KR19990033739A

KR19990033739A - 미색류 껍질로부터 황산다당류의 추출 및 정제방법

Info

Publication number: KR19990033739A
Application number: KR1019970057053A
Authority: KR
Inventors: 최병대; 홍병일; 이강호; 강석중
Original assignee: 최병대
Priority date: 1997-10-22
Filing date: 1997-10-22
Publication date: 1999-05-15
Also published as: KR100229948B1

Abstract

본 발명은 사료조제, 의약품, 화장품, 건강음료, 등 황산다당류를 이용하고자 하는 각종 분야에 우렁쉥이(멍게) 등의 미색류 껍질로부터 황산다당류를 추출·정제하여 공급할 수 있게 하므로서 이들 미이용자원의 활용과 이로 부터 염가 공급이 가능하게 하는 등의 효과를 도모코져 한 것으로서;

본 발명은, 미색류 껍질 분말에 증류수를 가하고 단백질분해효소를 첨가하여 48시간 반응시킨 후 원심분리하여 상등액을 취하고 TCA(trichloroacetic acid)액을 첨가, 처리한 다음, 다시 원심분리하여 침전물을 제거하고 상등액에 에탄올을 첨가한 후 -10℃에서 24시간 방치하여 조다당류(enzyme digestibles)를 침전시키고 상기 침전된 조다당류를 24시간 투석후 동결건조하거나 고온, 고압처리하여 조다당류를 추출한 것이며, 상기 추출된 조다당류를 Nacl이 함유된 인산완충용액으로 당이 검출되지 않을 때까지 용출시키고, 용출액은 분획하여 알콜처리하고 침전된 것을 Sephadex G-25로 재처리하여 알콜처리, 투석 후 동결건조하여 부분정제된 황산다당류를 얻을 수 있도록 한 것에 요지가 있음.

Description

[발명의 명칭]

미색류 껍질로부터 황산다당류의 추출 및 정제방법

[발명의 상세한 설명]

[발명의 목적]

본 발명은 사료조제, 의약품, 화장품, 건강음료, 등 황산다당류를 이용하고자하는 각종 분야에 우렁쉥이(멍게) 등 미색류 껍질로부터 황산다당류를 추출·정제하여 공급할 수 있도록 한 것이다.

[발명이 속하는 기술분야 및 그 분야의 종래기술]

황산다당류를 이용한 산업분야에의 응용에 관한 기술은 매우 다양하다. 특히, 콘드로이친황산을 함유한 자원의 탐색은 1950년대 이후 지금까지 계속되고 있으며, 콘드로이친황산의 생리적 기능은 세포외액의 용량조절과 수분대사, 세포외액의 이온이동과 조절, 뼈의 석회화에의 기여, 손상된 조직의 치료, 관절조직의 원활화, 혈액응고방지작용, 각막의 투명도 유지작용, 감염방지작용, 건강음료, 미용효과, 노화억제 등이 있는 것으로 알려져 있다.

황산다당류인 콘드로이친은 상어지느러미의 연골로부터 공업적으로 생산하고 있으며, 일부에서는 당에 황을 결합시켜 황산화다당을 제조하려는 시도도 이루어지고 있다.

황산다당류와 관련된 기술은 발명특허 공고번호 제97-009608호, 제97-010792호, 제96-000238호, 제96-003746호, 제96-040174호, 제95-024690호, 제95-700918호, 제90-018129호 등이 있으며, 이와 같은 황산다당류는 식품, 화장품, 의약품 등에 널리 이용되고 있고, 앞으로 그 용도는 더욱 넓어질 전망이다.

그러나 현재와 같이 상어지느러미나 해삼과 같은 고급의 천연자원으로부터 황산다당류가 추출되어 이용된다면 자원의 지속적인 공급이 어려울 뿐만 아니라 생산가격 또한 매우 높아 제품의 단가를 상승시키는 원인이 될 수도 있을 것이다.

[발명이 이루고자 하는 기술적 과제]

이에 본 발명에서는 상어지느러미, 해삼과 같은 고급의 천연자원을 이용하지 않고, 많은 량이 폐기되고 있는 우렁쉥이 등을 포함한 미색류 껍질을 이용하여 염가로서 황산다당류를 추출, 이용할 수 있도록 한 것으로서;

일례로, 우렁쉥이 등의 미색류는 경남 통영을 중심으로 년간 100,000톤 이상이 생산되며, 이 중 50%인 50,000톤이 껍질로서 전량 폐기되기 있는 실정 등에 있는 바, 본 발명은 상기와 같이 전량 폐기되고 있는 이들 미 이용자원을 재활용함으로서 폐기되는 자원을 재활용하는 산업적 효과와 염가의 황산다당류 공급을 이루고자 한다.

[발명의 구성 및 작용]

본 발명이 목적하는 우렁쉥이 등 미색류로부터 황산다당류를 추출 및 정제하는 과정은 다음과 같다.

[실시예 1]

황산다당류의 추출

황산다당류는 건조된 미색류 껍질에서 우선 색소를 추출하고 남은 잔사로부터 다시 추출하였다.

먼저, 효소처리에 의한 방법은 재료를 단백질 분해효소인 alkalase, neutrase, mixture-2000으로 처리하였다.

즉, 일정량의 미색류 분말에 적당량의 증류수를 가하고 여기에 각각의 효소를 농도별로 첨가하여 진탕항온수조에서 48시간 반응시켰다.

반응 후 원심분리(3000rpm, 15min)하여 상등액을 취하고 여기에 10% TCA(trichloroacetic acid) 용액으로 처리하였다.

다시 원심분리(3000 rpm, 15 min)하여 침전물을 제거하고 상등액에 에탄올을 농도별로 첨가한 후 -10℃에서 24시간 방치하여 조다당류(enzyme digestibles)를 침전시켰다.

침전된 조다당류는 24시간 투석후 동결건조하였다.

한편, 고온·고압처리에 의한 황산다당류를 추출하기위해 고압가열멸균기로 125℃(압력 : 1.5 kg/㎠)에서 시간별로 처리하였다.

즉, 삼각플라스크에 일정량의 시료를 취하고 여기에 시료의 15배 정도의 물을 가해 삼각플라스크 입구부분을 알루미늄 호일로 덮어 고압가열멸균기에서 처리를 하고, 이후의 과정은 효소처리와 동일하게 알코올 처리하여 조다당류(water solubles)를 얻었다.

[실시예 2]

황산다당류의 정제

황산다당류의 정제는 20 mM 인산완충용액(pH 7.0)으로 평행화시킨 DEAE-Cellulose(35mm × 25cm)에 조다당류를 넣고 염화나트륨(NaCl)이 함유된 완충용액을 1.5 M까지 직선적으로 증가시키면서 당이 검출되지 않을 때까지 용출시켰다.

용출액을 분획기로 6 ml씩 모은 후 전당을 측정하고, 각 시료 획분을 합쳐 증류수에 24시간 투석한 후 농축하여 동결 건조하였다.

크로마토그라피에 의한 각 획분(4 획분)의 단백질함량은 분광광도계로 280 nm로 측정하였다.

이온교환처리한 시료는 겔여과를 행하였다.

즉, 유리 칼럼(1.5×100 cm)에 팽윤시킨 Sephadex G-100을 75 cm 까지 충진시키고, 전용량에 대해 2-5% 의 시료액을 용출, 분획하였다.

용출액은 0.05 M NaCl 용액으로 하였고, 각 획분별 6 ml 씩 분취하여, 전당을 분석하여 활성획분을 모아 알콜처리하여 침전된 것을 Sephadex G-25로 재처리하여 알콜처리, 투석 후 동결건조하여 부분 정제된 황산다당류를 얻었다.

(3) 미색류 껍질로부터 추출한 황산다당류의 이용 예는 다음과 같다.

[이용예 1]

가. 개요

양어용 채색개선제는 대부분이 지용성 카로테노이드를 이용하므로 이를 그대로 사용하기는 매우 곤란하다.

즉, 액체상태이기 때문에 이를 분말사료에 일정량 혼합하여 사료로 다시 제조해야 하며 어민들이 직접 사용하기에는 곤란할 것이다.

따라서 채색개선용 카로테노이드 색소를 흡착할 수 있는 부형제가 필요하다. 뿐만 아니라 이 부형제는 어류의 성장을 정상적으로 유지하면서 독성을 나타내어서는 안된다는 두가지 조건을 함께 만족시켜야 한다.

나. 색소흡착능의 측정

수용성인 Coomassie brilliant blue R-250과 Red-2, 그리고 지용성인 우렁쉥이 색소추출물을 대상으로 색소흡착력을 측정하였다.

각 시료 1.0 g을 정평하여 삼각플라스크에 취하고 여기에 미리 조제한 각 색소용액(Coomassie brilliant blue R-250과 Red-2는 70% 에탄올에 녹였고, 지용성인 우렁쉥이 껍질 색소추출물은 99% 에탄올에 녹였다)10 ml를 가하여 1시간 방치하여 색소를 흡착시킨 후, 열풍건조기에서 용매인 에탄올을 휘발시켰다.

흡착된 시료를 아세톤으로 3회에 걸쳐 추출한 후 450 nm에서 흡광도(UV/Visspectrophotometer)를 측정하였다.

색소함량은 흡광도를 측정하여 기존의 방법에 따라 계산하였다.

다. 결과

색소흡착능을 조사하기 위해 Blue-R-250, Red-2 그리고 우렁쉥이 껍질 색소추출물을 황산다당류에 첨가하여 흡착시키기 위해 용매를 증발시킨 후 Blue-R-250과 Red-2는 70% 에탄올로 우렁쉥이 껍질 색소추출물은 아세톤으로 3회에 걸쳐 추출하여 정량하였는 바;

다음의 표 1 과 같이 색소흡착능이 있는 것으로 알려진 chitin 및 chitosan과 비교하여 손색이 없을 정도였으며 특히, 우렁쉥이 껍질 색소추출물의 색소흡착능은 고압가열멸균기와 neutrase처리한 황산다당류가 각각 85.2%와 85.6%로 대조 시료에 비해 다소 우수하였다.

[표 1]

미색류 껍질 효소가수분해물(neutrase), 고압가열가수분해물(autoclave), 키틴(chitin), 키토산(chitosan)의 색소흡착능(%)

[이용예 2]

가. 개요

일반적으로 해조류나 척추동물에 존재하는 황산다당류는 항혈액응고 효과가 있으며, 이밖에 항암 및 항돌연변이 효과가 있는 것으로 알려져 잇다.

나. 항혈액응고능

항혈액응고능 측정은 정상인의 정맥혈 4.5 ml를 채취하여 0.5ml의 sodium cirtrate (3.8%) 용액과 혼합한 다음 3,000 rpm에서 10분간 원심분리하여 혈장을 분리하였다.

분리한 혈장은 -20℃에 저장하여 두고 실험에 사용하였다.

활성트롬보플라스틴시간(activated partial thromboplastin time, APTT) 측정은 혈장 100 ㎕에 시료 용액 10 ㎕를 넣고 교반한 후 37℃ 항온수조에서 1분간 가온하였다.

여기에 100 ㎕ actin을 첨가한 후 다시 37℃ 항온수조에서 2분간 가온하였다.

2분간 되는 순간 37℃로 가열한 20 mM CaCl₂100 ㎕를 넣음과 동시에 스톱워치를 눌러 응고 시간을 특정하였다.

대조시료는 heparin을 희석하여 항혈액응고 시간을 동일하게 측정하였다.

프로트롬빈시간(prothrombin time, PT)측정은 37℃ 항온수조에서 1분 이상 미리 가온시켜 놓은 thromboplastin 200 ㎕에, 37℃에서 미리 1분 이상 가온시켜 놓은 혈장과 시료용액 혼합액(혈장:시료용액=10:1) 100 ㎕를 가함과 동시에 스톱워치를 눌러 응고 시간을 측정하였다.

다. Angiotesin I 전환효소(ACE) 저해작용

ACE 저해작용은 두가지 방법으로 실험하였다.

하나는 Cushman 과 Cheung의 방법으로 일정 농도의 시료용액 50 ㎕에 ACE 조효소액 200 ㎕ 및 0.1 M sodium borate buffer(pH 8.3) 200 ㎕를 가한 후 37℃에서 5분간 전(前)반응 시켰다. 여기에 기질로써 Hippuryl-His-Leu 용액(25 mg/2.5 ml sodium borate buffer) 100 ㎕를 가하여 다시 37℃에서 30분간 반응시킨 후 1 N HCl을 500㎕ 가하여 반응을 정지시켰다. (공시험은 올리고당 용액 대신에 증류수를 사용하였으며, 대조구는 1 N HCl 500 ㎕를 가한 다음, ACE 조효소액 200 ㎕를 가하였다).

여기에 ethyl acetate 1.5 ml를 가하여 15초간 voltex한 후, 3,000 rpm에서 5분간 원심분리시켜 상층액 1 ml를 취하였다.

이것을 완전히 건조시킨 후, 증류수 3 ml를 가하여 용해시키고 228 nm에서 흡광도를 측정하여 ACE 저해율로 나타내었다.

다른 방법으로는 TNBS(trinitrobenzene sulfonate)를 이용한 방법으로 실험하였다.

라. 결과

표 2 는 황산다당류의 항혈액응고능을 살펴보기 위해 각각의 시료들을 일정한 농도(100㎍/㎖)로 하여 activated partial thromboplastin time(APTT) 및 prothrombin time(PT)를 측정한 결과이다.

모든 시료에서 APTT 저지효과는 나타났으나 PT값은 약 14.5초로 일정하여 혈액응고저지 효과가 거의 없었다.

특히, 고압가열멸균기 처리구를 DEAE-Celluse ion exchange chromatography하여 얻은 F₄(획분4)는 APTT가 75초로 가장 효과적이었으며, Sephadex G-100의 F₂가 70초 정도, DEAE-Celluse ion exchange chromatography하여 얻은 F₃과 autoclave로 추출한 조다당류가 각각 66초와 65초였다.

해조 다당인 fucoidan의 항혈액응고능은 황산기의 함량이 높을수록 증가한다고 하였는데, 본 실험의 결과와도 잘 일치하였다.

[표 2]

¹⁾시료 농도 : 100㎍/㎖,²⁾Prothrombin time.³⁾Activated partial thromboplastin time.⁴⁾고압가열+DEAE-Cellulose 이온교환+Sepadex G-25 or G-100.

표 3 은 추출된 황산다당류의 ACE 저해효과를 살펴본 것이다.

모든 시료에서 ACE저해효과가 있었으며, 채택된 실험 방법에 따라 동일시료 경우에 있어서도 저해효과 정도가 차이를 보였다.

Cushman 과 Cheung의 방법보다는 TNBS를 이용한 방법이 다소 높은 값을 보였고, 특히 DEAE-Cellulose 이온교환 활성 획분의 ACE 조해효과가 우수하였는데, 획분 4가 35.7%로 가장 효과적이었고, neutrase 처리 다당류가 비교적 낮은 저해능을 보였다.

[표 3]

¹⁾시료농도:100㎍/㎖.²⁾Cushman and Cheung's method.³⁾TNBS(trinitrobenzene sulfonate)method.⁴⁾고압가열+DEAE-Cellulose 이온교환+Sepadex G-25 or G-100

[이용예 3]

가. 개요

황산다당류의 뛰어난 색소흡착능을 이용하고자, 붉은색의 육색이 상품가치를 좌우하는 연어과 어류 중 무지개송어를 택하여 육색 개선을 위한 색소 부형제로서의 이용 가능성을 검토하였다.

즉, 황산다당류에 우렁쉥이 색소추출물을 최적량 흡착시켜, 이것을 사료에 첨가하여 무지개송어 사육실험을 하였다.

나. 실험어 및 사육실험

먼저 시판사료로써 4주간 예비사육한 평균체중 500 g의 무지개송어를 사용하였으며, 각 실험구마다 20마리씩 수용하였고, 각 실험구는 duplicate로 하였다.

사육실험은 1996년 6월 3일부터 7월 29일까지 8주간 경상남도 밀양시 소재 경상남도 내수면개발시험장의 옥외 사육장에서 행하였으며, 사육장치는 지하수를 계속 공급하는 유수식 사육장치로서 계속적인 보충수의 첨가에 의하여 어류의 배설물이 즉시 사육조 밖으로 유출될 수 있도록 하였다.

사육조의 크기는 직경 1.7 m, 수심 0.9 m(수량 2톤)의 원형의 FRP탱크였으며, 이 때 주수량은 20 ℓ/min였으며, 용존 산소량은 8ppm 전후였고, 전 사육기간을 통하여 수온은 16.0~18.5℃(평균 17.3℃)였다. 급이는 체중의 1.5%에 해당하는 양을 하루 3회, 주 7일 급이하였다.

어분은 미국산 백색어분을 사용하였고, 색소원의 첨가량과 astaxanthin의 함량은 최적첨가량으로 하였다.

다. 사료조제

우렁쉥이 색소추출물은 일정량의 에탄올에 녹여서 황산다당류 6 g에 약 1.6 g첨가하여(그림 1) 혼합기를 이용하여 30분간 균일하게 혼합한 후 펠렛사료를 제조하였다.

캐로필 핑크는 수입시판용인 인공합성색소로서 사료 중의 astaxanthin 함량이 64ppm이 되도록 하였다.

제조한 실험사료는 소량 단위로 비닐포장하여 질소충진하여 -20℃의 냉장고에 보관하면서 실험에 사용하였다.

라. 색소함량의 측정

색소함량 측정은 실험어를 얼음에 채워 실험실로 운반한 후 꼬리 및 아가미를 떼어내고 육과 표피로 분리하였다.

육은 일정량을 분쇄기에 넣고 아세톤을 용매로 마쇄하였고, 표피는 그대로 아세톤에 침지하여 하룻밤 방치하였다.

각각 3회 반복 추출하고 이를 에테르 층으로 전용시킨 후 농축하였다.

총카로테노이드 함량은 최대흡광도 480 nm에서 벤젠을 용매로 흡광계수 E^1% _1cm=2,400으로 계산하였다.

육 및 표피 중 astaxanthin 획분의 분리 및 동정은 고속액체크로마토그라피로 하였다.

흡광도는 uv/visible apectrophotometer로 476 nm에서, 용매는 헥산/아세톤(86:16)을 0.8 ml/min 속도로 흘리면서 분석하였다.

표품 astaxanthin의 retention time과 비교하여 동정하였다.

마. 결과

표 4과 5는 우렁쉥이 껍질 분말로부터 추출한 황산다당류, 색소추출물 및 carophyll pink 등을 첨가한 실험구의 색소함량의 변화를 나타낸 것이다.

실험전 예비 사육된 무지개송어의 육 및 껍질 중의 색소함량은 각각 0.0157, 0.2073mg/100g였다.

무지개송어 육 색소함량의 변화를 살펴보면 4주 후 대조구가 0.0652mg/100g, pink 구와 색소추출물구는 각각 0.1156, 0.1263mg/100g으로 조다당류 첨가구보다 약간 높은 함량을 나타내었다.

사육 8주 후 대조구는 0.0896mg/100g였으나, 색소추출물구는 0.2841mg/100g으로 색소 축적이 가장 양호하였다.

Pink구와 조다당류 첨가구는 각각 0.2840, 0.2224 및 0.2137mg/100g으로 거의 유사한 값을 나타내어 황산다당류에 의한 색소침착은 정상적으로 이루어졌던 것으로 생각되어진다.

무지개송어 껍질 중 색소함량 변화는 4주 후 대조구가 0.2363mg/100g, 추출물 첨가구는 0.5734mg/100g으로 pink구나 조다당 첨가구보다는 약간 높았다.

8주 후 대조구는 거의 변화가 없었지만 추출물 첨가구가 가장 높아 0.9023mg/100g이었으며, pink구가 0.8816mg/ 100g, 조다당류 첨가구가 각각 0.8625, 0.8437mg/100g으로 껍질에서도 색소 침착이 원할했던 것으로 나타났다.

무지개송어 육 및 껍질 중 astaxanthin의 축척형태는 astaxanthin diester가 가장 많고, monoester, free 순이었다.

그러나 4주 후 육중의 형태는 diester>free>monoester 순이었다.

육중 비의 변화는 대조구를 제외하고는 diester가 70-75%로 가장 높고, free가 13-18%, monoester가 7-9%였다.

그러나 껍질은 diester가 77-83%, monoester가 6-9%, free가 5-10%로 나타났다.

대조구에서 미동정 물질이 14.04%로 나타나 급이원에 따라 체내대사가 달라지는 것으로 나타났다.

[표 4]

무지개송어 육 및 표피의 카로테노이드 함량¹⁾(mg/100g tissue)

¹⁾실험전 무지개송어 육 및 표피의 카로테노이드 함량은 각각 0.0517, 0.2073mg/100g tissue.²⁾카로테노이드 함량은 측정하지 않았음.³⁾64ppm astaxanthin 첨가.⁴⁾껍질을 고압가열 처리후 단백질 제거함(80ppm 색소추출물 첨가).⁵⁾껍질을 고압가열 처리후 단백질 제거안함(80ppm 색소추출물 첨가).⁶⁾80ppm 색소추출물만 첨가.

[표 5]

무지개송어 육 및 표피의 아스타잔틴 함량

¹⁾Free;astaxanthin free, Mono.;astaxanthin monoester, Di.;astaxanthindiester, U.K.;unknown²⁾카로테노이드 함량은 측정하지 않았음.³⁾64ppm astaxanthin 첨가.⁴⁾껍질을 고압가열 처리후 단백질 제거함(80ppm 색소추출물 첨가).⁵⁾껍질을 고압가열 처리후 단백질 제거안함(80ppm 색소추출물 첨가).6)80ppm 색소추출물만 첨가.

[발명의 효과]

이상에서 살펴본 바와 같이 본 발명은 우렁쉥이를 포함한 미색류 껍질로부터 황산다당류의 추출이 가능하게 되어 폐기되는 자원을 재활용하는 산업상의 잇점과 염가로서 황산다당류의 추출, 정제, 이용이 가능하게 되는 것으로서, 본 발명은 상기와 같이 염가의 황산다당류 추출과 이의 이용이 가능하게 되어 사료조제, 의약품, 화장품, 건강음료, 등 각종 황산다당류의 이용분야에서 많은 경제적 이익과 효과를 얻을 수 있는 우수한 발명이다.

Claims

미색류 껍질 분말에 증류수를 가지고 단백질분해효소를 첨가하여 반응시킨 후 원심분리하여 상등액을 취하고 TCA(trichloroacetic acid)액을 첨가, 처리한 다음, 다시 원심분리하여 침전물은 제거하고 상등액에 에탄올을 첨가한 후, 조다당류(enzyme digestibles)를 침전시키고 상기 침전된 조다당류는 24시간 투석후 동결건조하거나 고온, 고압처리하여 조다당류를 추출하며,

상기 추출된 조다당류를 염화나트륨(Nacl)이 함유된 인산완충용액으로 당이 검출되지 않을 때까지 용출시키고 용출액은 용출, 분획하여 알콜처리하고 침전된 것을 Sephadex G-25로 재처리하여 알콜처리, 투석 후 동결건조하여 정제된 황산다당류를 얻을 수 있도록 한 것을 특징으로 하는 미색류 껍질로부터 황산다당류의 추출 및 정제방법.