SE532249C2 - Nya formuleringar av IL-18 för behandling av olika inflammatoriska sjukdomar genom vaccinering - Google Patents

Description

533 249 ft som måste avlägsnas. Vi har därför insett att det kommer att vara mycket svårt att nå vårt mål i hund genom att vaccinera mot IgE (6). Nya innovativa strategier måste därför utvecklas. Vi presenterar här en möjlig lösning på detta problem, vaccination mot en viktig pro-inflammatorisk tillväxt och differentieringsfaktor IL-18.

IL-18 är en cytokin som tillsammans med IL- 12 har visats vara en mycket viktig inducerare av cellmedierad immunitet. Denna effekt på cellförrnedlad immunitet har visats till stor del medieras genom induktion av interferon-gamrna produktion från NK- celler (Naturliga mördarceller) och från flera andra celltyper. IL-18 visades nyligen även vara en viktig inducerare av lgE-produktion och att tillsammans med IL4 och IL-13 delta i de tidiga faserna av allergiutveckling. Denna senare upptäckt indikerade att IL-18 också spelar en viktig roll i den andra armen av vårt adaptiva immunförsvar det humorala immunförsvaret. Denna arm benämns även TH2 rörmedlad immunitet. Överproduktion av IL-18 i hudceller, keratinocyter genom introduktion av IL-18 genen i en mus (s.k. transgen kopia) med en promotor från en keratinocytspecifik gen resulterade i svår atopisk dermatit i dessa transgena djur (7). Om man slog ut genen för ett signal- överförande protein, STAT6, som deltar i den transcriptionella aktiveringen som svar på IL-4 signalering påverkade detta inte denna effekt av IL-l8 (7). IL-18 har även visats inducera astmaliknande symptom vilket indikerar att denna cytokin också deltar i många TH2 medíerade inflammatoriska reaktioner (7). Detta gör IL-18 till en mycket intressant målmolekyl för nya behandlingsstrategier, framförallt mot atopisk dermatit och astma.

Dessutom kan IL-1 8 komma att bli mycket intressant för behandling av autoimmuna sjukdomar p. g.a. sin starka interferon-garruna inducerande förmåga. Jag beskriver här ett nytt sätt att styra lL-18 inducerad inflammation. Denna behandlingsstrategi kan komma att bli ett nytt viktigt tillskott till behandlingen av svår astma i människa och atopisk dermatit i hund.

Vad som tidigare var känt inom fältet (Prior art) Patentansökningar som beskriver användandet av monoklonala antikroppar och lösliga receptorer för att blockera aktiviteten av IL- l 8 har sänts in (WOOl158956 A2). Dessa strategier för att angripa IL-1 8 är beroende av injektion av högrenade rekombinanta proteiner varannan till var fjärde vecka för resten av patientens liv. Ett vaccin som det beskrivs i denna patentansökan skulle här vara en mycket klar förbättring över tidigare känd teknik i och med att den endast är beroende av inj ektioner av rekombinant protein i mycket mindre mängd, kanske så lite som 1/ 10000 del av vad som skulle behövas med motsvarande behandling med monoklonala antikroppar eller löslig receptor. Ett vaccin behöver också bara administreras 2-4 gånger om året ijärnförelse med de betydligt mer frekventa inj ektionerna med monoklonala antikroppar och lösliga receptorer som beskrivits här ovan.

Ugpfinningens mål Målet med uppfinningen är att kurma erbjuda en metod för behandling av olika inflammatoriska sjukdomar där orsaken är att IL-l8 produceras i alltför stor mängd.

Vaccination med ett fusionsprotein bestående av IL-18 eller delar av denna cytokin och 532 249 ett främmande bärarprotein för att reducera nivåema av fritt lL-18 och därmed mildra symptomen som orsakats av förhöjd frisättning av IL-1 8.

Sammanfattning av uppfinningen Målet som beskrivits ovan uppnås enligt uppfinningen med hjälp av ett vaccin som karaktäriseras av att det innehåller hela aminosyrasekvensen eller segment större än 5 aminosyror av IL-18 i dess ursprungliga eller multimeriserade form. Proteinet kan kopplas till ett eller flera bärarprotein och kan även innehålla ett adjuvans.

Kortfattad beskrivning av figurerna Figur lA och lB visar nukleotid och motsvarande aminosyrasekvens för hund och humant IL-l 8.

Figur 2 visar en schematisk bild på tre olika genkonstrukt som tillverkats för mus och hund IL-18 fusionsproteiner, en med GST fiån parasitmasken Schistozomajaponicum som fusionspartner och två olika varianter med ett bakteriellt thioredoxin från E. coli som fusionspartner. Figuren visar också det renade GST-mus-IL-IX som användes för immuniseringsstudier.

Beskrivning av uppfinningen Anti-IL-18 antikroppar produceras i patienten genom aktiv imrnunisering, vilket även kallas vaccination. Genom att injicera en modifierad IL-l8 molekyl så börjar patientens immunsystem att producera ett polyklonalt antikroppssvar riktad mot dess eget IL-18 och reducerar därmed effekterna av en för kraftig IL-18 produktion. Det är av största vikt att modifiera antigenet så att patientens irnmunsystem uppfattar vaccinantigenet som ett främmande protein. Detta kan åstadkommas genom kovalent koppling av ett främmande (icke själv) protein eller del av protein till hela eller delar av IL-l 8 från den art som skall behandlas. Peptidregioner inom det främmande, icke kroppsegna proteinet drar då till sig och aktiverar icke toleriserade T celler som kan ge hjälp till potentiellt autoreaktiva B-celler.

Det finns minst fyra olika sätt att göra denna modifiering av självproteinet. En metod är att producera vaccinantigenet som ett fusionsprotein mellan ett frännnande protein och hela eller en utvald del på mer än 5 aminosyror i längd av IL-18 i ett prokaryot eller eukaryot expressions system. Den öppna läsramen för IL-l8, tex. hund eller humant IL-18 som kan ses i figur 1 klonas först in i bakteriell, svamp eller eukaryot (mammalie eller insekt) fusionsproteinvektor. Denna vektorkonstruktion transfekteras sedan in i en eukaryot, eller prokaryot värdcell för produktion av det önskade proteinet.

Denna fusionspartner kan här vara vilket för kroppen främmande protein som helst av en storlek från 10 aminosyror till flera hundra kD. Det är dock vanligen bäst att använda en fusionspartner av liknande storlek som självproteinet.

Alternativt kan en immunodominant peptid sättas in i den valda IL-18 sekvensen vilket resulterar i ett fusionsprotein med sj älv IL-18 sekvenser på båda sidor om den främmande peptiden. 532 249 Som ett tredje alternativ kan det icke modifierade IL-18 produceras i ett däggdjurs eller prokaryot värd eller värdcell och sedan kovalent kopplas till ett bärarprotein genom kemisk koppling.

Det fjärde alternativet som i vår mening är mindre fördelaktigt är att producera en utvald del av IL-18s aminosyrasekvens som en syntetisk peptid och sedan koppla denna peptid till ett främmande bärarprotein genom kemisk koppling. Detta tredje alternativ resulterar normalt, efter injektion i patienten, i antikroppssvar som uppvisar låg bindningsaktivitet mot nativt rätt veckat protein vilket därmed ger sämre klinisk effekt.

Efter produktion av vaccinantigenet skall det sedan testas för pyrogeninnehåll och möjligt innehåll av andra kontaminerande ämnen. För att erhålla ett tillräckligt starkt immunsvar mot sj älvproteinet kan det blandas med en immunstimulerande substans, ett adj uvans före injektion i patienten. Efter injektion i patienten induceras vaccinet ett immunsvar mot vaccinantigenet. På grund av närvaron av sj älvepitoper i vaccinantigenet så inducerar detta protein ett antikroppssvar mot denna målmolekyl, i detta fall IL- I 8, vilket leder till en sänkning av nivåerna av detta protein i patienten.

Exempel Fusionsprotein för både mus och hund IL-18 har producerats i en prokaryot värd.

Tre olika varianter av vaccinet har konstruerats, en med glutathíon-S-transferas (GST) från parasitmasken Schítozoma japonícum som fusionspartner och två olika varianter med ett bakteriellt protein, thioredoxin från E.coli, som fusionspartner (Pig. 2). För att studera förmågan hos detta fusionsprotein att inducera ett terapeutisk anti-IL-18 immunsvar så injicerades GST-IL-18 fusionsproteinet tillsammans med ett adjuvans i möss. Efter tre veckor fick mössen ytterligare en dos vaccin och efter fem veckors behandling analyserades serum från dessa möss för mängden anti-IL-l 8 som producerats. Vaccinet visade sig inducera betydande mängder anti-IL-18 i dessa möss. Detta visar att vaccinet har kapacitet att inducera produktion av substantiella mängder av anti-IL-18 i en testorganism.

Referenser 1 Hellman, L. Profound reduction in allergen sensitivity following treatment With a novel allergy vaccine. Eur J Immunol 1994, 24(2), 415-420. 2 Hellman, L. Is vaccination against IgE possible? Adv Exp Med Biol 1996, 409, 337-342. 3 Hellman, L. & Carlsson, M. Allergy Vaccines: A review of developments. Clin Immunotherapeutics 1996, 6(2), 130-142. 4 Hellman, L. Vaccines against allergies. ln Handbook of Experimental Pharmacology, Vol.133, Vaccines, Vol. 133 (Eds. Perlmann, P. & Wigzell, H.) Springer-Verlag, Berlin, 1999. 499-526. 5 Vemersson, M., Ledin, A., Johansson, J. & Hellman, L. Generation of therapeutic antibody responses against IgE through vaccination. Faseb J 2002, 16(8), 875- 877. 532 249 Ledin, A., Bergvall, K., Salmon-Hillbertz, N. et al. Generation of therapeutic antibody responses against IgE in dogs, an animal species with exceptionally high plasma IgE levels. Vaccine 2006, 24, 66-74.

Tsutsui, H., Yoshimoto, T., Hayashi, N., Mizutani, H. & Nakanishi, K. Induction of allergic inflarnmation by interleukin-IS in experimental animal models.

Immunol Rev 2004, 202, 115-138.

Claims (4)

532 249 .š-a Patentkrav

1. Vaccin innehållande IL-l8 eller ett fragment därav i dess ursprtmgliga eller multimeriserade form kopplad till en icke kroppsegen bärarmolekyl som företrädesvis administreras tillsammans med ett farmakologískt accepterbart adjuvant.

2. Vaccin enligt patentkrav l där lL-l8 är från människa, hund, katt eller häst.

3. Vaccin mot IL-18 enligt patentkrav l och 2 for användning i behandling av allergi, astma och andra inflammatoriska tillstånd.

4. Användning av ett fusionsprotein innehållande hela eller delar av IL-l8 från den art som skall behandlas kopplat till ett främmande bärarprotein för framställning av ett vaccin för behandling av allergi, astma eller andra inflammatoriska tillstånd.