JP5781762B2 - ユニバーサルiii型フィブロネクチン結合ドメインのライブラリ - Google Patents
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Description
本願は、2007年8月10日出願の米国仮出願60/955,334号と、2008年6月24日出願の米国仮出願61/075,107号に基づく優先権を主張し、前記の両米国仮出願は本願に参照として組み込まれる。
スカフォールドフレームワークのコアは遺伝子工学的に合成することができ、これにより様々な配列変異体のライブラリを構築することができる。配列の多様性は一般に、ループ構造部等のタンパク質の外部表面、またはリガンド結合領域として機能する他のタンパク質の外部表面に集中して表れる。
このような手法は本質的に確率的なものであり、十分な配列の多様性を包括的に調査するためには非常に大きなライブラリを構築する必要がある。また、生じた変異体の数や、タンパク質の何処にどのようなタイプの変異体が生じたかを明らかにする手段が無い。
さらに、このようなランダムな方法においてはでたらめな置換が生じ、タンパク構造体の不安定化の原因となる。親和性最適化等の性質を改善した場合、元のタンパク質のスカフォールドフレームワークと比較すると熱安定性が低下することが知られている。
さらに、ライブラリのサイズを、異なるシステムにおいて全ての多様性を容易にスクリーニングできるようなサイズにすることができる。また、設計されたループの多様性の典型的なものは、予め決められた多数の標的リガンドに結合することができる。さらに、ループのシステマチックな設計は、次の段階で、回収された結合クローンの親和性成熟を可能にする。
このポリペプチドライブラリには、(a)選択された1以上の天然III型フィブロネクチンポリペプチドの野生型アミノ酸配列を有するA, AB, B, C, CD, D, E, EF, F, 及びG領域と、(b)選択された長さを有するBC, DE, 及びFGループ領域とが含まれる。
選択された長さを有する少なくとも1の選択されたループ領域が自然−変異体組合せ配列のライブラリを有し、この自然−変異体組合せ配列は、各ループ位置において保存、または選択された半保存コンセンサスアミノ酸をエンコードし、もしコンセンサスアミノ酸の発現頻度が選択された閾値頻度である50%以上と同じか低い場合には、半保存アミノ酸、及び発現率がその位置における選択された最小閾値頻度より高い可変性アミノ酸を含む他の自然変異体アミノ酸をエンコードし、またはこれらの化学的等価物をエンコードするコード配列によって発現される。
この実施形態では、ライブラリには、選択されたループ位置において例えば10%の合理的な発現頻度を有する全ての自然変異体、またはこれら自然変異体の化学的等価物が含まれる。
別の実施形態では、ライブラリには、ヒトフィブロネクチンのIII型フィブロネクチンの10番目のモジュールのA, AB, B, C, CD, D, E, EF, F,及びG領域中の野生型アミノ酸配列が含まれる。
特に、自然−変異体組合せライブラリにより、FNFα. VEGF、及びHMGB1等の様々な抗原標的に対し、高い効率で高度に結合するポリペプチドが提供されることが見出された。
スクリーニングにはさらに、選択されたフィブロネクチン結合ドメインをエンコードするFN3ポリヌクレオチドを同定する操作が含まれる。
このポリペプチドライブラリには、(a)選択された天然III型フィブロネクチンポリペプチドの野生型アミノ酸配列を有するA, AB, B, C, CD, D, E, EF, F, 及びG領域、及び(b)選択された長さを有するBC, DE, 及びFGループ領域が含まれる。
少なくとも1の選択された長さを有する選択されたループ領域には、保存または選択された半保存コンセンサスアミノ酸、あるいは、コンセンサスアミノ酸の出現頻度が選択された閾値頻度である少なくとも50%と同じかそれ未満のときは、単一の共通標的アミノ酸及び副生アミノ酸を各ループ位置にエンコードするコード配列のライブラリにより発現されたウォークスルー突然変異誘発配列が含まれる。
別の実施形態では、ライブラリには、ヒトフィブロネクチンのIII型フィブロネクチンの10番目のモジュールのA, AB, B, C, CD, D, E, EF, F,及びG領域中の野生型アミノ酸配列が含まれる。
この方法には、以下のステップが含まれる。
(i) BC, DE,及びFG アミノ酸ループ配列を、天然III型フィブロネクチンドメインポリペプチドの集合体中にアライメントさせるステップと、
(ii) アライメントさせたループ配列を、ループ長に従って分類するステップと、
(iii) ステップ(ii)から選択した任意のループ及びループ長について、位置的アミノ酸出現頻度測定を行い、各ループ位置におけるアミノ酸出現頻度を求めるステップと、
(iv) ステップ(iii)で分析した各ループ及びループ長について、それぞれの位置毎に、保存または選択された半保存コンセンサスアミノ酸、及びその他の自然−変異体アミノ酸であるかを同定するステップと、
(v) 少なくとも1の選択されたループ及びループ長について、
(1)コンセンサスアミノ酸、あるいはコンセンサスアミノ酸の出現頻度が選択された閾値頻度である少なくとも50%と同じかそれ未満のときは、単一の共通標的アミノ酸及び副生成アミノ酸を各ループ位置にエンコードするコード配列のライブラリにより発現されたウォークスルー突然変異誘発配列のライブラリ、または
(2) コンセンサスアミノ酸、あるいはコンセンサスアミノ酸の出現頻度が選択された閾値頻度である少なくとも50%と同じかそれ未満のときは、半保存アミノ酸と、発現率がその位置における選択された最小閾値頻度より高い可変性アミノ酸、またはこれらの化学的等価物を含む他の自然変異体アミノ酸を各ループ位置にエンコードするコード配列のライブラリにより発現された自然−変異体組合せ配列のライブラリを構築するステップと、
(vi) コード配列のライブラリをFN3コード配列のフレームワークに導入して、FN3発現ライブラリを構築するステップと、
(vi) 発現ライブラリのFN3ポリペプチドを発現させるステップ。
特に断りが無い限り、以下の用語は下記に示す意味で用いられる。
各FN3ドメインポリペプチドの呼び名は、例えばヒトフィブロネクチンの10番目と14番目のモジュール(10/FNまたは14/FN)、あるいはテネイシンの1番目のモジュール(1/テネイシン)等のように、モジュールの番号とタンパクの名称で示す。
また、「ライブラリ」という用語は、選択された長さを有する選択されたBC, DE, またはFGループ中のアミノ酸配列の集合体、及びループまたはポリペプチドアミノ酸ライブラリをエンコードするコード配列の集合体の意味でも用いられる。
指定された1つの残基がこのような高頻度、すなわち約50%の閾値より高い頻度で出現すると認められるとき、その残基は保存されていると認められ、この発明のライブラリにおいて、少なくとも分析されたループ中のアミノ酸残基位置に関しては、「固定された」または「一定の」残基と表される。
一般に、適切な量の核酸の突然変異誘発/変異性が、半保存アミノ酸(コドン)位置に2または3残基が適切に出現するようにして導入される。すなわち、この2または3残基は、その位置に「半保存である」と言うことができる。一般に「選択された半保存アミノ酸残基」は、その位置において最も高い出現頻度を有する2以上の半保存アミノ酸残基であるが、必ずそうである必要は無い。
一般に、適切な量の核酸の突然変異誘発/多様性が、可変性アミノ酸(コドン)位置に、正確な残基のスペクトルが表れるようにして導入される。所望により、アミノ酸残基位置、すなわち保存、半保存、または可変性の多様性または結果を、本願に開示するWTMや自然−変異体組合せ配列ライブラリ等の、適切な突然変異誘発方法を用いて表わし、調査し、変更することができることは言うまでもない。
可変性アミノ酸の閾値頻度の下限は、例えば5から10%またはこれより低い値である。この閾値頻度より低い場合、自然−変異体アミノ酸のその位置には、可変性アミノ酸残基は含まれない。
自然変異体アミノ酸は、化学的に等価なアミノ酸で置換されていてもよい。また、自然−変異体アミノ酸には、選択された出現頻度が例えば5〜10%より低い可変性アミノ酸残基や、別の自然−変異体アミノ酸と化学的に等価なアミノ酸残基は含まれない。
このコード配列は、各ループ位置において、保存または選択された半保存コンセンサスアミノ酸をエンコードするか、あるいはコンセンサスアミノ酸の出現頻度が選択された閾値頻度である少なくとも50%と同じかそれ未満のときは、単一の共通標的アミノ酸及び副生アミノ酸をエンコードする。
従って、各標的アミノ酸に関して、選択されたループ内のウォークスルー突然変異誘発配列のライブラリには、コンセンサスアミノ酸の出現頻度が指定された閾値頻度以下であるループ内における1から全ての位置の全組合せにおける標的アミノ酸が含まれる。
閾値頻度が100%である場合、ループ中の各位置には、ライブラリに含まれる少なくとも1の標的アミノ酸が含まれる。
また、「ウォークスルー突然変異誘発配列のライブラリ」という用語には、例えば9つの異なるアミノ酸毎のライブラリ等のように、標的アミノ酸毎のウォークスルー突然変異誘発ライブラリの混合物も含まれる。
従って、選択されたループ長を有する選択されたループ内の各アミノ酸位置において、自然変異体組合せ配列のライブラリには、その位置におけるコンセンサスアミノ酸と、その位置において例えば少なくとも5〜10%の頻度のような最小の頻度を有することで特定される他のアミノ酸変異体、または化学的に等価なアミノ酸が含まれる。
さらに、自然変異体は、コドン縮重のためにそのアミノ酸のコード配列が多数の副生アミノ酸を産出するときは、置換されているか、または欠損している。
そのループ領域においてエンコードされるアミノ酸変異体の平均数は、例えばBC/11 , BC/14, BC/15等のようにループ長が10以上のループの場合一般に3〜5、例えば4である。また、置換の平均数は、DE/6, FG/8, FG/11等の短いループの場合6以上である(変異体が生じるのは6箇所だけである)。これらにより、FN3 BC, DE, またはFGループの場合、典型的ループ領域の全体的多様性が好ましくは約104〜107の範囲に保たれ、この3つのループの内の2つのループの多様性が約1012以下に保たれる。
以下に示す実施例9,10から、任意のループ位置における自然変異体は、最大3〜5の変異体に限定されることが分かる。ここで、除外された自然変異体は、そのアミノ酸についてのコドン変化が多数の副生アミノ酸を生じる原因となり、既にその変異体が配列中に化学的に等価なアミノ酸で表されているか、または配列プロファイル中におけるアミノ酸の出現頻度が、例えば10%以下のように相対的に低い変異体である。
また、フレームワーク領域には、ストランドAとB、CとD、及びEとFの間のAB, CD, 及びEFループが含まれる。BC, DE,及びFG可変性配列ループもフレームワーク領域と呼ばれ、このフレームワーク領域において、このル内に所望のアミノ酸多様性を生成するために突然変異誘発が行われる
この発明では、配列の多様性はBC, DE及びFGループの1以上に組み込まれ、一方、AB, CD及びEFループは、FN3ポリペプチドの野生型アミノ酸配列に割り当てられて、FN3ポリペプチドの他のフレームワーク領域を構成する。
一般的なアミノ酸の分類は次の通りである。(1 ) グリシン、水素側鎖を有する;(2)アラニン(Ala, A)、バリン(VaI, V)、ロイシン(Leu, L)及びイソロイシン(Iso, I)、水素または非置換の脂肪族側鎖を有する;(3)セリン(Ser, S)及びトレオニン(Thr, T)、水酸基が結合した脂肪族側鎖を有する;(4) アスパラギン酸(Asp, D)及びグルタミン酸(GIu, E)、カルボキシル基が結合した側鎖を有する;(5) アスパラギン(Asn, N)及びグルタミン(GIu, Q)、末端がアミド基の脂肪族側鎖を有する;(6)アルギニン(Arg, R)、リジン(Lys, L)及びヒスチジン(His, H)、末端が塩基性アミノ基の脂肪族側鎖を有する;(7)システイン(Cys, C)及びメチオニン(Met, M)、硫黄が結合した脂肪族側鎖を有する;(8)チロシン(Tyr, Y)及びフェニルアラニン(Phe, F)、芳香族側鎖を有する;及び(9)トリプトファン(Trp, W),プラリン(Pro, P)、及びヒスチジン(His, H)、複素環側鎖を有する。
所望により、ポリヌクレオチドを例えば公知の核酸化学を用いて合成したり、ポリメラーゼ等の酵素を用いて作ったりすることができる。また、所望によりポリヌクレオチドを修飾することもできる。修飾の典型例はメチル化、ビオチン化その他の公知の修飾である。さらに、核酸分子は一本鎖でも二本鎖でもよく、所望により検出可能な部位に結合されていてもよい。本願では、ポリヌクレオチド塩基及び他の塩基は、次に示す通常の略号で表す:アデノシン(A)、グアノシン(G)、シチジン(C)、チミジン(T)、ウリジン(U)、 プリン(R=A/G)、ピリミジン(Y=C/TまたはC/U)、アミノ(M=A/C)、ケト(K=G/TまたはG/U)、ストロング(S=G/C), ウィーク(W=A/TまたはA/U), V (AまたはCまたはG、Tではない), NまたはX(任意の塩基)。
特定のリガンドに結合する人工的抗体スカフォールドは、抗体の合理的な代替物になりつつある。抗体は、診断方法及び治療方法の両者において有用である。しかし、あるリガンドを認識する特定の抗体を得ることは困難であった。
現状の抗体ライブラリは、特定の抗原に免疫学的に暴露した後のものに偏っている。したがって、特定の抗体を回収する前に、宿主動物を特定の抗原で免疫付与することが往々にして必要である。さらに、このような生体内から得られる抗体のライブラリには、自己抗原を認識する可能性のあるものは通常含まれていない。通常、自己活性抗体はドナーの免疫系の陰性選択により除去されるため、ヒト発現ライブラリには含まれていない。さらに、抗体の生産には特殊な細胞培養反応器と精製方法が必要とされるため、抗体の生産は難しく、また高価である。
ユニバーサルフィブロネクチンライブラリは、FACS、ファージ・パニング、あるいは選択的リガンド保持による物理的陽性クローン選択を用いてスクリーニングすることができる。このようなin vitroのスクリーニングにより、抗体ハイブリドーマライブラリを作る際の標準的で面倒な操作や、上清のスクリーニングが回避される。
またさらに、フィブロネクチン結合ドメインライブラリ増殖させ、再スクリーニングすることにより、他の所望の標的に対するフィブロネクチン結合モジュールを更に見出すこともできる。
III型フィブロネクチン(FN3)タンパクとは、III型フィブロネクチン(FN3)構造を有する単分子性のサブユニットで構成される一群のタンパク、または、3つの結合ループを有する7つのβ−ストランドからなるモチーフで構成される一群のタンパクである。β−ストランドA, B,及びEはβ−サンドイッチの片方にあり、β−ストランドC, D, F,及びGはもう一方にあり(図2a, 2b参照)、約94アミノ酸の分子量及び約10Kdaの分子量を有する。
FN3ドメインの全体的折り畳み構造は、免疫グロブリンの折り畳み構造に密接に関連しており、BC, DE, 及びFG(図2b参照)と呼ばれるFN3のN-末端近傍の3つのループはそれぞれ、構造的に抗体の重可変(VH)ドメインの相補性決定領域であるDR1, CDR2, 及びCDR3の類似体と考えることができる。
下に示す表1に、いくつかのFN3タンパクと、種類の異なるFN3モジュール、または各タンパクに関連するドメインの数を示す。すなわち、フィブロネクチンそのものは16種の異なるモジュールもしくはドメインから成る。図5に、このモジュールもしくはドメインのアミノ酸配列をアライメントさせた形態で示す。
本願では、FN3タンパクのモジュールの指定は、例えばヒトフィブロネクチンの14番目のFN3モジュール(14/FN or 14/FN3)や、ヒトフィブロネクチンの10番目のFN3モジュール(10/FN or 10/FN3)、テネイシンの1番目のFN3モジュール(1/tenascin)等のように、モジュール番号とタンパクの名称で行う。
フィブロネクチンのアミノ酸配列は、(通常)短い結合配列で隔てられた3つのタイプの内的に相同のリピートまたはモジュールを有する。12種のI型モジュール、2種のII型モジュール、及び16種のIII 型モジュールがあり、それぞれFN I, FN II及びFN IIIと呼ばれる。各FNモジュールは独立して折り畳まれ、ドメインと呼ばれるユニットを構成する。
上記のように、フィブロネクチン中のモジュールと相同なモジュールは、しばしば他のタンパクにおいても見られ、特に随所で見出されるモジュールのひとつであるFN3モチーフは、キナーゼ、フォスファターゼ、テネイシンその他の細胞外レセプターにおいて見られる。
FN3ドメインは、最初に発見された後多くの動物タンパクにおいても見出され、今日ではタンパク配列の2%を占めると考えられている。フィブロネクチンそのものの内部には、三次構造が著しく類似する、16のFN3ドメインがある。興味深いことに、FN3のコンフォメーションは高度に保存されている一方、所与のフィブロネクチン中では、同じ型のモジュールでも個別のモジュール間の類似性は低く、一般に20%未満である。これに対し、多数種の同じFN-IIIモジュールのアミノ酸配列の相同性はきわめて高く、約80%から90%である。
周知のアミノ酸配列と三次構造との関係から予想されるように、同じ型のモジュールは同様の折り畳み構造となる。3種のモジュールは、ほとんど全て逆平行βシートとターンのみから成り、アルファへリックスはまったく無いか、ごく僅かである。F3モジュールでは、トップシートには4つの逆平行βストランドが含まれ、ボトムシートは三本鎖である。FN3の構造は、ジスルフィド結合では安定化されていない。その代わり、モジュールのコアにおける疎水性相互作用によってのみ安定化されている。
この発明のユニバーサルフィブロネクチンライブラリを構築する際の第1ステップは、予め定めた基準に適合する配列の選択である。
PFAM, ProSite及び同様のデータベースにより、FN3ドメイン(図1)を含む配列の検索を行った。これらの電子データベース(図1の枠30)には、発現されたフィブロネクチンとフィブロネクチン様タンパクの配列がカタログ化されており、FN3モジュールや同等の配列を検索することができる(枠32のBLAST検索アルゴリズムを使用)。
次に、FN3モジュールを、モジュールのサブクラス、配列の類似性、または由来生物等の、予め決めた基準に従ってグループ分けする。また、FN I、FN II、アンキリン、その他のタンパク等(枠34)のスカフォールドタンパクのフレームワーク配列の選択を行なうこともできる。
図1に示すように、ループを同定したら、枠38, 40, 及び42に示すように各ループ内の各配列をアライメントさせ、次に枠44に示すようにアライメントさせた配列をループ長に従って複数のグループに分ける。BC, DE, 及びFGループのループ長の分布を、それぞれ図6〜8に示す。
枠46において、この情報を用いて最も一般的ループサイズを選択する。以下説明するこの発明の一般的実施形態では、選択されるループ長はBC/11, BC/14, BC15, DE/6, FG/8, 及びFG11であり、枠48にはBC/11を示してある。
各β−ストランドについて、構造及び配列の両者の比較分析(図3,5)に基づき、フレームワーク中の好ましいループアクセプターサイトを決定することができる。例えば、図3Aにフィブロネクチン10/FN3と14/FN3の全体的ループとβ−ストランドスカフォールドとの構造を重ね合わせて比較した図を示す。また、図3BにFGループと、FN3のモジュール10, 13,及び14の境界のF及びGベータ−ストランドの構造を重ね合わせて比較する図を示す。
各ループ位置を正確に同定する際、上記のステップによって機能的リガンド結合特異性をもたらさないと思われるループ突然変異多様性を最小限にすることができる。さらに詳しくは、実施例2を参照されたい。
高頻度の位置は保存または固定されていると考えられる。やや高い頻度、または「半保存」アミノ酸、または(2または3の組合せが>40%のとき)は、その位置は「野生型」として選択される。
このような野生型アミノ酸は、例えばウォークスルー突然変異誘発 (WTM)等の突然変異誘発を用いて系統的に変異され、ユニバーサル・ループ・ライブラリが構築される(実施例3参照)。
「可変」位置とは、出現頻度が20%を超えるアミノ酸が一つも無い位置のことである。
変異性プロファイル分析を行い、閾値頻度を用いることにより、ループ全体の多様性の設定に用いるために最も適した配列を特定することができる(枠52)。
以下に示すように、アミノ酸変異を導入する際の出現頻度閾値は、下限値が40%、好ましくは50%であり、上限値が最大100%の範囲から選択される。閾値頻度が100%のとき、WTMによるアミノ酸はループの全位置に導入される。この場合、自然−変異体アミノ酸に対する制約は、変異体の総数と、化学的等価物の入手可否だけである。
この発明のユニバーサルフィブロネクチンループライブラリとその構築は、配列及び構造に関する情報を利用して、改良されたフィブロネクチン結合ドメインが増加し得るようにして行われる。
分子構造変換モデルの情報も、特定のループ領域に導入されるべきアミノ酸多様性の選択の指針として用いられる。さらに、この発明により実際に得られたフィブロネクチン結合ドメインの結果も、その後反復して作られ、スクリーニングされるフィブロネクチン結合ドメインの選択(または除外)や、例えば親和性成熟の指針となる。
別の実施形態では、コンピュータによるモデル化は、例えば遺伝子やタンパクの配列の情報や、三次構造のデータベース、あるいはフィブロネクチン結合ドメインの試験結果等の、関連性の高い追加のモデル化情報に基づいて継続的にアップデートされ、コンピュータデータベースの予見性精度が高められる(図1参照)。
この方法によれば、この発明の親和性成熟は、特定の配列との機能応答性と構造に関する情報の範囲と一致し、このような情報を将来評価するフィブロネクチン結合ドメインを産出する際の指針に用いることができる。この方法は、例えばBiacoreアッセイを用いてフィブロネクチン結合ドメインの特定のリガンドに対する結合親和性のスクリーニングを行う場合に特に適している。
例えば導入された多様性等の、フィブロネクチン結合ドメインの特定の複数の領域機能性アミノ酸残基の等位構造とこれらの残基間の空間的相互関係を考慮して、モデル化する。このようなモデル化の基準には、例えばアミノ酸残基側鎖の化学構造、原子間距離、結晶学的データが含まれる。これにより、産出すべきフィブロネクチン結合ドメインの数を合理的に最小限にとどめることができる。
この方法は、その一部また全部を例えばコンピュータで制御された装置等により修正して実施することができる。例えば、フィブロネクチンのモジュール配列選択のデータベース検索、多様性の設計、オリゴヌクレオチドの合成、これらのPCRによるアッセンブリー、選択された標的に結合するフィブロネクチン結合ドメインの候補の選択と発現等の一部または全部を、前記の装置を組み合わせて行うことができる。さらに、この方法を実行するための指令の一部または全部を、電子機器に指令を実行させるために適した媒体に記録することができる。
以上のように、この発明の方法をソフトウエア(例えばコンピュータが読み取れる指令)とハードウエア(例えばコンピュータ、ロボット、及び半導体)を用いる手法により修正して、効率を向上させることができる。
この発明に共通する一側面では、この発明には選択された結合または酵素活性を有する1以上のポリペプチドの存在のスクリーニングに有用な、III型フィブロネクチンドメインポリペプチドのウォークスルー突然変異誘発(WTM)ライブラリが含まれる。
このライブラリのポリペプチドには、(a) 選択された天然III型フィブロネクチンポリペプチドの野生型アミノ酸配列を有するA, AB, B, C, CD, D, E, EF, F, 及びG領域、及び(b)1以上の選択された長さを有するBC, DE, 及びFG領域、が含まれる。
選択された長さの少なくとも1のループ領域には、WTM配列のライブラリが含まれる。このWTM配列のライブラリは、各ループ位置において保存または選択された半保存コンセンサスアミノ酸をエンコードし、コンセンサスアミノ酸の出現頻度が選択された閾値頻度である少なくとも50%と同じかそれ未満のときは、単一の共通標的アミノ酸と任意の副生アミノ酸(所与の位置でのコドンの縮重の結果生じるコード配列により産出されるアミノ酸)をエンコードするコード配列のライブラリでエンコードされたものである。
図15A〜15Iに、選択されたアミノ酸K (15A), Q (15B), D (15C), Y (15D), L (15E), P (15F), S (15G), H (15H), 及びG (151)の各々について、BCループ長サイズ11の基本固定配列と可変位置、野生型を示すアミノ酸マトリックス、WTM標的位置、及び、WTMの縮重コドンから生成する可能性のある多様性を示す。
図16A〜16I、17A〜17I、18A〜18Iは、それぞれBCループ長15 (BC/15)、DEループ長6 (DE/6)、及びFGループ長11 (FG/11 )の場合についての、上記と同様の図である。
ひとつの好ましい実施形態では、コーディングライブラリには、前記の6つの異なるループ及びループ長の各々のコード配列と、前記の9つの選択された「代表的」WTM標的アミノ酸(下記参照)の各々のコード配列とが含まれる。
別の一般的側面では、この発明には、選択された結合活性、または酵素活性を有する1以上のポリペプチドの存在を確認するためのスクリーニングに有用なIII型フィブロネクチンドメインポリペプチドの自然−変異体組合せライブラリが含まれる。このライブラリのポリペプチドには、(a)選択された天然III型フィブロネクチンドポリペプチドの野生型アミノ酸配列を有するA, AB, B, C, CD, D, E, EF, F, 及びG領域と、(b)選択された長さを有するBC, DE, 及びFG領域とが含まれる。
少なくとも1の選択された長さの選択されたループ領域には、各ループ位置において、保存または選択された半保存コンセンサスアミノ酸をエンコードし、コンセンサスアミノ酸の出現頻度が少なくとも選択された閾値頻度である50%以下のときは、その位置における出現頻度が選択された最小閾値頻度より高い半保存アミノ酸及び可変性アミノ酸、またはその化学的等価物を含む他の自然変異体アミノ酸をエンコードするコード配列のライブラリにより発現された自然変異体組合せ配列のライブラリが含まれる。
例えば、選択された閾値頻度が約60%である場合は、FG/11の保存または半保存残基はN79, G79, G/S 81 及びS84(実施例3)であり、これらの位置では自然−変異置換は行わない。
逆に、閾値頻度が100%である場合は、全ての位置において変異が可能と考えられ、そのループ位置における出現頻度が100%の単一のアミノ酸は置換されないものと特定し、例えば出現頻度が90%の非常に優勢なアミノ酸を有する位置の場合には、出現頻度が低い異性体が優勢なアミノ酸に化学的に類似していないときだけ置換する。
一般に、選択される変異(副生アミノ酸を含む)の数は、ループ中の変異可能な置換位置の数と、置換されたループ位置毎の変異体の平均数とに依存する。
望ましくは、ループの多様性が105〜107/全シーケンスの範囲となり、2つの可変シーケンスループのライブラリが約1012の範囲となるように、変異の数を選択する。
以下の実施例9に示すように、11ある位置の内の10にアミノ酸変異を有するFG/11ループは、平均約4アミノ酸変異/位置を有する一方、DE/6等の短いループは、ひとつの位置について6以上の変異を受け入れる。自然−変異体置換が単一ループのみに導入される場合、ひとつの位置についてより多くの変異を受け入れることができる。
要約すれば、自然−変異体ループ配列は、副生アミノ酸とアミノ酸側鎖の冗長性を最小にしながら最も高い自然変異体の出現頻度を含むように構築され、必要であればループとループ長の全多様性が制限されるように、すなわち1以上のループに配列の変異が導入されるように構築される。
これらのルールの適用例は、図9に示すBC/11ループプロファイルを基にしたBC/11ループ(図25B)の変異置換の例に示されている。また、これらのルールの適用例は、図12に示すDEループプロファイルを基にしたDEループ(図25B)の変異置換の例に示されている。
好ましい実施形態のひとつでは、コード配列のライブラリには一対のBC/DEループ, BC/FGループ、またはDE/FGループのコード配列が含まれ、各組合せの中の各ループは、例えばBC/11やDE/6のような選択された長さを有する。このような2つ一組のループのライブラリは、下記の実施例9と10に示されている。
このライブラリから高親和結合性(または酵素性)ポリペプチドを選択した後、始めの一対のループの自然−変異体ライブラリの一方または両方に含まれていた有益な変異体、及び別のループ、すなわち予め固定された配列ループ中の自然−変異体アミノ酸を含む、別の「有用な」ライブラリを構築することができる。
(a) BCループ長11、及びSEQ ID NO.43または49のアミノ酸配列;(b) BCループ長14、及びSEQ ID. NO.44または50のアミノ酸配列;(c) BCループ長15、及びSEQ ID. NO.45または51のアミノ酸配列; (d) DEループ長6、及びSEQ ID. NO.46または52のアミノ酸配列;(e) FGループ長8、及び最初のN-末端の6アミノ酸がSEQ ID. NO.47のアミノ酸配列、またはSEQ ID NO.53のアミノ酸配列;(f) FGループ長11、及び最初のN-末端の9アミノ酸がSEQ ID. NO.48のアミノ酸配列、またはSEQ ID NO.54のアミノ酸配列。
この発明に従って構築した14/FN自然−変異体組合せライブラリの、2つの選択された抗原であるVEGF及びHMGB1に対し高い結合親和性を有するFN3ポリペプチドの選別における効率は、実施例9と図25A〜25C、及び実施例10と図26A〜26Cに示されている。
ひとつの実施形態では、この発明のユニバーサルフィブロネクチン結合ドメインはスクリーニングに用いられ、指定されたポリペプチドの領域をエンコードし、予め決められたアミノ酸のコドンを1以上備えない個々のオリゴヌクレオチドを合成することにより作成される。
これは、オリゴヌクレオチド内の各コドン位置に、野生型ポリペプチドの合成に必要なコドン、または予め決まられたアミノ酸のコドンを導入することにより行われ、ルック・スルー突然変異誘発 (LTM)と呼ばれる(例えば米国特許公開No. 20050136428参照)。
WTMにより、最小限の数のオリゴヌクレオチドから複数の変異体を作ることができる。オリゴヌクレオチドは、例えばドーピング法を用いて、個別に、バッチごとに作り、所望により混合し、または貯蔵することができる。
ポリヌクレオチドは、例えば指定された領域等のポリヌクレオチドの、より大きな遺伝子コンテクストへの導入または組込みを促進するために、制限酵素認識部位、またはプラーマーハイブリダイゼーション部位を含有するようにして合成することができる。
認識部位は、天然に存在する認識部位に相当するか、あるいはその領域をエンコードするDNAの近くの遺伝子に導入された認識部位に相当するように設計することができる。ポリヌクレオチドを二本鎖に変換した後、ポリヌクレオチドを公知の方法により遺伝子または遺伝子ベクターに結紮する。適切なベクター(例えばファージベクター、プラスミド等)により、遺伝子をセルフリー抽出液、ファージ、原核細胞、または真核細胞に導入して、フィブロネクチン結合ドメイン分子を発現させることができる。
これにより、適切な宿主(例えばSayers, J. R. et al., Nucleic Acids Res. 16: 791-802 (1988)参照)に導入可能な分子群に、各類似ストランドが導入される。この方法により、突然変異を誘発するために多数のドメインが選択される、多数のクローン化ステップを回避することができる。
例えば、ポリヌクレオチドそのものを、伸長用のプライマーとして用いることができる。この方法では、指定された領域(またはそのタンパク)に対応する突然変異原生カセットをエンコードするポリヌクレオチドは、互いに少なくとも一部が相補的であり、例えばPCR増幅等のポリメラーゼ増幅によって大きな遺伝子カセット(例えばフィブロネクチン結合ドメイン)となるように伸長される。
しかし、この発明の範囲には、タンパク質化学を用いて所望のポリペプチド領域を直接合成することにより、本願のフィブロネクチン結合ドメインの多様性を表現する方法も含まれる。この方法により得られるポリペプチドは、ポリヌクレオチド中間体の使用を排除できる点を除き、この発明の特徴を備えている。
ループ領域の修飾により、改善されたリガンド結合性、あるいは所望により改善された触媒特性を有するフィブロネクチン結合ドメインを作ることがでる。β−ストランドフレームワーク領域の修飾により、溶解性や安定性等の化学−物理的性質が改善される。これは、例えば商業生産、バイオアベイラビリティ、及びリガンドに対する親和性において有用である。
一般に、突然変異誘導はフィブロネクチン結合ドメインのループ領域、すなわち3つのループ領域から成り、リガンド−結合活性に関与する構造部を標的とする。
好ましい実施形態では、指定された結合分子の候補を親和性成熟することによって、その結合分子の標的リガンドに対する親和性/アビディティ(avidity)を向上させる。
上記のいずれかの方法、またはその他の方法で構築されたポリヌクレオチドのライブラリを発現させ、スクリーニングすることにより、所望の構造、および/または活性を有するフィブロネクチン結合ドメインを特定することができる。
フィブロネクチン結合ドメイン分子の発現は、セルフリー抽出液(及び例えばリボソームディスプレイ)、ファージディスプレイ、原核細胞、または真核細胞(例えばイーストディスプレイ)を用いて行うことができる。
ひとつの実施形態では、フィブロネクチン結合ドメインは、ompA, phoA またはpelBシグナル配列(Lei, S. P. et al., J. Bacteriol. 169: 4379 (1987年))等のシグナル配列をエンコードする配列の3'末端に結合している。
これらの遺伝子融合は単一ベクターから発現され、E. coliの細胞膜周辺腔中に分泌され、リフォールドされて活性な形態となるように、ジシストロン性構造(dicistronic construct)中に組み込まれる(Skerra, A. et al., Biotechnology 9: 273-278 (1991年)参照)。
この発明のフィブロネクチン結合ドメインの、例えばタンパク分解機能等の触媒機能のスクリーニングは、例えば米国特許No.5,798,208に開示された標準的ヘモグロビン・プラーク・アッセイを用いて行うことができる。
候補フィブロネクチン結合ドメインの、治療上の標的への結合能力は、例えばBiacore測定装置を用いてin vitroで評価することができる。Biacore測定装置は、フィブロネクチン結合ドメインの所与の標的またはリガンドへの結合速度を測定するものである。in vitroでの評価は、多くの実験動物モデルを用いて行い、次いで、必要に応じてヒトでの試験を行う。
FN3 WTMライブラリを、触媒活性を有するFN3タンパクのスクリーニングに用いることもできる。
タンパク質の研究により、特定のアミノ酸がタンパクの構造と機能において重要な役割を果たしていることが明らかになっている。例えば、限られた数のアミノ酸が酵素の触媒作用に関与していると考えられている。
セリンプロテアーゼは事実上全ての生命体に存在する酵素の一種であり、セリン、ヒスチジン、及びアスパラギン酸の組合せを有することで特徴付けられる類似の触媒部位を備える。これらのアミノ酸は、恐らく他の決定基とともに、基質の遷移状態を安定化させる触媒性トライアッドを形成する。この触媒性トライアッドの機能的役割は、セリンプロテアーゼの部位特異的突然変異誘発法によるセリン、ヒスチジン、及びアスパラギン酸の個別及び複数個所の置換によって確認されている。また、触媒中でのこれらのアミノ酸残基間の相互作用の重要性はよく知られている。これらと同様の3つのアミノ酸は、リパーゼの触媒機構においても見られる。
図26は、セリン、ヒスチジン、及びアスパラギン酸を利用する活性部位の「ウォークスルー」突然変異誘発を表す模式図である。
スクリーニングは、任意の適切な方法で行うことができる。例えば、触媒活性を基質の転換と結合活性の適切な分析により研究し、標準的な免疫学的検定および/またはアフィニティ・クロマトグラフィによって評価することができる。
典型的な極性及び中性の側鎖はCys, Ser, Thr, Asn, GIn 及びTyrのものである。GIyもこのグループにかろうじて属すると考えられる。SerとThrは水素結合の形成において重要な役割を果たす。Thrはベータカーボンにさらなる非対称性を有するため、たった1つの異性体が用いられる。GInとAsnの酸アミドも、アミド基が水素ドナーとして機能し、カルボニル基がアクセプターとして機能することにより、水素結合を形成する。
GInはAsnよりCH2基が1つ多く、極性基がよりフレキシブルなので、主鎖との相互作用が低減される。Tyrは極性が強い水酸基(フェノール性OH)を有し、高pHのとき解離する。Tyrは、荷電した側鎖のような挙動を示し、水素結合性はかなり強い。
荷電したアミノ酸は、一般にタンパクの表面に見られる。
この方法により、改良された、または全く新規な触媒部位を創出する方法が提供される。図26に示すように、標的リガンドに結合するように遺伝子操作可能なFN3の3つのループ領域に同時に突然変異を生じさせ、あるいはBC, DE及びFGループ内に別々に突然変異を生じさせて、この結合部位の触媒活性への寄与を評価することができる。
すなわち、タンパクのリガンド結合領域への、さらなる「触媒的に重要な」アミノ酸の導入は、同一の標的リガンドに対する新規な触媒活性をもたらす。
今日では、標準的な体細胞融合技術を用いて触媒抗体を産出することができる。この方法では、所望の基質の遷移状態に結合して反応の触媒となる抗体の産出を誘発する基質の遷移状態に似た抗原を用いて、動物に免疫を与える。抗体産出細胞をその動物から採取し、不死化細胞と融合してハイブリッド細胞を作る。この細胞から所望の反応の触媒となる抗体の分泌のスクリーニングを行う。
この方法は、基質の遷移状態類似体の入手可否に依存する。ほとんどの場合、このような類似体を同定し合成することは困難なことが多いため、このプロセスには限界がある。
この発明の方法で産出可能なこれらの酵素やその他の酵素は、ヘルスケア、化粧品、食品、醸造、洗剤、環境(例えば廃水処理)、農業、革なめし、衣料品、その他の化学プロセスにおける酵素的変換の商業的応用のために重要である。これらには、診断及び治療用途、脂肪、炭水化物、タンパク質の変換、有機汚染物質の分解、及び薬品の合成等が含まれるが、これらに限定されない。例えば、線維素溶解活性を有する治療上有用なプロテアーゼ、またはウイルス外皮タンパク等の感染に必要なウイルス構造に対する活性を、遺伝子工学的に操作することができる。
このようなプロテアーゼは、有用な抗血栓剤、またはエイズ、ライノウイルス、インフルエンザ、または肝炎ウイルスに対する抗ウイルス薬として用いることができる。
芳香族環または他の二重結合の酸化に補因子を必要とする種類の酵素であるオキシゲナーゼ(例えばジオキシゲナーゼ)の場合、バイオパルピング(biopulping)プロセス、バイオマスの燃料や他の薬品への変換、汚水中の不純物の処理、石炭のバイオプロセス、及び有害な有機物質の無害化等への応用が、新規なタンパクの工業的に可能な用途である。
この発明の実施するとき、時に断りの無い限り、文献に記載された公知の化学、分子生物学、DNA組み換え技術、PCR技術、免疫学(例えば、特に抗体技術)発現系(例えばセルフリー発現、ファージディスプレイ、リボソームディスプレイ、及びProfusionTM)、及び必要な細胞培養を用いる。例えば、Sambrook, Fritsch, Maniatis, Molecular Cloning: Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989年); DNA Cloning, VoIs. 1&2, (D.N. Glover著, 1985年); Oligonucleotide Synthesis (MJ. Gait著, 1984年); PCR Handbook Current Protocols in Nucleic Acid Chemistry, Beaucage著, John Wiley & Sons (1999年); Oxford Handbook of Nucleic Acid Structure, Neidle著, Oxford Univ Press (1999年); PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications, lnnisら, Academic Press (1990年); PCR Essential Techniques: Essential Techniques, Burke著, John Wiley & Son Ltd (1996年); The PCR Technique: RT-PCR, Siebert著, Eaton Pub. Co. (1998年); Current Protocols in Molecular Biology, Ausubelら著, John Wiley & Sons (1992年); Large-Scale Mammalian Cell Culture Technology, Lubiniecki, A.著, Marcel Dekker, Pub., (1990年). Phage Display: A Laboratory Manual, C. Barbas著, CSHL Press, (2001年); Antibody Phage Display, P O'Brien著, Humana Press (2001年); Borderら, Yeast surface display for screening combinatorial polypeptide libraries, Nature Biotechnology, 15(6):553-7 (1997年); Borderら, Yeast surface display for directed evolution of protein expression, affinity, and stability, Methods Enzymol., 328:430-44 (2000年); Pluckthunらが米国特許No. 6,348,315に開示したリボソームディスプレイ、及びSzostaらが米国特許No. 6,258,558; 6,261 ,804;及び6,214,553に開示したProfusionTM、 及び米国特許20040058403A1に開示されたバクテリアペリプラズム発現を参照されたい。
フィブロネクチン結合ドメインのライブラリ(すなわちFN3)は、公知の方法により受容バクテリア/イースト宿主に形質移入される。
イーストは、各細胞の表面にディスプレイされた各FNII融合タンパクのコピーを103〜105有し、最大107のサイズのライブラリを容易に提供することができる。イースト細胞は、フローサートメトリーと、蛍光活性化細胞分類(FACS)または電磁ビーズを用いて、容易にスクリーニングし、分離することができる。
イーストの真核性分泌システム及びイーストのグリコシル化経路は、細胞表面のN及びO結合糖によるによるFN3型分子のディスプレイを可能にする。
E. coli宿主からプラスミド精製により産出させたプラスミドpYD1を、制限酵素Bam HIとNot Iで消化させ、最終的に仔牛小腸アルカリホスファターゼで脱リン酸化する。通常の分子生物学的手法で、pYD1ベクター及び上記のSOE-PCR産出WTMライブラリ(Bam HIとNot Iで消化されている)のライゲーション、E. coli (DH5a)形質転換、及びLB-アンピシリン平板培地上での選別を行なってWTMライブラリの増幅を行った後、イースト細胞宿主中への電気穿孔を行った。
このようなライブラリは、例えばFITC標識されたanti-Myc-tag FN3結合ドメイン分子、及び迅速同定及び確認用FACS分析によって、容易にハイ−スループット形式にすることができる。さらに、発現の程度の監視、および/または結合親和性の測定に利用可能なカルボキシ末端タグが含まれている。
経時変化測定が終了し、高速FACS sorterを用いてソートした後、低解離速度のクローンを、ストレプトアビジン-PE標識化により同定する。Aga2-FN3誘導後、飽和濃度(400 nM)のビオチン化TNF-α中で、25℃で3時間振り混ぜながら細胞をインキュベートした。
細胞を洗浄した後、非標識化TNF-a (1μM) を用いて、25℃で40時間コールドチェイス(cold chase)を行った。細胞をPBS/BSA緩衝液で2回洗浄し、ストレプトアビジン-PE(2 mg/ml)anti-HIS-FITC (25 nM)で氷冷しながら30分間標識化し、洗浄して再懸濁させた後、FACS ARIA sorterで分析した。
リボソームディスプレイでは、タンパクのライブラリの構築にin vitroでの無細胞転写/翻訳結合機構を利用する。FN3遺伝子ライブラリは、タンパク合成がmRNAの末端に達したとき、リボソームでのタンパクの合成を停止させる一方、タンパクは放出させないことにより、終止コドンを備えないカッパ免疫グロブリン軽鎖遺伝子の上流に挿入される。さらに、カッパドメインのスペーサーがFN3タンパクをリボソーム複合体から物理的に離間させる役割を果たし、FN3結合ドメインがその同族リガンドを認識し易くなる。
mRNAライブラリは、S30 E. coliリボソーム抽出液(Roche社)、またはウサギ網状赤血球溶出液(Promega社)に導入される。いずれの場合にも、発生期のmRNAの5'末端がリボソームに結合し、翻訳が行われる。翻訳中、高分子複合体中{He, 2005 #58; He, 1997 #59; He, 2007 #57}において、リガンド結合タンパクはその前駆mRNAとともに非共有結合的にリボソームに付随した状態を保つ。
5' FN3とカッパ遺伝子の3'位置の各々に対し特異性を有するプライマーを用いたRT-PCRにより、結合したmRNAを検出する(図9)。 次に、増幅された二本鎖cDNAを発現ベクター中にクローン化して、配列分析とタンパクの産出を行う。
翻訳を37℃で7分間行い、次にリボソーム複合体を、氷冷した選択バッファー[50 mMのトリスアセテート緩衝液(pH 7.5)、150 mMのNaCl、50 mMの酢酸マグネシウム、0.1%のTween 20、2.5 mg/mlのヘパリン]で5倍に希釈して安定化させた。
翻訳は、37℃で20分間行い、次にリボソーム複合体を氷冷したPBSで2倍に希釈して安定化させた。
安定化したリボソーム複合体を、ビオチン化ハプテン[50 nM フルオレセイン-ビオチン(Sigma社)]またはアンチゲン[100 nM IL-13 (Peprotech社)をビオチン化して使用]を用いて4℃で1〜2時間インキュベートし、次にスプレプトアビジンでコートしたM280電磁ビーズ(Dynal社)で捕捉した。次に、この電磁ビーズを洗浄して、非特異的に付着したリボソーム複合体を除去した。
原核生物選択は、氷冷した選択バッファーで5回洗浄することにより行った。真核性選択は、0.1% BSAと5 mMの酢酸マグネシウムを含むPBSで3回洗浄し、次にPBSだけで1回洗浄することにより行った。
次に、真核性複合体を40mMのTris-HCl、6mMのMgCl2、10mMのNaCl、10 mMのCaCl2を含む10 UのDNAse Iを用いて37℃で25分間インキュベートし、次いで5 mMの酢酸マグネシウム、1%のTween 20を含むPBSで3回洗浄した。
回収したmRNAの特異性破壊を伴わない分析は、電磁ビーズに結合したリボソーム複合体を直ちに逆転写反応させることにより行った。リボソーム複合体破壊による原核生物選択からmRNAを回収するために、選択したリボソーム複合体をEB20 [50 mM Tris acetate (pH 7.5), 150 mM NaCl, 20 mM EDTA, 10 mg/mlのサッカロミセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisae) RNA]中、4℃で10分間インキュベートした。
真核性選択からのmRNAの回収における20 mMのEDTAの効果を評価するために、リボソーム複合体をPBS20 (PBS, 20 mM EDTA, 10 mg/ml サッカロミセス・セレビシエRNA)中4℃で10分間インキュベートした。mRNAを市販のキット(High Pure RNA Isolation Kit, Roche社)で精製した。
原核性サンプルについては、このキットのオプションであるDNAse I消化を行った。しかし、DNAse I消化は選択後の洗浄時に行うため、この操作は真核性サンプルの場合には不要である。
逆転写反応は、4 mlの精製RNA、または4 mlの選択し固定化したリボソーム複合体(すなわち、懸濁させたビーズ)について行った。
真核性サンプルの逆転写反応は、50 mM Tris-HCl (pH 8.3), 50 mM KCl, 10 mM MgCl2, 0.5 mMスペルミン, 10 mM DTT, 1.25 mM RTプライマー, 0.5 mM PCRヌクレオチド混合物, 1 U RNasin 及び 5 U AMV 逆転写酵素 (Promega社)を用いて、48℃で45分間インキュベートすることにより行った。
完全長構築物の増幅を視覚化するために、エンドポイントPCRを行った。各逆転写反応のサンプル5 mlを、0.25 mM PCRヌクレオチド混合物, 0.25 mM フォワードプライマー(原核性または真核性実験のそれぞれにT7BまたはT7KOZ)及び0.25 mM RT プライマーを含む20 mM Tris-HCl (pH 8.4), 50 mM KCl, 1 mM MgCl2, 5% DMSO中の2.5 UTaqポリメラーゼ(Roche社)で増幅した。温度サイクリングは、94℃で3分間、次に、94℃で30秒間、50℃で30秒間、72℃で1.5分間のサイクルを30回繰り返し、最終ステップは72℃で30秒間行った。
PCR産品を、臭素化エチジウム染色したアガロースゲルを用いた電気泳動により視覚化した。この次に、分離したPCR産品を、溶解性タンパク産出用の細菌pBAD発現ベクターにサブクローニングすることもできる(下記参照)。
コンピテントE. coli宿主細胞を、取り扱い説明書(Invitrogen pBAD発現システム)に従って調製した。簡潔にいうと、40μlのLMG 194コンピテントセルと、0.5μlのpBAD FN3構築体(約1 μg DNA)を氷冷下で15分間インキュベートし、その後42℃で1分間のヒートショックを与えた。コンピテントセルをSOC培地において37℃で10分間回復させた後、LB-Amp平板培地に塗布し、37℃で一晩増殖させた。翌日、FN3を産出するための最適L-アラビノース誘導濃度を予め決定するために、小スケール液体培地用の単一コロニーを採取した。
室温で一晩増殖させた後、OD600=0.5n達した各クローンの複製を、L-アラビノース連続(1:10)滴定(0.2%から最終濃度0.00002%)により試験誘発(test induced)した。テスト培地(1 ml)を回収し、ペレット化した後、100μlの1X BBSバッファー(10mM, 160mM NaCl, 200mM 硼酸, pH=8.0)を添加して細胞を再懸濁させ、次に50μlのリゾチーム溶液を37℃で1時間添加した。
遠心分離後、リゾチーム消化液の細胞上清を回収し、MgSO4を最終濃度が40mMになるまで添加した。この溶液をPBSで予め平衡にしたNi-NTAカラムに通した。His-タグを結合させたFN3サンプルを、PBSバッファーで2回洗浄し、250mMのイミダゾールを添加して溶離を完了した。溶解性FN3発現の純度をSDS-PAGEで評価した。
His-タグを結合させたFN3サンプルを、PBSバッファーで2回洗浄し、250mMのイミダゾールを添加して溶離を完了した。次に上清のpHを6MのHClで5.5に調整し、SPセファロースHP陽イオン交換カラム(Pharmacia社)に通した。FN3を塩勾配(NaCl)により溶出させ、FN3を含む分画の濃度を280 nmにおける光学密度で測定し、PAGEで検証した。複数のFN3変異体を含む分画を貯蔵し、PBSで透析した。
FN3変異体の結合親和性(KD=kd/ka=koff/kon)を、OCTETバイオレイヤー・インフェロメトリー(biolayer inferometry)システム(ForteBio社)により測定した会合速度定数(ka=kon)、及び解離(kd=koff)速度定数から計算により求めた。
例えばTNF-α等のリガンドをOCTETストレプトアビジン・キャピラリー・センサーチップの表面に固定化し、実質的に単分子性FN3の結合反応速度を測定した。OCTETストレプトアビジンチップは、50μM TNF-aを用い、取扱説明書に従って活性化した。また、PBS/BSA溶液を遮断薬として添加した。
図25に、D2E7 anti-TNF-a抗体を参照に用いた9-14 TNF FN3クローンのOCTET測定結果を示す。
<バイオインフォマティックスを利用したユニバーサルフィブロネクチン結合ドメインライブラリ配列の特定方法>
この実施例では、バイオインフォマティックスと、この発明の基準とを利用して、フィブロネクチン結合ドメインライブラリ配列のユニバーサルBC, DE,及びFGループ配列を特定し選択する。発現のプロセスを一般化した模式図を図1に示す。
基本のデータセットである〜9321のFN3スーパーファミリー配列には、ヒトフィブロネクチン、テネイシン、ショウジョウバエ・セブンレス、プロテイン・チロシン・ホスファターゼ 、EPHチロシン・キナーゼ、及びサイトカイン受容体、Zタンパク質(表1参照)等の、様々な起源のFN3配列が含まれる。
FN1, FN2及び他のタンパクスカフォールド・フレームワーク・ドメインに関連する配列をこれらのデータベースから検索して、同様の方法で特定することもできる。
このため、最初の〜9321のベースデータセットから、冗長または重複する配列を除去することにより、5955の非冗長性のFN3配列のフィルタリングを行った。この第2のサブセットからさらに794のヒトFN3配列から成る第3のサブセット得た。
このような個別の性質を共有するサブセットの構成成分により、サブセット内での有意性のある比較と、正確なデータ分析に適した、より「標準化」されたセットが構築される。
このプロセスを繰り返すことによって、所定の関係をより高度に有する、複数の小さなサブセットを得ることができる。例えば非−ヒトモジュールが含まれるデータセットを追加することにより、配列の多様性を拡張することもできる。
例えば表3に示すように、10FN3を参照配列に用いて、以下のβ-ストランド及びループアミノ酸の位置を指定した。
W22にフランキングして、複数のBCループの手前にある複数の重なり合うループにおいて、構造上の相違があることが見出された。複数のBCループは、それらの間に見出されるC β-ストランドの良く保存されたY/F32に再度進入する。
位置21と31をBCループの外境界と指定することにより、「フィルタリング後のデータセット」をBCループサイズに応じて分け、そのアミノ酸出現頻度の構成を特定した。DE及びFGループについても同様にして配列/構造比較分析を行った。
DEループを、D β-ストランドの位置50(10FN3中のV50)にあるバリン、ロイシン、及びイソロイシンから成る保存されたグループを境界とし、E β-ストランドの位置56(10FN3中のT56)で終了すると指定した。同様にして、位置76(10FN3中のT76)及び位置86(10FN3中のK86)を、FGループのFβ-ストランド及びGβ-ストランドの接合点として選択した。
BSループの定義において、当初はスカフォールドループの境界を11アミノ酸長に設定した。しかし、BCループの長さの範囲は9から18アミノ酸であり、アミノ酸の長さが14 (BC/14)、及び15(BC/15)のものもよく出現する(図6参照)。
異なるループ長の場合でも、ループアミノ酸のアライメントを行うことができる。例えば、BC/15中の位置25のプロリン(P25)は、BC/15構成要素の中で良く保存されていることが見出された。またP25は、BC/14とBC/11構成要素の中で一般的であることが見出された。
ループアミノ酸位置のアライメントは、これらの等価位置に最も近づくようにして行った。従って、ループBC/15において、ループに含まれる追加のアミノ酸が残基26と27の間にあるとき、この追加のアミノ酸には26a, 26b, 26c, 及び26dの位置が指定される。ループBC/14において、ループに含まれる追加のアミノ酸が残基26と27の間にあるとき、この追加のアミノ酸には26a, 26b, 及び26cの位置が指定される。
上記のように、10/FN3(ヒトフィブロネクチンの10番目のFN3モジュール)を基準にして番号の付与を行う。
<フィルタリング及び遺伝子配列のクラスター分析によるバイオインフォマティクッスを利用したループ変異性プロファイルの評価>
ユニバーサルフィブロネクチン結合ドメインライブラリを、in vivoで発現されたループの変異性プロファイルを決めることにより設計した。変異性プロファイルは、アライメントされた配列のデータセットにおいて、特定の位置にあって種類が異なるアミノ酸のカタログ化、及び各アミノ酸の代表的な発生率を表す。当初の「ベースデータセット」内の上記のパラメータを用いたループ配列のサイズ関連ファミリーを特定し、分類する。これらの多数のアライメントされたループの比較分析により、潜在的にリガンド結合性付与に繋がるアミノ酸変化を導入するための、既存の多様性及び「許容」多様性に関する変異性プロファイルの情報が提供される。
同様の定義を用いて、他のスカフォールド様タンパクのループの指定、及びループを構成するアミノ酸を表すことができる。
BCループの場合(図6)、15アミノ酸ループサイズが最も一般的であり、BCループ集団の30%を占める。14アミノ酸及び11アミノ酸のループサイズがこれに次いで一般的なループサイズであり、BCループ集団の18%及び16%を占める。本願の変異性プロファイル分析用のBCループサイズとして、11, 14及び15アミノ酸を選んだ。
FGループの出現頻度分析では、8及び11アミノ酸のループサイズが最も一般的な2つのループサイズであり、それぞれが分析したデータセット中の58%及び18%を占めることが認められた。このため、変異性プロファイルの分析には、8及び11アミノ酸のFGループサイズの両者を用いた。
これより前の分析では、FGループ長FG/8及びFG/11はそれぞれFG/6及びFG/9と特定された。この違いは、以下の表5に示すように、各ループ長に2つのC末端アミノ酸S, Kを付加したことによる。
いくつかの実施形態では、FG/8ループが6つのアミノ酸で特定されている場合、これらのアミノ酸はFG/8の6つのN末端アミノ酸を表している。同様に、FG/11ループが9つのアミノ酸で特定されている場合、これらのアミノ酸はFG/11の9つのN末端アミノ酸を表している。
構文解析により、各位置について相対的出現頻度が「下限」閾値より高く、累積出現頻度が「上限」閾値に達するまでの範囲のアミノ酸を評価した。上限閾値に達しない場合は、構文解析により、相対的出現頻度が下限閾値より低いアミノ酸を評価した。閾値の好ましい下限〜上限の組合せは5〜50であった。これは、位置の分類において良好な検出感度が得られるためである。すなわち、構文解析により、各位置において最も出現頻度のアミノ酸のみに限定されたリストが得られる。構文解析の結果を、図9〜14に出現頻度を表わす図として示す。
<閾値による固定及び非固定ループ位置の特定>
ひとつの実施形態では、保存コンセンサスアミノ酸、または選択された半保存コンセンサスアミノ酸の自然−変異体組合せライブラリを、以下のように設計した。
例えば、BCループサイズ11(図9)の場合、全てのFN3ループ位置の約95%で位置22にトリプトファン(W)の存在が認められ、トリプトファンの選択圧が高いことを示している。トリプトファンは、予め設定した閾値レベルの40%より高い頻度で出現し、その位置において2番目に出現頻度が高いアミノ酸より2倍以上の頻度で出現することから、位置22にはトリプトファン(W22)が保存されていると考えられる(下記の実施例3参照)。
「固定」された残基は、そのループ位置に出現する他のアミノ酸に対し、優勢なアミノ酸と見なせる。「固定」された位置は、最初のライブラリ構築段階では、変異誘発による多様化の対象にはしない。
他のBCループサイズ11のループ位置では、位置25ではプロリン(P) (約>45%)が優勢であり、その位置において2番目に出現頻度が高いアミノ酸(<20%)より2倍の頻度で出現することが分かった。すなわち、P25の位置は、出現頻度が2番目に高いアミノ酸に対し優勢アミノ酸が2倍の頻度で出現することから、「固定」されていると考えられる。
これに対し、プロリンは位置24, 26及び28においても最も優位であるが、他のアミノ酸の出現頻度も十分高い(8-19%)。位置24, 26及び28は、同程度の出現頻度を有する多くのアミノ酸が存在し、優勢アミノ酸の出現頻度が他アミノ酸の2倍を超えないため、これたの位置は「可変」であると考えられる。
また、位置29のイソロイシンも固定されている。すなわち、BC/14では、イソロイシン(I29)の出現頻度は>52%であり、その位置において2番目によく見られ、出現頻度がそれぞれ18%及び16%であるバリン及びロイシンよりも、2倍以上の頻度で出現する
先ずこれらの「固定」された位置と非固定の位置(「X」で表わす)を決めることによって、B/15の出発「固定」配列は:X21 W22 X23 X24 P25 X26 X26a D26b G26c G26d X27 X28 129 X30 X31と表わされる。
同様に、BC/4とBC/1の出発「固定」配列はそれぞれX21 W22 X23 X24 P25 X26 X26a X26b X26c X27 X28 I29 X30 X31、及びX21 W22 X23 X24 P25 X26 X26 X27 X28 I29 X30 X31と表わされる。
要約すると、サイズ6のDEループ(図12)の場合は、単一のアミノ酸がその位置に表れるアミノ酸の35%以上を占めるようなループ位置は認められなかった。
位置52のグリシン(52G)、位置55のトレオニン(55T)、及び位置56のセリン(56S)について、優位性が僅かに認められた。しかしこの場合、「固定」アミノ酸と考えられる閾値レベルである40%を超える優勢アミノ酸は認められず、全てのループ位置が「可変」と考えられる。
ライブラリを構築する際、各ループ位置における最も一般的アミノ酸が、最初の突然変異誘発操作における出発アミノ酸となる。従って、DE/ループは全て「可変」であり、出発ループ配列はX51 X52 X53 X54 X55 X56で表わされる。
FGループサイズ8の他の位置は全て「可変」であり、FG/8の出発「固定」配列は、最も出現頻度の高いアミノ酸を用いて、X76 X77 X78 X79 X80 84S (FG/8の6つのN-末端アミノ酸)と表わされる。
FG/8のループ番号は80から84に跳ぶ。これは、より長いループサイズ9を、10/FN3を基準とするサイズ長の基準に用いるためである。
FG/ 11には、アスパラギン(56N)、グリシン(79G)、セリン(84S)の4つの「固定」アミノ酸と、位置84にある「半固定」のグリシン及びセリンが含まれる。3つのアミノ酸56N, 79G, 84Sと、半固定の81G/Sの配列中での出現頻度は40%を超える。
この分析の結果、FG/11の出発「固定」配列は、N76 X77 X78 79G X80 G/S81 X82 X83 S84 (FG/11のN末端の9つのアミノ酸)と表わされた。
上記の結果は、出現頻度の閾値レベルによって、ライブラリに導入されるループアミノ酸の多様性を「微調整」可能であることを示している。これらの「固定」されたループ位置により、いくつかの天然多様性が再現されて、構造安定効果が生じ得る。
しかし、これとは逆に、より多様性に富み、より大きなライブラリを得ることができる場合もある。この場合、「拡張」効果は、「固定」アミノ酸を指定するために用いる出現頻度の閾値を高くすることによって得られる。この方法では、変異性プロファイルにより、相対的に少数の保存されたループ位置が捉えられ、これらが「固定」された位置に分類される。残りのループ位置が、相対的に広範で、多様化され得る「可変」アミノ酸に分類される。
<閾値を用いない、固定ループ位置及び非固定ループ位置の特定>
別の実施形態では、選択された6つのループ(表4)において変異性の閾値を用いることなく、すなわち閾値を100%として、自然−変異体組合せ多様性を設計することができる。この実施形態では、各変異ループは、変異性及び相互作用の両者に関して変異性プロファイルを再現するアミノ酸を含むように設計される。
特定のループ位置のそれぞれにおいて、その位置での相互作用及び変異性に合致し、再現することができる縮重コドンを含むようにオリゴヌクレオチド合成を最適化する。変異性プロファイルにおいて、2以上のアミノ酸が存在しうる位置を、その位置の変異性の程度にかかわらず、変異化させることができる。
BCループサイズ15の場合、3つの固定された位置(W22, P25 and G26c)がある結果、次の突然変異誘発パターンとなる:BC/15 = X21 W22 X23 X24 P25 X26 X26a X26b G26c X26d X27 X28 X29 X30 X31。
最後に、FGループサイズ11は、出発配列FG/11 = X76 X77 X78 G79 X80 X81 X82 X83 X84 S85 S86によりエンコードされる。
実際には、特定の位置にある2以上のアミノ酸が、化学的に非常に類似している場合がある。このような場合、突然変異誘発の設計にこれらのアミノ酸のサブセットのみを含めて、その位置の化学的性質を保存しておくことができる。これらにより、変異体の総数を減らすとともに、オリゴヌクレオチド合成の最適化をよりフレキシブルに行うことができる。
<閾値制限を用いてFN3ドメインライブラリのWTMループ多様性を設計する方法>
この実施例では、FN3結合ドメインライブラリのループ多様性を最適化する方法を説明する。
前記の候補フレームワークの選択は、導入するループサイズと最初のアミノ酸配列の選択の両者に影響する。この方法について、特にFG/11ループを例に説明する。
上記のように、「固定」されたアミノ酸残基は、指定されたループ位置における頻度閾値が典型的には少なくとも40%(典型的には少なくとも50%)であり、2番目に出現頻度が高いアミノ酸より出現頻度が2倍以上高いと定義される。
FN3 のFG/11変異性プロファイル(図14)から、位置79のGly (G79)は約85%で出現することが見出された。次に出現頻度が高いアミノ酸は、その出現頻度が5%未満であり、下限閾値に達していなかった。(構文解析で排除された。)
指定された残基、この場合はG79が、このような高い出現頻度を有すると認められるときは、高度に保存されており、この発明のライブラリでは「固定」されていると表現される。これは、最初のライブラリの多様化において突然変異誘発されないことを意味する。
同様に、N76, G81及びS84も「高度に保存」されており、その出現頻度はそれぞれ66%, 47%,及び61 %である。これらは、最初の多様性ライブラリにおいて「固定」される。
2つの半保存アミノ酸が指定された1のループ位置に存在する場合がある。例えば、G81とS81はそれぞれ66% と30%の頻度で出現する。すなわちこのような場合、G81とS81を保持し、他のアミノ酸を排除する強い選択圧があることから、この2つのアミノ酸は位置81に「半固定」されていると考えられる。
G81が66%でS81が30% となる比率は、添加するヌクレオチド混合物の「ドーピング」を制御することにより、一定に保つことができる(実施例5参照)。1ループ当りのWTM置換数は、オリゴヌクレオチド合成ドーピングにより容易に達成できる(例えば米国特許出願US20040033569A1参照)。
全ての部位に多様性を導入しない理由は、ライブラリの最初の多様性サイズを制限して、全ての変異体の効率的発現とディスプレイを促進するためである。
最初に「固定」された位置は、その保存に対する強い選択圧の存在を示す。しかし、これらの位置は、親和性成熟の間のルック・スルー突然変異誘発(LTM)の対照となる部位である。別言すれば、最初の「固定」された位置を、その後突然変異誘発させることができる。
最初のライブラリ多様化における「固定」された位置の最終目標は2つあり:1)好ましいループ残基の大部分を導入して、機能性クローンの数を最大にすること、及び2)全ライブラリサイズを最小限にすること、である。
次に、回収したクローンのLTMマッピングにおいて、「固定」された部位が、総合的結合能力を失うことなく親和性成熟させるために変異させることが可能な「ホット」スポットであるか、または「コールド」スポットであるかを正確に評価する。
例えば、図14の例のようにFG/11の変異性プロファイルを分析することにより、可変位置77, 78, 80, 82 及び83のいずれにも、40%以上の高頻度で出現する単一のアミノ酸が存在しないことが分かる。
FG/11の位置77, 78, 80, 82及び83の場合、各ループ位置には多くの種類のアミノ酸が相対的に低い頻度で出現する。
従って、位置77, 78, 80, 82及び83は、例えばWTM等の突然変異誘発によって、最初のループ配列多様性を構築するための部位である。次にアミノ酸多様性を導入するとき、FG/11配列はN76 X77 X78 79G X80 G/S81 X82 X83 S84である。ここで、Xは最初の突然変異誘発 (例えばWTM)が行われる際の可変位置を表わす。X位置は、WTMで設計されたコドン変化に応じて、出発時の「野生型」アミノ酸、WTM置換、または「副生」アミノ酸から成る。
FG/11 WTM(K):ライブラリの各変異体の最終的配列には、単一置換が含まれている:
FG/11 : WTM(K): ライブラリの各変異体に配列にはさらに、例えば次のような三置換が含まれ得る:
FG/11 : WTM(K): ライブラリの各変異体に配列にはさらに、四置換が含まれ得る:
最後に、FG/11 : WTM(K): ライブラリの各変異体に配列にはさらに、五置換が含まれ得る:
変異性プロファイル(図14)にA77, A78, P82, 及びP83残基がそれぞれの位置において最も出現頻度の高いアミノ酸であることが示されたため、これらの残基を出発「野生型」アミノ酸として選択した。
WTM (K)アミノ酸は、標的の「可変」位置のみで生じ、「固定」された位置では生じないものと理解される。
産出された多様性WTMには、標的コドンの「野生型」アミノ酸の縮重に起因する「副生」アミノ酸が含まれる。例えば、位置77の「野生型」アミノ酸はアラニン(Ala)である。位置77においてリジンWTMを行って、位置77にAlaとLysの両者が存在し得るようにする場合、用いられる縮重コドンはRMGである。RMGから生じる「副生」アミノ酸はトレオニン(T)及びグルタミン酸(E)である。残余のWTMアミノ酸(G, S, H, L, P1 Y, D,及びQ)は、FN3 FG_9 ループの下記配列の可変位置Xを置換する。
アミノ酸のWTMは、そのアミノ酸に対する「副生」アミノ酸とともに生じるものと理解される。
従って、FG/11の全ループ位置について飽和突然変異誘発させたときのライブラリの多様性は、209あるいは5×1011である。この多様性は、現状ではライブラリディスプレイ及びスクリーニング技術の限界に近い。
しかし、ただ1つの変異ループを含むFN3ループのライブラリにおいて、他のFN3ループ(例えばBC/11及びDE/6)が飽和突然変異誘発により多様化された場合、FN3ライブラリの最小サイズは2026、または6.7×1033.となることに注意する必要がある。一方、BC, DE及びFGループの「可変」位置を特定して構築したライブラリの最小及び最大サイズは6.7×1033である。
これらに対し、この発明ではより小さなサイズで、より代表的なライブラリを構築することができる。この発明の方法により、結合分子の第一世代を特定するために、いくつかのループを管理可能なライブラリが提供される。引き続き他のCDR位置について行われる親和性成熟突然変異誘発により、これらの特定された結合分子の最適化が行われる。
<WTM及び拡張WTMを用いたループ多様性導入のためのオリゴヌクレオチドの設計>
BC/15の多様性(表5)を設計するために、閾値を50%として(図11)、フィルタリングしたデータセット中のBC/15ループ位置の変異性プロファイルを検討した。
変異性プロファイルにより、BC/15は下記の「野生型」出発配列を有することが示された。
さらに、agaがRをエンコードし、aacがNをエンコードし、これらはいずれもWTM混合ベース反応の「副生物」である。
位置22では (tgg)がWをエンコードする。
位置23では (raa) または (a/g a a)がEまたはKをエンコードする。
位置24では (mma) または (a/c a/c a) が T, K , Q または Pをエンコードする。
位置25では (ccg) が Pをエンコードする。
位置26では (raa) または(a/g a a) が EまたはKをエンコードする。
位置26aでは (raw) または(a/g a a/t)が N, E, KまたはDをエンコードする。
位置26bでは, (gat)がをエンコードする。
位置26cでは, (ggc)がGをエンコードする。
位置26dでは, (ggc)がGをエンコードする。
位置27, または arm または(a a/g a/c) がR, N, K または Sをエンコードする。
位置28, または mma (a/c a/c a) が T, K, QまたはPをエンコードする。
位置29, または (att)がIをエンコードする。
位置30, または ama (a a/c a)が TまたはKをエンコードする。
位置31, または rra (a/g a/g a)がR, E, Gまたは Kをエンコードする。
WTMの「副生物」はライブラリの更なる多様性をもたらす。残りのBC_15ループコドンを同様に処理すれば、8192の変異体の組合せが可能な、制限されたWTM (K)ループライブラリを構築することができる。
残りのWTMアミノ酸であるG, S, H, L, P, Y, E, 及びQ (表5参照)にもWTMを適用した。9つのアミノ酸のWTMを完了したとき、全BC_15ループライブラリのサイズは105であった。
出発「野生型」アミノ酸がグルタミン酸(E)であるチロシン(Y)のWTMを行うとき、望ましくない副作用は終止コドンの導入である。チロシンはtat及びtacでエンコードされ、グルタミン酸はgaa及びgagでエンコードされ、アンバー終止コドンはtagで、オーカー終止コドンはtaaである。
このため、チロシンをグルタミン酸で置換するとき、最初の位置はチロシンではt、グルタミン酸ではgとなり、2番目の位置はa、3番目の位置はチロシンではtまたはc、グルタミン酸ではaまたはgとなる。従って、上記のようにして設計した標準的ヌクレオチド混合物は、taaまたはtagとなる。
このスプリット−プール合成により、通常の単一反応オリゴヌクレオチド合成で生じるアンバー終止コドン等の望ましくない副生物を産出することなく、(Y) WTM残基を導入することが可能になる。
スプリット−プール合成では、2種のプールを用いる。最初のプールにはYをエンコードするコドンTATを用い、第2のプールにはEをエンコードするコドンGAAを用いる。このスプリット−プール法では、各反応プールはUAGまたはUAA終止コドンをエンコードしないので、アンバー終止コドンを生じない。
BC_15の場合、(Y) WTMオリゴヌクレオチド反応を位置26まで行い、その後反応液を2つの別のカラムに分けて、さらに合成を続ける。
3つのヌクレオチドを結合させた後、2つのカラムを開き、合成担体をアセトニトリルで洗浄し、樹脂をプールした。混合した後、樹脂をカラムの1つに入れた。この時点で、次の部分の位置25と24を合成した。単一のカラムで、上記のようにCGGコドンとYMTコドンを合成した。次に、樹脂を(Y) WTMの位置23と位置26とに、上記のように再分配した。その後、合成物をプールし、引き続き51の固定及びフランキング領域の合成を行った。
上記のように、配列中のXで示す部分はウォークスルーアミノ酸を意味し、ダッシュ(-)の後のアミノ酸は出発野生型アミノ酸を意味する。
Figures 15a and 15b.
拡張ウォークスルーはもう一つのWTMコドン設計の例であり、副生物を予め決めておくことができる。例えば、変異性プロファイルに、GとPが特定の位置において出現頻度が高いアミノ酸であることが示されているとする。出発WTM配列中のG及びPアミノ酸の出現頻度は、これらが「固定」アミノ酸または「野生型」アミノ酸であることを示していない。しかし、拡張ウォークスルーによれば、GまたはPがWTM副生物となるようにWTM縮重コドンを偏らせることができる。
下記のフランキングスカフォールド5'及び3'配列を、BC, DE及びFGループに用いる。
<WTMオリゴヌクレオチドの設計(閾値不使用)>
別の実施形態では、各ループの全長にわたってWTM突然変異誘発を行うことが可能であり、各ループの全ての位置が可変であると考えることができる(閾値=100%)。すなわち、このライブラリは前記の例のスーパーセットである。さらに、WTMがどのように機能するかにより、各位置において最も豊富なアミノ酸は、ループ中の全ての位置の各々で出現頻度が25%から50%になるようにエンコードされる。
従って、本願のライブラリは大きな配列スペースをカバーすることができるが、それでもデータベースに見られるアミノ酸パターンに偏っている。
位置21では、(age)がSをエンコードする。
位置22では、(tgg)がWをエンコードする。
位置23では、(raa) または (a/g a a)がE または Kをエンコードする。
位置24では、(mma) または (a/c a/c a)がP, K , Q または Tをエンコードする。
位置25では、(mma) または (a/c a/c a)がP, K , Q または Tをエンコードする。
位置26では、(raa) または (a/g a a)がE または Kをエンコードする。
位置26aでは、(raw) または (a/g a a/t)がD, E, K または Nをエンコードする。
位置26bでは、(raw) または (a/g a a/t)がD, E, K または Nをエンコードする。
位置26cでは、(rra) または (a/g a/g a)がG, R1 E または Kをエンコードする。
位置26cでは、(rra) または (a/g a/g a)がG, R, E または Kをエンコードする。
位置27では、または arm または (a a/g a/c)がS1 N, K または Rをエンコードする。
位置28では、または mma (a/c a/c a)がP, K, Q または Tをエンコードする。
位置29では、または (awa) または (a a/t a)がI または K をエンコードする。
位置30では、または ama (a a/c a)がT または Kをエンコードする。
位置31では、または rra (a/g a/g a)がG, R, E または Kをエンコードする。
FN3 BC_14は、下記の変異性プロファイルを有する。
(Table 16)
FN3 BC_14は、下記の変異性プロファイルを有する。
(Table 17)
上記のように、配列中のXはウォークスルーアミノ酸を意味し、ダッシュ(-)の次に示すアミノ酸は、出発野生型アミノ酸を意味する。
(Table 18)
<フィブロネクチン結合ドメインライブラリを遺伝子工学により構築する方法>
この実施例では、ユニバーサルフィブロネクチン結合ドメインライブラリを、遺伝子工学技術を用いて構築する方法を説明する。WTM FN3ライブラリを構築する方法を下記の説明、及び図20に示す。
ベータ‐ストランド・スカフォールド・フレームワーク、及び可変領域の多様性ループをエンコードするオリゴヌクレオチドは、図20に示すシングルオーバーラップ伸長ポリメラーゼ連鎖反応(SOE-PCR)により調製した。
この分子の全長を、発現−ディスプレイベクター中へのクローン化を促進する制限酵素認識部位を有するフランキング5'プラーマー及びフランキング3'プラーマーを用いて増幅した。構築されたライブラリの全多様性は、フレームワーク配列の数と、ループ中に突然変異を誘発させるために選択した位置の数に依存し、突然変異誘発は例えばWTMにより行う。
A'ベータ−ストランド(BamHI制限酵素認識部位を含むフランキング領域を有するAベータ−ストランドのN-末端をエンコードするセンスストランド):
これらのオリゴヌクレオチドをSOE-PCR法によって組み立てて、必要とされるFN3 BC/11, FN3 DE/6 、及びFN3 FG/9の組合せを含むライブラリを構築した。
<ユニバーサルフィブロネクチン結合ドメインライブラリから選択した候補のハイスループット親和性成熟を行う方法>
この実施例では、CBM (combinatorial benefical mutations:有益組合せ突然変異誘発) /WTM/LTM親和性成熟を用いて、候補フィブロネクチン結合ドメインを特定し、改善する手順を説明する。
<アンチ-TNFα結合活性WTMライブラリを構築するためのWTM 14/FN3ライブラリのスクリーニングと分析>
WTMフィブロネクチンライブラリをポリメラーゼ・サイクリング・アッセンブリ(PCA)で構築し、ファージミドベクター中にクローン化した。オリゴヌクレオチドは、逆配向性の隣接オリゴヌクレオチドと相同な塩基対を15共有する。
8つのオリゴヌクレオチドを用いて、フィブロネクチンの完全な遺伝子を組立てた。Oligo 3にはBC loopの11のアミノ酸が含まれ、Oligo 5はDEループの6つのアミノ酸をエンコードし、Oligo 7にはFGループの9つのアミノ酸が含まれる。
野生型14FN3のフレームワークを下記に示す。
50μlのAssembly PCR 1混合物には、5μlのプールしたOligo(10μM)、10μlの5X Buffer (Finnzymes社)、1μlの10 mM dNTP、Phusion Polymerase (Finnzymes社)、33.5μl diH2Oが含まれる。
PCR操作は、98℃で30秒のサイクルを1回行った後、98℃で7秒、50℃で20秒、72℃で15秒とするサイクルを30回繰り返して行う。最終サイクルは72℃に1分間の条件で行う。
PCR操作は、98℃で30秒のサイクルを1回行った後、98℃で7秒、50℃で20秒、72℃で15秒とするサイクルを30回繰り返して行う。最終サイクルは72℃に1分間の条件で行う。
ファージ粒子ライブラリのストックを、サイズがこのライブラリの10倍で、当初接種材料であるTG1細胞ライブラリから出発して作った(培地= 2YT、1 % グルコース、50 μg/ml アンピシリン)。細胞がOD600= 0.5になったとき、M13K07ヘルパーファージ(Invitrogen社)のMOI=20を添加し、細胞を37℃で30分間インキュベートした。次に、細胞を37℃で30分間振蕩した。細胞を遠心分離機で沈降させ、誘導培地(2YT、50μg/mlアンピリシン、25μg/mlカナマイシン、及び0.1 mM IPTG)中に再懸濁させ、30℃で一晩振蕩した。標準的な20%PEG/2.5M NaCl沈殿法により、上清からファージを精製し、連続希釈によりTG 1細胞中に滴下した。
最初の3回のパニング操作は、Reacti-BindTM NeutrAvidinTM Coated High Binding Capacity (HBC社) Clear 8-ウェル Stripsと、SuperblockTM Blocking Buffer (Pierce社)により行い、4回目のパニング操作は、MaxiSorp plate (Nunc社)により行った。これにより、ニュートラアビジン結合ファージ、及びビオチン化TNFα標的タンパクのみを認識するファージが不用になる。TNF-陰性対照は、ビオチン化TNFα(R&D Systems社)を添加せずに行なった。パニングの各操作段階において、BSA、オボアルブミン、インスタントミルク等の異なる阻害剤を用いることができる。
翌日、ウェルをPBS中に0.2% BSAと0.1 % Tween- 20とを含む液で5回洗浄し、さらに PBS中に0.05% Tween-20を含む液で5回洗浄した。
ファージを100μl の100mM HClで溶出させ、1 mlの1.0 M Tris-HCl,pH 8.0で中和した。ファージをTG1細胞に滴下した。
1回目のパニング操作では、産出されたファージは1.7e7ファージ/mlで、陰性対照は2.4e6ファージ/mlであった。これは、7.1倍濃縮したことに相当する。
翌日、ウェルをPBS中に0.2% オボアルブミンと0.1 % Tween- 20とを含む液で5回洗浄し、さらに PBS中に0.05% Tween-20を含む液で5回洗浄した。
ファージを100μl の100mM HClで溶出させ、1 mlの1.0 M Tris-HCl,pH 8.0で中和した。ファージをTG1細胞に滴下した。
2回目のパニング操作では、産出されたファージは3.0e6ファージ/mlで、陰性対照は1.36e 6ファージ/mlであった。これは、2.2倍濃縮したことに相当する。
翌日、ウェルをPBS中に0.2% インスタントミルクと0.1 % Tween- 20とを含む液で5回洗浄し、さらに PBS中に0.05% Tween-20を含む液で5回洗浄した。
ファージを100μl の100mM HClで溶出させ、1 mlの1.0 M Tris-HCl,pH 8.0で中和した。ファージをTG1細胞に滴下した。
3回目のパニング操作では、産出されたファージは5.66e7ファージ/mlで、陰性対照は4.16e7ファージ/mlであった。これは、1.4倍濃縮したことに相当する。
次に、PBS 中に1e1013の3回目のファージ粒子と、0.2%インスタントミルクと、0.1 % Tween-20とを含むオーバーナイト結合バッファーを添加した。
翌日、ウェルをPBS中に0.2% インスタントミルクと0.1 % Tween- 20とを含む液で5回洗浄し、さらに PBS中に0.05% Tween-20を含む液で5回洗浄した。
ファージを100μl の100mM HClで溶出させ、1 mlの1.0 M Tris-HCl,pH 8.0で中和した。
ファージをTG1細胞に滴下した。
4回目のパニング操作では、産出されたファージは1.0e6ファージ/mlで、陰性対照は3.56e5ファージ/mlであった。これは、2.8倍濃縮したことに相当する。
3回目及び4回目のパニング操作の後、全部で373のクローンについて、ELISAファージを用いてTNF-α結合性を評価した。
要約すると、各クローン由来のファージは、96穴のウェルブロック中の1mlの培地において、M13K07ヘルパーファージで重感染させることにより調製した。次に、ファージ含有培地の上清を、標的タンパクでコートしたマイクロタイタープレートに添加した。PBS-0.1 % Tween-20で洗浄し、結合したファージをマウスanti-M13抗体ホースラディッシュ・ペルオキシダーゼ複合体(GE Biosciences社)とTMB 基質(Pierce社)で検出した。陽性の変異体について、VEG-Fとニュートラアビジンのプレートのみに対する結合特異性のスクリーニングを行った。
これらの評価により、48の陽性なクローンが特定された。図24bに示すように、これらのクローンはTNF-αに結合するが、VEGFまたはブランクのウェルには結合しない。このことから、TNF-αに対する特異的結合性が示される。
これらの変異体を、溶解性タンパクとして発現させた。ファージミドクローンで非抑制TOP10 E. Coli株を形質転換することで、溶解性タンパクが産出された。タンパクの発現は、1 mM IPTGで30℃において4時間処理することにより誘導され、6X His-タグを有するタンパクをNi-NTAスピンカラム(Qiagen社)を用いて精製した。
これらの変異体の結合特異性を、ELISAによって評価した。図24aに示すように、3つの変異体は全てTNFαに結合しが、VEGFとの交差反応は生じなかった。このことから、TNF-αに対する特異的結合性が示される。このスクリーニングの結果は、14FN3スカフォールドは、特異的結合性を有するタンパクの産出に適していることを示している。
48の陽性クローンのシークエンシングを行った後、9つのユニークな変異体が特定された。anti-TNFα変異体のシークエンシングにより、顕著な配列の収斂が示され、特にBC及びFGループにおいていくつかのクローンが同じFGループを有することが認められた。
興味深いことに、回収された変異体は全てチロシンWTMライブラリからの変異体であった。このことから、アミノ酸が14のBCループ長に対する明確な優先傾向が認められる。
さらに、全ての変異体はBC及びFGループ中にシステイン残基を有し、拡張されたBCループの位置26Cと、FGループの位置82においてシステインに対する明確な選択性が認められる。このようなシステインの存在により、これらの変異体では、BCループとFGループの間にジスルフィド結合が形成されることが示唆される。
BCループとFGループの間にジスルフィド結合が形成されることにより14FN3の構造が安定化され、また2つのループが互いに接近する。この結果、TNFαとの接触面積が大きくなるとともに、結合親和性が高くなる。
14FN3-Fc融合体の性質を評価するために、最良のanti-TNFα変異体であるR41 A6をFc融合タンパクとして発現させた。このFc融合タンパク用のテンプレートDNAは、MGC:39273 IMAG E: 5440834 9 (Ref ID: BC024289)クローンに由来するものであった。Ncol及びXhol制限酵素認識部位を有するR41A6遺伝子とXhol末端を有するヒトIgG1のFc領域の PCRによる増幅には、以下のオリゴヌクレオチドを用いた。
Fc増幅のPCR反応には、2μlのOrigene clone BC024289.1 mini-prep DNA (100 ng)、1μlのFc Xhol For primer (20μM)、1μlのFc Xhol Revプライマー(20μM)、1μlの10 mM dNTP、5μlの10X Standard Taq Reaction Buffer (NEB社)、1μl Taq DNA Polymerase (NEB)、及び39μlのdiH2Oを用いた。
PCRは、94℃で2分間のサイクルを1回行い、次に94°Cで30秒、60℃で30秒、75℃で3分間のサイクルを25回繰り返すことにより行った。
制限酵素Ncol (NEB社)、Xhol (NEB社)及びCalf Intestinal Alkaline Phosphatase (NEB社のCIP)により、20μgのpET-20bベクターを37℃で完全に消化させた。1.2%アガロースゲルを用いてDNA骨格を精製し、Qiagen Gel Extraction Kitを用いて DNAバンドを精製した。Qiagen Qiaquick PCR Clean-up Kit を取扱説明書に従って用いてPCR単位複製配列を精製し、80μlのdiH2Oでスピンカラムから溶出させた。
制限酵素Ncol (NEB社)及びXhol (NEB社) によりR41 A6 PCRフラグメントを37℃で消化させ、1.2%アガロースゲルを用いて精製し、Qiagen Gel Extraction Kitを用いて DNAバンドを精製した。
消化させたpET-20b DNA骨格とR41A6 PCRフラグメントとを、一晩ライゲーションさせた。ライゲーションさせたDNA (1μl)をTOP10細胞(Invitrogen社)中に電気穿孔し、LB-AMPプレートを用いてクローンを選択した。制限酵素消化とシークエンシングによりmini-prep DNAをスクリーニングした後、pET-20b + TNF A6 #27クローンを回収した。
制限酵素Xhol (NEB社) によりFc PCRフラグメントを37℃で消化させ、1.2%アガロースゲルを用いて精製し、Qiagen Gel Extraction Kitを用いてDNAバンドを精製した。
消化させたpET-20b+ TNF A6 #27 (A6) DNA骨格とFc PCRフラグメントとを、一晩ライゲーションさせた。ライゲーションさせたDNA (1μl)をTOP10細胞(Invitrogen社)中に電気穿孔し、LB-AMPプレートを用いてクローンを選択した。制限酵素消化とシークエンシングによってmini-prep DNAの正しい配向方向についてスクリーニングした後、pET-20b + TNF A6 + Fc #39 (A6 + Fc)クローンを回収した。
溶解物を14,000rpm,4℃で20分間遠心分離し、Talon電磁ビーズと4℃で1時間混合した。磁石で電磁ビーズをペレット化し、洗浄バッファー(50 mMリン酸ナトリウム、pH 8、500 mM NaCl、40 mMイミダゾール、5%グリセロール、 及び0.01 % Tween-20)で5回洗浄した。
タンパクを350μlの溶出バッファー(50 mMリン酸ナトリウム、pH 8、500 mM NaCl、40 mMイミダゾール、5%グリセロール、 及び0.01 % Tween-20)で2回溶出させ、Zeba脱塩カラム(Pierce社)を用いて、PBSへ緩衝液交換した。CBQCA Protein Quantification Kit (Invitrogen社)を用いてタンパク濃度を定量した。
Octet計測器を用い、取り扱い説明書に従ってBasic Kinetic Assay測定を行った。A6のKDは20-100 nMで、A6+FcのKDは2-25 nMである。A6+FcのKoffは、モノマー性A6タンパクと比較すると2倍に改善された。これらの結果は、14FN3バインダーにFc領域を追加することにより、結合性を改善できることを示している。
<FN3ライブラリのANTI-VEGFに対する結合性のスクリーニングと分析>
この発明の組合せライブラリの機能を評価するために、2つの自然−変異体組合せループ(BC/11とDE/6)のバインダーを設計した。このライブラリは、図25Bの紙面上方に示したBCループの自然−変異体アミノ酸、または化学的等価物が含まれるようにして構築した。
図9に示した各天然アミノ酸変異体と、BCループに導入されたアミノ酸(図25A)の比較から、各位置には出現頻度が最も高い1〜6種のアミノ酸変異体またはその化学的等価物が用いられ、用いられる変異体の数はその変異体の出現頻度分布に依存し、必要に応じて、1残基当りの変異体の数の平均値が4より大きくなるようにして副生アミノ酸の発生につながるコドン変化を最小にし、全体の多様性を約106にしていることが分かる。
同様に、DE/6ループは、図25Bの紙面上方に示したBCループの自然−変異体アミノ酸、または化学的等価物が含まれるようにして構築した。図12に示した各天然アミノ酸変異体と、DEループに導入されたアミノ酸(図25A)の比較から、最も出現頻度が高い6種のアミノ酸変異体またはその化学的等価物が各位置に用いられていることが分かる。但し、位置1では9種の変異体全てが用いられている。
各位置における変異体の数の平均値をより大きくして、より少ない数の残基位置に導入したことにより、各位置の残基数を大きくしながら、全体の多様性を約105以下に保つことができた。
このライブラリのスクリーニングを行うために、ファージを、PBS-2.5%の脱脂粉乳中、室温で1時間処理して、ストレプトアビジン−被覆電磁ビーズに予め結合させたビオチン化VEGF(121)とともに、インキュベートした。
続いて、PBS-0.1 % Tween-20で洗浄し、結合したファージを0.1N HClで溶出させ、次の選択を行うために、TG1細胞中で増殖させた。第1回の処理ではVEGFの濃度を1μMとし、1回処理を行う毎にこの濃度を5倍に希釈し、最終回の選択時のVEGF濃度が20 nMになるようにした。
相対的な濃縮率を測定するために、クロラムフェニコール耐性が賦与された比較用非ディスプレイファージミド(pBC)から産出されたファージもインキュベートした。いずれの処理回でも、ライブラリのファージは、比較用の非ディスプレイファージと比較して、2から5倍の濃縮率が認められた(Table20)。
R1 D4を溶解性タンパクとして発現させ、Ni-キレートカラムを用いて精製した。Octetを用いて分析した結果、VEGF結合における解離速度は1.7×10-4であった(図25c)。これは、Koff値が1.1×10-4の anti-VEGF抗体と比肩し得る。
これらの結果は、本願の組合せライブラリの設計と14FN3スカフォールドとを組合せることにより、標的に対する親和性が非常に高いバインダーが得られることを証明している。
<FN3ライブラリのANTI-HMGB1結合活性に関するスクリーニングと評価>
<14FN3組合せユニバーサルライブラリのHMGB1スクリーニング>
実施例9の14FN3自然−変異体組合せライブラリは、別の治療標的であるHMGB1にも抗する。(図26A にBC/11ループとDE/6ループの各位置における配列の変異を示す。)
HMGB1は、当初はクロマチンの安定化と転写制御において重要な遍在的DNA-結合タンパクと考えられていた。最近になって、細胞外HMGB1は、壊死細胞または活性化された免疫細胞から放出されたとき、重要な炎症促進性サイトカインとなることが示された。
14FN3-ベースのHMGB1に対する抗体摸倣体を特定するために、HMGB1バインダーに対する 14FN3の2つのループ(BC/DE) の組合せライブラリを構築した。上記のVEGFの場合と同様にして、ファージディスプレイによる選択を3回繰り返して行った。1回目の操作では、0.5μM HMGB1または0.1μM HMGB1のいずれかを用いた。操作回毎に2.5倍に希釈し、選択の最終操作回において80または16 nM HMGB1が含まれるようにした。選択の最終操作回において、ライブラリのファージは、比較用の非ディスプレイファージと比較して、900から1300倍の濃縮率が認められた(Table 11 )。
最も共通性が高い変異体は50種のクローン中22種で認められ、他の4つの配列も複数回単離された。
興味深いことに、配列間に顕著な類似性が認められ、このことからある共通特性への収斂が示唆される。DEループ中の基本アミノ酸、特にKR(S/T)-Hのモチーフに、明確な選択性が認められた。BCループにも、位置24と29のバリンとイソロイシン、位置21と31のアルギニン等、いくつかの保存残基が認められた。変異体間の類似性から、これらがHMGB1の共通のエピトープを認識していることが示唆される。
各クローンを、非抑制E. Coli菌株NEB Express Iq中に形質転換した。次に、1 mM IPTGを用い30℃、6時間培養して2 mlの培養物を得た。次に、6xHis-タグ14FN3変異体を、Talon電磁ビーズ(Invitrogen社)を用いて精製した。これにより、それぞれ5から10μgの溶解性タンパクが得られた。
分析した複数のクローンの解離定数は1.4×10-2から1.0×10-6の範囲であり、大部分は1.5〜2.0×10-4の範囲であった。解離定数がこの範囲内にあることは、これらのバインダーはHMGB1に対し高い親和性を有することを示唆している。
6種の候補を選び出して、さらに分析した。Octetを用いて、結合定数と解離定数を測定した (図26C)。Table 22は、測定されたKd値はナノモルオーダーであることを示している。
<FN3ライブラリの触媒機能に関するスクリーニングと評価>
<プロテアーゼ活性プレート評価>
評価する活性がタンパク質の活性である場合、基質を含むニュートリエントプレートを用いて、プロテアーゼを分泌するコロニーをスクリーニングすることができる。変性ヘモグロビン等のプロテアーゼの基質を、ニュートリエントプレートに添加することができる(Schumacher, G. F. B., Schill, W. B., Anal. Biochem., 48: 9-26 (1972年); Benyon, Bond, Proteolytic Enzymes, 1989 (IRL Press, Oxford) p. 50)。
FN3変異体ライブラリは、イースト細胞表面、または細菌細胞表面 {Rutherford, 2006 #60} {Varadarajan, 2005 #61} に、融合タンパクとしてディスプレイさせることができる。
プロテアーゼは、この評価で検出されるために、いくつかの条件に適合しなければならない。第1に、プロテアーゼは培地中に分泌され、基質と相互作用を生じなければならない。第2に、プロテアーゼは基質中のいくつかのペプチド結合を切断して水溶性生成物を生じ、透明帯を生じさせなければならない。第3に、細胞は、評価の検出可能な閾値を超える十分なプロテアーゼ活性を示さなければならない。
プロテアーゼの比活性が低下するに従い、評価において検出に必要な閾値は増大する。p3ファージ融合タンパクとして産出されたプロテアーゼは、酵素機能(REF)も有する。
プレート評価において検出可能な活性の範囲を求めるために、異なる特異性と反応機構を有する4種のプロテアーゼを試験した。これらの酵素にはエラスターゼ、スブチリシン、トリプシン、及びキモトリプシンが含まれていた。比活性度(エラスターゼ, 81 U/mg パウダー;スブチリシン, 7.8 U/mg パウダー;トリプシン, 8600 U/mg パウダー;キモトリプシン, 53 U/mg パウダー)は、製造者が測定した値である。
各酵素、エラスターゼ、スブチリシン、トリプシン、及びキモトリプシンの希釈液を調製し、各々から5μlをピペットで採取し、3つの異なる評価プレートそれぞれの各ウェルに滴下した。
カゼインのプレート(0.2%)では、試験した最も少量の条件(タンパクが0.75 ng)でも、4種の酵素が検出可能な透明帯を生じた。
粉ミルク(3%)を含むプレートでは、エラスターゼとトリプシンはタンパクを3 ngまで低下させても検出でき、キモトリプシンは1.5 ngまで検出可能で、スブチリシンはタンパクが25 ngのときまで検出可能であった。
ヘモグロビンのプレートでは、ヘモグロビンの濃度が0.05から0.1パーセントのとき、1.5 ngのエラスターゼ、トリプシン、及びキモトリプシンが検出可能な透明帯を生じた。試験した条件下において、ヘモグロビンのプレートでは、スブチリシンはタンパクが6 ng以下のとき検出可能な透明帯を生じなかった。
Claims (11)
- 所定の結合性または酵素活性を有する1以上のポリペプチドの有無のスクリーニングに有用な、III型フィブロネクチンドメインポリペプチドのライブラリを構築する方法であって、
(i) BC、DE、及びFG アミノ酸ループ配列を、天然III型フィブロネクチンドメインポリペプチドの集合体中にアライメントさせるステップと、
(ii) アライメントさせたループ配列を、ループ長に従って分類するステップと、
(iii) ステップ(ii)から選択した任意のループ及びループ長について、位置的アミノ酸出現頻度測定を行い、各ループ位置におけるアミノ酸出現頻度を求めるステップと、
(iv) ステップ(iii)で分析した各ループ及びループ長について、それぞれの位置毎に、保存または選択された半保存コンセンサスアミノ酸であるかを同定するステップと、
(v) 少なくとも1の選択されたループ及びループ長について、
BCループ長が11で、SEQ ID NO.43または49で特定されるアミノ酸配列を有するライブラリ;
BCループ長が14で、SEQ ID NO.44または50で特定されるアミノ酸配列を有するライブラリ;
BCループ長が15で、SEQ ID NO.45または51で特定されるアミノ酸配列を有するライブラリ;
DEループ長が6で、SEQ ID NO.46または52で特定されるアミノ酸配列を有するライブラリ;
FGループ長が8で、SEQ ID NO.53で特定されるアミノ酸配列を有するか、または、最初のN−末端の6つのアミノ酸がSEQ ID NO.47で特定されるアミノ酸配列を有するライブラリ;または
FGループ長が11で、SEQ ID NO.54で特定されるアミノ酸配列を有するか、または、最初のN−末端の9つのアミノ酸がSEQ ID NO.48で特定されるアミノ酸配列を有するライブラリを構築するステップと、
(vi) コード配列のライブラリをFN3コード配列のフレームワークに導入して、FN3発現ライブラリを構築するステップと、
(vi) 発現ライブラリのFN3ポリペプチドを発現させるステップとを含む方法。 - ループ及びループ長の選択された組合せにおける2つの選択されたループの各々の多様性が105から107の範囲にあるか、または、各位置における異なるアミノ酸の種類数の平均値が5以下である、請求項1に記載の方法。
- 前記ポリペプチドが、ヒトフィブロネクチンのIII型フィブロネクチンの14番目のモジュールのA,AB,B,C,CD,D,E,EF,F, 及びGベータ−ストランド領域中の野生型アミノ酸配列を有する、請求項1に記載の方法。
- 選択された結合性または触媒活性を有する1以上のポリペプチドの有無のスクリーニングに有用な、III型フィブロネクチンドメインポリペプチドのウォークスルー突然変異誘発ライブラリであって、III型フィブロネクチンドメインポリペプチドに、
(a)選択された天然III型フィブロネクチンポリペプチドの野生型アミノ酸配列を有するA,AB,B,C,CD,D,E,EF,F,及びG領域、及び
(b)選択された長さを有するBC,DE,及びFGループ領域が含まれ、
BCループ長が11で、SEQ ID NO.43または49で特定されるアミノ酸配列;
BCループ長が14で、SEQ ID NO.44または50で特定されるアミノ酸配列;
BCループ長が15で、SEQ ID NO.45または51で特定されるアミノ酸配列;
DEループ長が6で、SEQ ID NO.46または52で特定されるアミノ酸配列;
FGループ長が8で、SEQ ID NO.53で特定されるアミノ酸配列を有するか、または、最初のN−末端の6つのアミノ酸がSEQ ID NO.47で特定されるアミノ酸配列;または
FGループ長が11で、SEQ ID NO.54で特定されるアミノ酸配列を有するか、または、最初のN−末端の9つのアミノ酸がSEQ ID NO.48で特定されるアミノ酸配列が含まれるライブラリ。 - 選択された結合性または触媒活性を有する1以上のポリペプチドの有無のスクリーニングに有用な、III型フィブロネクチンドメインポリペプチドの自然−変異体組合せライブラリであって、III型フィブロネクチンドメインポリペプチドに、
(a)選択された天然III型フィブロネクチンポリペプチドの野生型アミノ酸配列を有するA,AB,B,C,CD,D,E,EF,F,及びG領域、及び
(b)選択された長さを有するBC,DE,及びFGループ領域が含まれ、
BCループ長が11で、SEQ ID NO.43または49で特定されるアミノ酸配列;
BCループ長が14で、SEQ ID NO.44または50で特定されるアミノ酸配列;
BCループ長が15で、SEQ ID NO.45または51で特定されるアミノ酸配列;
DEループ長が6で、SEQ ID NO.46または52で特定されるアミノ酸配列;
FGループ長が8で、SEQ ID NO.53で特定されるアミノ酸配列を有するか、または、最初のN−末端の6つのアミノ酸がSEQ ID NO.47で特定されるアミノ酸配列;または
FGループ長が11で、SEQ ID NO.54で特定されるアミノ酸配列を有するか、または、最初のN−末端の9つのアミノ酸がSEQ ID NO.48で特定されるアミノ酸配列が含まれるライブラリ。 - 2つの選択されたループの各々の多様性が105から107の範囲にある、請求項5に記載のライブラリ。
- 前記ポリペプチドが、ヒトフィブロネクチンのIII型フィブロネクチンの14番目のモジュールのA,AB,B,C,CD,D,E,EF,F,及びGベータ−ストランド領域中の野生型アミノ酸配列を有する、請求項5に記載のライブラリ。
- ポリペプチドが、リボソームディスプレイライブラリ、ポリソームディスプレイライブラリ、ファージディスプレイライブラリ、バクテリア発現ライブラリ、及びイーストディスプレイライブラリからなる群から選択される発現ライブラリによりエンコードされる、請求項5に記載のライブラリ。
- 請求項5に記載のポリペプチドのライブラリをエンコードするポリヌクレオチドの発現ライブラリであって、1以上のベータ−ストランドフレームワーク領域と1以上のループ領域とをエンコードするポリヌクレオチドを合成して作られ、ここで、前記ポリヌクレオチドは予め決められたものであり、また、前記の2つの領域をエンコードする前記ポリヌクレオチドには十分なオーバーラップ配列が含まれ、これにより前記ポリヌクレオチド配列は、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)条件下において、完全なフィブロネクチン結合ドメインをエンコードする構造のポリヌクレオチドになることができる、ポリヌクレオチドの発現ライブラリ。
- 選択された抗原に対する所望の結合親和性を有するポリペプチドを特定する方法であって、請求項5に記載のFN3ポリペプチドの自然−変異体組合せライブラリと選択された抗原とを反応させるステップと、FN3ポリペプチドをスクリーニングして、選択された抗原に対する所望の結合親和性を有するポリペプチドを選択するステップとを備える方法。
- さらに、選択されたフィブロネクチン結合ドメインをエンコードするポリヌクレオチドを特定するステップを備える、請求項10に記載の方法。
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