8、6或4和长度权重1、2、3、4、5或6确定两个氨基酸序列之间的百分比同一性。
具有保守修饰的抗体
在某些实施方案中，本发明的抗体具有包含CDR1、CDR2和CDR3序列的重链可变区和包含CDR1、CDR2和CDR3序列的轻链可变区，其中这些CDR序列中的一个或多个具有基于本文所述抗体的特定氨基酸序列或者其保守修饰，并且其中所述抗体保留本发明的抗BAFFR抗体所需的功能性质。因此，本发明提供分离的重组抗体，或包含其抗原结合部分的功能性蛋白，其组成为包含CDR1、CDR2和CDR3序列的重链可变区和包含CDR1、CDR2和CDR3序列的轻链可变区，其中：重链可变区CDR1的氨基酸序列选自SEQ ID NO：1-7及其保守修饰；重链可变区CDR2的氨基酸序列选自SEQ ID NO：8-14及其保守修饰；重链可变区CDR3的氨基酸序列选自SEQ ID NO：15-21及其保守修饰；轻链可变区CDR1的氨基酸序列选自SEQ ID NO：22-28及其保守修饰；轻链可变区CDR2的氨基酸序列选自SEQ ID NO：29-35及其保守修饰；轻链可变区CDR3的氨基酸序列选自SEQ ID NO：36-42及其保守修饰；该抗体特异性结合BAFFR，并且抗体显示至少一种以下功能性质：抗体抑制BLyS诱导的B细胞增殖，或BLyS诱导的IgG1生产，和它在体外或体内排除B细胞。
在多种实施方案中，抗体可以显示出上面讨论所列的功能性质的一种或多种、两种或多种，或三种或多种。该抗体可以是例如，人抗体、人源化抗体或嵌合抗体。
在其他实施方案中，在哺乳动物细胞中就表达被优化的本发明抗体具有全长重链序列和全长轻链序列，其中一种或多种这些序列具有基于本文描述的抗体的特定氨基酸序列或其保守修饰，并且其中所述抗体保留本发明的抗BAFFR抗体的所希望的功能性质。因此，本发明提供在哺乳动物细胞中就表达被优化的分离的单克隆抗体，其由全长重链和全长轻链组成，其中：全长重链具有选自SEQ ID NO：75-78的氨基酸序列及其保守修饰；全长轻链具有选自SEQ ID NO：71-74的氨基酸序列及其保守修饰；该抗体特异性结合BAFFR，并且抗体显示至少一种以下功能性质：抗体抑制BLyS诱导的B细胞增殖，或BLyS诱导的IgG1生产和它在体外或体内排除B细胞。
在多种实施方案中，抗体可以显示出上面讨论的功能性质的一种或多种、两种或多种，或三种或多种。该抗体可以是例如，人抗体、人源化抗体或嵌合抗体。
本文所用的术语“保守序列修饰”意指氨基酸修饰，其不显著影响或改变含有该氨基酸序列的抗体的结合特征。此类保守修饰包括氨基酸取代、添加和缺失。可以通过本领域已知的标准技术，如位点定向诱变和PCR介导的诱变向本发明的抗体中引入修饰。
保守氨基酸取代是其中将氨基酸残基用具有相似侧链的氨基酸残基置换的取代。在本领域中已经定义了具有相似侧链的氨基酸残基家族。这些家族包括具有碱性侧链的氨基酸(例如，赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、酸性侧链氨基酸(例如，天冬氨酸、谷氨酸)、不带电极性侧链氨基酸(例如，甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、色氨酸)、非极性侧链氨基酸(例如，丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸)、β分枝侧链氨基酸(例如，苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和芳香族侧链氨基酸(例如，酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)。从而，本发明抗体的CDR区内的一个或多个氨基酸残基可以用来自相同侧链家族的其他氨基酸残基置换，并且可以使用本文所述的功能测定法测试经改变的抗体所保留的功能。
结合到与本发明的抗BAFFR抗体相同的表位上的抗体
在另一个实施方案中，本发明提供了结合与本文描述的本发明的多种特异性抗BAFFR抗体结合相同表位的抗体。实施例中描述的能够阻断BLyS诱导效应的所有抗体以高亲和力结合BAFFR中的相同的表位，所述表位包含在SEQ ID NO：88的氨基酸之间。
因此，可以基于抗体在标准BAFFR结合测定中与本发明的其他抗体交叉竞争(例如，以统计学显著方式竞争性抑制结合)的能力来鉴别额外的抗体。测试抗体抑制本发明的抗体与人BAFFR结合的能力表明该测试抗体与本发明抗体竞争结合人BAFFR；根据非限制性理论，这种抗体可以与它所竞争的抗体结合人BAFFR上相同或相关的(例如，结构上相似或空间上接近的)表位。因此，本发明的另一个方面提供了这样的抗体，所述抗体结合到与本文通过序列公开的抗体所结合的相同抗原上，并与其竞争。在一些实施方案中，与本发明的抗体结合人BAFFR上相同表位的抗体是人重组抗体。此类人重组抗体可以如实施例中所述的制备和分离。
改造和修饰的抗体
还可以使用具有本文所示的一个或多个VH和/或VL序列的抗体作为起始物质，进一步制备本发明的抗体，以改造修饰的抗体，该修饰的抗体可以具有从起始抗体改变的性质。可以通过修饰一个或两个可变区(即，VH和/或VL)中的一个或多个残基来改造抗体，例如，在一个或多个CDR区内和/或一个或多个构架区内的残基。此外或可选的，可以通过修饰恒定区内的残基来改造抗体，例如改变抗体的效应功能。
可以进行的一种类型的可变区改造是CDR嫁接。抗体主要通过位于六个重链和轻链互补决定区(CDR)中的氨基酸残基与靶抗原相互作用。为此，各抗体之间CDR内的氨基酸序列比CDR外的序列更多样化。因为CDR序列负责多数抗体-抗原相互作用，所以可能通过构建表达载体表达重组抗体，所述重组抗体模拟特定天然存在的抗体的性质，所述表达载体包括来自特定天然存在的抗体的CDR序列，其嫁接到来自具有不同性质的不同抗体的构架区上(见例如，Riechmann，L.等人，1998 Nature332：323-327；Jones，P.等人，1986 Nature 321：522-525；Queen，C.等人，1989 Proc.Natl.Acad.See.U.S.A.86：10029-10033；winter的美国专利号5,225,539，和Queen等人的美国专利号5,530,101；5,585,089；5,693,762和6,180,370)。
因此，本发明的另一个实施方案涉及分离的单克隆抗BAFFR抗体，或包含其抗原结合部分的功能性蛋白质，其包括重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区包含分别具有选自SEQ ID NO：1-7的氨基酸序列的CDR1序列，分别具有选自SEQ ID NO：8-14的氨基酸序列的CDR2序列，分别具有选自SEQ ID NO：15-21的氨基酸序列的CDR3序列；所述轻链可变区具有分别具有选自SEQ IDNO：22-28的氨基酸序列的CDR1序列，分别具有选自SEQ IDNO：29-35的氨基酸序列的CDR2序列，和分别由选自SEQIDNO：36-42的氨基酸序列组成的CDR3序列。因此，这类抗体包含单克隆抗体的VH和VLCDR序列，也可包含这些抗体的不同的构架序列。
可以从公共DNA数据库或公布的参考文献中得到此类构架序列，包括种系抗体基因序列。例如，人重链和轻链可变区基因的种系DNA序列可以在″VBase″人种系序列数据库(可以在英特网网址www.mrc-cpe.cam.ac.uk/vbase获取)，以及在Kabat，E.A.，等人，1991 Sequences ofProteins of Immunological Interest，第五版，U.S.Department of Healthand Human Services，NIH Publication No.91-3242；Tomlinson，I.M.，等人，1992 J.fol.Biol.227：776-798；和Cox，J.P.L.等人，1994 Eur.JImmunol.24：827-836中找到。
用于本发明抗体的构架序列的实例是与所选的本发明抗体使用的构架序列结构相似的构架序列，例如，本发明的单克隆抗体使用的共有序列和/或构架序列结构。可以将VH CDR1、2和3序列，和VL CDR1、2和3嫁接在构架区上，该构架区具有与该构架序列所来源的种系免疫球蛋白基因中发现的序列相同的序列，或者可以将CDR序列嫁接在构架区上，该构架区与种系序列相比包含一个或多个突变。例如，已经发现在一些情况中，有益的是突变构架区内的残基以保持或增强抗体的抗原结合能力(见，例如，Queen等人的美国专利号5,530,101；5,585,089；5,693,762和6,180,370)。
另一类型的可变区修饰是突变VH和/或VL CDR1、CDR2和/或CDR3区内的氨基酸残基，从而改善目的抗体的一种或多种结合性质(例如，亲和力)，称作“亲和力成熟”。可以进行位点定向诱变或者PCR介导的诱变以导入突变，并且可以用如本文所述的和实施例中提供的体外或体内测定法，评估对抗体结合或者其他目的功能性质的影响。可以引入保守修饰(如上文讨论)。突变可以是氨基酸取代、添加或缺失。此外，通常改变CDR区内不超过一个、两个、三个、四个或五个残基。
因此，在另一个实施方案中，本发明提供分离的抗BAFFR单克隆抗体，或包含其抗原结合部分的功能性蛋白质，其包含重链可变区，其具有：组成为选自SEQ ID NO：1-7的氨基酸序列或与SEQ ID NO：1-7相比具有一、二、三、四或五个氨基酸取代、添加或缺失的氨基酸序列的VH CDR1区；具有选自SEQ ID NO：8-14的氨基酸序列或与SEQ ID NO：8-14相比具有一、二、三、四或五个氨基酸取代、添加或缺失的氨基酸序列的VHCDR2区；具有选自SEQ ID NO：15-21的氨基酸序列或与SEQ ID NO：15-21相比具有一、二、三、四或五个氨基酸取代、添加或缺失的氨基酸序列的VH CDR3区；具有选自SEQ ID NO：22-28的氨基酸序列或与SEQ IDNO：22-28相比具有一、二、三、四或五个氨基酸取代、添加或缺失的氨基酸序列的VL CDR1区；具有选自SEQ ID NO：29-35的氨基酸序列或与SEQ ID NO：29-35相比具有一、二、三、四或五个氨基酸取代、添加或缺失的氨基酸序列的VL CDR2区；以及具有选自SEQ ID NO：36-42的氨基酸序列或与SEQ ID NO：36-42相比具有一、二、三、四或五个氨基酸取代、添加或缺失的氨基酸序列的VLCDR3区。
嫁接抗原结合结构域到可选的构架或支架中
可应用多种抗体/免疫球蛋白构架或支架，只要得到的多肽包括至少一个特异性结合BAFFR的结合区。这类构架或支架包括人类免疫球蛋白的五个主要的独特型或其片段(例如本文别处公开的那些片段)，并包括其他动物物种的免疫球蛋白，优选地具有人源化特征。如在骆驼中鉴定的那些单一的重链抗体在这方面特别受关注。将由本领域的技术人员继续发现和开发新的构架、支架和片段。
一方面，本发明涉及使用可移植本发明的CDR于其上的非免疫球蛋白支架来产生基于非免疫球蛋白的抗体。可应用已知或未知的非免疫球蛋白构架和支架，只要它们包括SEQ ID NO：87的靶蛋白质的特异性结合区。这类化合物在本文中称为“包括靶标特异性结合区的多肽”。非免疫球蛋白构架的实例进一步描述在下文章节中(骆驼抗体和非抗体支架)。
骆驼抗体
获得自包括新界成员如美洲驼物种(骆驼(Lama paccos)、原驼(Lamaglama)和瘦驼(Lama vicugna))的骆驼和单峰骆驼家族成员(双峰驼(Camelus bactrianus)和Calelus dromaderius)的抗体蛋白质已为人类对象表征了大小、结构复杂性和抗原性。对于其他动物的抗体，自然界中发现的该家族哺乳动物的某些IgG抗体缺乏轻链，并因此在结构上明显不同于典型的含两条重链和两条轻链的四链四级结构。见PCT/EP93/02214(WO94/04678，公开于1994年3月3日)。
鉴定为VHH的小单链可变域的骆驼抗体区可通过基因工程获得以产生对靶标具有高亲和力的小蛋白质，结果形成已知为“骆驼抗体”的低分子量的源自抗体的蛋白质。见美国专利号5,759,808，出版于1998年6月2日，也见Stiilemans，B.等人2004 J Biol Chem 279：1256-1261，Dumoulin，M.等人，2003 Nature 424：783-788，Pleschberger，M.等人2003 BioconjugateChem 14：440-448，Cortez-Retamozo，V.等人2002 Int J Cancer 89：456-62，以及Lauwereys，M.等人1998 EMBO J 17：3512-3520。骆驼抗体和抗体片段的工程化文库通过商业途径获得，例如，来自Ablynx、Ghent、Belgium。与非人源的其他抗体一样，可重组改变骆驼抗体的氨基酸序列以获得更相似于人类序列的序列，即可将纳米抗体“人源化”。因此可将骆驼抗体对人类的天然低抗原性进一步降低。
骆驼抗体具有人类IgG分子的大约十分之一的分子量，并且该蛋白质具有仅仅几纳米的物理直径。小尺寸的一个结果是骆驼纳米抗体结合到对于较大抗体蛋白质是功能不可见的抗原位点的能力，即骆驼纳米抗体可用作检测抗原的试剂，否则使用典型的免疫学技术是隐蔽的，以及作为可能的治疗制剂。因此小尺寸的另一个结果是骆驼纳米抗体由于能够抑制结合到靶蛋白的凹槽或窄裂缝中的特异位点，因而能够提供比典型抗体更相似于典型低分子量药物的功能。
低分子量和紧凑尺寸进一步导致骆驼纳米抗体极端耐热，对极端pH和蛋白酶解消化稳定，并且是低抗原性的。另一个结果是骆驼纳米抗体易于从循环系统转移进组织，并且甚至穿过血脑屏障而可以治疗影响神经组织的病症。纳米抗体可进一步促进穿过血脑屏障的药物转运。参见美国专利申请20040161738，2004公开于8月19日。组合这些对人类低抗原性的特征显示很大的治疗潜力。另外，这些分子在原核细胞如大肠杆菌(E.coli)中可完整表达并且表达为与噬菌体的融合蛋白并具有功能。
因此，本发明的特征是对BAFFR具有高亲和力的骆驼抗体或纳米抗体。在本文的某些实施方案中，骆驼抗体或纳米抗体是在骆驼类动物中天然产生的，即用BAFFR或其肽片段免疫后的骆驼产生的，对其他抗体使用本文所述技术。备选地，抗BAFFR骆驼纳米抗体是改造的，即通过使用如本文实施例中所述的以BAFFR作为靶标的筛选程序，例如从展示适当诱变的骆驼纳米抗体蛋白质的噬菌体文库中选择来产生的。在一个实施方案中，本公开文本的抗体是骆驼源化(camelized)的，具有如本文公开的骆驼构架和VH CDR1、CDR2和/或CDR3区。改造的纳米抗体可进一步通过基因工程定制，使其在受体对象中具有从45分钟到两周的半寿期。在特定的实施方案中，通过将本发明的人抗体的重链或轻链CDR序列嫁接到例如PCT/EP93/02214中描述的纳米抗体或单一结构域抗体构架序列上，而获得骆驼抗体或纳米抗体。
非抗体支架
已知的非免疫球蛋白构架或支架包括但不限于Adnectin(纤连蛋白)(Compound Therapeutics，Inc.，Waltham，MA)、锚蛋白(MolecularPartners AG，Zurich，瑞士)、结构域抗体(Domantis，Ltd(Cambridge，MA)和Ablynx nv(Zwijnaarde，Belgium))、脂笼蛋白(Anticalin)(PierisProteolab AG，Freising，德国)、小型免疫药物(small modularimmuno-pharmaceutical)(Trubion Pharmaceuticals Inc.，Seattle，WA)、maxybodies(Avidia，Inc.(Mountain View，CA))、A蛋白(Afiibody AG，瑞典)以及affilin(γ-晶体蛋白或泛素)(Scil Proteins GmbH，Halle，德国)、蛋白质表位模拟物(Polyphor Ltd，Allschwil，Switzerland)。
(i)纤连蛋白支架
纤连蛋白支架优选的基于纤连蛋白III型结构域(例如纤连蛋白III型的第十模块(10Fn3结构域))。纤连蛋白III型结构域具有7或8条分布在两个β片层的β链，其中它们之间相互包装(pack against each other)以形成蛋白质核心，并且还包含互相连接β链并且暴露于溶剂的环(类似于CDR)。在β片层夹心层的每一边缘至少有三个这样的环，其中边缘是蛋白质垂直于β链方向的界线。(US 6,818,418)。
这些基于纤连蛋白的支架不是免疫球蛋白，尽管全部折叠密切涉及最小的功能性抗体片段——重链可变区，其包括骆驼和美洲驼IgG中的完整抗原识别单位。由于这种结构，非免疫球蛋白抗体模拟与抗体特性在本质上和亲和力上相似的抗原结合特性。可将这些支架用于体外的环随机化和改组策略中，其与体内抗体亲和力成熟过程相似。这些基于纤连蛋白的分子可用作支架，其中使用标准克隆技术可将分子的环区用本发明的CDR置换。
(ii)锚蛋白-分子伴侣
该技术基于使用具有锚蛋白来源的重复模块的蛋白质作为携带可变区的支架，其可用于结合到不同靶标。锚蛋白重复模块是由两个反平行的α-螺旋和β-转角构成的33个氨基酸多肽。可变区的结合主要通过使用核糖体展示来最优化。
(iii)Maxybodies/Avimer-Avidia
Avimer源自包含蛋白质如LRP-1的天然结构域A。这些结构域本来是用于蛋白质-蛋白质相互作用并且在人中超过250个蛋白质中结构性基于结构域A。由大量不同的经由氨基酸键连接的“A结构域”单体(2-10)构成Avimer。使用描述于例如20040175756、20050053973、20050048512以及20060008844中的方法能够产生可结合到目的抗原的Avimer。
(vi)A蛋白-亲和体(affibody)
亲和配基是小型的、简单的蛋白质，其组成为基于A蛋白的一种IgG结合结构域的支架的三个螺旋束。A蛋白是细菌金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)的表面蛋白。该支架域由58个氨基酸构成，其中的13个随机产生含大量配体变体的文库(参见例如US5,831,012)。分子模拟抗体，与150kDa分子量的抗体相比，它们具有6kDa的分子量。虽然它的尺寸小，但分子的结合位点与抗体的结合位点相似。
(v)Anticalin-Pieris
是由Pieris ProteoLab AG公司开发的产品。它们源自脂笼蛋白，一组分布广泛的小而强力的蛋白质，该蛋白质通常涉及化学敏感的或不溶的化合物的生理转运或贮藏。某些天然的脂笼蛋白产生于人类组织或体液中。
该蛋白质构造让人联想到具有刚性构架顶部高变环的免疫球蛋白。然而，与抗体或其重组片段相反，脂笼蛋白由含160至180个氨基酸残基的单一多肽链构成，仅在边缘比单一免疫球蛋白结构域更大些。
一套四个环组成结合口袋，显示显著的结构可塑性并耐受多种侧链。可因此在专有的程序中改造结合位点以识别指定的具有高亲和力和特异性的不同形状的靶分子。
通过诱变一套四个环，脂笼蛋白家族的一种蛋白质，甘兰菜粉蝶(PierisBrassicae)的胆汁三烯结合蛋白(BBP)已用于开发Anticalin。描述“Anticalin”的专利申请书的一个实例是PCT WO 199916873。
(vi)Affilin-Scil蛋白质
AffilinTM分子是设计成对蛋白质和小分子具有特异亲和力的小的非免疫球蛋白蛋白质。新的AffilinTM分子可从两个文库中非常迅速地筛选出，每一文库都是基于源自不同人类的支架蛋白质。
AffilinTM分子未显示与免疫球蛋白蛋白质的任何结构同源性。Sell蛋白质使用两种AffilinTM支架，其中一种是γ-晶体蛋白，人类结构性眼晶状体蛋白质以及另一种是“泛素”超家族蛋白质。两种人类支架都非常小，显示高温稳定性并且几乎能抵抗pH变化和变性剂。这种高稳定性主要是由于蛋白质的延展β片层结构。源自蛋白质的γ-晶体蛋白的实例描述于WO200104144中并且“泛素样”蛋白质的实例描述于WO2004106368中。
(vii)蛋白质表位模拟物(PEM)
PEM是中等大小的、环状的肽样分子(MW 1-2kDa)，模拟蛋白质的β发夹二级结构，是参与蛋白质-蛋白质相互作用的主要二级结构。
构架或Fc改造
本发明的经改造的抗体包括这样的抗体，其中已经对VH和/或VL内的构架残基进行修饰以例如改善抗体的性质。通常，进行此类构架修饰以降低抗体的免疫原性。例如，一种方法是“回复突变”一个或多个构架残基成对应的种系序列。更特别地，已经经历体细胞突变的抗体可以含有与该抗体所来源的种系序列不同的构架残基。通过比较抗体构架序列与该抗体所来源的种系序列可以鉴定此类残基。为了使构架区序列回复到它们的种系构型，可以例如通过位点定向诱变或PCR介导的诱变将体细胞突变“回复突变”成种系序列。此类“回复突变”抗体也意在被本发明包括。
另一类型的构架修饰涉及突变构架区内，或者甚至一个或多个CDR区内的一个或多个残基，以除去T细胞表位，从而降低抗体的潜在免疫原性。该方法也称作“去免疫”并且在Carr等人的美国专利公布号20030153043中进一步详细描述。
作为在构架或CDR区内进行修饰，额外或备选地可以改造本发明的抗体以包括Fc区内的修饰，通常改变抗体的一种或多种功能性质，如血清半寿期、补体固定、Fc受体结合，和/或抗原依赖性细胞毒性。此外，本发明的抗体可以被化学修饰(例如，一个或多个化学部分可以连接到抗体)或经修饰而改变它的糖基化，再次改变该抗体的一种或多种功能性质。这些实施方案的每一个都在下面详细描述。Fc区内的残基编号为Kabat的EU指数编号。
在一个实施方案中，修饰CH1的铰链区使得改变，例如，增加或减少铰链区中半胱氨酸残基的数目。该方法在Bodmer等人的美国专利号5,677,425中进一步描述。改变CH1的铰链区中的半胱氨酸残基数目以例如方便轻链和重链的装配或增加或降低抗体的稳定性。
在另一实施方案中，将抗体的Fc铰链区突变以降低该抗体的生物学半寿期。更具体地，将一个或多个氨基酸突变导入Fc-铰链片段的CH2-CH3结构域界面区，使得该抗体相对于天然Fc铰链结构域SpA结合具有受损的葡萄球菌A蛋白(SpA)结合。该方法在Ward等人的美国专利号6,165,745中进一步详细描述。
在另一实施方案中，修饰抗体以增加其生物学半寿期。多种方法是可能的。例如，可以导入一个或多个下面的突变：T252L、T254S、T256F，如Ward的美国专利号6,277,375所述。备选地，为了延长生物学半寿期，可以在抗体的CH1或CL区内改变以含有从IgG的Fc区的CH2结构域的两个环得到的回复受体结合表位，如Presta等人的美国专利号5,869,046和6,121,022中描述。
在其他实施方案中，通过将至少一个氨基酸残基用不同的氨基酸残基置换以改变抗体的效应功能来改变Fc区。例如，一个或多个氨基酸可以用不同的氨基酸残基置换，使得该抗体对于效应配体具有改变的亲和力但是保留亲本抗体的抗原结合能力。改变亲和力的效应配体可以是例如，Fc受体或补体的C1组分。该方法在Winter等人的美国专利号5,624,821和5,648,260中进一步详述。
在另一实施方案中，选自氨基酸残基的一个或多个氨基酸可以用不同氨基酸残基置换使得该抗体具有改变的C1q结合和/或减小或消除的补体依赖性细胞毒性(CDC)。该方法在Idusogie等人的美国专利号6,194,551中进一步详述。
在另一实施方案中，改变一个或多个氨基酸残基以改变该抗体固定补体的能力。该方法在Bodmer等人的PCT公布WO 94/29351中进一步描述。
在另一实施方案中，通过修饰一个或多个氨基酸修饰Fc区以增加该抗体介导抗体依赖性细胞毒性(ADCC)和/或增加抗体对Fcγ受体的亲和力。该方法在Presta的PCT公布号WO 00/42072中进一步描述。此外，已经为人IgG1对FcγRl、FcγRII、FcγRIII和FcRn的结合位点作图并且已经描述了具有改善的结合的变体(见Shields，R.L.等人，2001 J.Biol.Chen.276：6591-6604)。
在另一实施方案中，修饰抗体的糖基化。例如，可以制备无糖基化抗体(即，缺少糖基化的抗体)。可以改变糖基化以例如，增加抗体对“抗原”的亲和力。此类糖类修饰可以通过例如改变抗体序列内一个或多个糖基化位点完成。例如，可以进行一个或多个氨基酸取代，其导致去除一个或多个可变区构架糖基化位点，从而去除该位点的糖基化。此类无糖基化可以增加抗体对抗原的亲和力。这种方法在Co等人的美国专利号5,714,350和6,350,861中进一步详细描述。
额外或备选地，可以制备具有改变类型的糖基化的抗体，如具有减少量的或没有岩藻糖残基的低岩藻糖基化或非岩藻糖基化的抗体，或者具有增加的等分GlcNac结构的抗体。已经表明此类改变的糖基化模式增加抗体的ADCC能力。通过例如在具有改变的糖基化系统的宿主细胞中表达抗体完成此类糖类修饰。具有改变的糖基化系统的细胞已经在本文中描述并且可以用作宿主细胞，在其中表达本发明的重组抗体从而产生具有改变的糖基化的抗体。例如，Hang等人的EP 1,176,195描述了具有功能被破坏的FUT8基因的细胞系，所述FUT8基因编码岩藻糖基转移酶，使得在这种细胞系中表达的抗体显示出低岩藻糖基化或缺少岩藻糖残基。因此，在一个实施方案中，通过在表现出低岩藻糖基化或非岩藻糖基化模式的细胞系中重组表达，来生产本发明的抗体，例如缺乏表达编码岩藻糖基转移酶的FUT8基因的哺乳动物细胞系。Presta的PCT公开WO 03/035835描述了变体CHO细胞系Lecl3细胞，其将岩藻糖连接到Asn(297)-连接的糖类的能力降低，也导致在该宿主细胞中表达的抗体的低岩藻糖化(也见Shields，R.L.等人，2002 J.Biol.Chem.277：26733-26740)。Umana等人的PCT公开WO 99/54342描述了细胞系，其被改造而表达修饰糖蛋白的岩藻糖基转移酶(例如，β(1，4)-N乙酰基葡糖胺基转移酶III(GnTIII)，使得在该改造细胞系中表达的抗体显示出增加的等分GlcNac结构，其导致抗体增加的ADCC活性(也见Umana等人，1999 Nat.Biotech.17：176-180)。Eureka Therapeutics进一步描述了遗传改造的CHO哺乳动物细胞，其能够生产具有改变的哺乳动物糖基化模式的抗体，所述抗体缺少岩藻糖残基(http://www.eurekainc.com/about_us/companyoverview.html)。可选的，可以在酵母或丝状真菌中生产本发明的抗体，所述酵母或丝状真菌经改造具有哺乳动物样糖基化模式，并能够生产作为糖基化模式缺少岩藻糖的抗体(参见例如EP1297172B1)。
本发明设想的本文抗体的另一种修饰是聚乙二醇化。可以将抗体聚乙二醇化，例如，以延长该抗体的生物学(例如，血清)半寿期。为了聚乙二醇化抗体，通常将该抗体或其片段与聚乙二醇(PEG)，如PEG的活性酯或醛衍生物在这样的条件下反应，在所述条件下，一个或多个PEG基团变得附着到抗体或抗体片段。通过用反应性PEG分子(或其类似的反应性水溶性聚合物)进行酰化反应或烷基化反应，可以进行聚乙二醇化。本文所用的术语“聚乙二醇”意在包括任一形式的PEG，其已经被用于衍生其他蛋白质，如单(C1-C10)烷氧基-或芳氧基聚乙二醇或者聚乙二醇-马来酰亚胺。在一些实施方案中，待聚乙二醇化的抗体是无糖基化的抗体。聚乙二醇化蛋白质的方法是本领域已知的，并且可以应用于本发明的抗体。见例如，Nishimura等人的EP 0 154 316和Ishikawa等人的EP 0 401 384。
本发明设想的抗体的另一种修饰是至少本发明抗体的抗原结合区与血清蛋白(例如人血清白蛋白或其片段)的缀合或蛋白质融合，以增加所获得分子的半寿期。此类方法描述在例如Balance等人，EP0322094。
另一种可能性是至少本发明抗体的抗原结合区与能够结合血清蛋白(例如人血清白蛋白)的蛋白质的融合，以增加所获得分子的半衰期。此类方法描述在例如Nygren等人，EP0 486 525。
改造改变的抗体的方法
如上面讨论，具有本文所示的VH和VL序列，或全长重链和轻链序列的抗BAFFR抗体可以用于通过修饰全长重链和/或轻链序列、VH和/或VL序列或其连接的恒定区而产生新的抗BAFFR抗体。从而，在本发明的另一方面，本发明的抗BAFFR抗体的结构特征用于产生结构相关的抗BAFFR抗体，其保留本发明抗体的至少一种功能性质，如结合人BAFFR，以及还抑制BAFFR的一种或多种功能性质(例如，拮抗剂活性、B细胞排除活性)。
例如，本发明抗体的一个或多个CDR区或其突变可以与已知的构架区和/或其他CDR重组组合，以产生如上文讨论的额外的重组改造的抗BAFFR抗体。其他类型的修饰包括前面部分中描述的那些修饰。用于改造方法的起始材料是本文提供的一种或多种VH和/或VL序列，或者其一个或多个CDR区。为了产生改造的抗体，不必实际上制备(即，作为蛋白质表达)具有本文提供的一个或多个VH和/或VL序列或其一个或多个CDR区的抗体。相反，将序列中所含的信息用作起始材料产生来自最初序列的“第二代”序列，然后制备“第二代”序列并表达为蛋白质。
因此，在另一实施方案中，本发明提供制备抗BAFFR抗体的方法，所述抗BAFFR抗体由重链可变区抗体序列和轻链可变区抗体序列组成，所述重链可变区抗体序列具有选自SEQ ID NO：1-7的CDR1序列，选自SEQ ID NO：8-14的CDR2序列和/或选自SEQ ID NO：15-21的CDR3序列；所述轻链可变区抗体序列具有选自SEQ ID NO：22-28的CDR1序列，选自SEQ ID NO：29-35的CDR2序列和/或选自SEQ ID NO：36-42的CDR3序列；改变所述重链可变区抗体序列和/或轻链可变区抗体序列内的至少一个氨基酸残基以产生至少一个改变的抗体序列；并将该改变的抗体序列表达为蛋白质。
因此，在另一实施方案中，本发明提供制备在哺乳动物细胞系中就表达被优化的抗BAFFR抗体的方法，所述抗BAFFR抗体由全长重链抗体序列和全长轻链抗体序列组成，所述全长重链抗体序列具有选自SEQ IDNO：75-78的序列；所述全长轻链抗体序列具有选自SEQ ID NO：71-74的序列；改变所述全长重链抗体序列和/或全长轻链抗体序列内的至少一个氨基酸残基以产生至少一个改变的抗体序列；并将该改变的抗体序列表达为蛋白质。
还可以通过筛选抗体文库来制备改变的抗体序列，所述文库具有选自SEQ ID NO：15-21和SEQ ID NO：36-42的固定的CDR3序列，或在US20050255552中描述的最小必需结合决定子以及在CDR1和CDR2序列上的多样性。可以根据任何适合从抗体文库中筛选抗体的筛选技术实施筛选，例如，噬菌体展示技术。
可以用标准分子生物学技术制备和表达改变的抗体序列。所改变的抗体序列编码的抗体是保留本文所述的抗BAFFR抗体的一种、一些或所有功能性质的抗体，其功能性质包括但不限于，特异性结合人BAFFR；和/或抑制BLyS诱导的B细胞增殖、BLyS诱导的B或BLyS诱导的IgG1生产；和/或在体外或体内排除人B细胞。
所改变的抗体可以显示出一种或多种、两种或多种，或三种或多种上面讨论的功能性质。
可以使用本领域中可得的和/或本文所述的标准测定法，如实施例中给出的那些(例如，ELISA)评估改变的抗体的功能性质。
在改造本发明抗体的方法的一些实施方案中，可以沿着抗BAFFR抗体编码序列的全部或者部分随机或者选择性导入突变，并可以对得到的经修饰的抗BAFFR抗体筛选如本文所述的结合活性和/或其他功能性质。突变方法已经在本领域描述。例如，Short的PCT公布WO 02/092780描述了使用饱和诱变、合成连接装配，或者其组合产生和筛选抗体突变的方法。备选地，Lazar等人的PCT公布WO 03/074679描述了使用计算机筛选方法优化抗体的理化性质的方法。
编码本发明抗体的核酸分子
本发明的另一方面涉及编码本发明抗体的核酸分子。就在哺乳动物细胞中表达而被优化的全长轻链核苷酸序列的实例示于SEQ ID NO：83-86中。就在哺乳动物细胞中表达而被优化的全长重链核苷酸序列的实例示于SEQ ID NO：79-82中。
核酸可以存在于完整细胞、细胞裂解物中，或者可以是部分纯化或者基本上纯的形式。当通过标准技术纯化核酸以除去其他细胞组分或其他污染物，例如，其他细胞核酸或蛋白质时，核酸是“分离的”或“使得基本上纯的”，所述标准技术包括碱/SDS处理、CsCl分带(binding)、柱层析、琼脂糖凝胶电泳和本领域公知的其他技术。见F.Ausubel，等人，编著，1987Current Protocols in Molecular Biology，Greene Publishing and WileyInterscience，New York。本发明的核酸可以是例如DNA或RNA，并且可以含有或不含有内含子序列。在一个实施方案中，核酸是cDNA分子。核酸可以存在于载体，如噬菌体展示载体，或者重组质粒载体中。
可以使用标准分子生物学技术得到本发明的核酸。对于杂交瘤(例如，如下文进一步描述的携带人免疫球蛋白基因的转基因小鼠制备的杂交瘤)表达的抗体，编码通过杂交瘤制备的抗体的重链和轻链的cDNA可以通过标准PCR扩增或cDNA克隆技术得到。对于从免疫球蛋白基因文库(例如，使用噬菌体展示技术)得到的抗体，可以从作为文库成员的多种噬菌体克隆回收编码所述抗体的核酸。
一旦得到编码VH和VL区段的DNA片段，就可以通过标准重组DNA技术进一步操作这些DNA片段，例如，以将可变区基因转变成全长抗体链基因、Fab片段基因，或者scFv基因。在这些操作中，编码VL-或VH的DNA片段有效连接到另一DNA分子，或者编码另一蛋白质的片段，如抗体恒定区或柔性接头。该上下文中使用的术语“有效连接”意指两个DNA片段以功能性方式连接，例如，使得这两个DNA片段编码的氨基酸序列保持符合读框，或者使得该蛋白质在所希望的启动子控制下表达。
可以将编码VH区的分离的DNA转变成全长重链基因，通过将VH编码DNA有效连接到编码重链恒定区(CH1、CH2和CH3)的另一DNA分子实现所述转变。人重链恒定区基因的序列是本领域已知的(见例如，Kabat，E.A.，等人，1991 Sequences of Proteins of Immunological Interest，第五版，U.S.Department of Health and Human Services，NIH Publication No.91-3242)，并且可以通过标准PCR扩增得到包含这些区域的DNA片段。重链恒定区可以是IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、IgE、IgM或IgD恒定区。在一些实施方案中，重链恒定区选自IgG1同种型。对于Fab片段重链基因，可以将编码VH的DNA有效连接至编码仅仅重链CH1恒定区的另一DNA分子。
通过将VL编码DNA有效连接到编码轻链恒定区CL的另一DNA分子，可以将分离的编码VL区的DNA转变成全长轻链基因(以及Fab轻链基因)。人轻链恒定区基因的序列是本领域已知的(见例如，Kabat，E.A.，等人，1991 Sequences of Proteins of Immunological Interest，第五版，U.S.Department of Health and Human Services，NIH Publication No.91-3242)并且包含这些区的DNA片段可以通过标准DNA扩增得到。轻链恒定区可以是κ或λ恒定区。
为了产生scFv基因，可以将编码VH和VL的DNA片段有效连接到编码柔性接头，例如，编码氨基酸序列(Gly4-Ser)3的另一片段，使得VH和VL序列可以作为连续的单链蛋白质表达，通过柔性接头连接VL和VH区(见，例如，Bird等人，1988 Science 242：423-426；Huston等人，1988 Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85：5879-5883；McCafferty等人，1990 Nature348：552-554)。
本发明单克隆抗体的产生
可以通过多种技术产生单克隆抗体(mAb)，所述技术包括常规的单克隆抗体方法，例如，Kohler和Milstein，1975 Nature 256：495的标准体细胞杂交技术。可以使用多种用于产生单克隆抗体的技术，例如，B淋巴细胞的病毒或癌基因转化。
用于制备杂交瘤的动物系统是鼠系统。在小鼠中的杂交瘤产生是成熟的方法。用于分离用于融合的经免疫的脾细胞的免疫方案和技术是本领域已知的。融合配偶体(例如，鼠骨髓瘤细胞)和融合步骤也是已知的。
可以基于如上述制备的鼠单克隆抗体的序列制备本发明的嵌合或人源化抗体。编码重链和轻链免疫球蛋白的DNA可以从目的鼠杂交瘤得到并使用标准分子生物学技术改造成含有非鼠(例如人)免疫球蛋白序列。例如，为了产生嵌合抗体，可以使用本领域已知的方法将鼠可变区连接到人恒定区(见，例如，Cabilly等人的美国专利号4,816,567)。为了产生人源化抗体，可以使用本领域已知的方法将鼠CDR区插入到人构架区。见例如，Winter的美国专利号5,225,539和Queen.等人的美国专利号5,530,101；5,585,089；5,693,762和6；180；370。
在某一实施方案中，本发明的抗体是人单克隆抗体。可以使用携带部分人免疫系统而不是小鼠免疫系统的转基因或转染色体小鼠产生针对BAFFR的此类人单克隆抗体。这些转基因和转染色体小鼠包括在本文中分别称作HuMAb小鼠和KM小鼠的小鼠，并且它们在本文中统称为“人Ig小鼠”。
HuMAb(Medarex，Inc.)含有人免疫球蛋白基因小基因座(miniloci)，其编码未重排的人重链(μ和γ)和κ轻链免疫球蛋白序列，以及定向突变，其失活内源μ和κ链基因座(见例如，Lonberg，等人，1994Nature 368(6474)：856-859)。因此，小鼠显示出小鼠IgM或κ的降低的表达，并且在应答免疫时，所导入的人重链和轻链转基因经历类别转换和体细胞突变以产生高亲和性人IgGκ单克隆抗体(Lonberg，N.等人，1994上文；Lonberg，N.，1994 Handbook of Experimental Pharmacology113：49-101；Lonberg，N.和Huszar，D.，1995 Intern.Rev.Immunol.13：65-93，和Harding，F.和Lonberg，N.，1995 Ann.N.Y.Acad.Sci.764：536-546中综述)。HuMAb小鼠的制备和用途，和此类小鼠携带的基因组修饰在Taylor，L.等人，1992 Nucleic Acids Research 20：6287-6295；Chen，J.等人，1993 International Immunology 5：647-656；Tuaillon等人，1993 Proc.Natl.Acad.Sci.USA 94：3720-3724；Choi等人，1993 NatureGenetics 4：117-123；Chen，J.等人，1993 EMBO J.12：821-830；Tuaillon等人，1994 J.Immunol.152：2912-2920；Taylor，L.等人，1994International Immunology 579-591；和Fishwild，D.等人，1996 NatureBiotechnology 14：845-851中进一步描述。还见，Lonberg和Kay的美国专利号5,545,806；5,569,825；5,625,126；5,633,425；5,789,650；5,877,397；5,661,016；5,814,318；5,874,299；和5,770,429；Surani等人的美国专利号5,545,807；和Lonberg和Kay的PCT公开号WO 92103918、WO 93/12227、WO 94/25585、WO 97113852、WO 98/24884和WO 99/45962；和Korman等人的PCT公开号WO 01/14424。
在另一实施方案中，使用在转基因或转染色体上携带人免疫球蛋白序列的小鼠，如携带人重链转基因和人轻链转染色体的小鼠产生本发明的人抗体。此类小鼠在本文中称作“KM小鼠”，在Ishida等人的PCT公布号WO 02/43478中详细描述。
此外，表达人免疫球蛋白基因的备选的转基因动物系统可以在本领域中得到并且可以用于产生本发明的抗BAFFR抗体。例如，可以使用称作Xenomouse(Abgenix，Inc.)的备选转基因系统；此类小鼠在例如Kucherlapati等人的美国专利号5,939,598；6,075,181；6,114,598；6,150,584和6,162,963中描述。
此外，表达人免疫球蛋白基因的备选的转染色体动物系统可以在本领域中获得并且可以用于产生本发明的抗BAFFR抗体。例如，可以使用称作“TC小鼠”的携带人重链转染色体和人轻链转染色体的小鼠；此类小鼠在Tomizuka等人，2000 Proc.Natl.Acad.Sci.USA 97：722-727中描述。此外，携带人重链和轻链转染色体的奶牛已经在本领域描述(Kuroiwa等人，2002 Nature Biotechnology 20：889-894)并且可以用于产生本发明的抗BAFFR抗体。
也可以使用筛选人免疫球蛋白基因文库的噬菌体展示方法制备本发明的人重组抗体。此类用于分离人抗体的噬菌体展示方法在本领域中建立或描述在下列实施例中。见例如：Ladner等人的美国专利号5,223,409；5,403,484；和5,571,698；Dower等人的美国专利号5,427,908和5,580,717；McCafferty等人的美国专利号5,969,108和6,172,197；和Griffiths等人的美国专利号5,885,793；6,521,404；6,544,731；6,555,313；6,582,915和6,593,081。
也可以使用其中已经重建了人免疫细胞的SCID小鼠制备本发明的人单克隆抗体，从而当免疫时可以产生人抗体应答。此类小鼠在例如Wilson等人的美国专利号5,476,996和5,698,767中描述。
产生人单克隆抗体的杂交瘤的制备
为制备产生本发明的人单克隆抗体的杂交瘤，可将免疫小鼠的脾细胞和/或淋巴腺细胞分离并融合到合适的永生化细胞系，如小鼠骨髓瘤细胞。得到的杂交瘤可筛选用于产生抗原特异性抗体。例如，可将免疫小鼠的脾脏淋巴细胞的单细胞悬浮液用50％PEG融合到六分之一量的P3X63-Ag8.653非分泌性小鼠骨髓瘤细胞(ATCC，CRL 1580)。细胞在平底微量滴定板中以约2x 145涂布，接下来在含20％胎克隆血清、18％“653”条件培养基、5％origen(IGEN)、4mM L-谷氨酰胺、1mM丙酮酸钠、5mMHEPES、0:055mM 2-巯基乙醇、50单位/ml青霉素、50mg/ml链霉素、50mg/ml庆大霉素和IX HAT(Sigma；融合后24h加入HAT)的选择性培养基中温育两周。约两周后，细胞可培养于其中的HAT培养基替换为HT培养基中。然后单独的孔通过ELISA来筛选人类单克隆IgM和IgG抗体。只要发生广泛的杂交瘤生长，通常就在10-14天后观测培养基。抗体分泌性杂交瘤重涂布、再次筛选，并且如果仍然对人类IgG呈阳性，则可将单克隆抗体通过限制性稀释进行至少两次亚克隆。然后将稳定的亚克隆于体外培养，用以在组织培养基中产生小量抗体用于表征。
为纯化人单克隆抗体，可将选择的杂交瘤在两升搅拌式培养瓶中生长以纯化单克隆抗体。采用A蛋白-琼脂糖凝胶(Pharmacia，Piscataway，N.J.)的亲和色谱法前可过滤和浓缩上清液。洗脱的IgG可通过凝胶电泳和高效液相色谱检测以确保纯度。缓冲溶液可调换成PBS，并且浓度可通过使用消光系数为1.43的OD280来测定。可将单克隆抗体等分并储存于-80℃。
产生单克隆抗体的转染瘤的制备
还可以在宿主细胞转染瘤中产生本发明的抗体，使用例如，本领域公知的重组DNA技术和基因转染方法的组合(例如，Morrison，S.(1985)Science 229：1202)。
例如，为了表达抗体，或者其抗体片段，可以通过标准分子生物学技术(例如，PCR扩增或cDNA克隆，使用表达目的抗体的杂交瘤)可以得到编码部分或全长轻链和重链的DNA，并且可以将DNA插入到表达载体中，使得基因有效连接到转录和翻译控制序列。在该上下文中，术语“有效连接”意指抗体基因连接到载体中，从而载体内的转录和翻译控制序列发挥它们调节抗体基因转录和翻译的预期功能。选择表达载体和表达控制序列以与所用的表达宿主细胞相容。可以将抗体轻链基因和抗体重链基因插入到单独的载体，或者更典型地，可以将两种基因插入到相同的表达载体中。通过标准方法向表达载体中插入抗体基因(例如，在抗体基因片段或载体上连接互补限制性位点，或者如果不存在限制性位点，那么为平末端连接)。本文所述抗体的轻链和重链可变区可以用于产生任何抗体同种型的全长抗体基因，通过将所述基因插入到已经编码所希望同种型的重链恒定区和轻链恒定区的表达载体中，使得VH区段有效连接载体内的CH区段并且VL区段有效连接载体内的CL区段，可以实现所述产生。额外或备选地，重组表达载体可以编码信号肽，其方便抗体链从宿主细胞的分泌。可以将抗体链基因克隆到载体中使得信号肽与抗体链基因的氨基末端符合读框地连接。信号肽可以是免疫球蛋白信号肽或异源信号肽(即，来自非免疫球蛋白蛋白质的信号肽)。
除了抗体链基因外，本发明的重组表达载体还可以携带控制抗体链基因在宿主细胞中表达的调节序列。术语“调节序列”意在包括启动子、增强子和其他表达控制元件(例如，多聚腺苷酸化信号)，其控制抗体链基因的转录或翻译。此类调节序列描述于例如Goeddel(Gene ExpressionTechnology.Methods in Enzymology 185，Academic Press，San Diego，CA1990)。本领域技术人员将明白表达载体的设计，包括调节序列的选择，可以依赖于此类因素，如待转化的宿主细胞的选择、所希望的蛋白质表达水平，等等。哺乳动物宿主细胞表达的调节序列包括指导哺乳动物细胞中高水平蛋白质表达的病毒元件，如启动子和/或增强子，其来自巨细胞病毒(CMV)、猿猴病毒40(SV40)、腺病毒(例如，腺病毒主要晚期启动子(AdMLP))，和多瘤。备选地，可以使用非病毒调节序列，如泛蛋白启动子或P珠蛋白启动子。此外，由不同来源的序列组成的调节元件，如SRa启动子系统，其含有来自SV40早期启动子的序列和人T细胞白血病病毒1型的长末端重复的序列(Takebe，Y.等人，1988 Mol.Cell.Biol.8：466-472)。
除了抗体链基因和调节序列外，本发明的重组表达载体可以携带额外的序列，如调节宿主细胞中载体复制的序列(如复制原点)和选择标记基因。选择标记基因方便已经导入载体的宿主细胞的选择(见，例如，Axel等人的美国专利号4,399,216，4,634,665和5,179,017)。例如，通常，选择标记基因对已经导入载体的宿主细胞赋予对药物(如G418、潮霉素或氨甲蝶呤)的抗性。选择标记基因包括二氢叶酸还原酶(DHFR)基因(用于dhfr-宿主细胞，使用氨甲蝶呤选择/扩增)和neo基因(用于G418选择)。
对于轻链和重链的表达，通过标准技术将编码重链和轻链的表达载体转染到宿主细胞。术语“转染”的多种形式意在包括常用于向原核或真核宿主细胞中导入外源DNA的多种技术，例如，电穿孔、磷酸钙沉淀、DEAE-葡聚糖转染等等。在理论上可能在原核或真核宿主细胞中表达本发明的抗体。讨论了抗体在真核细胞，尤其哺乳动物宿主细胞中的表达，因为此类真核细胞，尤其哺乳动物细胞，比原核细胞更可能装配和分泌正确折叠的和免疫活性抗体。已经报导抗体基因的原核表达对于产生高产量的活性抗体是无效的(Boss，M.A.和Wood，C.R.，1985 Immunology Today6：12-13)。
用于表达本发明的重组抗体的哺乳动物宿主细胞包括中国仓鼠卵巢(CHO)细胞(包括dhfr-CHO细胞，描述于Urlaub和Chasin，1980 Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77：4216-4220，使用DH FR选择标记，如R.J.Kaufman和P.A.Sharp，1982 Mol.Biol.159：601-621中描述)、NSO骨髓瘤细胞、COS细胞和SP2细胞。具体地，为使用NSO骨髓瘤细胞，另一种表达系统是示于WO 87/04462，WO 89/01036和EP 338,841中的GS基因表达系统。在一个实施方案中，用于表达本发明的重组抗体的哺乳动物宿主细胞包括缺乏FUT8基因表达的哺乳动物细胞系，例如US6,946,292B2中描述的。当将编码抗体基因的重组表达载体导入哺乳动物宿主细胞时，通过培养宿主细胞足够允许抗体在宿主细胞中表达的时间或者将抗体分泌到宿主细胞所生长的培养基中来产生抗体。可以使用标准蛋白质纯化方法从培养基回收抗体。
免疫缀合物
另一方面，本发明的特征是抗BAFFR抗体，或其片段，其与治疗部分缀合，例如细胞毒素、药物(如免疫抑制剂)或放射性毒素。此类缀合物在本文中称为“免疫缀合物”。包括一种或多种细胞毒素的免疫缀合物称为“免疫毒素”。细胞毒素或细胞毒性剂包括对细胞有害(例如杀死细胞)的任何活性剂。实例包括taxon、细胞松弛素B(cytochalasin B)、短杆菌肽D(gramicidin D)、溴化乙啶(ethidium bromide)、依米丁(emetine)、丝裂霉素(mitomycin)、依托泊苷(etoposide)、tenoposide、长春新碱(vincristine)、长春碱(vinblastine)、秋水仙碱(t.colchicin)、多柔比星(doxorubicin)、柔红霉素(daunorubicin)、二羟基炭疽菌素二酮(dihydroxyanthracin dione)、米托蒽醌(mitoxantrone)、光辉霉素(mithramycin)、放线菌素D(actinomycin D)、1-去氢睾酮(1-dehydrotestosterone)、糖皮质激素(glucocorticoids)、普鲁卡因(procaine)、丁卡因(tetracaine)、利多卡因(lidocaine)、普萘洛尔(propranolol)和嘌罗霉素(puromycin)及其类似物或同源物。治疗剂还包括例如：抗代谢物(例如，氨甲蝶呤(methotrexate)、6-巯嘌呤(6-mercaptopurine)、6-硫鸟嘌呤(6-thioguanine)、阿糖胞苷(cytarabine)、5-氟脲嘧啶氮烯咪胺(5-fluorouracil decarbazine))、剥离剂(ablating agents)(例如，氮芥(mechlorethamine)、thioepa chloraxnbucil、美法仑(meiphalan)、卡莫司汀(carmustine(BSNU))和洛莫司汀(lomustine(CCNU))、cyclothosphamide、白消安(busulfan)、二溴甘露醇(dibromomannitol)、链脲霉素(streptozotocin)、丝裂霉素C(mitomycin C)和顺二氯二胺铂(II)(DDP)顺铂(cis-dichlorodiamine platinum(II)(DDP)cisplatin)、蒽环类(anthracyclines)(例如，柔红霉素(daunorubicin)(原名道诺霉素(daunomycin))和多柔比星(doxorubicin))、抗生素(例如，放线菌素D(dactinomycin)(原名放线菌素(actinomycin))、博来霉素(bleomycin)、光辉霉素(mithramycin)和安曲霉素(anthramycin(AMC))，和抗有丝分裂剂(例如，长春新碱(vincristine)和长春碱(vinblastine))。
可以与本发明的抗体缀合的治疗性细胞毒素的其它实例包括多卡米星(duocarmycin)、加利车霉素(calicheamicin)、美坦辛(maytansine)和auristatins，及其衍生物。加利车霉素抗体缀合物的实例是可商购的(MylotargTm；Wyeth-Ayerst)。
可以利用本领域现有的接头技术将细胞毒素与本发明的抗体缀合。已用于缀合细胞毒素和抗体的接头类型的实例包括但不限于：腙、硫醚、酯、二硫化物和含肽的接头。可以选择的接头是例如对溶酶体区室内的低pH切割敏感的，或对蛋白酶切割敏感的，例如优选的在肿瘤组织中表达的蛋白酶，如组织蛋白酶(如，组织蛋白酶B、C、D)。
对于细胞毒素类型、接头和缀合治疗剂与抗体的方法的其它讨论，也参见Saito，G.等人，2003 Adv.Drug Deliv.Rev.55：199-215；Trail，P.A.等人，2003 Cancer Immunol.Immunother.52：328-337；Payne，G.，2003Cancer Cell 3：207-212；Allen，T.M.，2002 Nat.Rev.Cancer 2：750-763；Pastan，I.和Kreitman，R.J.，2002 Curr.Opin.Investig.Drugs3：1089-1091；Senter，P.D.和Springer，C.J.，2001 Adv.Drug Deliv.Rev.53：247-264。
本发明的抗体还可以与放射性同位素缀合，产生细胞毒性的放射性药物，还称为放射性免疫缀合物。可以与用于诊断或治疗的抗体缀合的放射性同位素的实例包括对不限于：碘131、铟111、钇90和镥177。用于制备放射性免疫缀合物的方法是本领域已建立的。放射性免疫缀合物的实例是可商购的，包括ZevalinTM(DEC Pharmaceuticals)和BexxarTM(CorixaPharmaceuticals)，并可以使用相似的方法利用本发明的抗体制备放射性免疫缀合物。
本发明的抗体缀合物可用于修饰给定的生物学应答，且药物部分不视为限于经典的化学治疗剂。例如，药物部分可以是具有理想生物学活性的蛋白质或多肽。此类蛋白质可以包括例如酶促活性的毒素，或其活性片段，例如相思豆毒蛋白、蓖麻毒蛋白A、假单胞菌外毒素或白喉毒素；蛋白质例如肿瘤坏死因子或干扰素-γ；或生物学应答修饰剂例如淋巴因子、白介素-1(“IL-1”)、白介素-2(“IL-2”)、白介素-6(“IL-6”)、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(“GM-CSF”)、粒细胞集落形成刺激因子(“G-CSF”)或其它生长因子。
将此类治疗部分与抗体缀合的技术是普遍已知的，参见例如Amon等人，″Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs In CancerTherapy″，在Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy，Reisfeld等人(编著)第243-56页(Alan R.Liss，Inc.1985)；Hellstrom等人，″AntibodiesFor Drug Delivery″，在Controlled Drug Delivery(第二版)，Robinson等人(编著)第623-53页(Marcel Dekker，Inc.1987)；Thorpe，″AntibodyCarriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy：A Review″，在Monoclonal Antibodies′84：Biological And Clinical Applications，Pinchera等人(编著)第475-506页(1985)；″Analysis，Results，And FutureProspective Of The Therapeutic Use Of Radiolabeled Antibody In CancerTherapy″，在Monoclonal Antibodies For Cancer Detection And Therapy，Baldwin等人(编著)第303-16页(Academic Press 1985)，和Thorpe等人，″The Preparation And Cytotoxic Properties Of Antibody-ToxinConjugates″，Inmunol.Rev.，62：119-58(1982)。
双特异性分子
在另一个方面，本发明的特征是包含本发明的抗BAFFR抗体或其片段的双特异性或多特异性分子。本发明的抗体或其抗原结合区是可以衍生化的，或可与另一种功能分子连接，例如，另一种肽或蛋白质(例如，另一种抗体或受体的配体)，来产生与至少2个不同的结合位点或靶分子结合的双特异性分子。本发明的抗体实际上可以衍生自或与一个以上的其它功能分子连接，产生与2个以上的不同结合位点和/或靶分子结合的多特异性分子；此类多特异性分子还意在涵盖于本文使用的术语“双特异性分子”中。为了产生本发明的双特异性分子，本发明的抗体可以与一个或多个其它结合分子功能性的连接(例如，通过化学偶联、基因融合、非共价结合或其它)，所述结合分子例如另一种抗体、抗体片段、肽或结合模拟物，从而获得双特异性分子。
因此，本发明包括包含至少一种对BAFFR的第一结合特异性和对第二靶表位的第二结合特异性的双特异性分子。例如，第二靶表位是BAFFR的另一种表位，其不同于第一靶表位。另一个实例是包含至少一种对BAFFR的第一结合特异性和对CD20中的表位的第二结合特异性的双特异性分子。
额外的，对于本发明，其中双特异性分子是多特异性的，除第一和第二靶表位外，分子可以进一步包括第三结合特异性。
在一个实施方案中，本发明的双特异性分子包括至少一种抗体或其抗体片段作为结合特异性，所述片段包括例如Fab、Fab’、F(ab′)2、Fv或单链Fv。抗体还可以是轻链或重链二聚体，或任何它们的最小片段，例如Fv或单链构建体，如Ladner等人，US专利号4,946,778中描述的，其内容通过引用明确的整合。
在本发明的双特异性分子中可以使用的其它抗体是鼠的、嵌合的和人源化的单克隆抗体。
利用本领域已知的方法，可以通过缀合组成的结合特异性，来制备本发明的双特异性分子。例如，可以分别产生双特异性分子的各个结合特异性，然后相互缀合。当结合特异性是蛋白质或肽时，可以使用多种偶联或交联剂进行共价缀合。交联剂的实例包括A蛋白、碳二亚胺、N-琥珀酰亚胺-S-乙酰-硫代乙酸(SATA)、5，5′-二硫二(2-硝基苯甲酸)(DNTB)、邻苯双马来酰亚胺(o-phenylenedimaleimide，oPDM)、N-琥珀酰亚胺-3-(吡啶基二硫)丙酸(N-succinimidyl-3-(2-pyridyldithio)propionate，SPDP)和磺基琥珀酰亚胺4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-l-羧酸盐(sulfosuccinimidyl4-(N-maleimidomethyl)cyclohaxane-1-carboxylate，磺基-SMCC)(参见例如，Karpovsky等人，1984 J.Exp.Med.160：1686；Liu，MA等人，1985 Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82：8648)。其它方法包括在Paulus，1985 Behring Ins.Mitt.No.78，118-132；Brennan等人，1985 Science 229：81-83和Glennie等人，1987 J.Immunol.139：2367-2375中描述的。缀合剂是SATA和磺基-SMCC，都可从Pierce Chemical Co.(Rockford，IL)中商购。
当结合特异性是抗体时，可以通过两条重链的C端铰链区的硫氢基键缀合。在特定的实施方案中，在缀合前，修饰铰链区获得奇数的硫氢基残基，例如1个。
可选的，可以在相同的载体中编码两个结合特异性，并在相同的宿主细胞中表达和装配。当双特异性分子是mAb x mAb、mAb x Fab、Fab xF(ab′)2或配体x Fab的融合蛋白时，该方法是特别有效的。本发明的双特异性分子可以是包含一个单链抗体和结合决定子的单链分子，或包含2个结合决定子的单链双特异性分子。双特异性分子可以包含至少2个单链分子。制备双特异性分子的方法描述在例如美国专利号5,260,203；美国专利号5,455,030；美国专利号4,881,175；美国专利号5,132,405；美国专利号5,091,513；美国专利号5,476,786；美国专利号5,013,653；美国专利号5,258,498；和美国专利号5,482,858中。
可以通过例如酶联免疫吸附测定(ELISA)、放射性免疫测定(REA)、FACS分析、生物测定(例如，生长抑制)或Western印记测定，来验证双特异性分子与其特异性靶标的结合。各种这类测定通常通过使用特异针对目的复合物的标记试剂(例如，抗体)，来检测特定目标蛋白质-抗体复合物的存在。
多价抗体
在另一个方面，本发明提供了包含至少2个相同或不同的抗原结合部分的多价抗体，所述抗原结合部分是本发明的结合BAFFR的抗体的抗原结合部分。在一个实施方案中，多价抗体提供至少2、3或4个抗体的抗原结合部分。抗原结合部分可以通过蛋白质融合或共价或非共价的连接而连接到一起。可选的，已描述了用于双特异性分子的连接方法。例如，可以通过交联本发明的抗体与结合本发明抗体的恒定区(例如Fc或铰链区)的抗体，来获得四价化合物。
药物组合物
另一方面，本发明提供了组合物，例如，药物组合物，其含有本发明的单克隆抗体或其抗原结合部分之一或组合，与可药用载体一起配制。此类组合物可以包括本发明的抗体之一或组合(例如，两种或多种不同的)、或免疫连接物或双特异性分子。例如，本发明的药物组合物可以包含结合靶抗原上不同表位或者具有互补活性的抗体的组合。
也可以以组合疗法，即与其他活性剂相组合来施用本发明的药物组合物。例如，组合疗法可以包括与至少一种其他抗炎剂或另一种化疗剂组合组合的本发明的抗BAFFR抗体，所述化疗剂例如细胞毒性、抗癌或抗增殖剂。可以用于组合疗法的治疗剂的实例在下面关于本发明抗体用途的章节中更详细地描述。
本文所用的“可药用载体”包括生理上相容的任何和所有溶剂、分散介质、包衣、抗细菌和抗真菌剂、等渗和吸收延缓剂，等等。载体应该适于静脉内、肌内、皮下、肠胃外、脊柱或表皮施用(例如，通过注射或灌输)。取决于施用途径，活性化合物，即抗体、免疫连接物，或双特异性分子可以用材料包衣以保护化合物免于酸和可以失活该化合物的其他自然条件的作用。
本发明的药物化合物可以包括一种或多种可药用盐。“可药用盐”指保留亲本化合物的所希望的生物活性并且不赋予任何不希望的毒理学效应的盐(见例如，Berge，S.M.，等人，1977 J.Pharm.Sci.66：1-19)。此类盐的实例包括酸加成盐和碱加成盐。酸加成盐包括来自无毒无机酸的盐，如盐酸、硝酸、磷酸、硫酸、氢溴酸、氢碘酸、亚磷酸的盐，等等，以及来自无毒有机酸的盐，所述无毒有机酸为如脂肪族一或二羧酸、苯基取代的链烷酸、羟基链烷酸、芳族酸、脂肪族和芳族磺酸，等等。碱加成盐包括来自碱土金属如钠、钾、镁、钙等等的那些盐，以及来自无毒有机胺的盐，所述无毒有机胺为如N，N′-二苯甲基乙二胺、N-甲基葡糖胺、氯普鲁卡因、胆碱、二乙醇胺、乙二胺、普鲁卡因，等等。
本发明的药物组合物还可以包括可药用抗氧化剂。可药用抗氧化剂的实例包括：水溶性抗氧化剂，如抗坏血酸、盐酸半胱氨酸、硫酸氢钠、偏亚硫酸氢钠、亚硫酸钠等等；油可溶的抗氧化剂，如棕榈酸抗坏血酸酯、丁基化羟基苯甲醚(BHA)、丁基化羟基甲苯(BHT)、卵磷脂、没食子酸丙酯、α生育酚，等等；和金属螯合剂，如柠檬酸、乙二胺四乙酸(EDTA)、山梨醇、酒石酸、磷酸，等等。
可以用于本发明的药物组合物中的合适的水性和非水性载体的实例包括水、乙醇、多元醇(如甘油、丙二醇、聚乙二醇，等等)，和其合适的混合物，植物油，如橄榄油，和可注射的有机酯，如油酸乙酯。例如，通过使用包衣材料，如卵磷脂，对于分散体的情况通过保持所需的颗粒大小，和通过使用表面活性剂，可以保持适当的流动性。
这些组合物还可以含有佐剂，如防腐剂、湿润剂、乳化剂和分散剂。微生物存在的防止可以通过如上消毒程序，和通过包括多种抗细菌和抗真菌剂来确保，所述抗细菌和抗真菌剂为例如对羟基苯甲酸酯、氯代丁醇、苯酚、山梨酸等等。还希望在组合物中包括等渗剂，如糖、氯化钠等等。此外，通过包括延缓吸收的活性剂，如单硬脂酸铝和明胶可以引起可注射药物形式的延长吸收。
可药用载体包括无菌水溶液或分散体和无菌粉剂，其用于临时制备无菌注射液或分散体。此类介质和试剂在药学活性物质中的用途是本领域已知的。除了与活性化合物不相容的任何常规介质或活性剂之外，预期其用于本发明的药物组合物。还可以将补充性活性化合物掺入组合物中。
治疗组合物通常必须是在生产和保存条件下是无菌的和稳定的。可以将组合物配制成溶液剂、微乳剂、脂质体或适于高药物浓度的其他有序结构。载体可以是溶剂或分散介质，含有例如水、乙醇、多元醇(例如，甘油、丙二醇和液体聚乙二醇，等等)，和其合适的混合物。可以保持适当流动性，例如，通过使用包衣，如卵磷脂，对于分散体的情况通过保持所需的颗粒大小和通过使用表面活性剂。在许多情况中，可以在组合物中包括等渗剂，例如，糖、多元醇，如甘露醇，山梨醇，或者氯化钠。可注射组合物的延长吸收可以通过在组合物中包括延缓吸收的物质，如单硬脂酸盐和明胶来实现。
对开发稳定蛋白质(例如抗体)配方的综述可见于Cleland等人，(1993)Crit.Reviews.Ther.Drug Carrier Systems 10(4)：307-377和Wei Wang(1999)Int.J.Pharmaceutics 185：129-88。关于抗体的其它配方讨论可见于例如Daugherty和Mrsny(2006)Advanced Drug Delivery Reviews 58：686-706；US 6171586；US4618486；US20060286103；WO06044908；WO07095337；WO04016286；Colandene等人，(2007)J.Pharm.Sci96：1598-1608；Schulman(2001)Am.J.Respir.Crit.Care Med.164：S6-S11和其它已知的参考文献。
用于皮内或皮下施用的溶液或悬浮液通常包括一种或多种以下组分：无菌稀释剂例如注射用水、盐水溶液、不挥发油、聚乙二醇、甘油、丙二醇或其它合成溶剂；抗菌剂例如苯甲醇或对羟基苯甲酸甲酯；抗氧化剂例如抗坏血酸或亚硫酸氢钠；螯合剂例如乙二胺四乙酸；缓冲剂例如乙酸盐、柠檬酸盐或磷酸盐；和调节张力的活性剂例如氯化钠或葡萄糖。可以用酸或碱调节pH，例如盐酸或氢氧化钠。此类制品可以封闭在安瓶、一次性注射器或玻璃或塑料制成的倍剂量小瓶中。
通过将本发明的抗体以所需的量在合适的溶剂中与上面列举的成分之一或者组合掺和，如果需要，接着无菌微量过滤来制备无菌注射溶液。通常，通过将活性化合物掺入无菌载体制备分散体，所述载体含有基本分散介质和来自上面列举的那些成分的所需的其他成分。对于用于制备无菌注射溶液的无菌粉剂的情况，制备方法是真空干燥和冷冻干燥(冻干)，其产生活性成分加上来自其之前无菌过滤溶液的任何额外的所需成分的粉末。
当通过例如静脉内、皮肤的或皮下注射施用治疗有效量的本发明抗体时，结合剂可以是无致热原的、肠胃外可接受的水溶液的形式。此类肠胃外可接受的蛋白质溶液的制备是本领域技术人员已知的，根据pH具有等渗性、稳定性等。用于静脉内、皮肤的或皮下注射的优选的药物组合物除结合剂外，还应该含有等渗载体，例如氯化钠注射液、林格注射液、葡萄糖(dextrose)注射液、葡萄糖和氯化钠注射液、乳酸盐林格注射液(lactatedRinger’s injection)或其它本领域已知的载体。本公开文本的药物组合物还可以含有稳定剂、防腐剂、缓冲剂、抗氧化剂或其它本领域技术人员已知的添加剂。
可以与载体物质组合以产生单一剂型的活性成分的量将取决于被治疗的对象、具体施用方式而变。可以与载体物质组合以产生单一剂型的活性成分的量将通常是产生治疗效果的组合物的量。通常，以百分比计，该量将为约0.01％到约99％活性成分、约0.1％到约70％，或约1％到约30％活性成分与可药用载体组合。
调节剂量方案以提供最佳的目的应答(例如，治疗应答)。例如，可以施用单次快速浓注，可以随时间施用几个分份剂量，或者可以根据治疗情况的紧迫性成比例地减小或增加剂量。特别有利的是以剂量单位形式配制肠胃外组合物以容易施用和剂量统一。如本文所用的剂量单位形式指适宜作为待治疗对象的单一剂量的物理上分散的单位；每个单位含有预定量的活性成分，所述量经计算以与所需的药物载体结合产生所希望的治疗效果。本发明的剂量单位形式的规格由如下决定并且直接依赖于：活性化合物的独特特征和待实现的具体治疗效果，和本领域中配制用于治疗个体中敏感性的这种活性化合物的固有局限性。
对于抗体施用，剂量为约0.0001到100mg/kg，更通常0.01到5mg/kg宿主体重。例如，剂量可以为0.3mg/kg体重、1mg/kg体重、3mg/kg体重、5mg/kg体重或10mg/kg体重或1-10mg/kg的范围内。示例性治疗方案需要每周施用一次、每两周一次、每三周一次、每四周一次、每月一次、每3月一次、或每3到6月一次。本发明的抗BAFFR抗体的剂量方案可以包括通过静脉内或皮下施用1mg/kg体重或3mg/kg体重，用下面的给药方案之一施用抗体：例如，每四周一次施用6次剂量，然后每3月一次；每3周一次；3mg/kg体重一次，接着每3周1mg/kg体重。
在一些方法中，同时施用具有不同结合特异性的两种或多种单克隆抗体，在这种情况下施用的每种抗体的剂量落入所指出的范围内。通常在多个时机施用抗体。单次剂量之间的间隔可以是例如每周、每月、每3月或每年。间隔也可以是不规则的，通过测量患者中针对靶抗原的抗体的血液水平来指示。在一些方法中，调节剂量以实现血浆抗体浓度为约1-1000μg/ml，并且在一些方法中为约25-300μg/ml。
备选地，可以作为持续释放制剂施用抗体，在该情况中，需要低频率的施用。剂量和频率取决于抗体在患者中的半寿期而变。通常，人抗体显示出最长的半寿期，其次是人源化抗体、嵌合抗体，和非人抗体。剂量和施用频率可以随着治疗是预防性还是治疗性的而变。在预防性应用中，在长时间期间内以相对不频繁的间隔施用相对低的剂量。一些患者终生持续接受治疗。在治疗应用中，有时需要以相对较短的间隔施用相对高剂量直到疾病的进展减慢或者终止或者直到患者显示出疾病症状的部分或完全减轻。之后，可以对患者施用预防方案。
本发明的药物组合物中活性成分的实际剂量水平可以改变，只要活性成分的量对于具体患者、组合物和施用方式实现所希望的治疗应答，而对该患者无毒性。所选的剂量水平将取决于多种药物代谢动力学因素，包括使用的本发明的具体组合物或者其酯、盐或酰胺的活性，施用途径，施用时间，使用的具体化合物的排泄速率，治疗持续时间，与所用的具体组分组合使用的其他药物、化合物和/或物质、被治疗的患者的年龄、性别、体重、状况、一般健康和以前的医疗史，和医学领域中公知的其他因素。
本发明抗BAFFR抗体的“治疗有效剂量”可以导致疾病症状严重性的降低、无疾病症状期的频率和持续时间的增加，或者由于疾病折磨而引起的病损或残疾的预防。
可以使用本领域已知的一种或多种方法，通过一种或多种施用途径施用本发明的组合物。如技术人员将理解，施用途径和/或方式将取决于所希望的结果而变。本发明抗体的施用途径包括静脉内、肌内、皮内、腹膜内、皮下、脊柱其他肠胃外施用途径，例如，通过注射或灌注。如本文使用的短语“肠胃外施用”指不同于经肠和局部施用的施用方式，通常通过注射，并且包括但不限于，静脉内、肌内、动脉内、鞘内、囊内、眶内、心内、真皮内、腹膜内、经气管、皮下、表皮下、关节内、被膜下、蛛网膜下腔、脊柱内、硬膜外和intrastemal注射和灌注。
备选地，本发明的抗体可以通过非肠胃外途径施用，如局部、表皮或粘膜施用途径，例如，鼻内、口腔、阴道、直肠、舌下或局部。
可以用保护活性化合物免于快速释放的载体制备活性化合物，如控释制剂，包括植入物、经皮贴剂，和微囊化递送系统。可以使用生物可降解的生物相容的聚合物，如乙烯乙酸乙烯酯、聚酐、聚乙醇酸、胶原、聚原酸酯和聚乳酸。制备此类制剂的许多方法被申请专利或者是本领域技术人员公知的。见例如，Sustained and Controlled Release Drug DeliverySystems，J.R.Robinson，ed.，Marcel Dekker，Inc.，New York，1978。
可以用本领域已知的医学装置施用治疗组合物。例如，在一个实施方案中，可以用无针头的皮下注射装置施用本发明的治疗组合物，如美国专利号5,399,163；5,383,851；5,312,335；5,064,413；4,941,880；4,790,824或4,596,556中所示的装置。可用于本发明的公知的植入物或组件的实例包括：美国专利号4,487,603，其说明了用于以受控速率分配药物的可植入的微量输液泵；美国专利号4,486,194，其说明了用于通过皮肤施用药物的治疗装置；美国专利号4,447,233，其说明了用于以精确的输注速率递送药物的药物输液泵；美国专利号4,447,224，其说明了用于连续药物递送的变速流可植入输液器；美国专利号4,439,196，其说明了具有多个腔室的渗透药物递送系统；和美国专利号4,475,196，其说明了渗透药物递送系统。许多其他此类植入物、递送系统，和组件是本领域技术人员已知的。
在一些实施方案中，可以配制本发明的人单克隆抗体以确保在体内适当分配。例如，血脑屏障(BBB)排除许多高亲水性化合物。为了确保本发明的治疗化合物穿过BBB(如果希望)，可以将它们用例如脂质体配制。关于生产脂质体的方法，见例如，美国专利4,522,811；5,374,548；和5,399,331。脂质体可以包含一种或多种部分，其被选择性运输到特定细胞或器官中，从而增强定向药物递送(见，例如，V.V.Ranade，1989 J.Cline Pharmacol.29：685)。示例性定向部分包括叶酸或生物素(见，例如，Low等人的美国专利5,416,016)；甘露糖苷类(Umezawa等人，1988 Biochem.Biophys.Res.Commun.153：1038)；抗体(P.G.Bloeman等人，1995 FEBS Lett.357：140；M.Owais等人，1995 Antimicrob.Agents Chernother.39：180)；表面活性剂A蛋白受体(Briscoe等人，1995 Am.J.Physiol.1233：134)；p120(Schreier等人，1994 J.Biol.Chem.269：9090)；也见K.Keinanen；M.L.Laukkanen，1994 FEBSLett.346：123；J.J.Killion；I.J.Fidler，1994 Immnunomethods4：273。
本发明的用途和方法
本发明的抗体具有体外和体内诊断和治疗效用。例如，可以将这些分子施用于例如体外或体内的培养细胞，或者施用于对象(例如，体内)以治疗、预防或诊断多种病症。如本文所用的术语“对象”意在包括人和非人动物。非人动物包括所有脊椎动物，例如，哺乳动物和非哺乳动物，如非人灵长类、绵羊、狗、猫、牛、马、鸡、两栖动物和爬行类。
所述方法尤其适于治疗、预防或诊断BAFFR相关病症和/或自身免疫疾病，例如系统性红斑狼疮或类风湿性关节炎。
本发明还提供了通过施用包含治疗有效剂量的本发明的抗体的组合物，在动物中排除B细胞的方法，优选的排除或杀死人B细胞的方法。
如本文使用的，“BAFFR相关病症”包括与异常的BLyS水平相关的或以异常的BLyS水平为特征的病况，和/或可以通过排除或杀死B细胞治疗的疾病或病况。这包括炎性病况、变态反应和过敏性病况、超敏反应、自身免疫疾病、严重感染和器官或组织移植排斥。这还包括B细胞瘤。
例如，本发明的抗体可用于治疗心脏、肺、心肺组合、肝、肾、胰腺、皮肤或角膜移植的受体，包括同种异体移植排斥或异种移植排斥，并且可用于预防移植物抗宿主病，例如在骨髓移植和器官移植后相关的动脉硬化。
本发明的抗体可用于治疗、预防或减轻自身免疫疾病和炎性病况，特别是具有包括自身免疫组分的病因的炎性病况，如关节炎(例如类风湿关节炎、arthritis chronica progrediente和变形性关节炎)和风湿性疾病，包括炎性病况和风湿性疾病，其涉及骨丢失、炎性痛、包括强直性脊椎炎的脊椎关节病、赖特尔综合症、反应性关节炎、银屑病关节炎和肠病性关节炎、超敏(包括呼吸道超敏和皮肤超敏)和变态反应。可以使用本发明抗体的特异的自身免疫疾病包括自身免疫血液学病症(包括例如，溶血性贫血、再生障碍性贫血、纯红细胞贫血(pure red cell anaemia)和自发性血小板减少(idiopathic thrombocytopenia))、获得性血友病A(acquiredhemophilia A)、冷凝集素病(cold agglutinin disease)、冷球蛋白血症(cryoglobulinemia)、血栓性血小板减少性紫癜(thromboticthrombocytopenic purpura)、综合征(syndrome)、系统性红斑狼疮(systemic lupus erythematosus)、炎性肌肉病症(inflammatorymuscle disorders)、多发性软骨炎(polychondritis)、sclerodoma、抗嗜中性粒细胞胞浆抗体相关的血管炎(anti-neutrophil cytoplasmic antibody-associated vasculitis)、IgM介导的神经病(IgM mediated neuropathy)、斜视眼阵挛-肌阵挛综合征(opsoclonus myoclonus syndrome)、韦格纳肉牙肿病(Wegener granulomatosis)、皮肌炎(dermatomyositis)、慢性活动性肝炎(chronic active hepatitis)、重症肌无力(myasthenia gravis)、牛皮癣(psoriasis)、斯-琼氏综合征(Steven-Johnson syndrome)、寻常天疱疮(pemphigus vulgaris)、落叶型天疱疮(pemphigus foliacius)、特发性口炎性腹泻(idiopathic sprue)、自身免疫炎性肠病(autoimmune inflammatorybowel disease)(包括例如，溃疡性结肠炎(ulcerative colitis)、克罗恩氏病(Crohn′s disease)和肠激惹综合征(Irritable Bowel Syndrome))、内分泌性眼病(endocrine ophthalmopathy)、Grave病(Graves’disease)、结节病(sarcoidosis)、多发性硬化(multiple sclerosis)、视神经脊髓炎(neuromyelitisoptica)、原发性胆汁性肝硬变(primary biliary cirrhosis)、青少年糖尿病(I型糖尿病)(juvenile diabetes(diabetes mellitus type I))、葡萄膜炎(前葡萄膜炎、中葡萄膜炎和后葡萄膜炎，以及全葡萄膜炎)、干燥性角结膜炎(keratoconjunctivitis sicca)、和春季角结膜炎(vernal keratoconjunctivitis)、间质性肺纤维化(interstitial lung fibrosis)、银屑病关节炎(psoriatic arthritis)和肾小球肾炎(glomerulonephritis)(有或无肾变病综合征(nephroticsyndrome)，例如包括特发性肾病综合征(idiopathic nephrotic syndrome)或微小病变肾病(minimal change nephropathy))、肿瘤、皮肤和角膜的炎性疾病、肌炎、骨移植物丢失(loosening of bone implants)、代谢病症如动脉粥样硬化、糖尿病和血脂紊乱(dislipidemia)。
本发明的抗体还可用于治疗、预防或减轻哮喘、支气管炎、尘肺、肺气肿和其它呼吸道的阻塞性或炎性疾病。
本发明的抗体还可用于治疗骨代谢疾病，包括骨关节炎、骨质疏松和其它炎性关节炎，以及常规的骨丢失，包括与年龄相关骨丢失，特别是牙周病。
由于BAFFR与人外周血淋巴细胞和人B细胞系结合受BAFFR多肽介导，故本发明的抗体还可以用于诊断或治疗B细胞瘤。此类疾病和病况的实例包括但不限于B细胞非霍奇金淋巴瘤，例如小淋巴细胞淋巴瘤、浆细胞样淋巴细胞性淋巴瘤、套细胞淋巴瘤(mantle cell lymphoma)、滤泡型淋巴瘤、粘膜相关淋巴样组织淋巴瘤、弥漫型大细胞性淋巴瘤和伯基特淋巴瘤(Burkitt′s lymphoma)；前体B急性淋巴细胞白血病；和B细胞慢性淋巴细胞白血病，和多发性骨髓瘤。本发明的范围内还涵盖了其它B细胞瘤。
本发明的抗体可以作为唯一的活性成分施用，或与例如佐剂联合施用，或与其它药物组合施用，例如免疫抑制剂或免疫调节剂或其它抗炎剂或其它细胞毒性或抗癌剂，用于例如治疗或预防上述疾病。例如，本发明的抗体可以与DMARD组合使用，例如金盐(Gold salts)、柳氮磺胺吡啶(sulphasalazine)、antimalarias、氨甲蝶呤(methotrexate)、D-青霉胺(D-penicillamine)、硫唑嘌呤(azathioprine)、麦考酚酸(mycophenolic acid)、环胞素A(cyclosporine A)、他克莫司(tacrolimus)、西罗莫司(sirolimus)、米诺环素(minocycline)、来氟米特(leflunomide)、糖皮质激素(glococorticoids)；钙依赖磷酸酶抑制剂(calcineurin inhibitor)，例如环胞素A(cyclosporin A)或FK 506；淋巴细胞再循环的调节剂，例如FTY720和FTY720类似物；mTOR抑制剂，例如雷帕霉素(rapamycin)、40-O-(2-羟乙基)-雷帕霉素、CCI779、ABT578、AP23573或TAFA-93；具有免疫抑制性性质的子囊霉素(ascomycin)，例如ABT-281、ASM981等；皮质甾类(corticosteroids)；环磷酰胺(cyclo-phos-phamide)；咪唑硫嘌呤(azathioprene)；氨甲蝶呤；咪唑立宾(mizoribine)；麦考酚酸(mycophenolicacid)；麦考酚酸吗乙酯(myco-pheno-late mofetil)；15-deoxyspergualine或其免疫抑制同源物、类似物或衍生物；免疫抑制性单克隆抗体，例如白细胞受体的单克隆抗体，如MHC、CD2、CD3、CD4、CD7、CD8、CD11a、CD25、CD28、CD40、CD45、CD52、CD58、CD80、CD86或它们的配体；其它免疫调节化合物，例如具有CTLA4或其突变体的至少一部分胞外结构域的重组结合分子，如CTLA4或其突变体的至少胞外部分与非CTLA4蛋白质序列结合，例如CTLA4Ig(如，命名为ATCC 68629)或其突变体，如LEA29Y；粘附分子抑制剂，例如LFA-1拮抗剂、ICAM-1或-3拮抗剂、VCAM-4拮抗剂或VLA-4拮抗剂；或化疗剂，例如紫杉醇(paclitaxel)、吉西他滨(gemcitabine)、顺铂(cisplatinum)、多柔比星(doxorubicin)或5-氟尿嘧啶；抗TNF剂，例如对TNF的单克隆抗体，如英利昔单抗(infliximab)、阿达木单抗(adalimumab)、CDP870，或对TNF-RI或TNF-RII的受体构建体，如Etanercept(依那西普)、PEG-TNF-RI；促炎细胞因子的阻断剂，IL-1阻断剂例如阿那白滞素(Anakinra)或IL-1trap、AAL160、ACZ 885、IL-6阻断剂；趋化因子阻断剂例如蛋白酶的抑制剂或活化剂，如金属蛋白酶、抗IL-4抗体、抗IL-15抗体、抗IL-6抗体、抗IL-21抗体、抗IL-12抗体、抗p40抗体、抗IL-17抗体、抗CD-20抗体、NSAID如阿司匹林(aspirin)或抗感染剂(列出的不限于所提及的试剂)。
根据上述内容，本发明还提供了其它方面：
上文定义的方法包括共同施用(例如，同时或顺序的)治疗有效量的BAFFR拮抗剂，例如本发明的抗体，和至少一种第二种药物物质，所述第二种药物物质是免疫抑制/免疫调节、抗炎的化疗或抗感染药物，例如如上所述。
或者，治疗组合(例如试剂盒)，其包含治疗有效量的a)BAFFR拮抗剂，如本发明的抗体，和b)至少一种第二种物质，所述物质选自免疫抑制/免疫调节、抗炎的化疗药物或抗感染药物，如上所述。试剂盒可以包括关于其施用的说明书。
当本发明的抗体与其它免疫抑制/免疫调节、抗炎的化疗药物或抗感染疗法联合施用时，共同施用的组合化合物的剂量当然将根据所用的共同药物的类型、所用的特定药物、治疗的病况等而改变，例如不论所述共同药物类型是否是DMARD、抗TNF、IL-1阻断剂或其它。
在一个特定的实施方案中，本发明的抗体可以与另一种B细胞杀灭剂组合施用，即例如具有ADCC活性的靶向CD20的抗体，如利妥昔单抗(Rituximab)。
在其它实施方案中，本发明的抗体仅向选自患SLE或RA并表现出异常的BLyS血清水平的患者的患者群体施用。在其它实施方案中，本发明的抗体仅向选自应答抗BLyS治疗的患者的患者群体施用。鉴别具有增加的应答抗BLyS治疗的可能性的患者的生物标志物可以是下列任一项，但不限于此：升高的BLyS血清水平、升高的某些B细胞子集的水平、存在或缺少某些类型的自身抗体。
在一个实施方案中，本发明的抗体可用于检测BAFFR的水平，或含有BAFFR的细胞的水平。这可以例如，通过将样品(如体外样品)和对照样品与抗BAFFR抗体在允许抗体和BAFFR之间形成复合体的条件下接触来实现。检测抗体和BAFFR之间形成的任何复合体并在样品和对照中比较。例如，可以使用本发明的组合物进行本领域公知的标准检测方法，如ELISA和流式细胞测定法。
因此，一方面，本发明还提供了检测样品中BAFFR(例如，人BAFFR抗原)的存在，或测量BAFFR的量的方法，其包括将样品和对照样品与本发明的抗体或其特异结合BAFFR的抗原结合区域在允许所述抗体或其部分与BAFFR之间形成复合体的条件下接触。然后检测复合体的形成，其中样品与对照样品相比复合体形成的差异表明在该样品中存在BAFFR。
本发明的范围内还包括试剂盒，其由本发明的组合物(例如，抗体、人抗体和双特异性分子)和使用说明书组成。试剂盒可以还含有至少一种额外试剂，或者一种或多种本发明的额外抗体(例如，具有互补活性的抗体，其与第一种抗体结合靶抗原上不同的表位结合)。试剂盒通常包括标签，指出该试剂盒内含物的预期用途。术语标签包括在试剂盒上提供或试剂盒提供或附随该试剂盒的任何书面或录音材料。试剂盒还可以包括诊断患者是否属于上文定义的应答抗BAFFR抗体治疗的群体所用的工具。
已经完全描述了本发明，通过下面的实施例和权利要求进一步阐明本发明，所述实施例是说明性的并且不意在进一步限定。
附图的简要说明
图1显示了在第0天免疫，第21天加强，以及治疗开始天数减9后，DBA/1小鼠(MCOL37)中的胶原诱发性关节炎(CIA)的结果。方块符号显示剂量等于200μg/200μl i.p.2x每周的抗-BAFF Ab-MOR6743-mlgG2a的爪(paws)评分(n＝8)。三角符号显示剂量等于200μg/200μl i.p.2x每周的同种型抗CSA-IgG2a对照的爪评分(n＝7)。统计：Dunnett多重比较测试(单边ANOVA)。与载体对照比较(p＜0.05＊，p＜0.01＊＊，p＞0.05n.s.)。
图2显示了在20mg/kg静脉内施用抗BAFFR(MOR06654)抗体后，3只食蟹猴(cynomolgous monkey)中的CD20+和CD40+外周血细胞的绝对数量。
图3A显示了在20μg/kg静脉内施用抗BAFFR(MOR06654)抗体后，3只食蟹猴中的CD20+和CD40+外周血细胞的绝对数量。
图3B显示了在20μg/kg静脉内施用非岩藻糖基化的抗BAFFR(MOR06654)抗体后，3只食蟹猴中的CD20+和CD40+外周血细胞的绝对数量。
实施例
1：筛选测定
初始盘选(panning)的FACS筛选
对于从第一次初级筛选(例如噬菌体展示筛选)中检测BAFFR结合的Fab抗体，和/或对于ELISA阳性克隆的次级筛选步骤，可以在FACS中如下筛选选定的大肠杆菌克隆的裂解物：
计数各细胞系的细胞(亲本细胞或用BAFFR转染的细胞)，并在PBS/3％FCS/0.02％NaN3(FACS缓冲液)中调整至2x107细胞/ml。在96孔圆底平板中，将2x105细胞与35μl含Fab的细菌裂解物在100μl终体积的FACS缓冲液中混合，并在4℃下摇床孵育1小时。然后，用FACS缓冲液洗涤细胞1次，重悬在藻红蛋白缀合的山羊抗人IgG二抗中，所述二抗已在FACS缓冲液中1∶200稀释。在4℃下摇床孵育1小时后，再次用FACS缓冲液洗涤细胞1次，重悬在FACS缓冲液中，并测量细胞表面结合，例如通过FACSArray仪器(Becton Dickinson)中的细胞的荧光强度。
Fc捕获ELISA
为了从噬菌体展示中鉴别富集克隆中的BAFFR结合的Fab抗体，在Fc捕获ELISA设置中如下筛选选定的大肠杆菌克隆裂解物：用PBS稀释的20μg/ml山羊抗人IgG Fc在4℃包被Maxisorp 384孔板过夜。第二天，洗涤平板，用5％MTBST封闭，并用5μg/ml BAFFR:Fc(Alexis)室温孵育1小时。平行的，用终浓度为2.5％奶粉封闭含Fab的细菌裂解物。然后，将预封闭的细菌裂解物添加到平板上的捕获BAFFR:Fc上。然后，通过与碱性磷酸酶缀合的山羊抗人IgG(Fab特异性的，在0.5％MTBST中1∶5000稀释)孵育，然后添加AttoPhos荧光底物(Roche Diagnostics)，来检测BAFFR:Fc结合的Fab。在TECAN Spectrafluor读板器中，用430nm激发光记录在535nm的荧光发射。
Fab捕获ELISA
为了从噬菌体展示中检测BAFFR结合的Fab抗体，在Fab捕获ELISA设置中筛选选定的大肠杆菌克隆裂解物：用PBS 1∶1000稀释的绵羊抗人IgG Fd片段特异性抗体在4℃包被Maxisorp 384孔板过夜。第二天，洗涤平板，用TBS/0.05％Tween/5％奶粉(5％MTBST)室温封闭1小时。平行的，用终浓度为2.5％奶粉封闭含Fab的细菌裂解物。然后，将预封闭的细菌裂解物添加到固定在平板上的捕获抗体上。然后，允许捕获的-Fab片段与1μg/ml生物素化的BAFFR:Fc(在PBST中稀释)结合，最终通过与碱性磷酸酶缀合的链霉亲和素(Zymax)(在2.5％MPBST中1∶3000稀释)孵育，然后添加AttoPhos荧光底物(Roche Diagnostics)，来进行检测。在TECAN Spectrafluor读板器中，用430nm激发光记录在535nm的荧光发射。
BAFFR-BLyS结合ELISA
为了直接鉴别抑制性抗体，在BAFFR-BLyS结合ELISA中筛选FLAG标记的Fab：用PBS中的1μg/ml hsBLyS在4℃包被Maxisorp 96孔板过夜。第二天，洗涤平板，用PBS/2％BSA室温封闭至少1小时。平行的，用终浓度为2.5％BSA封闭含Fab的细菌裂解物。预封闭的细菌裂解物用5μg/ml单克隆抗FLAG M2抗体孵育30min，从而增加交联的抑制活性，然后再添加10ng/ml生物素化的BAFFR:Fc(在PBS/2％BSA中稀释)室温再30min，轻微振荡。将预孵育的裂解物/生物素-BAFFR:Fc混合物添加到平板结合的hsBLyS上。在室温30min和洗涤后，通过与碱性磷酸酶缀合的链霉亲和素(Zymax)(在PBS/2.5％BSA中1∶3000稀释)孵育，然后添加AttoPhos荧光底物(Roche Diagnostics)，来进行检测。在TECANSpectrafluor读板器中，用430nm激发光记录在535nm的荧光发射。
在使用纯化的Fab而非细菌裂解物的情况下，省略抗FLAG交联的步骤。
成熟后的FACS筛选
第二次成熟：
对于从成熟中筛选结合子，可以如具有以下改变的描述实施FACS分析：稀释选定的大肠杆菌克隆裂解物至最大信号低于饱和。分析裂解物与Raji细胞的结合。将每个96孔5x104细胞与100μl不同稀释的细菌裂解物混合。如描述实施对与细胞结合的Fab的检测。可以根据它们的信号强度排列克隆。
2：从筛选测定中鉴别的抗体的亲和力确定
使用BioVeris进行KD确定的溶液平衡滴定(SET)方法
基本如文献所述实施溶液中的亲和力确定(Friquet等人，(1985)J.Immunol.Meth.77，305-319和Haenel等人(2005)Anal.Biochem.339，182-184)。为了改善SET方法的灵敏度和精确度，方法从经典的ELISA转换为基于ECL的BioVeris技术。根据生产商的说明，用BV-tagTMNHS-Ester(Bioveris Europe，Witney，Oxfordshire，UK)标记1mg/ml山羊抗人(Fab)2或山羊抗小鼠IgG，Fc片段特异性抗体(Dianova)。在聚丙烯微滴度板中进行实验，添加了0.5％BSA和0.02％Tween 20的PBSpH7.4作为测定缓冲液。以2n系列稀释未标记的BAFFR:Fc。使用没有抗原的孔确定Smax值。在添加100pM Fab(在75μl终体积中的终浓度)后，在RT孵育混合物2小时。然后，每个孔添加25μl用0.25μg/ml生物素化BAFFR:Fc抗原包被的Dynabeads(0.4mg/ml M-280链霉亲和素，DYNAL，Hamburg)和BV-标签标记的检测抗体的混合物，所述检测抗体是对抗人Fab是1∶4000的终稀释，或对抗小鼠IgG是1∶2000的终稀释。在Eppendorf振荡器(700rpm)上RT孵育30min后，使用M-384工作站(Bioveris Europe)检测电化学发光信号。
对直接包被的抗原的Biacore KD确定
使用BIAcore 3000仪器(Biacore，Uppsala，Sweden)，用分别与Fc捕获的BAFFR:Fc，或与共价固定的BAFFR:Fc(Alexis)，或与BAFFR(Peprotech)结合的各Fab梯度稀释液，确定动力学常数Kon和Koff。对于共价固定的抗原或抗Fc捕获的抗体，使用标准EDC-NHS胺偶联化学。在PBS(136mM NaCl，2.7mM KCl，10mM Na2HPO4，1.76mM KH2PO4pH 7.4)中，以流速20μl/min，使用浓度范围从1.5至500nM的Fab，进行动力学测量。各浓度的注射时间是1min，然后进行3或15min解离期。为了再生，使用2次甘氨酸/HCl pH1.5注射。使用BIA评估软件3.1(Biacore)拟合所有的感应图(sensogram)。
对于亲和力确定，在存在10％人血清的条件下，在含10％人血清的PBS中实施动力学测量，其中所述PBS在使用前进行无菌过滤(孔径1.2和0.2μm)从而去除解冻后的蛋白质聚集。
在BAFFR-BLyS结合测定(竞争FACS)中IC50值的确定
使用表达内源性BAFFR的Raji细胞实施BAFFR-BLyS结合测定。使用的BAFFR特异性Fab的终稀释范围从40至0.001nM。在振荡器上，在96孔板中用每孔5x104Raji细胞4℃孵育稀释的Fab 1h。将生物素化的hsBLyS以25ng/ml的终浓度添加，并在4℃在振荡器上孵育细胞30min。用FACS缓冲液洗涤细胞2次，然后重悬在藻红蛋白缀合的链霉亲和素(Dianova)中，后者已经在FACS缓冲液中1∶200稀释。在振荡器上，4℃实施染色1小时。最后，用FACS缓冲液洗涤细胞2次，重悬在FACS缓冲液中，并在FACSArray仪器(Becton Dickinson)中，通过荧光细胞仪检测与细胞表面BAFFR结合的BLyS。
在BAFFR:Fc-BLyS结合测定(竞争FACS)中IC50值的确定
用人可溶性BLyS在4℃包被96孔MaxiSorp平板过夜。在包被后，用PBS/0.05％Tween20(PBST)洗涤孔4次，然后用含1％牛血清白蛋白的PBST 37℃封闭1h，再用PBST进行4个洗涤步骤。添加20ng/ml的生物素化人BAFFR:Fc融合蛋白(Axxora)，在37℃与递增浓度的抗BAFFR抗体共同捕获1h。在另一轮洗涤循环后，向孔中添加ExtrAvidin-碱性磷酸酶(Sigma)，并在37℃孵育30分钟。通过添加含对硝基苯磷酸盐的二乙醇胺溶液(Sigma)，检测结合的磷酸酶。在用等体积的2N氢氧化钠ca.20分钟后，终止显色反应，并在读板器(SpectraMax 190，MolecularDevices)上测量405nm吸光度。
在BAFFR肽(miniBR3)-BLyS结合测定(竞争FACS)中IC50值的确定
用人可溶性BLyS在4℃包被96孔MaxiSorp平板过夜。在包被后，用PBS/0.05％Tween20(PBST)洗涤孔4次，然后用含1％牛血清白蛋白的PBST 37℃封闭1h，再用PBST进行4个洗涤步骤。添加20ng/ml的生物素化BAFFR来源肽(miniBR3，PiCHEM，Austria)，在37℃与递增浓度的抗BAFFR抗体共同捕获1h。在另一轮洗涤循环后，向孔中添加ExtrAvidin-碱性磷酸酶(Sigma)，并在37℃孵育30分钟。通过添加含对硝基苯磷酸盐的二乙醇胺溶液(Sigma)，检测结合的磷酸酶。在用等体积的2N氢氧化钠ca.20分钟后，终止显色反应，并在读板器(SpectraMax190，Molecular Devices)上测量405nm吸光度。
对食蟹猴BAFFR交叉反应的分析
在FACS滴定分析中，对cyno BAFFR转染的HEK293T细胞测试Fab对食蟹猴BAFFR的交叉反应性。所使用的最终候选Fab的稀释范围在177nM至0.001nM。在96孔板中，用5x104细胞/孔孵育稀释的Fab，振荡器上4℃，1h。然后，用FACS缓冲液洗涤细胞2次，并重悬在藻红蛋白缀合的山羊抗人IgG(Dianova)中，后者已经1∶200稀释在FACS缓冲液中。在振荡器上4℃实施染色1h。最后，用FACS缓冲液洗涤细胞2次，并在FACSArray仪器(Becton Dickinson)中，通过荧光细胞仪检测Fab结合。
分析BCMA和TACI的交叉反应性
FACS
在FACS滴定分析中，对BCMA转染的HEK293T细胞测试Fab对BCMA的交叉反应性：在终浓度范围从高nM或者甚至μM下降至pM使用Fab。如描述的实施细胞染色和Fab结合检测。
ELISA
用山羊抗人IgG，Fcγ片段特异性捕获抗体在4℃包被384孔MaxiSorp平板过夜。在包被后，用PBS/0.05％Tween20(PBST)洗涤孔2次，然后用含5％奶粉的PBST室温封闭1小时，再用PBST进行2次洗涤步骤。添加重组的BCMA和TACI Fc-融合蛋白，并在室温捕获1h。然后，添加纯化和稀释的BAFFR特异性Fab，并在室温孵育平板1小时。为了检测Fab，添加碱性磷酸酶(AP)缀合的山羊抗人IgG，Fab特异性，并在室温孵育平板1小时。在每个孵育步骤后，用PBST洗涤孔5次。对于AP缀合物的检测，根据生产商的说明书使用AttoPhos(Roche)。使用TECAN Spectrafluor读板器测量荧光。
3：基于细胞的功能测定
BLyS诱导的人B细胞增殖的共刺激
利用MACS B-细胞分离试剂盒II(Miltenyi Biotec)，通过排除其它细胞类型，从外周血单核细胞中纯化未接触的B淋巴细胞。为了诱导B细胞增殖，以5个重复，将含1x105细胞的100μl接种到圆底96孔板中。以3ng/ml的浓度添加人可溶性BLyS，以及0.35％(体积/体积)偶联了抗人IgM抗体的珠子。为了确定其抑制效力，以不同的浓度添加不同浓度的抗BAFFR抗体。为了确定抗BAFFR抗体的激动性质，用0.35％(体积/体积)偶联了抗人IgM抗体的珠子和递增浓度的抗BAFFR抗体(不添加额外的BLyS)诱导细胞。其后，培养细胞3天。对于最后的12小时，添加1μCi/孔滴定的胸腺嘧啶。将细胞收获到滤器上，在闪烁计数器中定量细胞相关的放射活性。
BLyS诱导的人B细胞IgG1生产的共刺激
利用MACS B-细胞分离试剂盒II(Miltenyi Biotec)，通过排除其它细胞类型，从外周血单核细胞中纯化未接触的B淋巴细胞。为了诱导IgG1合成，以5个重复，将含1x105细胞的100μl接种到圆底96孔板中，并用3ng/ml的人可溶性BLyS和100ng/ml的人IL-21(Pepro Tech Inc.)共同刺激。为了确定其抑制效力，以不同的浓度添加抗BAFFR抗体。为了确定抗BAFFR抗体的激动性质，用100ng/ml的人IL-21和递增浓度的抗BAFFR抗体(不添加额外的BLyS)诱导细胞。培养细胞9天并收集上清液。通过酶联免疫吸附测定(ELISA)确定细胞上清液中的IgG1。
抗体依赖性细胞毒作用测定(ADCC)
利用MACS B-细胞分离试剂盒II(Miltenyi Biotec)，通过排除其它细胞类型，从外周血单核细胞(PBMC)中纯化未接触的B淋巴细胞。相似的，利用MACS人NK细胞分离试剂盒(Miltenyi Biotec)，在AutoMAC装置上，通过阴性排除从PBMC中纯化自体的天然杀伤(NK)细胞。在V形96孔板(Corning)中，在50μl培养基中用1x104B细胞孵育100μl的递增浓度的抗BAFFR抗体20分钟。然后，添加含1x105NK细胞的50μl，并在37℃孵育4小时。离心沉淀细胞，去除150μl上清液。重悬细胞，并添加10μl的1∶100稀释的7-胺放线菌素D(7-AAD，BectonDickinson)。在FACScalibur(Becton Dickinson)仪器中计数细胞。使用CellQuest Pro软件(Becton Dickinson)实施7-AAD阳性细胞的数据分析。
4：体内功能测定
体内B细胞排除测定
如下评估抗BAFFR抗体对B细胞数量的排除效应：
a)通过全血或分离的外周血单核细胞(PBMC)染色，测量血淋巴细胞部分中的B细胞相对数量，所述染色是使用荧光标记的B细胞和T细胞表面标志物(分别是CD3和CD19)特异性的抗体。通过流式细胞仪定量CD3和CD19阳性细胞的相对百分比，可以通过T细胞相对于B细胞的比例的增加来表示B细胞的选择性降低。
b)根据生产商的说明，利用荧光标记的抗CD19抗体组合TruCOUNT管(Cat#340334；Becton Dickinson，San Jose CA)，通过流式细胞仪以细胞/微升血液来确定绝对B细胞数量。
CIA动物模型测定
已假设胶原诱导性关节炎(CIA)反映了人类疾病的许多方面。通过用佐剂中的II型胶原免疫遗传敏感的小鼠品系来诱导CIA，并通过自体免疫反应介导CIA，包括自身抗体产生，所述自身抗体然后结合至II型胶原(CII)的特定区域。两种B和T淋巴细胞对CIA的发病机制是重要的。动物模型中的关节组织学与人类疾病在多个方面具有许多相似性，例如滑膜增生、边缘侵蚀和软骨表面破坏是发病机制的一些特征。
在第0天用II型胶原(C-II)免疫和随后第21天用C-II加强处理后，DBA/1小鼠通常发展出严重的关节炎症状。在本研究中，腹膜内处理小鼠，在预防性方案中，每只小鼠用200μg抗BAFFR抗体或同种型对照抗体每周处理2次(-10天至约第36天)。在实验过程中监控爪肿胀，作为疾病严重程度的指示。在实验结束时，如果观察到肿胀效果，则对爪实施组织学。可以通过细胞分离和FACS分析评估脾脏、血和淋巴结中的B细胞排除。实施抗胶原抗体的ELISA，研究是否还抑制了抗体滴度。当使用Dunnetts多重比对测试(单边ANOVA)时，如果抗体表现出对肿胀的统计学显著的降低，则认为抗体在CIA动物模型中具有良好的效果。通常，这反映为随时间进程爪肿胀50％降低，并在各组的动物之间具有低差异。
实施例：
下表描述了本发明抗体的特定实例的相应CDR的SEQ ID号。
HCDR1、HCDR2和HCDR3代表抗体重链的CDR1、CDR2和CDR3；
LCDR1、LCDR2和LCDR3代表抗体轻链的CDR1、CDR2和CDR3。
  mAb#   HCDR1   HCDR2   HCDR3   LCDR1   LCDR2   LCDR3
  MOR06743   NO：2   NO：9   NO：16   NO：23   NO：30   NO：37
  MOR06654   NO：3   NO：10   NO：17   NO：24   NO：31   NO：38
  MOR07342   NO：4   NO：11   NO：18   NO：25   NO：32   NO：39
  MOR07347   NO：5   NO：12   NO：19   NO：26   NO：33   NO：40
  MOR07348   NO：6   NO：13   NO：20   NO：27   NO：34   NO：41
  MOR07349   NO：7   NO：14   NO：21   NO：28   NO：35   NO：42
表1：mAb#和SEQ ID的对应
实施例的详细表征
在FACS中确定人Fab模式的本发明抗体的EC50
通过对转染的HEK293细胞以及表达内源性BAFFR的Raji细胞在FACS中的Fab滴定，确定Fab的EC50。
  MOR0   Raji细胞的EC50[nM]   HEK293-hBAFFR的EC50[nM]
  6654   0.12/0.32/0.44/0.51   0.98/0.25
  6743   0.23/0.18   0.59/0.27
  7342   0.06   0.18
  7347   0.03/0.06/0.18   0.08
  7348   0.12   0.24
  7349   0.13   0.24
表2：Fab抗体对Raji细胞和转染的HEK293-hBAFFR的EC50
由于在MOR07347中HCDR3的110位发现的谷氨酰胺似乎是有利的，也将该位置导入到交叉克隆MOR6743中，获得抗体MOR07685。该抗体表现出在FACS滴定中确定的EC50与MOR06743和MOR07347可比较。
在BAFFR-BLyS结合测定(FACS)中确定Fab的IC50值
在BAFFR-BLyS结合抑制测定中，通过Fab滴定Raji细胞(FACS)，确定人Fab模式的本发明抗体的IC50值。这些分析的结果列举在表3中。
  MOR0   IC50[nM]
  6654   0.09/0.37/0.30/0.16
  6743   0.13/0.17
  7342   0.09
  7347   0.02
  7348   0.20
  7349   0.17
  7685   0.12
表3：BAFFR-BLyS结合抑制在人Fab模式对Raji细胞的IC50值
在BAFFR-BLyS结合测定(ELISA)中确定抗体的IC50值
在竞争性ELISA中确定人Fab和IgG2模式的本发明抗体的IC50值，其中滴定抗体至抑制BAFFR的胞外结构域(BAFFR:Fc融合蛋白)与人可溶性BLyS之间的相互作用。还在相似的竞争性ELISA中确定IC50值，其中滴定本发明的抗体至抑制BAFFR来源肽(miniBR3)对人可溶性BLyS测定的结合。
这些分析的结果列举在表4中。
表4：BAFFR-BLyS结合抑制在人IgG2模式中的IC50值
分析BCMA和TACI的交叉反应性
BCMA和TACI是与BAFFR相关的蛋白质，也可以与配体BLyS结合。测试Fab与这两种蛋白质的不需要的交叉反应性。在ELISA中对重组蛋白测试BCMA与结合子的交叉反应性，以及在FACS分析中对细胞表面抗原测试BCMA与结合子的交叉反应性。
在ELISA中，在通过抗人Fc抗体捕获至Maxisorp平板上的BAFFR:Fc上，滴定Fab从400nM至0.005nM。在高Fab浓度＞100nM时，仅MOR07342和MOR07346表现出与BCMA的一些交叉反应性。相反，MOR06654、MOR07347、MOR07348、MOR07349表现出无高于背景的BCMA结合。所有的Fab都满足1000倍的辨别因子。
在FACS中，在BCMA-转染的HEK293细胞中分析下列Fab，并从1μM滴定至0.005nM：MOR06654、MOR06743、MOR07342、MOR07347、MOR07348和MOR07349。在330nM，仅MOR07342表现出升高的结合信号，超出背景2倍。在该浓度下，所有的其它受试Fab都未表现出信号。在1μM的Fab浓度下，MOR06654、MOR06743和MOR07347表现出超出背景3-4倍的信号。MOR07342表现出具有超出背景20倍的信号的与BCMA-转染的细胞结合。直到1μM的Fab浓度，MOR07348和MOR07349完全不与BCMA结合。
本发明的抗体在功能性B细胞测定中的效价
抗体在BLyS介导的共刺激B细胞增殖测定中的效价和激动作用
用抗IgM抗体和人可溶性BLyS刺激原始人血来源的B细胞，诱导B细胞增殖。滴定本发明的抗体，阻断BLyS的共刺激作用。为了测量抗体的激动(即，BLyS样)效应，只用抗IgM抗体刺激B细胞。滴定BAFFR抗体，测量B细胞增殖的潜在增强。关于不同的BAFFR抗体模式(人Fab、IgG2和IgG1)，这些分析的结果显示在表5中。
表5：在人Fab、IgG2和IgG1模式下，本发明的抗体的拮抗和激动活性
抗体在BLyS介导的共刺激B细胞IgG1生产测定中的效价和激动作用
用IL-21和人可溶性BLyS刺激原始人血来源的B细胞，诱导IgG1生产。滴定本发明的抗体，阻断BLyS的共刺激作用。为了测量抗体的激动(即，BLyS样)效应，只用IL-21刺激B细胞。滴定抗BAFFR抗体，测量IgG1分泌的潜在增强。这些分析的结果显示在表6中。
表6：B细胞IgG1生产的IC50
在ADCC测定中抗体引发B细胞杀伤的效价
在添加自体的天然杀伤(NK)细胞之前，允许递增浓度的抗BAFFR抗体与原始的人血来源的B细胞结合，诱导杀伤反应。4个小时后，通过FACS计数凋亡细胞的数量。关于IgG1和IgG2抗体模式的这些分析的结果显示在表7中。
  模式   MOR0   ADCC
  EC50[nM]
  IgG2   6654   ＞63
  IgG2   7342   ＞63
  IgG1   6654   0.186
  IgG1   7342   0.195
表7：显示本发明抗体在IgG1和IgG2模式下的B细胞杀伤活性的EC50
实施例2：CIA小鼠模型中的体内功效
在用完全弗氏佐剂中的牛2型胶原免疫前9、6和2天时，用200μg/动物的抗BAFFR抗体(与鼠IgG2a缀合)或同种型对照抗体处理小鼠。在整个实验过程中，以200μg/小鼠每周施用2次抗体(直到免疫后第35天)。在免疫后第21天，用磷酸缓冲盐溶液中的牛2型胶原加强小鼠。从加强开始的那天起，每2-3天评估肿胀。如图1所示，与它的对照抗CSA抗体相比，抗BAFFR抗体显著的降低了肿胀。
实施例3：在食蟹猴中排除外周B细胞
用每周4次20mg/kg剂量的静脉内抗人BAFF-R单克隆抗体MOR06654(IgG1/k)处理食蟹猴。在不同的给药前和给药后时间点，通过FACS分析确定血中的B细胞数量。简而言之，在True Count管(BD，cat#340334)中，用荧光标记的抗CD20抗体(抗人CD20-PE，Clone 2H7，BD，cat#555623)或抗CD40抗体(抗人CD40-APC，Clone 5C3 BD，cat#555591)孵育血液样品。结果显示在图2中。
在处理的猴子中，B细胞快速排除下降到平均33％的给药前B细胞数(n＝3)。B细胞随后续给药保持或递增的下降。在第56天，B细胞降低的均值是85％(n＝3)，即最后给药后45天。在第56天后观察到B细胞数量的逐渐增加。
总之，用人抗BAFF-R抗体处理导致食蟹猴中外周B细胞快速和持续的降低。该药物动力学效应是可逆的，允许在从循环系统中消除抗体后，重建正常B细胞稳态。
实施例4：用非岩藻糖基化的抗体更强和更多持续的B细胞排除
在第二个实验中，用单剂量的MOR06654(IgG1)或非岩藻糖基化的变体MOR06654B处理食蟹猴。使用PotelligentTM细胞系(Biowa，Inc.)生产MOR06654B。这些细胞系是CHO哺乳动物细胞系，敲除了编码岩藻糖基转移酶的基因。在此细胞系中生产的抗体(MOR06654B)是无岩藻糖基化的。此次，单剂量是仅20μg/kg，i.v.。
如图3所示，在第7天观察到用20μg/kg，i.v.MOR06654处理的微少的、但可观察到的B细胞降低(平均降低22％，n＝3)。对于缺少岩藻糖的抗体MOR06654B，外周B细胞更显著且更持续的降低。此处，降低达到57％(n＝3)，且在单次给药后28天仍有约40％(n＝3)。
实施例5：筛选交叉阻断本发明的BAFFR结合抗体的抗体
Biacore交叉阻断测定
下文一般性的描述了适用于确定抗体或其它结合剂是否交叉阻断或能够交叉阻断本发明的抗体的合适Biacore测定。可以理解，测定可以使用任何本文描述的BAFFR结合剂。
根据生产商的推荐操作Biacore仪器(例如Biacore 3000)。
BAFFR可以通过常规使用的胺偶联化学与例如CM5 Biacore芯片偶联，例如EDC-NHS胺偶联，来产生BAFFR包被的表面。为了获得可测量的结合水平，通常可以将200-800共振单位的BAFFR与芯片偶联(该量产生可测量的结合水平，并且同时可被所用测试试剂的浓度方便的饱和)。
附着BAFFR至BIAcore芯片上的替代方法是通过使用“标签”版的BAFFR，例如N端或C端His标签的BAFFR。在该模式中，抗His抗体可与Biacore芯片偶联，然后His标签的BAFFR可以通过芯片表面并被抗His抗体捕获。
在合适的缓冲液中，以化学当量的量混合其交叉阻断彼此的能力有待评估的两种抗体，例如以结合位点1比1的摩尔比，产生测试混合物。使用的缓冲液通常是在蛋白质化学中通常使用的缓冲液，例如PBS(136mMNaCl，2.7mM KCl，10mM Na2HPO4，1.76mM KH2PO4 pH 7.4)。当计算基于结合位点的浓度时，假设抗体的分子量为抗体的总分子量除以该抗体上的靶(即，BAFFR)结合位点的数。
测试混合物中的各抗体的浓度应该足够高，以保证抗体的结合位点对于结合在BIAcore芯片上的BAFFR分子是饱和的。混合物中的抗体处于相同的摩尔浓度(基于结合)，且所述浓度可通常在1.0mM和1.5mM之间(基于结合位点)。
含有独立抗体的独立溶液本身也是分别制备的。用于这些独立溶液的缓冲液应该是测试混合物使用的相同浓度的相同缓冲液。
将测试混合物通过BAFFR包被的BIAcore芯片，并记录结合。然后通过用例如酸(如30mM HCl)处理芯片约1分钟，来去除结合的抗体。重要的是，不破坏结合在芯片上的BAFFR分子。
然后，只将第一抗体的溶液通过BAFFR包被的表面，并记录结合。然后，在不破坏芯片结合的BAFFR的条件下处理芯片，去除所有的结合抗体，例如通过上述酸处理。
然后，只将第二抗体的溶液通过BAFFR包被的表面，并记录结合的量。
最大理论结合可以定义为各抗体分别与BAFFR结合的总量。然后，将其与所测量的抗体混合物的实际结合相比。如果实际结合低于理论结合的值，则两种抗体是彼此交叉阻断的。
基于ELISA的交叉阻断测定
还可以通过使用ELISA测定检测抗BAFFR抗体或另一种BAFFR结合剂的交叉阻断。
ELISA测定的基本原则涉及将抗BAFFR抗体包被到ELISA平板的孔上。然后，向溶液中添加过量的第二种潜在交叉阻断的、抗BAFFR抗体(即，未结合至ELISA平板上)。然后向孔中添加有限量的BAFFR-Fc。
包被至孔上的抗体和溶液中的抗体将竞争结合有限量的BAFFR分子。然后洗涤平板，去除未与包被的抗体结合的BAFFR-Fc，也去除第二溶液相的抗体，以及第二溶液相抗体与BAFFR-Fc之间形成的任何复合物。然后，使用适当的BAFFR检测试剂测量结合的BAFFR的量。相对于在缺少第二溶液相的抗体的条件下，包被抗体可以结合的BAFFR分子数量，能够交叉阻断包被抗体的溶液中的抗体将能够导致包被抗体可以结合的BAFFR分子数量的下降。
下文进一步更详细的描述了关于命名为Ab-X和Ab-Y的两种抗体的上述测定。在选择Ab-X作为固定化抗体的情况下，将Ab-X包被至ELISA平板的孔中，之后用适当的阻断溶液封闭平板，以最小化随后添加的试剂的非特异性结合。然后，向ELISA平板添加过量的Ab-Y，使得在包被ELISA平板的过程中，每孔的Ab-Y BAFFR结合位点的摩尔数至少比每孔所使用的Ab-X BAFFR结合位点的摩尔数高10倍。然后添加BAFFR-Fc，使得每孔添加的BAFFR-Fc的摩尔数至少比包被每孔使用的Ab-X BAFFR结合位点的摩尔数低25倍。在适当的孵育期后，洗涤ELISA平板，并添加BAFFR检测试剂，测量包被的抗BAFFR抗体(在此情况下是Ab-X)特异性结合的BAFFR的量。测定的背景信号定义为在具有包被抗体(在此情况下是Ab-X)、第二溶液相抗体(在此情况下是Ab-Y)、仅BAFFR缓冲液(即，无BAFFR)和BAFFR检测试剂的孔中获得的信号。测定的阳性对照信号定义为在具有包被抗体(在此情况下是Ab-X)、仅第二溶液相抗体缓冲液(即，无第二种溶液相抗体)、BAFFR和BAFFR检测试剂的孔中获得的信号。ELISA测定需要以这样的方式运行，所述方式使得阳性对照信号是背景信号的至少6倍。
为了避免由用作包被抗体和用作第二(竞争者)抗体的抗体选择导致的任何人为结果(例如，Ab-X和Ab-Y对于BAFFR显著不同的亲和力)，需要以两种模式运行交叉阻断测定：1)模式1是其中Ab-X是包被在ELISA平板上的抗体，Ab-Y是在溶液中的竞争者抗体，和2)模式2是其中Ab-Y是包被在ELISA平板上的抗体，Ab-X是在溶液中的竞争者抗体。

Claims (40)

1.分离的抗体，其包含
重链可变区CDR1，其由SEQ ID NO:2的氨基酸序列组成；重链可变区CDR2，其由SEQ ID NO:9的氨基酸序列组成；重链可变区CDR3，其由SEQ ID NO:16的氨基酸序列组成；轻链可变区CDR1，其由SEQ IDNO:23的氨基酸序列组成；轻链可变区CDR2，其由SEQ ID NO:30的氨基酸序列组成；和轻链可变区CDR3，其由SEQ ID NO:37的氨基酸序列组成；或
重链可变区CDR1，其由SEQ ID NO:3的氨基酸序列组成；重链可变区CDR2，其由SEQ ID NO:10的氨基酸序列组成；重链可变区CDR3，其由SEQ ID NO:17的氨基酸序列组成；轻链可变区CDR1，其由SEQ IDNO:24的氨基酸序列组成；轻链可变区CDR2，其由SEQ ID NO:31的氨基酸序列组成；和轻链可变区CDR3，其由SEQ ID NO:38的氨基酸序列组成；或
重链可变区CDR1，其由SEQ ID NO:4的氨基酸序列组成；重链可变区CDR2，其由SEQ ID NO:11的氨基酸序列组成；重链可变区CDR3，其由SEQ ID NO:18的氨基酸序列组成；轻链可变区CDR1，其由SEQ IDNO:25的氨基酸序列组成；轻链可变区CDR2，其由SEQ ID NO:32的氨基酸序列组成；和轻链可变区CDR3，其由SEQ ID NO:39的氨基酸序列组成；或
重链可变区CDR1，其由SEQ ID NO:5的氨基酸序列组成；重链可变区CDR2，其由SEQ ID NO:12的氨基酸序列组成；重链可变区CDR3，其由SEQ ID NO:19的氨基酸序列组成；轻链可变区CDR1，其由SEQ IDNO:26的氨基酸序列组成；轻链可变区CDR2，其由SEQ ID NO:33的氨基酸序列组成；和轻链可变区CDR3，其由SEQ ID NO:40的氨基酸序列组成；或
重链可变区CDR1，其由SEQ ID NO:6的氨基酸序列组成；重链可变区CDR2，其由SEQ ID NO:13的氨基酸序列组成；重链可变区CDR3，其由SEQ ID NO:20的氨基酸序列组成；轻链可变区CDR1，其由SEQ IDNO:27的氨基酸序列组成；轻链可变区CDR2，其由SEQ ID NO:34的氨基酸序列组成；和轻链可变区CDR3，其由SEQ ID NO:41的氨基酸序列组成；或
重链可变区CDR1，其由SEQ ID NO:7的氨基酸序列组成；重链可变区CDR2，其由SEQ ID NO:14的氨基酸序列组成；重链可变区CDR3，其由SEQ ID NO:21的氨基酸序列组成；轻链可变区CDR1，其由SEQ IDNO:28的氨基酸序列组成；轻链可变区CDR2，其由SEQ ID NO:35的氨基酸序列组成；和轻链可变区CDR3，其由SEQ ID NO:42的氨基酸序列组成；
其特征是所述抗体以100nM或更低的KD结合BAFFR多肽，并以10nM或更低的IC50抑制BLyS诱导的人B细胞增殖，并在体内或体外排除B细胞。
2.权利要求1的抗体，其包含SEQ D NO:51的VH多肽序列和SEQID NO:44的VL多肽序列。
3.权利要求1的抗体，其包含SEQ D NO:52的VH多肽序列和SEQID NO:45的VL多肽序列。
4.权利要求1的抗体，其包含SEQ D NO:53的VH多肽序列和SEQID NO:46的VL多肽序列。
5.权利要求1的抗体，其包含SEQ D NO:54的VH多肽序列和SEQID NO:47的VL多肽序列。
6.权利要求1的抗体，其包含SEQ D NO:55的VH多肽序列和SEQID NO:48的VL多肽序列。
7.权利要求1的抗体，其包含SEQ D NO:56的VH多肽序列和SEQID NO:49的VL多肽序列。
8.权利要求1-7中任一项的抗体，其中如在人B细胞排除ADCC测定中测量的，所述抗体以10nM或更低、1nM或更低或100pM或更低的EC50在体外排除B细胞。
9.权利要求1-7中任一项的抗体，其中如B细胞的荧光激活细胞分选(FACS)所测量的，与未处理对照相比，所述抗体能够在体内降低B细胞的百分比达70％。
10.权利要求1-7中任一项的抗体，其中如B细胞的荧光激活细胞分选(FACS)所测量的，与未处理对照相比，所述抗体能够在体内降低B细胞的百分比达80％。
11.权利要求1-7中任一项的抗体，其中如B细胞的荧光激活细胞分选(FACS)所测量的，与未处理对照相比，所述抗体能够在体内降低B细胞的百分比达90％。
12.权利要求1-7任一项的抗体，其中所述抗体不具有或具有低的激动活性。
13.权利要求1-7任一项的抗体，其是完全人IgG1抗体或人源化IgG1抗体。
14.权利要求13的抗体，其包含突变的或化学修饰的氨基酸Fc区，其中所述突变的或化学修饰的Fc区与野生型Fc区相比时提供增加的ADCC活性。
15.权利要求13的抗体，其通过在缺少岩藻糖基转移酶的细胞系中重组表达来生产，从而与表达野生型FUT8基因的细胞系相比，增加其中生产的抗体的ADCC活性。
16.权利要求14的抗体，其通过在缺少岩藻糖基转移酶的细胞系中重组表达来生产，从而与表达野生型FUT8基因的细胞系相比，增加其中生产的抗体的ADCC活性。
17.权利要求15或16的抗体，其中所述细胞系为缺乏表达编码岩藻糖基转移酶的FUT8基因的哺乳动物细胞系。
18.权利要求1-7任一项的抗体，其与氨基酸17和43之间的BAFFR的区结合。
19.权利要求18的抗体，其中所述区为肽SEQ ID NO:88。
20.权利要求1-7任一项的抗体，其包含与SEQ ID NO:75-78中的至少一种具有至少100百分比序列同一性的全长重链氨基酸序列。
21.抗体，其包含任一的：
(a)SEQ ID NO:75的重链序列和SEQ ID NO:71的轻链序列；
(b)SEQ ID NO:76的重链序列和SEQ ID NO:72的轻链序列；
(c)SEQ ID NO:77的重链序列和SEQ ID NO:73的轻链序列；或
(d)SEQ ID NO:78的重链序列和SEQ ID NO:74的轻链序列。
22.权利要求1-7和21任一项的抗体，其被权利要求21的至少一种抗体交叉阻断与BAFFR的结合。
23.权利要求1-7和21任一项的抗体，其交叉阻断与BAFFR的结合，或被权利要求21的至少一种抗体交叉阻断与BAFFR的结合。
24.包含权利要求1-23任一项的抗体的药物组合物。
25.权利要求24的药物组合物，其与一种或多种可药用赋形剂、稀释剂或载体组合。
26.权利要求24或25的药物组合物，其还包含其它活性成分。
27.权利要求1-7和21任一项的抗体或权利要求24或25的药物组合物，其用作药剂。
28.权利要求1-7和21任一项的抗体或权利要求24或25的药物组合物，其用于治疗病理性病症，所述病理性病症是由BAFF受体介导的或可以通过杀死或排除B细胞被治疗。
29.权利要求1-7和21任一项的抗体或权利要求24或25的药物组合物，其用于治疗自身免疫疾病。
30.权利要求29的抗体或药物组合物，其中所述自身免疫疾病为类风湿性关节炎或系统性红斑狼疮或综合征或寻常天疱疮。
31.权利要求1-7和21任一项的抗体或权利要求24或25的药物组合物，其用于治疗B细胞瘤。
32.权利要求31的抗体或药物组合物，其中B细胞瘤为淋巴瘤、白血病或骨髓瘤。
33.编码权利要求1-23任一项的抗体的分离的核酸。
34.包含权利要求33的一种或多种核酸的克隆或表达载体。
35.权利要求34的克隆或表达载体，其包含选自SEQ ID NO:79-86的至少一种核酸，或编码至少一种CDR区的片段。
36.包含权利要求34或35的一种或多种克隆或表达载体的宿主细胞。
37.用于生产权利要求1-23的任一项的抗体的方法，其包括培养权利要求36的宿主细胞和分离所述抗体。
38.权利要求37的方法，其中所述宿主细胞是缺少岩藻糖基转移酶表达的细胞系。
39.权利要求38的方法，其中所述细胞系是缺乏编码岩藻糖基转移酶的基因表达的哺乳动物细胞。
40.权利要求39的方法，其中所述哺乳动物细胞是缺乏FUT8基因的CHO细胞系。
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