JP2013504307A - アレルギー治療用低アレルゲン性ハイブリッドポリペプチド - Google Patents
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Abstract
Description
a)少なくとも2つの異なるアレルゲンに由来するN個のフラグメントを含むポリペプチドであって、隣接する任意の2フラグメントの連続したアミノ酸配列が前記アレルゲンのいずれにおいても連続するアミノ酸配列として存在せず、かつNが3より大きい整数であるポリペプチドで構成されるポリペプチド群を準備する工程;
b)前記ポリペプチドのIgE反応性を判定する工程;
c)前記ポリペプチドのT細胞反応性を判定する工程;
d)前記ポリペプチドが前記アレルゲンに対するIgG応答を誘導することが可能か否かを判定する工程;
e)前記ポリペプチドが、アレルギー患者由来IgEの前記アレルゲンへの結合を阻害する防御性IgG応答を誘導することが可能か否かを判定する工程;および
f)前記ポリペプチドの中から、(i)前記アレルゲンのいずれか1つよりもIgE反応性が低く、(ii)T細胞反応性を示し、(iii)1以上の前記アレルゲンに対するIgG応答を誘導することが可能であり、かつ(iv)アレルギー患者由来IgEの前記アレルゲンへの結合を阻害する防御性IgG応答を誘導することが可能であるポリペプチドを選択する工程
を含む、低アレルゲン性ポリペプチドの同定方法に関する。
前記ポリペプチド群は、少なくとも2つの異なるポリペプチドからなる。前記ポリペプチド群は、2〜100、好ましくは3〜75、より好ましくは4〜50、最も好ましくは5〜30の異なるポリペプチドからなることが好ましい。
(I) Met−F1−F2−...−FN−tag、
(II) Met−F1−F2−...−FN、
(III) F1−F2−...−FN−tag、
(IV) Met−tag−F1−F2−...−FN、
(V) tag−F1−F2−...−FN、
(VI) tag−F1−F2−...−FN−tag、および
(VII) F1−F2−...−FN
のいずれかの構造で構成されていてもよい。上記式中、MetはN末端メチオニン残基を示し、F1、F2およびFNは、それぞれ第1、第2および第Nフラグメントを示し、tagはタグ配列(例えば、ヘキサヒスチジンタグ((His)6))を示す。これらの実施形態(I)〜(VII)において、フラグメント間に外来のアミノ酸は存在しない。すなわち、F1−F2−...−FNは、アレルゲンフラグメントが連続する配列である。本発明の他の実施形態において、フラグメント間に1以上(例えば、1、2または3)の外来アミノ酸が存在してもよいが、存在しない方が好ましい。
本明細書における「アレルゲン」とは、アトピー性個体においてI型過敏性反応を誘発し得る物質を意味する。ほとんどのヒトでは、寄生虫感染への防御としてのみ、有意な免疫グロブリンE(IgE)応答が惹起される。しかし、一部の個体では、一般的な環境抗原に対してもIgE応答が惹起される。この遺伝的素因をアトピーと言う。アトピー性個体においては、寄生虫に由来しない抗原がIgEの異常産生を誘導するため、I型過敏症を発症する。
本発明の方法は、さらなる工程において、前記ポリペプチドのIgE反応性を判定する。「IgE反応性」とは、広義には、ある物質のIgE抗体に対する結合能を意味する。より具体的には、本明細書における「IgE反応性」とは、前記ポリペプチドの、ポリペプチド内のフラグメントの起源である1以上のアレルゲンに対してアレルギーを示す個体由来のIgE抗体に結合する能力を表す。
本発明の方法は、さらなる工程において、前記ポリペプチドのT細胞反応性を判定する。本明細書における「T細胞反応性」とは、ある物質の、T細胞受容体に特異的に結合する能力を意味する。より具体的には、「T細胞反応性」とは、前記ポリペプチドの、T細胞の増殖を誘導する能力を表す。
(1)フラグメントの起源である1以上のアレルゲンに対してアレルギーを示す個体より単離した末梢血単核細胞(PBMC)を準備し、
(2)このPBMCに含まれるT細胞の増殖の程度を求める
ことにより測定できる。実施例5および参考文献(16)を参照のこと。
本発明の方法は、さらなる工程において、前記ポリペプチドの、フラグメントの起源である1以上のアレルゲンに対してIgG応答を誘導する能力を判定する。この判定は、
(1)前記ポリペプチドで非ヒト哺乳動物(例えば、マウス、ラットまたはウサギ)を免疫し、
(2)この非ヒト哺乳動物における、フラグメントの起源である1以上の前記アレルゲンに対する特異的IgG抗体の増加量を求める
ことにより実施できる。測定するIgG抗体は、IgG1抗体が好ましい。工程(2)はELISA法により行われることが好ましい。実施例6を参照のこと。
(1)前記ポリペプチドで非ヒト哺乳動物(例えば、マウス、ラットまたはウサギ)を免疫して、IgG抗体を含む組成物を準備し、
(2)前記ポリペプチド内のフラグメントの起源である1以上の前記アレルゲンに対してアレルギーを示す個体由来のIgE抗体を含む組成物を準備し、
(3)IgG抗体を含む前記組成物が、1以上の前記アレルゲンと前記IgE抗体との結合を阻害可能であるか否か、および/またはその阻害の程度を判定する
ことにより実施できる。
本発明の方法は、最終工程として、良好な特性を示しひいてはワクチンとしての利用可能性を有する有用なポリペプチドを選択する工程を含む。選択されるポリペプチドは以下の特性を有する必要がある:
(i)ポリペプチド内のフラグメントの起源であるアレルゲンの1以上よりもIgE反応性が低い;
(ii)T細胞反応性を有する;
(iii)ポリペプチド内のフラグメントの起源であるアレルゲンに対するIgG応答を誘導できる;かつ
(iv)ポリペプチド内のフラグメントの起源であるアレルゲンへのアレルギー患者由来IgEの結合を阻害する防御性IgG応答を誘導できる。
本発明は、さらなる態様において、本発明により同定・作製される低アレルゲン性ポリペプチドに関する。
(VIII)Met−F1−F2−...−FN−tag、
(IX)Met−F1−F2−...−FN、
(X)F1−F2−...−FN−tag、
(XI)Met−tag−F1−F2−...−FN、
(XII)tag−F1−F2−...−FN、
(XIII)tag−F1−F2−...−FN−tag、および
(XIV)F1−F2−...−FN
のいずれかの構造で構成されていることが好ましい。上記式中、MetはN末端メチオニン残基を示し、F1、F2およびFNは、それぞれ第1、第2および第Nフラグメントを示し、tagはタグ配列(例えば、(His)6)を示し、各フラグメントは配列番号55〜76からなる群より選択されるアミノ酸配列からなる。通常、タグ配列は5〜10個のアミノ酸で構成される。
(XV)Met−SEQ−tag、
(XVI)Met−SEQ、
(XVII)SEQ−tag、
(XVIII)Met−tag−SEQ、
(XIX)tag−SEQ、
(XX)tag−SEQ−tag、および
(XXI)SEQ
のいずれかの構造で構成されていてもよい。上記式中、MetはN末端メチオニン残基を示し、SEQは配列番号22、23、24、25、36および37からなる群より選択されるアミノ酸配列を示し、tagはタグ配列(例えば、(His)6)を示す。通常、タグ配列は5〜10個のアミノ酸で構成される。
さらに本発明は、本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに関する。遺伝子コードの縮重により、複数の異なるポリヌクレオチド分子が1種類のポリペプチドをコードする場合がある。本発明のポリヌクレオチドは、目的のポリペプチドを宿主細胞で発現させることにより取得するための発現用コンストラクトであることが好ましい。発現用コンストラクトは、プロモーター配列、抗生物質耐性因子をコードする遺伝子、複製開始点などの当技術分野で公知の構成要素をさらに含んでいてもよい。
ハイブリッド分子の設計、発現および精製
低アレルゲン性ハイブリッド分子を作製するために、主要なオオアワガエリ花粉アレルゲンPhl p1、Phl p2、Phl p5およびPhl p6由来のアレルゲンフラグメントを組み合わせて、図1に示すような17種類の異なるハイブリッド分子を設計した。設計した各タンパク質(A〜Qと記載する)のアミノ酸配列を表1に示す。P1MおよびP2Mは、以前に設計したアレルゲン誘導体(参考文献15、16)である。これらの配列はすべて、大腸菌発現用にコドン最適化されており、各配列の5’末端に開始コドン(ATG)が、3’末端に6×ヒスチジンタグ、次いで終止コドンが付加されている。ハイブリッド分子A〜Qをコードする遺伝子を、それぞれ発現ベクターpET17b(Novagen)にクローニングして、液体培養により大腸菌BL21(DE3)株(Stratagene)で発現させた。すべてのタンパク質をアフィニティークロマトグラフィーにより標準プロトコール(Qiagen)に従って精製した。発現したハイブリッド分子の純度をSDS−PAGEにより調べた(図2)。
ハイブリッド分子の二次構造の推定
ハイブリッド分子の二次構造を決定するために、タンパク質B、C、PおよびQをそれぞれ水に溶解し、各タンパク質の遠紫外線CDスペクトルをJasco J−810分光偏光計(Japan Spectroscopic、東京、日本)を用いて収集した。遠紫外線CDスペクトルの収集は、(16)の記載に準じて行った。二次構造を分析したところ、これらのハイブリッドタンパク質はすべて、ランダムコイル構造を示した。これは他の複数のアレルゲン誘導体においても以前に確認されている(18、19)。
ハイブリッド分子のIgE反応性
ハイブリッド分子のIgE反応性を調べるために、花粉症患者の血清からIgEを採取し、該IgEの、Phl p1、Phl p2、Phl p5およびPhl p6由来のハイブリッド分子A〜Q、rPhl p1、rPhl p2、rPhl p5、rPhl p6、またはネガティブコントロールであるHSAに対する直接的な結合を、(18、19)に記載の非変性ドットブロット実験により調べた。花粉症患者のIgE抗体は、組換えタンパク質である「野生型」アレルゲンPhl p1、Phl p2、Phl p5およびPhl p6には結合したが、コントロールタンパク質HSAには結合しなかった。一方、ハイブリッド分子A〜Qに対しては、意外にもそれぞれ異なる反応性を示すことが分かった。しかし、この異なる反応性を一次構造によって説明することはできなかった(例えば、ハイブリッドAとC、およびハイブリッドEとFは、それぞれ全く同一のアレルゲンフラグメントを含んでいるため)。
ハイブリッド分子B、C、PおよびQの低アレルゲン性
4つのハイブリッド分子B、C、PおよびQを選択し、これらについてさらなる解析を行った。IgE依存性のエフェクター細胞活性化に関するハイブリッドB、C、PおよびQのIgE反応性を判定するために、花粉症患者より単離したヒト好塩基球表面のCD203cの発現を調べた。CD203cは、ヒト好塩基球の活性化マーカーとして報告されており、受容体に結合したIgE同士がアレルゲンにより架橋を形成するとアップレギュレートされる(20)。図5に示すように、等モル量の野生型アレルゲンと比較して少なくとも10倍高い濃度のハイブリッド分子に対して、好塩基球は耐容性を示した(患者1〜12)。このデータは、4つのハイブリッド分子B、C、PおよびQのアレルゲン性が大幅に減弱していることを示唆するものである。
T細胞の増殖
ハイブリッド分子のT細胞反応性を評価するために、4名の花粉症患者より単離したPBMCを用いて、(16)の記載に準じてin vitro増殖実験を行った。ハイブリッド分子のアレルゲン性は減弱しているものの、野生型アレルゲンPhl p1、Phl p2、Phl p5およびPhl p6のほとんどのT細胞エピトープは保存されていた(表2)。
ハイブリッド分子B、C、PおよびQによる免疫化は、野生型アレルゲンに対するIgG応答を誘導した
B、C、PまたはQによる免疫化で誘導されたIgG抗体が野生型アレルゲンrPhl p1、rPhl p2、rPhl p5およびrPhl p6を認識可能か否か判定するために、2つの異なる動物モデル(BALB/cマウスおよびウサギ)を使用した。Phl p1とPhl p5との混合物、Phl p2とPhl p6との混合物、BとCとの混合物、PまたはQでBALB/cマウスを免疫し、Phl p1、Phl p2、Phl p5、Phl p6のそれぞれに対する特異的IgG1抗体の量の推移をELISA法により比較した(図6)。ハイブリッドB+C、PおよびQは、Phl p1、Phl p2、Phl p5およびPhl p6に対して特異的なIgG1抗体応答を誘導することが可能であり、その応答は、野生型アレルゲン自体による抗体応答よりも強力であった。
ハイブリッドアレルゲンB、C、PおよびQによる免疫化は、アレルギー患者由来IgEの野生型アレルゲンおよび花粉抽出物への結合を阻害する防御性IgG応答を誘導した
ハイブリッド分子B、C、PおよびQにより誘導されたIgG抗体が、花粉症患者由来IgEのrPhl p1、Phl p2、Phl p5、rPhl p6または天然由来の花粉抽出物への結合を阻害する能力を有するか否かを検討した。ELISAプレートに固定した天然由来の花粉抽出物と、抗Pおよび抗Qのウサギ抗血清混合物、抗B、抗Cおよび抗Qのウサギ抗血清混合物、Phl p1、Phl p2、Phl p5およびPhl p6からなる花粉ハイブリッド(GPH)(参考文献11に記載)で免疫したウサギの抗血清、またはそれぞれの免疫前血清とをあらかじめインキュベーションして、ELISA阻害実験を行った。これらのウサギIgG抗体は、14名の花粉症患者由来IgEの花粉抽出物への結合を次の通り阻害した:P+Q:73%;B+C+Q:78%;GPH:75%(表3)。同様の実験を、ELISAプレートに固定したrPhl p1、rPhl p2、rPhl p5またはPhl p6を用いて行ったところ、平均阻害率は、Phl p1に対しては81〜94%(表4)、Phl p5に対しては86〜90%(表5)、Phl p2に対しては45%(表6)、およびPhl p6に対しては34%(表7)であった。
ハイブリッド分子B、CおよびPによる免疫化は、野生型アレルゲンPhl p1に対するIgG応答を誘導した
ウサギ抗血清を段階希釈し、各希釈液中のPhl p1特異的IgG抗体の有無をELISAにより調べた。構築物B、CおよびPは、野生型アレルゲンPhl p1に対するIgG抗体応答を誘導することができた。このIgG応答を、高い免疫原性を有する分子として報告されている、野生型アレルゲンPhl p1、Phl p2、Phl p5およびPhl p6からなるハイブリッド分子(花粉ハイブリッド、GPH)(11)による免疫化で誘導されたIgG抗体量と比較した。驚くべきことに、CおよびPで免疫したウサギにおいて誘導されたPhl p1特異的IgG抗体の量は、GPHの場合の抗体量をさらに上回った。これらの結果を図8に示す。
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Claims (15)
- a)少なくとも2つの異なるアレルゲンに由来するN個のフラグメントを含むポリペプチドであって、隣接する任意の2フラグメントの連続したアミノ酸配列が前記アレルゲンのいずれにおいても連続するアミノ酸配列として存在せず、かつNが3より大きい整数であるポリペプチドで構成されるポリペプチド群を準備する工程;
b)前記ポリペプチドのIgE反応性を判定する工程;
c)前記ポリペプチドのT細胞反応性を判定する工程;
d)前記ポリペプチドが前記アレルゲンに対するIgG応答を誘導することが可能か否かを判定する工程;
e)前記ポリペプチドが、アレルギー患者由来IgEの前記アレルゲンへの結合を阻害する防御性IgG応答を誘導することが可能か否かを判定する工程;および
f)前記ポリペプチドの中から、(i)前記アレルゲンのいずれか1つよりもIgE反応性が低く、(ii)T細胞反応性を示し、(iii)1以上の前記アレルゲンに対するIgG応答を誘導することが可能であり、かつ(iv)アレルギー患者由来IgEの前記アレルゲンへの結合を阻害する防御性IgG応答を誘導することが可能であるポリペプチドを選択する工程
を含む、低アレルゲン性ポリペプチドの同定方法。 - 前記ポリペプチド群内の少なくとも2つのポリペプチドが、それぞれ同一のフラグメントを含むもののその結合順序が異なることを特徴とする請求項1に記載の方法。
- 前記ポリペプチド内のすべてのフラグメントが、それぞれ20〜100個のアミノ酸で構成されていることを特徴とする請求項1または2に記載の方法。
- 前記ポリペプチドが、それぞれ独立して、2つの異なるアレルゲンに由来する4〜12個のフラグメントからなることを特徴とする先行する請求項のいずれか1項に記載の方法。
- 工程(a)で準備したポリペプチドの二次構造を決定して、ランダムコイル構造を示すポリペプチドを選択する工程をさらに含む先行する請求項のいずれか1項に記載の方法。
- 前記アレルゲンが、花粉アレルゲンPhl p1、Phl p2、Phl p3、Phl p4、Phl p5、Phl p6、Phl p7、Phl p11、Phl p12およびPhl p13からなる群より選択されることを特徴とする先行する請求項のいずれか1項に記載の方法。
- 各フラグメントが、配列番号55〜76からなる群より選択されるアミノ酸配列からなることを特徴とする請求項6に記載の方法。
- 前記ポリペプチド群内の少なくとも1つのポリペプチドが、配列番号21〜37からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むことを特徴とする先行する請求項のいずれか1項に記載の方法。
- 少なくとも2つの異なるアレルゲンに由来する少なくとも4個のフラグメントを含む低アレルゲン性ポリペプチドであって、隣接する任意の2フラグメントの連続したアミノ酸配列が前記アレルゲンのいずれにおいても連続するアミノ酸配列として存在せず、かつ少なくとも1つのフラグメントがPhl p1またはPhl p5に由来する低アレルゲン性ポリペプチド。
- 少なくとも2つの異なるアレルゲンに由来する少なくとも4個のフラグメントを含む低アレルゲン性ポリペプチドであって、隣接する任意の2フラグメントの連続したアミノ酸配列が前記アレルゲンのいずれにおいても連続するアミノ酸配列として存在せず、かつ各フラグメントが配列番号55〜76からなる群より選択されるアミノ酸配列からなる低アレルゲン性ポリペプチド。
- 配列番号22、23、24、25、36および37からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む請求項10に記載の低アレルゲン性ポリペプチド。
- 配列番号39、40、41、42、53および54からなる群より選択されるアミノ酸配列からなる請求項11に記載の低アレルゲン性ポリペプチド。
- 請求項9〜12のいずれか1項に記載のポリペプチドおよび薬学的に許容される希釈剤または賦形剤を含む医薬組成物。
- アレルギー、好ましくは花粉症を予防および/または治療する医薬を製造するための請求項9〜12のいずれか1項に記載のポリペプチドの使用。
- 請求項9〜12のいずれか1項に記載のポリペプチドをコードする核酸。
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