NO174277B - Fremgangsmaate for fremstilling av et hyaluronsyresalt - Google Patents

Abstract

Farmasøytiske preparater for lokal administrasjon inneholdende en farmakologisk aktiv substans sammen med hyaluronsyre eller en molekylvektfraksjon derav. Hyaluronsyren kan foreligge i form av den frie syren eller kan være et salt av et alkali- eller jordalkalimetall, magnesium, aluminium eller ammonium, eller i form av et salt med én eller flere, farmakologisk aktive substanser.

Description

Foreliggende oppfinnelse gjelder fremgangsmåte for fremstilling av farmasøytisk aktive hyaluronsyresalter som kan anvendes i medikamenter for lokal anvendelse og mere spesielt medikamenter som inneholder: 1. En aktiv, farmakologisk substans eller en blanding av farmakologiske substanser egnet for lokal administrasjon og 2. en bærer som omfatter et salt av hyaluronsyre med en farmakologisk substans, eventuelt sammen med ytterligere, konvensjonelle bindemidler for farmasøytiske preparater for lokal anvendelse.

Anvendelsen av et lokalt aktivt medikament kan være en nytte eiler hjelp, spesielt i dermatologien, ved sykdommer i slimhinnene generelt og spesielt slimhinner i øre- og nese-hulrommene, sykdommer i det ytre øret og spesielt sykdommer i øyets ytre overflate. Anvendelse av disse lokale medikamentene er spesielt tilrådelige i pediatrien og på veterinærområdet.

Fordelene med en terapi med medikamenter som inneholder hyaluronsyresalter fremstilt ifølge foreliggende oppfinnelse, skyldes en mere effektiv bærer for medisinene, som fremmes av det sure polysakkaridet i hyaluronsyrebestanddelen og en bedre biotilgjengelighet for den aktive substansen sammenlignet med den som oppnås med andre farmasøytiske preparater. Videre har medikamentene som inneholder hyaluronsaltene fremstilt ifølge oppfinnelsen særlig betydning som oftalmiske medikamenter, fordi det på grunn av de ovenfor nevnte kvaliteter, forekommer en ytterligere spesiell forenlighet med hornhinne-epitelet og derfor et meget høyt toleransenivå, uten sensibiliserings-virkninger. Når medikamentene administreres i form av konsentrerte løsninger med elastisk-viskøse egenskaper eller i fast form, er det mulig å oppnå filmer på hornhinne-epitelet som er homogene, stabile, helt gjennomskinnelige og som sitter godt, hvilket garanterer forlenget biotilgjengelighet for medisinen, og derved utgjør utmerkede preparater med en forlenget effekt.

Slike oftalmiske medikamenter er av spesiell verdi på veterinærområdet, tatt i betraktning at det for tiden ikke finnes veterinærspesialiteter for bruk i øyet som inneholder kjemoterapeutika. Det brukes derfor isteden preparater for human bruk, og disse garanterer ikke alltid et spesielt aktivitetsområde eller passer for de spesielle tilstander behandlingen skal gjennomføres for.

Dette er for eksempel tilfelle når det gjelder terapi for infektiøs keratoconjunctivitt, rosa øye eller IBK, en infeksjon som i hovedsak påvirker kveg, sauer og geiter. Disse tre arter har sannsynligvis spesielle etiologiske faktorer felles. Spesielt hos kveg synes den viktigste mikroorganismen som er involvert å være Moraxelle bovis (selv om andre virkemidler av virusopprinnelse ikke skal utelukkes, som for eksempel Rhinotracheitis virus, Micoplasma, Rickettsia og Chlamydia når det gjelder sauer og Rickettsia når det gjelder geiter). Sykdommen manifesterer seg i en akutt form og har en tendens til å spre seg raskt. I de første stadiene er symptornatologien karakterisert ved blepharospasme og utstrakt tåredannelse fulgt av purulent eksudat, conjunctivitt og keratitt, ofte fulgt av feber, redusert appetitt og melkeproduksjon. Skader i hornhinnen er spesielt alvorlig og kan i sluttstadiene til og med forårsake perforeringer av selve hornhinnen. Det kliniske for-løpet varierer fra noen få dager til flere uker.

Et bredt område av kjemoterapeutiske midler anvendes for behandling, administrert både lokalt (ofte i forbindelse med antiinflammatoriske steroider), og.systemisk. Blant disse er følgende: tetracykliner, som for eksempel oxytetracyklin, penicilliner, som for eksempel cloxacillin og benzylpenicillin, sulfamider, polymyxin B (sammen med micronazol og prednisolon), kloramfenikol, tylosin og kloromycetin. På tross av dens til-synelatende enkelhet representerer lokal behandling av sykdommen fortsatt et uløst problem, siden det av en eller annen grunn har vist seg umulig inntil nå å oppnå øyepreparater med konsentrasjoner av antibiotika eller sulfamider som er terapeutisk effektive i tåresekresjonen. Dette er ganske forståelig når det gjelder løsninger, når man tar i betraktning den i hovedsak hengende stilling til hodet hos disse dyrene. Men det gjelder også halvfaste medikamenter, siden bindemidlene som normalt brukes i dem, ikke har de kvaliteter som er nødvendige for å hefte til hornhinnens overflate, da de ikke vanligvis har en tilstrekkelig høy konsentrasjon av aktiv substans og ikke kan oppnå perfekt fordeling (det vil si nærvær av en fordelingsgradient). Disse mangler ved konvensjonelle collirium i oftalmisk bruk er beskrevet av Slatter et al., i "Austr. vet. J.," 1982, 59 (3), sider 69-72.

En fordel med foreliggende oppfinnelse er at den har utviklet nye typer av collirium i hvilke de ovennevnte mangler er overvunnet. Bruken av hyaluronsyre som en bærer for oftalmiske medisiner muliggjør sammensetning av utmerkede preparater som er fri for konsentrasjonsgradienter av den aktive substans og derfor er helt homogene, transparente og klebende til hornhinne-epitelet, uten sensibiliserings-virkninger, med utmerket binding av den aktive substansen og muligens med en langtidseffekt.

De ovenfor nevnte egenskaper til medikamentene som inneholder hyaluronsyresaltene fremstilt ifølge oppfinnelsen, kan naturligvis også anvendes på andre områder enn oftalmologi. Som allerede nevnt kan de anvendes i dermatologien og i sykdommer som påvirker slimhinnene, som i munnen, for eksempel i odontologi. De kan også anvendes for å oppnå en systemisk effekt på grunn av virkningen av transkutan reabsorbsjon, for eksempel i suppositorier. Alle disse anvendelsene er mulige både i human- og veterinærmedisinen. I humanmedisinen er de nye medikamentene spesielt egnede for anvendelse i pediatrien. Medikamentene som fremstilles ifølge foreliggende oppfinnelse er brukbare i hvilke som helst terapeutiske anvendelser.

Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer en fremgangsmåte for fremstilling av et farmasøytisk aktivt hyaluronsyresalt ved at A) en vandig løsning av et bariumsalt av hyaluronsyre kombineres med et sulfat av en farmasøytisk aktiv substans og B) det utfelte bariumsulfatet separeres for å oppnå det farmasøytisk aktive hyaluronsyresaltet i vandig løsning, idet det som utgangsmateriale anvendte bariumsalt av hyaluronsyre hensiktsmessig er fremstilt ved at

a) et cetylpyridiniumsalt av hyaluronsyre eller en molekylvektfraksjon derav behandles med en vandig løsning

av bariumklorid og

b) den vandige løsningen separeres og det tilsettes etanol for derved å utfelle bariumsaltet av hyaluronsyren

eller av en molekylvektfraksjon derav.

Medikamenter som inneholder hyaluronsyresaltene fremstilt ifølge foreliggende oppfinnelse inneholder i hovedsak to bestanddeler: Bestanddel (1) - en farmasøytisk aktiv substans, inkludert som diskutert nedenfor, blandinger av forskjellige slike substanser.

Bestanddel (2) - forskjellige salter av hyaluronsyre eller molekylvektfraksjoner derav.

Bestanddel ( 1) - Farmasøytisk substans: Bestanddel (1) kan fremfor alt kategoriseres med henblikk på dens bruk i de forskjellige terapiområdene, idet det startes med distinksjon mellom human- og veterinærmedisin og så spesifisere de forskjellige anvendelsessektorer når det gjelder organer eller vev som skal behandles, som for eksempel oftalmologi, dermatologi, otorhinolaryngologi, obstetrikk, angiologi, nevrologi eller en hvilken som helst type patologi i de indre organene som kan behandles lokalt, som for eksempel rektale anvendelser. Ifølge et spesielt aspekt brukes den farmakologiske aktive substans (1) først og fremst oftalmisk. Ifølge et annet kriterium må den farmakologisk aktive substansen (1) være klar når det gjelder dens effekt og kan derfor, for eksempel anvendes som et anestetisk, analgetisk, vasokonstriktor-, antibakterielt, antivirus- eller antiinflammatorisk middel. For det oftalmiske området kan det spesielt være indikert for eksempel for dens miotiske, antiinflammatoriske, sårhelende og antimikrobielle effekter.

Bestanddelen (1) kan også fremstilles som en blanding av to eller flere aktive substanser. For eksempel kan i oftalmologi et antibiotikum forbindes med et antiflogistikum og en vasokonstriktor eller flere antibiotika kan være forbundet med ett eller flere antiflogistika, eller ett eller flere antibiotika kan være forbundet med et mydiatrisk, et miotisk, et sårhelende eller et antiallergisk middel. For eksempel er det mulig å bruke følgende forbindelser av oftalmiske medisiner: (a) kanamycin + fenylefrin + fosfat-dexametason; (b) kanamycin + fosfat-betametason + fenylefrin, eller lignende forbindelser med andre antibiotika som anvendes i oftalmologien, som for eksempel rolitetracyklin, neomycin, gentamicin og tetracyklin.

I dermatologien er det mulig å bruke som aktiv substans, bestanddel (1) eller blandinger av forskjellige antibiotika, som for eksempel erythromycin, gentamicin, neomycin, gramicidin, polymyxin B, eller blandinger av slike antibiotika med antiinflammatoriske midler, for eksempel kortikosteroider. For eksempel blandinger omfattende: (a) hydrocortison + neomycin; (b) hydrocortison + neomycin + polymyxin B + gramicidin; (c) dexametason + neomycin; (d) fluorornetolon + neomycin; (e) prednisolon + neomycin; (f) triamcinolon + neomycin + gramicidin + nistatin, eller en hvilken som helst annen blanding som anvendes i konvensjonelle preparater for dermatologi. Blandingene av forskjellige aktive substanser er naturligvis ikke begrenset til dette området, men i hvert av de ovenfor nevnte felter av medisinen er det mulig

å bruke blandinger som er lik de som allerede er i bruk for kjente farmasøytiske preparater på fagområdet.

Eksempler på den farmakologisk aktive substans (1) for bruk i oftalmiske medikamenter er: basiske og ikke-basiske antibiotika, for eksempel aminoglukosidika, makrolider, tetracyklin og peptider, som for eksempel gentamicin, neomycin, streptomycin, dihydrostreptomycin, kanamycin, amikacin, tobra-mycin, spectinomycin, erythromycin, oleandomycin, carbomycin, spiramycin, oxytetracyklin, rolitetracyklin, bacitracin, polymyxin B, gramicidin, colistin, kloramfenikol, lincomycin, vancomycin, novobiocin, ristocetin, clindamycin, amfotericin B, griseofulvin, nystatin og muligens deres salter, som for eksempel sulfater eller nitrater, eller blandinger av de samme eller med andre aktive prinsipper, som for eksempel de som er nevnt nedenfor.

Andre oftalmiske medisiner som med fordel kan brukes

er: andre anti-infektive midler som for eksempel dietylcarbamazin, mebendazol, sulfamider, som for eksempel sulfacetamid, sulfadiazin, sulfisoxazol; antivirus- og anti-tumor midler som for eksempel jododeoxyuridin, adenin-arabinosid, trifluorothtmidin, aciclovir, etyldeoxyuridin, bromvinyldeoxyuridin, 5-jod-5<1->amino-2<1>,5'-dideoxyuridin; antiinflammatoriske steroider, som for eksempel dexametason, hydrocortison, prednisolon, fluorometolon, medryson og muligens deres estere, for eksempel estere av fosforsyre, ikke-steroide antiinflammatoriske midler, for eksempel indometacin, oxyfen-butazon, flurbiprofen; sårhelende midler som for eksempel den epidermale vekstfaktor EGF; lokal anestetika, som for eksempel benoxinat, proparacain og muligens deres salter, kolinergiske agonist (promotor)-medisiner som for eksempel pilocarpin, meta-cholin, carbaylocholin, aceclidin, fysiostigmin, neostigmin, demecarium og muligens deres salter, kolinergiske antagonistmedisiner som for eksempel atropin og dets salter, de adrenergiske agonist (promotor)-medisiner som for eksempel nor-adrenalin, adrenalin, naphozolin, metoxamin og muligens deres salter og adrenergiske antagonistmedisiner som for eksempel propranolol, timolol, pindolol, bupranolol, atenolol, metoprolol, pindolol, bupranolol, atenolol, metoprolol, oxprenolol, practolol, butoxamin, sotalol, budarin, labetalol og muligens deres salter.

Som bemerket ovenfor kan den aktive bestanddel (1) ha form av en blanding av to eller flere aktive substanser. Eksempler på aktive substanser som kan anvendes alene eller i blanding med hverandre eller med andre aktive stoffer i dermatologien er: terapeutiske midler som for eksempel anti-infektive, antibiotiske, antimikrobielle, antiinflammatoriske, cytostatiske, cytotoksiske, antivirus, anestetiske midler, og profylaktiske midler, som for eksempel solbeskyttere, deodo-ranter, antiseptika og desinfiserende midler. Av antibiotika skal de følgende noteres: erythromycin, bacimycin, gentamicin, neomycin, aureomycin, gramicidin og deres blandinger, av de antibakterielle midlene og desinfiseringsmidlene: nitrofurazon, mafenid, klorhexidin, og derivater av 8-hydroksykinolin og muligens deres salter, av de antiinflammatoriske midlene, fremfor alt kortikosteroidene som for eksempel prednisolon, dexametason, flumetason, clobetasol, triamcinolon-acetonid, betametason eller deres estere, som for eksempel valerianatene, benzoatene, dipropionatene, av cytotoksika, bluorouracil, metotrexat, podofyllin, av anestetika, dibucain, lidocain, benzocain.

Listen er naturligvis bare for illustrerende formål og et hvilket som helst annet middel som er beskrevet i litteraturen kan anvendes.

Av de eksempler som er nevnt for oftalmologi og dermatologi, er det mulig ved hjelp av analogi å konkludere med hvilke av de medikamenter som er fremstilt ifølge foreliggende oppfinnelse som kan anvendes på det ovenfor nevnte felt av medisinen som for eksempel i otorhinolaryngologi eller odontologi eller i indremedisin, for eksempel i endekrinologi, hvor det er mulig å gjennomføre behandlinger med preparater for intradermal absorbsjon eller absorbsjon gjennom slimhinnen, for eksempel rektal eller intranasal absorbsjon, for eksempel som nesespray eller

-inhaleringer i munnhulen og i svelget.

Disse preparater kan derfor eksempelvis være anti-inf lammatoriske, eller vasokonstriktorer eller vasopressorer, som for eksempel de som allerede er nevnt for oftalmologi, vitaminer, antibiotika, som for eksempel de som er nevnt ovenfor, hormoner, kjemoterapeutika, antibakterielle midler, osv., inkludert de som er nevnt ovenfor for bruk i dermatologi. Bestanddel ( 2) - Hyaluronsyrebærer: Som bemerket ovenfor omfatter medikamentene som bestanddel (2) hyaluronsyresalter og molekylvektfraksjoner derav. Hyaluronsyre (heretter noen ganger referert til som "HY") er et naturlig heteropolysakkarid som består av alternerende rester av D-glucuronsyre og N-acetyl-D-glucosamin. HY er tilstede i pericellulære geler, i den fundamentale, ekstracellulære substansen i bindevev, i hvirveldyrorganismer, i leddvannet i leddene, i glasslegemet, i menneskets navlevev, i hanekammer og i noen bakterier. Dens molekylvekt er ca. 8-13 millioner.

Den første undersøkelsen som ble utført med HY var av Balazs (se US-patent 4.141.973), som isolerte en HY-fraksjon som kunne være en erstatning for endobulbare-væsker og egnet for andre terapeutiske anvendelser. Hyaluronsyre og dens mole-kylvektf raks joner med lavere molekylvekter har vist seg meget anvendbar i medisinen og en kosmetisk anvendelse er også aktuell (se for eksempel, Balazs et al., Cosmetics & Toiletries, italiensk utgave, nr. 5/84). Den har spesielt vært brukt som et terapeutisk middel i terapier for arthropatier, som for eksempel på veterinærområdet for å helbrede artritt hos hester (Acta Vet. Scand., 167, 379 (1976).

Hyaluronsyre og dens molekylfraksjoner er brukt i oftalmisk kirurgi som terapeutikum, hjelpe- og erstatningsmidler for naturlige organer og vev (se for eksempel E. A. Balazs et al., Modern Problems in Ophtalmology, 1_0, 3 (1970), E. B. Strieff, S. Karger, utgivere Basel og Balazs et al., Viscosurgery and the Use of Sodium Hyaluronate During Intraocular Lens Implantation, Paper presented at the International Congress and First Film Festival on Intraocular Implantation, Cannes, 1979).

I den publiserte europeiske patentsøknad nr. 138572 beskrives en molekylfraksjon av hyaluronsyre som kan anvendes for henholdsvis intraokulære og intraartikulære injeksjoner, egnet for erstatning av de endobulbare væsker i øyet og for terapi av arthropatier.

I motsetning til denne terapeutiske anvendelsen eller som et plastisk hjelpemiddel i kirurgien eller i kosmetikken, anvendes hyaluronsyre eller dens molekylfraksjoner i foreliggende oppfinnelse som bærestoffer for administrasjon av farmakologisk aktive substanser for lokal bruk.

Som et bærestoff som skal anvendes som bestanddel (2) ved fremgangsmåten ifølge foreliggende oppfinnelse, kan hyaluronsyre av en hvilken som helst opprinnelse anvendes, som for eksempel de syrer som ekstraheres fra de ovenfor nevnte, naturlige startmaterialene, inkludert hanekammer. Fremstillingen av råekstrakter av slike syrer er beskrevet i litteraturen. Fortrinnsvis skal det anvendes renset hyaluronsyre. I fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen er det mulig isteden for integrerte hyaluronsyrer som oppnås direkte ved ekstraksjon fra de organiske materialene, å anvende fraksjoner av de samme med molekylvekter som kan variere meget, som for eksempel fra 90 % (MV = 11,7 - 10,4 millioner til 0,23 % (MV = 30.000) av molekylvekten til en integrert syre med en molekylvekt på 13 millioner, fortrinnsvis mellom 5 % og 0,23 %. Slike fraksjoner kan oppnås ved hjelp av forskjellige fremgangsmåter, som for eksempel ved hydrolysering, oksydering eller enzymatiske, kjemiske midler, fysikalske fremgangsmåter, som for eksempel mekaniske eller ved bestråling, og dannes derfor ofte i de samme rensefremgangsmåter av de primære ekstraktene (se for eksempel Balazs et al., Cosmetics and Toiletries, sitert ovenfor). Separeringen og rensingen av de oppnådde fraksjonene oppnås for eksempel ved molekylfiltrering.

Av spesiell betydning for anvendelse som bærer (2) ved fremgangsmåten ifølge foreliggende oppfinnelse er to rensede fraksjoner som kan oppnås fra hyaluronsyre, for eksempel fra hanekammer, og er kjent som Hyalastin og Hyalectin. Den fraksjon som er kjent som Hyalastin, har.en gjennomsnittlig molekylvekt på mellom 50.000 og 100.000. Hyalectin har en gjennomsnittlig molekylvekt på mellom 500.000 og 730.000. En kombinert fraksjon av disse to fraksjoner er også isolert og karakterisert ved å ha en gjennomsnittlig molekylvekt på fra 250.000 til 350.000. Denne kombinerte fraksjon kan oppnås med et utbytte på 80 % av total tilgjengelig hyaluronsyre fra det spesielle startmaterialet, mens fraksjonen Hyalectin kan oppnås med et utbytte på 30 % og fraksjonen Hyalastin med et utbytte på 50 % av start-HY.

Den foretrukne hyaluronsyre for anvendelse er en molekylvektfraksjon med en molekylvekt som grovt varierer fra 30.000 til 13 millioner og fortrinnsvis fra 30.000 til 730.000. De mest foretrukne hyaluronsyrefraksjoner har en molekylvekt på fra 50.000 til 100.000, eller fra 500.000 til 730.000, eller en kombinert fraksjon med en molekylvekt på fra 250.000 til 350.000. Det er viktig at disse foretrukne fraksjonene er i det vesentlige fri for hyaluronsyre med lav molekylvekt på mindre enn 30.000 og, derfor, er fri for inflammatoriske bireaksjoner når den administreres. (Ytterligere henvisninger heretter til hyaluronsyre eller HY menes å omfatte der det stemmer med den spesielle teksten, både hyaluronsyre og molekylvektfraksjoner derav).

Ved fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen anvendes bariumsalter av hyaluronsyre. I tillegg kan man anvende salter med andre metaller, som for eksempel alkalimetall (natrium, kalium, litium), andre jordalkalimetaller (kalsium, strontium), magnesium eller aluminium. Disse salter kan være støkiometrisk nøytrale i den betydning at alle syrefunksjonene er saltdannet, eller partialsalter eller -syrer, i hvilke bare et visst antall av syrefunksjonene er saltdannet med de ovenfor nevnte metallene. Slike salter oppnås lett, for eksempel ved å omsette HY eller de ovenfor nevnte fraksjoner med den beregnede mengde base, og det er også mulig å anvende blandede salter som stammer fra forskjellige baser.

I tillegg til de ovenstående saltene er det også mulig å anvende salter av HY og forbindelser som grovt kan anses som ammonium eller substituert ammonium (aminer), for eksempel mono-, di-, tri- og tetra-alkylammonium der alkylgruppene fortrinnsvis har mellom 1 og 18 karbonatomer eller arylalkyler med samme antall karbonatomer i den alifatiske delen og der aryl betyr en benzenrest, eventuelt substituert med mellom 1 og 3 metyl-, halogen- eller hydroksygrupper. Disse ammonium- eller substituerte ammoniumsalter av HY fremstilles ved kjemisk reaksjon mellom hyaluronsyre og primære, sekundære eller tertiære amindeler eller ammoniumhydroksyddeler av forbindelser eller medisiner med farmasøytisk aktivitet, det vil si med disse deler av forbindelsene som omfatter aktiv bestanddel (1). Som med de ovenfor diskuterte saltene, kan også disse saltene være støkiometrisk nøytrale hvor alle syrefunksjonene er saltdannet, eller kan være partialsalter eller -syrer, og kan omfatte blandede salter som stammer fra forskjellige baser.

Medikamentpreparater som kombinerer bestanddeler ( 1) og ( 2) ;

Det er forskjellige muligheter for gjennomføring av fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen for fremstilling av medikamentene inkludert: (a) ved å bruke en nøytral eller sur, aktiv substans som bestanddel (1) blandet med hyaluronsyre eller en molekylvektfraksjon derav, eller deres metallsalter, (b) ved å bruke partialsalter av HY og en basisk, aktiv substans som bestanddel (1) som etterlater restsyregrupper av HY frie eller nøytraliserte med de ovenfor nevnte metaller eller baser, (c) ved å bruke støkiometrisk nøytrale salter av HY og en basisk substans som bestanddel (1), muligens tilsetning av HY eller et av dens partial- eller total (nøytral) -metallsalter, (d) ved å bruke støkiometrisk nøytrale salter av HY og en basisk substans som bestanddel (1), og tilsette ytterligere mengder av bestanddel (1) og (e) ved å bruke ad libitum-blandinger av de salter eller av de blandinger som er beskrevet ovenfor.

En spesiell form for medikament som fremstilles ifølge oppfinnelsen representeres ved blandinger av den farmakologisk aktive substans bestanddel (1) og hyaluronsyrer eller molekylfraksjoner derav når den nevnte aktive substans (1) er av basisk natur, for eksempel i tilfelle av basiske antibiotika. I dette tilfelle danner hyaluronsyrebestanddelen (2) og den aktive substans (1) sammen støkiometriske partialsalter, eller syre-salter, i hvilke en alikvot av alle syregrupper i HY-bestanddelen (2) er saltdannet med de basiske gruppene i den aktive bestanddel (1), eller støkiometrisk nøytrale salter, i hvilke alle gruppene i HY-bestanddelen (2) er saltdannet, eller blandinger av disse nøytrale saltene med en ytterligere mengde av den basiske aktive substans (1).

Om det for formålene ifølge foreliggende oppfinnelse derfor anvendes en basisk aktiv substans (1), er det mulig å erstatte blandingene av bestanddelene (1) og (2) med de ovenfor nevnte sure saltene eller de som er støkiometrisk nøytrale, eller naturligvis blandinger av slike salter både med bestanddel (1)

og med bestanddel (2).

Blandinger av medisiner med hverandre og muligens med andre stoffer kan også anvendes som den aktive bestanddel (1) ved fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen. Dersom det isteden for bare én aktiv substans (1) anvendes blandinger av aktive substanser, som for eksempel de som er nevnt ovenfor, kan saltene av de basiske, aktive substansene og hyaluronsyren og dens molekyl-vektf raks joner være blandede salter av én eller flere av slike basiske substanser eller muligens blandede salter av denne typen med et visst antall av andre sure grupper i HY-polysakkaridet som er saltdannet med de ovenfor nevnte metaller eller baser. Det er eksempelvis mulig å fremstille salter av hyaluronsyre eller én av molekylfraksjonene Hyalastin eller Hyalectin med en viss prosent saltdannede syregrupper med antibiotikumet kanamycin, en annen prosentdel saltdannet med vasokonstriktoren fenylefrin, mens en gjenværende prosentdel av syregrupper er frie eller saltdannet eksempelvis med natrium eller et annet av de ovenfor nevnte metaller^ Det er også mulig å blande denne type av blandet salt med andre mengder av hyaluronsyre eller dens fraksjoner eller deres metallsalter, som angitt ovenfor for det medikament som inneholder salter av bare én aktiv substans og de foran nevnte, sure polysakkaridene.

Det er derfor mulig å anvende de ovenfor nevnte salter, isolert og muligens renset til fast, vannfri tilstand, som et amorft pulver. Når pulveret kommer i kontakt med det vev som skal behandles, danner pulveret en konsentrert, vandig løsning av en gelatinøs karakter, med en viskøs konsistens og med elastiske egenskaper. Disse kvaliteter bibeholdes også ved sterkere for-tynninger og det kan derfor isteden for de ovenfor nevnte, vannfrie saltene anvendes løsninger i vann med forskjellige konsentrasjonsgrader eller i saltløsning, muligens med tilsetning av andre farmasøytisk godtagbare bindemidler eller additiver, som for eksempel andre mineralsalter for å regulere pH og det osmotiske trykket. Det er også naturligvis mulig å anvende saltene for å fremstilles geler, stikkpiller, kremer eller salver, i hvilke det er andre bindemidler eller ingredienser som anvendes i konvensjonelle sammensetninger av disse farma-søytiske preparatene. Det foretrekkes medikamenter som fremstilles med et innhold av hyaluronsyre, molekylvektfraksjoner derav eller deres mineralsalter eller deres partial- eller nøytralsalter med den aktive substansen (1) som den eneste bærer (med et mulig unntak for et vandig løsnings-middel) .

De kvantitative vektforholdene mellom de to bestanddelene (1) og (2) som fremstilles ifølge oppfinnelsen kan variere innen vide grenser og dette avhenger naturligvis også av naturen til de to bestanddelene og i første rekke av den aktive substansen. Slike grenser er for eksempel forhold på 0,01:1 og 100:1 mellom de to bestanddelene (1) og (2). Varia-sjonsområdet er imidlertid fortrinnsvis mellom grenser på 0,01:1 og 10:1 for de to bestanddelene og spesielt mellom 0,1:1 og 2:1.

Medikamentene kan foreligge i fast form, for eksempel frysetørkede pulvere som inneholder bare de to bestanddelene i blanding eller pakket separat.

I fast form danner slike medikament i kontakt med det epitel som skal behandles mer eller mindre konsentrerte løsninger ifølge naturen til det spesielle epitel med samme egenskaper som de tidligere fremstilte løsninger in vitro. Slike løsninger fremstilles fortrinnsvis med destillert vann eller steril saltløsning og inneholder fortrinnsvis ingen andre farmasøytiske bærere ved siden av hyaluronsyre eller et av dens salter. Konsentrasjonene til slike løsninger kan også variere innen vide grenser, for eksempel mellom 0,01 og 75% både for hver av de to bestanddelene separat, og for deres blandinger eller salter. Løsninger med en uttalt elastisk-viskøs karakter er spesielt foretrukket, for eksempel med et innhold på mellom 10 og 90 % av medikamentet eller av hver av dets bestanddeler. Medikamenter av denne type er spesielt viktig, både i en vannfri form (frysetørkede pulvere) eller konsentrerte løsninger eller fortynnet i vann eller salt-løsning, eventuelt med tilsetning av additiv eller hjelpe-substanser, som for eksempel spesielle desinfiserende substanser eller mineralsalter som opptrer som buffere eller andre, for oftalmisk bruk.

Blant medikamentene som spesielt velges, er de som har en surhetsgrad som er egnet for det stedet der de skal anvendes, det vil si med en fysiologisk tålbår pH. Justering av pH, for eksempel i de ovenfor nevnte salter av hyaluronsyre med en basisk aktiv substans, kan gjennomføres ved på passende måte å regulere mengdene av polysakkarid, av dets salter og av selve den basiske substansen. Om eksempelvis surheten til et hyaluronsyresalt med en basisk substans skulle være for høy, nøytraliseres overskuddet av de frie syregruppene med de ovenfor nevnte uorganiske basene, for eksempel med natrium eller kalium eller ammoniumhydrat.

Følgende blandinger er eksempler på preparater som inneholder hyaluronsyresalt som er fremstilt ifølge foreliggende oppfinnelse og som omfatter en forbindelse av en aktiv farmasøytisk bestanddel (1) og bærerbestanddelen (2) omfattende hyaluronsyre.

HY-natriumsalt (Hyalastin-fraksjon), 55 g HY-natriumsalt (Hyalectin-fraksjon), 30 g

EGF 0,5 g

to ganger destillert vann 23,5 g

Blanding 2 - En 100 mg stikkpille med Pilocarpin-nitrat inneholdende : HY-natriumsalt (Hyalastin-fraksjon), 100 mg Pilocarpin-nitrat, 2 mg

Blanding 3 - Et pulver for lokal applikasjon inneholdende Streptomycin:

100 g pulver inneholder:

HY-natriumsalt (Hyalastin-fraksjon), 70 g HY-natriumsalt (Hyalectin-fraksjon), 28,5 g Streptomycin 1,5 g

Blanding 4 - En 100 g stikkpille med Pilocarpin inneholdende: Blandet salt av hyaluronsyre med pilocarpin og med natrium (se fremstilling i Eksempel 18,

100 mg

Blanding 5 - Et Collirium inneholdende Gentamycin og

Naphazolin, av hvilket 100 ml inneholder: Blandet salt av hyaluronsyre med gentamycin, med naphazolin og med natrium (se fremstilling i Eksempel 16), 2,910 g

propyloksybenzoat, 0,050 g

natriumfosfat, 1,500 g

destillert vann, q.b.a. 100 ml

Blanding 6 - Et Collirium med Kloramfenikol, Neomycin, Fenylefrin, Nitrofurazon, av hvilket 100 ml inneholder: - blandet salt av hyaluronsyre med neomycin, med fenylefrin, og med natrium (se fremstilling Eksempel 17), 2,890 g kloramfenikol, 0,500 g

- nitrofurazon, 0,02 g

- destillert vann, q.b.a. 100 ml

Blanding 7 - Et Collirium med Dexametasonfosfat, Kanamycin E

Fenylefrin, av hvilket 100 ml inneholder:

blandet salt av hyaluronsyre med kanamycin og fenylefrin (se fremstilling Eksempel 15),

3,060 g

Dexametasonfosfat-natriumsalt, 0,100 g

- metyl-p-hydroksybenzoat, 0,060 g

- destillert vann, q.b.a. 100 ml.

Fremst i11inqsmetoder

Oppfinnelsen gjelder en ny fremgangsmåte for fremstilling av hyaluronsyresalter, utgående fra hyaluronsyre-bariumsalt. Den nye fremgangsmåten gjelder de salter som er løselige i vann og spesielt hyaluronsyresalter med aktive substanser, hvori alle karboksylgruppene i hyaluronsyren kan være saltdannet eller bare en del av gruppene er saltdannet.

I partialsaltene kan de gjenværende karboksylgruppene i hyaluronsyren være frie eller saltdannet med andre aktive substanser eller med alkalimetaller, magnesium, aluminium, ammonium eller substituert ammonium.

Den nye fremgangsmåten består i å fremstille en vandig løsning av bariumsaltet av en hyaluronsyre, og tilsette en vandig løsning inneholdende et antall svovelsyre-ekvivalenter, totalt eller delvis saltdannet med én eller flere organiske eller uorganiske baser, hvori antallet svovelsyre-ekvivalenter tilsvarer antallet hyaluronsyre-ekvivalenter som er tilstede i den vandige bariumsaltoppløsningen. Den vandige løsningen av hyaluronsyresalt oppnås ved filtrering av det separerte bariumsulfatet. Det vil si ved filtrering av det separerte bariumsulfatet er det mulig å oppnå den vandige løsningen av hyaluronsyresaltet fra hvilken saltet i sin tørre form kan oppnås ved konsentrering.

Bariumsaltet av hyaluronsyre er ikke beskrevet i litteraturen og har overraskende vist seg å være løselig i vann. Det kan lett fremstilles ved å behandle det ikke meget løselige hyaluronatet av cetylpyridinium med en vandig løsning av bariumklorid og utfelle hyaluronatet av barium fra løsningen med etanol eller et annet passende løsningsmiddel. Cetylpyridinium-hyaluronatet er et mellomprodukt som vanligvis anvendes i fremgangsmåter for fremstilling av hyaluronsyre for å separere og rense hyaluronsyren som er ekstrahert fra forskjellige organiske materialer.

Den vandige løsningen, som inneholder et antall svovelsyre-ekvivalenter, helt eller delvis saltdannet med én eller flere organiske baser, fremstilles ved å oppløse de nøytrale sulfatene av basene i vann og eventuelt tilsette svovelsyre. Skulle det være en løsning dannet av nøytrale sulfater av én eller flere organiske eller uorganiske baser, inneholdende et antall svovelsyre-ekvivalenter tilsvarende antallet hyaluronsyre-ekvivalenter tilstede i den vandige løsningen av bariumsaltet, ville sluttresultatet være et støkiometrisk nøytralt salt av hyaluronsyre med de baser som er tilstede i den tilsvarende vandige løsningen (sulfater). Dersom et støkiometrisk partialsalt eller syresalt av hyaluronsyre er ønsket, skal svovelsyre tilsettes til den vandige løsningen av sulfater, eller basiske syresulfater skal anvendes.

Oppfinnelsen illustreres ved hjelp av følgende eksempler.

Eksempel 1 - Fremgangsmåte for oppnåelse av en blanding av fraksjonene Hyalastin og Hyalectin i form av bariumsalter og uten noen inflammatorisk aktivitet.

Friske eller frosne hanekammer (3000 g) males i en kjøtt-kvern og homogeniseres så omsorgsfullt i en mekanisk homo-genisator. Den oppnådde pasta behandles i en beholder av rust-fritt stål (AISI 316) eller i glass med 10 volumer vannfritt aceton. Det hele omrøres i 6 timer med en hastighet på 50 rpm. Det får stå å skille seg i 12 timer og acetonet kastes ved hjelp av hevert. Acetonekstraksjonen fortsettes inntil det kastede acetonet har nådd den riktige fuktighetsgraden (Karl-Fischer-metoden). Det hele sentrifugeres så og vakuum-tørkes ved en passende temperatur i 5-8 timer. På denne måten oppnås ca. 500-600 g tørre, pulveriserte hanekammer.

300 g tørt pulver fordøyes enzymatisk med papain (0,2 g) under vandige betingelser og buffres i en fosfatbuffer i nærvær av en passende mengde cystein-hydroklorid. Den resulterende blanding omrøres i 24 timer med 60 rpm., idet temperaturen holdes konstant på 60-65°C. Det hele avkjøles til 25°C og

Celite tilsettes, mens omrøringen fortsettes i ytterligere

1 time. Blandingen filtreres inntil det oppnås en klar væske. Den klare væsken underkastes molekylær ultrafiltrering ved

bruk av membraner med en molekylvektutelukkelsesgrense på 30.000. Mellom 5 og 6 startvolumer av produktet ultrafiltreres, mens det kontinuerlig tilsettes destillert vann til det ultra-filtrerte produkt. Tilsetningen av vann avbrytes og ultrafiltreringen fortsettes inntil volumet er redusert til 1/3 av det opprinnelige volumet.

Restvæsken bringes til 0,1M ved tilsetning av bariumklorid og temperaturen bringes til 50°C. Under omrøring ved 60 rpm. tilsettes 45 g cetylpyridiniumklorid. Løsningen omrøres i 60 minutter og så tilsettes 50 g Celite TJ. Under omrøring bringes temperaturen i hele blandingen til 25°C og det bunnfall som dannes, oppsamles ved sentrifugering. Bunnfallet suspenderes i en 0,1M løsning av bariumklorid (5 liter) inneholdende 0,05 % cetylpyridiniumklorid. Blandingen omrøres i 60 minutter ved 50°C. Temperaturen bringes så til 25°C og bunnfallet sentrifugeres. Vaskeprosessen gjentas tre ganger til og tilslutt oppsamles bunnfallet i en beholder inneholdende 3 liter av en 0,05M løsning av bariumklorid inneholdende 0,05 % cetylpyridiniumklorid. Den resulterende suspensjonen omrøres ved 60 rpm. i 60 minutter og temperaturen holdes konstant ved 25°C

i 2 timer. Den klare supernatanten elimineres ved sentrifugering.

Prosessen gjentas flere ganger med en løsning av 0,1M bariumklorid inneholdende 0,05 % cetylpyridiniumklorid. Blandingen sentrifugeres og supernatanten kastes. Bunnfallet dispergeres i en 0,3M løsning av bariumklorid inneholdende 0,05 % cetylpyridiniumklorid (3 liter). Blandingen omrøres og både bunnfallet og den klare væsken samles. Bunnfallet underkastes ekstraksjon tre ganger til, hver gang ved bruk av 0,5 liter av den samme vandige løsning.

Tilslutt elimineres restbunnfallet og de klare væskene samles i én beholder. Temperaturen i væsken bringes til 50°C under konstant omrøring. Væsken bringes så til 0,23M med bariumklorid. 1 g cetylpyridiniumklorid tilsettes og omrøring fortsettes i 12 timer. Blandingen avkjøles til 25°C, filtreres først med Celite og så gjennom et filter. Den underkastes molekylær ultrafiltrering én gang til gjennom membraner med en molekylutelukkelsesgrense på 30.000, idet tre opprinnelige volumer ultrafiltrer med tilsetning av 0,33M bariumklorid-løsning. Bariumkloridløsningen suspenderes og volumet reduseres til 1/4 av det opprinnelige. Løsningen som er konsentrert på denne måten, utfelles under omrøring (60 rpm.) ved 25°C med 3 volumer etanol (95 %). Bunnfallet samles ved sentrifugering og supernatanten kastes. Bunnfallet oppløses i én liter 0,1M løsning av bariumklorid og utfellingen gjentas med 3 volumer etanol (95 %).

Bunnfallet oppsamles og vaskes først tre ganger med 75 % etanol, så med absolutt etanol (tre ganger), og tilslutt med absolutt aceton (tre ganger). Det således.oppnådde produkt (fraksjoner Hyalastin + Hyalectin) har en gjennomsnittlig molekylvekt mellom 250.000 og 350.000. Utbyttet av HY tilsvarer 0,6 % av det opprinnelige, friske vevet.

Eksempel 2 - Fremgangsmåte for oppnåelse av Hyalastin-fraks j onen i form av bariumsaltet fra den blanding som ble oppnådd ved hjelp av den fremgangsmåte som er beskrevet i Eksempel 1.

Den blanding som ble oppnådd med den fremgangsmåten som

er beskrevet i Eksempel 1 oppløses i apyrogenisk, destillert vann i en mengde på 10 mg produkt pr. 1 ml vann. Den således oppnådde løsningen underkastes molekylfiltrering gjennom en membran med en molekylutelukkelsesgrense på 200.000, ved å følge en konsentreringsteknikk uten tilsetning av vann oppå membranen. Under ultrafiltreringen gjennom membraner med en molekylutelukkelsesgrense på 200.000 tilbakeholdes molekylene med en molekylvekt på mer enn 200.000, mens de mindre molekylene går gjennom membranen sammen med vannet. Under filtreringen tilsettes intet vann oppå membranen, slik at volumet minsker og konsentrasjonen av molekyler med en molekylvekt på mer enn 200.000 økes. Ultrafiltreringen fortsettes inntil volumet oppå membranen reduseres til 10 % av det opprinnelige volumet.

2 volumer apyrogenisk, destillert vann tilsettes og det hele ultrafiltreres igjen inntil volumet er redusert til 1/3. Operasjonen gjentas to ganger til. Løsningen som går gjennom membranen bringes til 0,1M med bariumklorid og utfelles så med 4 volumer 95 % etanol. Bunnfallet vaskes tre ganger med 75 % etanol og vakuumtørkes så. Det således oppnådde produktet

(Hyalastin-fraksjonen) har en gjennomsnittlig molekylvekt på mellom 50.000 og 100.000. Utbyttet av HY er lik med 0,4 % av det friske startvevet.

Eksempel 3 - Fremgangsmåte for oppnåelse av Hyalectin-fraks jonen i form av bariumsaltet.

Den konsentrerte løsningen som er samlet i beholderen oppå ultrafiltreringsmembranen med en molekylutelukkelsesgrense på 200.000, som i Eksempel 2 fortynnes med vann inntil det oppnås en løsning som inneholder 5 mg/ml hyaluronsyre, slik det bestemmes ved kvantitativ analyse basert på glucuronsyre-doseringen. Løsningen bringes til 0,1M med bariumklorid og utfelles så med 4 volumer 95 % etanol. Bunnfallet vaskes tre ganger med 75 % etanol og vakuumtørkes så. Det således oppnådde produktet (Hyalectin-fraksjonen) har en molekylvekt på mellom 500.000 og 730.000. Utbyttet av HY er lik 0,2 % av det friske startvevet.

Eksempel 4 - Fremstilling av saltet av en hyaluronsyre (HY) og Streptomycin.

4,47 g HY-bariumsalt (10 mekv.) løses i 300 ml destillert H20.

2,43 g streptomycin-sulfat (10 mekv.) oppløses i 100 ml destillert H20 og tilsettes så dråpevis under omrøring til løsningen av HY-saltet. Blandingen sentrifugeres i 30 minutter ved 6000 rpm. Løsningen separeres, bunnfallet vaskes to ganger med 25 ml destillert ^0. Løsningen og vaskevannene samles og frysetørkes så. I det således oppnådde saltet ble alle syregruppene i hyaluronsyren saltdannet med de basiske funksjonene i streptomycin. Utbytte: 5,5 g.

Mikrobiologisk bestemmelse på B. subtilis (ATCC 6633) sammenlignet med standard streptomycin viser et innhold på 33,8 vektprosent av basisk streptomycin, tilsvarende den teoretisk beregnede vekt. Kolorimetrisk bestemmelse av glucuron-- syre kombinert med polysakkaridet ifølge metoden til Bitter

et al., viser et innhold i vekt av HY-syre på 66,2 %

(teoretisk prosent 66, 0 %) .

Eksempel 5 - Fremstilling av saltet av en hyaluronsyre (HY) og Nafazolin.

4,47 g av bariumsaltet av HY med en molekylvekt på 625.000, tilsvarende 10 mekv. av en monomer-enhet, oppløses i 400 ml destillert H20.

2,6 g nøytralt nafazolin-sulfat (10 mekv. sulfat) oppløses i 50 ml destillert vann og tilsettes til løsningen av HY-bariumsaltet. Blandingen omrøres ved 5°C inntil bariumsulfatet er fullstendig utfelt. Etter sentrifugering fryses den resulterende løsningen og frysetørkes øyeblikkelig. Utbytte: 5,72 g.

I det således oppnådde saltet er alle syregrupper i HY-syren saltdannet med nafazolin. Kvantitativ, spektrofotometrisk bestemmelse sammenlignet med standard nafazolin (USP) viste et innhold på 35,7 vektprosent av basisk nafazolin, tilsvarende den teoretisk beregnede verdi. Kolorimetrisk bestemmelse av glucuronsyre kombinert med polysakkaridet, utført ifølge metoden til Bitter et al., viste et HY-syreinn-hold på 64,3 %.

Eksempel 6 - Fremstilling av partialsaltet av en hyaluronsyre (HY) og Nafazolin.

4,47 g av bariumsaltet av HY med en molekylvekt på 625.000, tilsvarende 10 mekv. av en monomer-enhet, oppløses i 400 ml destillert H20.

1,54 g surt nafazolin-sulfat (10 mekv. sulfat) oppløses i 50 ml to ganger destillert vann og tilsettes til løsningen av bariumsaltet av HY. Blandingen omrøres ved 5°C inntil fullstendig utfelling av bariumsulfatet. Etter sentrifugering fryses den resulterende oppløsningen øyeblikkelig og fryse-tørkes. Utbytte: 4,5 g.

I det således oppnådde saltet er 50 % av syregruppene i HY-syren saltdannet med nafazolin og 50 % er frie. Kvantitativ, spektrofotometrisk bestemmelse sammenlignet med standard nafazolin (USP) viser et vektinnhold av basisk nafazolin som tilsvarer den teoretisk beregnede verdi.

Eksempel 7 - Fremstilling av saltet av en hyaluronsyre (HY)

og Fenylefrin.

2,16 g nøytralt L-fenylefrin-sulfat (10 mekv.) oppløses

i 25 ml destillert H20.

4,47 g av bariumsaltet av HY med en molekylvekt på 820.000, tilsvarende 10 mekv. av en monomer-enhet, oppløses i 400 ml destillert vann og tilsettes til løsningen av fenylefrin-sulfatet. Blandingen omrøres inntil bariumsulfatet er fullstendig utfelt. Etter sentrifugering fryses den resulterende løsningen og frysetørkes. I det oppnådde saltet er alle syregruppene i HY saltdannet med fenylefrin.

Ultrafiolett, spektrofotometrisk bestemmelse utført ved standard-tilsetningsmetoden (USP) viser et innhold på 30,6 %

av basisk fenylefrin, tilsvarende den teoretisk beregnede verdien.

Kolorimetrisk bestemmelse av glucuronsyre kombinert med polysakkaridet ifølge metoden til Bitter et al., viser et HY-syreinnhold på 69,4 %.

Eksempel 8 - Fremstilling av det blandede saltet av en hyaluronsyre (HY) med Neomycin, Fenylefrin og Natrium.

7,15 g av HY-bariumsaltet med en molekylvekt på 65.000, tilsvarende 16 mekv. av en monomer-enhet, oppløses i 400 ml destillert H20.

1,28 g neomycin-sulfat (8,42 mekv.) oppløses i 150 ml destillert H20. 0,34 g nøytralt fenylefrin -sulfat (1,58 mekv.) og 0,43 g Na2S0^ (6 mekv.) tilsettes til løsningen. Den resulterende løsning tilsettes til løsningen av HY-bariumsaltet og, etter fullstendig utfelling av bariumsulfatet, sentrifugeres blandingen.

Bariumsulfatet separeres og løsningen fryses og fryse-tørkes. Utbytte: 7,35 g.

Farmakologiske undersøkelser

Den tekniske effekten av de nye medikamentene som fremstilles ifølge oppfinnelsen kan påvises in vivo ved forsøk på kaninøye, som viser deres overlegenhet sammenlignet med bruken av bestanddel (1) når den administreres på konvensjonell måte. Som eksempel skal det heretter rapporteres forsøk utført med hyaluronsyresalter og følgende antibiotika: streptomycin, erythromycin, neomycin, gentamicin. Dette er de totale saltene i hvilke alle syregruppene i hyaluronsyren er saltdannet med en basisk gruppe av antibiotikumet. Av disse ble det brukt oppløsninger i destillert vann med konsentrasjoner som er passende for innholdet av antibiotikum, som følger:

hyaluronsyre + streptomycin (HYA1) - 33,8 %

hyaluronsyre + erythromycin (HYA2) - 66,0 %

hyaluronsyre + neomycin (HYA4) - 21,2 %

hyaluronsyre + gentamicin (HYA5) - 20,0 %

Aktiviteten til disse antibiotika ble sammenlignet med

den aktivitet som oppnås av de samme antibiotika oppløst i fosfatbuffer og med de samme konsentrasjoner av antibiotikum. Aktiviteten til de to produktgruppene ble målt på basis av den tid som er nødvendig for å undertrykke en tørr inflammasjon i kaninøyet som er indusert av et bakterielt middel. Mere nøyaktig ble den tørre inflammasjonen bestemt i begge øynene til 24 kaniner ved intraokulær injeksjon av en titrert suspensjon av en av følgende bakterielle grupper: pseudomonas aeruginosa, staphylococcus aureus, salmonella typhi (0,1 ml).

De forskjellige saltderivatene av antibiotikaene ble administrert (3 dråper hver 6. time) i kaninenes høyre øye

(RE), mens det i det venstre øyet (LE) ble innført tilsvarende mengder av antibiotika oppløst i fosfatbuffer. Behandlingen ble begynt like etter injeksjon av bakteriesuspensjonen og ble fortsatt inntil inflammasjonen forsvant. Begge øynene til hver kanin ble observert med en spaltelampe. Spesielt det følgende ble undersøkt: tilstanden til conjunctiva og hornhinne-epitelet, fremre kammer (nærvær av Tyndall-effekt) og tilstanden til iris i det bakre segment av øyet. Tilstanden til bakdelen av øyet ble undersøkt med en Goldman-linse. Nærværet av tegn på inflammasjon (hyperemi, eksudater, uklarhet i væsker, osv.) ble registrert. Den prosent av øynene som ikke oppviste noen tegn på inflammasjon ble så beregnet.

Resultatene av forsøkene er oppført i Tabell 1, hvorved det kan observeres at administrasjon av saltderivatene som fremstilles ifølge oppfinnelsen ble fulgt av en raskere bedring fra inflammasjonen sammenlignet med administrasjonen av tilsvarende antibiotika som ikke er saltdannet med hyaluronsyre .

Den tekniske effekten av medikamentene som inneholder hyaluronsyresalter som fremstilles ifølge oppfinnelsen, viser videre ved hjelp av følgende andre forsøk som gjelder miotisk, antiinflammatoriske, sårhelende og antimikrobiell virkning. I. Miotisk aktivitet av pilocarpin- nitrat i hyaluronsyre.

Materialer

Følgende materialer ble brukt som bindemidler for pilocarpin i de forskjellige blandingene av pilocarpin-nitrat: hyaluronsyre-natriumsalt, Hyalastinfraksjon, (molekyl vekt ca. 100.000) i konsentrasjoner på 10 og 20 mg/ml,

hyaluronsyre-natriumsalt, Hyalectinfraksjon, (molekylvekt 500.000-730.000) i konsentrasjoner på 10 og

20 mg/ml,

5 % polyvinyl-alkohol som sammenlignende oftalmisk bindemiddel.

Forskjellige blandinger med 2 % (collirium eller gel) pilocarpin-nitrat ble fremstilt og tilblandet bindemiddel ved å tilsette de to forskjellige fraksjonene av HY-natriumsalt i konsentrasjoner på 10 og 20 mg/ml. Følgende løsninger ble fremstilt:

Blanding 1. - saltløsning med pilocarpin-nitrat (PiNO^

(2 %) anvendt som referanse.

Blanding 2. - løsning av (PiNC^) (2 %) innblandet i 5 % polyvinyl-alkohol anvendt som referanse.

Blanding 3. - løsning av (PiNO^) (2 %) innblandet i Hyalastinfraksjon-natriumsalt (10 mg/ml).

Blanding 4. - løsning av (PiN03) (2 %) innblandet i Hyalastinfraksjon-natriumsalt (20 mg/ml).

Blanding 5. - løsning av (PiNO^) (2 %) innblandet i Hyalectinfraksjon-natriumsalt (10 mg/ml).

Blanding 6. - løsning av (PiN03) (2 %) innblandet i Hyalectinfraksjon-natriumsalt (20 mg/ml).

Metode

New Zealand albinokaniner ble brukt (2-2,5 kg). Den blanding som skulle testes ble innført i et øye hos hver kanin med en mikrosprøyte (10 mel). Den andre øyet ble brukt som referanse. Diameteren til pupillen ble målt i alle tilfeller med passende tidsintervaller. Hver løsning ble testet på minst 8 kaniner. Hvert øye ble ikke behandlet mer enn tre ganger og hvert øye fikk en hvileperiode på minst én uke mellom hver behandling.

Parametere

Målinger ble utført på diametrene til pupillene etter forskjellige intervaller for å bestemme den miotiske aktivitetskurven avhengig av tiden. Følgende aktivitetsparametre ble så beregnet av miosis/tid-kurver: I max = maksimal forskjell i pupillens diameter mellom det behandlede øye og referanseøyet.

Tid for den maksimale topp = den tid det tok for å nå

1 max.

Varighet = den tid det tar for å returnere til utgangsbetingelsene .

Platå = periode med absolutt miotisk aktivitet.

AUC = areale under miosis/tid-kurven.

Resultater

Resultatene av undersøkelsene er angitt i Tabell 2. Det

er mulig å se fra dataene fra de forskjellige parametrene som er bestemt av tidskurven for miotisk aktivitet for alle de løsninger som er undersøkt, at tilsetning til hyaluronsyre av 2 %ige pilocarpin-nitratløsninger forårsaker en økning i den miotiske aktiviteten til medisinen. Biotilgjengeligheten for medisinen kan faktisk være 2,7 ganger større enn den til den vandige løsningen inneholdende 2 % pilocarpin-nitrat

(Blanding 1).

Det er også viktig å merke seg at det er en statistisk signifikant økning i aktiviteten når Hyalectinfraksjonen av hyaluronsyre anvendes som et bindemiddel både med 10 og 20 mg/ml (Blandingene 5-6), sammenlignet med pilocarpin-nitratløsninger med polyvinyl-alkohol som bindemiddel

(Blanding 2). Bruken av hyaluronsyre som bindemiddel er spesielt interessant fordi den miotiske aktiviteten til pilocarpin-nitrat varer lenger når denne substansen er bindemiddel. Det vil si for de blandingene som inneholder hyaluronsyre er

den tiden som er nødvendig for pupillens diameter å vende tilbake til utgangsbetingelsene er mer enn 190 minutter (Blanding 6) sammenlignet med 110 minutter for pilocarpin i saltløsning alene (Blanding 1).

II. Miotisk aktivitet av Pilocarpi n saltdannet med Hyaluronsyre

Materialer

For de forskjellige blandingene av saltdannet pilocarpin ble følgende produkter anvendt: hyaluronsyre med lav molekylvekt (Hyalastin, molekyl vekt 100.000) [HY^;

hyaluronsyre-natriumsalt med høy melokylvekt

(Hyalectin, molekylvekt mellom 500.000 og 730.000)

[HY2~Na] i konsentrasjoner på 10 og 20 mg/ml; - 5 % polyvinyl-alkohol som oftalmisk bindemiddel for å oppnå sammenligningsblandinger.

De forskjellige blandingene som ble fremstilt var følgende:

1) saltløsning med pilocarpin-nitrat (PiNC^) 2 %

(anvendt som referanse); 2) løsning av PiN03 2 % med 5 % polyvinyl-alkohol som bindemiddel (anvendt som referanse); 3) løsning av pilocarpin-base/HY^-syre i vandig løsning.

Pilocarpinbase-innholdet tilsvarer 2 %;

4) løsning inneholdende pilocarpinsalt/HY^-syre med HY2~Na

10 mg/ml som bindemiddel. Pilocarpinbase-innholdet tilsvarer 2 %;

5) løsning inneholdende pilocarpinsalt/HY^-syre med HY2~Na

20 mg/ml som bindemiddel. Pilocarpinbase-innholdet tilsvarer 2 %; 6) innføringsmidler av HY2~Na inneholdende pilocarpinbasesalt med hyaluronsyre [HY^3. Pilocarpinbasen-tilsvarer 6,25 %.

Metode

New Zealand albino kaniner ble brukt (2-2,5 kg). Den løsning som skulle testes ble innført i et øye på hver av kaninene med en mikrosprøyte (lO^ul). Det andre øyet ble brukt som referanse. Innføringsmidlet ble plassert i conjunctiv-sekken ved hjelp av passende pinsett. I alle tilfeller ble pupillens diameter målt ved passende intervaller. Hver blanding ble testet på minst 8 kaniner. Hvert øye ble ikke behandlet mer enn tre ganger. Hvert øye fikk en hvileperiode på minst én uke

mellom hver behandling.

Parametere

Pupillediameteren ble målt ved forskjellige tidsintervaller for å bestemme den miotiske aktivitetskurven avhengig av tiden og deretter beregning av følgende aktivitets-parametere fra miosis/tid-diagrammer: Imax = maksimal forskjell i pupillediameter mellom det behandlede og referanseøyet;

Topp tid = tiden det tar for å nå I ;

max

Varighet = den tid det tar for å vende tilbake til utgangs-tilstanden;

Platå = periode med absolutt miotisk aktivitet;

AUC = areale under miosis/tid-kurven.

Resultater

Som det kan sees av Tabell 3 hvor verdiene for de forskjellige parametrene som er registrert fra kurven for den miotiske aktiviteten i tid er angitt for hver testet løsning, er det mulig å vise hvordan saltdannelse med hyaluronsyre av 2 % pilocarpin forårsaker en økning i miotisk aktivitet for medisinen, hvis aktivitet kan nå ca. to ganger den som vises av en vandig løsning med 2 % pilocarpin-nitrat (Blanding 1).

Det skal også bemerkes en statistisk signifikant økning i aktiviteten når hyaluronsyre med høy molekylvekt anvendes som et bindemiddel både med 10 og 20 mg/ml (Blanding 4-5).

Saltdannelse med hyaluronsyre er spesielt interessant også i forhold til den lengre varigheten av miotisk aktivitet for pilocarpin etter tilsetning av slike bindemidler i blandingene: Den tid det tar for å vende tilbake til normal pupillediameter under grunntilstandene når verdier på

160 minutter (Blanding 3) sammenlignet med 110 minutter for pilocarpin (Blanding 1).

III. Stabilitet i hornhinnefilraene av hyaluronsyre og

Pilocarpinderivater.

Formålet med forsøkene var å vurdere klebe- og filmegen-skapene til saltderivatene mellom pilocarpin og hyaluronsyre etter påføring på hornhinnen til dyr.

Metode

Testen besto i visuell evaluering av dannelse, stabilitet og varighet av filmen som er dannet av blandingene på hornhinnen. For å oppnå dette ble natrium-fluorescein tilsatt til de oftalmiske preparatene (0,1 %) og øyet ble etter inndrypping undersøkt i UV-lys av 366 nm. 12 albino kaniner ble brukt i alt (New Zealand, 2-2,5 kg) av begge kjønn. En dråpe (50yul) av hvert bindemiddel ble inn-dryppet i et øye hos hver kanin, idet det andre øyet ble brukt som kontroll.

Anvendte løsninger

1. saltløsning med 2 % pilocarpin-nitrat (PiNO^); 2. 2 %ig løsning av PiN03, fortykket med 5 %ig polyvinyl-alkohol (Wacker Chemie, PVA W 48/20); 3. løsning inneholdende pilocarpinbasesalt/HY^-syre. Pilocarpinbaseinnholdet tilsvarer 2 %; 4. løsning inneholdende pilocarpinbasesalt/HY.j-syre tilsatt HY2~Na 10 mg/ml. Pilocarpinbaseinnholdet tilsvarer 2 %; 5. løsning inneholdende pilocarpinbasesalt/HY^-syre tilsatt HY2~Na 20 mg/ml. Pilocarpinbaseinnholdet tilsvarer 2 %.

Alle løsninger inneholdt 0,1 % natrium fluorescein. pH i løsningene var i alle tilfeller rundt 5,8.

Resultater

Parametere i relasjon til fluorescensen: a) varighet av den integrerte hornhinnefilmen, b) varighet av fluorescens (tid som er nødvendig for den totale forsvinning av fluorescens fra øyet), c) nærvær av fluorescens i nesen (den tid løsningen tar etter applikasjon for å komme tilsyne på nesenivået), er angitt i Tabell 4.

Derivatene av hyaluronsyre og pilocarpin gir en stabil hornhinnefilm i en periode på mer enn 2 timer. Gjennomtregning gjennom hornhinnen av pilocarpin synes derfor å avhenge av kapasiteten til hyaluronsyre til å være bindemiddel for den medisinen som danner en homogen og stabil film på hornhinnen. IV. Antiinflammatorisk aktivitet av triamcinolon med hyaluronsyre som bindemiddel.

Materiale

Det følgende ble brukt:

løsning av hyaluronsyre-natriumsalt Hyalectin-fraksjon (molekylvekt mellom 500.000 og 730.000), 10 mg/ml i saltløsning;

løsning av triamcinolon-fosfat (10 % i saltløsning)

Metode

Forsøkene ble utført på New Zealand hannkaniner (gjennom-snittsvekt 1,6 kg). Etter en tilpasningsperiode på 5 dager ble intraokulær inflammasjon indusert i dyrene ved injeksjon av dextran (10 %, 0,1 ml) i det fremre kammer. Administrasjonen ble utført i begge øyne, i tilstand med lokal anestesi med Novesine 4 %, idet sprøytenålen ble innstukket ved kanten av hornhinnen i det fremre kammer i en avstand på 2 ml.

Testen ble utført på 10 dyr.

Behandling

Behandlingen ble utført på hvert dyr både i det høyre og det venstre øyet ved tildrypping av 3 dråper 3 ganger om dagen

i totalt 6 dager av respektive:

løsning.av triamcinolon-fosfat (10 % i saltløsning) i

det venstre øye (LE) ,

- løsning av hyaluronsyre-natriumsalt Hyalectin-fraksjon (10 mg/ml) + triamcinolon-fosfat (10 %) i det høyre øye (RE).

Parametere

Den antiinflammatoriske effekten på den reaksjon som ble indusert med dextran ble vurdert ved observasjon av øyet gjennom en spaltelampe ved følgende intervaller: 0, 1 time,

3 timer, 24 timer, 48 timer, 3 dager, 4 dager, 5 dager, 6 dager. Det følgende ble observert ved intervaller: tilstand av conjunctiva og hornhinnen, på mulig nærvær av hyperemi, ødem, og spesielt iris, som normalt er følsom for inflammatoriske prosesser etter injeksjon av inflammatoriske midler i det fremre kammer,

Tyndall-effekt, i hvilken nærvær av uklarhet av varierende intensitet ("nubecola") er en indikasjon på nærvær av corpuskulære (inflammatoriske) elementer i det fremre kammer.

Resultatene av observasjonene er rapportert ifølge subjektiv bedømmelse mellom 0 og 3 i forhold til den observerte effekt.

Resultater

Som rapportert i Tabell 5, synes administrasjon av triamcinolon å ha en antiinflammatorisk effekt på iris og forårsaker forsvinning av uklarhet (Tyndall-effekt) i det fremre kammer. Den inflammatoriske prosessen som er tydelig fra den første til tredje time inntil tredje til fjerde dag forsvinner gradvis, og vender tilbake til nesten normale verdier, med perfekt klarhet i øyet, på den sjette dagen. På den annen side reduserer administrasjon forbundet med hyaluronsyre-natriumsalt Hyalectin-fraksjon sammen med triamcinolon-fosfat den intraokulære inflammasjonen som ble observert på de ovenfor nevnte tider sammenlignet med administrasjonen av triamcinolon-fosfat alene. Det vil si den inflammatoriske prosessen i iris og uklarheten i det fremre kammer viser seg å være lavere så raskt som 24 timer senere, med progressiv reduksjon ved 48 timer og

totalt fravær av inflammatorisk reaksjon fra den 4. dag av.

I conjunctiva og hornhinnen ble det ikke observert noen merkbare inflammatoriske reaksjoner etter injeksjon av dextran i det fremre kammer.

Administrasjon av triamcinolon-fosfat sammen med hyaluronsyre-fråksjonen resulterte således i økning i medisinens aktivitet, demonstrert ved raskere dekongestion av kaninøyet.

V. Helbredende aktivitet av EGF i hyaluronsyre som bindemiddel

Materialer

De følgende ble brukt:

Blanding A - EGF (epidermisk vekstfaktor), oppløst i saltløsning (0,5 mg/5 ml)

Blanding B - hyaluronsyre-natriumsalt HYALASTINE-fraksjon (molekylvekt 100.000) oppløst i saltløsning (10 mg/ml).

Metode

Forsøkene ble utført på New Zealand hann-albinokaniner (gjennsnittsvekt 1,8 kg). Etter en tilpasningsperiode på ca. 5 dager ble dyrene tilført en skade i hornhinne-epitelet i passende lokalbedøvelse med novesine (4 %).

Skaden besto i et monokulært snitt av et cirkelformig område i den optiske sonen, utført ved bruk av en konkav glass-cylinder (0,3 mm) med en skarp kant.

Behandling

Dyrene ble oppdelt i grupper, idet hver gruppe inneholdt

5 dyr, og de undergikk farmakologisk behandling ved conjunctival tildrypping som vist nedenfor:

Behandlingen ble gjennomført i det høyre øyet (RE) ved conjunctival tildrypping av 2 dråper hver 8. time i totalt 3 administrasjoner.

Parametere

Helbredelse av hornhinne-epitelet ble vurdert ved observasjon av øyet og fotografisk dokumentering med en spaltelampe ved forskjellige intervaller etter snittet: 0,8 timer,

16 timer, 24 timer, 32 timer, 40 timer, 48 timer.

Resultater

Den oftalmiske undersøkelsen 1 som er angitt i Tabell 4, viste at i kontrollene (Gruppe 1) var det fullstendig helbredelse (5/5 dyr) 48 timer etter skaden. Hos de dyrene som var behandlet med EGF (Gruppe 2) er prosessen tydelig så raskt som 24 timer etter innsnittet med merkbar effektivitet (4/5 dyr). Hos de dyrene som var behandlet med blanding C bestående av hyaluronsyre-natriumsalt, HYALASTINE-fraksjon + EGF (Gruppe 3) er helbredelsesprosessen fullstendig hos alle dyrene (5/5) så

raskt som 16 timer etter innsnittet.

Disse resultatene viser at bruken av HYALASTINE-fraksjonen av hyaluronsyre som et bindemiddel for EGF forbedrer helbredelsesprosessen, og gir en raskere og mere effektiv helbredelse av hornhinneskader.

VI. Antimikrobiell aktivitet av Gentamicin med hyaluronsyre som bindemiddel

Materialer

De følgende ble brukt:

- Gentamicin oppløst i saltløsning (50 mg/ml) Hyaluronsyre-natriumsalt, HYALECTIN-fraksjon (2 mg/ml)

Metode

Septisk inflammasjon ble indusert i begge øyne hos 11 kaniner ved intraokular injeksjon av en titrert suspensjon av pseudomonas aeruginosa (0,1 ml). Til de kaniner som viste septisk inflammasjon ble hyaluronsyre, HYALECTIN-fraksjon i kombinasjon med gentamicin administrert ved inndrypping i det høyre øyet og gentamicin i et bindemiddel av fosfat og salt-løsning i det venstre øye. Behandlingen (3 dråper hver 6. time) ble begynt straks etter injeksjonen av det infiserende midlet og ble fortsatt inntil infeksjonen forsvant. Kaninenes øyne ble observert hver dag med en spaltelampe.

Resultater

Behandling med en kombinasjon av gentamicin og hyaluronsyre resulterte i raskere forsvinning av septisk infeksjon når den ble sammenlignet med administrasjonen av antibiotikumet alene. Denne konklusjonen er klar fra de data som er angitt i Tabell 7.

Verdiene er uttrykt som prosent av antall øyne som er kurert for inflammasjonen, sammenlignet med antall øyne som er behandlet.

+ = signifikative forskjeller mot fosfat-bindemiddel (- di 0,05,

T test B Fischer)

Claims (10)

1. Fremgangsmåte for fremstilling av et farmasøytisk aktivt hyaluronsyresalt, karakterisert ved at A) en vandig løsning av et bariumsalt av hyaluronsyre kombineres med et sulfat av en farmasøytisk aktiv substans og B) det utfelte bariumsulfatet separeres for å oppnå det farmasøytisk aktive hyaluronsyresaltet i vandig løsning, idet det som utgangsmateriale anvendte bariumsalt av hyaluronsyre hensiktsmessig er fremstilt ved at a) et cetylpyridiniumsalt av hyaluronsyre eller en molekylvektfraksjon derav behandles med en vandig løsning av bariumklorid og b) den vandige løsningen separeres og det tilsettes etanol for derved å utfelle bariumsaltet av hyaluronsyren eller av en molekylvektfraksjon derav.

2. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at sulfatet tilsettes i en mengde slik at antallet sulfat-ekvivalenter er lik antallet hyaluronsyre-ekvivalenter, hvorved det dannes et støkiometrisk nøytralt hyaluronsyresalt.

3. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at sulfatet tilsettes i en mengde slik at antallet sulfat-ekvivalenter er mindre enn antallet hyaluronsyre-ekvivalenter, hvorved det dannes et delvis saltdannet hyaluronsyresalt.

4. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at bariumsaltet av hyaluronsyre ytterligere kombineres med et sulfat av minst ett alkali- eller jordalkalimetall, aluminium eller ammonium.

5. Fremgangsmåte ifølge krav 4, karakterisert ved at sulfatene tilsettes i en mengde slik at antallet sulfat-ekvivalenter er lik med antallet hyaluronsyre-ekvivalenter.

6. Fremgangsmåte ifølge krav 4, karakterisert ved at sulfatene tilsettes i en mengde slik at antallet sulfat-ekvivalenter er mindre enn antallet hyaluronsyre-ekvivalenter.

7. Fremgangsmåte ifølge ett av kravene 1 til 6, karakterisert ved at den aktive substansen er minst ett av: erytromycin, gentamycin, neomycin, streptomycin, kanamycin, rolitetracyklin, polymyxin B, gramicidin, klor-amf enikol, atropin og dexametason.

8. Fremgangsmåte ifølge ett av kravene 1 til 7, karakterisert ved at hyaluronsyren er en molekylvektfraksjon med en molekylvekt på mellom 90% og 0,23 % av molekylvekten av integrert hyaluronsyre med en molekylvekt på 13 millioner.

9. Fremgangsmåte ifølge krav 8, karakterisert ved at hyaluronsyrefraksjonen er i det vesentlige fri for hyaluronsyre med en molekylvekt mindre enn 30.000.

10. Fremgangsmåte ifølge krav 9, karakterisert ved at molekylvektfraksjonen har en gjennomsnittlig molekylvekt på 50.000 til 100.000, 500.000 til 730.000 eller 250.000 til 350.000.