JPS6128503A - ヒアルロン酸薬理活性画分、その製造方法および医薬組成物 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 発明の背景と分野 本発明は、治療的効用を有し、しかも使用時になんら炎
症性を示さないヒアルロン酸（以下ＨＡと略称する）の
特定分子量の画分に関する。本発明に示すＨＡ画分の一
つは創傷治癒を促進するのに有用であり、また他方、第
２のＨＡ画分は眼球内液の代用液として眼内使用に有用
であり、また骨関節の損傷の治療適用のため関節内注入
に有用である。さらにそれらのＨＡ画分は、眼科用薬の
賦形薬として角膜上皮とよく適合し得る製剤を調製し、
眼科用薬の活性を高めるのに有用であることが明らかに
された。

従来の技術 Ｄ−グルクロン酸残基とＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミ
ン残基から構成されている異種多糖類である。ＨＡは、
一般に約８００万〜１３００万の高。

い分子量を有する線状のポリマーで、細胞外被、を推動
物の結合組織の細胞外間質物質、関節の滑液、眼の眼球
内液、ヒトの謄帯組織、および雄鶏のとさかに存在して
いる。

ＨＡの利用に関する従来の研究の一つに、眼球内液に代
用され、その他の治療にも適用し得る有用なＨＡの１画
分を示したバラズスの研究がある（米国特許第４，１４
１，９７３号）。然しなから１、この特許は平均分子量
が約７５０，０００より大きく、好ましくは約１，２０
０，０００　　より大きいＨＡ画分を特に指定している
。バラズスは、平均分子量が７５０，０００より小さい
ＨＡ画分は炎症活性があるので治療用に使用できないこ
とを特に指摘している。これらの低級分子量のＨＡ画分
は・（ラズスによると破棄されている。然しこのために
、原料組織から入手される利用可能なＨＡの総量の約９
０％は破棄され、利用可能なＨＡの僅かな量（約１０％
）だけが使用される結果となっている。

バラズスの指摘した結果と逆に、本発明者はＨＡの低級
分子量の画分が、実際に有用な薬学的活性を有すること
を発見した。したがって、本発明によると種々の材料か
ら入手し得るＨＡの約８０％までが利用される。特に本
発明者は、創傷治癒の促進に有用なＨＡの１画分、およ
び眼の眼球内液の代用液として眼内に注射し、損傷され
た関節の治療用として関節内注射に使用し得るＨＡの第
２の画分を発見した。

発明の詳細な記載 前述のように、従来のＨＡの研究では、バラズスの特許
に代表される如く、平均分子量が７５０，０００以上の
高分子量の画分を使用するように指摘している。本発明
者は、低分子量を有する画分と、中間に位置する平均分
子量を有するもう一つの画分との２個の新規なＨＡ画分
を単離し、確認した。

それらの画分は高度の純度を示すので実質的に純粋であ
ると考えられ、しかも炎症活性を有しない。

これらの新規ＨＡ画分は、ヒアルロン酸の抽出し得る量
を含有する種々の結合組織から入手することができる。

本発明に示した特殊画分は、分子沖過の技術に従って逐
次的に分別され、分離される。

本出願方法によって分離される最初の画分はヒアラスチ
ン（ＨＹＡＬＡＳＴＩＮ　）と命名され、約５０．００
０〜約１００，０００　の平均分子量を有する。このヒ
アラスチン画分は、その創傷治癒活性から獣医用および
ヒト用の治療的応用に好適であることが確認された。本
出願方法によって単離された第２の画分はヒアレクチン
（ＨＹＡＬＥＣＴＩＮ）と命名され、約５００．０００
〜約７３０，０００の平均分子量を有する。このヒアレ
クチンは眼球内液の代用液として眼科手術の際に使用さ
れ、また獣医学領域およびヒトにおける関節の外傷性お
よび退行性疾患の治療に好適である。

ヒアラスチンは皮肉注射、または創傷治癒用の局所剤の
いずれでも投与できる。一方、ヒアレクチンは眼内注射
および関節内注射が好適である。

本出願方法においてはＨＡの各種画分について入念な検
討を行ない、従来の方法と比べて明らかにより正確な方
法を以て、ＨＡの治療上有用な画分と、炎症性で利用で
きないＨＡ画分とを明瞭に決定づけた。これらの研究の
結果から、本発明者はＨＡ画分に特有な二つの性質、即
ち細胞可動化（ｃｅｌｌ　　ｍｏｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ
　）活性と固有粘度（ｉｎｔｒｉｎｓｉｃ　　ｖｉｓｃ
ｏｓｉｔ’ｙ　）　　を確認し、検討した。

動物における創傷治癒の過程は細胞運動性、特に繊維芽
細胞の細胞運動性によって促進される。一方、細胞運動
性または増殖能（即ち、有糸分裂）は、眼球内側の手術
の場合はできるだけ回避されるべきである。癒合速度の
増大が却って有害な影響をもたらす可能性がある網膜剥
離の矯正手術において、このことは特に事実である。

固有粘度もまた、口Ａ画分の有用性の判定に際して考慮
すべき重要な指標である。固有粘度が高い画分は、外傷
性および退行性の関節疾患の治療における手術適用に有
用であり、また眼球外液の代用液としても有用である。

一方、高い粘度は、創傷治癒を促進する薬物として使用
される画分にとって好ましからぬ特性である。事実、創
傷治癒に利用される画分は、実際の適用に当たって使用
し易いように低い粘度であるべきである。

本発明においてヒアラスチンと呼ばれる画分は、良好な
運動性、即ち細胞増殖能を有し、且つ低粘度を有するこ
とが確認された。従って、ヒアラスチンは、創傷治癒の
促進に有用な物質として望ましい特性を有する。

同時に一方では、この特性がヒアラスチン画分の眼内注
射療法、または関節内注射療法への適用を好ましくない
ものにしている。

本発明において、ヒアレクチンと呼ばれる画分は、細胞
運動性、即ち増殖能がごく僅かである一方、同時に高い
粘度を有することが確認された。

従ってこれらの特性から、ヒアレクチン画分は眼内注射
療法および関節内注射療法に有用である。

然し他方、ヒアレクチンは細胞運動活性を示さないので
、この画分は創傷治癒療法には有用ではない。

ヒアルロン酸の有用な画分を分離する場合、炎症活性を
、示基ない画分を得ることが重要である。

前述のバラズスの特許は、炎症活゛性がないヒアルロン
酸画分を得るためには、平均分子量がもっばら７５０，
０００以上の画分だけを使用しなければならないことを
教示している。このように、バラズスは炎症活性の理由
から有用でないとして、平均分子量７５０　、０００以
下の画分を破棄している。

バラズスの教示に反して、本出願方法はバラズスにより
平均分子量７５０，０００以下の画分に帰せられた炎症
活性が、実は平均分子量３０，０００以下の不純物に由
来していることを発見した。従って本発明は、化学的方
法に引続き、分子量３０，０００以下の炎症性画分を除
去し得る一連の分子沖過技術からなる方法を提供する。

本発明方法によって、特殊な出発材料から入手し得る総
ヒアルロン酸に対し、両者を併わせ約８０％の総状率に
達する炎症活性のない有用なヒアルロン酸画分を得るこ
とが可能である。この８０％の収率で入手し得るヒアル
ロン酸画分は、ヒアレクチン画分とヒアラスチン画分の
双方を含んでいる平均分子量約２５０，０００〜約３５
０，０００の混合画分からなる。更に限定すれば、ヒア
レクチン画分は原料組織から入手し得るＨＡの約３０％
の収率で得られ、またヒアラクチン画分は入手し得るＨ
Ａの約５０％の収率で得られる。この要素は、前述のバ
ラズスの特許方法に対し、利用し得るヒアルロン酸の薬
学的に有用な量を有意に増大させることを発見した本発
明の重要な改良点である。

平均分子量７５０．０００以上の画分だけを利用するバ
ラズスの特許方法では、動物臓器から利用し得るもとの
ヒアルロン酸の僅かに約１０％だけの収率しか得られず
、利用し得るヒアルロン酸の約９０％は破棄される。こ
のように本発明によって、総ヒアルロン酸抽出物の利用
度は著しく高められた。

ヒアルロン酸の各種画分の抽出の相対的収率の比較を第
１表に示す。

第　　　１　　　表 （バラズスの方法）　　　　　　　　　　　　第４，１
４１，９７３号ヒアレクチン＋ヒアラスチン　０．６　
　　　　８０　　本発明方法ヒアレクチン　　　　　　
　０．２　　　　３０　　本発明方法ヒアラスｆン　　
　　　　　０；４　　　　５０　　本発明方法炎症性画
分　　　　　　　０．１６　　　　２０　　本発明方法
添付した第１図は、本出願方法で確認された各種のＨＡ
画分を図式的に示したものである。第１図の釣鐘型の曲
線は、原料組織から入手し得るＨＡ画分の分布の概略を
表わしている。第１図の１Ｂ″　領域は、バラズス（米
国特許第４，１４１　、９７３号）によって確認された
薬学的に有用なＨＡ画分を表わす。′Ａ”、工および■
領域は本発明により確認されたＨＡ画分を表わす。Ａ区
分は平均分子量３０．０００以下の炎症性画分であり、
工領域はヒアラスチン画分であり、■領域はヒアレクチ
ン画分である。このグラフから、バラズスの方法は平均
分子量７５０，０００　以下のＨＡ画分を除去すること
によって利用し得るＨＡ抽出画分の大部分を破棄してい
ることが判る。これに対し、発明では平均分子量が３０
，０００以下の低分子量のヒアルロン酸が炎症活性を生
じることを、予かじめ研究者らがＨＡｏ）種々の抽出物
について着目していたので、入手し得るＨＡの大部分が
薬学的に利用できた。

本発明者は、特別な治療適応により開示した発明技術に
従って分離すれば、入手し得る大部分のＨＡが、実際治
療目的に利用できることを発見した。バラズスの特許は
入手し得るＨＡの約１０％だけの応用を特定して、開示
しているが、本発明では創傷治癒の適用に対しヒアラス
チン画分の形で、または眼内適用または関節内適用に対
しヒアレクチン画分９形で、或いは、創傷治癒の適用に
使用できるヒアラスチン画分とヒアレクチン画分を合わ
せた形で、入手し得るＨＡの約８０％を利用できる。

確認された画分の化学的および物理的性質を、本書諦発
明で調査し、これらの諸性質を第２表にまとめた。

製造方法 新しい、または冷凍した雌鶏のとさか（３０００Ｆ）を
ひき内器にかけてミンチにひき、次に機械的ホモジナイ
ザーで注意深くホモジネートとする。得られたペースト
を１０容量の無“水アセトンと共に、ステンレススチー
ル製容器Ａｌ５Ｉ３１６　　またはガラス製容器に入れ
る。次いで全内容物を、５０９／分の速度で６時間攪拌
した後、１２時間静置して分離し、アセトンをサイフオ
ンで除いて棄てる。

この抽出操作を、破棄する。アセトンが正しい湿度水準
に達するまで（カール・フィッシャー法）反復する。

得られた物質を次に遠心し、好適な温度で５〜８時間真
空乾燥する。この操作により、雌鶏のとさかから約５０
０〜６００ｇの乾燥粉末が得られる。

次に、この乾燥粉末３００ｆＩを、適量の塩酸システィ
ンの存在下にリン酸バッファー緩衝水性媒質中で、パパ
イン（０，２ｇ）により酵素的に消化させる。次いで、
この混合液を６０〜６５℃の一定温度で２４時間、６０
ｆ／分の速さで攪拌する。

この全量にセライト６０ｆを加えて冷却し、なお１時間
攪拌を持続する。

得られた混合物は、透明な沖波が得られるまで濾過する
。次にこの透明な沖液を、分子量の最大端（排出限界）
が３０，０００であるメンブランを用いて限外濾過し、
分子量３０，０００以上の分子をメンブラン上に捕捉す
る。原液の５〜６倍量を限外濾過し、同時に絶えず生成
物に蒸留水を加える。蒸留水を加えて懸濁させ、原容量
の１／３となるまで生成物を限外濾過する。

残った液体に、０．１モルになるよう塩化ナトリウムを
加え、温度を５０℃に上昇させる。生成物を６０ｆ／分
で攪拌しつつ、セチルピリジニウムクロリド４５ｙを加
える。この混合液を６０分間攪拌した後、セライｌ−５
（ｌを加える。攪拌しつつ生成物の温度を２５℃まで下
げ、生成する沈澱を遠心して採取する。このようにして
得られた沈澱を、セチルピリジニウムクロリド０．０５
％を含有する塩化ナトリウムの０．０１モル溶液（５Ｉ
りに懸濁させる。この懸濁液をさらに５０℃で６０分間
攪拌する。温度を２５℃に下げ、沈澱を遠心して採取す
る。

次に、洗浄操作を３回反復し、最後に沈澱物を集めて、
セチルピリジニウムクロリド０．０５％を含有する塩化
ナトリウムの０．０５モル溶液を加えた容器に入れる。

これを６０ダ／分で６０分間攪拌し、内容物を２５℃の
一定温度で２時間放置する。上清を遠沈によって除去す
る。

この操作を、０．０５％のセチルピリジニウムクロリド
を含有する塩化ナトリウムの０．１モル溶液を用いて、
数回反復する。混合物を遠心し、上清を棄てる。沈澱を
０．０５％のセチルピリジニウムクロリドを含有する塩
化ナトリウムの０．３０モル溶液（３リツトル）に分散
させる。混合物を攪拌し、沈澱と透明な液の双方を採取
する。沈澱はさらに３回、それぞれ前述の溶液０．５１
Ｊツトルを用いて抽出を繰り返す。

゛最後に残った沈澱を除去し、透明な抽出液を１個の容
器にまとめる。攪拌しつつ溶液の温度を５０℃に上昇さ
せる。次に溶液に塩化ナトリウムを０゜２３モルとなる
よう添加する。さらにセチルピリジニウムクロリド１ダ
を加え、１２時間攪拌を続ける。混合液を２５℃に冷却
し、最初はセライト充填物、次いでフィルター（１μ）
を通して濾過する。

得られた混合液を、次に分子量の最大端（排出限界）３
０．０００　　のメンブランを用い、塩化ナトリウムの
０．３３モル溶液を加えて原容量の、３倍とし、分子限
外濾過を行なう。塩化ナトリウム溶液の添加を中止し、
液量はもとの容量の１／４　　まで減少する。

このようにして濃縮した溶液は、２５℃で攪拌（６（１
Ｉ分）しつつ、エタノール（９５％）の３倍量を加えて
沈澱させる。沈澱を遠心により採取し、上清は棄てる。

沈澱は０．１モルの塩化ナトリウム溶液１リツトルに溶
解し、９５％エタノールの３倍量を用いて沈澱操作を反
復する。

沈澱を集めて、最初は７５％エタノール（３回）、次に
無水エタノール（３回）、最後に無水アセトン（３回）
で洗浄する。

′このようにして得られた生成物（ヒアラスチン＋ヒア
レクチン画分）は、２５０，０００〜３５０　、０００
の平均分子量を有する。

ヒアルロン酸の収率は、もとの新しい組織の０．６％に
相当する。

実施例１に記載した方法により得られた混合物を、発熱
物質を含有しない蒸留水に、生成物ｌＯキに対し水１ｄ
の割合いで溶解する。このようにし−て得られた溶液を
、分子量の最大端（排出限界）が２００，０００　のメ
ンブランを用い、メンブラン上に水を加えることなく濃
縮手技を用いて、分子限外濾過に掛ける。分子量の最大
端が２００，０００のメンブランを通して限外濾過の操
作を行なうことにより、分子量が２００．０００　以上
の分子は通過しないが、一方、それより小さい分子は水
と共に膜を通過する。濾過操作中は膜の上方部分に水を
加えないので、この部分の容量は減少すると共に、分子
量が２００，０００　以上の分子の濃度は高まる。２回
蒸留した発熱物質を含有しない蒸留水の２倍量を加え、
容量が１７３となるまで溶液を再度限外濾過に掛ける。

この操作をさらに２回反復する。

膜を通過した溶液に塩化ナトリウムを加えて１．０モル
とし、次に９５″％エタノールの４倍量を加えて沈澱さ
せる。沈澱は７５％エタノールで３回洗浄し、真空乾燥
する。

このようにして得られた生成物（ヒアラスチン画分）は
５０．０００〜１００，０００の平均分子量を有する。

ヒアルロン酸収率は、もとの新しい組織の０．４％に相
当する。

実施例３：ヒアレクチン画分の製造方法。

実施例２に記載した分子量の最大端が２００，０００の
限外濾過メンブランから容器中に集めあれだ濃縮物を１
、グルクロン酸を測定する容量分析で、ヒアルロン酸濃
度が５η／ｍｔの溶液となるまで水で希釈する。

溶液に塩化ナトリウムを加えて０．１モルに調製し、９
５％エタノールの４倍量を加えて沈澱させる。沈澱を７
５％エタノールで３回洗浄し、真空乾燥する。

このようにして得られた生成物（ヒアレクチン画分）は
５００，０００〜７３０　、０００の平均分子量を有す
る。これは、高純度の約２　、５００〜３，５００サツ
力ライド単位の分子鎖長と規定される特定のヒアルロン
酸画分に相当する。

ヒアルロン酸収率は、もとの新しい組織の０．２％に相
当する。

〔効果〕

１、　ヒアルロン酸の各画分の生物学的細胞可動化活性 ＨＡ画分の細胞可動化活性を評価する方法として、培養
における線維芽細胞の解離能を測定することからなる方
法を使用した。

マウスＢＡＬＢ　３Ｔ３細胞を、１０％ウシ血清、ペニ
シリン（２５０単位／讐）およびストレプトマイシン（
０，２５■／−）を添加したダルベツコ修飾のイーグル
培地に発育させ、５％Ｃ０２，９５％空気中で加湿しな
がら３７℃でインキュベートした。実験のために、細胞
は常に６０ｍ直径のプラスチック製組織培養皿に接種（
６Ｘ１０５細胞／皿）された。

３Ｔ３細胞の全呵集密的細胞）単層を傾瀉し、新たにＨ
Ａの各種画分のそれぞれ２．ＯＷ１ｇ／ｉを含有する媒
質を加えた。一定時間後に、細胞解離の状態を顕微鏡的
、並びにコールタ−カウンターで運動している細胞数を
数えることの両者により観察した。

解離測定：解離速度を測定するため、細胞をプラスチッ
ク皿に接台し、２４時間発育させた。この時点で培地を
傾瀉して除き、新たに２．ｏｍｙ／ｍｌのＨＡを含有す
る媒質を加えた。それぞれ１枚づ４つの試験培養と対照
培養からなる２枚の皿を、２４時間毎に傾瀉し、上溝中
にある細胞と付着している細胞とをコールタ−カウンタ
ーでカウントした。

第３表に、先の実施例１〜３で得られた各画分を用いて
試験した成績を示した。

対照　　　　　　　　　　　２Ｘ１０６ヒアレクチン　
　　　２　　　　２．ｌＸ１０６　　　　　　　５ヒア
ラスチン　　　　２　　　　　５ｘ１０６　　　　　１
５０第３表に報告した成績から、ヒアラスチン画分は高
い細胞可動化活性を有し、この画分が創傷治癒適用に有
用であることが判る。このヒアラスチンの細胞可動化活
性から、この画分の薬学的製剤を障害された組織部位に
適用すれば、新生細胞の移動と増殖を盛んにすることに
なると考えられる。

これに対して、ヒアレクチン画分は細胞可動化活性が非
常に小さく、従って創傷には有用でないと推定される。

然し、ヒアレクチンは平均分子量が高く、内部粘度（１
ｎｈｅｒｅｎｔ　　ｖｉｓｃｏｓｉｔｙ　）も高いので
、眼内注射および関節的注射用として有用であり、細胞
可動化活性が欠除していることは、特に眼内注射および
関節内注射にヒアレクチン画分を有用にする、却って重
要な特性となっている。

２、　ヒアルロン酸の各画分の炎症活性この評価には、
家兎における眼内投与後の侵襲細胞をカウントする方法
を使用する。

方法 体重約２に９の、視覚に異常のないことを確かめたニュ
ージランド系またはカリホルアア系家兎５羽を、この試
験に使用する。家兎の眼の外側の炎症性の経過は肉眼的
に、また内側は検眼鏡を用いて検査する。眼底が明瞭に
見え、正常であれば、試験を実施する。

選ばれた動物は、適宜滅菌した眼科用局所麻酔薬を数滴
下して局所麻酔を施す。眼科用アトロピン溶液の数滴を
同時に滴下する。

試験は無菌条件下に実施する。眼球を圧迫して突出させ
、２６ゲージ針を用い縁から約５〜６ＩＩ＋＋＋＋の掌
膜を通してガラス体腔の中心に１００μｊの溶液を注射
する。もう一つの眼を対照とする。処置後、抗生物質溶
液を２滴滴下した後、動物をそれぞれ単独ケージに収容
する。

５０〜６０時間後、さらに試験を続行する。両眼を、前
述の動物を選出した方法と同様にして検査する。ベンド
パルビタールを静注して、動物を屠殺する。まず最初に
、２６ゲージ針のインスリンシリンジを用いて、眼房水
（約０．２　ｒｎｌ’）を採取する。次に、眼球を摘出
し、すべての異物を除去し、生理食塩液で洗浄し、ビル
バララス紙（ｂｉｌｂｕｌｏｕｓ　ｐａｐｅｒ　）で乾
かし、切開して内容物をペトリ皿にあけ、ガラス体の主
要部分を分離し、それを滅菌シリンジで採取する（約０
．７　ｍ／　）。ガラス体はポリエチレン製の小試験管
に採り、５０μｌのヒアルロニダーゼ（１００ＯＮＦ／
ｄ）を添加する。混合液の粘度を低下させるため、約３
時間、３７℃の温度に保つ。

顕微鏡下に位相差法（１２０Ｘ）により、白血球数をビ
ュルケル計算板でカウントする。各検体毎に一連の計算
値を記録し、平均値を算出し、結果を白血球数／ｒｒＩ
ｍ３として表わす。

その結果、 １）眼になんらの障害の徴候が認められず、２）処置し
た５眼のうち、少なくとも４眼で平均白血球数が２００
　Ａｒｒｒｅ　）を超えず、各対照眼において平均白血
球数が５０２４ｄを超えない時、試験は陽性と判断する
。

第４表に、前述の実施例１〜３で得られたＨＡの各画分
をこの評価に用いて、得られた結果を示す。

第４表：炎症活性試験の成績 画　　分　　　　　　　　　　　　侵襲細胞数対照　　
　　　　　　　　　　　　　　　　２５ヒアラスチン＋
ヒアレクチン　　　　　　　３２ヒアラスチン　　　　
　　　　　　　　　　２０ヒアレクチン　　　　　　　
　　　　　　　２２炎症性画分（平均分子量３０，００
０）　　　　　　１５０雄鶏とさかから得られた総ヒア
ルロン酸＊　　　　１２０＊Ｓｗａｎｎ　Ｄ、　Ａ、　
１９６８　、　Ｂ、Ｂ、Ａ、　１５６　、１７〜２９参
照第４表に示した成績から、ヒアラスチンおよびヒアレ
クチンの各画分の炎症活性は対照より低く、またヒアラ
スチンとヒアラクチンの両者を含有する画分が示した炎
症活性の増加は対照に比べて無視し得る程度に過ぎない
ことが明らかにされた。

従って、ヒアラスチン画分およびヒアレクチン画分は、
好ましからぬ副作用がなく薬学的に有用である。さらに
これらの結果は、ＨＡ製剤の炎症活性の原因が、約３０
，０００以下の平均分子量を有するＨＡ画分にある々す
る本壁緋特寺尋溌明を裏付けるものである。スワンの文
献（Ｓｗａｎｎ　Ｄ、Ａ、　。

１９６８　、　Ｂ、Ｂ、Ａ、　１５６　、１７〜２９）
に記載された方法に従い、雄鶏のとさかから調製したヒ
アルロン酸は著しい炎症活性を示す。

このようにして、平均分子量が約５０．０００〜１００
．０００　　のヒアラスチン画分は高い細胞可動化活性
を有し、従って、不快な炎症反応を示すことなく創傷治
癒適応に有用であることが明らかになった。平均分子量
が約５００，０００〜７３０　、０００であるヒアレク
チンは、その高い分子量と内部粘度の故に、眼内注射お
よび関節内注射に有用であることが示され、同時にこれ
らの薬学的適用では回避すべき不快な副作用である細胞
可動化活性または炎症反応を元進しなかった。

より明確に述べれば、ヒアラスチン画分は次の特性によ
り、創傷治癒剤として有用であることが見出された。

１、その製剤によって、通常の治療と比べ、障害部位の
急速な清浄化、潰瘍辺縁の正常化、盛んな肉芽組織の形
成、マクロファージおよび線維芽細胞の細胞遊走の活性
化、および急速な上皮形成を伴なう治癒時間の急速な短
縮を促進される。

２、その製剤によって、重症例における再生手術に対す
る順応の増加が促進される。

３、痴痕化組織を最後に仕上げして美容上および機能的
に良好な結果を得ることにより、ケロイドまたは退縮性
の癲痕形成を残さないこと。

ヒアラスチン製剤は、褥癒傷（床ずれ）、栄養性潰瘍、
火傷、無痛性潰瘍、外傷後潰瘍、静脈および静脈炎後の
静脈血腫による潰腫、皮膚病巣、皮膚移植および単純ヘ
ルペスに由来する皮膚病変を含む種々の傷の処置に有用
であることが明らかにされた。これらの創傷治療の処置
に、ヒアラスチン製剤、またはそのナトリウム塩はガー
ゼノぐラド、クリーム、スプレ、イ、または陵内注射用
注射剤のような種々の方法により投与できる。クリーム
やガーゼノ々ツドに用いる局所適用には、ヒアラスチン
は、露出している部分から出る寥出物を吸収し、同時に
ヒアルロン酸を効果的に拡散させる乳化剤、および傷の
包帯の除去を容易にさせるための水に拡散性の賦形薬と
組合わせることが望ましい。

ヒアレクチン画分は馬の治療、特に競争馬の関節障害、
および急性または慢性の外傷、感染または副腎皮質ステ
ロイドの反復した関節内注射に起因する疾患の治療に有
用であることが見出された。

特にヒアレクチンで治療し得る障害を例示すると、炎症
症状を伴なう、または無症状の骨関節症、急性または慢
性の滑膜炎、関節軟骨の変性過程、および乾性の関節疾
患である。これらの疾患に最も良く見受けられる徴候は
一般に、疼痛、関節の機能不全、および関節の屈伸性の
減退である。本発明のヒアレクチン画分は、通常の治療
に比べ、そのような障害馬に対して関節機能の急速で、
しかも持続する改善を早め、また疼痛および殴打を軽減
して治癒期間を著しく短縮するのに効果があることが判
明した。これらの臨床的に好ましい効果は、滑液の粘弾
性を回復し、関節軟骨における組織修復過崩を賦活化す
ることにより促進されるものと考えられる。

その上に、上記の好ましい効果は、すべてヒアレクチン
画分が局所的および／または全身的に毒性作用を伴ない
ことからさらに増強される。ヒアレクチンを反復して投
与しても、アレルギー反応、および何らの有害性または
残存性の影響をも生じない。

薬学的製剤 前記の知見から、ヒアラスチン画分およびヒアレクチン
画分は薬学的適用に良好な活性を有することが明らかに
された。次に示す製剤例は、ＨＡ画分を実際に生体（イ
ンビボ）べ投与する場合に可能な薬学的製剤を、単に例
示的に記載する目的で提供するものである。

Ａ、創傷治癒用製剤 製剤例１：皮内注射用注射剤、１アンプル中：ヒアラス
チンナトリウム塩り１１ｖ 塩化ナトリウム　　　　　　　　１６１Ｆ９注射用精製
水　適量を加えて２−とする。

製剤例２：皮内注射用注射剤。１アンプル中：ヒアラス
チンカリウム塩　　　　５〜 塩化ナトリウム　　　　　　　　　８ｍｇ注射用精製水
　適量を加えて１ｄとする。

製剤例３：局所適用用スプレー。１瓶中：ヒアラスチン
ナトリウム塩　　　　　２０■塩化ナトリウム　　　　
　　　　８０Ｗｑ注射用精製水　適量を加えて１０ｒｎ
ｌとする。

製剤例４：局所適用用スプレー。１瓶中：ヒアラスチン
カリウム塩　　　３０１ｎｇマンニット　　　　　　　
　°　１００〜注射用精製水　適量を加えて１０−とす
る。

製造例５：局所適用用クリーム。１チューブ中：ヒアラ
スチンカリウム塩　　　２５■ ポリエチレングリコール− モノステアレート４００　　　１０００ｍ９セチオール
（オレイン酸 デシルエステル＞　　　　　　　５００”１９ラネツテ
ＳＸ（セチルステア− リルアルコール＋ラウリル硫酸塩９　：　１　）　１５
０ｑグリセリン　　　　　　　　２００　Ｗ９ソルビッ
ト　　　　　　　　　　１５０■デヒドロ酢酸ナトリウ
ム　　　　１０■Ｐ−オキシメチルベンゾエート　　　
７，５〜ｐ　−、ｔ−ｔ−ジプロピルベンゾエート　　
　　　　５■再蒸留水　　　適量を加えて１０ｇとする
。

製剤例６：局所適用用クリーム。１チユーブ中ニヒアラ
スチンナトリウム塩　　　　　　３０■パラフインゼリ
ー　　　　　　　　３〜ポリエチレングリコール− モノステアレート４００　　　１００１００Ｏセチオー
ル（オレイン酸 デシルエステル）　　　　　　　５００■ラネツテＳＸ
（セチルステアリル− アルコール＋ラウリル硫酸塩９：１）１５０〜グリセリ
ン　　　　　　　　２００〜 ソルビツト　　　　　　　　　　１５０■デヒドロ酢酸
ナトリウム　　　　１０〜Ｐ−オキシメチルベンゾエー
ト　　　７．５〜Ｐ−オキシプロピルベンゾエート　　
　５〜再蒸留水　　　適量を加えて１０ダとする。

製剤例７：医薬用ガーゼパッド（局所適用）。１パツド
中（ＩＯＸＩＯＣＩ＋）： ヒアラスチンナトリウム塩　　　３１Ｒｇグリセリン　
　　　　　　　　ｉｐ ポリエチレングリコール　　　　２ｇ 再蒸留水　　　　適量を加えて３ｙとする。

製剤例８：医療用ガーゼバット（局所適用）。ｌ・　パ
ッド中（１５ｘｌ、５ｃｍ）： ヒアラスチンカリウム塩　　　　６キ パラフインゼリー　　　　　　０．５■グリセリン　　
　　　　　　　１ｆＩ ポリエチレングリコール　　　　２ｆ 再蒸留水　゛　　適量を加えて３ｇとする。

製剤例９：創傷治癒用乾燥粉末、乾燥粉末１ｇ中：ヒア
ラスチンナトリウム塩１０１１１１Ｐマンニット　　　
　　　　　　０．７５ｆグリシン　　　　　　　　　　
０．２４ダＢ、眼内適用製剤 製剤例１０：１−バイアル。１バイアル中：ヒアレクチ
ンナトリウム塩　　１０η 塩化ナトリウム　　　　　　　　８ｍ９−塩基リン酸ナ
トリウム・２Ｈ２００，２５′Ｉｖ二塩基リン酸ナトリ
ウム・１１２Ｈ２Ｏ３ＷＩ注射用精製水　適量を加えて
１ｄとする。

製剤例１１：５−バイアル。１バイアル中：ヒアレクチ
ンカリウム塩６０■ マンニット　　　　　　　　　　５０■−塩基リン酸ナ
トリウム・２８２０　　１．２５■二塩基リン酸ナトリ
ウム・１２Ｈ２０工５＃ｖ注射用精製水　適量を加えて
５−とする。

製剤例１２：シリンジ製剤。１シリンジ中：ヒアレクチ
ンナトリウム塩　　　４０■塩化ナトリウム　　　　　
　　　１６■−塩基リン酸ナトリウム・２Ｈ２００，８
■二基基リン酸ナトリウム・１２Ｈ２０８，１６〜注射
用精製水　適量を加えて２−とする。

Ｃ１関節内適用製剤 製剤例１３：２−バイアル。１バイアル中：ヒアレクチ
ンナトリウム　　　　４０ｍ９塩化ナトリウム　　　　
　　　　１６η注射用精製水　適量を加えて２−とする
製剤例１４：４−バイアル。１バイアル中：ヒアレクチ
ンカリウム塩　　　　６０Ｔｎｇマンニット　　　　　
　　　　　３５■グリシン　　　　　　　　　　　１０
Ｉｖ注射用精製水　適量を加えて４−とする製剤例１５
：シリンジ製剤。１シリンジ中−ヒアレクチンナトリウ
ム塩２５〜 塩化ナトリウム　　　　　　　　１２ｒｎ？マンニツト
　　　　　　　　　　１ｏｑ−塩基リン酸ナトリウム・
２Ｈ２００，５ｒＮｉ二塩基リン酸ナト１功ム・１２Ｈ
２０６■注射用精製水　適量を加えて２−とする上記の
製剤は例示的目的を以て記載されたものであり、本発明
者によって発見されたヒアラスチン画分およびヒアレク
チン画分、またはそのカリウム塩またはナトリウム塩を
、薬学的に許容し得るその他の基剤、希釈剤、または賦
形薬と組合わせることにより、また特定の使用に応じて
種々の投与量製」Ｉとして、その他の薬学的製剤を調製
できることも、当然類推できる。

創傷治癒に適用するために、ヒアラスチン画分の製剤は
、前述したクリーム、スプレー、ガーゼパッド、乾燥粉
末、または陵内注射のような投与０　　　用される。

関節内に適用するためには、ヒアレクチン製剤は、前述
したバイアル製剤またはシリンジに予製した製剤のいず
れかから、一般に関節に対し１投与量２−の割合で投与
される。

ざらにヒアルロン酸は、種々の分子の担体として使用で
き、効果的であることが研究され、特に象を起こさない
）が完全に保証され、眼科用薬基〜剤として使用される
。ヒアルロン酸は眼科用基剤として特に興味深いものと
考えられる。前述のように、°ＨＡは種々の結合組織お
よび生物学的液体（例えば滑液、および特にガラス体）
に存在するグリコサミノグリカンであって、その化学的
および物理学的性質、特にその著しい弾粘性により、組
織における基本的に重要な構造上および生物学的な役割
りを果している。

このような理由から、種々の分子量のＨＡ画分、特にヒ
アラスチン画分とヒアレクチン画分−およびそれらの混
合画分を、点眼剤−ゲル−クリーム、挿入剤、または乾
燥粉末のような種々の製剤剤型に調製する応用について
研究を行なった。特に−各種の眼科用薬の基剤として、
この生物学的ポリマーの種々の画分を積極的に利用すべ
く広汎な知識を得るため検討した。

以下に報告する実験は−ヒアルロン酸を賦形薬として含
有する製剤が、それらに調合されている生薬の生物学的
利用能（バイオアベイラビリティ−）を高めるかどうか
、また生薬と組合わせることによって相乗効果を生じる
かどうかを、特に眼科領域における活性、若しくは有用
性を有する薬物について検討することを目的としそいる
。

ＨＡの基剤として重用なこれらの活性は、家兎の眼を用
い一種類と薬効の異なる４種の眼科用薬、特にピロカル
ピン、トリアムシノロンー表皮生長促進因子（ＥＧ”Ｆ
）およびストレプトマイシンおよびゲンタマイシンのよ
うな抗＃ｌｈ’ｉｔを用いて給討した。これらの薬物は
すべて縮瞳作用、抗炎症作用、治癒作用および抗微生物
作用を有することが知られている。なかでも、ヒアルロ
ン酸を基剤とする゛抗生物質ストレプトマイシンの活性
評価は、この薬剤が眼科領域の感染症に最も広範囲に使
用されている抗生物質の一つである理由から非常に重要
である。

研究した実験モデルおよび行なった実験を示す。

１）ヒアルロン酸を基剤とした硝酸ピロカルピンの家兎
の眼における縮瞳活性。

２）デキストランにより起こした家兎の眼の実験的炎症
に対するーヒアルロン酸を基剤としたトリアムシメロン
の抗炎症活性。

３）家兎の角膜表皮の実験的損傷に対するヒアルロン酸
を基剤とした表皮成長促進因子（ＥＧＦ）の治癒活性。

４）ヒアルロン酸を基剤としたストレプトマイシンの、
寒天培地中におけるバチルス・ズブチリス（Ｂａｃｉｌ
ｌｕｓ　５ｕｂｔｉｌｉｓ　）　６６３３　に対する抗
菌譚性。

■、ヒアルロン酸を基剤とした硝酸ピロカルピンの縮瞳
活性 材料 種々の硝酸ピロカルピン製剤の賦形薬として一次の材料
を使用した。

ヒアルロン酸ナトリウム塩、ヒアラスチン画分（分子量
約１００，０００）、濃度１０■／ｄおよび２０＊／Ｗ
ｌ： ヒアルロン酸ナトリウム塩−ヒアレクチン画分（分子量
ｓｏｏ、ｏｏｏ〜７３０，０００）、濃度１０岬／＋ｄ
および２０■／ｄ； 眼科用賦形薬の対照として、５％ポリビニルアルコール
。

種々の、硝酸ピロカルピンの２％製剤（点眼薬またはゲ
ル）を、２種類の異なるＨＡナトリウム塩の１０岬／−
および２０■／ｄ濃度を基剤として調製した。次の溶液
を調製した。

製剤１−硝酸ピロカルピン（Ｐ　１ＮＯ３）（２％）の
生理食塩液溶液（対照）。

Ｕ剤２　　Ｐ　ｔ　ＮＯａ　（２％）の５％ポリビニル
アルコール溶液（対照）。

製剤３−　Ｐ　Ｉ　Ｎ０３（２％）のヒアラスチン画分
ナトリウム塩（１０■／ｄ　）溶液。

製剤４−ＰｉＮ０３（２％）のヒアラスチン画分ナトリ
ウム塩（２０−ｙ／ｄ）溶液。

製剤５　　Ｐ　１ＮＯａ　（２％）のヒアレクチン画分
ナトリウム塩（１０−ｙ／、ｄ）溶液。

製剤６−Ｐ　１ＮＯ３（２％）のヒアレクチン画分ナト
リウム塩（２０＃／　ｄ　）溶液。

方法 白色ニューシーラント系家兎（２〜２．５Ｑ）５−使用
した。試験する製剤をマイクロシリンジ（１゛Ｏｌ）で
１眼に滴下し、他の１眼を対照とした。瞳孔の直径を、
適宜時間をおき金側について測定した。各溶液はそれぞ
れ最低８羽の家兎で試験した。

冬眠の処置は３回を超えることなく、各処置毎の間に最
低１週間の体薬期間を置いて観察した。

測定パラメーター 瞳孔の直径は一時間による縮瞳活性曲線を画くため一種
々の間隔を置いて測定した。次の活性パラメーターは、
縮瞳／時間グラフに基づいて計算した： ＩｍａＸ＝処置眼と対照眼の瞳孔直径の最大差。

ピーク時間＝Ｉｍａｘに達するまでの時間。

持続時間＝基準条件に回復するまでに要する時間。

プラトー−絶対縮瞳活性期。

ＡＵＣ＝縮瞳／縮瞳７練 結果 試験結果を第５表に示す。試験したすべての溶液の、瞳
孔活性／時間曲線から決定された種々のパラメーターの
成績から、２％硝酸ピロカルピン溶液にヒアルロン酸を
加えると一薬物の縮瞳活性の増加が上昇することが判る
。事実、２％硝酸ピロカルビン水溶液（製剤１）に比べ
て、薬物のバイオアベイラビリティ−は２．７倍にまで
達する。

マタ、ヒアルロン酸のヒアレクチン画分を基剤として使
用した場合、１０■／−および２０■／−＋ｃ（製剤５
、６）の両者とも、ポリビニルアルコールを基剤とした
硝酸ピロカルピン溶液（製剤２）と比較して統計的に有
意な増加が見られることは注目すべきである。

ヒアルロン酸を硝酸ピロカルピンの基剤として使用する
と、ピロカルピンの縮瞳活性が一層長く持続することか
ら、ヒアルロン酸を基剤として利用することは特に興味
深い。即ち、瞳孔の直径が基準条件に回復するまでに要
する時間は、°ピロカルピンの生理食塩液単独溶液（製
剤１）で１１０分であるのに比べ、ヒアルロン酸を含有
する製剤（製剤６）では１９０分まで延長される。

■、ヒアルロン酸を基剤としたトリアムシメロンの抗炎
症活性 材料 次の検体を使用した： ヒアルロン酸ナトリウム塩−ヒアレクチン画分（分子量
５００，０００〜７３０，０００）の生理食塩液溶液（
１０＋ｎｙ／＋＋＋ｐ）。

トリアムシメロンの１０考溶液（生理食塩液）。

方法 ニューシーラント系雄性家兎（平均体重１．６ＫＦ）で
実験を行なつ、た。５日間の予備飼育期間後−デキスト
ラン（１０％、０．１−）を眼内注射し、家兎の眼内炎
症を起こさせた。両眼とも４％ノベシーナ（商標、Ｎｏ
ｖｅｓｉｎａ　）で局所麻酔し、前眼房の角膜縁から２
餌の位置にシリンジの針を４＃ｌｌｌまで挿入し一投与
した。試験は１０羽で行なった。

処置 各動物とも、右眼および左眼に次の液を１日３回−１回
３滴つつ滴下し一金側６日間処置した。

左眼（ＬＥ）：１０％トリアムシメロン溶液（生理食塩
液）。

右眼（ＲＥ）：ヒアルロン酸ナトリウム塩、ヒアレクチ
ン溶液（１０■／＋、２）＋）リアムシノロン（１０％
）。

評価方法 デキストランにより生じた炎症反応に対する抗炎症効果
を、デキストラン投与前−１−３，２４−４８時間、３
日−４日、５日および６日目にスリット光源を用いて眼
を観察して評価した。

各観察時、眼の検査は次の所見によって評価した： 角膜および結膜に見られる充血−浮腫の有無−特に通常
、炎症性薬剤の眼内注射後の炎症経過に敏感な虹彩の所
見。

濃い−または淡い混濁（片雲）が見られるチンダル効果
は一前眼房に微粒子体が存在する（炎症）ことを示して
いる。

観察結果は一効果の段階的評価法により主観的に採点（
θ〜１）して表わした。

結果 第６表に示した結果から、トリアムシメロンの投与は虹
彩に対し抗炎症効果を示し一前眼房の混濁（チンダル効
果）が消失することが判る。炎症の経過は１〜３時間目
から３〜４日目までの間が著しく、その後、除々に軽快
して、６日目までには殆んど常態に回復し、眼は完全に
清澄となる。

これに対して、ヒアルロン酸ナトリリム塩、ヒアレクチ
ン画分、をトリアムシメロンと一緒に投与すると、上述
のトリアムシメロンの単独投与に比較して眼内炎症の期
間が短縮される。即ち一虹彩の炎症経過と前眼房の混濁
は２４時間までに減少傾向が見られ、４８時時間区はか
なり軽快し、４日目以後−炎症反応は完全に消失する。

結膜および角膜は−デキストランの眼内注射後も殆んど
注意すべき反応は観察されなかった。

以上のように、トリアムシメロンをヒアルロン酸画分と
共に投与すると、家兎の眼の急速な回復が見られ薬物の
活性が高められる結果を得た。

■、ヒアルロン酸を基剤とするＥＧＦの創傷治癒活性 材料 次の材料を使用した。

製剤Ａ　　ＥＧＦ（表皮生長促進因子）−生理食塩液に
溶解（０，５■７　ｓ　ｍｅ　）。

製剤Ｂ−ヒアルロン酸ナトリウム塩−ヒアラスチン（分
子量−約１００，０００）、生理食塩液に溶解（１０巧
／−）。

方法 雄性白色ニューシーラント系家兎（平均体重１．８階）
で実験を行なった。約５日間の予備飼育後、ノベシーナ
（４％）による好適な局所麻酔条件下に一角膜表皮の損
傷を実施した。損傷は１眼の光学帯に、鋭い縁を有する
凹型ガラスシリンダー（径３朋）で円形に傷をつけた。

処置 動物は一各群５羽づつからなる群に分け、結膜に次の液
を滴下して一薬理学的な処置を施した。

群　　　　　　パ　　　　処　　置 第１群（対照）　生理食塩液 第２群　　　　　ＥＧＦ溶液（製剤Ａ）第３群　　　　
　ヒアルロン酸ナトリウム塩、ヒアレクチン溶液＋ＥＧ
Ｆ溶液− 製剤Ａと製剤Ｂを１＝１の比率 で組合わせて製剤Ｃを作る 処置は右眼（ＲＥ）に行ない、粘膜に８時間毎に２滴づ
つ滴下し、総計３回投与した。

評価方法 角膜表皮の回復は、損傷後、０．８時間後、１６時間後
−２４時間後、３２時間後、４０時間後および４８時間
後に、眼の観察およびスリット光源による写真記録によ
り評価した。

結果 第７表に示したように、眼科的検査の成績から、対照（
第１群）は損傷後４８時間で完全治癒に到達した（５１
５羽）。ＥＧＦ処置動物（第２群）では、損傷後２４時
間程度まで治癒経過が早まり明らかにや＼有効であった
（４７５羽）。ヒアルロン酸ナトリウム塩、ヒアレクチ
ン画分十ＥＧＦからなる製剤Ｃで処置した動物（第３群
）では、治癒経過はすべての動物（５１５羽）で、損傷
後１６時間程度で完全になった。

これらの結果は、角膜損傷の治療効果をより速かに促進
しておリーヒアルロン酸のヒアラスチン画分がＥＧＦの
基剤として使用することが治癒過程を速めることを示し
ている。

第７表二角膜表皮の損傷の治癒 第１群　生理食塩液　＋　＋＋＋− ＋＋＋＋　　　　− ＋＋＋＋−Ｌ 第２群　ＥＧＦ（製剤Ａ）＋　　　＋　　　十　　−−
＋＋＋−− ＋＋＋−− ＋＋＋＋− ＋＋＋−− 第３群　ヒアルロン酸　＋　　十−ｍ−＋ＥＣ；Ｆ（製
剤Ｃ）十十−−一 ＋＋−−− ＋、＋、−−− ＋＋−’　　− ＋＝治癒しない眼 ｍ＝治癒した眼 ■、ヒアルロン酸を基剤とするゲンタマイシンの抗微生
物活性 材料 次の材料を使用した。

ゲンタマイシンを生理食塩液に溶解（５０ｍｇ／／ＩＩ
Ｉｅ）。

ヒアルロン酸ナトリウム塩、ヒアレクチン画分（２〜７
ｍｅ　）。

方法 １１羽の家兎の両眼に、シュードモナス・エルギノーザ
（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）の
一定量浮遊液（０，１Ｔｎｌ）を注入し、敗血症性炎症
を起こさせた。敗血症性炎症を示したそれらの家兎の右
眼に、ゲンタマイシンとヒアルロン酸−ヒアレクチン画
分の組合わせを滴下投与し、左眼にはゲンタマイシンの
生理食塩液の緩衝溶液を投与した。

処置（６時間毎に３滴）は感染菌注入直後から開始し、
感染が消失するまで続けた。−家兎の眼は毎日、スリッ
ト光源下に観察した。

結果 ゲンタマイシンのヒアルロン酸との併用による治療は一
抗生物質の単独投与に比べ、敗血症感染のより速かな消
失を来たした。゛この結論は、第８表に示した結果から
明らかである。

第８表：ヒアルロン酸、ヒアレクチン画分を基剤とした
ゲンタマイシンの敗血症性炎症に対する効果 処　置　　　　　　炎症発現からの日数衝溶液 ゲンタマイシン＋ ヒアルロン酸ヒア０．０　０．０　９．Ｏ＋２７．２＋
７２．７＋１００　１００レクチン画分 数値は百分率で表わした（炎症が治癒した眼の数を、処
置した眼の数で除す）。

＋＝緩衝溶液に対して有意差あり（Ｆｉｓｈｅｒ（１）
　ｔ　−検定で０．０５以下） 本発明に示したＨＡ画分を基剤として使用し得る眼科用
薬の例を以下に追加して示す。但し、本発明はこれらに
限定されるものではない。

抗生物質：　　　　クロラムフェニコールネオマイシン オーレオマイシン ミキシンおよび゛ポリミキシン バシトラシン マイセチン類 ホルモン：　　　ナンドロロンおよび硫酸ナンドロロン 麻酔剤（局所）：ヘノキシネート（ｈｅｎｏｘｉｎａｔ
ｅ　）　・およびその塩酸塩 抗ウィルス剤：　ヨードデオキシウリジンヨードデオキ
シシチジン 抗炎症剤：　　　デキサメサゾンおよびそのリン酸塩、
および 昇圧剤および血管 収縮剤：　　　　シネフリンおよびネオシネフリン 結論 以上の実験結果から−ヒアルロン酸ナトリウム塩溶液（
ヒアラスチンおよびヒアレクチンの両画分）は眼科用薬
の基剤として使用でき、異った生物学的作用を有する種
々の型の医薬品に対して効果的であると結論できる。例
えば、縮瞳作用、抗炎症作用、治癒作用および抗微生物
作用がそれぞれ報告されている一硝酸ピロカルピンのよ
うな抗線内症薬−トリアムシメロンのような抗アレルギ
ーおよび抗炎症薬−ＥＧＦのような眼の組織治癒を促進
させる組織治癒および細胞増殖促進薬、ストレプトマイ
シンおよびゲンタマイシンのような抗生物質からなる医
薬品は、すべてＨＡを基剤として使用し、効果的に投与
できる。

種々の分子量のヒアルロン酸画分を基剤とする眼科用薬
製剤は宿主により完全に忍容され、従って感作現象を高
めることなく角膜表皮によく適合することが証明された
。

また、生物学的生成物ヒアルロン酸が、基剤として使用
することにより生薬のインビボのバイオアベイラビリテ
ィ−を高め、それらの薬物の薬理学的活性を強めること
ができる有用な基剤であることは、次に示す実験結果か
らよく観察できる。

硝酸ピロカルピンの作用時間を延長し、縮瞳活性を増強
し、 デキストランにより生じた眼内炎症に対するトリアムシ
メロンの抗炎症活性を増強し、しかもトリアムシメロン
単独と比較して、より短時間に炎症経過を軽減し、 角膜の表在性損傷に対する表皮成長促進因子（ＥＧＦ）
の防御活性を−明らかな相乗効果によって増強し、ＥＣ
，Ｆ単独投与による回復時間に比べ治一時間を短縮し、
また ゲンタマイシンのような抗生物質のインビボの生物学的
活性を増強する。

この生物学的ポリマー、ヒアルロン酸を、そのような性
質と作用の異なる薬物の基剤として使用することにより
、他の多くの眼科用薬にその活性を導入することができ
る。

下に示すのは、ヒアルロン酸の二つの画分、ヒアラスチ
ンとヒアレクチンだけを賦形薬として使用した粉末、点
眼剤−ゲル、クリーム、または挿入剤の剤型をとり得る
眼科用薬の各種の製剤例である。

製剤例１： ヒアルロン酸ナトリウム塩ヒアレ クチン画分　　　　　　　　　　　　１０■リン酸緩衝
液ｐＨ７，５Ｍを含有す る生理食塩液　　　　　　　　　　　１〇−を含有する
１人工涙液”に使用し得る点眼薬。

製剤例２： ヒアルロン酸ナトリウム塩ヒアレ クチン画分　　　　　　　　　　　　２０〜リン酸緩衝
液ｐＨ７，６Ｍを含有す る生理食塩液　　　　　　　　　　　１０献を含有する
゛人工涙液”に使用し得る点眼薬。

製剤例３： １００ｙ中に： ヒアルロン酸ナトリウム塩ヒアラ ステン画分　　　　　　　　　　　　５５ｆヒアルロン
酸ナトリウム塩ヒアレ クチン画分　　　　　　　　　　　　３０ｙＥＧＦ　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　ｏ：５ｙ再蒸留
水　　　　　　　　　　　　　２３．５Ｆを含有するゲ
ル剤。

製剤例４： ヒアルロン酸ナトリウム塩ヒアラ スチン画分　　　　　　　　　　　１００ＩＩＩＦ硝酸
ピロカルピン　　　　　　　　　　２ｔｖを含有する硝
酸ピロカルピンの１００ｖ挿入剤。

製剤例５： 粉末１００ｙ中に： ヒアルロン酸ナトリウム塩ヒアラ スチン画分　　　　　　　　　　　　７０ｙヒアルロン
酸ナトリウム塩ヒアレ クチン画分　　　　　　　　　　　２Ｂ、５ｙストレプ
トマイシン　　　　　　　　１．５ｙを含有する局所用
ストレプトマイシン含有粉末。

上記の製剤は代表例を示すべく記載したが、その他の作
用薬と、特殊用途に対する種々の投与剤型についても、
ヒアルロン“酸画分、特にヒアレクチンまたはヒアラス
チン画分−またはヒアレクチン／ヒアラスチンの混合画
分、またはそれらのカリウム塩またはナトリウム塩を組
合わせることによっても、薬学的製剤を当然調製できる
。

従って−ヒアルロン酸、特に実質的に純粋なヒアレクチ
ンおよびヒアラスチン画分は、眼科的に有用性または活
性を有する種々の薬物と組合わせて使用する効果的な基
剤または賦形薬であることが示された。ＨＡ画分を医薬
品基剤として含有する薬学的組成物は、ＨＡ画分が眼に
対する高度の耐容性と、角膜表皮に対する高度の適合性
を有することから特に有用である。

さらに、ＨＡ画分の使用により、眼科用薬のインビボの
生物学的活性を実質的に向上する手段が提供される。特
に、とアレ゛−クチンおよびヒアラスチンのＨＡ画分を
使用することは、これらの画分を眼に投与しても不都合
な炎症性の副作用を示さないことから、一層有用で、し
かも重要である。

【図面の簡単な説明】

第１図は、本発明者等の同定したヒアルロン酸画分の種
別を示すグラフである。 図面の浄書（内容に変更なし） 手続補正書（睦） １、事件の表示 昭和５９年特許願第２１４０４６　　　　号および医薬
組成物 ３補正をする者 事件との関係　特許出願人 住所　イタリア国パドヴア、３５０３１アパーノ・テル
メ、ヴイア・ポンチ・デツプ・ファブリーカ３−ア番名
称　フイディーア・ソシエタ・ベル・アチオニ４、代理
人 ５、補正命令の日付：自発 特許請求の範囲 １．利用し得る量のヒアルロン酸を含宵する組織を脱水
し、得られる脱水組織を酵素的に消化し、得られる混合
物を分子戸遇することにより、約ｓｏ、ｏｏｏ〜約１０
０，０００　、約２５０　、０００〜約３５０．０００
、または約ｓｏｏ、ｏｏｏ〜約７３０　、０００の平均
分子量を有するヒアルロン酸謔分を得ることから成る、
実質的に純粋で炎症性のないヒアルロン酸画分の製造方
法。 ２、　ヒアルロン酸抽出に利用し得る組織を脱水し、得
られる組織を酵素的に消化し、得られる混合物を、分子
量の最大端（排出限界）が３０　、０００のメンブラン
で分子濾過して分子量が３０，０００以上の分子を戸別
し、該メンブランに捕捉された混合物を採取することに
より、約ｚｓｏ、ｏｏｏ〜約３５０．０００の平均分子
量を有する第１のとアルロン酸画分生成物を得ることか
ら成る、実質的に純粋で炎症性のないヒアルロン酸画分
の製造方法。 ３、第２項で得られた第１のヒアルロン酸画分を、さら
に分子量の最大端（排出限界）が約２００．０００のメ
ン／ランで分子限外濾過して分子量が２００．０００以
上の分子を戸別し、引続き限外濾過を続けて対象とする
限外濾過の混合物の量が当初の量の１０％となるまで行
ない、膜を通過する混合物を採取して、約５０，０００
〜約１００，０００、ｏｏｏの平均分子量を有する第２
のヒアルロン酸画分生成物を得ることから成る、第２項
記記載の実質的に純料で炎症性のないヒアルロン酸画分
の製造方法。 ４、限外濾過段階を終えて、第３項に記載の分子量の最
大端（排出限界）が約２００　、０００のメンブラン上
多こ捕捉された混合物を採取して約５００．０００〜約
７３０，０００の平均分子量を有する第３のヒアルロン
酸画分生成物を得ることから成る、実質的に純粋で炎症
性のないヒアルロン酸画分の製造方法。 ５、約３０，０００〜約７３０．０００１７）平均分子
量を有する実質的に純粋で炎症性のないヒアルロン酸画
分、またはそのカリウム塩またはナトリウム塩。 ６、約２５０．０００〜約３５０．０００の平均分子量
を有する、第５項に記載の実質的に純粋で炎症性のない
ヒアルロン酸画分、またはそのカリウム塩またはナトリ
ウム塩。 ７、約５０，０００〜約１００，０００　　の平均分子
量を有する、第５項に記載の実質的に純粋で炎症性のな
いヒアルロン酸画分、またはそのカリウム塩味たはナト
リウム塩。 ８、約５００　、０００〜約７３０．０００の平均分子
量を有する、第５項に記載の実質的に純粋で炎症性のな
いヒアルロン酸画分、またはそのカリウム塩またはナト
リウム塩。 ９、＄６項に記載のヒアルロン酸画分の創傷治癒有効量
と、少なくとも１種の薬学的に許容し得る基剤、賦形剤
、または希釈剤から成る医薬組成物。 １０、第７項に記載のヒアルロン酸画分の創傷治癒有効
量と、少なくとも１個の薬学的に許容し得る基剤、賦形
剤、または希釈剤から成る医薬組成る基剤、賦形剤、ま
たは希釈剤から成る医薬組成物。 １２、有効成分としての眼科的活性を有する薬物の有効
量と、ヒアルロン酸の実質的に純粋な画分またはその塩
を含む薬学的に許容し得る担体基剤または希釈剤から成
る眼科用医薬組成物。 １３、該ヒアルロン酸画分が、約５０，０００〜約１０
０．０００、約２５０，０００〜約３５０，０００．ま
たは約５００，０００〜約７３０．０００の平均分子量
を有する第１２項に記載の医薬組成物。 １４、該ヒアルロン酸画分が、約ｓｏｏ、ｏｏｏ〜約７
３０．０００の平均分子量を有する第１２項に記載の医
薬組成物。 １５、第７項に記載のヒアルロン酸画分の創傷治癒有効
量を投与することから成る組織創傷の治癒促進方法。 １６、第８項に記載のヒアルロン酸画分の有効量を障害
関節へ注射することを特徴とする関節の外傷性および退
行性疾患の処置方法並びに関節の機能改善方法。 １７、第８項に記載のヒアルロン酸画分を、眼球内液の
代用液として眼内へ注射することを特徴とする眼内処置
方法。 １８、実質的に純粋なヒアルロン酸画分、またはその塩
を含む基剤と組合わせて眼科用薬を宿主の眼に投与する
ことから成る眼の状態の処置方法。 １９、該ヒアルロン酸の画分が、約５０．０００〜約１
００，０００．約２５０，０００〜約３５０．０００、
または約５００．０００〜約７３０，０００の平均分子
量を有する第１８項に記載の方法。 加、該ヒアルロン酸の画分が、約５００，０００〜約７
３０，０００　　の平均分子量を有する第１８項に記載
の方法。 ２１、該薬物が硝酸ピロカルピン、トリアムシノロン、
表皮成長促進因子、ストレプトマイシンおよびゲンタマ
イシンから成る薬物群から選ばれる一員であるＩＪ１９
項に記載の方法。 ２２、ｗ１１項記載の方法で得られたヒアルロン酸画分
またはその塩からなる障害組織処置剤。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、利用し得る量のヒアルロン酸を含有する組織を脱水
   し、得られる脱水組織を酵素的に消化し、得られる混合
   物を分子ろ過することにより、約５０，０００〜約１０
   ０，０００、約２５０，０００〜約３５０，０００、ま
   たは約５００，０００〜約７３０，０００の平均分子量
   を有するヒアルロン酸画分を得ることから成る、実質的
   に純粋で炎症性のないヒアルロン酸画分の製造方法。 ２、ヒアルロン酸抽出に利用し得る組織を脱水し、得ら
   れる組織を酵素的に消化し、得られる混合物を、分子量
   の最大端（排出限界）が３０，０００のメンブランで分
   子ろ過して分子量が３０，０００以上の分子をろ別し、
   該メンブランに捕捉された混合物を採取することにより
   、約２５０，０００〜約３５０，０００の平均分子量を
   有する第１のヒアルロン酸画分生成物を得ることから成
   る、実質的に純粋で炎症性のないヒアルロン酸画分の製
   造方法。 ３、第２項で得られた第１のヒアルロン酸画分を、さら
   に分子量の最大端（排出限界）が約２００，０００のメ
   ンブランで分子限外ろ過して分子量が２００，０００以
   上の分子をろ別し、引続き限外ろ過を続けて対象とする
   限外ろ過の混合物の量が当初の量の１０％となるまで行
   ない、膜を通過する混合物を採取して、約５０，０００
   〜約１００，０００の平均分子量を有する第２のヒアル
   ロン酸画分生成物を得ることから成る、第２項記記載の
   実質的に純料で炎症性のないヒアルロン酸画分の製造方
   法。 ４、限外ろ過段階を終えて、第３項に記載の分子量の最
   大端（排出限界）が約２００，０００のメンブラン上に
   捕捉された混合物を採取して約５００，０００〜約７３
   ０，０００の平均分子量を有する第３のヒアルロン酸画
   分生成物を得ることから成る、実質的に純粋で炎症性の
   ないヒアルロン酸画分の製造方法。 ５、約３０，０００〜約７３０，０００の平均分子量を
   有する実質的に純粋で炎症性のないヒアルロン酸画分、
   またはそのカリウム塩またはナトリウム塩。 ６、約２５０，０００〜約３５０，０００の平均分子量
   を有する、第５項に記載の実質的に純粋で炎症性のない
   ヒアルロン酸画分、またはそのカリウム塩またはナトリ
   ウム塩。 ７、約５０，０００〜約１００，０００の平均分子量を
   有する、第５項に記載の実質的に純粋で炎症性のないヒ
   アルロン酸画分、またはそのカリウム塩またはナトリウ
   ム塩。 ８、約５００，０００〜約７３０，０００の平均分子量
   を有する、第５項に記載の実質的に純粋で炎症性のない
   ヒアルロン酸画分、またはそのカリウム塩またはナトリ
   ウム塩。 ９、第６項に記載のヒアルロン酸画分の創傷治癒有効量
   と、少なくとも１種の薬学的に許容し得る基剤、賦形剤
   、または希釈剤から成る医薬組成物。 １０、第７項に記載のヒアルロン酸画分の創傷治癒有効
   量と、少なくとも１個の薬学的に許容し得る基剤、賦形
   剤、または希釈剤から成る医薬組成物。 １１、第８項に記載のヒアルロン酸画分の創傷治癒有効
   量と、少なくとも１個の薬学的に許容し得る基剤、賦形
   剤、または希釈剤から成る医薬組成物。 １２、有効成分としての眼科的活性を有する薬物の有効
   量と、ヒアルロン酸の実質的に純粋な画分またはその塩
   を含む薬学的に許容し得る担体基剤または希釈剤から成
   る眼科用医薬組成物。 １３、該ヒアルロン酸画分が、約５０，０００〜約１０
   ０，０００、約２５０，０００〜約３５０，０００、ま
   たは約５００，０００〜約７３０，０００の平均分子量
   を有する第１２項に記載の医薬組成物。 １４、該ヒアルロン酸画分が、約５００，０００〜約７
   ３０，０００の平均分子量を有する第１２項に記載の医
   薬組成物。 １５、第７項に記載のヒアルロン酸画分の創傷治癒有効
   量を投与することから成る組織創傷の治癒促進方法。 １６、第８項に記載のヒアルロン酸画分の有効量を障害
   関節へ注射することを特徴とする関節の外傷性および退
   行性疾患の処置方法並びに関節の機能改善方法。 １７、第８項に記載のヒアルロン酸画分を、眼球内液の
   代用液として眼内へ注射することを特徴とする眼内処置
   方法。 １８、実質的に純粋なヒアルロン酸画分、またはその塩
   を含む基剤と組合わせて眼科用薬を宿主の眼に投与する
   ことから成る眼の状態の処置方法。 １９、該ヒアルロン酸の画分が、約５０，０００〜約１
   ００，０００、約２５０，０００〜約３５０，０００、
   または約５００，０００〜約７３０，０００の平均分子
   量を有する第１８項に記載の方法。 ２０、該ヒアルロン酸の画分が、約５００，０００〜約
   ７３０，０００の平均分子量を有する第１８項に記載の
   方法。 ２１、該薬物が硝酸ピロカルピン、トリアムシノロン、
   表皮成長促進因子、ストレプトマイシンおよびゲンタマ
   イシンから成る薬物群から選ばれる一員である第１９項
   に記載の方法。 ２２、第１項記載の方法で得られたヒアルロン酸画分ま
   たはその塩からなる障害組織処置剤。