CN108603115A - 神经生长促进剂及其制造方法、内服剂、培养基用添加剂、细胞稀释液用添加剂、培养基、细胞稀释液、抗氧化剂及其制造方法、外用剂、以及伤口治疗剂及其制造方法 - Google Patents
神经生长促进剂及其制造方法、内服剂、培养基用添加剂、细胞稀释液用添加剂、培养基、细胞稀释液、抗氧化剂及其制造方法、外用剂、以及伤口治疗剂及其制造方法 Download PDFInfo
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Abstract
一种神经生长促进剂及抗氧化剂，含有用蛋白酶对含有透明质酸和蛋白质的组合物进行分解而得到的分解产物。一种伤口治疗剂，含有用蛋白酶对含有透明质酸和蛋白质的组合物进行分解而得到的分解产物的乙酸乙酯提取物。
Description
技术领域
本发明涉及一种神经生长促进剂、抗氧化剂、伤口治疗剂及该等的制造方法。并且，本发明还涉及一种内服剂、外用剂、培养基用添加剂、细胞稀释液用添加剂、培养基、细胞稀释液。
背景技术
已知透明质酸具有提高保湿效果和锁水效果的作用，并且，以往调配于各种化妆品和药物中。例如，通常通过直接适用于干燥皮肤或粗糙皮肤来提高保湿性以调节皮肤的状态，或预防性地适用于皮肤表面，以防止在干燥时期水分从皮肤表面流失。并且，还期望透明质酸显现出除了从保湿效果中衍生的功能或保湿效果以外的有用的特性，还发现一些有关其新的用法的研究。
例如，专利文献1中提出了将用蛋白酶对含有透明质酸和蛋白质的组合物进行分解而得到的分解产物用于伤口治疗剂。该伤口治疗剂使用活体成分，即透明质酸和蛋白质、反应缓慢的酶，因此安全性高，例如，能够通过口服给药和对伤口部位直接给药来迅速地治疗伤口。
以往技术文献
专利文献
专利文献1：日本特开2002-145800号公报
发明内容
发明要解决的技术课题
如上所述，用蛋白酶对含有透明质酸和蛋白质的组合物进行分解而得到的分解产物作为伤口治疗剂具有高实用性。然而，关于该分解产物也只是确认到伤口治疗效果，而其他的作用效果几乎未知，应用范围有限。
(1)另一方面，作为对日常生活影响非常大的人类的障碍，已知有阿尔茨海默氏病和帕金森病等神经变性疾病，由脑缺血、脑挫伤、脊髓损伤引起的神经损伤。若产生这种神经系统的障碍，则理解力、记忆力、判断力等认知功能和运动功能受损，导致从过去生活中完全改变，而难以度过正常的生活。因此，迫切希望开发出用于缓解这种神经系统的功能障碍的药剂和医疗技术。
在此，对于人类等动物而言，能够使认知功能和运动功能成为可能的是，通过神经细胞的细胞体生长神经突触，并相互构建突触而形成的复杂的神经回路，已知在许多神经疾病中，在其早期阶段，形成其神经回路的神经突触变性并脱落。因此，为了抑制神经疾病的进展和缓解症状，需要抑制神经突触的变性，或补充已变性及脱落的神经突触，认为供给促进神经突触的形成和生长的物质是有效的。另一方面，认为在恢复由神经损伤引起的受损的认知功能和运动功能时，通过供给促进神经突触的形成和生长的物质，重建神经回路是有效的。从这种方面考虑，近年来，积极进行促进神经突触的形成和生长的物质的开发，并且已存在许多报告。然而，迄今已报告的促进神经突触的形成和生长的物质难以获得，或不适合内服，或是效果不充分的物质，实际上还没有实现可获得高效果且廉价并且适合于内服的神经生长促进剂。
因此，为了解决这种现有技术的课题，本发明人等以提供促进神经突触的形成和生长的效果高，并且适合于内服的神经生长促进剂作为课题，进行了研究。并且，以提供能够以廉价制造这种神经生长促进剂的神经生长促进剂的制造方法作为课题，进行了研究。
(2)另一方面，近年来，活体内所产生的活性氧对生物体给予的不良影响成为很大问题。活性氧是指，活性比普通的氧分子更高的氧分子及其相关物质，除了包括如过氧化物(·O2 -)、羟基自由基(HO·)、过氧化氢(H2O2)、单重态氧(1O2)等狭义的活性氧以外，还包括如氢过氧自由基、烷氧自由基、烷基过氧自由基自由基种、过氧氮化物、脂氢过氧化物等非自由基种。狭义的活性氧为生物体在消耗氧(3O2)的过程中所产生的活性氧，若这种活性氧过度地产生，则诸如DNA、脂质、酶、蛋白质等重要活体成分通过活性氧而被氧化，生成其他的活性氧和氧化变性物等，即引起所谓的氧化障碍。已知由这种活性氧引起的氧化障碍加速老化现象，且发现深深关系到与以糖尿病、高血压、动脉硬化等以生活常见疾病为代表的各种疾病的发病。
作为抑制由这些活性氧引起的生物体的氧化障碍的方法，以往已知有通过对生物体供给抗氧化物质来除去活性氧的方法。抗氧化物质有类黄酮、儿茶素、维生素C(抗坏血酸)等水溶性抗氧化物质、维生素E和β胡萝卜素等脂溶性抗氧化物质，但由于脂溶性抗氧化物质积存于体内，因此存在难以选定供给量和供给方法的问题。另一方面，由于水溶性抗氧化物质不产生这种体内积存的问题，因此除了药物以外，经常用作补充剂，但未确认到充分抑制生物体的氧化障碍的程度的高抗氧化活性。
因此，为了解决这种现有技术的课题，本发明人等以提供具有高抗氧化活性，并能够有效地抑制活体成分的氧化障碍的抗氧化剂及其制造方法作为课题进行了研究。
(3)如上所述，已知用蛋白酶对含有透明质酸和蛋白质的组合物进行分解而得到的分解产物作为伤口治疗剂具有高实用性。然而，本发明人等以人类皮肤成纤维细胞的伤口部位中的迁移距离作为指标，对该分解产物的伤口治愈促进效果进行评价的结果，判断出若要在其评价中获得显著的伤口治愈促进效果，则需要以十分高的浓度供给分解产物。在伤口治疗剂中以高浓度调配分解产物时，由于与其他成分的组合使用及与赋形剂的混合受到很大限制，因此，认为需要进一步改进。
因此，针对上述分解产物，本发明人等开始进行为了提高伤口治愈促进效果的各种研究，其中，使用各种溶剂对分解产物进行分液操作，并进行了对所获得的各组分的伤口治愈促进效果进行评价的研究。其结果，首次发现该分解产物根据使用于分液中的溶剂的种类和组合而各组分的伤口治愈促进效果大有不同。
在这种情况下，本发明人等以提供使用用蛋白酶对含有透明质酸和蛋白质的组合物进行分解而得到的分解产物，并且即便是低浓度也可获得高伤口治愈促进效果的伤口治疗剂及其制造方法作为课题进行了深入研究。
用于解决技术课题的手段
为了解决上述(1)～(3)的课题而进行深入研究的结果，本发明人等首次发现，已知具有上述伤口治疗作用的组合物，即用蛋白酶对含有透明质酸和蛋白质的组合物进行分解而得到的分解产物具有较强的神经生长促进作用和抗氧化作用。而且，通过利用该分解产物的神经生长促进作用，以至发现能够以廉价提供适合于内服的神经生长促进剂及适合于内服和外用的抗氧化剂。并且，本发明人等发现，对用蛋白酶对含有透明质酸和蛋白质的组合物进行分解而得到的分解产物进行通过乙酸乙酯和水的分液操作而获得的乙酸乙酯组分具有非常高的伤口治愈促进效果。具体而言，得知如下结果，该乙酸乙酯组分在以相当于在上述分解产物中确认到显著的伤口治愈促进效果的浓度的1/10以下的浓度下，发挥超过在其分解产物中确认到的效果的高伤口治愈促进效果。
本发明是根据这些结果而提出的，具体具有如下构成。
[1]一种神经生长促进剂，其特征在于，
含有用蛋白酶对含有透明质酸和蛋白质的组合物进行分解而得到的分解产物。
[2]根据[1]所述的神经生长促进剂，其特征在于，
所述组合物为鸡冠。
[3]根据[1]或[2]所述的神经生长促进剂，其特征在于，
所述分解产物含有分子量为380～5000的低分子透明质酸。
[4]根据[1]～[3]中任一项所述的神经生长促进剂，其特征在于，
所述分子量为380～5000的低分子透明质酸的含量相对于神经生长促进剂的总量为10质量％以上。
[5]根据[3]或[4]所述的神经生长促进剂，其特征在于，
分子量为1520～5000的低分子透明质酸的比例为分子量为380～5000的低分子透明质酸总量的60质量％以上。
[6]根据[1]～[5]中任一项所述的神经生长促进剂，其特征在于，
N-乙酰葡糖胺的含量相对于神经生长促进剂的总量为0.01质量％以下。
[7]根据[1]～[6]中任一项所述的神经生长促进剂，其特征在于，
总游离氨基酸量相对于神经生长促进剂的总量以质量比计为2质量％以上，并且，总蛋白质量相对于神经生长促进剂的总量以质量比计为2质量％以上。
[8]根据[7]所述的神经生长促进剂，其特征在于，
所述游离氨基酸含有选自异亮氨酸、β-氨基异丁酸、丙氨酸、牛磺酸、苯丙氨酸、天冬氨酸、胱氨酸及酪氨酸中的至少1种。
[9]根据[1]～[8]中任一项所述的神经生长促进剂，其特征在于，
包含对所述分解产物的冷冻干燥物进行粉碎而获得的粉碎物。
[10]根据[1]～[9]中任一项所述的神经生长促进剂，其特征在于，
含有通过由水和水饱和1-丁醇对所述分解产物进行分液操作而获得的水饱和1-丁醇组分。
[11]根据[1]～[10]中任一项所述的神经生长促进剂，其特征在于，
具有促进从神经体形成神经突触的作用。
[12]根据[1]～[11]中任一项所述的神经生长促进剂，其特征在于，
具有促进神经突触的生长的作用。
[13]根据[1]～[12]中任一项所述的神经生长促进剂，其特征在于，
具有促进干细胞分化为神经细胞的作用。
[14]根据[1]～[13]中任一项所述的神经生长促进剂，其特征在于，
具有促进神经生长因子诱导性神经突触的形成及生长的作用。
[15]一种神经生长促进剂的制造方法，其特征在于，
包括用蛋白酶对含有透明质酸和蛋白质的组合物进行分解的酶处理工序。
[16]根据[15]所述的神经生长促进剂的制造方法，其特征在于，
所述组合物为鸡冠，在所述酶处理工序之前，具有将所述鸡冠碎片化为1边0.5cm见方以上的工序。
[17]根据[15]或[16]所述的神经生长促进剂的制造方法，其特征在于，
在所述酶处理工序之后，具有对在所述酶处理工序中获得的分解产物进行冷冻干燥之后，进行粉碎而获得粉碎物的工序。
[18]根据[15]～[17]中任一项所述的神经生长促进剂的制造方法，其特征在于，
在所述酶处理工序之后，具有对在所述酶处理工序中获得的分解产物进行提纯的提纯工序。
[19]根据[18]所述的神经生长促进剂的制造方法，其特征在于，
所述提纯工序包括通过水和水饱和1-丁醇对所述分解产物进行分液操作而获得水饱和1-丁醇组分的分液工序。
[20]一种内服剂，其特征在于，
包含[1]～[14]中任一项所述的神经生长促进剂。
[21]一种培养基用添加剂，其特征在于，
包含[1]～[14]中任一项所述的神经生长促进剂。
[22]一种细胞稀释液用添加剂，其特征在于，
包含[1]～[14]中任一项所述的神经生长促进剂。
[23]一种培养基，其特征在于，
含有[21]所述的培养基用添加剂。
[24]一种细胞稀释液，其特征在于，
含有[22]所述的细胞稀释液用添加剂。
[25]一种抗氧化剂，其特征在于，
含有用蛋白酶对含有透明质酸和蛋白质的组合物进行分解而得到的分解产物。
[26]根据[25]所述的抗氧化剂，其特征在于，
所述组合物为鸡冠。
[27]根据[25]或[26]所述的抗氧化剂，其特征在于，
所述分解产物含有分子量为380～5000的低分子透明质酸。
[28]根据[25]～[27]中任一项所述的抗氧化剂，其特征在于，
所述分子量为380～5000的低分子透明质酸的含量相对于抗氧化剂的总量为10质量％以上。
[29]根据[27]或[28]所述的抗氧化剂，其特征在于，
分子量为1520～5000的低分子透明质酸的比例为分子量为380～5000的低分子透明质酸总量的60质量％以上。
[30]根据[25]～[29]中任一项所述的抗氧化剂，其特征在于，
N-乙酰葡糖胺的含量相对于抗氧化剂的总量为0.01质量％以下。
[31]根据[25]～[30]中任一项所述的抗氧化剂，其特征在于，
总游离氨基酸量相对于抗氧化剂的总量以质量比计为2质量％以上，并且，总蛋白质量相对于抗氧化剂的总量以质量比计为2质量％以上。
[32]根据[31]所述的抗氧化剂，其特征在于，
所述游离氨基酸含有选自异亮氨酸、β-氨基异丁酸、丙氨酸、牛磺酸、苯丙氨酸、天冬氨酸、胱氨酸及酪氨酸中的至少1种。
[33]根据[25]～[32]中任一项所述的抗氧化剂，其特征在于，
包含对所述分解产物的冷冻干燥物进行粉碎而获得的粉碎物。
[34]根据[25]～[33]中任一项所述的抗氧化剂，其特征在于，
含有通过由水和水饱和1-丁醇对所述分解产物进行分液操作而获得的水饱和1-丁醇组分。
[35]根据[25]～[34]中任一项所述的抗氧化剂，其特征在于，
具有捕捉自由基的作用。
[36]根据[25]～[35]中任一项所述的抗氧化剂，其特征在于，
具有抑制活体成分的氧化障碍的作用。
[37]一种抗氧化剂的制造方法，其特征在于，
包括用蛋白酶对含有透明质酸和蛋白质的组合物进行分解的酶处理工序。
[38]根据[37]所述的抗氧化剂的制造方法，其特征在于，
所述组合物为鸡冠，在所述酶处理工序之前，具有将所述鸡冠碎片化为1边0.5cm见方以上的工序。
[39]根据[37]或[38]所述的抗氧化剂的制造方法，其特征在于，
在所述酶处理工序之后，具有对在所述酶处理工序中获得的分解产物进行冷冻干燥之后，进行粉碎而获得粉碎物的工序。
[40]根据[37]～[39]中任一项所述的抗氧化剂的制造方法，其特征在于，
在所述酶处理工序之后，具有对在所述酶处理工序中获得的分解产物进行提纯的提纯工序。
[41]根据[40]所述的抗氧化剂的制造方法，其特征在于，
所述提纯工序包括通过水和水饱和1-丁醇对所述分解产物进行分液操作而获得水饱和1-丁醇组分的分液工序。
[42]一种内服剂，其特征在于，
包含[25]～[36]中任一项所述的抗氧化剂。
[43]一种外用剂，其特征在于，
包含[25]～[36]中任一项所述的抗氧化剂。
[44]根据[43]所述的外用剂，其特征在于，
所述外用剂为化妆品。
[45]一种伤口治疗剂，其特征在于，
含有用蛋白酶对含有透明质酸和蛋白质的组合物进行分解而得到的分解产物的乙酸乙酯提取物。
[46]根据[45]所述的伤口治疗剂，其特征在于，
所述组合物为鸡冠。
[47]根据[45]或[46]所述的伤口治疗剂，其特征在于，
所述分解产物含有分子量为380～5000的低分子透明质酸。
[48]根据[45]～[47]中任一项所述的伤口治疗剂，其特征在于，
所述分子量为380～5000的低分子透明质酸的含量相对于伤口治疗剂的总量为10质量％以上。
[49]根据[47]或[48]所述的伤口治疗剂，其特征在于，
分子量为1520～5000的低分子透明质酸的比例为分子量为380～5000的低分子透明质酸总量的60质量％以上。
[50]根据[45]～[49]中任一项所述的伤口治疗剂，其特征在于，
N-乙酰葡糖胺的含量相对于伤口治疗剂的总量为0.01质量％以下。
[51]根据[45]～[50]中任一项所述的伤口治疗剂，其特征在于，
总游离氨基酸量相对于伤口治疗剂的总量以质量比计为2质量％以上，并且，总蛋白质量相对于伤口治疗剂的总量以质量比计为2质量％以上。
[52]根据[51]所述的伤口治疗剂，其特征在于，
所述游离氨基酸含有选自异亮氨酸、β-氨基异丁酸、丙氨酸、牛磺酸、苯丙氨酸、天冬氨酸、胱氨酸及酪氨酸中的至少1种。
[53]根据[45]～[52]中任一项所述的伤口治疗剂，其特征在于，
包含对所述分解产物的冷冻干燥物进行粉碎而获得的粉碎物的乙酸乙酯提取物。
[54]根据[45]～[53]中任一项所述的伤口治疗剂，其特征在于，
所述乙酸乙酯提取物为通过由乙酸乙酯和水对所述分解产物进行分液操作而获得的乙酸乙酯组分。
[55]根据[45]～[54]中任一项所述的伤口治疗剂，其特征在于，
具有促进人类成纤维细胞迁移的作用。
[56]一种伤口治疗剂的制造方法，其特征在于，
包括用蛋白酶对含有透明质酸和蛋白质的组合物进行分解而获得分解产物的酶处理工序及通过由乙酸乙酯和水对所述分解产物进行分液操作而获得乙酸乙酯组分的分液工序。
[57]根据[56]所述的伤口治疗剂的制造方法，其特征在于，
所述组合物为鸡冠，在所述酶处理工序之前，具有将所述鸡冠碎片化为1边0.5cm见方以上的工序。
[58]根据[56]或[57]所述的伤口治疗剂的制造方法，其特征在于，
在所述酶处理工序之后，具有对在所述酶处理工序中获得的分解产物进行冷冻干燥之后，进行粉碎而获得粉碎物的工序，
在所述分液工序中，通过由乙酸乙酯和水对所述粉碎物进行分液操作而获得乙酸乙酯组分。
[59]根据[56]～[58]中任一项所述的伤口治疗剂的制造方法，其特征在于，
在所述分液工序之后，具有对在所述分液工序中获得的乙酸乙酯组分进行提纯的提纯工序。
[60]一种内服剂，其特征在于，
包含[45]～[55]中任一项所述的伤口治疗剂。
[61]一种外用剂，其特征在于，
包含[45]～[55]中任一项所述的伤口治疗剂。
[62]根据[61]所述的外用剂，其特征在于，
所述外用剂为化妆品。
发明效果
本发明的神经生长促进剂具有有效地促进神经细胞中的神经突触的形成和生长的作用，且能够获得高神经生长促进效果。本发明的抗氧化剂具有高抗氧化活性，且能够有效地抑制活体成分的氧化障碍。本发明的伤口治疗剂能够以较低的浓度发挥高伤口治愈促进效果，并通过供给至具有伤口的生物体而使该伤口迅速地治愈。并且，根据本发明的制造方法，能够以低成本制造发挥上述有用的作用效果的神经生长促进剂、抗氧化剂及伤口治疗剂。
附图说明
图1是表示在添加及未添加二丁酰cAMP的PC-12细胞的培养基中，以各种浓度添加了蛋白酶分解物的冷冻干燥粉末(神经生长促进剂1)时的神经突触形成率的曲线图。
图2是表示在添加了NGF的PC-12细胞的培养基中，以各种浓度添加了蛋白酶分解物的冷冻干燥粉末(神经生长促进剂1)时的神经突触形成率的曲线图。
图3是表示在添加了二丁酰cAMP的PC-12细胞的培养基中，以各种浓度添加了蛋白酶分解物的冷冻干燥粉末(神经生长促进剂1)、其水饱和1-丁醇(1-BuOH)组分、乙酸乙酯(EtOAc)组分或水组分时的神经突触形成率的曲线图。
图4是表示在实施例1中进行的蛋白酶分解物的提纯工序的方案图。
图5是表示蛋白酶分解物(抗氧化剂1)、抗坏血酸及熊果苷对ABTS自由基阳离子的捕捉活性的曲线图。
图6是表示针对蛋白酶分解物(抗氧化剂1)、抗坏血酸，使用ORAC法进行测定的对烷氧基自由基及过氧自由基的抗氧化活性的曲线图。
图7是表示针对蛋白酶分解物(抗氧化剂1)、抗坏血酸，进行氧化应激诱导性红细胞溶血抑制试验的结果的曲线图。
图8表示对通过对蛋白酶分解物的分液操作而获得的水饱和1-丁醇组分、水组分、乙酸乙酯组分的ABTS自由基阳离子的捕捉活性的曲线图。
图9是表示在实施例2中进行的蛋白酶分解物的提纯工序的方案图。
图10是用于说明伤口治愈促进作用的评价方法的图，图10(a)是表示擦伤阱(well)内的细胞群的状态的示意图，图10(b)是表示由于擦伤而形成的伤处及细胞的最长迁移地点的示意图。
图11是表示针对蛋白酶分解物的乙酸乙酯组分(伤口治疗剂1)、蛋白酶分解物的冷冻干燥粉末、蛋白酶分解物的水组分及水饱和1-丁醇组分，在伤口治愈促进作用的评价中测定的细胞迁移距离的曲线图。
图12是表示在实施例3中进行的蛋白酶分解物的提纯工序的方案图。
具体实施方式
以下，针对本发明进行详细说明。在以下记载的构成要件的说明是根据代表性实施方式和具体例而进行的，但本发明并不限定于这些实施方式。另外，在本说明书中用“～”表示的数值范围是指记载于“～”前后的数值作为下限值及上限值而包括的范围。
1.神经生长促进剂
[神经生长促进剂的详细]
本发明的神经生长促进剂的特征在于，其含有用蛋白酶对含有透明质酸和蛋白质的组合物进行分解而得到的分解产物。
上述组合物中所包含的透明质酸只要是通常用作化妆品和药物的成分的透明质酸，则能够不受特别限制地使用。透明质酸起初是从牛眼的玻璃体中单独分离出的物质，但并不限定于此，还能够使用从动物的关节液或鸡的鸡冠等中单独分离出的物质。并且，可以不是从自然界中单独分离出的物质，而是通过合成或微生物发酵法而获得的物质。
透明质酸为包含氨基酸及糖醛酸的复杂的多糖类，但其结构的细节并无特别限定。例如，能够举出以包含D-葡萄糖醛酸及N-乙酰基-D-氨基葡萄糖的二糖作为重复单元的多糖。组合物中所包含的透明质酸的分子量并无特别限定，但例如鸡冠中所包含的透明质酸由于分子量为600万～1000万，且从鸡冠中提取的透明质酸在提取过程中被分解，因此，平均分子量为几十万～几百万。本发明中所使用的透明质酸只要不会过度损失神经生长促进效果即可，即便是经衍生化或热变性的透明质酸也可以使用。已知的作为所谓透明质酸衍生物的化合物能够有效地使用于本发明。
上述组合物中所包含的蛋白质不受其种类的限制，但极其优选鸡冠中所包含的蛋白质。鸡冠的种类并无特别限制，但优选使用鸡的鸡冠。由于鸡的鸡冠含有透明质酸，因此，在提供用于制造本发明的神经生长促进剂的组合物时，具有不用在鸡冠中特意添加透明质酸的优点。因此，当使用鸡冠时，能够简化本发明的神经生长促进剂的制造工序，并且还能够降低制造成本。
本发明中所使用的组合物可以仅包含蛋白质及透明质酸，也可以包含其他成分或溶剂、分散介质。作为溶剂及分散介质，只要是能够溶解蛋白质和透明质酸的分散介质即可，能够优选使用水或水性缓冲液。并且，组合物也可以是包含蛋白质及透明质酸的天然物质本身。作为成为组合物的天然物质，能够举出动物的关节液和鸡冠，从包含丰富的透明质酸的观点考虑，优选为鸡的鸡冠。
本发明中所使用的分解产物为用蛋白酶对上述组合物进行分解的产物。蛋白酶的种类并无特别限制。只要是通常的蛋白质分解中所使用的蛋白酶，则均能够使用。即，内肽酶和外肽酶均能够使用，并且活性部位可以是丝氨酸、半胱氨酸、金属、天冬氨酸等中的任一种。并且，也可以混合使用多种蛋白酶。作为优选的蛋白酶，例如能够使用链霉蛋白酶。
并且，由于本发明中所使用的分解产物为用蛋白酶对上述组合物进行分解的产物，因此，至少含有通过蛋白酶进行分解的蛋白质的分解物及透明质酸，也可以含有源自未分解的蛋白质(原本在添加蛋白酶之前的组合物中包含的蛋白质)和组合物的其他成分。
作为分解产物中所包含的蛋白质的分解物，能够举出比未分解的蛋白质的分子量低的蛋白质、肽、游离氨基酸，这些可以混合在一起。
并且，分解产物优选含有游离氨基酸。分解产物中所含有的游离氨基酸可以是作为蛋白质的分解物的游离氨基酸，也可以是原本在添加蛋白酶之前的组合物中作为游离氨基酸而包含的游离氨基酸。游离氨基酸的种类根据组合物的成分而异，但对于例如组合物为鸡冠的分解产物，作为含有率较多的氨基酸，能够举出异亮氨酸、β-氨基异丁酸、丙氨酸、牛磺酸、苯丙氨酸、天冬氨酸、胱氨酸、酪氨酸等，除此以外，包含多种氨基酸。
神经生长促进剂中的总蛋白质量相对于神经生长促进剂的总量以质量比计优选为0.5～10质量％，更优选为1～7质量％，进一步优选为2～5质量％。并且，神经生长促进剂中的总游离氨基酸量相对于神经生长促进剂的总量以质量比计优选为0.5～12质量％，更优选为1～8质量％，进一步优选为2～6质量％。通过神经生长促进剂中的总蛋白质量及游离氨基酸量在上述范围，认为神经生长促进剂有效地作用，能够显著促进神经细胞中的神经突触的形成和生长。
本说明书中，“总蛋白质量”是指通过Lowry法求得的总蛋白质含量，“总游离氨基酸量”是指通过Ninhydrin法求得的游离氨基酸的总量。
上述分解产物中所包含的透明质酸可以是原本在添加蛋白酶之前的组合物中所包含的透明质酸直接残留的透明质酸(以下，称为“未分解的透明质酸”)，也可以是透明质酸的分解物(以下，称为“低分子透明质酸”)，也可以是未分解的透明质酸和低分子透明质酸混合在一起的透明质酸，但优选含有低分子透明质酸。低分子透明质酸容易渗透到生物体的深部，能够有效地获得对生物体的作用。分解产物中所含有的低分子透明质酸可以是在组合物中，使透明质酸进行加水分解而获得的低分子透明质酸，可以是指在与上述组合物不同的体系中，使透明质酸进行加水分解，并将所获得的低分子透明质酸添加到分解产物而得到的低分子透明质酸，但优选在组合物中，使透明质酸进行加水分解而获得的低分子透明质酸。在组合物中，低分子透明质酸的生成能够通过将盐酸或透明质酸酶等使透明质酸进行加水分解的物质添加到组合物来进行。并且，组合物为天然物质的情况下，可以利用通过原本在天然物质中所包含的物质的自身消化而生成低分子透明质酸。但是，从有效地获得对透明质酸的活体的作用的观点考虑，透明质酸优选保持构成单元，即不进展到分解成葡萄糖醛酸及N-乙酰葡糖胺。具体而言，神经生长促进剂中的N-乙酰葡糖胺的含量相对于神经生长促进剂的总量优选为0.01质量％以下，最优选为0质量％。
本说明书中，“N-乙酰葡糖胺量”是指通过Morgan-Elson法求得的N-乙酰葡糖胺含量。
分解产物中所含有的低分子透明质酸优选分子量为380～5000。分子量380～5000相当于以透明质酸的重复单元数计为约1～14。神经生长促进剂中的分子量380～5000的低分子透明质酸的含量相对于神经生长促进剂的总量优选为5质量％以上，更优选为7质量％以上，进一步优选为10质量％以上。并且，在低分子透明质酸中，优选分子量1520～5000的低分子透明质酸为主成分，分子量1520～5000的低分子透明质酸的比例优选为分子量380～5000的低分子透明质酸总量的60质量％以上，更优选为70质量％以上，进一步优选为75质量％以上。由此，认为神经生长促进剂有效地作用，能够显著促进神经细胞中的神经突触的形成和生长。
低分子透明质酸的分子量和质量比率能够通过将聚乙二醇用于分子量标记的高效液相色谱法来分析。
分解产物的性状根据所使用的组合物的成分和组成比、蛋白酶的种类而异，但通常为液态，进一步为带粘性的液态。分解产物可以直接作为本发明的神经生长促进剂，也可以适当地进行提纯而与其他成分组合等来作为本发明的神经生长促进剂。通过提纯分解产物，能够设为神经生长促进效果更高的神经生长促进剂。液态的神经生长促进剂能够用作涂布和滴眼液的外用剂，作为饮料类的内服剂等使用。并且，将分解产物通过冷冻干燥等来进行干燥之后，在进行粉碎时，能够投提供粉末状神经生长促进剂。粉末状神经生长促进剂可以直接或者使其含有其他成分而使用于内服剂，也可以加工成片剂和胶囊剂，也可以添加所希望的溶剂或分散介质而成为液态，以用作涂布和滴眼液的外用剂和饮料类的内服剂等。
本发明的神经生长促进剂除了上述分解产物以外，能够含有各种成分。例如，使神经生长促进剂含有赋形剂的情况下，能够通过控制分解产物和赋形剂的调配率来调整总蛋白质量和总游离氨基酸量、低分子透明质酸量等成分量。并且，作为容易保存的神经生长促进剂的方式，能够举出使用赋形剂稀释对冷冻干燥的分解产物进行粉碎而获得的粉末的混合粉末。作为赋形剂，并无特别限定，但优选糊精。赋形剂的稀释倍率以质量比计优选为2～10倍，更优选为2～7倍，进一步优选为3～5倍。
本发明的神经生长促进剂具有促进神经细胞中的神经突触的形成和生长的作用(神经生长促进作用)，尤其能够有效地促进通过神经生长因子(NGF)衍生的神经突触的形成和生长。
因此，本发明的神经生长促进剂被口服摄入，当其成分在肠道吸收时，在所到达的神经系统中，有效地促进神经突触的形成和生长，有助于通过神经突触的变性或损伤而受损的神经回路的重建。由此，能够有效地缓解由神经变性疾病或神经损伤引起的认知功能和运动功能障碍。在此，由于本发明的神经生长促进剂使用作为活体成分的透明质酸和蛋白质、反应缓慢的酶，因此具有安全性高，且容易作为口服摄入的内服剂来使用的优点。
并且，本发明的神经生长促进剂具有促进在培养基中培养的干细胞分化为神经细胞的作用。因此，本发明的神经生长促进剂能够在利用iPS细胞等多能干细胞和神经前体细胞的再生医疗领域中，作为促进这些干细胞向神经细胞的分化的分化促进剂而有效地使用。由此，能够高效地进行来自干细胞的神经细胞的生产，并能够对提高与再生医疗相关的各种产业的生产效率及减少成本有很大贡献。
本发明的神经生长促进剂的使用量根据作为对象的障碍而异，但优选例如以如下使用量使用。
例如，将本发明的神经生长促进剂作为内服药来口服给药的情况下，其供给量优选为80～2000mg/成人标准体重/天，适宜1天分2～3次供给。
并且，将本发明的神经生长促进剂添加到培养多能干细胞和神经前体细胞的培养基的情况下，其添加量相对于总量以质量比率计优选为0.1质量％以上，更优选为0.2质量％以上，进一步优选为0.2～1.0质量％。并且，作为蛋白酶分解物的添加量以冷冻干燥物计优选为0.03质量％以上，更优选为0.05质量％以上，进一步优选为0.05～0.25质量％。
[神经生长促进剂的制造方法]
接着，针对本发明的神经生长促进剂的制造方法进行说明。
本发明的神经生长促进剂的制造方法的特征在于，包括用蛋白酶对含有透明质酸和蛋白质的组合物进行分解的酶处理工序。
本发明的神经生长促进剂的制造方法可以根据需要进一步具有其他工序。例如，组合物为鸡冠的情况下，在酶处理工序之前，可以具有对鸡冠进行碎片化的碎片化工序。并且，可以具有在酶处理工序之后，将分解产物进行过滤的过滤工序、将过滤后的分解产物进行干燥之后，进行粉碎的制粉工序及将过滤后的分解产物进行提纯的提纯工序。以下，对本发明的神经生长促进剂的制造方法进行详细说明。
首先，准备含有透明质酸和蛋白质的组合物。作为组合物利用鸡的鸡冠的情况下，可以不受性别、年龄的限制而使用。但是，优选在采取之后尽可能不搁置时间提供于蛋白酶分解。并且，当搁置时间后进行蛋白酶分解时，优选在冷冻保存之后进行解冻来使用。
将鸡冠进行蛋白酶分解时，优选首先进行将鸡冠进行碎片化的碎片化工序之后，使该鸡冠的碎片与含蛋白酶溶液接触。鸡冠优选设为0.5cm见方以上，更优选设为0.7cm见方以上，进一步优选设为0.9cm见方以上的碎片。若过度细片化或若过度设为碎末状，则水分会过度地流出，因此不优选。
接着，进行用蛋白酶对组合物进行分解的酶处理工序。关于本发明的制造方法中所使用的蛋白酶的说明，能够参考上述[神经生长促进剂]栏的蛋白酶的说明。酶处理根据组合物和蛋白酶的种类而异，但例如组合物为鸡冠等固体物质或粉末的情况下，优选通过将溶解了蛋白酶的水溶液等溶液(酶液)添加到组合物之后，放置一定时间来进行。在此，酶液的pH优选为5.0～10.0，处理温度优选为40～60℃，处理时间优选为0.5～3.0小时。并且，优选一边震动添加了酶液的组合物，一边进行酶处理。
如上述方式获得的分解产物能够通过过滤等方法去除鸡冠等固体成分而用作液态分解产物。并且，通过进行冷冻干燥等进行干燥并进一步粉碎的制粉工序，能够用作粉末状的分解产物。这些分解产物可以直接作为本发明的神经生长促进剂，也可以适当地进行提纯，组合赋形剂等其他成分等而作为本发明的神经生长促进剂。
如此，本发明的神经生长促进剂能够以非常简单的工序来制造。因此，能够通过使用本发明的神经生长促进剂的制造方法并以低成本提供实用性高的神经生长促进剂。
并且，通过将过滤后的分解产物和粉末状的分解产物进行提纯，能够设为神经生长促进效果更高的神经生长促进剂。提纯分解产物的详细方法，能够参考后述的实施例1的＜蛋白酶分解物的提纯＞栏。在对分解产物进行提纯时，优选对分解产物进行通过水和水饱和1-丁醇的分液操作。通过该分液操作而获得的水饱和1-丁醇组分包含神经生长促进效果高的成分，通过进一步进行柱层析(column chromatography)等其他提纯操作，从而能够获得神经生长促进效果非常高的神经生长促进剂。
[神经生长促进剂的用途]
如上所述，本发明的神经生长促进剂具有神经生长促进作用，并且具有如多能干细胞或神经前体细胞的具有促进干细胞分化为神经细胞的作用。
因此，本发明的神经生长促进剂能够对人类等动物供给以作为缓解由其神经变性疾病和神经损伤引起的功能障碍的内服剂而有效地使用。在作为内服剂的神经生长促进剂中，除了上述分解产物和赋形剂以外，能够根据需要使其含有各种成分。例如，能够根据需要含有维生素、蔬菜粉末、矿物、酵母提取物、着色剂、增稠剂等。这些成分的种类并没有特别限制，能够在充分发挥成为目标功能的范围内，适当地对含量进行调节。
并且，本发明的神经生长促进剂在利用iPS细胞等多能干细胞和神经前体细胞的再生医疗领域中，通过添加到培养基和细胞的稀释液，能够作为促进向这些干细胞的神经细胞的分化的分化促进剂而优选使用。添加神经生长促进剂的培养基可以为液体(肉汤)培养基、半流动培养基、固态(琼脂)培养基中的任一种，其组成也并无特别限制。并且，关于稀释液，虽然通常作为生理盐水等细胞的稀释液而使用，但能够适用于任一种。
2.抗氧化剂
[抗氧化剂的详细]
关于本发明的抗氧化剂的原料、成分、组成、制造、适用方式及该等优选方式，能够参考有关上述神经生长促进剂的原料、成分、组成、制造、适用方式的记载及优选方式。
本发明的抗氧化剂具有捕捉自由基的作用，发挥高抗氧化活性。
在此，本说明书中的“抗氧化活性”是指防止氧化的性质，除了抑制活体成分(DNA、脂质、酶及蛋白质等)的氧化障碍的功能以外，还包括防止由于食品等氧化而导致劣化的功能等。本发明的抗氧化剂发挥这两方面的功能，但从实用性尤其高的观点考虑，优选利用抑制活体成分的氧化障碍的功能。
本发明的捕捉于抗氧化剂的自由基并无特别限定，可以是作为活性氧的自由基，也可以是活性氧以外的自由基。作为自由基的具体例，能够举出过氧化物(·O2 -)、羟基自由基(HO·)、氢过氧自由基(HOO·)、烷氧自由基(RO·)、烷基过氧自由基(ROO·)等。
如此，由于本发明的抗氧化剂具有高抗氧化活性，因此口服摄入，当其成分在肠道吸收时，捕捉活体内所产生的活性氧，并能够有效地抑制活体成分的氧化障碍。其结果，抑制老化的进行，并且，能够抑制由生活常见疾病或癌症等氧化应激引起的各种疾病的发病。
在此，由于本发明的抗氧化剂使用成为活体成分的透明质酸和蛋白质，且使用反应缓慢的酶，因此安全性高，作为口服摄入的内服剂，具有容易使用的优点。
并且，本发明的抗氧化剂还能够适用于皮肤。从皮肤吸收至内部的成分能够有效抑制捕捉在表皮和真皮及皮下组织所产生的活性氧、皮肤的老化或炎症及色素沉积等障碍。并且，未从皮肤吸收至活体内，而在皮肤表面残留的成分捕捉皮肤的表面或表面附近所产生的活性氧，并有效地抑制由活性氧引起的皮肤的老化和炎症及色素沉积等障碍。由于本发明的抗氧化剂经过通过蛋白酶的分解，因此，通过其条件的变更而能够控制来自皮肤的吸收性，由此，能够优先作用于特定部位(例如皮肤表面、皮肤的表面附近或皮肤的深部等)。
本发明的抗氧化剂的使用量根据作为对象的障碍而异，但在将例如本发明的抗氧化剂作为内服药而口服给药的情况下，其供给量优选为80～2000mg/成人标准体重/天，适宜1天分成2～3次供给。
并且，在将本发明的抗氧化剂作为化妆品或外用药而涂布于皮肤的情况下，其涂布量优选为0.5g～5.0g/10cm2，适宜的使用次数为1～4次/天左右。
[抗氧化剂的用途]
如上所述，本发明的抗氧化剂具有高抗氧化活性，能够有效地抑制活体成分的氧化障碍。因此，本发明的抗氧化剂能够作为对人类等动物供给的内服剂或外用剂而有效地使用。本发明的抗氧化剂为外用剂的情况下，可以为外用药，也可以为化妆品。当为化妆品的情况下，能够以例如乳液、乳膏、化妆水、精华素等基础化妆品材料、口红、粉底、粉底液、彩妆粉饼、扑粉、眼影等彩妆化妆品材料等的方式优选使用。
本发明的抗氧化剂根据其用途，除了上述分解产物和赋形剂以外，还能够含有各种成分。例如，能够根据需要含有维生素、蔬菜粉末、矿物、酵母提取物、着色剂及增稠剂等。这些成分的种类并无特别限制，能够在充分发挥目标功能的范围内，适当地对含量进行调节。
并且，作为抗氧化剂的化妆品中，能够根据需要适当地调配通常使用于化妆品的调配成分，例如油性成分、表面活性剂、保湿剂、增稠剂、防腐剂·杀菌剂、粉体成分、紫外线吸收剂、色素、香料等。
3.伤口治疗剂
[伤口治疗剂的详细]
本发明的伤口治疗剂的特征在于，其含有用蛋白酶对含有透明质酸和蛋白质的组合物进行分解而得到的分解产物的乙酸乙酯提取物。
关于在提取乙酸乙酯之前的“用蛋白酶对含有透明质酸和蛋白质的组合物进行分解而得到的分解产物”原料、成分、组成、制造及这些的优选方式，能够参考有关上述神经生长促进剂的原料、成分、组成及制造的记载及优选方式。
使用乙酸乙酯的提取方法并无特别限定，可以是使用乙酸乙酯及非相溶性溶剂的分液法(液-液提取法)，也可以将乙酸乙酯用作提取溶剂的溶剂提取法(固-液提取法)，但由于分解产物通常为液态，因此，分液法更为常用。在此，分液法中的“非相溶性溶剂”是指，即使与乙酸乙酯接触也不会混合的相互分离的溶剂，具体而言，能够举出水、己烷、氯仿，乙醚等，优选为水。通过分液法或溶剂提取法获得的乙酸乙酯提取物为液态，可以直接作为本发明的伤口治疗剂，也可以适当地进行提纯而与其他成分组合等来作为本发明的伤口治疗剂。通过对乙酸乙酯提取物进行提纯，能够设为伤口治愈促进效果更高的伤口治疗剂。液态伤口治疗剂能够用于涂布或滴眼液的外用剂及饮料类的内服剂等使用。并且，通过冷冻干燥等将乙酸乙酯提取物进行干燥之后，进行粉碎的情况下，能够提供粉末状的伤口治疗剂。粉末状的伤口治疗剂可以直接或使其含有其他成分而用于内服剂，也可以加工成片剂和胶囊剂，也可以添加所希望的溶剂或分散介质而成为液态，并用作涂布和滴眼液的外用剂和饮料类的内服剂等使用。
本发明的伤口治疗剂除了上述分解产物以外，还能够含有各种成分。例如，使伤口治疗剂含有赋形剂的情况下，能够通过控制乙酸乙酯提取物与赋形剂的调配率来调整总蛋白质量和总游离氨基酸量、低分子透明质酸量等成分量。并且，作为容易保存的伤口治疗剂的方式，能够举出使用赋形剂稀释对冷冻干燥的乙酸乙酯提取物进行粉碎而获得的粉末的混合粉末。作为赋形剂，并无特别限定，但糊精较适宜。通过赋形剂的稀释倍率以质量比计优选为2～10倍，更优选为2～7倍，进一步优选为3～5倍。
当供给本发明的伤口治疗剂时，能够显著激活(促进)向成纤维细胞的伤口部位的迁移，并能够促进伤口的治愈。由此，能够迅速地治愈伤口。并且，通过预先供给本发明的伤口治疗剂，能够成为形成伤口时可以迅速恢复的状态。在此，本发明的伤口治疗剂不是用蛋白酶对含有透明质酸和蛋白质的组合物进行分解而得到的分解产物本身，与直接含有分解产物的伤口治疗剂发挥显著效果的浓度相比，通过含有其分解产物的乙酸乙酯提取物能够以非常低的浓度提高伤口治愈促进效果。因此，即使含有其他成分或赋形剂，也得到充分的伤口治愈促进效果，获得容易实现改进制剂的效果。并且，每单位制剂中使用的原料使用量受很大抑制，能够大幅度减少成本。
本发明的伤口治疗剂的给药方式并无特别限制，可以口服给药，也可以对伤口部位直接给药。口服摄入本发明的伤口治疗剂的情况下，通过在其肠道吸收的伤口治疗剂的成分，不仅对外伤起作用，而且对活体内的伤口也起到了治愈促进作用，能够迅速治愈这些伤口，并且，通过口服给药在如下情况有效：在全身背负多个伤口的情况、在自身难以进行局部适用的部位背负伤口的情况及对婴幼儿或老人等难以察觉背负伤口的情况等。在此，由于本发明的伤口治疗剂使用成为活体成分的透明质酸和蛋白质、反应缓慢的酶，因此安全性高，作为口服摄入的内服剂，具有容易使用的优点。
并且，本发明的伤口治疗剂还能够适用于皮肤。本发明的伤口治疗剂适用于皮肤的情况下，从皮肤吸收的伤口治疗剂的成分局部作用于适用处附近的伤口，能够迅速治愈其伤口。
能够通过组合透明质酸和蛋白质分解物，并进一步供给通过乙酸乙酯从其中提取的成分(乙酸乙酯提取物)来首次提高本发明的伤口治疗效果。关于这种伤口治疗效果，除了上述乙酸乙酯提取物以外，能够通过同时摄入尤其是抗坏血酸等维生素类和蔬菜粉末来进一步提高。蔬菜粉末是将以胡萝卜为代表的蔬菜进行粉末化的粉末，但也可以仅使用提取物。相对于上述酯提取物的蔬菜粉末的固体成分重量比优选在1∶100至100∶1的范围内，更优选在1∶10至10∶1的范围内，更进一步优选在1∶2至2∶1的范围内。
本发明的伤口治疗剂的供给量能够考虑给药对象的年龄、体重、伤口的状态、伤口的位置、给药方式等而适当地确定。例如将本发明的伤口治疗剂作为内服药进行口服给药的情况下，其供给量优选为80～2000mg/成人标准体重/天，适宜1天分成2～3次供给。
并且，将本发明的伤口治疗剂作为外用药或化妆品而涂布于皮肤的情况下，其涂布量优选为0.5g～5.0g/10cm2，适当的使用次数为1～4次/天左右。
[伤口治疗剂的制造方法]
本发明的伤口治疗剂的制造方法的特征在于，包括用蛋白酶对含有透明质酸和蛋白质的组合物进行分解而获得分解产物的酶处理工序及通过乙酸乙酯和水对分解产物进行分液操作而获得乙酸乙酯提取物的分液工序。其中，关于获得分解产物的酶处理工序，能够参考有关上述神经生长促进剂的制造工序的记载及优选方式。
分液工序中使用的乙酸乙酯和水的容量比优选为1∶1～10∶1，更优选为1∶1～5∶1，进一步优选为1∶1～3∶1。并且，在进行分液操作时的环境温度优选为0～70℃，更优选为10～50℃，进一步优选为20～30℃。分液操作可以进行1次，也可以进行多次，但优选进行多次。分液操作的顺序并无特别限定，能够以通常的分液操作顺序进行。作为优选的方法，能够举出如下方法：将用水稀释分解产物的冷冻干燥物而得到的稀释液投入到分液漏斗中，向其中加入乙酸乙酯，并摇动分液漏斗。由此，水组分成为下层、乙酸乙酯组分成为上层而进行分离，由此采取其上层的乙酸乙酯组分。并且，进行多次分液操作的情况下，反复进行在残留于分液漏斗中的水组分中加入新的乙酸乙酯，并摇动分液漏斗之后，采取乙酸乙酯组分的分液操作。由此，能够更可靠地提取水组分中所包含的可溶于乙酸乙酯的成分。如上述方式获得的乙酸乙酯组分能够用作液态的乙酸乙酯提取物。并且，还能够通过进行冷冻干燥等干燥而进一步进行粉碎而用作粉末状的乙酸乙酯提取物。这些乙酸乙酯提取物可以直接作为本发明的伤口治疗剂，也可以适当地进行提纯，并与赋形剂等其他成分进行组合等而作为本发明的伤口治疗剂。
如此，本发明的伤口治疗剂能够以非常简单的工序来制造。因此，通过使用本发明的伤口治疗剂的制造方法，能够以低成本提供实用性高的伤口治疗剂。
并且，通过对乙酸乙酯提取物进行提纯，能够设为伤口治愈促进效果更高的伤口治疗剂。乙酸乙酯提取物的提纯能够使用柱层析等。关于该提纯方法的详细内容，能够参考后述的实施例3的＜蛋白酶分解物的提纯＞栏。
[伤口治疗剂的用途]
如上所述，本发明的伤口治疗剂具有高伤口治愈促进效果，能够迅速地治愈伤口。因此，本发明的伤口治疗剂能够作为供给于人类等动物的内服剂或外用剂而有效地使用。本发明的伤口治疗剂为外用剂的情况下，可以为外用药，也可以为化妆品。当为化妆品的情况下，能够以例如乳液、乳膏、化妆水、精华素等基础化妆品材料、口红、粉底、粉底液、彩妆粉饼、扑粉、眼影等彩妆化妆品材料等的方式优选使用。
本发明的伤口治疗剂根据其用途，除了上述分解产物和赋形剂以外，还能够含有各种成分。例如，能够根据需要含有维生素、蔬菜粉末、矿物、酵母提取物、着色剂及增稠剂等。这些成分的种类并无特别限制，能够在充分发挥目标功能的范围内，适当地对含量进行调节。。
并且，在作为伤口治疗剂的化妆品中，还能够根据需要适当地调配通常在化妆品中使用的调配成分，例如油性成分、表面活性剂、保湿剂、增稠剂、防腐剂·杀菌剂、粉体成分、紫外线吸收剂、色素、香料等。
[实施例]
以下，列举实施例对本发明进行进一步具体的说明。以下实施例中示出的材料、比例、操作等，只要不脱离本发明的主旨就能够适当地变更。从而，本发明的范围并不被以下示出的具体例而限定地解释。
实施例1：神经生长促进剂
[制造例]
将新鲜采样的1kg鸡的鸡冠切割成约1cm见方进行碎片化，并通过在100℃下进行了蒸汽加热来加热灭菌。在该碎片状的鸡冠中添加以蛋白酶为中心的源自食物的酶类，并在45℃下反应1.5小时之后，通过搅拌进行均质化。然后，通过过滤去除粗大的固体成分，获得了液态的分解产物(以下，称为“蛋白酶分解物”)。该蛋白酶分解物的pH为6.5、Brix值为6.20，固体成分浓度为5.91质量％。通过将该蛋白酶分解物进行冷冻干燥并进行粉碎而获得了蛋白酶分解物的冷冻干燥粉末(神经生长促进剂1)。并且，在该蛋白酶分解物的冷冻干燥粉末中添加3倍等量(质量比)的糊精，从而制造了糊精添加冷冻干燥粉末(神经生长促进剂1’)。
[分析法]
通过下述方法进行了本实施例中所制造的神经生长促进剂的成分分析。
(1)水分含量的测定
将1g神经生长促进剂在105℃下加热干燥3小时，并用精密天平求出恒定重量以对水分含量进行了定量。
(2)总氮的定食
通过基于AOAC法的半微量凯氏定氮法(Semi-micro Kjeldahl method)对总氮进行了定量。
(3)游离氨基酸的定量及氨基酸组成的分析
通过茚三酮(Ninhydrin)法对总游离氨基酸量进行了定量。在定量中，作为标准氨基酸制作并使用了亮氨酸的校准曲线。并且，使用安装有活体分析用柱的氨基酸自动分析装置(Hitachi，Ltd.制造，L-8500型)对游离氨基酸的组成进行了分析。在该分析中，将50mg的神经生长促进剂溶解于蒸馏水，并用旋转蒸发器(Rotary evaporator)(60℃)进行减压干燥固化之后，用5mL的0.02N盐酸进行洗提，并用滤纸过滤之后，将用无菌过滤器过滤的50μL滤液用作分析试样。
(4)蛋白质的定量
通过Lawry法确定了总蛋白质量。在制作标准校准曲线时使用了牛血清白蛋白。
(5)N-乙酰基-D-氨基葡萄糖的定量
通过Morgan-Elson法对N-乙酰基-D-氨基葡萄糖含量进行了定量。
(6)糖胺聚糖的定量
通过基于2-硝基苯肼偶联法的比色法进行了分析。标准校准的制作中使用了源自鸡冠的透明质酸钠(FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation制造，HARC)及源自兽疫链球菌(streptococcus zooepidemicus)的透明质酸钠(FUJIFILM Wako Pure ChemicalCorporation制造，HASZ)。
(7)低分子透明质酸的分子量测定
通过安装了差示折射计(Shimadzu Corporation制造，RID-10A型)的高速液相色谱法(Shimadzu Corporation制造)来推断透明质酸的分子量。作为柱使用TSKgel G-2，500PWXL(7.8mmID×30cm)，以水作为移动相以1ml/min的流速进行了分析。分子量标记中使用了分子量400、1000、2000、6000这4种聚乙二醇(Aldrich公司制造)。并且，各低分子透明质酸的构成重量比是通过将神经生长促进剂和糊精的样品通过高效液相色谱法进行分析，并通过从神经生长促进剂所显现的峰的峰面积减去糊精的峰面积而求得。
[神经生长促进剂的成分分析]
通过上述方法，对所制造的神经生长促进剂1’进行了成分分析。所测定的一般成分的含有率示于表1，游离氨基酸的组成示于表2，低分子透明质酸的分子量的分析结果示于表3。另外，表1～表3中的“％”表示“质量％”。
[表1]
表1-一般成分
[表2]
表2游离氨基酸组成
*表示蛋白质构成氨基酸
[表3]
表3低分子HA的推断分子量，构成单元数及构成重量比率
如表2所示，在神经生长促进剂1’中所包含的游离氨基酸中，异亮氨酸、β-氨基异丁酸的含量多，包含得其次多的是丙氨酸、牛磺酸、苯丙氨酸、天冬氨酸、胱氨酸、酪氨酸等。
并且，如表3所示，可知神经生长促进剂1’中所包含的低分子透明质酸中包含推断分子量5000、1520、1140、760及380这5种。并且，若透明质酸的重复单元的1个分子量设为约400，则各低分子透明质酸的重复单元数按分子量从大到小的顺序排列为13～14、4、3、2及1，质量比率为33％、47％、10％、6％及4％。因此，可知低分子透明质酸的主要成分为分子量1520左右的4分子成分及分子量5000左右的13～14分子成分这2个成分。另外，神经生长促进剂1’中的，分子量380～5000的低分子透明质酸的含有率相对于神经生长促进剂1’的总量为13.4质量％。
[神经突触形成促进作用的评价]
(a)二丁酰cAMP诱导性神经突触形成促进作用的评价
针对在制造例中制造的神经生长促进剂1(蛋白酶分解物的冷冻干燥粉末)，对二丁酰cAMP诱导性神经突触形成促进作用进行了评价。评价用样品为将神经生长促进剂1以各种浓度溶解于下述液体培养基中的溶液。
按照Biol.Pharm.Bull.，26，341-346(2003)中记载的方法，并使用源自大鼠肾上腺髓质嗜铬细胞瘤PC-12细胞，对二丁酰cAMP诱导性神经突触形成促进作用进行了评价。
首先，在包括10％HS(Horse Serum：马血清)及5％FBS(Fetal Bovine S erum：胎牛血清)的RPMI-1640培养基(液体培养基)中，制备了PC-12细胞悬浊成4.4×104cells/mL的细胞悬浊液。将该细胞悬浊液以90μL/well的量播种于涂有胶原蛋白的96阱微孔板之后，在包含5％CO2的空气气相中，在37℃下培养了24小时。培养之后，以二丁酰cAMP(DibutyrylCyclic Adenosine Monophosphate：二丁酰环磷酸腺苷)的最终浓度成为0.5mM的方式添加到各阱中，并且，将各评价用样品分别以每5nL的量添加到各阱中。在添加二丁酰cAMP和各评价用样品后，经24小时后去除培养基，将1％戊二醛以每100μL的量分注到各阱中，并通过静置20分钟来固定细胞。然后，去除戊二醛，并将姬姆萨染色液以每100μL的量分注到各阱中，通过放置20分钟来进行染色。然后，去除姬姆萨染色液，用超纯水清洗2次，并使其干燥。
如上述方式进行细胞的固定及染色之后，对每1个阱的250～400个细胞测量长度，将具有比细胞体的长径更长的神经突触的细胞判定为阳性细胞。求出阳性细胞数相对于测量中所提供的细胞总数的百分率(神经突触形成率)的结果示于图1。
并且，在培养PC-12细胞的各阱内未添加二丁酰cAMP，并通过添加上述液体培养基5μL来代替二丁酰cAMP，除此以外，进行了相同的评价。其结果也一并示于图1。
观察图1可知，在添加及未添加二丁酰cAMP的任一体系中，随着神经生长促进剂1的添加，神经突触形成率增高。由此，能够确认神经生长促进剂1具有促进神经突触的形成和生长的作用。但是，发现在添加了二丁酰cAMP的体系中，神经生长促进剂1的培养基中的浓度为0.3μg/mL为止，依赖于其浓度而神经突触形成率增高，但若浓度超过0.3μg/mL，则具有神经突触形成率反而降低的倾向。由此，可知添加于培养基的神经生长促进剂1的浓度优选设为0.3μg/mL以下。
(b)NGF诱导神经突触形成促进作用的评价
在实际活体内，神经生长因子(NGF：nerve growth factor)起到神经轴突的生长及神经递质的合成促进作用、神经细胞的维持作用、细胞损伤时的修复作用、脑神经的功能恢复作用。因此，由于在此确认到本发明的神经生长促进剂在与活体内相似的条件下有效地发挥作用，因此，对NGF诱导性神经突触形成促进作用进行了评价，并且调查了所形成的神经突触是否为正常分化衍生的神经突触。评价用样品为将神经生长促进剂1以各种浓度溶解于上述液体培养基的溶液。
关于NGF诱导性神经突触形成促进作用的评价，将培养基中悬浊的PC-12细胞的数量变更为2.2×104cells/mL，代替二丁酰cAMP，以最终浓度成为10ng/mL的方式将神经生长因子添加到各阱中，在添加NGF及评价用样品之后，经过48小时后，去除培养基并通过戊二醛进行细胞固定，除此以外，以与上述二丁酰cAMP诱导性神经突触形成促进作用的评价相同的方式进行了评价。将对各阱内的细胞群求得的神经突触形成率的结果示于图2。
从图2中确认到，发现NGF诱导性神经突触形成率也具有与图1所示的二丁酰cAMP诱导性神经突触形成率相同的浓度依赖性，通过添加神经生长促进剂1，在0.003μg/mL左右的低浓度范围发挥显著的神经突触形成促进效果。
并且，针对用NGF及神经生长促进剂1处理的PC-12细胞，使用一级抗体Anti-neurofilament 200IgG fraction of antiserum：抗神经丝200IgG片段抗血清)及二级抗体(Anti-Rabbit IgG(whole molecule)-FITC antibody produced in goat：抗兔IgG(整个分子)-源自山羊的FITC抗体)进行了免疫荧光染色，其结果确认到显现出作为分化标记的神经丝。
从这些内容能够确认，神经生长促进剂1具有促进NGF诱导性神经突触形成的作用，且有助于有效地促进在活体内的神经突触的形成和生长。
[蛋白酶分解物的提纯]
以如下方式对在上述制造例中制备的蛋白酶分解物的冷冻干燥粉末进行了提纯。
首先，将超纯水加入到蛋白酶分解物的冷冻干燥粉末32.0g中并进行过滤，对其滤液加入超纯水以总量成为1.5L的方式进行了稀释。针对该滤液的稀释液进行了2次通过1.5L的乙酸乙酯(EtOAc)的分液操作，进而对所获得的水组分进行了2次通过750ml的水饱和1-丁醇的分液操作。针对通过分液操作而获得的水饱和1-丁醇组分、乙酸乙酯组分、水组分进行了上述二丁酰cAMP诱导性神经突触形成促进作用的评价，将其结果示于图3。如图3所示，确认到水饱和1-丁醇组分及乙酸乙酯组分具有高神经突触形成促进效果，确认到尤其水饱和1-丁醇组分具有很强的神经突触形成促进效果。并且，针对通过分液操作而获得的水饱和1-丁醇组分(固体成分：403.3mg)、水组分(固体成分：37.3g)，以如下方式进行了基于柱层析的提纯。其提纯方案示于图4。另外，图4所示的柱中，在柱1、柱5以外的柱中所注入的样品为如下：在前一个柱中洗提的馏分中，在二丁酰cAMP诱导性神经突触形成促进作用的评价中确认到活性较高的馏分或这些馏分的混合液。
(a)水饱和1-丁醇组分的提纯
首先，将水饱和1-丁醇组分注入到下述条件的柱1中，并浇注70％甲醇1L进行了洗提。
(柱1的条件)
柱1：TOYOPEARL HW-40C(直径4.0cm×39.0cm、489.8cm3)
样品：水饱和1丁醇组分(固体成分：393.3mg)
馏分量(size)：馏分1；100mL、馏分2～19；50mL
洗提液：70％甲醇(1L)
将从柱1中洗提的馏分3注入到下述条件的柱2中，并浇注50％甲醇400mL进行了洗提。
(柱2的条件)
柱2：TOYOPEARL HW-40F(直径2.5cm×长度37.8cm、185.5cm3)
样品：柱1的馏分3(固体成分：63.7mg)
流速：1.2mL/min
馏分量：10mL
洗提液：50％甲醇(400mL)
将从柱2中洗提的馏分9～12的混合液注入到下述条件的柱3中，并浇注40％甲醇330mL进行了洗提。
(柱3的条件)
柱3：TOYOPEARL HW-40F(直径2.5cm×长度34.2cm、167.8cm3)
样品：柱2的馏分9～12的混合液(固体成分：33.1mg)
流速：1.2ml/min
馏分量：10mL
洗提液：40％甲醇(330mL)
将从柱3中洗提的馏分7～16的混合液浇注到下述条件的柱4中，并浇注40％甲醇120mL进行了洗提。
(柱4的条件)
柱4：Sephadex LH-20(直径1.5cm×长度34.8cm、61.5cm3)
样品：柱3的馏分7～16的混合液(固体成分：22.2mg)
流速：0.5mL/min
馏分大小：2.0mL
洗提液：40％甲醇(120mL)
将从该柱4中洗提的馏分12～15(固体成分：12.1mg)作为神经生长促进剂2。
(b)水组分的提纯
将水组分注入到下述条件的柱5中，并将甲醇和水浇注到柱中进行了洗提，所浇注的甲醇和水的混合比例(甲醇/水)按0/100、5/95、10/90、20/80、40/60的顺序改变，且每次浇注5.0L。
(柱5的条件)
柱5：DIAION HP20(直径12.0cm×长度40.5cm、4578cm3)
样品：水组分(固体成分：37.3g)
馏分大小：2.5L
洗提液：水、甲醇和水的混合液
将从柱5中洗提的馏分1～2注入到下述条件的柱6中，并将甲醇和水浇注到柱中进行了洗提，所浇注的甲醇和水的混合比例(甲醇/水)按0/100、2.5/97.5、5/95的顺序改变，且每次浇注2.0L。
(柱6的条件)
柱6：DIAION HP20(直径7.0cm×长度39.5cm、1519cm3)
样品：柱5的馏分1～2的混合液(固体成分：4.8g)
馏分大小：400mL
洗提液：水、甲醇和水的混合液
将从柱6中洗提的馏分2～6的混合液注入到下述条件的柱7中，并将水2.05L浇注到柱中进行了洗提。
(柱7的条件)
柱7：TOYOPEARL HW-40C(直径4.0cm×长度41.5cm、521.2cm3)
样品：柱6的馏分2～6的混合液(固体成分：3.5g)
馏分大小：30mL
洗提液：水(2.05L)
将从柱7中洗提的馏分11～15作为神经生长促进剂3。
针对在以上工序中提纯的神经生长促进剂2、3，进行了上述二丁酰cAMP诱导性神经突触形成促进作用的评价，结果能够确认到神经生长促进剂2、3显示出比神经生长促进剂1更高的神经突触形成促进效果。
实施例2：抗氧化剂
将在实施例1的制造例中制造的神经生长促进剂1作为抗氧化剂1，且将神经生长促进剂2作为抗氧化剂2，并进行了以下评价。
[抗氧化活性评价]
(a)自由基捕捉试验
针对所制造的抗氧化剂1(蛋白酶分解物的冷冻干燥粉末)，使用Biol.Pharm.Bull.，29，766-771(2006)中记载的分光光度法对ABTS自由基阳离子(非天然的模型自由基)的自由基捕捉活性进行了评价。具体而言，在包含ABTS自由基阳离子的反应溶液3mL中加入抗氧化剂1，以使最终浓度成为300μg/mL，且在经过5分钟、15分钟、30分钟、60分钟及120分钟的时刻调查了ABTS自由基阳离子的残留率。并且，作为比较，针对代替抗氧化剂1而添加了每次各20μM的抗坏血酸的体系或熊果苷的体系、添加了与抗氧化剂1等量的水的体系(控制(Control))也进行了同样的试验。将这些结果示于图5。
[化学式1]
在观察图5时，能够确认如下：与控制或添加了抗坏血酸的体系相比，添加了抗氧化剂1的体系中ABTS自由基阳离子的残留率大幅度减少，抗氧化剂1显示出优异的自由基捕捉活性。并且，在添加了抗坏血酸或熊果苷的体系中，自由基残留率一旦降低，则即使经过其以上的更多的时间，自由基残留率也没有变化，相对于此，在添加了抗氧化剂1的体系中，在自由基残留率一旦大幅度减少之后，自由基残留率随着时间的经过而逐渐降低。由此，确认到抗氧化剂1的自由基捕捉活性具有持续性，且作为抗氧化剂具有有利的特征。
(b)ORAC法
针对所制造的抗氧化剂1(蛋白酶分解物的冷冻干燥粉末)，使用在Biosci.Biotechnol.Biochem.，72，1558-1563(2008)中记载的ORAC(Oxygen RadicalAbsorbance Capacity：氧自由基吸收能力)法，对由2，2’-偶氮双(2-氨基丙烷)二盐酸盐(AAPH)产生的烷氧基自由基及过氧自由基的抗氧化活性在将反应溶液调整为生理pH(pH7.4)的条件下进行了评价。试验中所使用的抗氧化剂1的量为30μg/mL。并且，作为比较，针对代替抗氧化剂1而添加了每次各3μM的抗坏血酸的体系、添加了与抗氧化剂1等量的水的体系(控制)也进行了同样的试验。将这些结果示于图6。
ORAC法是利用作为荧光探针的荧光素通过自由基而被氧化和分解，从而减少荧光强度的现象的方法，使荧光强度的减少越延迟(使曲线图向右移动)，则能够评价为抗氧化活性越高。并且，在该评价中所使用的烷氧基自由基及过氧自由基为模拟参与活体成分的过氧化反应的脂质烷氧基自由基、脂质过氧自由基的自由基种。因此，在此评价的抗氧化活性能够看作是接近于活体内的抗氧化活性。
从以上的观点观察图6时，显示出如下：与控制或添加了抗坏血酸的体系的曲线图相比，添加了抗氧化剂1的体系的曲线图大幅度向右侧移动，荧光强度的减少更延迟。由此，表明抗氧化剂1可以在活体成分的过氧化反应中发挥远高于抗坏血酸的高抗氧化活性。
(c)氧化应激诱导性红细胞溶血抑制试验
针对所制造的抗氧化剂1(蛋白酶分解物的冷冻干燥粉末)，使用在Food Chem.，134，606-610(2012)中记载的氧化应激诱导性红细胞溶血抑制试验，对由2，2’-偶氮双(2-氨基丙烷)二盐酸盐(AAPH)产生的烷氧基自由基及过氧自由基的抗氧化活性进行了评价。试验中所使用的抗氧化剂1的量为300μg/mL。并且，作为比较，针对代替抗氧化剂1而添加了每次各50μM的抗坏血酸的体系、添加了与抗氧化剂1等量的水的体系(控制)也进行了同样的试验。在相同条件下进行了3次试验，将求出其平均值和标准偏差的结果示于图7。
氧化应激诱导性红细胞溶血抑制试验是利用通过烷氧基自由基及过氧自由基而红细胞膜的脂质和蛋白质被氧化而产生的溶血反应(氧化障碍)，从而红细胞的残留率减少的现象的试验，使溶血反应越延迟(使曲线图向右侧移动)，则能够评价为抗氧化活性越高。
在观察图7时，显示出如下：与控制或添加了抗坏血酸的体系的曲线图相比，添加了抗氧化剂1的体系的曲线图向右侧移动，红细胞的溶血反应更延迟。由此，能够确认到抗氧化剂1具有有效地抑制活体成分的氧化障碍的作用，其作用大大超过抗坏血酸。
[蛋白酶分解物的提纯]
以如下方式对实施例1的制造例中制备的蛋白酶分解物的冷冻干燥物粉末进行了提纯。
首先，将超纯水加入到蛋白酶分解物的冷冻干燥物粉末32.0g中并进行过滤，对其滤液加入超纯水以总量成为1.5L的方式进行了稀释。针对该滤液的稀释液进行了2次通过1.5L的乙酸乙酯(EtOAc)的分液操作，进而对所获得的水组分进行了2次通过750ml的水饱和1-丁醇的分液操作。针对通过分液操作而获得的水饱和1-丁醇组分、乙酸乙酯组分、水组分进行了使用上述ABTS自由基阳离子的自由基捕捉试验。将其结果示于图8。如图8所示，确认到水饱和1-丁醇组分及水组分具有高抗氧化活性，尤其水饱和1-丁醇组分具有很强的抗氧化活性。并且，针对通过各分液操作而获得的水饱和1-丁醇组分(固体成分：403.3mg)、水组分(固体成分：37.3g)，以如下方式进行了基于柱层析的提纯。其提纯方案示于图9。另外，示于图9的柱中，在柱1、柱5以外的柱中所注入的样品为如下：在前一个柱中洗提的馏分中，在使用ABTS自由基阳离子的自由基捕捉试验中确认到活性较高的馏分或这些馏分的混合液。
(a)水饱和1-丁醇组分的提纯
首先，将水饱和1-丁醇组分注入到下述条件的柱1中，并浇注70％甲醇1L进行了洗提。
(柱1的条件)
柱1：TOYOPEARL HW-40C(直径4.0cmx39.0cm、489.8cm3)
样品：水饱和1丁醇组分(固体成分：393.3mg)
馏分量：馏分1；100mL、馏分2～19；50mL
洗提液：70％甲醇(1L)
将从柱1中洗提的馏分4注入到下述条件的柱2中，并浇注50％甲醇400mL进行了洗提。
(柱2的条件)
柱2：TOYOPEARL HW-40F(直径2.5cm×长度35.0cm、171.7cm3)
样品：柱1的馏分4(127.0mg)
流速：1.2mL/min
馏分大小：10mL
洗提液：50％甲醇(400mL)
将从柱2中洗提的馏分13～14的混合液注入到下述条件的柱3中，并浇注40％甲醇400mL进行了洗提。
(柱3的条件)
柱3：TOYOPEARL HW-40F(直径2.5cm×长度34.5cm、170.0cm3)
样品：柱2的馏分13～14的混合液(固体成分：47.8mg)
流速：1.0mL/min
馏分大小：10ml
洗提液：40％甲醇(400mL)
将从柱3中洗提的馏分13注入到下述条件的柱4中，并浇注50％甲醇80mL进行了洗提。
(柱4的条件)
柱4：Sephadex LH-20(直径1.0cm×长度26.0cm、20.41cm3)
样品：柱3的馏分13(固体成分：14.2mg)
流速：0.5mL/min
馏分大小：2.0mL
洗提液：50％甲醇(80mL)
将从柱4中洗提的馏分7～11的混合液作为抗氧化剂2。
(b)水组分的提纯
将水组分注入到下述条件的柱5中，并将甲醇和水浇注到柱中进行了洗提，所浇注的甲醇和水的混合比例(甲醇/水)按0/100、5/95、10/90、20/80、40/60的顺序改变，且每次浇注5.0L。
(柱5的条件)
柱5：DIAION HP20(直径12.0cm×长度40.5cm、4578cm3)
样品：水组分(固体成分：37.3g)
馏分大小：2.5L
洗提液：水、甲醇和水的混合液
将从柱5中洗提的馏分7～12的混合液注入到下述条件的柱6中，并将甲醇和水浇注到柱中进行了洗提，所浇注的甲醇和水的混合比例(甲醇/水)按0/10、1/9、2/8、4/6、6/4、8/2的顺序改变，且每次浇注4.0L。
(柱6的条件)
柱6：DIAION HP20(直径12.0cm×长度40.5cm、4578cm3)
样品：柱5的馏分7～12的混合液(固体成分：12.58g)
馏分大小：2.0L
洗提液：水、甲醇和水的混合液
将从柱6中洗提的馏分8～9的混合液注入到下述条件的柱7中，并将甲醇和水浇注到柱中进行了洗提，所浇注的甲醇和水的混合比例(甲醇/水)按0/10、1/9、2/8、3/7、4/6、5/5、6/4的顺序改变，且每次浇注2.0L。
(柱7的条件)
柱7：D1AION HP20(直径7.0cm×长度36.5cm、1404cm3)
样品：柱6的馏分8～9的混合液(固体成分：6.57g)
馏分大小：500mL
洗提液：水、水和甲醇的混合液
将从柱7中洗提的馏分21～26的混合液注入到下述条件的柱8中，并浇注50％甲醇1.0L进行了洗提。
(柱8的条件)
柱8：TOYOPEAL HW-40C(直径4.0cm×长度43cm、540.0cm3)
样品：柱7的馏分21～26的混合液(固体成分：2.0g)
馏分大小：30mL
洗提液：50％甲醇(1.0L)
将从柱8中洗提的馏分13～14的混合液作为抗氧化剂3。
针对以上工序中提纯的抗氧化剂2、3，进行了上述自由基捕捉试验、基于ORAC法的试验及氧化应激诱导性红细胞溶血抑制试验，结果能够确认到抗氧化剂2、3显示出比抗氧化剂1更高的抗氧化活性。并且，在通过分液操作而获得的各组分中，水饱和1-丁醇组分具有高抗氧化活性，进而对水饱和1-丁醇组分进行提纯而获得的抗氧化剂2显示出非常高抗氧化活性。
实施例3：伤口治疗剂
[制造例]
将超纯水加入到在实施例1的制造例中制造的神经生长促进剂1’(糊精添加冷冻干燥粉末)32.0g中，并进行过滤，对其滤液加入超纯水以总量成为1.5L的方式进行了稀释。针对该滤液的稀释液进行了2次通过1.5L的乙酸乙酯(EtOAc)的分液操作，从而获得了水组分和乙酸乙酯组分。采取其中的乙酸乙酯组分作为伤口治疗剂1。
并且，进行2次在上述水组分中加入750ml的水饱和1-丁醇来分液的分液操作，获得了水组分和水饱和1-丁醇组分。
[伤口治愈促进作用的评价]
针对伤口治疗剂1(蛋白酶分解物的乙酸乙酯组分(EtOAc组分))、蛋白酶分解物的冷冻干燥粉末及作为比较用而获得的蛋白酶分解物的水组分及水饱和1-丁醇组分(水饱和1-BuOH组分)，对伤口治愈促进作用进行了评价。评价用样品为将固体成分调整成图11所示的各浓度的样品。
伤口治愈促进作用的评价中使用人类皮肤成纤维细胞(NB1RGB细胞)及正常人类皮肤成纤维细胞(CSC2F0细胞)，并通过以下方法进行了评价。
首先，使NB1RGB细胞或CSC2F0细胞在10％FBS/DMEM培养基中悬浊成6.0x104cells/mL，将该悬浊液以1.0mL/well的量播种于24孔的孔板之后，在包含5％CO2的空气气相中，在37℃下培养了24小时。如图10(a)所示，培养之后，用细胞划痕器11从上往下擦伤阱12的中央部而划伤了2mm宽。抽吸去除培养基，并在基本培养基中清洗1次之后，重新将不含血清的DMEM以每次900μL的量分注到各阱中，进而，将各浓度的评价用样品分别以每100μL的量添加到各孔中。在添加评价用样品后，经48小时后去除培养基，将1％戊二醛以每500μL的量分注到各孔中，并通过静置20分钟来固定细胞。然后，去除戊二醛，并将姬姆萨染色液以每500μL的量分注到各孔中，通过放置20分钟来进行染色。然后，去除姬姆萨染色液，用超纯水清洗1次，并使其干燥。如上述方式进行了染色的各阱内的细胞群中，如图10(b)所示，在一直线上5个以上的细胞2迁移的地方视为最长迁移地点，将从用细胞划痕器划出的1处伤的宽度2mm中减去其最长迁移地点之间的长度A(伤口部分的宽度)的长度2-A(mm)作为细胞迁移距离。将针对添加了各评价用样品的细胞群测定了细胞迁移距离的结果示于图11。图11中，对于“控制(Control)”，除了未添加评价用样品以外，以同样的方法对伤口治愈促进作用进行评价。
如图11所示，在控制中，细胞迁移距离为0.7mm左右，相对于此，在添加了伤口治疗剂1(乙酸乙酯组分)的体系中，在伤口治疗剂的浓度为12.5μg/mL下，能够实现为约1.6mm的非常长的细胞迁移距离。并且，在直接添加了蛋白酶分解物的冷冻干燥粉末的体系中，在浓度为250μg/mL下，细胞迁移距离为1.2mm左右，与此相比，伤口治疗剂1在其浓度的1/10以下的浓度下，如上述般获得长的细胞迁移距离。并且，与控制比较时，添加了水饱和1-丁醇组分或水组分的体系也延长细胞迁移距离，但与添加了乙酸乙酯组分的体系相比，尽管所添加的浓度高，但是细胞迁移距离短。由此，表明蛋白酶分解物中所包含的促进伤口治愈的成分优先转移至乙酸乙酯组分中，并且，可知与蛋白酶分解物本身、水组分及水饱和1-丙醇组分相比，乙酸乙酯组分(伤口治疗剂)具有远远优异的伤口治愈促进作用。
[蛋白酶分解物的提纯]
针对在上述制造例中获得的乙酸乙酯组分(固体成分：176.8mg)及作为比较用而获得的水组分(固体成分：37.3g)，以如下方式进行了基于柱层析的提纯。将其提纯方案示于图12。另外，图12所示的柱中，在柱1、柱3以外的柱中所注入的样品为如下：在前一个柱中洗提的馏分中，确认到对基于上述评价方法的伤口治愈促进作用的活性较强的馏分或这些馏分的混合液。
(a)乙酸乙酯组分的提纯
将乙酸乙酯组分注入到下述条件的柱1中，并将甲苯和丙酮浇注到柱1中进行了洗提，所浇注的甲苯和丙酮的混合比例(甲苯/丙酮)按10/0、9/1、8/2、6/4的顺序改变，且每次浇注100mL，之后将丙酮200mL浇注到柱中，然后，将以9/1的比例(丙酮/甲醇)混合的丙酮和甲醇的混合液200L浇注到柱1中进行了洗提。
(柱1的条件)
柱1：Wakogel C-200(直径2.0cm×长度13cm、40.8cm3)
样品：乙酸乙酯组分(固体成分：177mg)
馏分大小：馏分1～25；20mL、馏分26；50mL、馏分27～28；100mL
洗提液：甲苯、甲苯和丙酮的混合液、丙酮、丙酮和甲醇的混合液
将从柱1中洗提的馏分8～9的混合液浇注到下述条件的柱2中，并将己烷和乙酸乙酯浇注到柱2中进行了洗提，所浇注的己烷和乙酸乙酯的混合比例(己烷/乙酸乙酯)按10/0、9/1、8/2、6/4(其中，分别加入了1滴乙酸)的顺序改变，且每次浇注25mL，之后浇注50mL的在以4/6的比例(己烷/乙酸乙酯)混合的己烷和乙酸乙酯的混合液中加入1滴乙酸的混合液进行了洗提。
(柱2的条件)
柱2：Wakogel C-300(直径1.0cm×长度28.0cm，22.0cm3)
样品：柱1的馏分8～9的混合液(89.0mg)
馏分大小：2.5mL
洗提液：在己烷、己烷和乙酸乙酯的混合液中加入1滴乙酸的混合液
将从柱2中洗提的馏分1～20的混合液作为伤口治疗剂2。
(b)水组分的提纯
将水组分注入到下述条件的柱3中，并将甲醇和水浇注到柱3中进行了洗提，所浇注的甲醇和水的混合比例(甲醇/水)按0/100、5/95、10/90、20/80、40/60的顺序改变，且每次浇注5.0L。
(柱3的条件)
柱3：DIAION HP20(直径12.0cm×长度40.5cm、4578cm3)
样品：水组分(固体成分：37.3g)
馏分大小：2.5L
洗提液：水、甲醇和水的混合液
将从柱3中洗提的馏分5～6的混合液注入到下述条件的柱4中，并将甲醇和水浇注到柱4中进行了洗提，所浇注的甲醇和水的混合比例(甲醇/水)按0/100、2.5/97.5、5/95、10/90、15/85的顺序改变，且每次浇注2L。
(柱4的条件)
柱4：DIAION HP20(直径7.0cm×长度43cm、1654cm3)
样品：柱3的馏分5～6的混合液(固体成分：5.1g)
馏分大小：500mL
洗提液：水、甲醇和水的混合液
将从柱4中洗提的馏分8～10的混合液注入到下述条件的柱5中，并浇注水1.5L进行了洗提。
(柱5的条件)
柱5：TOYOPEARL HW-40C(直径4.0cm×长度35cm、440cm3)
样品：柱4的馏分8～10的混合液(固体成分：509.4mg)
馏分大小：30mL
洗提液：水(1.5L)
将从柱5中洗提的馏分14～18作为水组分提纯物。
针对在以上工序中提纯的伤口治疗剂2，以与上述相同的方法进行了伤口治愈促进作用的评价，结果能够确认到显示出比伤口治疗剂1或水组分提纯物更高的伤口治愈促进作用。
产业上的可利用性
根据本发明，能够以低成本提供可有效地促进神经细胞中的神经突触的形成和生长的神经生长促进剂。因此，当使用本发明的神经生长促进剂时，能够提供可缓解由神经变性疾病或神经损伤引起的认知功能障碍或运动功能障碍且廉价的内服剂。并且根据本发明，能够以低成本提供具有高抗氧化活性，且有效地抑制活体成分的氧化障碍的抗氧化剂。因此，当使用本发明的抗氧化剂时，由活性氧引起的老化现象的加速及以生活常见疾病为代表的各种疾病的发病抑制成为可能，进而能够提供这种抗氧化活性高，而且廉价的内服剂和外用剂。并且根据本发明，能够以低成本提供能够显著促进伤口的治愈且发挥高伤口治疗效果的伤口治疗剂。因此，当使用本发明的伤口治疗剂时，伤口的迅速治愈成为可能，进而能够提供这种伤口治疗效果高，而且廉价的内服剂和外用剂。因此，本发明在产业上的可利用性高。
Claims (62)
1.一种神经生长促进剂，其特征在于，
含有用蛋白酶对含有透明质酸和蛋白质的组合物进行分解而得到的分解产物。
2.根据权利要求1所述的神经生长促进剂，其特征在于，
所述组合物为鸡冠。
3.根据权利要求1或2所述的神经生长促进剂，其特征在于，
所述分解产物含有分子量为380～5000的低分子透明质酸。
4.根据权利要求1～3中任一项所述的神经生长促进剂，其特征在于，
所述分子量为380～5000的低分子透明质酸的含量相对于神经生长促进剂的总量为10质量％以上。
5.根据权利要求3或4所述的神经生长促进剂，其特征在于，
分子量为1520～5000的低分子透明质酸的比例为分子量为380～5000的低分子透明质酸总量的60质量％以上。
6.根据权利要求1～5中任一项所述的神经生长促进剂，其特征在于，
N-乙酰葡糖胺的含量相对于神经生长促进剂的总量为0.01质量％以下。
7.根据权利要求1～6中任一项所述的神经生长促进剂，其特征在于，
总游离氨基酸量相对于神经生长促进剂的总量以质量比计为2质量％以上，并且，总蛋白质量相对于神经生长促进剂的总量以质量比计为2质量％以上。
8.根据权利要求7所述的神经生长促进剂，其特征在于，
所述游离氨基酸含有选自异亮氨酸、β-氨基异丁酸、丙氨酸、牛磺酸、苯丙氨酸、天冬氨酸、胱氨酸及酪氨酸中的至少1种。
9.根据权利要求1～8中任一项所述的神经生长促进剂，其特征在于，
包含对所述分解产物的冷冻干燥物进行粉碎而获得的粉碎物。
10.根据权利要求1～9中任一项所述的神经生长促进剂，其特征在于，
含有通过由水和水饱和1-丁醇对所述分解产物进行分液操作而获得的水饱和1-丁醇组分。
11.根据权利要求1～10中任一项所述的神经生长促进剂，其特征在于，
具有促进从神经体形成神经突触的作用。
12.根据权利要求1～11中任一项所述的神经生长促进剂，其特征在于，
具有促进神经突触的生长的作用。
13.根据权利要求1～12中任一项所述的神经生长促进剂，其特征在于，
具有促进干细胞分化为神经细胞的作用。
14.根据权利要求1～13中任一项所述的神经生长促进剂，其特征在于，
具有促进神经生长因子诱导性神经突触的形成及生长的作用。
15.一种神经生长促进剂的制造方法，其特征在于，
包括用蛋白酶对含有透明质酸和蛋白质的组合物进行分解的酶处理工序。
16.根据权利要求15所述的神经生长促进剂的制造方法，其特征在于，
所述组合物为鸡冠，在所述酶处理工序之前，具有将所述鸡冠碎片化为1边0.5cm见方以上的工序。
17.根据权利要求15或16所述的神经生长促进剂的制造方法，其特征在于，
在所述酶处理工序之后，具有对在所述酶处理工序中获得的分解产物进行冷冻干燥之后，进行粉碎而获得粉碎物的工序。
18.根据权利要求15～17中任一项所述的神经生长促进剂的制造方法，其特征在于，
在所述酶处理工序之后，具有对在所述酶处理工序中获得的分解产物进行提纯的提纯工序。
19.根据权利要求18所述的神经生长促进剂的制造方法，其特征在于，
所述提纯工序包括通过水和水饱和1-丁醇对所述分解产物进行分液操作而获得水饱和1-丁醇组分的分液工序。
20.一种内服剂，其特征在于，
包含权利要求1～14中任一项所述的神经生长促进剂。
21.一种培养基用添加剂，其特征在于，
包含权利要求1～14中任一项所述的神经生长促进剂。
22.一种细胞稀释液用添加剂，其特征在于，
包含权利要求1～14中任一项所述的神经生长促进剂。
23.一种培养基，其特征在于，
含有权利要求21所述的培养基用添加剂。
24.一种细胞稀释液，其特征在于，
含有权利要求22所述的细胞稀释液用添加剂。
25.一种抗氧化剂，其特征在于，
含有用蛋白酶对含有透明质酸和蛋白质的组合物进行分解而得到的分解产物。
26.根据权利要求25所述的抗氧化剂，其特征在于，
所述组合物为鸡冠。
27.根据权利要求25或26所述的抗氧化剂，其特征在于，
所述分解产物含有分子量为380～5000的低分子透明质酸。
28.根据权利要求25～27中任一项所述的抗氧化剂，其特征在于，
所述分子量为380～5000的低分子透明质酸的含量相对于抗氧化剂的总量为10质量％以上。
29.根据权利要求27或28所述的抗氧化剂，其特征在于，
分子量为1520～5000的低分子透明质酸的比例为分子量为380～5000的低分子透明质酸总量的60质量％以上。
30.根据权利要求25～29中任一项所述的抗氧化剂，其特征在于，
N-乙酰葡糖胺的含量相对于抗氧化剂的总量为0.01质量％以下。
31.根据权利要求25～30中任一项所述的抗氧化剂，其特征在于，
总游离氨基酸量相对于抗氧化剂的总量以质量比计为2质量％以上，并且，总蛋白质量相对于抗氧化剂的总量以质量比计为2质量％以上。
32.根据权利要求31所述的抗氧化剂，其特征在于，
所述游离氨基酸含有选自异亮氨酸、β-氨基异丁酸、丙氨酸、牛磺酸、苯丙氨酸、天冬氨酸、胱氨酸及酪氨酸中的至少1种。
33.根据权利要求25～32中任一项所述的抗氧化剂，其特征在于，
包含对所述分解产物的冷冻干燥物进行粉碎而获得的粉碎物。
34.根据权利要求25～33中任一项所述的抗氧化剂，其特征在于，
含有通过由水和水饱和1-丁醇对所述分解产物进行分液操作而获得的水饱和1-丁醇组分。
35.根据权利要求25～34中任一项所述的抗氧化剂，其特征在于，
具有捕捉自由基的作用。
36.根据权利要求25～35中任一项所述的抗氧化剂，其特征在于，
具有抑制活体成分的氧化障碍的作用。
37.一种抗氧化剂的制造方法，其特征在于，
包括用蛋白酶对含有透明质酸和蛋白质的组合物进行分解的酶处理工序。
38.根据权利要求37所述的抗氧化剂的制造方法，其特征在于，
所述组合物为鸡冠，在所述酶处理工序之前，具有将所述鸡冠碎片化为1边0.5cm见方以上的工序。
39.根据权利要求37或38所述的抗氧化剂的制造方法，其特征在于，
在所述酶处理工序之后，具有对在所述酶处理工序中获得的分解产物进行冷冻干燥之后，进行粉碎而获得粉碎物的工序。
40.根据权利要求37～39中任一项所述的抗氧化剂的制造方法，其特征在于，
在所述酶处理工序之后，具有对在所述酶处理工序中获得的分解产物进行提纯的提纯工序。
41.根据权利要求40所述的抗氧化剂的制造方法，其特征在于，
所述提纯工序包括通过水和水饱和1-丁醇对所述分解产物进行分液操作而获得水饱和1-丁醇组分的分液工序。
42.一种内服剂，其特征在于，
包含权利要求25～36中任一项所述的抗氧化剂。
43.一种外用剂，其特征在于，
包含权利要求25～36中任一项所述的抗氧化剂。
44.根据权利要求43所述的外用剂，其特征在于，
所述外用剂为化妆品。
45.一种伤口治疗剂，其特征在于，
含有用蛋白酶对含有透明质酸和蛋白质的组合物进行分解而得到的分解产物的乙酸乙酯提取物。
46.根据权利要求45所述的伤口治疗剂，其特征在于，
所述组合物为鸡冠。
47.根据权利要求45或46所述的伤口治疗剂，其特征在于，
所述分解产物含有分子量为380～5000的低分子透明质酸。
48.根据权利要求45～47中任一项所述的伤口治疗剂，其特征在于，
所述分子量为380～5000的低分子透明质酸的含量相对于伤口治疗剂的总量为10质量％以上。
49.根据权利要求47或48所述的伤口治疗剂，其特征在于，
分子量为1520～5000的低分子透明质酸的比例为分子量为380～5000的低分子透明质酸总量的60质量％以上。
50.根据权利要求45～49中任一项所述的伤口治疗剂，其特征在于，
N-乙酰葡糖胺的含量相对于伤口治疗剂的总量为0.01质量％以下。
51.根据权利要求45～50中任一项所述的伤口治疗剂，其特征在于，
总游离氨基酸量相对于伤口治疗剂的总量以质量比计为2质量％以上，并且，总蛋白质量相对于伤口治疗剂的总量以质量比计为2质量％以上。
52.根据权利要求51所述的伤口治疗剂，其特征在于，
所述游离氨基酸含有选自异亮氨酸、β-氨基异丁酸、丙氨酸、牛磺酸、苯丙氨酸、天冬氨酸、胱氨酸及酪氨酸中的至少1种。
53.根据权利要求45～52中任一项所述的伤口治疗剂，其特征在于，
包含对所述分解产物的冷冻干燥物进行粉碎而获得的粉碎物的乙酸乙酯提取物。
54.根据权利要求45～53中任一项所述的伤口治疗剂，其特征在于，
所述乙酸乙酯提取物为通过由乙酸乙酯和水对所述分解产物进行分液操作而获得的乙酸乙酯组分。
55.根据权利要求45～54中任一项所述的伤口治疗剂，其特征在于，
具有促进人类成纤维细胞迁移的作用。
56.一种伤口治疗剂的制造方法，其特征在于，
包括用蛋白酶对含有透明质酸和蛋白质的组合物进行分解而获得分解产物的酶处理工序及通过由乙酸乙酯和水对所述分解产物进行分液操作而获得乙酸乙酯组分的分液工序。
57.根据权利要求56所述的伤口治疗剂的制造方法，其特征在于，
所述组合物为鸡冠，在所述酶处理工序之前，具有将所述鸡冠碎片化为1边0.5cm见方以上的工序。
58.根据权利要求56或57所述的伤口治疗剂的制造方法，其特征在于，
在所述酶处理工序之后，具有对在所述酶处理工序中获得的分解产物进行冷冻干燥之后，进行粉碎而获得粉碎物的工序，
在所述分液工序中，通过由水和乙酸乙酯对所述粉碎物进行分液操作而获得乙酸乙酯组分。
59.根据权利要求56～58中任一项所述的伤口治疗剂的制造方法，其特征在于，
在所述分液工序之后，具有对在所述分液工序中获得的乙酸乙酯组分进行提纯的提纯工序。
60.一种内服剂，其特征在于，
包含权利要求45～55中任一项所述的伤口治疗剂。
61.一种外用剂，其特征在于，
包含权利要求45～55中任一项所述的伤口治疗剂。
62.根据权利要求61所述的外用剂，其特征在于，
所述外用剂为化妆品。
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