KR101830344B1 - 피브로넥틴 단편 및 면역글로불린 단편의 융합 단백질 및 이의 용도 - Google Patents

피브로넥틴 단편 및 면역글로불린 단편의 융합 단백질 및 이의 용도 Download PDF

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Abstract

본 발명은 면역글로불린 단편과 피브로넥틴 단편의 융합 단백질의 약물 캐리어로서의 신규한 용도에 관한 것이며, 보다 구체적으로 면역글로불린 단편과 헤파린 결합 도메인을 포함하는 피브로넥틴 단편의 융합 단백질을 약물의 캐리어로서 포함하는 약학적 조성물에 관한 것이다. 본 발명에 따른 면역글로불린 단편과 피브로넥틴 단편의 융합 단백질은 이에 결합되는 약물의 생체내 활성은 비교적 높게 유지하면서 혈중 반감기를 현저히 증가시킬 뿐만 아니라 면역반응 유발의 위험성이 적어 다양한 폴리펩티드 약물의 지속형 제제 개발을 위한 캐리어로서 유용하게 사용될 수 있다.

Description

피브로넥틴 단편 및 면역글로불린 단편의 융합 단백질 및 이의 용도{A FUSION PROTEIN OF A FIBRONECTIN FRAGMENT AND AN IMMUNOGLOBULIN FRAGMENT AND USE THEREOF}
본 발명은 피브로넥틴 단편 및 면역글로불린 단편의 융합 단백질, 상기 융합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 상기 융합 단백질을 약물의 캐리어로 포함하는 약학적 조성물, 및 상기 융합 단백질을 약물의 캐리어로 이용하여 약물의 혈중 반감기를 증가시키는 방법에 관한 것이다.
일반적으로 단백질/폴리펩티드는 안전성이 낮아 쉽게 변성되고 혈액 내 단백질 가수분해효소에 의해 분해되어 신장이나 간을 통해 쉽게 제거되기 때문에, 약리성분으로 단백질/폴리펩티드 의약품의 혈중 농도 및 역가를 유지하기 위해서는 단백질 약물을 환자에게 자주 투여할 필요가 있다. 그러나, 대부분 주사제 형태로 투여되는 단백질 의약품의 경우, 활성 폴리펩티드의 혈중 농도를 유지하기 위해 자주 주사하는 것은 환자에게 엄청난 고통을 야기하게 된다. 이를 해결하기 위해, 단백질 약물의 혈중 안정성을 증가시키고 혈중 약물 농도를 오랫동안 높게 지속시켜 약효를 극대화하려는 노력이 계속되어 왔다. 이러한 단백질 약물의 지속성 제제는 단백질 약물의 안정성을 높이는 동시에 약물 자체의 역가가 충분히 높게 유지되어야 하고 환자에게 면역반응을 유발하지 않아야 한다.
단백질을 안정화시키고 단백질 가수분해효소와의 접촉 및 신장 소실을 억제하기 위해 방법으로, 종래에는 폴리에틸렌 클리콜(polyethylene glycol, PEG)과 같이 용해도가 높은 고분자를 단백질 약물 표면에 화학적으로 부가시키는 방법이 사용되어 왔다. PEG는 목적단백질의 특정 부위 또는 다양한 부위에 비특이적으로 결합하여 용해도를 높임으로써 단백질을 안정화시키고, 단백질의 가수분해를 방지하는데 효과가 있으며 특별한 부작용도 일으키지 않는 것으로 알려져 있다(Sada et al., J. Fermentation Bioengineering 71: 137-139, 1991). 그러나 PEG 결합에 의해 단백질의 안정성은 증가할 수 있지만 생리활성 단백질의 역가가 현저히 낮아지고, PEG의 분자량이 증가할수록 단백질과의 반응성이 낮아져 수율이 감소하는 문제가 있다.
생리활성 단백질의 생체내 안정성을 높이는 또 다른 방법으로서, 알부민 또는 그 단편을 유전자 재조합에 의해 목적하는 생리활성 단백질에 결합시켜 생산한 융합 단백질이 보고되어 있다(국제특허 공개 WO93/15199호 및 WO93/15200호, 유럽특허공개 EP413622호). 또한, 휴먼 게놈 사이언스(Human Genome Science)사가 효모에서 생산한 인터페론 알파와 알부민의 융합 단백질은 원숭이에서 인터페론의 반감기를 5시간에서 93시간으로 증가시켰지만, 변형되지 않은 인터페론에 비해 생체 활성도가 5% 미만으로 현저히 감소하는 문제가 있다(Osborn et al., J. Phar. Exp. Ther 303(2): 540-548, 2002). 노보(Novo)사는 식전 투여해야 하는 인슐린의 투여 빈도를 줄이기 위해 인슐린에 지방산을 결합시킨 레바미르(Levemir)를 개발하였다. 레바미르에 결합되어 있는 지방산은 혈중 알부민과 비가역적 결합을 통해 그 지속성이 증가한 것으로 알려져 있으나 24시간을 넘지 않는다. 아벤티스(Aventis)사는 인슐린의 아미노산 서열을 변경하여 PI를 낮춘 지속형 인슐린인 란투스(Lantus)를 상용화하였다. 란투스는 낮아진 PI에 의해 피하투여 시 주사부위에서 혈중으로 이동시간을 늦추어 효력의 지속성을 증가시킨 것으로 알려져 있으나 이 또한 24시간을 넘지 않는다.
한편, 면역글로불린 및 이의 단편을 이용하여 단백질 약물의 안정성을 높이고자 하는 시도가 활발히 이루어졌는데, 유전자 재조합에 의해 제조된 Fc 융합 단백질, 그 예로서 인터페론-베타 또는 그의 유도체와 면역글로불린 Fc 단편의 융합 단백질(국제특허 공개 WO00/23472호), IL-5 수용체와 면역글로불린 Fc 단편의 융합 단백질(미국특허 제5,712,121호)이 개시되어 있다. 그러나 이러한 유전자 재조합 방법에 의해 생산된 Fc 융합 단백질은 면역글로불린 Fc 단편의 특정 부위, 즉 아미노 말단 또는 카르복실 말단에서만 단백질 융합이 가능하고, 당쇄화 단백질간의 또는 비당쇄화 단백질간의 융합만이 가능하여 당쇄화 단백질과 비당쇄화 단백질의 융합은 불가능한 단점이 있다.
본 발명자들은 이미 상기 융합 기술의 단점을 극복하면서 생체내 지속성을 향상시키고 동시에 활성감소를 최소화하여 약물의 캐리어로서 유용하게 사용될 수 있는 Fc 단편을 개발한 바 있다(대한민국 특허등록 제755315호, 제775343호, 제824505호).
한편, 피브로넥틴(fibronectin)은 분자량이 250 KDa 정도의 서로 유사한 두 개의 폴리펩티드로 구성된 당단백질로서 섬유아세포, 대식세포, 혈관내피세포, 연골세포 및 일부 상피세포에서 생성되어 혈장, 상피 기저막, 진피, 근육세포와 혈관의 기저막 등과 같은 세포외 기질에 존재한다. 상기 피브로넥틴은 3종류의 동형반복모듈(homologus repeating module)인 타입 Ⅰ, Ⅱ 및 Ⅲ로 이루어져 있다. 피브로넥틴은 섬유소, 교원질, 프로테오글리칸(proteoglycan) 및 글리코사미노글리칸(glycosamino glycan) 등과 결합하여 세포간 또는 세포와 기질층간의 부착을 강화하며, 세포의 형태 유지 및 세포 기질의 조직화에 관여한다고 알려져 있다(Glosen JB. et al., J. Dermatol. Surg. Oncol., 14: 198, 1998; Stenman S. et al., J. Exp. Med., 147: 1054, 1978).
이에 본 발명자들은 약물의 생체내 지속성을 향상시키고 생체내 활성 감소를 최소화할 수 있는 약물의 캐리어를 개발하기 위해 예의 연구 노력한 결과, 피브로넥틴의 헤파린 결합부위를 본 발명자들이 기 개발한 면역글로불린 Fc 단편에 융합하면 Fc 캐리어와 피브로넥틴의 헤파린 결합부위에 의해 약물의 캐리어로서 유용하게 사용될 수 있음을 발견하고 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 약물의 캐리어로서 유용한 피브로넥틴 단편 및 면역글로불린 단편의 융합 단백질 및 이를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 융합 단백질을 캐리어로 포함하는 약학적 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 융합 단백질을 약물의 캐리어로 이용하여 약물의 혈중 반감기를 증가시키는 방법을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 하나의 양태로서 본 발명은 약물의 캐리어로서 유용하게 사용될 수 있는 피브로넥틴 단편 및 면역글로불린 단편의 융합 단백질에 관한 것이다. 바람직하게는 본 발명은 피브로넥틴의 헤파린 결합 도메인과 면역글로불린 Fc 단편의 융합 단백질을 제공한다.
본 발명에 사용된 바와 같이, "캐리어"란 용어는 약물과 함께 결합되는 물질을 의미하며, 일반적으로 약물에 결합되어 약물의 생리활성을 증감시키거나 제거하게 된다. 그러나, 본 발명에서의 캐리어는 본 발명의 목적상 결합되는 약물의 생리활성의 감소를 최소화하면서 동시에 약물의 생체내 안정성 및 피하투여 시 투여 부위로부터 혈중으로의 이동을 지연시켜 효력의 지속성을 증가시키기 위한 것이다. 이러한 약물의 캐리어로 기존에 지질(lipid), 중합체(polymer) 등 다양한 물질들이 연구되어 왔으나, 면역글로불린 Fc 단편과 피브로넥틴 단편의 융합체를 이용한 기술은 공지되어 있지 않다. 즉, 본 발명은 결합되는 약물의 생체내 지속성 증진과 생체내 활성 감소의 최소화를 위한 캐리어로서 피브로넥틴 헤파린 결합 도메인 및 면역글로불린 Fc 단편의 융합 단백질을 제공하는 것을 특징으로 한다.
본 발명에서 "면역글로불린 Fc 단편"은 면역글로불린의 중쇄와 경쇄 가변영역, 중쇄 불변영역 1(CH1)과 경쇄 불변영역1(CL1)을 제외한, 중쇄 불변영역 2(CH2) 및 중쇄 불변영역 3(CH3) 부분을 의미하며, 중쇄 불변영역에 힌지(hinge) 부분을 포함하기도 한다. 또한, 본 발명의 면역글로불린 Fc 단편은 천연형과 실질적으로 동등하거나 향상된 효과를 갖는 한, 면역글로불린의 중쇄와 경쇄 가변영역만을 제외하고, 일부 또는 전체 중쇄 불변영역 1(CH1) 및/또는 경쇄 불변영역 1(CL1)을 포함하는 확장된 Fc 단편일 수 있다. 또한, CH2 및/또는 CH3에 해당하는 상당히 긴 일부 아미노산 서열이 제거된 영역일 수도 있다. 즉, 본 발명의 면역글로불린 Fc 단편은 1) CH1 도메인, CH2 도메인, CH3 도메인 및 CH4 도메인, 2) CH1 도메인 및 CH2 도메인, 3) CH1 도메인 및 CH3 도메인, 4) CH2 도메인 및 CH3 도메인, 5) 1종 또는 2종 이상의 도메인과 면역글로불린 힌지 영역(또는 힌지 영역의 일부)과의 조합, 6) 중쇄 불변영역 각 도메인과 경쇄 불변영역의 이량체일 수 있다.
면역글로불린 Fc 단편은 생체내에서 대사되는 생분해성의 폴리펩티드이기 때문에 약물의 캐리어로 사용하기에 안전하다. 또한, 면역글로불린 Fc 단편은 면역글로불린 전체 분자에 비해 상대적으로 분자량이 작아 결합체의 제조, 정제 및 수율 면에서 유리할 뿐만 아니라, 아미노산 서열이 항체마다 달라 높은 비균질성을 나타내는 Fab 부분이 제거되기 때문에 물질의 동질성이 크게 증가되고 혈중 항원성의 유발 가능성도 낮아지는 효과를 기대할 수 있다.
또한, 본 발명의 면역글로불린 Fc 단편은 천연형 아미노산 서열뿐만 아니라 이의 서열 유도체(derivatives)를 포함한다. 아미노산 서열 유도체란 천연의 아미노산 서열과 하나 이상의 아미노산 잔기가 상이한 서열을 가지는 것을 의미하고 자연적으로 발생하거나 인위적으로 발생시킬 수 있다. 면역글로불린의 Fc 단편은 결실, 삽입, 비상보적 또는 상보적 치환 또는 이들의 조합에 의한 유도체를 포함한다. 삽입은 통상적으로 약 1개 내지 20개 아미노산의 연속 서열로 이루어지나, 보다 큰 삽입도 가능하다. 결실은 통상적으로 약 1개 내지 30개의 잔기로 이루어진다. 이러한 면역글로불린 Fc 단편의 서열 유도체를 제조하는 기술은, 본 명세서에 참고로서 포함되는, 국제특허 공개 WO97/34631호, 국제특허 공개 WO96/32478호 등에 개시되어 있다. 분자의 활성을 전체적으로 변경시키지 않는 단백질 및 펩티드에서의 아미노산 교환은 당해 분야에 공지되어 있다(H. Neurath, R.L. Hill, The Proteins, Academic Press, New York, 1979). 가장 통상적으로 일어나는 교환은 아미노산 잔기 Ala/Ser, Val/Ile, Asp/Glu, Thr/Ser, Ala/Gly, Ala/Thr, Ser/Asn, Ala/Val, Ser/Gly, Thy/Phe, Ala/Pro, Lys/Arg, Asp/Asn, Leu/Ile, Leu/Val, Ala/Glu, Asp/Gly 사이의 교환이다. 경우에 따라서는 인산화(phosphorylation), 황화(sulfation), 아크릴화(acrylation), 당화(glycosylation), 메틸화(methylation), 파네실화(farnesylation), 아세틸화(acetylation), 아밀화(amidation) 등으로 수식(modification)될 수도 있다.
상기에 기술된 면역글로불린 Fc 유도체는 본 발명의 Fc 단편과 동일한 생물학적 활성을 나타내나 Fc 단편의 열, pH 등에 대한 구조적 안정성을 증대시킨 유도체다.
또한, 이러한 면역글로불린 Fc 단편은 인간, 소, 염소, 돼지, 마우스, 토끼, 햄스터, 랫트, 기니아 피그 등의 동물의 생체내에서 분리한 천연형으로부터 얻어질 수도 있고, 형질전환된 동물세포 또는 미생물로부터 얻어진 재조합형 또는 이의 유도체 일 수 있다. 여기서, 천연형으로부터 획득하는 방법은 전체 면역글로불린을 인간 또는 동물의 생체로부터 분리한 후, 단백질 분해효소를 처리하여 얻을 수 있다. 파파인(papain)을 처리할 경우에는 Fab 및 Fc로 절단되고, 펩신(pepsin)을 처리할 경우에는 pF'c 및 F(ab')2로 절단된다. 이를 크기 배제 크로마토그래피(size-exclusion chromatography) 등을 이용하여 Fc 또는 pF'c를 분리할 수 있다. 바람직하게는 본 발명에 따른 면역글로불린 Fc 단편은 인간 유래의 면역글로불린 Fc 단편을 미생물로부터 수득한 재조합형 면역글로불린 Fc 단편이다.
또한, 면역글로불린 Fc 단편은 천연형 당쇄, 천연형에 비해 증가된 당쇄, 천연형에 비해 감소한 당쇄 또는 당쇄가 제거된 형태일 수 있다. 이러한 면역글로불린 Fc 당쇄의 증감 또는 제거에는 화학적 방법, 효소학적 방법 및 미생물을 이용한 유전공학적 방법과 같은 통상적인 방법이 이용될 수 있다. 여기서, Fc에서 당쇄가 제거된 면역글로불린 Fc 단편은 보체(c1q)의 결합력이 현저히 저하되고, 항체-의존성 세포독성 또는 보체-의존성 세포독성이 감소 또는 제거되므로, 생체내에서 불필요한 면역반응을 유발하지 않는다. 이런 점에서 약물의 캐리어로서의 본 발명의 목적에 보다 부합하는 형태는 당쇄가 제거되거나 비당쇄화된 면역글로불린 Fc 단편이다.
본 발명에서 "당쇄의 제거(deglycosylation)"는 효소로 당을 제거한 면역글로불린 Fc 단편을 말하며, "비당쇄화(aglycosylation)"는 원핵세포, 바람직하게는 대장균에서 생산하여 당쇄화가 되지 않은 면역글로불린 Fc 단편을 의미한다.
한편, 면역글로불린 Fc 단편은 인간, 소, 염소, 돼지, 마우스, 토끼, 햄스터, 랫트, 기니아 피그 등의 동물 기원일 수 있으며, 바람직하게는 인간 기원이다. 또한, 면역글로불린 Fc 단편은 IgG, IgA, IgD, IgE, IgM 유래 또는 이들의 조합(combination) 또는 이들의 하이브리드(hybrid)에 의한 Fc 단편일 수 있다. 바람직하게는 인간 혈액에 가장 풍부한 IgG 또는 IgM 유래이며, 가장 바람직하게는 리간드 결합 단백질의 반감기를 향상시키는 것으로 공지된 IgG 유래이다.
한편, 본 발명에서 "조합(combination)"이란 이량체 또는 다량체를 형성할 때, 동일 기원 단쇄 면역글로불린 Fc 단편을 암호화하는 폴리펩티드가 상이한 기원의 단쇄 폴리펩티드와 결합을 형성하는 것을 의미한다. 즉, IgG Fc, IgA Fc, IgM Fc, IgD Fc 및 IgE의 Fc 단편으로 이루어진 군으로부터 선택된 2종 이상의 단편으로부터 이량체 또는 다량체의 제조가 가능하다.
본 발명에서 "하이브리드(hybrid)"란 단쇄의 면역글로불린 Fc 단편 내에 2종 이상의 상이한 기원의 면역글로불린 Fc 단편에 해당하는 서열이 존재함을 의미한다. 본 발명의 경우 여러 형태의 하이브리드가 가능하다. 즉, IgG Fc, IgM Fc, IgA Fc, IgE Fc 및 IgD Fc의 CH1, CH2, CH3 및 CH4로 이루어진 군으로부터 1개 내지 4개 도메인으로 이루어진 도메인의 하이브리드가 가능하며, 힌지영역을 포함할 수 있다.
한편, IgG 역시 IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4의 서브클래스로 나눌 수 있으며, 본 발명에서는 이들의 조합 및 이들의 하이브리드를 포함한다. 바람직하게는 IgG2 및 IgG4 서브클래스이며, 가장 바람직하게는 보체 의존적 독성(complement-dependent cytotoxicity, CDC)과 같은 효과기 기능이 거의 없는 IgG4의 Fc 단편이다.
한편, 본 발명의 면역글로불린 Fc 단편은 그의 N-말단에 힌지 영역이 연결된 재조합 형태일 수 있는데, 이 경우 응집체 형태로 발현된 면역글로불린 Fc 단편은 활성 손실을 유발하지 않으면서 개시 코돈에 의해 코딩되는 개시 메티오닌 잔기가 제거된 활성형의 이합체 또는 단량체 형태의 Fc 단편으로 수용화(solublization) 및 재중첩(refolding)되는 장점이 있다.
상기한 바와 같이 본 발명에 적합한 면역글로불린 Fc 단편에 대한 설명은, 본 명세서에 참고로서 포함되는, 대한민국 특허등록 제755315호, 제775343호 및 제824505호에 자세히 기술되어 있다.
즉, 약물의 캐리어로서 본 발명에 따른 피브로넥틴 단편과의 융합 단백질에 사용하기에 가장 바람직한 면역글로불린 Fc 단편은 인간 IgG4 유래의 비-당쇄화된 Fc 단편이다. 인간 유래의 Fc 단편은 인간 생체에서 항원으로 작용하여 이에 대한 새로운 항체를 생성하는 등의 바람직하지 않은 면역반응을 유발할 수 있는 비-인간 유래의 Fc 단편에 비하여 바람직하다.
본 발명의 일 양태에서, 상기 면역글로불린 Fc 단편은 피브로넥틴 단편과의 융합 단백질 형태로 제작되어 약물의 캐리어로서 유용하게 사용될 수 있다.
본 발명에서 피브로넥틴은 막대-유사(rod-like) 형태로 3종류의 동형 반복 모듈(homologus repeating module)인 타입 Ⅰ, Ⅱ 및 Ⅲ로 이루어져 있다. 상기 타입 I 모듈은 약 45개 정도의 아미노산으로 이루어져 있으며, 아미노 말단과 카르복실 말단에 존재하면서 섬유소 및 교원질과의 결합작용과 관련이 있다고 알려져 있다. 타입 Ⅱ 모듈은 약 60개 정도의 아미노산으로 이루어져 있으며, 주로 콜라겐과의 결합작용과 관련이 있는 것으로 알려져 있다. 타입 Ⅲ 모듈은 피브로넥틴 단백질을 구성하는 가장 큰 형태로서 약 90개 정도의 아미노산으로 이루어져 있으며, 15개의 도메인으로 구성되어 있고, 수용체 결합 모티프인 RGD(Arg-Gly-Asp)와 헤파린 결합 모티프를 포함한다. 상기 헤파린 결합 모티프는 12, 13 및 14번째 도메인에 존재한다.
본 발명에서 "피브로넥틴 단편"은 헤파린 결합 도메인 12, 13 및 14 및 이들의 조합, 예컨대 13 및 14 도메인을 포함하는 단편, 12 내지 14 도메인 모두를 포함하는 단편 등이 선택될 수 있다. 바람직하게는 헤파린 결합 도메인 13이 선택될 수 있고, 더욱 바람직하게는 헤파린 결합 도메인 13에서 헤파린 결합 모티프(heparin binding motif, HBM)가 선택될 수 있다. 본 발명의 바람직한 실시형태에서는, 피브로넥틴 단편으로 서열번호: 11로 기재되는 아미노산 서열을 갖는 헤파린 결합 도메인 13, 서열번호: 17로 기재되는 아미노산 서열을 갖는 헤파린 결합 도메인 14, 서열번호: 24로 기재되는 아미노산 서열을 갖는 헤파린 결합 도메인 13 및 14, 서열번호: 4로 기재되는 아미노산 서열을 갖는 헤파린 결합 도메인 12 내지 14, 및 서열번호: 30으로 기재되는 아미노산 서열을 갖는 헤파린 결합 도메인 13 내 헤파린 결합 모티프가 사용된다.
이에 본 발명은 약물의 캐리어로서 유용하게 사용될 수 있는 피브로넥틴 단편과 면역글로불린 Fc 단편의 융합 단백질, 상기 융합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 및 이를 포함하는 재조합 발현벡터를 제공한다.
본 발명의 일 양태에서, 본 발명의 융합 단백질에서 면역글로불린 Fc 단편에 연결될 수 있는 피브로넥틴 단편은 피브로넥틴의 헤파린 결합 도메인 12, 13 및 14 및 이들의 조합일 수 있으며, 바람직하게는 서열번호: 4, 11, 17, 24 및 30으로 기재되는 아미노산 서열을 갖는 피브로넥틴 단편일 수 있다. 본 발명에 따라 면역글로불린 Fc 단편에 피브로넥틴 단편이 연결된 융합 단백질은 바람직하게는 서열번호: 10, 16, 21, 23 및 29로 기재되는 아미노산 서열을 가지며, 이를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 서열번호: 9, 15, 20, 22 및 28로 기재되는 염기서열을 갖는다.
피브로넥틴 단편과 면역글로불린 Fc 단편의 융합 단백질을 코딩하는 상기 폴리뉴클레오티드 서열은 이를 발현할 수 있는 벡터에 작동적으로 연결시켜 제공된다.
본 발명에서 "벡터"란 적당한 숙주세포에서 목적 단백질을 발현할 수 있는 재조합 벡터로서, 유전자 삽입물이 발현되도록 작동가능하게 연결된 필수적인 조절 요소를 포함하는 유전자 구조물(construct)을 말한다. 본 발명에서 "작동가능하게 연결된 (operably linked)"이라는 용어는 일반적 기능을 수행하도록 핵산 발현 조절서열과 목적하는 단백질을 코딩하는 핵산 서열이 기능적으로 연결되어 있는 것을 말한다. 벡터와의 작동적 연결은 당업계에 공지된 유전자 재조합 기술을 이용하여 제조할 수 있으며, 부위-특이적 DNA 절단 및 연결은 당업계에 일반적으로 알려진 효소 등을 사용하여 용이하게 수행할 수 있다. 적합한 발현벡터는 프로모터, 개시코돈, 종결코돈, 폴리아데닐화 시그널 및 인핸서와 같은 발현 조절서열을 포함할 수 있다. 개시코돈 및 종결코돈은 유전자 구조물이 투여되었을 때 개체에서 반드시 작용을 나타내야 하며 코딩서열과 인프레임(in frame)에 있어야 한다. 일반 프로모터는 구성적 또는 유도성일 수 있다. 발현벡터는 또한 벡터를 함유하는 숙주세포를 선택하기 위한 선택성 마커를 포함하고, 복제 가능한 발현벡터인 경우 복제 기원을 포함할 수 있다.
바람직하게는 면역글로불린 Fc 단편에 연결될 피브로넥틴 단편을 피브로넥틴 cDNA 중 타입 Ⅲ 헤파린 결합 도메인 12~14를 선택적으로 중합효소 연쇄반응(PCR)으로 증폭하거나 DNA 합성기를 이용하여 합성할 수 있다. 증폭/합성된 피브로넥틴 단편을 적절한 제한효소로 절단하여 삽입 절편을 제조한 후 이를 면역글로불린 Fc 단편을 포함하는 발현벡터에 삽입함으로써 면역글로불린 Fc에 피브로넥틴 단편이 연결된 융합 단백질을 발현하는 발현벡터를 제조하였다.
본 발명의 바람직한 실시형태에서는, 면역글로불린 Fc 단편에 피브로넥틴의 헤파린 결합 도메인 13이 연결된 융합 단백질을 발현하는 pET22b-CarrierA-Hep13; 면역글로불린 Fc 단편에 피브로넥틴의 헤파린 결합 도메인 14가 연결된 융합 단백질을 발현하는 pET22b-CarrierA-Hep14; 면역글로불린 Fc 단편에 피브로넥틴의 헤파린 결합 도메인 12, 13 및 14가 연결된 융합 단백질을 발현하는 pET22b-CarrierA-Hep12~14; 면역글로불린 Fc 단편에 피브로넥틴의 헤파린 결합 도메인 12 및 13이 연결된 융합 단백질을 발현하는 pET22b-CarrierA-Hep12-13; 및 면역글로불린 Fc 단편에 피브로넥틴의 헤파린 결합 도메인 13 내 헤파린 결합 모티프가 연결된 융합 단백질을 발현하는 pET22b-CarrierA-HBM을 제조하였다.
본 발명은 상기 재조합 발현벡터로 형질전환된 형질전환체 및 이를 이용하여 융합 단백질을 대량 생산하는 방법을 제공한다.
본 발명의 일 양태에서, 상기 융합 단백질을 발현하는 재조합 발현벡터를 숙주세포에 형질전환시킨다. 본 발명의 목적상, 숙주세포는 당쇄화가 일어나지 않는 원핵세포이다. 이러한 원핵세포에는 대장균(Escherichia coli), 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis), 스트렙토마이세스(Streptomyces sp.), 슈도모나스(Pseudomonas sp.), 프로테우스 미라빌리스(Proteus mirabilis) 또는 스타필로코쿠스 (Staphylococcus sp.) 등이 있으나, 바람직하게는 대장균이다. 본 발명에 적합한 대장균에는 대장균 XL-1 블루, 대장균 BL21(DE3), 대장균 JM109, 대장균 DH 시리즈, 대장균 TOP10 및 대장균 HB101이 포함되고, 바람직하게는 대장균 BL21(DE3)이나, 이로 제한되는 것은 아니다. 대장균을 숙주세포로 이용하는 경우에는 대장균이 당쇄를 단백질에 연결하는 체계가 없기 때문에 천연형 면역글로불린의 CH2 도메인에 존재하는 당이 원천적으로 결실된 형태로 면역글로불린의 Fc 단편을 생산할 수 있다. 면역글로불린의 CH2 도메인의 당은 면역글로불린의 구조적 안정성에는 영향을 미치지 않지만, 면역글로불린이 Fc 수용체를 발현하는 세포와 결합하여 항체-의존적 세포독성을 일으키고, 면역세포들이 사이토카인들을 분비시켜 염증반응을 일으키도록 하며, 보체의 C1q 요소와 결합하여 보체 고정반응을 유발하는 것으로 알려져 있다. 따라서, 비당쇄화된 면역글로불린의 Fc 단편을 생산하여 치료용 단백질과 결합시키면 바람직하지 않은 면역글로불린의 효과기 기능은 유발하지 않으면서 치료용 단백질의 혈중 농도를 오래 유지시킬 수 있다.
상기 재조합 발현벡터의 원핵세포로의 형질전환 방법은 핵산을 세포내로 도입하는 어떤 방법도 포함되며, 당업계에 공지된 바와 같이 숙주세포에 따라 적합한 표준 기술을 선택하여 수행할 수 있다. 이런 방법에는 전기충격 유전자 전달법(electroporation), 원형질 융합, 인산칼슘(CaPO4) 침전, 염화칼슘(CaCl2) 침전, 실리콘 카바이드 섬유를 이용한 교반, PEG, 덱스트란 설페이트, 리포펙타민 등이 포함되나, 이들로 제한되지 않는다.
본 발명의 바람직한 실시형태에서는, 대장균 BL21(DE3)에 면역글로불린 Fc 단편에 피브로넥틴의 헤파린 결합 도메인 13 내 헤파린 결합 모티프(HBM)가 연결된 융합 단백질을 발현하는 재조합 발현벡터 pET22b-CarrierA-HBM을 형질전환시켜 융합단백질을 제조하였다.
상기 재조합 발현벡터로 형질전환된 형질전환체는 통상의 방법으로 배양된다. 이러한 배양과정은 당업자라면 선택되는 균주에 따라 용이하게 조정하여 사용할 수 있다. 배양에 사용되는 배지는 일반적으로 세포의 성장과 생존에 필수적인 모든 영양소를 함유해야 한다. 상기 배지는 다양한 탄소원, 질소원 및 미량원소 성분을 포함한다. 사용될 수 있는 탄소원의 예에는, 포도당, 자당, 유당, 과당(fructose), 말토스, 전분, 셀룰로스와 같은 탄수화물, 대두유, 해바라기유, 피마자유, 코코넛유와 같은 지방, 팔미트산, 스테아린산, 리놀레산과 같은 지방산, 글리셀롤 및 에탄올과 같은 알코올, 아세트산과 같은 유기산이 포함된다. 이들 탄소원은 단독 또는 조합되어 사용될 수 있다. 사용될 수 있는 질소원의 예에는, 펩톤, 효모 추출물, 육즙, 맥아 추출물, 옥수수 침지액(CSL), 및 대두밀과 같은 유기 질소원 및 요소, 황산암모늄, 염화암모늄, 인산암모늄, 탄산암모늄 및 질산암모늄과 같은 무기 질소원이 포함된다. 이들 질소원은 단독 또는 조합되어 사용될 수 있다. 상기 배지에는 인원으로서, 인산이수소칼륨, 인산수소이칼륨 및 대응되는 나트륨-함유 염이 포함될 수 있다. 또한, 황산마그네슘 또는 황산철과 같은 금속염을 포함할 수 있다. 그 외에, 아미노산, 비타민, 및 적절한 전구체 등이 포함될 수 있다. 배양 중에 수산화암모늄, 수산화칼륨, 암모니아, 인산 및 황산과 같은 화합물을 배양물에 적절한 방식으로 첨가하여, 배양물의 pH를 조절할 수 있다. 또한, 배양 중에는 지방산 폴리글리콜 에스테르와 같은 소포제를 사용하여 기포 생성을 억제할 수 있다. 또한, 배양물의 호기성 상태를 유지하기 위하여, 배양물 내로 산소 또는 산소-함유 기체(예, 공기)를 주입할 수 있다. 배양물의 온도는 보통 20 내지 45℃, 바람직하게는 25 내지 40℃이다. 또한, 발효기를 이용할 수 있는데, 발효기를 이용하여 단백질을 생산하는 경우에는 숙주세포의 성장속도와 발현산물의 양 등 여러 인자를 고려해야 한다. 적절한 배양조건에서 IPTG 등을 첨가하여 단백질의 발현을 유도할 수도 있다.
상기 형질전환체로부터 발현된 면역글로불린 단편 및 피브로넥틴 단편의 융합 단백질은 당업계에 공지된 통상의 방식으로 정제될 수 있다. 형질전환체로부터 생산된 융합 단백질은 프렌치 프레스, 초음파 분쇄기 등의 방법을 이용하여 세포를 파쇄한 후, 융합 단백질을 포함하는 불용성 응집체만을 원심분리기를 이용하여 분리하고, 이어서 수득된 분획을 용해 및 변성시켜 요소, 구아니딘, 아르기닌 시스테인, 베타-머캅토에탄올 등의 제제로 재중첩시킨 후 투석, 겔 여과, 이온 교환, 침전, 흡착, 전기영동, 역상 칼럼 크로마토그래피와 같은 칼럼 크로마토그래피 및 한외여과 등의 기법을 단독 또는 조합으로 적용시켜 본 발명의 융합 단백질을 순수하게 수득할 수 있다.
상기와 같이 형질전환체로부터 분리, 정제된 면역글로불린 단편과 피브로넥틴 단편의 융합 단백질은 약물의 캐리어로서 유용하게 사용될 수 있다. 이에, 본 발명은 상기 융합 단백질을 캐리어로 포함하는 약학적 조성물을 제공한다. 또한 본 발명은 상기 융합 단백질을 약물의 캐리어로 이용하여 약물의 혈중 반감기를 증가시키는 방법을 제공한다.
본 발명의 일 양태에서, 본 발명에 따른 면역글로불린 단편과 피브로넥틴 단편의 융합 단백질은 약물의 캐리어로 작용하여 약물과 결합체를 형성할 수 있다.
본 발명에서 "약물 결합체" 또는 "결합체"는 하나 이상의 약물이 하나 이상의 면역글로불린 단편과 피브로넥틴 단편의 융합 단백질의 융합 단백질과 상호 연결되어 있는 것을 의미한다.
본 발명에서 "약물"이란 인간이나 동물에게 투여될 경우 치료적 활성을 나타내는 물질을 의미하며, 폴리펩티드, 화합물, 추출물, 핵산 등을 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 약물은 바람직하게는, 폴리펩티드 약물이다. 본 발명에서, "생리활성 폴리펩티드 약물", "폴리펩티드 약물" 및 "단백질 약물"은 동일한 의미로 사용되고 있으며, 생체내에서 다양한 생리적 현상에 길항작용을 나타내는 생리학적 활성형인 것을 특징으로 한다.
이러한 폴리펩티드 약물은 쉽게 변성되거나 생체내에 존재하는 단백질 분해효소에 의해 잘 분해되는 등의 이유로 장시간에 걸쳐 생리학적 활성을 지속할 수 없는 단점이 있다. 그러나, 본 발명에 따른 면역글로불린 단편과 피브로넥틴 단편의 융합 단백질에 폴리펩티드를 결합시킨 결합체의 경우, 약물의 구조적 안정성이 증가하고 분해 반감기가 증가하며 피하로 투여 시에 헤파린과의 결합에 의해 약물의 지속시간이 증가하는 효과가 있다.
본 발명의 면역글로불린 단편과 피브로넥틴 단편의 융합 단백질에 연결 가능한 단백질 약물의 예로는, 간 성장호르몬, 성장호르몬 방출 호르몬, 성장호르몬 방출 펩티드, 인터페론류와 인터페론 수용체류(예: 인터페론-알파, -베타 및 -감마, 수용성 타입 I 인터페론 수용체 등), 과립구 콜로니 자극인자(G-CSF), 과립구-대식세포 콜로니 자극인자(GM-CSF), 글루카콘-유사 펩티드류(GLP-1 등), G-단백질 관련 수용체(G-protein-coupled receptor), 인터루킨류(예: IL-1 수용체, IL-4 수용체 등), 효소류(예: 글루코세레브로시다제(glucocerebrosidase), 이두로네이트-2-설파타제(iduronate-2-sulfatase), 알파-갈락토시다제-A, 아갈시다제 알파(agalsidase alpha), 베타, 알파-L-이두로니다제(alpha-L-iduronidase), 부티릴콜린에스터라제(butyrylcholinesterase), 키티나제(chitinase), 글루타메이트 디카르복실라제(glutamate decarboxylase), 이미글루세라제(imiglucerase), 리파제(lipase), 유리케이즈(uricase), 혈소판-활성인자 아세틸하이드롤라제(platelet-activating factor acetylhydrolase), 중성 엔도펩티다제(neutral endopeptidase), 마이엘로퍼옥시다제(myeloperoxidase) 등), 인터루킨 및 사이토카인 결합 단백질류(예: IL-18bp, TNF-결합 단백질 등), 대식세포 활성인자, 대식세포 펩티드, B 세포인자, T 세포인자, 단백질 A, 알러지 억제인자, 세포 괴사 당단백질, 면역독소, 림포독소, 종양 괴사인자, 종양 억제인자, 전이 성장인자, 알파-1 안티트립신, 알부민, 알파-락트알부민(alpha-lactalbumin), 아포리포단백질-E, 적혈구 생성인자, 고 당쇄화 적혈구 생성인자, 안지오포이에틴류(angiopoietin), 헤모글로빈, 트롬빈(thrombin), 트롬빈 수용체 활성 펩티드, 트롬보모듈린(thrombomodulin), 혈액인자 Ⅶ, 혈액인자 Ⅶa, 혈액인자 Ⅷ, 혈액인자 Ⅸ, 혈액인자 XⅢ, 플라스미노겐 활성인자, 피브린-결합 펩티드, 유로키나제, 스트렙토키나제, 히루딘(hirudin), 단백질 C, C-반응성 단백질, 레닌 억제제, 콜라게나제 억제제, 수퍼옥사이드 디스뮤타제, 렙틴, 혈소판 유래 성장인자, 상피세포 성장인자, 표피세포 성장인자, 안지오스타틴(angiostatin), 안지오텐신(angiotensin), 골 형성 성장인자, 골 형성 촉진 단백질, 칼시토닌, 인슐린, 아트리오펩틴, 연골 유도인자, 엘카토닌(elcatonin), 결합조직 활성인자, 조직인자 경로 억제제(tissue factor pathway inhibitor), 여포 자극 호르몬, 황체 형성 호르몬, 황체 형성 호르몬 방출 호르몬, 신경 성장인자류(예: 신경 성장인자, 모양체 신경영양인자(cilliary neurotrophic factor), 악소제네시스 인자-1(axogenesis factor-1), 뇌-나트륨뇨배설 펩티드(brain-natriuretic peptide), 신경교 유래 신경영양인자(glial derived neurotrophic factor), 네트린(netrin), 중성구 억제인자(neurophil inhibitor factor), 신경영양인자, 뉴트린(neuturin) 등), 부갑상선 호르몬, 릴랙신, 시크레틴, 소마토메딘,인슐린 유사 성장인자, 부신피질 호르몬, 글루카곤, 콜레시스토키닌, 췌장 폴리펩티드, 가스트린 방출 펩티드, 코티코트로핀 방출인자, 갑상선 자극호르몬, 오토탁신(autotaxin), 락토페린(lactoferrin), 미오스타틴(myostatin), 수용체류(예: TNFR(P75), TNFR(P55), IL-1 수용체, VEGF 수용체, B 세포 활성인자 수용체 등), 수용체 길항물질(예: IL1-Ra 등), 세포표면항원(예: CD 2, 3, 4, 5, 7, 11a, 11b, 18, 19, 20, 23, 25, 33, 38, 40, 45, 69 등), 단일클론 항체, 다중클론 항체, 항체 단편류(예: scFv, Fab, Fab', F(ab')2 및 Fd), 바이러스 유래 백신 항원 등 다양한 종류를 포함하며, 상기 예시된 종류로 한정되지 않는다.
한편, 본 발명에 따른 면역글로불린 단편과 피브로넥틴 단편의 융합 단백질은 유전자 재조합 방법 혹은 링커를 매개로 하여 약물과 연결된 결합체를 형성할 수 있다. 링커를 사용할 경우 펩티드성 링커 또는 비펩티드성 링커 모두를 포함하나, 바람직하게는 비펩티드성 링커이며, 보다 바람직하게는 비펩티드성 중합체이다. 본 발명에서, "펩티드성 링커"란 아미노산, 바람직하게는 펩티드 결합으로 연결된 1 내지 20개의 아미노산을 의미하며, 당쇄화된 형태일 수도 있다. 이러한 펩티드성 링커는 Gly, Ser 반복 단위를 갖는 펩티드로 T 세포에 대해 면역학적으로 불활성인 펩티드를 사용하는 것이 바람직하다. 본 발명에서 "비펩타이드성 중합체"란 반복 단위가 2개 이상 결합된 생체적합성 중합체를 의미하며, 이러한 비펩타이드성 중합체의 예로는, 폴리에틸렌 글리콜(polyethylene glycol, PEG), 폴리프로필렌 글리콜(polypropylene glycol, PPG), 에틸렌글리콜-프로필렌글리콜 공중합체(co-poly(ethylene/propylene) glycol), 폴리옥시에틸렌(polyoxyethylene, POE), 폴리우레탄(polyurethane), 폴리포스파젠(polyphosphazene), 폴리사카리드(polysaccharide), 덱스트란(dextran), 폴리비닐 알코올(polyvinyl alcohol), 폴리비닐 피로리돈(polyvinyl pyrrolidones), 폴리비닐 에틸 에테르(polyvinyl ethyl ether) 폴리아크릴 아미드(polyacryl amide), 폴리아크릴레이트(polyacrylate), 폴리시아노아크릴레이트(polycyanoacrylates), 지질 중합체, 키틴류, 히아루론산(hyaluronic acid), 헤파린(heparin) 등이 있고, 바람직하게는 폴리에틸렌 글리콜다. 본 발명에 따른 면역글로불린 단편과 피브로넥틴 단편의 융합 단백질에 결합 가능한 링커의 개수는 특별히 제한되지 않는다. 바람직하게는, 본 발명의 약물 결합체에 있어 면역글로불린 단편과 피브로넥틴 단편의 융합 단백질과 링커는 1:1 내지 1:10, 바람직하게는 1:1 내지 1:2의 몰비로 결합될 수 있다.
본 발명의 바람직한 실시형태에서는, 면역글로불린 단편과 피브로넥틴 단편의 융합 단백질에 폴리에틸렌 글리콜을 페길화시킨다. 본 발명에서 "페길화"란 폴리에틸렌 글리콜이 결합되는 과정을 지칭하며, 본 발명의 목적상, 폴리에틸렌 글리콜이 면역글로불린 Fc 단편에 공유결합하는 것을 의미한다. 비펩티드성 중합체를 이용한 면역글로불린 단편의 페길화는, 본 명세서에 참고로서 포함되는, 대한민국 특허등록 제754667호에 상세히 기술되어 있다.
본 발명에 따른 면역글로불린 단편과 피브로넥틴 단편의 융합 단백질에 결합 가능한 약물의 개수는 특별히 제한되지 않는다. 바람직하게는, 본 발명의 약물 결합체에 있어 면역글로불린 단편과 피브로넥틴 단편의 융합 단백질과 약물은 1:1 내지 1:10, 바람직하게는 1:1 내지 1:4의 몰비로 결합될 수 있다. 면역글로불린 단편과 피브로넥틴 단편의 융합 단백질, 임의의 링커 및 약물의 결합은, 유전자 재조합 방법에 의해 면역글로불린 단편과 피브로넥틴 단편의 융합 단백질에 폴리펩티드 약물이 융합 단백질 형태로 발현되는 경우의 펩티드 결합(peptide bond)을 제외한 모든 공유결합과 수소결합, 이온결합, 반데르발스 친화력, 소수성 상호작용 같은 종류의 모든 종류의 비공유 결합을 포함한다. 그러나, 약물의 생리활성 측면에서 공유결합인 것이 바람직하다.
본 발명의 다른 양태에서, 본 발명은 면역글로불린 단편과 피브로넥틴 단편의 융합 단백질에 약물이 연결된 약물 결합체를 포함하는 약물의 생체내 지속성 및 안정성을 증가시키는 약학적 조성물을 제공한다. 이때, 약물 결합체는 상기한 바와 같은 링커를 이용하여 융합 단백질 연결될 수 있다.
상기한 약학적 조성물은 여러 경로를 통해 투여될 수 있다. 본 발명에서 "투여"는 어떠한 적절한 방법으로 환자에게 소정의 물질을 도입하는 것을 의미하며 상기 약물 결합체의 투여 경로는 약물이 목적 조직에 도달할 수 있는 한 어떠한 일반적인 경로를 통하여 투여될 수 있다. 복강내 투여, 정맥내 투여, 근육내 투여, 피하 투여, 혈액내 투여, 경구 투여, 국소 투여, 비강내 투여, 폐내 투여, 직장내 투여될 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다. 그러나 경구 투여 시에, 펩티드는 소화되기 때문에 경구용 조성물은 활성 약제를 코팅하거나 위에서의 분해로부터 보호되도록 제형화하는 것이 바람직하다. 바람직하게는 주사제 형태로 투여될 수 있다. 또한, 활성 물질이 표적 세포로 이동할 수 있는 임의의 장치에 의해 투여될 수 있다.
발명의 약학적 조성물은 약학적으로 허용가능한 담체를 포함할 수 있다. 약학적으로 허용되는 담체는 경구 투여의 경우에는 결합제, 활탁제, 붕해제, 부형제, 가용화제, 분산제, 안정화제, 현탁화제, 색소, 향료 등을 사용할 수 있으며, 주사제의 경우에는 완충제, 보존제, 무통화제, 가용화제, 등장제, 안정화제 등을 혼합하여 사용할 수 있으며, 국소 투여의 경우에는 기제, 부형제, 윤활제, 보존제 등을 사용할 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물의 제형은 상술한 바와 같은 약학적으로 허용되는 담체와 혼합하여 다양하게 제조될 수 있다. 예를 들어, 경구 투여 시에는 정제, 트로키, 캡슐, 엘릭서(elixir), 현탁액, 시럽, 웨이퍼 등의 형태로 제조될 수 있으며, 주사제의 경우에는 단위 투약 앰플 또는 다중 투약 형태로 제조될 수 있다. 기타 용액, 현탁액, 정제, 캡슐, 서방형 제제 등으로 제형화될 수 있다. 제제화에 적합한 담체, 부형제 및 희석제의 예로는, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말디톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로스, 메틸 셀룰로스, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 물, 메틸하이드록시벤조에이트, 프로필하이드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 또는 광물유 등이 사용될 수 있다. 또한, 충진제, 항응집제, 윤활제, 습윤제, 향료, 유화제, 방부제 등을 추가로 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 약학적 조성물의 투여량은 질환, 투여 경로, 환자의 연령, 성별 및 체중, 및 질환의 중증도 등의 여러 관련 인자와 함께, 활성성분인 약물의 종류에 따라 결정된다. 본 발명의 약학적 조성물은 생체내 지속성이 매우 우수하므로, 약학적 제제의 투여 횟수 및 빈도를 현저하게 감소시킬 수 있다. 또한 본 발명의 약학적 조성물은 생체내에서 면역원성으로 작용하지 않으므로 부작용의 우려가 적고 장기간의 투여가 가능하고 안전하다.
본 발명에 따른 면역글로불린 단편과 피브로넥틴 단편의 융합 단백질에 약물을 결합시키면, 약물의 구조적 안정성이 증가하고 분해 반감기가 증가하며 피하로 투여 시 헤파린과의 결합에 의해 약물의 지속시간을 증가시킬 수 있다. 따라서, 본 발명에 따른 면역글로불린 단편과 피브로넥틴 단편의 융합 단백질을 캐리어로서 포함하는 약학적 조성물은 약물의 혈중 지속성을 유지하면서 생체내 활성 감소를 최소화할 뿐만 아니라, 면역반응 유발의 위험성도 거의 없어 단백질 약물의 지속형 제제 개발에 유용하게 사용될 수 있다.
도 1은 본 발명에 따른 면역글로불린 Fc 단편과 피브로넥틴의 헤파린 결합 모티프(HBM)의 융합 단백질이 헤파린에 부착 활성을 가짐을 확인한 칼럼 크로마토그래피 결과이고,
도 2는 본 발명에 따른 면역글로불린 Fc 단편과 피브로넥틴의 헤파린 결합 모티프(HBM)의 융합 단백질에 인슐린이 결합된 약물 결합체의 생체내 약물동력학을 측정한 결과이다.
이하, 하기 실시예에 의하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐 본 발명의 범위가 이들만으로 한정되는 것은 아니다.
실시예 1: 면역글로불린 단편과 피브로넥틴 단편의 융합 단백질의 제조
<1-1> 피브로넥틴 단백질의 타입 Ⅲ Hep12 , 13 및 14 도메인을 포함하는 발현벡터의 제조
피브로넥틴의 타입 Ⅲ Hep12 내지 14 도메인을 포함하는 발현벡터를 제조하기 위하여, 피브로넥틴 cDNA(NM_212482.1)를 주형으로 하고 서열번호: 1 및 2의 프라이머 쌍을 이용하여 Hep12 내지 14 도메인에 해당하는 아미노산 1723번부터 2075번까지의 부분을 PCR로 증폭하였다. 이때 서브클로닝을 용이하게 하기 위하여, 프라이머의 양쪽 말단이 제한효소 NdeI과 BamHI으로 절단되도록 고안하였고, 피브로넥틴 cDNA는 Liver cDNA 라이브러리(Stratagene, USA)를 사용하였다.
PCR은 주형 DNA 150 ng, 100 pM 프라이머 각각 1 ㎖씩, 2.5 mM dNTP 5 ㎖, pfx 중합효소 10 단위(Invitrogen, USA) 및 10× 완충액을 혼합하여 반응용액을 제조하고, 95℃에서 3분간의 초기 변성 후 95℃에서 30초, 55℃에서 30초 및 68℃에서 80초간의 증폭을 30회 수행하고, 마지막으로 68℃에서 30초간 반응시켰다. 이로부터 수득된 PCR 증폭산물을 겔 추출 키트(Quiagen, 독일)를 이용하여 추출한 후 제한효소 NdeI과 BamHI으로 처리하여 삽입 절편을 제조하였다. 이어서, pET22b 벡터(Novagen, USA)를 동일한 제한효소로 절단하고 동일한 겔 추출 키트를 이용하여 추출하였다. 이와 같이 준비된 벡터에 상기 삽입 절편을 T4 리가아제를 이용하여 연결시킨 후 대장균 TOP10 적격 세포(competent cell)(Invitrogen, USA)에 형질전환시켰다.
상기 형질전환체를 암피실린 함유 LB 고체 배지에 접종하고 배양하여 배지 위에 형성된 콜로니 10개를 무작위로 선택하였다. 선택된 콜로니를 다시 암피실린 함유 LB 액체 배지에 접종하여 밤새 배양한 후 플라스미드 DNA를 추출키트(퀴아젠, 독일)를 이용하여 추출하였다. 상기 플라스미드 DNA를 제한효소 AlwNI 및 SacI으로 절단하고 전기영동을 통하여 789bp 크기의 삽입 DNA가 존재함을 확인한 후 DNA 서열분석을 통하여 피브로넥틴의 타입 Ⅲ Hep12 내지 14 도메인이 벡터에 올바르게 삽입되었음을 확인하였다. 서열분석 결과, 피브로넥틴의 타입 Ⅲ Hep12 내지 14 도메인은 서열번호: 4로 기재되는 아미노산 서열을 가지며, 이를 코딩하는 폴리펩티드는 서열번호: 3으로 기재되는 염기서열을 갖는다. 본 발명자들은 상기와 같이 제조된 피브로넥틴의 타입 Ⅲ Hep12 내지 14 도메인을 포함하는 발현벡터를 "pET22b-FNHeparin"이라 명명하였다.
<1-2> 면역글로불린 Fc 단편과 피브로넥틴 타입 Ⅲ Hep13 도메인의 융합 단백질을 포함하는 발현벡터의 제조
면역글로불린 Fc 단편의 C-말단에 Hep13 도메인이 융합된 융합 단백질을 제조하기 위하여, 먼저 면역글로불린 Fc 단편을 주형으로 하고 NdeI 제한효소 절단부위를 포함하는 면역글로불린 Fc 단편의 N-말단 프라이머(서열번호: 5)와 Hep13의 N-말단 부위를 일부 포함하는 면역글로불린 Fc 단편의 C-말단 프라이머(서열번호: 6)를 이용한 1차 PCR을 수행하여 면역글로불린 Fc 유전자 절편을 증폭하였고, Hep13 유전자를 주형으로 하고 면역글로불린 Fc의 C-말단을 일부 포함하는 Hep13 N-말단 프라이머(서열번호: 7)와 BamHI 제한효소 절단 부위를 포함하는 Hep13 C-말단 프라이머(서열번호: 8)를 이용한 2차 PCR을 수행하여 Hep13 유전자 절편을 증폭하였다. PCR 조건은 1차 PCR은 95℃에서 30초, 55℃에서 30초 및 68℃에서 80초간의 증폭을 30회 수행하고, 2차 PCR은 95℃에서 30초, 55℃에서 30초 및 68℃에서 80초간의 증폭을 30회 수행하는 것을 제외하고는 상기 실시예 <1-1>과 동일하게 수행되었다.
상기 1차 및 2차 PCR에서 증폭된 유전자 절편을 주형으로 하고 서열번호: 5 및 8번의 프라이머 쌍을 이용하여 3차 PCR을 수행한 후 PCR 증폭산물을 제한효소 NdeI 및 BamHI로 절단하여 면역글로불린 Fc-Hep13 융합 단백질의 삽입 절편을 제조하였다. 이어서 pET-22b 벡터를 동일한 제한효소로 절단하고 상기에서 제조한 면역글로불린 Fc-Hep13 융합 단백질의 삽입 절편을 T4 리가아제를 통해 연결시킨 후 대장균 TOP10 적격 세포(Invitrogen, USA)에 형질전환시켰다.
형질전환체를 상기 실시예 <1-2>와 같이 배양하여 플라스미드 DNA를 추출한 후 서열분석을 통하여 면역글로불린 Fc-Hep13 융합 단백질이 벡터에 올바르게 삽입되었음을 확인하였다. 서열분석 결과, 본 발명에 따른 면역글로불린 Fc-Hep13 융합 단백질은 서열번호: 10으로 기재되는 아미노산 서열을 가지며, 이는 서열번호: 9로 기재되는 폴리펩티드에 의해 코딩되고, 상기 융합 단백질에서 Hep13 단백질은 서열번호: 11로 기재되는 아미노산 서열을 갖는다. 본 발명자들은 상기와 같이 제조된 면역글로불린 Fc-Hep13 융합 단백질을 포함하는 발현벡터를 "pET22b-CarrierA-Hep13"이라 명명하였다.
<1-3> 면역글로불린 Fc 단편과 피브로넥틴 타입 Ⅲ Hep14 도메인의 융합 단백질을 포함하는 발현벡터의 제조
면역글로불린 Fc 단편의 C-말단에 Hep14 도메인이 융합된 융합 단백질을 제조하기 위하여, 먼저 면역글로불린 Fc 단편을 주형으로 하고 NdeI 제한효소 절단부위를 포함하는 면역글로불린 Fc 단편의 N-말단 프라이머(서열번호: 7)와 면역글로불린 Fc 단편의 C-말단 프라이머(서열번호: 12)를 이용한 1차 PCR을 수행하여 면역글로불린 Fc 유전자 절편을 증폭하였고, Hep14 유전자를 주형으로 하고 StuI 제한효소 절단부위를 포함하는 Hep14 N-말단 프라이머(서열번호: 13)와 BamHI 제한효소 절단부위를 포함하는 Hep14 C-말단 프라이머(서열번호: 14)를 이용한 2차 PCR을 수행하여 Hep14 유전자 절편을 증폭하였다. PCR 조건은 상기 실시예 <1-2>와 동일하게 수행하였다.
증폭된 유전자를 각각 NdeI, StuI 및 BamHI으로 절단하여 면역글로불린 Fc-Hep14 융합 단백질의 삽입 절편을 제조한 후 이를 동일한 제한효소로 절단된 pET-22b 벡터에 T4 리가아제를 통해 연결시킨 후 대장균 TOP10 적격 세포(Invitrogen, USA)에 형질전환시켰다.
형질전환체를 상기 실시예 <1-2>와 같이 배양하여 플라스미드 DNA를 추출한 후 서열분석을 통하여 면역글로불린 Fc-Hep14 융합 단백질이 벡터에 올바르게 삽입되었음을 확인하였다. 서열분석 결과, 본 발명에 따른 면역글로불린 Fc-Hep14 융합 단백질은 서열번호: 16으로 기재되는 아미노산 서열을 가지며, 이는 서열번호: 15로 기재되는 폴리펩티드에 의해 코딩되고, 상기 융합 단백질에서 Hep14 단백질은 서열번호: 17로 기재되는 아미노산 서열을 갖는다. 본 발명자들은 상기와 같이 제조된 면역글로불린 Fc-Hep14 융합 단백질을 포함하는 발현벡터를 "pET22b-CarrierA-Hep14"라 명명하였다.
<1-4> 면역글로불린 Fc 단편과 피브로넥틴 타입 Ⅲ Hep12 ~14 도메인의 융합 단백질을 포함하는 발현벡터의 제조
면역글로불린 Fc 단편의 C-말단에 Hep12~14 도메인이 융합된 융합 단백질을 제조하기 위하여, 먼저 면역글로불린 Fc 단편을 주형으로 하고 NdeI 제한효소 절단부위를 포함하는 면역글로불린 Fc 단편의 N-말단 프라이머(서열번호: 3)와 Hep12 N-말단 부위를 포함하는 면역글로불린 Fc 단편의 C-말단 프라이머(서열번호: 18)를 이용한 1차 PCR을 수행하여 면역글로불린 Fc 유전자 절편을 증폭하였고, Hep12~14 유전자를 주형으로 하고 면역글로불린 Fc 단편의 C-말단 부위를 포함하는 Hep12 N-말단 프라이머(서열번호: 19)와 BamHI 제한효소 절단부위를 포함하는 Hep14 C-말단 프라이머(서열번호: 14)를 이용한 2차 PCR을 수행하여 Hep12~14 유전자 절편을 증폭하였다. PCR 조건은 상기 실시예 <1-2>와 동일하게 수행하였다.
증폭된 유전자를 각각 NdeI 및 BamHI으로 절단하여 면역글로불린 Fc-Hep12~14 융합 단백질의 삽입 절편을 제조한 후 이를 동일한 제한효소로 절단된 pET-22b 벡터에 T4 리가아제를 통해 연결시킨 후 대장균 TOP10 적격 세포(Invitrogen, USA)에 형질전환시켰다.
형질전환체를 상기 실시예 <1-2>와 같이 배양하여 플라스미드 DNA를 추출한 후 서열분석을 통하여 면역글로불린 Fc-Hep12~14 융합 단백질이 벡터에 올바르게 삽입되었음을 확인하였다. 서열분석 결과, 본 발명에 따른 면역글로불린 Fc-Hep12~14 융합 단백질은 서열번호: 21로 기재되는 아미노산 서열을 가지며, 이를 코딩하는 폴리펩티드는 서열번호: 20으로 기재되는 염기서열을 갖는다. 본 발명자들은 상기와 같이 제조된 면역글로불린 Fc-Hep12~14 융합 단백질을 포함하는 발현벡터를 "pET22b-CarrierA-Hep12~14"라 명명하였다.
<1-4> 면역글로불린 Fc 단편과 피브로넥틴 타입 Ⅲ Hep13 -14 도메인의 융합 단백질을 포함하는 발현벡터의 제조
면역글로불린 Fc 단편의 C-말단에 Hep13-14 도메인이 융합된 융합 단백질을 제조하기 위하여, 먼저 면역글로불린 Fc 단편을 주형으로 하고 NdeI 제한효소 절단부위를 포함하는 면역글로불린 Fc 단편의 N-말단 프라이머(서열번호: 5)와 Hep13 N-말단 부위를 포함하는 면역글로불린 Fc 단편의 C-말단 프라이머(서열번호: 6)를 이용한 1차 PCR을 수행하여 면역글로불린 Fc 유전자 절편을 증폭하였고, Hep13-14 유전자를 주형으로 하고 면역글로불린 Fc 단편의 C-말단 부위를 포함하는 Hep13 N-말단 프라이머(서열번호: 7)와 BamHI 제한효소 절단부위를 포함하는 Hep14 C-말단 프라이머(서열번호: 14)를 이용한 2차 PCR을 수행하여 Hep13-14 유전자 절편을 증폭하였다. PCR 조건은 상기 실시예 <1-2>와 동일하게 수행하였다.
증폭된 유전자를 각각 NdeI 및 BamHI으로 절단하여 면역글로불린 Fc-Hep13-14 융합 단백질의 삽입 절편을 제조한 후 이를 동일한 제한효소로 절단된 pET-22b 벡터에 T4 리가아제를 통해 연결시킨 후 대장균 TOP10 적격 세포(Invitrogen, USA)에 형질전환시켰다.
형질전환체를 상기 실시예 <1-2>와 같이 배양하여 플라스미드 DNA를 추출한 후 서열분석을 통하여 면역글로불린 Fc-Hep13-14 융합 단백질이 벡터에 올바르게 삽입되었음을 확인하였다. 서열분석 결과, 본 발명에 따른 면역글로불린 Fc-Hep13-14 융합 단백질은 서열번호: 23으로 기재되는 아미노산 서열을 가지며, 이는 서열번호: 22로 기재되는 폴리펩티드에 의해 코딩되고, 상기 융합 단백질에서 Hep13-14 단백질은 서열번호: 24로 기재되는 아미노산 서열을 갖는다. 본 발명자들은 상기와 같이 제조된 면역글로불린 Fc-Hep13-14 융합 단백질을 포함하는 발현벡터를 "pET22b-CarrierA-Hep13-14"라 명명하였다.
<1-5> 면역글로불린 Fc 단편과 헤파린 결합 모티프( HBM )의 융합 단백질을 포함하는 발현벡터의 제조
면역글로불린 Fc 단편의 C-말단에 Hep13 도메인의 중간 부위인 헤파린 결합 모티프(heparin binding motif, HBM) 20개 아미노산(서열번호: 30)을 포함하는 융합 단백질을 제조하기 위하여, 먼저 면역글로불린 Fc 단편을 주형으로 하고 NdeI 제한효소 절단부위를 포함하는 면역글로불린 Fc 단편의 N-말단 프라이머(서열번호: 5)와 HBM N-말단 부위를 포함하는 면역글로불린 Fc 단편의 C-말단 프라이머(서열번호: 25)를 이용한 1차 PCR을 수행하여 면역글로불린 Fc 유전자 절편을 증폭하였고, 면역글로불린 Fc 단편의 C-말단 부위를 포함하는 HBM N-말단 프라이머(서열번호: 26)와 BamHI 제한효소 절단부위를 포함하는 HBM C-말단 프라이머(서열번호: 27)를 이용한 2차 PCR을 수행하여 HBM 유전자 절편을 증폭하였다. PCR 조건은 상기 실시예 <1-2>와 동일하게 수행하였다.
증폭된 유전자를 각각 NdeI 및 BamHI으로 절단하여 면역글로불린 Fc-HBM 융합 단백질의 삽입 절편을 제조한 후 이를 동일한 제한효소로 절단된 pET-22b 벡터에 T4 리가아제를 통해 연결시킨 후 대장균 TOP10 적격 세포(Invitrogen, USA)에 형질전환시켰다.
형질전환체를 상기 실시예 <1-2>와 같이 배양하여 플라스미드 DNA를 추출한 후 서열분석을 통하여 면역글로불린 Fc-HBM 융합 단백질이 벡터에 올바르게 삽입되었음을 확인하였다. 서열분석 결과, 본 발명에 따른 면역글로불린 Fc-HBM 융합 단백질은 서열번호: 29로 기재되는 아미노산 서열을 가지며, 이를 코딩하는 폴리펩티드는 서열번호: 20으로 기재되는 염기서열을 갖는다. 본 발명자들은 상기와 같이 제조된 면역글로불린 Fc-HBM 융합 단백질을 포함하는 발현벡터를 "pET22b-CarrierA-HBM"이라 명명하였다.
실시예 2: 면역글로불린 Fc 단편과 헤파린 결합 모티프( HBM )의 융합 단백질의 헤파린 부착 활성 조사
상기 실시예 <1-5>에서 제조된 면역글로불린 Fc-HBM 융합 단백질을 포함하는 발현벡터 pET22b-CarrierA-HBM을 대장균 BL21-DE3(Novagen, USA)에 형질전환시키고, 상기 대장균 형질전환체를 5 L 발효기(jar fermentor)에서 유가식(fed-batch)으로 배양한 후 0.5 mM IPTG를 첨가하고 단백질 발현을 유도하였다. 상기 대장균 형질전환체를 회수한 후 -80℃ 초저온 냉동고(deep freezer)에 보관하였다.
20 g의 대장균 형질전환체를 용해 완충액(lysis buffer, 50mM Tris 9.0, 1mM EDTA, 0.2M NaCl, 0.5% Triton X-100)을 이용하여 용해시킨 후 고압분쇄기를 이용하여 균체를 분쇄하였다. 이로부터 8 M 우레아(urea)를 이용하여 단백질을 회수하고, 10배 부피의 재중첩 완충액(2M Urea, 50mM Tris 8.0, 1mM Cystein)을 이용하여 단백질의 재중첩을 유도하였다. 재중첩된 단백질을 Q HP 칼럼(GE healthcare)에 로딩하여 불순물을 제거하였고, 이로부터 용출된 분획을 다시 헤파린 HP 칼럼(GE healthcare)에 로딩한 후 용출된 분획을 SDS-PAGE로 분석하여 헤파린에 대한 부착 활성을 조사하였다.
그 결과, 도 1에 나타난 바와 같이, 본 발명에 따른 면역글로불린 Fc-HBM 융합 단백질은 헤파린에 대해 부착 활성이 있음을 확인하였다.
실시예 3: 면역글로불린 Fc - HBM -인슐린 결합체의 제조
<3-1> PEG 링커가 결합된 면역글로불린 Fc 단편의 제조
5K PropionALD(3) PEG(프로필알데히드기를 3개 가지고 있는 PEG, NOF, 일본)를 면역글로불린 Fc 단편의 N-말단에 페길화시키기 위하여, 면역글로불린 Fc 단편의 농도를 10 ㎎/㎖로 하고 면역글로불린 Fc 단편과 PEG를 1:2의 몰비로 혼합하여 4℃에서 4.5시간 동안 반응시켰다. 이때, 상기 반응은 100 mM 인산칼륨(pH 6.0) 용액 중에서 환원제인 20 mM SCB(NaCNBH3)를 첨가하여 수행되었다. 반응이 종결된 후, 반응액을 소스 15Q(Source 15Q) 정제 칼럼(GE healthcare)에 로딩하여 모노-페길화된 면역글로불린 Fc 단편을 정제하였다.
<3-2> 면역글로불린 Fc -인슐린 결합체의 제조
상기 실시예 <3-1>에서 제조된 모노-페길화된 면역글로불린 Fc 단편과 인슐린(Humulin R, Lilly)을 몰비가 4:1이 되도록 혼합하고 전체 단백질 농도를 20 ㎎/㎖로 하여 4℃에서 20시간 동안 반응시켰다. 이때, 상기 반응은 100 mM 인산칼륨(pH 6.0) 용액 중에서 환원제인 20 mM SCB(NaCNBH3)를 첨가하여 수행되었다. 반응이 종결된 후, 반응액을 소스 15Q 정제 칼럼(GE healthcare)에 로딩하여 1차 정제한 후 이로부터 용출된 분획을 다시 소스 15ISO 정제 칼럼에 로딩하여 2차 정제를 수행하였다. 이로부터 모노-페길화된 면역글로불린 Fc 단편에 인슐린이 결합된 면역글로불린 Fc-인슐린 결합체를 수득하였다.
<3-3> PEG 링커가 결합된 면역글로불린 Fc - HBD 융합 단백질의 제조
5K PropionALD(3) PEG(프로필알데히드기를 3개 가지고 있는 PEG, NOF, 일본)를 헤파린 결합 모티프를 갖는 면역글로불린 Fc 단편의 N-말단에 페길화시키기 위하여, 상기 실시예 <1-5>에서 제조된 면역글로불린 Fc-HBM 융합 단백질의 농도를 6 ㎎/㎖로 하고 상기 융합 단백질과 PEG를 1:2의 몰비로 혼합하여 4℃에서 4시간 동안 반응시켰다. 이때 반응은 상기 반응은 100 mM 인산칼륨(pH 6.0) 용액 중에서 환원제인 20 mM SCB(NaCNBH3)를 첨가하여 수행되었다. 반응이 종결된 후, 반응액을 소스 15Q 정제 칼럼(GE healthcare)에 로딩하여 모노-페길화된 면역글로불린 Fc-HBM 융합 단백질을 정제하였다.
<3-4> 면역글로불린 Fc - HBM -인슐린 결합체의 제조
상기 실시예 <3-3>에서 제조된 모노-페길화된 면역글로불린 Fc-HBM 융합 단백질과 인슐린(Humulin R, Lilly)을 몰비가 4:1이 되도록 혼합하고 전체 단백질 농도를 20 ㎎/㎖로 하여 4℃에서 20시간 동안 반응시켰다. 이때, 상기 반응은 100 mM 인산칼륨(pH 6.0) 용액 중에서 환원제인 20 mM SCB(NaCNBH3)를 첨가하여 수행되었다. 반응이 종결된 후, 반응액을 소스 15Q 정제 칼럼(GE healthcare)에 로딩하여 1차 정제한 후 이로부터 용출된 분획을 다시 소스 15ISO 정제 칼럼에 로딩하여 2차 정제를 수행하였다. 이로부터 모노-페길화된 면역글로불린 Fc 단편에 인슐린이 결합된 면역글로불린 Fc-HBM-인슐린 결합체를 수득하였다.
실시예 4: 면역글로불린 Fc - HBM -인슐린 결합체의 생체내 약물동역학 측정
본 발명에 따른 면역글로불린 Fc-HBM-인슐린 결합체의 생체내 지속성을 확인하기 위하여, 정상 수컷 랫트(Normal SD rat)를 대상으로 하기와 같이 약물동역학을 측정하였다.
정상 수컷 랫트에 천연형 인슐린(Humulin R, Lilly) 단독, 상기 실시예 <3-2>에서 제조된 면역글로불린 Fc-인슐린 결합체, 및 상기 실시예 <3-4>에서 제조된 면역글로불린 Fc-HBM-인슐린 결합체를 100 ㎍/㎏(인슐린 기준)씩 1회 피하 투여한 후 인슐린 ELISA 키트(ALPCO)를 이용하여 시간에 따른 혈중 농도 변화를 측정하였고, 측정된 값으로부터 WinNonlin 5.2를 이용하여 약물동역학 매개변수를 산출하였다.
그 결과, 도 2에 나타난 바와 같이, 본 발명에 따른 면역글로불린 Fc-HBM-인슐린 결합체의 생체내 소실 반감기는 20시간으로 0.58시간의 천연형 인슐린과 17시간의 면역글로불린 Fc-인슐린 결합체에 비해 긴 지속성을 나타내었고, 제거율(clearance) 또한 우수한 것으로 확인되었다.
<110> Hanmi Holdings Co., Ltd <120> A FUSION PROTEIN OF A FIBRONECTIN FRAGMENT AND AN IMMUNOGLOBULIN FRAGMENT AND USE THEREOF <130> PA100654/KR <160> 30 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer <400> 1 ggaattccat atgattcctg caccaactga cctg 34 <210> 2 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer <400> 2 cgcggatcct cagggctcgc tcttctgatt attct 35 <210> 3 <211> 792 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Fibronectin Type III Hep12~14 domain <400> 3 atgattcctg caccaactga cctgaagttc actcaggtca cacccacaag cctgagcgcc 60 cagtggacac cacccaatgt tcagctcact ggatatcgag tgcgggtgac ccccaaggag 120 aagaccggac caatgaaaga aatcaacctt gctcctgaca gctcatccgt ggttgtatca 180 ggacttatgg tggccaccaa atatgaagtg agtgtctatg ctcttaagga cactttgaca 240 agcagaccag ctcagggagt tgtcaccact ctggagaatg tcagcccacc aagaagggct 300 cgtgtgacag atgctactga gaccaccatc accattagct ggagaaccaa gactgagacg 360 atcactggct tccaagttga tgccgttcca gccaatggcc agactccaat ccagagaacc 420 atcaagccag atgtcagaag ctacaccatc acaggtttac aaccaggcac tgactacaag 480 atctacctgt acaccttgaa tgacaatgct cggagctccc ctgtggtcat cgacgcctcc 540 actgccattg atgcaccatc caacctgcgt ttcctggcca ccacacccaa ttccttgctg 600 gtatcatggc agccgccacg tgccaggatt accggctaca tcatcaagta tgagaagcct 660 gggtctcctc ccagagaagt ggtccctcgg ccccgccctg gtgtcacaga ggctactatt 720 actggcctgg aaccgggaac cgaatataca atttatgtca ttgccctgaa gaataatcag 780 aagagcgagc cc 792 <210> 4 <211> 263 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Fibronectin Type III Hep12~14 domain <400> 4 Ile Pro Ala Pro Thr Asp Leu Lys Phe Thr Gln Val Thr Pro Thr Ser 1 5 10 15 Leu Ser Ala Gln Trp Thr Pro Pro Asn Val Gln Leu Thr Gly Tyr Arg 20 25 30 Val Arg Val Thr Pro Lys Glu Lys Thr Gly Pro Met Lys Glu Ile Asn 35 40 45 Leu Ala Pro Asp Ser Ser Ser Val Val Val Ser Gly Leu Met Val Ala 50 55 60 Thr Lys Tyr Glu Val Ser Val Tyr Ala Leu Lys Asp Thr Leu Thr Ser 65 70 75 80 Arg Pro Ala Gln Gly Val Val Thr Thr Leu Glu 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tggagtggga gagcaatggg 480 cagccggaga acaactacaa gaccacgcct cccgtgctgg actccgacgg ctccttcttc 540 ctctacagca ggctaaccgt ggacaagagc aggtggcagg aggggaatgt cttctcatgc 600 tccgtgatgc atgaggctct gcacaaccac tacacacaga agagcctctc cctgtctctg 660 ggtaaaagac cagctcaggg agttgtcacc actctggaga atgtcagccc accaagaagg 720 gctcgtgtga cagatgctac tgagaccacc atcaccatta gctggagaac caagactgag 780 acgatcactg gcttccaagt tgatgccgtt ccagccaatg gccagactcc aatccagaga 840 accatcaagc cagatgtcag aagctacacc atcacaggtt tacaaccagg cactgactac 900 aagatctacc tgtacacctt gaatgacaat gctcggagct cc 942 <210> 10 <211> 313 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> IG Fc-Hep13 fusion protein <400> 10 Pro Ser Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu 1 5 10 15 Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu 20 25 30 Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln 35 40 45 Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys 50 55 60 Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr 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ccagccaatg gccagactcc aatccagaga 1080 accatcaagc cagatgtcag aagctacacc atcacaggtt tacaaccagg cactgactac 1140 aagatctacc tgtacacctt gaatgacaat gctcggagct cccctgtggt catcgacgcc 1200 tccactgcca ttgatgcacc atccaacctg cgtttcctgg ccaccacacc caattccttg 1260 ctggtatcat ggcagccgcc acgtgccagg attaccggct acatcatcaa gtatgagaag 1320 cctgggtctc ctcccagaga agtggtccct cggccccgcc ctggtgtcac agaggctact 1380 attactggcc tggaaccggg aaccgaatat acaatttatg tcattgccct gaagaataat 1440 cagaagagcg agccc 1455 <210> 21 <211> 484 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> IG Fc-Hep12~14 fusion protein <400> 21 Pro Ser Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu 1 5 10 15 Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu 20 25 30 Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln 35 40 45 Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys 50 55 60 Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu 65 70 75 80 Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly 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cagatgtcag aagctacacc atcacaggtt tacaaccagg cactgactac 900 aagatctacc tgtacacctt gaatgacaat gctcggagct cccctgtggt catcgacgcc 960 tccactgcca ttgatgcacc atccaacctg cgtttcctgg ccaccacacc caattccttg 1020 ctggtatcat ggcagccgcc acgtgccagg attaccggct acatcatcaa gtatgagaag 1080 cctgggtctc ctcccagaga agtggtccct cggccccgcc ctggtgtcac agaggctact 1140 attactggcc tggaaccggg aaccgaatat acaatttatg tcattgccct gaagaataat 1200 cagaagagcg agccc 1215 <210> 23 <211> 404 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> IG Fc-Hep13-14 fusion protein <400> 23 Pro Ser Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu 1 5 10 15 Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu 20 25 30 Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln 35 40 45 Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys 50 55 60 Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu 65 70 75 80 Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys 85 90 95 Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys 100 105 110 Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser 115 120 125 Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys 130 135 140 Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln 145 150 155 160 Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly 165 170 175 Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln 180 185 190 Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn 195 200 205 His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys Arg Pro Ala 210 215 220 Gln Gly Val Val Thr Thr Leu Glu Asn Val Ser Pro Pro Arg Arg Ala 225 230 235 240 Arg Val Thr Asp Ala Thr Glu Thr Thr Ile Thr Ile Ser Trp Arg Thr 245 250 255 Lys Thr Glu Thr Ile Thr Gly Phe Gln Val Asp Ala Val Pro Ala Asn 260 265 270 Gly Gln Thr Pro Ile Gln Arg Thr Ile Lys Pro Asp Val Arg Ser Tyr 275 280 285 Thr Ile Thr Gly Leu Gln Pro Gly Thr Asp Tyr Lys Ile Tyr Leu Tyr 290 295 300 Thr Leu Asn Asp Asn Ala Arg Ser Ser Pro Val Val Ile Asp Ala Ser 305 310 315 320 Thr Ala Ile Asp Ala Pro Ser Asn Leu Arg Phe Leu Ala Thr Thr Pro 325 330 335 Asn Ser Leu Leu Val Ser Trp Gln Pro Pro Arg Ala Arg Ile Thr Gly 340 345 350 Tyr Ile Ile Lys Tyr Glu Lys Pro Gly Ser Pro Pro Arg Glu Val Val 355 360 365 Pro Arg Pro Arg Pro Gly Val Thr Glu Ala Thr Ile Thr Gly Leu Glu 370 375 380 Pro Gly Thr Glu Tyr Thr Ile Tyr Val Ile Ala Leu Lys Asn Asn Gln 385 390 395 400 Lys Ser Glu Pro <210> 24 <211> 183 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Fibronectin typeIII Hep13-14 domain <400> 24 Arg Pro Ala Gln Gly Val Val Thr Thr Leu Glu Asn Val Ser Pro Pro 1 5 10 15 Arg Arg Ala Arg Val Thr Asp Ala Thr Glu Thr Thr Ile Thr Ile Ser 20 25 30 Trp Arg Thr Lys Thr Glu Thr Ile Thr Gly Phe Gln Val Asp Ala Val 35 40 45 Pro Ala Asn Gly Gln Thr Pro Ile Gln Arg Thr Ile Lys Pro Asp Val 50 55 60 Arg Ser Tyr Thr Ile Thr Gly Leu Gln Pro Gly Thr Asp Tyr Lys Ile 65 70 75 80 Tyr Leu Tyr Thr Leu Asn Asp Asn Ala Arg Ser Ser Pro Val Val Ile 85 90 95 Asp Ala Ser Thr Ala Ile Asp Ala Pro Ser Asn Leu Arg Phe Leu Ala 100 105 110 Thr Thr Pro Asn Ser Leu Leu Val Ser Trp Gln Pro Pro Arg Ala Arg 115 120 125 Ile Thr Gly Tyr Ile Ile Lys Tyr Glu Lys Pro Gly Ser Pro Pro Arg 130 135 140 Glu Val Val Pro Arg Pro Arg Pro Gly Val Thr Glu Ala Thr Ile Thr 145 150 155 160 Gly Leu Glu Pro Gly Thr Glu Tyr Thr Ile Tyr Val Ile Ala Leu Lys 165 170 175 Asn Asn Gln Lys Ser Glu Pro 180 <210> 25 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer <400> 25 tcttggtggg ctgactttac ccagagacag ggag 34 <210> 26 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer <400> 26 ctgtctctgg gtaaagtcag cccaccaaga aggg 34 <210> 27 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer <400> 27 cgcggatcct cagctaatgg tgatggtggt tctc 34 <210> 28 <211> 726 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IG Fc-HBM fusion polyprptide <400> 28 atgccatcat gcccagcacc tgagttcctg gggggaccat cagtcttcct gttcccccca 60 aaacccaagg acactctcat gatctcccgg acccctgagg tcacgtgcgt ggtggtggac 120 gtgagccagg aagaccccga ggtccagttc aactggtacg tggatggcgt ggaggtgcat 180 aatgccaaga caaagccgcg ggaggagcag ttcaacagca cgtaccgtgt ggtcagcgtc 240 ctcaccgtcc tgcaccagga ctggctgaac ggcaaggagt acaagtgcaa ggtctccaac 300 aaaggcctcc cgtcctccat cgagaaaacc atctccaaag ccaaagggca gccccgagag 360 ccacaggtgt acaccctgcc cccatcccag gaggagatga ccaagaacca ggtcagcctg 420 acctgcctgg tcaaaggctt ctaccccagc gacatcgccg tggagtggga gagcaatggg 480 cagccggaga acaactacaa gaccacgcct cccgtgctgg actccgacgg ctccttcttc 540 ctctacagca ggctaaccgt ggacaagagc aggtggcagg aggggaatgt cttctcatgc 600 tccgtgatgc atgaggctct gcacaaccac tacacacaga agagcctctc cctgtctctg 660 ggtaaagtca gcccaccaag aagggctcgt gtgacagatg ctactgagac caccatcacc 720 attagc 726 <210> 29 <211> 241 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> IG Fc-HBM fusion protein <400> 29 Pro Ser Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu 1 5 10 15 Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu 20 25 30 Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln 35 40 45 Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys 50 55 60 Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu 65 70 75 80 Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys 85 90 95 Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys 100 105 110 Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser 115 120 125 Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys 130 135 140 Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln 145 150 155 160 Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly 165 170 175 Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln 180 185 190 Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn 195 200 205 His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys Val Ser Pro 210 215 220 Pro Arg Arg Ala Arg Val Thr Asp Ala Thr Glu Thr Thr Ile Thr Ile 225 230 235 240 Ser <210> 30 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Fibronectin typeIII HBM domain <400> 30 Val Ser Pro Pro Arg Arg Ala Arg Val Thr Asp Ala Thr Glu Thr Thr 1 5 10 15 Ile Thr Ile Ser 20

Claims (27)

  1. 헤파린 결합 도메인을 포함하는 피브로넥틴 단편 및 면역글로불린 Fc 단편 의 융합 단백질;과 약물의 결합체로서, 상기 결합체는 융합 단백질의 면역글로불린 Fc 단편과 약물이 비펩티드성 중합체를 통해 연결된 결합체이고,
    상기 비펩티드성 중합체는 폴리에틸렌글리콜인 결합체.
  2. 제1항에 있어서, 상기 피브로넥틴 단편이 타입 Ⅲ 모듈의 헤파린 결합 도메인 12, 13, 14 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 결합체.
  3. 제2항에 있어서, 상기 피브로넥틴 단편이 서열번호: 4, 11, 17, 24 및 30으로 기재되는 아미노산 서열 중 어느 하나의 아미노산 서열로 이루어진 결합체.
  4. 제1항에 있어서, 상기 면역글로불린 Fc 단편이 IgG, IgA, IgD, IgE, IgM, 이들의 조합(combination) 및 이들의 하이브리드(hybrid)의 Fc 단편으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 결합체.
  5. 제4항에 있어서, 상기 면역글로불린 Fc 단편이 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, 이들의 조합 및 이들의 하이브리드의 Fc 단편으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 결합체.
  6. 제5항에 있어서, 상기 면역글로불린 Fc 단편이 IgG4 Fc 단편인 것인 결합체.
  7. 제1항에 있어서, 상기 면역글로불린 Fc 단편이 당쇄 또는 비당쇄화된 것인 결합체.
  8. 제1항에 있어서, 상기 융합 단백질이 서열번호: 10, 16, 21, 23 및 29로 기재되는 아미노산 서열 중 어느 하나의 아미노산 서열로 이루어진 결합체.
  9. 삭제
  10. 제1항에 있어서, 상기 융합 단백질의 폴리뉴클레오티드가 서열번호: 9, 15, 20, 22 및 28로 기재되는 염기서열 중 어느 하나의 염기서열로 이루어진 결합체.
  11. 헤파린 결합 도메인을 포함하는 피브로넥틴 단편 및 면역글로불린 Fc 단편의 융합 단백질에 약물을 연결시키는 단계를 포함하는, 결합체의 제조방법으로서,
    상기 결합체는 융합 단백질의 면역글로불린 Fc 단편과 약물이 비펩티드성 중합체를 통해 연결된 결합체이고,
    상기 비펩티드성 중합체는 폴리에틸렌글리콜인 결합체의 제조방법.
  12. 삭제
  13. 제1항에 있어서, 상기 융합 단백질과 상기 약물이 1:1 내지 1:10의 몰비로 연결되는 것인 결합체.
  14. 삭제
  15. 제1항에 있어서, 상기 융합 단백질에 상기 비펩티드성 중합체가 1:1 내지 1:10의 몰비로 연결되는 것인 결합체.
  16. 삭제
  17. 제1항에 있어서, 상기 비펩티드성 중합체가 2개 이상의 반응기를 갖는 폴리에틸렌글리콜인 것인 결합체.
  18. 제1항에 있어서, 상기 약물이 생리활성 폴리펩티드인 것인 결합체.
  19. 제18항에 있어서, 상기 생리활성 폴리펩티드가 인간 성장 호르몬, 성장 호르몬방출 호르몬, 성장 호르몬 방출 펩티드, 인터페론류, 인터페론 수용체류, 콜로니자극인자류, 글루카콘-유사 펩티드류, 엑센딘-4 펩티드류, ANP, BNP, CNP,DNP, G-단백질 관련 수용체(G-protein coupled receptor), 인터루킨류, 인터루킨 수용체류, 효소류, 인터루킨 결합 단백질류, 사이토카인 결합 단백질류, 대식세포 활성인자, 대식세포 펩티드, B 세포인자, T 세포인자, 단백질 A, 알러지 억제인자, 세포 괴사 당단백질, 면역독소, 림포독소, 종양 괴사인자, 종양 억제인자, 전이 성장인자, 알파-1 안티트립신, 알부민, α-락트알부민, 아포리포단백질-E, 적혈구 생성인자, 고 당쇄화 적혈구 생성인자, 안지오포에이틴류, 헤모글로빈, 트롬빈, 트롬빈 수용체 활성펩티드, 트롬보모듈린, 혈액인자 Ⅶ, Ⅶa, Ⅷ, Ⅸ, 및 XⅢ, 플라스미노겐 활성인자, 피브린-결합 펩티드, 유로키나제, 스트렙토키나제, 히루딘, 단백질 C, C-반응성 단백질, 레닌 억제제, 콜라게나제 억제제, 수퍼옥사이드 디스뮤타제, 렙틴, 혈소판 유래 성장인자, 상피세포 성장인자, 표피세포 성장인자, 안지오스타틴, 안지오텐신, 골 형성 성장인자, 골 형성 촉진 단백질, 칼시토닌, 인슐린, 소마토스타틴, 옥트레오티드(소마토스타틴 아고니스트), 아트리오펩틴, 연골 유도인자, 엘카토닌, 결합조직 활성인자, 조직인자 경로 억제제, 여포 자극 호르몬, 황체 형성 호르몬, 황체 형성 호르몬 방출 호르몬, 신경 성장인자류, 부갑상선 호르몬, 릴랙신, 씨크레틴, 소마토메딘, 인슐린 유사 성장인자, 부신피질 호르몬, 글루카곤, 콜레시스토키닌, 췌장 폴리펩티드, 가스트린 방출 펩티드, 코르티코트로핀 방출인자, 갑상선 자극호르몬, 오토탁신, 락토페린, 미오스타틴, 수용체류, 수용체 길항물질, 세포표면항원, 바이러스 유래 백신 항원, 단일클론 항체, 다중클론 항체 및 항체 단편류로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 결합체.
  20. 제1항 내지 제8항 및 제10항 중 어느 한 항의 결합체를 포함하는 결합된 약물의 혈중 반감기 증가용 조성물.
  21. 제20항에 있어서, 상기 결합체는 융합 단백질에 약물이 1:1 내지 1:10의 몰비로 연결되는 것인 결합된 약물의 혈중 반감기 증가용 조성물.
  22. 삭제
  23. 제20항에 있어서, 상기 결합체는 융합 단백질에 상기 비펩티드성 중합체가 1:1 내지 1:10의 몰비로 연결되는 것인 결합된 약물의 혈중 반감기 증가용 조성물.
  24. 삭제
  25. 제20항에 있어서, 상기 결합체는 비펩티드성 중합체가 2개 이상의 반응기를 갖는 폴리에틸렌글리콜인 것인 결합된 약물의 혈중 반감기 증가용 조성물.
  26. 제20항에 있어서, 상기 결합체는 약물이 생리활성 폴리펩티드인 것인 결합된 약물의 혈중 반감기 증가용 조성물.
  27. 제26항에 있어서, 상기 생리활성 폴리펩티드가 인간 성장 호르몬, 성장 호르몬방출 호르몬, 성장 호르몬 방출 펩티드, 인터페론류, 인터페론 수용체류, 콜로니자극인자류, 글루카콘-유사 펩티드류, 엑센딘-4 펩티드류, ANP, BNP, CNP,DNP, G-단백질 관련 수용체(G-protein coupled receptor), 인터루킨류, 인터루킨 수용체류, 효소류, 인터루킨 결합 단백질류, 사이토카인 결합 단백질류, 대식세포 활성인자, 대식세포 펩티드, B 세포인자, T 세포인자, 단백질 A, 알러지 억제인자, 세포 괴사 당단백질, 면역독소, 림포독소, 종양 괴사인자, 종양 억제인자, 전이 성장인자, 알파-1 안티트립신, 알부민, α-락트알부민, 아포리포단백질-E, 적혈구 생성인자, 고 당쇄화 적혈구 생성인자, 안지오포에이틴류, 헤모글로빈, 트롬빈, 트롬빈 수용체 활성펩티드, 트롬보모듈린, 혈액인자 Ⅶ, Ⅶa, Ⅷ, Ⅸ, 및 XⅢ, 플라스미노겐 활성인자, 피브린-결합 펩티드, 유로키나제, 스트렙토키나제, 히루딘, 단백질 C, C-반응성 단백질, 레닌 억제제, 콜라게나제 억제제, 수퍼옥사이드 디스뮤타제, 렙틴, 혈소판 유래 성장인자, 상피세포 성장인자, 표피세포 성장인자, 안지오스타틴, 안지오텐신, 골 형성 성장인자, 골 형성 촉진 단백질, 칼시토닌, 인슐린, 소마토스타틴, 옥트레오티드(소마토스타틴 아고니스트), 아트리오펩틴, 연골 유도인자, 엘카토닌, 결합조직 활성인자, 조직인자 경로 억제제, 여포 자극 호르몬, 황체 형성 호르몬, 황체 형성 호르몬 방출 호르몬, 신경 성장인자류, 부갑상선 호르몬, 릴랙신, 씨크레틴, 소마토메딘, 인슐린 유사 성장인자, 부신피질 호르몬, 글루카곤, 콜레시스토키닌, 췌장 폴리펩티드, 가스트린 방출 펩티드, 코르티코트로핀 방출인자, 갑상선 자극호르몬, 오토탁신, 락토페린, 미오스타틴, 수용체류, 수용체 길항물질, 세포표면항원, 바이러스 유래 백신 항원, 단일클론 항체, 다중클론 항체 및 항체 단편류로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 결합된 약물의 혈중 반감기 증가용 조성물.
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