JPH068323B2 - ヒアルロン酸薬理活性画分、その製造方法および医薬組成物 - Google Patents

ヒアルロン酸薬理活性画分、その製造方法および医薬組成物

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JPH068323B2
JPH068323B2 JP59214046A JP21404684A JPH068323B2 JP H068323 B2 JPH068323 B2 JP H068323B2 JP 59214046 A JP59214046 A JP 59214046A JP 21404684 A JP21404684 A JP 21404684A JP H068323 B2 JPH068323 B2 JP H068323B2
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Description

【発明の詳細な説明】 発明の背景と分野 本発明は、治療的効用を有し、しかも使用時になんら炎
症性を示さないヒアルロン酸（以下ＨＡと略称する）の
特定分子量の画分に関する。本発明に示すＨＡ画分の一
つは創傷治癒を促進するのに有用であり、また他方、第
２のＨＡ画分は眼球内液の代用液として眼内使用に有用
であり、また骨関節の損傷の治療適用のため関節内注入
に有用である。さらにそれらのＨＡ画分は、眼科用薬の
賦形薬として角膜上皮とよく適合し得る製剤を調製し、
眼科用薬の活性を高めるのに有用であることが明らかに
された。
従来の技術 ヒアルロン酸は、天然に産性され、交互に並ぶＤ−グル
クロン酸残基とＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミン残基か
ら構成されている異種多糖類である。ＨＡは、一般に約
８００万〜１３００万の高い分子量を有する線状のポリ
マーで、細胞外皮、脊椎動物の結合組織の細胞外間質物
質、関節の滑液、眼の眼球内液、ヒトの臍帯組織、およ
び雄鶏のとさかに存在している。
ＨＡの利用に関する従来の研究の一つに、眼球内液に代
用され、その他の治療にも適用し得る有用なＨＡの１画
分を示したバラズスの研究がある（米国特許第4,141,97
3号）。然しながら、この特許は平均分子量が約750,000
より大きく、好ましくは約1,200,000より大きいＨＡ画
分を特に指定している。バラズスは、平均分子量が750,
000より小さいＨＡ画分は炎症活性があるので治療用に
使用できないことを特に指摘している。これらの低級分
子量のＨＡ画分はバラズスによると破棄されている。然
しこのために、原料組織から入手される利用可能なＨＡ
の総量の約９０％は破棄され、利用可能なＨＡの僅かな
量（約１０％）だけが使用される結果となっている。
バラズスの指摘した結果と逆に、本発明者はＨＡの低級
分子量の画分が、実際に有用な薬学的活性を有すること
を発見した。したがって、本発明によると種々の材料か
ら入手し得るＨＡの約８０％までが利用される。特に本
発明者は、創傷治癒の促進に有用なＨＡの１画分、およ
び眼の眼球内液の代用液として眼内に注射し、損傷され
た関節の治療用として関節内注射に使用し得るＨＡの第
２の画分を発見した。
発明の詳細な記載 前述のように、従来のＨＡの研究では、バラズスの特許
に代表される如く、平均分子量が750,000以上の高分子
量の画分を使用するように指摘している。本発明者は、
低分子量を有する画分と、中間に位置する平均分子量を
有するもう一つの画分との２個の新規なＨＡ画分を単離
し、確認した。それらの画分は高度の純度を示すので実
質的に純粋であると考えられ、しかも炎症活性を有しな
い。これらの新規ＨＡ画分は、ヒアルロン酸の抽出し得
る量を含有する種々の結合組織から入手することができ
る。本発明に示した特殊画分は、分子過の技術に従っ
て逐次的に分別され、分離される。
本出願方法によって分離される最初の画分はヒアラスチ
ン(HYALASTIN)と命名され、約50,000〜約100,000の平均
分子量を有する。このヒアラスチン画分は、その創傷治
癒活性から獣医用およびヒト用の治療的応用に好適であ
ることが確認された。本出願方法によって単離された第
２の画分はヒアレクチン(HYALECTIN)と命名され、約50
0,000〜約730,000の平均分子量を有する。このヒアレク
チンは眼球内液の代用液として眼科手術の際に使用さ
れ、また獣医学領域およびヒトにおける関節の外傷性お
よび退行性疾患の治療に好適である。
ヒアラスチンは皮内注射、または創傷治癒用の局所剤の
いずれでも投与できる。一方、ヒアレクチンは眼内注射
および関節内注射が好適である。
本出願方法においてはＨＡの各種画分について入念な検
討を行ない、従来の方法と比べて明らかにより正確な方
法を以て、ＨＡの治療上有用な画分と、炎症性で利用で
きないＨＡ画分とを明瞭に決定づけた。これらの研究の
結果から、本発明者はＨＡ画分に特有な二つの性質、即
ち細胞可動化(cell mobilization)活性と固有粘度(intr
insic viscosity)を確認し、検討した。動物における創
傷治癒の過程は細胞運動性、特に線維芽細胞の細胞運動
性によって促進される。一方、細胞運動性または増殖能
（即ち、有糸分裂）は、眼球内側の手術の場合はできる
だけ回避されるべきである。癒合速度の増大が却って有
害な影響をもたらす可能性がある網膜剥離の矯正手術に
おいて、このことは特に事実である。
固有粘度もまた、ＨＡ画分の有用性の判定に際して考慮
すべき重要な指標である。固有粘度が高い画分は、外傷
性および退行性の関節疾患の治療における手術適用に有
用であり、また眼球内液の代用液としても有用である。
一方、高い粘度は、創傷治癒を促進する薬物として使用
される画分にとって好ましからぬ特性である。事実、創
傷治癒に利用される画分は、実際の適用に当たって使用
し易いように低い粘度であるべきである。
本発明においてヒアラスチンと呼ばれる画分は、良好な
運動性、即ち細胞増殖能を有し、且つ低粘度を有するこ
とが確認された。従って、ヒアラスチンは、創傷治癒の
促進に有用な物質として望ましい特性を有する。
同時に一方では、この特性がヒアラスチン画分の眼内注
射療法、または関節内注射療法への適用を好ましくない
ものにしている。
本発明において、ヒアレクチンと呼ばれる画分は、細胞
運動性、即ち増殖能がごく僅かである一方、同時に高い
粘度を有することが確認された。従ってこれらの特性か
ら、ヒアレクチン画分は眼内注射療法および関節内注射
療法に有用である。然し他方、ヒアレクチンは細胞運動
活性を示さないので、この画分は創傷治癒法には有用で
はない。
ヒアルロン酸の有用な画分を分離する場合、炎症活性を
示さない画分を得ることが重要である。前述のバラズス
の特許は、炎症活性がないヒアルロン酸画分を得るため
には、平均分子量がもっぱら750,000以上の画分だけを
使用しなければならないことを教示している。このよう
に、バラズスは炎症活性の理由から有用でないとして、
平均分子量750,000以下の画分を破棄している。バラズ
スの教示に反して、本出願方法はバラズスにより平均分
子量750,000以下の画分に帰せられた炎症活性が、実は
平均分子量30,000以下の不純物に由来していることを発
見した。従って本発明は、化学的方法に引続き、分子量
30,000以下の炎症性画分を除去し得る一連の分子過技
術からなる方法を提供する。
本発明方法によって、特殊な出発材料から入手し得る総
ヒアルロン酸に対し、両者を併わせ約80％の総収率に達
する炎症活性のない有用なヒアルロン酸画分を得ること
が可能である。この８０％の収率で入手し得るヒアルロ
ン酸画分は、ヒアレクチン画分とヒアラスチン画分の双
方を含んでいる平均分子量約250,000〜約350,000の混合
画分からなる。更に限定すれば、ヒアレクチン画分は原
料組織から入手し得るＨＡの約３０％の収率で得られ、
またヒアラクチン画分は入手し得るＨＡの約５０％の収
率で得られる。この要素は、前述のバラズスの特許方法
に対し、利用し得るヒアルロン酸の薬学的に有用な量を
有意に増大させることを発見した本発明の重要な改良点
である。平均分子量750,000以上の画分だけを利用する
バラズスの特許方法では、動物臓器から利用し得るもと
のヒアルロン酸の僅かに約１０％だけの収率しか得られ
ず、利用し得るヒアルロン酸の約９０％は破棄される。
このように本発明によって、総ヒアルロン酸抽出物の利
用度は著しく高められた。
ヒアルロン酸の各種画分の抽出は相対的収率の比較を第
１表に示す。
添付した第１図は、本出願方法で確認された各種のＨＡ
画分を図式的に示したものである。第１図の釣鐘型の曲
線は、原料組織から入手し得るＨＡ画分の分布の概略を
表わしている。第１図の“Ｂ”領域は、バラズス（米国
特許第4,141,973号）によって確認された薬学的に有用
なＨＡ画分を表わす。Ａ区分は平均分子量30,000以下の
炎症性画分であり、Ｉ領域はヒアラスチン画分であり、
II領域はヒアレクチン画分である。このグラフから、バ
ラズスの方法は平均分子量750,000以下のＨＡ画分を除
去することによって利用し得るＨＡ抽出画分の大部分を
破棄していることが判る。これに対し、発明では平均分
子量が30,000以下の低分子量のヒアルロン酸が炎症活性
を生じることを、予かじめ研究者らがＨＡの種々の抽出
物について着目していたので、入手し得るＨＡの大部分
が薬学的に利用できるた。
本発明者は、特別な治療適応により開示した発明技術に
従って分離すれば、入手し得る大部分のＨＡが、実際治
療目的に利用できることを発見した。バラズスの特許は
入手し得るＨＡの約１０％だけの応用を特定して開示し
ているが、本発明では創傷治癒の適用に対しヒアラスチ
ン画分の形で、または眼内適用または関節内適用に対し
ヒアレクチン画分の形で、或いは、創傷治癒の適用に使
用できるヒアラスチン画分とヒアレクチン画分を合わせ
た形で、入手し得るＨＡの約８０％を利用できる。
確認された画分の化学的および物理的性質を、本発明で
調査し、これらの諸性質を第２表にまとめた。
製造方法 実施例１：炎症活性のないヒアラスチンとヒアレクチン
混合物の製造方法。
新しい、または冷凍した雌鶏のとさか(3000g)をひき肉
器にかけてミンチにひき、次に機械的ホモジナイザーで
注意深くホモジネートとする。得られたペーストを１０
容量の無水アセトンと共に、ステンレススチール製容器
AISI316またはガラス製容器に入れる。次いで全内容物
を、50g／分の速度で６時間攪拌した後、１２時間静置
して分離し、アセトンをサイフオンで除いて棄てる。
この抽出操作を、破棄する。アセトンが正しい湿度水準
に達するまで（カール・フィッシャー法）反復する。
得られた物質を次に遠心し、好適な温度で５〜８時間真
空乾燥する。この操作により、雌鶏のとさかから約５０
０〜６００ｇの乾燥粉末が得られる。
次に、この乾燥粉末３００ｇを、適量の塩酸システイン
の存在下にリン酸バッフアー緩衝水性媒質中で、パパイ
ン(0.2g)により酵素的に消化させる。次いで、この混合
液を６０〜６５℃の一定温度で２４時間、６０ｇ／分の
速さで攪拌する。この全量にセライト６０ｇを加えて冷
却し、なお１時間攪拌を持続する。
得られた混合物は、透明な液が得られるまで過す
る。次にこの透明な液を、分子量の最大端（排出限
界）が30,000であるメンブランを用いて限外過し、分
子量30,000以上の分子をメンブラン上に捕捉する。原液
の５〜６倍量を限外過し、同時に絶えず生成物に蒸留
水を加える。蒸留水を加えて懸濁させ、原容量の1/3と
なるまで生成物を限外過する。
残った液体に、0.1モルになるよう塩化ナトリウムを加
え、温度を５０℃に上昇させる。生成物を６０ｇ／分で
攪拌しつつ、セチルピリジニウムクロリド４５ｇを加え
る。この混合液を６０分間攪拌した後、セライト５０ｇ
を加える。攪拌しつつ生成物の温度を２５℃まで下げ、
生成する沈澱を遠心して採取する。このようにして得ら
れた沈澱を、セチルピリジニウムクロリド0.05％を含有
する塩化ナトリウムの0.01モル溶液（５）に懸濁させ
る。この懸濁液をさらに５０℃で６０分間攪拌する。温
度を２５℃に下げ、沈澱を遠心して採取する。
次に、洗浄操作を３回反復し、最後に沈澱物を集めて、
セチルピリジニウムクロリド0.05％を含有する塩化ナト
リウムの0.05モル溶液を加えた容器に入れる。これを６
０ｇ／分で６０分間攪拌し、内容物を２５℃の一定温度
で２時間放置する。上清を遠沈によって除去する。
この操作を、0.05％のセチルピリジニウムクロリドを含
有する塩化ナトリウムの0.1モル溶液を用いて、数回反
復する。混合物を遠心し、上清を棄てる。沈澱を0.05％
のセチルピリジニウムクロリドを含有する塩化ナトリウ
ムの0.30モル溶液（３リツトル）に分散させる。混合物
を攪拌し、沈澱と透明な液の双方を採取する。沈澱はさ
らに３回、それぞれ前述の溶液0.5リットルを用いて抽
出を繰り返す。
最後に残った沈澱を除去し、透明な抽出液を１個の容器
にまとめる。攪拌しつつ溶液の温度を50℃に上昇させ
る。次に溶液に塩化ナトリウムを0.23モルとなるよう添
加する。さらにセチルピリジニウムクロリド１ｇを加
え、１２時間攪拌を続ける。混合液を２５℃に冷却し、
最初はセライト充填物、次いでフイルター（１μ）を通
して過する。
得られた混合液を、次に分子量の最大端（排出限界）３
０，０００のメンブランを用い、塩化ナトリウムの0.33
モル溶液を加えて原容量の３倍とし、分子限外過を行
なう。塩化ナトリウム溶液の添加を中止し、液量はもと
の容量の1/4まで減少する。
このようにして濃縮した溶液は、２５℃で攪拌（６０ｇ
／分）しつつ、エタノール（９５％）の３倍量を加えて
沈澱させる。沈澱を遠心により採取し、上清は棄てる。
沈澱は0.1モルの塩化ナトリウム溶液１リットルに溶解
し、９５％エタノールの３倍量を用いて沈澱操作を反復
する。
沈澱を集めて、最初は７５％エタノール（３回）、次に
無水エタノール（３回）、最後に無水アセトン（３回）
で洗浄する。
このようにして得られた生成物（ヒアラスチン＋ヒアレ
クチン画分）は、250,000〜350,000の平均分子量を有す
る。
ヒアルロン酸の収率は、もとの新しい組織の0.6％に相
当する。
実施例２：実施例１に記載した方法により得られた混合
物からヒアラスチン画分を製造する方法。
実施例１に記載した方法により得られた混合物を、発熱
物質を含有しない蒸留水に、生成物１０mgに対し水１ｍ
の割合いで溶解する。このようにして得られた溶液
を、分子量の最大端（排出限界）が200,000のメンブラ
ンを用い、メンブラン上に水を加えることなく濃縮手枝
を用いて、分子限外過に掛ける。分子量の最大端が20
0,000のメンブランを通して限外過の操作を行なうこ
とにより、分子量が200,000以上の分子は通過しない
が、一方、それより小さい分子は水と共に膜を通過しな
い。過操作中は膜の上方部分に水を加えないので、こ
の部分の容量は減少すると共に、分子量が200,000以上
の分子の濃度は高まる。２回蒸留した発熱物質を含有し
ない蒸留水の２倍量を加え、容量が1/3となるまで溶液
を再度限外過に掛ける。この操作をさらに２回反復す
る。
膜を通過した溶液に塩化ナトリウムを加えて1.0モルと
し、次に９５％エタノールの４倍量を加えて沈澱させ
る。沈澱は７５％エタノールで３回洗浄し、真空乾燥す
る。
このようにして得られた生成物（ヒアラスチン画分）は
50,000〜100,000の平均分子量を有する。
ヒアルロン酸収率は、もとの新しい組織の0.4％に相当
する。
実施例３：ヒアレクチン画分の製造方法。
実施例２に記載した分子量の最大端が200,000の限外
過メンブランから容器中に集められた濃縮物を、グルク
ロン酸を測定する容量分析で、ヒアルロン酸濃度が５ｍ
ｇ／ｍの溶液となるまで水で希釈する。
溶液に塩化ナトリウムを加えて0.1モルに調製し、９５
％エタノールの４倍量を加えて沈澱させる。沈澱を７５
％エタノールで３回洗浄し、真空乾燥する。
このようにして得られた生成物（ヒアレクチン画分）は
500,000〜730,000の平均分子量を有する。これは、高純
度の約2,500〜3,500サツカライド単位の分子鎖長と規定
される特定のヒアルロン酸画分に相当する。
ヒアルロン酸収率は、もとの新しい組織の0.2％に相当
する。
〔効果〕
生物学的および薬学的活性の評価 １．ヒアルロン酸の各画分の生物学的細胞可動化活性 ＨＡ画分の細胞可動化活性を評価する方法として、培養
における線維芽細胞の解離能を測定することからなる方
法を使用した。
マウスＢＡＬＢ３Ｔ３細胞を、１０％ウシ血清、ペニシ
リン（２５０単位／ｍ）およびストレプトマイシン
（０．２５ｍｇ／ｍ）を添加したダルベッコ修飾のイ
ーグル培地に発育させ、５％ＣＯ２、９５％空気中で加
湿しながら３７℃でインキュベートした。実験のため
に、細胞は常に６０mm直径のプラスチック製組織培養皿
に接種（６×105細胞／皿）された。
３Ｔ３細胞の全面（集密的細胞）単層を傾瀉し、新たに
ＨＡの各種画分のそれぞれ２．０ｍｇ／ｍを含有する
媒質を加えた。一定時間後に、細胞解離の状態を顕微鏡
的、並びにコールターカウンターで運動している細胞数
を数えることの両者により観察した。
解離測定：解離速度を測定するため、細胞をプラスチッ
ク皿に接否し、２４時間発育させた。この時点で培地を
傾瀉して除き、新たに２．０ｍｇ／ｍのＨＡを含有す
る媒質を加えた。それぞれ１枚づつの試験培養と対照培
養からなる２枚の皿を、２４時間毎に傾瀉し、上清中に
ある細胞と付着している細胞とをコールターカウンター
でカウントした。
第３表に、先の実施例１〜３で得られた各画分を用いて
試験した成績を示した。
第３表に報告した成績から、ヒアラスチン画分は高い細
胞可動化活性を有し、この画分が創傷治癒適用に有用で
あることが判る。このヒアラスチンの細胞可動化活性か
ら、この画分の薬学的製剤を障害された組織部位に適用
すれば、新生細胞の移動と増殖を盛んにすることになる
と考えられる。
これに対して、ヒアレクチン画分は細胞可動化活性が非
常に小さく、従って創傷には有用でないと推定される。
然し、ヒアレクチンは平均分子量が高く、内部粘度(inh
erent viscosity)も高いので、眼内注射および関節内注
射用として有用であり、細胞可動化活性が欠除している
ことは、特に眼内注射および関節内注射にヒアレクチン
画分を有用にする、却って重要な特性となっている。
ヒアルロン酸各画分の走化性 １．−２ 材料および方法 ヒト血液ＰＭＮ（多核形白血球）はドリス Ｒ．等の
「ラット好中顆粒球に対するヒアルロン酸およびその可
溶性エステル類による走化性作用」（バイオマテリアル
ズ(Biomaterials)に投稿）に記載の方法に従い使用す
る。
約750,000ダルトンの分子量を持つヒアルロン酸の熱分
解により、ヒアルロン酸の各画分を調製する。
得られた試料の分子量を下記の表に示す。
ヒアルロン酸のイン・ビトロでの走化性活性は、先行技
術のボイデンチャンバー改良型を用いて求められた。こ
の方法では、標準条件（３７℃で１時間インキュベーシ
ョン）で、フィルター下に通過した溶液とフィルター上
に残った細胞の間の勾配の関数により、３μｍの穴をも
つミリポールR・フィルター内の細胞の通過を測定す
る。
細胞の走化性活性は「走化性指数」（Ｃ．Ｉ．＝Ｃ／Ｒ
×１００）によって測定する。このパラメーターは、走
化性物質の存在する場合でのフィルター（μｍ）内のＰ
ＭＮの細胞移動（Ｃ）と走化性物質がない場合の細胞移
動（Ｒ＝無秩序移動）との比率×１００により得られ
る。
負の対照は、緩衝液ＢＳＳ／ＢＳＡであり、ＦＭＬＰ(N
-formy1-L-methionyl-L-leucyl-L-phenylalanine)１０
-7Ｍ溶液であった。
ヒアルロン酸の各画分を３種の異なる濃度、１０-4、１
０-2、１ｍｇ／ｍｌで試験した（ジグモンド、Ｓ．Ｈお
よびヒルシュ Ｊ．Ｇ．、白血球移動および走化性、ジ
ャーナル・オブ・イクスペリメンタル・メディシン(J.E
xp.Med)、(1973年）、173巻、378-410頁））。
結果 結果は、ヒアルロン酸の走化性が分子量および濃度に依
存していることを示している（下記表）。
特に、低分子量画分は、正の走化性（細胞移動の増大）
を示し、一方、高分子量画分は、走化性を低減する。正
傾向と負傾向の間の変移点は、分子量約350,000の画分
付近にある（第２図参照）。
結論として、ヒアルロン酸が、分子量および濃度に依存
し、炎症領域内での炎症性細胞の回復を調節出来るとい
うことが認められ得る。すなわち、炎症性細胞の回復
が、低分子量では増強され、高分子量では低減される。
ヒアルロン酸のこの調節活性は、異なる症状でのヒアル
ロン酸の各画分の臨床的使用を正当化するものである。
実際、正の走化性は白血球による菌の貪食過程で要求さ
れ、一方、走化性の遮断または低減は抗炎症作用を示
し、骨関節症のような炎症性疾患の処置におけるヒアル
ロン酸の使用が要求され、炎症を抑制する。
250,000から350,000ダルトンのヒアルロン酸画分は非常
に低い走化性活性をもつと示されているが、画分の濃度
を調節することにより、正か、または負かを調節できる
ことは事実である。この方法では、骨関節症または炎症
性疾患の制御の両方に対し、種々の濃度で、この画分を
用いることが可能である。
２．ヒアルロン酸の各画分の炎症活性 この評価には、家兎における眼内投与後の侵襲細胞をカ
ウントする方法を使用する。
方法 体重約２kgの、視覚に異常のないことを確かめたニュー
ジランド系またはカリホルアア系家兎５羽を、この試験
に使用する。家兎の眼の外側の炎症性の経過は肉眼的
に、また内側は検眼鏡を用いて検査する。眼底が明瞭に
見え、正常であれば、試験を実施する。
選ばれた動物は、適宜滅菌した眼科用局所麻酔薬を数滴
下して局所麻酔を施す。眼科用アトロピン溶液の数滴を
同時に滴下する。
試験は無菌条件下に実施する。眼球を圧迫して突出さ
せ、２６ゲージ針を用い縁から約５〜６mmの鞏膜を通し
てガラス体腔の中心に１００μの溶液を注射する。も
う一つの眼を対照とする。処置後、抗生物質溶液を２滴
滴下した後、動物をそれぞれ単独ケージに収容する。
５０〜６０時間後、さらに試験を続行する。両眼を、前
述の動物を選出した方法と同様にして検査する。ペント
バルビタールを静注して、動物を屠殺する。まず最初
に、２６ゲージ針のインスリンシリンジを用いて、眼房
水（約０．２ｍ）を採取する。次に、眼球を摘出し、
すべての異物を除去し、生理食塩液で洗浄し、ビルバラ
ラス紙(bilbulous paper)で乾かし、切開して内容物を
ペトリ皿にあけ、ガラス体の主要部分を分離し、それを
滅菌シリンジで採取する（約０．７ｍ）。ガラス体は
ポリエチレン製の小試験管に採り、５０μのヒアルロ
ニダーゼ（１００ｕＮＦ／ｍ）を添加する。混合液の
粘度を低下させるため、約３時間、３７℃の温度に保
つ。
顕微鏡下に位相差法（１２０×）により、白血球数をビ
ュルケル計算板でカウントする。各検体毎に一連の計算
値を記録し、平均値を算出し、結果を白血球／mm3とし
て表わす。
その結果 １）眼になんらの障害の徴候が認められず、 ２）処置した５眼のうち、少なくとも４眼で平均白血球
数が２００／mm3)を超えず、各対照眼において平均白血
球数が５０／mm3を超えない時、 試験は陽性と判断する。
第４表に、前述の実施例１〜３で得られたＨＡの各画分
をこの評価に用いて、得られた結果を示す。
第４表に示した成績から、ヒアラスチンおよびヒアレク
チンの各画分の炎症活性は対照より低く、またヒアラス
チンとヒアラクチンの両者を含有する画分が示した炎症
活性の増加は対照に比べて無視し得る程度に過ぎないこ
とが明らかにされた。従って、ヒアラスチン画分および
ヒアレクチン画分は、好ましからぬ副作用がなく薬学的
に有用である。さらにこれらの結果は、ＨＡ製剤の炎症
活性の原因が、約30,000以下の平均分子量を有するＨＡ
画分にあるとする本発明を裏付けるものである。スワン
の文献(SwannD.A.,1968,B.B.A.156,17〜29)に記載され
た方法に従い、雄鶏のとさかから調製したヒアルロン酸
は著しい炎症活性を示す。
このようにして、平均分子量が約50,000〜100,000のヒ
アラスチン画分は高い細胞可動化活性を有し、従って、
不快な炎症反応を示すことなく創傷治癒適応に有用であ
ることが明らかになった。平均分子量が約500,000〜73
0,000であるヒアレクチンは、その高い分子量と内部粘
度の故に、眼内注射および関節内注射に有用であること
が示され、同時にこれらの薬学的適用では回避すべき不
快な副作用である細胞可動化活性または炎症反応に亢進
しなかった。
より明確に述べれば、ヒアラスチン画分は次の特性によ
り、創傷治癒剤として有用であることが見出された。
１．その製剤によって、通常の治療と比べ、障害部位の
急速な清浄化、潰瘍辺縁の正常化、盛んな肉芽組織の形
成、マクロファージおよび線維芽細胞の細胞遊走の活性
化、および急速な上皮形成を伴なう治癒時間の急速な短
縮を促進される。
２．その製剤によって、重症例における再生手術に対す
る順応の増加が促進される。
３．瘢痕化組織を最後に仕上げして美容上および機能的
に良好な結果を得ることにより、ケロイドまたは退縮製
の瘢痕形成を残さないこと。
ヒアラスチン製剤は、褥瘡傷（床ずれ）、栄養性潰瘍、
火傷、無痛性潰瘍、外傷後潰瘍、静脈および静脈炎後の
静脈血腫による潰腫、皮膚病巣、皮膚移植および単純ヘ
ルペスに由来する皮膚病変を含む種々の傷の処置に有用
であることが明らかにされた。これらの創傷治療の処置
に、ヒアラスチン製剤、またはそのナトリウム塩はガー
ゼパッド、クリーム、スプレイ、または皮内注射用注射
剤のような種々の方法により投与できる。クリームやガ
ーゼパードに用いる局所適用には、ヒアラスチンは、露
出している部分から出る滲出物を吸収し、同時にヒアル
ロン酸を効果的に拡散させる乳化剤、および傷の包帯の
除去を容易にさせるための水に拡散性の賦形薬と組合わ
せることが望ましい。
ヒアレクチン画分は馬の治療、特に競争馬の関節障害、
および急性または慢性の外傷、感染または副腎皮質ステ
ロイドの反復した関節内注射に起因する疾患の治療に有
用であることが見出された。特にヒアレクチンで治療し
得る障害を例示すると、炎症症状を伴なう、または無症
状の骨関節症、急性または慢性の滑膜炎、関節軟骨の変
性過程、および乾性の関節疾患である。これらの疾患に
最も良く見受けられる徴候は一般に、疼痛、関節の機能
不全、および関節の屈伸性の減退である。本発明のヒア
レクチン画分は、通常の治療に比べ、そのような障害馬
に対して関節機能の急速で、しかも持続する改善を早
め、また疼痛および跛行を軽減して治癒期間を著しく短
縮するのに効果があることが判明した。これらの臨床的
に好ましい効果は、滑液の粘弾性を回復し、関節軟骨に
おける組織修復過程を賦活化することにより促進される
ものと考えられる。
その上、上記の好ましい効果は、すべてヒアレクチン画
分が局所的および／または全身的に毒性作用を伴ないこ
とからさらに増強される。ヒアレクチンを反復して投与
しても、アレルギー反応、および何らの有害性または残
存性の影響をも生じない。
薬学的製剤 前記の知見から、ヒアラスチン画分およびヒアレクチン
画分は薬学的適用に良好な活性を有することが明らかに
された。次に示す製剤例は、ＨＡ画分を実際に生体（イ
ンビボ）へ投与する場合に可能な薬学的製剤を、単に例
示的に記載する目的で提供するものである。
Ａ．創傷治癒用製剤 製剤例１：皮内注射用注射剤．１アンプル中： ヒアラスチンナトリウム塩 ２mg 塩化ナトリウム １６mg 注射用精製水 適量を加えて２ｍとする。
製剤例２：皮内注射用注射剤。１アンプル中： ヒアラスチンカリウム塩 ５mg 塩化ナトリウム ８mg 注射用精製水 適量を加えて１ｍとする。
製剤例３：局所適用用スプレー。１瓶中： ヒアラスチンナトリウム塩 ２０mg 塩化ナトリウム ８０mg 注射用精製水 適量を加えて10ｍとする。
製剤例４：局所適用用スプレー。１瓶中： ヒアラスチンカリウム塩 ３０mg マンニット １００mg 注射用精製水 適量を加えて10ｍとする。
製造例５：局所適用用クリーム。１チューブ中： ヒアラスチンカリウム塩 ２５mg ポリエチレングリコール− モノステアレート４００ １０００mg セチオール（オレイン酸 デシルエステル） ５００mg ラネッテＳＸ（セチルステア−リルアル コール＋ラウリル硫酸塩９：１） １５０mg グリセリン ２００mg ソルビット １５０mg デヒドロ酢酸ナトリウム １０mg ｐ−オキシメチルベンゾエート ７．５mg ｐ−オキシプロピルベンゾエート ５mg 再蒸留水 適量を加えて１０ｇとする。
製剤例６：局所適用用クリーム。１チューブ中： ヒアラスチンナトリウム塩 ３０mg パラフィンゼリー ３mg ポリエチレングリコール− モノステアレート４００ １０００mg セチオール（オレフィン酸 デシルエステル） ５００mg ラネッテＳＸ（セチルステアリル−アル コール＋ラウリル硫酸塩９：１） １５０mg グリセリン ２００mg ソルビット １５０mg デヒドロ酢酸ナトリウム １０mg ｐ−オキシメチルベンゾエート ７．５mg Ｐ−オキシプロピルベンゾエート ５mg 再蒸留水 適量を加えて１０ｇとする。
製剤例７：医薬用ガーゼパッド（局所適用）。１ パッド中（１０×１０cm）： ヒアラスチンナトリウム塩 ３mg グリセリン １ｇ ポリエチレングリコール ２ｇ 再蒸留水 適量を加えて３ｇとする。
製剤例８：医療用ガーゼパット（局所適用）。１ パッド中（１５×１５cm）： ヒアラスチンカリウム塩 ６mg パラフィンゼリー ０．５mg グリセリン １ｇ ポリエチレングリコール ２ｇ 再蒸留水 適量を加えて３ｇとする。
製剤例９：創傷治癒用乾燥粉末、乾燥粉末１ｇ中： ヒアラスチンナトリウム塩 １０mg マンニット 0.75ｇ グリシン 0.24ｇ Ｂ．眼内適用製剤 製剤例10：１ｍバイアル。１バイアル中： ヒアレクチンナトリウム塩 １０mg 塩化ナトリウム ８mg 一塩基リン酸ナトリウム・2H2O 0.25mg 二塩基リン酸ナトリウム・12H2O ３mg 注射用精製水 適量を加えて１mとする。
製剤例11：５mバイアル。１バイアル中： ヒアレクチンカリウム塩 ６０mg マンニット ５０mg 一塩基リン酸ナトリウム・2H2O 1.25mg 二塩基リン酸ナトリウム・12H2O １５mg 注射用精製水 適量を加えて５mとする。
製剤例12：シリンジ製剤。１シリンジ中： ヒアレクチンナトリウム塩 ４０mg 塩化ナトリウム １６mg 一塩基リン酸ナトリウム・2H2O ０．８mg 二塩基リン酸ナトリウム・12H2O 8.16mg 注射用精製水 適量を加えて２mとする。
Ｃ．関節内適用製剤 製剤例13：２ｍバイアル。１バイアル中： ヒアレクチンナトリウム ４０mg 塩化ナトリウム １６mg 注射用精製水 適量を加えて２ｍとする。
製剤例14：４ｍバイアル。１バイアル中： ヒアレクチンカリウム塩 ６０mg マンニット ３５mg グリシン １０mg 注射用精製水 適量加えて４ｍとする。
製剤例15：シリンジ製剤。１シリンジ中− ヒアレクチンナトリウム塩 ２５mg 塩化ナトリウム １２mg マンニット １０mg 一塩基リン酸ナトリウム・2H2O ０．５mg 二塩基リン酸ナトリウム・12H2O ６mg 注射用精製水 適量を加えて２ｍとする。
上記の製剤は例示的目的を以て記載されたものであり、
本発明者によって発見されたヒアラスチン画分およびヒ
アレクチン画分、またはそのカリウム塩またはナトリウ
ム塩を、薬学的に許容し得るその他の基剤、希釈剤、ま
たは賦形薬と組合わせることにより、また特定の使用に
応じて種々の投与量製剤として、その他の薬学的製剤を
調製できることも、当然類推できる。
創傷治癒に適用するために、ヒアラスチン画分の製剤
は、前述したクリーム、スプレー、ガーゼパッド、乾燥
粉末、または皮内注射のような投与形式のいずれか一つ
の形で、皮膚の損傷部位に適用される。
関節内に適用するためには、ヒアレクチン製剤は、前述
したバイアル製剤またはシリンジに予製した製剤のいず
れかから、一般に関節に対して１投与量２ｍの割合で
投与される。
さらにヒアクロン酸は、種々の分子の担体として使用で
き、効果的であることが研究され、特に角膜表皮に対す
る耐容性と適合性（即ち、感作現象を起こさない）が完
全に保証され、眼科用薬基剤として使用される。ヒアル
ロン酸は眼科用基剤として特に興味深いものと考えられ
る。前述のように、ＨＡは種々の結合組織および生物学
的液体（例えば滑液、および特にガラス体）に存在する
グリコサミノグリカンであって、その化学的および物理
学的性質、特にその著しい弾粘性により、組織における
基本的に重要な構造上および生物学的な役割りを果して
いる。
このような理由から、種々の分子量のＨＡ画分、特にヒ
アラスチン画分とヒアレクチン画分、およびそれらの混
合画分を、点眼剤、ゲル、クリーム、挿入剤、または乾
燥粉末のような種々の製剤剤型に調製する応用について
研究を行なった。特に、各種の眼科用薬の基剤として、
この生物的的ポリマーの種々の画分を積極的に利用すべ
く広汎な知識を得るため検討した。
以下に報告する実験は、ヒアルロン酸を賦形薬として含
有する製剤が、それらに調合されている主薬の生物学的
利用能（バイオアベイラビリテイー）を高めるかどう
か、また主薬と組合わせることによって相乗効果を生じ
るかどうかを、特に眼科領域における活性、若しくは有
用性を有する薬物について検討することを目的としてい
る。
ＨＡの基剤として重用なこれらの活性は、家兎の眼を用
い、種類と薬効の異なる４種の眼科用薬、特にピロカル
ピン、トリアムシノロン、表皮生長促進因子（ＥＧＦ）
およびストレプトマイシンおよびゲンタマイシンのよう
な抗生物質を用いて検討した。これらの薬物はすべて縮
瞳作用、抗炎症作用、治癒作用および抗微生物作用を有
することが知られている。なかでも、ヒアルロン酸を基
剤とする抗生物質ストレプトマイシンの活性評価は、こ
の薬剤が眼科領域の感染症に最も広範囲に使用されてい
る抗生物質の一つである理由から非常に重要である。
研究した実験モデルおよび行なった実験を示す。
１）ヒアルロン酸を基剤とした硝酸ピロカルピンの家兎
の眼における縮瞳活性。
２）デキストランにより起こした家兎の眼の実験的炎症
に対する、ヒアルロン酸を基剤としたトリアムシノロン
の抗炎症活性。
３）家兎の角膜表皮の実験的損傷に対するヒアルロン酸
を基剤とした表皮成長促進因子（ＥＧＦ）の治癒活性。
４）ヒアルロン酸を基剤としたストレプトマイシンの、
寒天培地中におけるバチルス・ズブチリス(Bacillus su
btilis)6633に対する抗菌活性。
Ｉ．ヒアルロン酸を基剤とした硝酸ピロカルピンの縮瞳
活性 材料 種々の硝酸ピロカルピン製剤の賦形薬として、次の材料
を使用した。
ヒアルロン酸ナトリウム塩、ヒアラスチン画分（分子量
約100,000）、濃度１０ｍｇ／ｍおよび２０ｍｇ／ｍ
； ヒアルロン酸ナトリウム塩、ヒアレクチン画分（分子量
500,000〜730,000）、濃度１０ｍｇ／ｍおよび２０ｍ
ｇ／ｍ； 眼科用賦形薬の対照として、５％ポリビニルアルコー
ル。
種々の、硝酸ピロカルピンの２％製剤（点眼薬またはゲ
ル）を、２種類の異なるＨＡナトリウム塩の１０ｍｇ／
ｍおよび２０ｍｇ／ｍ濃度を基剤として調製した。
次の溶液を調製した。
製剤１−硝酸ピロカルピン(PiNO3)（２％）の生理食塩
液溶液（対照）。
製剤２−PiNO3（２％）の５％ポリビニルアルコール溶
液（対照）。
製剤３−PiNO3（２％）のヒアラスチン画分ナトリウム
塩（１０ｍｇ／ｍ）溶液。
製剤４−PiNO3（２％）のヒアラスチン画分ナトリウム
塩（２０ｍｇ／ｍ）溶液。
製剤５−PiNO3（２％）のヒアレクチン画分ナトリウム
塩（１０ｍｇ／ｍ）溶液。
製剤６−PiNO3（２％）のヒアレクチン画分ナトリウム
塩（２０ｍｇ／ｍ）溶液。
方法 白色ニュージーランド系家兎（２〜2.5kg）を使用し
た。試験する製剤をマイクロシリンジ（１０）で１眼
に滴下し、他の１眼を対照とした。瞳孔の直径を、適宜
時間をおき全例について測定した。各溶液はそれぞれ最
低８羽の家兎で試験した。各眼の処置は３回を超えるこ
となく、各処置毎の間に最低１週間の休薬期間を置いて
観察した。
測定パラメーター 瞳孔の直径は、時間による縮瞳活性曲線を画くため、種
々の間隔を置いて測定した。次の活性パラメーターは、
縮瞳／時間グラフに基づいて計算した： Imax＝処置眼と対照眼の瞳孔直径の最大差。
ピーク時間＝Imaxに達するまでの時間。
持続時間＝基準条件に回復するまでに要する時間。
プラトー＝絶対縮瞳活性期。
ＡＵＣ＝縮瞳／時間曲線下の面積。
結果 試験結果を第５表に示す。試験したすべての溶液の、瞳
孔活性／時間曲線から決定された種々のパラメーターの
成績から、２％硝酸ピロカルピン溶液にヒアルロン酸を
加えると、薬物の縮瞳活性の増加が上昇することが判
る。事実、２％硝酸ピロカルピン水溶液（製剤１）に比
べて、薬物のバイオアベイラビリテイーは2.7倍にまで
達する。
また、ヒアルロン酸のヒアレクチン画分を基剤として使
用した場合、１０ｍｇ／ｍおよび２０ｍｇ／ｍ（製
剤５、６）の両者とも、ポリビニルアルコールを基剤と
した硝酸ピロカルピン溶液（製剤２）と比較して統計的
に有意な増加が見られることは注目すべきである。
ヒアルロン酸を硝酸ピロカルピンの基剤として使用する
と、ピロカルピンの縮瞳活性が一層長く持続することか
ら、ヒアルロン酸を基剤として利用することは特に興味
深い。即ち、瞳孔の直径が基準条件に回復するまでに要
する時間は、ピロカルピンの生理食塩液単独溶液（製剤
１）で１１０分であるのに比べ、ヒアルロン酸を含有す
る製剤（製剤６）では１９０分まで延長される。
II．ヒアルロン酸を基剤としたトリアムシノロンの抗炎
症活性 材料 次の検体を使用した： ヒアルロン酸ナトリウム塩−ヒアレクチン画分（分子量
500,000〜730,000）の生理食塩液溶液（１０ｍｇ／ｍ
）。
トリアムシノロンの１０％溶液（生理食塩液）。
方法 ニュージーランド系雄性家兎（平均体重1.6kg）で実験
を行なった。５日間の予備飼育期間後、デキストラン
（１０％、０．１ｍ）を眼内注射し、家兎の眼内炎症
を起こさせた。両眼とも４％ノベシーナ（商標、Novesi
na）で局所麻酔し、前眼房の角膜縁から２mmの位置にシ
リンジの針を４mmまで挿入し、投与した。試験は１０羽
で行なった。
処置 各動物とも、右眼および左眼に次の液を１日３回、１回
３滴づつ滴下し、全例６日間処置した。
左眼（ＬＥ）：１０％トリアムシノロン溶液（生理食塩
液）。
右眼（ＲＥ）：ヒアルロン酸ナトリウム塩、ヒアレクチ
ン溶液（１０ｍｇ／ｍ）＋トリアムシノロン（１０
％）。
評価方法 デキストランにより生じた炎症反応に対する抗炎症効果
を、デキストラン投与前、１、３、２４、４８時間、３
日、４日、５日および６日目にスリット光源を用いて眼
を観察して評価した。
各観察時、眼の検査は次の所見によって評価した： 角膜および結膜に見られる充血、浮腫の有無、特に通
常、炎症性薬剤の眼内注射後の炎症経過に敏感な虹彩の
所見。
濃い、または淡い混濁（片雲）が見られるチンダル効果
は、前眼房に微粒子体が存在する（炎症）ことを示して
いる。
観察結果は、効果の段階的評価法により主観的に採点
（０〜１）して表わした。
結果 第６表に示した結果から、トリアムシノロンの投与は虹
彩に対し抗炎症効果を示し、前眼房の混濁（チンダル効
果）が消失することが判る。炎症の経過は１〜３時間目
から３〜４日目までの間が著しく、その後、徐々に軽快
して、６日目までには殆んど常態に回復し、眼は完全に
清澄となる。これに対して、ヒアルロン酸ナトリウム
塩、ヒアレクチン画分、をトリアムシノロンと一緒に投
与すると、上述のトリアムシノロンの単独投与に比較し
て眼内炎症の期間が短縮される。即ち、虹彩の炎症経過
と前眼房の混濁は２４時間までに減少傾向が見られ、４
８時間目にはかなり軽快し、４日目以後、炎症反応は完
全に消失する。
結膜および角膜は、デキストランの眼内注射後も殆んど
注意すべき反応は観察されなかった。
以上のように、トリアムシノロンをヒアルロン酸画分と
共に投与すると、家兎の眼の急速な回復が見られ薬物の
活性が高められる結果を得た。
III．ヒアルロン酸を基剤とするＥＧＦの創傷治癒活性 材料 次の材料を使用した。
製剤Ａ−ＥＧＦ（表皮生長促進因子）、生理食塩液に溶
解（０．５ｍｇ／５ｍ）。
製剤Ｂ−ヒアルロン酸ナトリウム塩、ヒアラスチン（分
子量、約100,000）、生理食塩液に溶解（１０ｍｇ／ｍ
）。
方法 雄性白色ニュージーランド系家兎（平均体重1.8kg）で
実験を行なった。約５日間の予備飼育後、ノベシーナ
（４％）による好適な局所麻酔条件下に、角膜表皮の損
傷を実施した。損傷は１眼の光学帯に、鋭い縁を有する
凹型ガラスシリンダー（径３mm）で円形に傷をつけた。
処置 動物は、各群５羽づつからなる群に分け、結膜に次の液
を滴下して、薬理学的な処置を施した。
処置は右眼（ＲＥ）に行ない、結膜に８時間毎に２滴づ
つ滴下し、総計３回投与した。
評価方法 角膜表皮の回復は、損傷後、０．８時間後、１６時間
後、２４時間後、３２時間後、４０時間後および４８時
間後に、眼の観察およびスリット光源による写真記録に
より評価した。
結果 第７表に示したように、眼科的検査の成績から、対照
（第１群）は損傷後４８時間で完全治癒に到達した（５
／５羽）。ＥＧＦ処置動物（第２群）では、損傷後２４
時間程度まで治癒経過が早まり明らかにやゝ有効であっ
た（４／５羽）。ヒアルロン酸ナトリウム塩、ヒアレク
チン画分＋ＥＧＦからなる製剤Ｃで処置した動物（第３
群）では、治癒経過はすべての動物（５／５羽）で、損
傷後１６時間程度で完全になった。
これらの結果は、角膜損傷の治療効果をより速かに促進
しており、ヒアルロン酸のヒアラスチン画分がＥＧＦの
基剤として使用することが治癒過程を速めることを示し
ている。
IV．ヒアルロン酸を基剤とするゲンタマイシンの抗微生
物活性 材料 次の材料を使用した。
ゲンタマイシンを生理食塩液に溶解（５０ｍｇ／ｍ
）。
ヒアルロン酸ナトリウム塩、ヒアレクチン画分（２ｍｇ
／ｍ）。
方法 １１羽の家兎の両眼に、シュードモナス・エルビノーサ
（Pseudomonas aeruginosa）の一定量浮遊液（０．１ｍ
）を注入し、敗血症性炎症を起こさせた。敗血症性炎
症を示したそれらの家兎の右眼に、ゲンタマイシンとヒ
アルロン酸、ヒアレクチン画分の組合わせを滴下投与
し、左眼にはゲンタマイシンの生理食塩液の緩衝溶液を
投与した。処置（６時間毎に３滴）は感染菌注入直後か
ら開始し、感染が消失するまで続けた。家兎の眼は毎
日、スリット光源下に観察した。
結果 ゲンタマイシンのヒアルロン酸との併用による治療は、
抗生物質の単独投与に比べ、敗血症感染のより速かな消
失を来たした。この結論は、第８表に示した結果から明
らかである。
本発明に示したＨＡ画分を基剤として使用し得る眼科用
薬の例を以下に追加して示す。但し、本発明はこれらに
限定されるものではない。
抗生物質： クロラムフエニコール ネオマイシン オーレオマイシン ミキシンおよびポリミキシン バシトラシン マイセチン類 ホルモン： ナンドロロンおよび硫酸ナンドロロン 麻酔剤（局所）：ヘノキシネート（henoxinate） およびその塩酸塩 抗ウイルス剤： ヨードデオキシウリジン ヨードデオキシシチジン 抗炎症剤： デキサメサゾンおよびそのリン酸塩、
および 昇圧剤および血管 収縮剤： シネフリンおよびネオシネフリン 結論 以上の実験結果から、ヒアルロン酸ナトリウム塩溶液
（ヒアラスチンおよびヒアレクチンの両画分）は眼科用
薬の基剤として使用でき、異った生物学的作用を有する
種々の型の医薬品に対して効果的であると結論できる。
例えば、縮瞳作用、抗炎症作用、治癒作用および抗微生
物作用がそれぞれ報告されている。硝酸ピロカルピンの
ような抗線内症薬、トリアムシノロンのような抗アレル
ギーおよび抗炎症薬、ＥＧＦのような眼の組織治癒を促
進させる組織治癒および細胞増殖促進薬、ストレプトマ
イシンおよびゲンタマイシンのような抗生物質からなる
医薬品は、すべてＨＡを基剤として使用し、効果的に投
与できる。
種々の分子量のヒアルロン酸画分を基剤とする眼科用薬
製剤は宿主により完全に忍容され、従って感作現象を高
めることなく角膜表皮によく適合することが証明され
た。
また、生物学的生成物ヒアルロン酸が、基剤として使用
することにより主薬のインビボのバイオアベイラビリテ
イーを高め、それらの薬物の薬理学的活性を強めること
ができる有用な基剤であることは、次に示す実験結果か
らよく観察できる。
硝酸ピロカルピンの作用時間を延長し、縮瞳活性を増強
し、 デキストランにより生じた眼内炎症に対するトリアムシ
ノロンの抗炎症活性を増強し、しかもトリアムシノロン
単独と比較して、より短時間に炎症経過を軽減し、 角膜の表在性損傷に対する表皮成長促進因子（ＥＧＦ）
の防御活性を、明らかな相乗効果によって増強し、ＥＧ
Ｆ単独投与により回復時間に比べ治癒時間を短縮し、ま
た ゲンタマイシンのような抗生物質のインビボの生物学的
活性を増強する。
この生物学的ポリマー、ヒアルロン酸を、そのような性
質と作用の異なる薬物の基剤として使用することによ
り、他の多くの眼科用薬にその活性を導入することがで
きる。
下に示すのは、ヒアルロン酸の二つの画分、ヒアラスチ
ンとヒアレクチンだけを賦形薬として使用した粉末、点
眼剤、ゲル、クリーム、または挿入剤の剤型をとり得る
眼科用薬の各種の製剤例である。
製剤例１： ヒアルロン酸ナトリウム塩ヒアレクチン画分 １０mg リン酸緩衝液pH7,6Mを含有する生理食塩液 １０m を含有する“人工涙液”に使用し得る点眼薬。
製剤例２： ヒアルロン酸ナトリウム塩ヒアレクチン画分 ２０mg リン酸緩衝液pH7,6Mを含有する 生理食塩液 １０ｍ を含有する“人工涙液”に使用し得る点眼薬。
製剤例３： １００ｇ中に： ヒアルロン酸ナトリウム塩ヒアラスチン画分 ５５ｇ ヒアルロン酸ナトリウム塩ヒアレクチン画分 ３０ｇ ＥＧＦ 0.5ｇ 再蒸留水 23.5ｇ を含有するゲル剤。
製剤例４： ヒアルロン酸ナトリウム塩ヒアラスチン画分１００ mg 硝酸ピロカルピン ２mg を含有する硝酸ピロカルピンの１００mg挿入剤。
製剤例５： 粉末１００ｇ中に： ヒアルロン酸ナトリウム塩ヒアラスチン画分 ７０ｇ ヒアルロン酸ナトリウム塩 ヒアレクチン画分 28.5ｇ ストレプトマイシン 1.5ｇ を含有する局所用ストレプトマイシン含有粉末。
上記の製剤は代表例を示すべく記載したが、その他の作
用薬と、特殊用途に対する種々の投与剤型についても、
ヒアルロン酸画分、特にヒアレクチンまたはヒアラスチ
ン画分、またはヒアレクチン／ヒアラスチンの混合画
分、またはそれらのカリウム塩またはナトリウム塩を組
合わせることによっても、薬学的製剤を当然調製でき
る。
従って、ヒアルロン酸、特に実質的に純粋なヒアレクチ
ンおよびヒアラスチン画分は、眼科的に有用性または活
性を有する種々の薬物と組合わせて使用する効果的な基
剤または賦形薬であることが示された。ＨＡ画分を医薬
品基剤として含有する薬学的組成物は、ＨＡ画分が眼に
対する高度の耐容性と、角膜表皮に対する高度の適合性
を有することから特に有用である。
さらに、ＨＡ画分の使用により、眼科用薬のインビボの
生物学的活性を実質的に向上する手段が提供される。特
に、ヒアレクチンおよびヒアラスチンのＨＡ画分を使用
することは、これらの画分を眼に投与しても不都合な炎
症性の副作用を示さないことから、一層有用で、しかも
重要である。
【図面の簡単な説明】
第１図は、本発明者等の固定したヒアルロン酸画分の種
別を示すグラフである。 第２図はヒアルロン酸各画分の走化活性を示す棒グラフ
である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.5 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ａ６１Ｋ 47/36 Ｎ 7433−4Ｃ // Ｃ１２Ｓ 3/02 7732−4Ｂ

Claims (23)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】ヒアルロン酸を含有する、入手可能な出発
    物質からヒアルロン酸の混合物を抽出し、得られた混合
    物を分子ろ過にかけ平均分子量約３０，０００〜約７３
    ０，０００を有するヒアルロン酸画分を得ることからな
    り、上記画分は、３０，０００以下の分子量を有するヒ
    アルロン酸を実質的に含まないものである、実質的に純
    粋で、非炎症性のヒアルロン酸画分を製造する方法。
  2. 【請求項２】ヒアルロン酸の上記混合物を、分子量排出
    限界約３０，０００を有する膜を用いて分子ろ過にか
    け、３０，０００以上の大きさの分子量を有する分子を
    排除し、これによって上記膜上に、３０，０００以下の
    分子量を有するヒアルロン酸を実質的に含まない最初の
    ヒアルロン酸画分が留どまるものである、特許請求の範
    囲第１項記載の方法。
  3. 【請求項３】上記最初のヒアルロン酸画分が平均分子量
    約２５０，０００〜約３５０，０００を有するものであ
    る、特許請求の範囲第２項記載の方法。
  4. 【請求項４】上記最初のヒアルロン酸画分を、分子量排
    除限界約２００，０００を有する膜を用いて、別の分子
    限外ろ過にかけ、２００，０００以上の大きさの分子量
    を有する分子を排除し、限外ろ過の対象となる混合物の
    量が初期量の１０％に減少するまで限外ろ過を続け、膜
    を通過する混合物を採取して、その結果平均分子量約５
    ０，０００〜約１００，０００を有する２番目のヒアル
    ロン酸画分生成物を得るものである、特許請求の範囲第
    ３項記載の方法。
  5. 【請求項５】特許請求の範囲第４項の分子量排除限界約
    ２００，０００を有する膜を用いた限外ろ過後、膜上に
    残留した混合物を採取し、その結果、平均分子量約５０
    ０，０００〜約７３０，０００を有する３番目のヒアル
    ロン酸画分生成物を得ることからなる、特許請求の範囲
    第４項記載の方法。
  6. 【請求項６】ヒアルロン酸の上記混合物が、出発組織材
    料を溶媒抽出させることによって得られる、特許請求の
    範囲第１〜５項の何れか１項記載の方法。
  7. 【請求項７】溶媒抽出から得られたヒアルロン酸の混合
    物をついで酵素分解させる、特許請求の範囲第６項記載
    の方法。
  8. 【請求項８】酵素分解がパパインを用いて行なわれるも
    のである、特許請求の範囲第７項記載の方法。
  9. 【請求項９】平均分子量約３０，０００〜約７３０，０
    ００を有し、３０，０００以下の分子量を有するヒアル
    ロン酸を実質的に含まない、実質的に純粋で、非炎症性
    のヒアルロン酸画分。
  10. 【請求項１０】平均分子量約２５０，０００〜約３５
    ０，０００を有する、特許請求の範囲第９項記載の実質
    的に純粋で、非炎症性のヒアルロン酸画分。
  11. 【請求項１１】平均分子量約５０，０００〜約１００，
    ０００を有する、特許請求の範囲第９項記載の実質的に
    純粋で、非炎症性のヒアルロン酸画分。
  12. 【請求項１２】平均分子量約５００，０００〜約７３
    ０，０００を有する、特許請求の範囲第９項記載の実質
    的に純粋で、非炎症性のヒアルロン酸画分。
  13. 【請求項１３】特許請求の範囲第９〜１２項の何れか１
    項記載のヒアルロン酸画分のナトリウム塩またはカルシ
    ウム塩。
  14. 【請求項１４】平均分子量約３０，０００〜約７３０，
    ０００を有し、３０，０００以下の分子量を有するヒア
    ルロン酸またはその塩を実質的に含まない、実質的に純
    粋で、非炎症性のヒアルロン酸画分から成る、組織傷の
    回復促進剤。
  15. 【請求項１５】上記平均分子量が約２５０，０００〜約
    ３５０，０００である、特許請求の範囲第１４項記載の
    剤。
  16. 【請求項１６】上記平均分子量が約５０，０００〜約１
    ００，０００である、特許請求の範囲第１４項記載の
    剤。
  17. 【請求項１７】平均分子量約５００，０００〜約７３
    ０，０００を有する、実質的に純粋で、非炎症性のヒア
    ルロン酸画分またはその塩から成る、関節の外傷性およ
    び退行性疾患の処置、および関節機能の改善剤。
  18. 【請求項１８】関節内処置のための、特許請求の範囲第
    １７項記載の剤。
  19. 【請求項１９】平均分子量約５００，０００〜約７３
    ０，０００を有する、実質的に純粋で、非炎症性のヒア
    ルロン酸画分またはその塩から成る、眼球内液代替剤。
  20. 【請求項２０】平均分子量約３０，０００〜約７３０，
    ０００を有し、３０，０００以下の分子量を有するヒア
    ルロン酸を実質的に含まない、実質的に純粋で、非炎症
    性のヒアルロン酸画分から成る、眼疾患活性を有する薬
    剤の眼投与用の医薬担体。
  21. 【請求項２１】上記平均分子量が約５００，０００〜７
    ３０，０００である、特許請求の範囲第２０項記載の担
    体。
  22. 【請求項２２】上記薬剤が硝酸ピロカルピン、トリアム
    シノロン、表皮成長因子、ストレプトマイシンおよびゲ
    ンタマイシンから成る群から選択されたものである、特
    許請求の範囲第２０項記載の担体。
  23. 【請求項２３】上記薬剤が抗生物質、抗緑内障剤、抗ア
    レルギー剤、抗炎症剤、または目の治療促進剤である、
    特許請求の範囲第２０項記載の担体。
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