KR20190136378A - 천연 단백질 분해효소액을 이용한 돈피 콜라겐의 제조방법 - Google Patents

천연 단백질 분해효소액을 이용한 돈피 콜라겐의 제조방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 축산물 유래의 콜라겐단백질을 효과적으로 제조하는 방법에 관한 것으로, 더욱 자세하게는 천연 단백질 분해효소액을 이용하여 돈피로부터 저분자화된 수용성 콜라겐(가용성 콜라겐)을 제조할 수 있는 방법에 관한 것이다. 본 발명의 돈피 콜라겐 추출방법은 최적화된 처리조건과 더불어 특정 조합의 천연 단백질 분해효소액을 이용하는 경우 돈피로부터 저분자화된 수용성 콜라겐을 효과적으로 제조할 수 있는바, 수용성 콜라겐을 소재로 하는 다양한 산업분야(식품, 의약품, 화장품 등)에 유용하게 사용될 수 있다. 특히, 본 발명에서 사용하는 천연 단백질 분해효소액은 천연효소제로서 종래 콜라겐 추출에서 사용되고 있는 화학적 효소제와 달리 인체에 무해한바, 이를 통해 생성되는 콜라겐의 경우 식품이나 화장품에 사용시에도 안전한 이점을 갖는다.

Description

천연 단백질 분해효소액을 이용한 돈피 콜라겐의 제조방법{Manufacturing method of pig skin collagen using natural proteinase solution}
본 발명은 축산물 유래의 콜라겐단백질을 효과적으로 제조하는 방법에 관한 것으로, 더욱 자세하게는 천연 단백질 분해효소액을 이용하여 돈피로부터 저분자화된 수용성 콜라겐(가용성 콜라겐)을 제조할 수 있는 방법에 관한 것이다.
콜라겐은 포유동물을 비롯한 수산동물, 설치류와 조류 등의 껍질, 연골, 뼈, 인대, 혈관, 근막 등 생체조직 전반에 걸쳐 분포되어 있는 조직의 구조를 형성하는 근간이 되는 구조 단백질이다. 콜라겐의 생체 내 기능 중 가장 중요한 것은 뮤코다당체로서 콘드로이틴황산과 함께 고분자 매트릭스를 구성하여 각 기관의 특정구조를 유지구성하는 것인데 다른 뮤코다당과 함께 분자량이나 함량 등에서는 차이가 있지만 포유동물의 동일 조직에서는 동일한 형태 및 비율로 존재한다.
특히 우리 몸속에는 단백질이 약 20% 포함되어 있는데 이중 콜라겐이 30%를 차지하는 물질이다(L.C.Junqueira and J.carneiro1983). 콜라겐은 다른 동물에도 똑같아서 소나 돼지, 닭, 생선 등의 뼈나 피부에도 다량 함유되어 있다. 현재, 이러한 콜라겐은 건강식품뿐만 아니라 화장품 및 의약품에 이르기까지 여러 가지의 상품에 이용되고 있다.
콜라겐은 단백질이므로 식품에서 섭취하면 체내에 아미노산으로 분해되어 필요에 의해 여러가지 단백질로 재합성된다. 이러한 이유 때문에 식품에서 콜라겐을 섭취한다고 할지라도 반드시 그것이 체내에서 콜라겐으로 남아있다고는 할 수 없다. 단지, 최근의 연구에 의하면 콜라겐을 섭취하는 경우 콜라겐의 대사가 좋아져 재차 콜라겐으로 합성되는 확률이 높아진다고 알려져 있다. 그러므로 피부나 뼈, 관절의 건강을 유지하기 위해서도 적극적으로 식품에서 콜라겐을 섭취하는 것을 연구 현장에서도 권하고 있는 실정이다. 콜라겐을 섭취하여 보충해 주면 노화가 저지되고 피부에 윤기와 탄력을 주게 된다.
한편, 콜라겐은 물에 용해되는 수용성 콜라겐(Soluble Collagen-혹은 가용성 콜라겐)과 용해되지 않는 불용성 콜라겐(Insoluble Collagen)의 두 종류로 나뉘는데, 노화가 되면 수용성 콜라겐이 불용성 콜라겐으로 변성되어져 수분의 함유량이 감소하고 주름이 증가하게 된다. 가용성 콜라겐은 어린 동물의 피부 등의 결합 조직에서 산으로 추출할 수 있으나, 이러한 경우 안전성에 문제가 있을 뿐 아니라 추출되는 양이 적고 고가인 문제점도 있다.
이러한 배경 하에, 본 발명자는 신체 내 섭취 또는 피부 침투에 효과적인 저분자화 수용성 콜라겐을 돈피로부터 추출 및 제조할 수 있는 방법을 도출하고자 연구하였으며, 그 결과 최적화된 처리조건과 더불어 특정 조합의 천연 단백질 분해효소액을 이용하는 경우 돈피 유래의 저분자화된 수용성 콜라겐을 효과적으로 제조할 수 있음을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
한국등록특허 제10-1361060호
따라서 본 발명의 목적은 돈피에서 콜라겐을 효과적으로 제조할 수 있는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은, 상기 방법으로 제조된 돈피 콜라겐을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은, 상기 돈피 콜라겐을 유효성분으로 포함하는 조성물을 제공하는 것이다.
상기와 같은 본 발명의 목적을 달성하기 위해서,
본 발명은 (a) 돈피를 압력추출기에 넣고 60~100℃에서 4~8시간 동안 추출하는 단계; 및 (b) 상기 돈피 추출물에 천연 단백질 분해효소액을 처리한 후 가수분해시키는 단계를 포함하는, 돈피 콜라겐의 제조방법.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 (a) 단계는 돈피를 압력추출기에 넣고 80℃에서 8시간 동안 추출할 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 천연 단백질 분해효소액은 키위, 파인애플 및 무화과로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 과즙액일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 천연 단백질 분해효소액은 파인애플 및 무화과 2종의 혼합 과즙액일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 혼합 과즙액은 파인애플과 무화과가 2:1의 중량비로 혼합된 과즙액일 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 방법으로 제조된 돈피 콜라겐을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 돈피 콜라겐을 유효성분으로 포함하는 조성물을 제공한다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 조성물은 식품 조성물, 의약품 조성물 또는 화장품 조성물일 수 있다.
본 발명의 돈피 콜라겐 추출방법은 최적화된 처리조건과 더불어 특정 조합의 천연 단백질 분해효소액을 이용하는 경우 돈피로부터 저분자화된 수용성 콜라겐을 효과적으로 제조할 수 있는바, 수용성 콜라겐을 소재로 하는 다양한 산업분야(식품, 의약품, 화장품 등)에 유용하게 사용될 수 있다. 특히, 본 발명에서 사용하는 천연 단백질 분해효소액은 천연효소제로서 종래 콜라겐 추출에서 사용되고 있는 화학적 효소제와 달리 인체에 무해한바, 이를 통해 생성되는 콜라겐의 경우 식품이나 화장품에 사용시에도 안전한 이점을 갖는다.
도 1은 본 발명의 방법으로 추출한 돈피 콜라겐의 분자량 패턴을 나타낸 전기영동사진이다(S: Standard, Con: 대조구, T15: 파파인, T16: 키위, T17: 파인애플, T18: 무화과, T19: 부추, T20: 고추, T21: 생강).
본 발명은 돈피 콜라겐의 제조방법에 관한 것이다.
본 발명의 돈피 유래 콜라겐의 제조방법은 (a) 돈피를 압력추출기에 넣고 60~100℃에서 4~8시간 동안 추출하는 단계; 및 (b) 상기 돈피 추출물에 천연 단백질 분해효소액을 처리한 후 가수분해시키는 단계를 포함할 수 있다.
본 발명의 상기 (a) 단계는 돈피를 압력추출기에 넣고 추출하는 단계로서, 자세하게는 압력추출기에 돈피를 넣고 60~100℃에서 4~8시간 동안 추출하는 단계일 수 있으며, 바람직하게는 압력추출기에 돈피를 넣고 80℃에서 8시간 동안 추출할 수 있다.
본 발명의 하기 실시예에서는 다양한 온도 및 시간 조건에서 수득되는 돈피 추출액의 동결건조물을 시료로하여 수용성 콜라겐 함량을 조사한 결과, 80℃에서 8시간 추출한 처리구에서 두드러지게 높은 수용성 콜라겐 함량을 보여주었다.
본 발명의 (b) 단계는 돈피 추출물을 가수분해시키는 단계로서, 자세하게는 상기 (a) 단계를 통해 수득한 돈피 추출물에 천연 단백질 분해효소액을 처리하여 가수분해시키는 단계이다.
본 발명의 일구예에서, 상기 천연 단백질 분해효소액은 키위, 파인애플 및 무화과로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 과즙액일 수 있으며, 바람직하게는 파인애플 및 무화과 2종의 혼합 과즙액일 수 있다.
본 발명의 다른 구체예에서, 상기 혼합 과즙액은 파인애플과 무화과가 2:1의 중량비로 혼합된 과즙액일 수 있다.
본 발명의 과즙액은 대상 과일의 껍질과 씨 등을 제거한 후 분쇄한 다음 여과시켜 수득한 추출물을 사용할 수 있으며, 또는, 대상 과일을 기식 부분을 분쇄하고 2배의 증류수를 가하여 균질화한 다음 여과하고, 원심분리한 후 상등액만을 취하여 사용할 수도 있다.
본 발명의 하기 실시예에서는 상기 (a) 단계를 통해 수득한 돈피 추출물에 다양한 과일(키위, 파인애플, 무화과) 또는 채소(부추, 고추, 생강) 유래의 천연 단백질 분해효소액을 처리하여 생성되는 수용성 콜라겐 함량 및 콜라겐의 분자량을 측정한 결과, 채소보다 과일에서 분해 효과가 우수하게 나타났다. 또한, 이들 과일즙을 2종 이상 혼합한 효소액 중 파인애플과 무화과를 2:1로 혼합한 처리구에서 수용성 콜라겐 함량이 두드러지게 높아지는 것을 확인하였다.
또한, 본 발명은 상기 방법으로 제조된 돈피 콜라겐을 제공한다.
본 발명의 방법으로 제조된 돈피 콜라겐은 분자량이 130kD이하의 저분자량을 가지며, 이와 더불어 수용성 콜라겐을 다량 함유하는 특징을 가진다.
상기와 같은 저분자량을 갖는 수용성 콜라겐은 체내 흡수율 및 피부 침투성이 우수한바, 건강기능식 육가공품; 크림, 유액, 화장수 등과 같은 화장품; 재생용 패치와 같은 의약품의 소재로 유용하게 사용될 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 돈피 콜라겐을 유효성분으로 포함하는 조성물을 제공한다.
본 발명의 일 구체예에서, 상기 조성물은 식품 조성물, 의약품 조성물 또는 화장품 조성물일 수 있다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
< 실시예 >
공시재료 준비
실험에서 사용한 우족, 도가니, 소머리, 닭발, 돈피는 모두 한살림 축산식품에서 공급받았다.
< 실시예 1>
축산물 5종의 성분 및 특성 조사
본 실험에서는 축산물 5종(소머리, 우족, 도가니, 돈피, 닭발)으로부터 수득한 추출물의 일반성분, 저장특성 및 콜라겐함량을 조사하였다. 이를 위해 전자동압력추출기(경서이엔피(주), 모델명 KS220S)를 이용하여 추출(100℃, 12H, 무압력)을 진행하였다. 1kg의 원료육과 5L의 물을 전자동압력추출기에 넣어 추출물을 추출하였다.
T1 T2 T3 T4 T5
우족 도가니 소머리 닭발 돈피
<1-1> 일반성분
각 처리구별 샘플 추출액의 일반성분 분석은 수분, 단백질, 지방 및 회분(%)은 AOAC방법(1990)에 따라 측정하였으며, 그 결과는 하기 표 1에서 자세히 나타내었다.
원료육에서 추출된 추출액의 일반성분 (%)
처리구 T1 T2 T3 T4 T5
수분 98.24
±0.11b
98.20
±0.00b
98.90
±0.00a
98.27
±0.11b
95.56
±0.05c
지방 0.01
±0.00c
0.07
±0.00b
0.17
±0.00a
0.02
±0.00c
0.02
±0.00c
회분 0.04
±0.00d
0.09
±0.00a
0.08
±0.00b
0.06
±0.00c
0.08
±0.00b
단백질 1.70
±0.11b
1.62
±0.00b
0.83
±0.00c
1.63
±0.11b
4.32
±0.05a
T1: 우족, T2: 도가니, T3: 소머리, T4: 닭발, T5: 돈피
a- d각 처리구간 서로 다른 머릿글자는 유의적인 차이가 있음(p<0.05).
<1-2> 화학적 특성
pH 측정은 시료 10g을 채취한 후 증류수 100㎖와 함께 stomacher(400 lab blender, seward, London, England)로 30초간 균질하여 pH-meter(WTW pH 720, Germany)로 측정하였다. 반복은 3반복으로 평균값을 취하였다.
휘발성염기태질소(VBN, volatile basic nitrogen)는 高坂(1975)의 방법을 이용하여 시료 10 g에 증류수 90 ㎖를 가하여 10,000 rpm으로 약 30초 균질한 후, 균질액을 Whatman No. 2 filter paper를 사용하여 여과하였으며, 여과액 3㎖를 Conway unit 외실에 넣고 내실에는 0.01N 붕산용액 1㎖와 지시약(0.066% methyl red + 0.066% bromocresol green)을 3방울 가한다. 뚜껑과의 접착부위에 glycerine을 바르고 뚜껑을 닫은 후 50% K2CO3 1 ㎖을 외실에 주입을 하고, 즉시 밀폐시킨 다음 용기를 수평으로 교반한 후 37℃에서 120분간 배양하였다. 배양 후 0.02N H2SO4로 내실의 붕산용액을 적정하였다. 휘발성염기태질소(VBN)의 수치는 100g 시료당 ㎎(㎎%)으로 환산하여 표시하였다.
VBN= ((a-b)*F*28.014*100)/시료의 양
- a: 주입된 황산의 양(ml)
- b: blank에 주입된 황산의 양(ml)
- f: 0.02N H2SO4 표준화 지수
- 28.014=0.02N H2SO4 1ml 소모하는데 필요한 N의 양
지방산패도(TBA, 2-thiobarbituric acid)는 Witte 등(1970)의 추출 방법을 약간 변형하여 TBA(2-thiobarbituric acid)수치로 나타내었으며, 시료 10g에 cold 10% perchloric acid 15ml과 3차 증류수 25ml을 Homogenizer에서 10,000rpm으로 10초 동안 균질을 한다. 균질액을 Whatman No. 2 filter paper를 사용하여 여과하였으며, 여과액 5ml과 0.02M thiobarbituric acid(TBA)용액 5ml을 넣어 완전히 혼합한 다음, 냉암소에서 16시간 방치후 Spectrophotometer(DU-650, Beckman, USA)를 이용하여 529nm의 파장에서 흡광도를 측정하였다. Blank는 3차 증류수를 이용하였다. TBA수치는 시료 1,000g당 ㎎ malonaldehyde(mg malonaldehyde/kg)으로 표시하였다. 이때 사용된 standard curve는 y=0.1975x-0.0011 (r=0.999)이었으며, y=흡광도, x=TBA가로 계산하였다.
자세한 결과는 하기 표 3에 나타내었다.
원료육에서 추출된 추출액의 화학적특성
처리구 T1 T2 T3 T4 T5
pH 7.52
±0.04a
7.25
±0.03c
6.31
±0.07d
7.36
±0.04b
7.55
±00a
VBN
(mg%)
8.59
±0.54c
9.05
±0.27c
11.34
±0.57b
9.17
±0.96c
13.45
±0.47a
TBA
(mg malonaldehyde/ 1,000g)
0.23
±0.00c
0.17
±0.05c
0.19
±0.03c
0.63
±0.05b
1.57
±0.16a
T1: 우족, T2: 도가니, T3: 소머리, T4: 닭발, T5: 돈피
a- e각 처리구간 서로 다른 머릿글자는 유의적인 차이가 있음(p<0.05).
상기에서 나타낸 바와 같이, 본 실험에서 사용한 축산물 5종(소머리, 우족, 도가니, 돈피, 닭발)의 경우 모두 pH, VBN 및 TBA 수치가 식품으로서 사용하기에 안전한 허용범위인 것을 확인할 수 있었다.
<1-3> 콜라겐 함량
각 처리구별 샘플의 콜라겐 함량을 측정하기 위하여, 삼각플라스크에 시료 약 4g을 넣고 30ml의 sulfuric acid solution을 첨가한 후, 뚜껑을 덮고 105℃ 드라이 오븐에서 16시간 동안 가열한 것을 500ml의 볼륨 플라스크에 넣고 3차 증류수로 희석하여 균질시켜 Whatman No. 2 φ150mm 여과지를 이용해 여과하였다. 여과액 5ml을 넣고 100ml로 희석한 후, test tube에 희석액 2ml을 넣고, oxidant 용액 1ml을 첨가하여 흔들어 준 후 상온에서 20분간 방치하였다. 그리고 각 시험관에 발색시약(color reagent) 1ml을 첨가하고 혼합한 후 60℃ water bath에 15분간 담근 후 3분이상 흐르는 물에 식혀 스펙트로포터미터(Spectrophotometer)를 이용하여 558nm에서 고정파장(흡광도)를 측정하였다. 표준곡선은 working standard 용액 2ml을 발색과 측정 과정을 거쳐 흡광도를 측정한 후에 회귀식에 대입하여 콜라겐 함량(g/100g)을 분석하였다.
자세한 결과는 하기 표 4에 나타내었다.
원료육에서 추출된 추출액의 콜라겐함량
처리구 T1 T2 T3 T4 T5
콜라겐(g/100g) 1.79
±0.03a
1.14
±0.01d
1.74
±0.00b
1.66
±0.00c
1.82
±0.00a
수용성 콜라겐 0.25
±0.02a
0.17
±0.00b
0.12
±0.02b
0.16
±0.01b
0.15
±0.01b
T1: 우족, T2: 도가니, T3: 소머리, T4: 닭발, T5: 돈피
a- d각 처리구간 서로 다른 머릿글자는 유의적인 차이가 있음(p<0.05).
상기에서 나타낸 바와 같이, 본 실험에서 사용한 축산물 5종(소머리, 우족, 도가니, 돈피, 닭발) 중 돈피의 경우 콜라겐 함량이 가장 높은 것으로 나타났으며, 우족에서 수용성 콜라겐 함량이 가장 높은 것으로 나타났다.
콜라겐 및 수용성 콜라겐의 함량을 종합적으로 살펴본 결과, 우족이 돈피 대비 다소 높은 수용성 콜라겐 함량을 보이는 것을 확인할 수 있었으나, 그 차이가 크지 않아 소재의 가격과 효율면에서 돈피가 콜라겐 추출에 유용한 소재라 판단되었다.
< 실시예 2>
콜라겐의 최적 추출방법 개발
본 실험에서는 축산물 중 돈피를 대상으로 하여 콜라겐을 수득할 수 있는 최적의 추출 조건을 규명하였다. 이를 위해 전자동압력추출기를 이용하여 추출(65~100℃, 4~12H, 무압력)을 진행하였다.
처리구
온도/시간 4H 8H 12H
65℃ T6 T7 T8
80℃ T9 T10 T11
100℃ T12 T13 T14
<2-1> 돈피 추출액의 추출시간과 온도에 따른 일반성분
각 처리구별 샘플 추출액의 일반성분 분석은 수분, 단백질, 지방 및 회분(%)은 AOAC방법(1990)에 따라 측정하였으며, 그 결과는 하기 표 6에서 자세히 나타내었다.
돈피 추출액의 추출시간과 온도에 따른 일반성분 (%)
처리구 T6 T7 T8 T9 T10 T11 T12 T13 T14
수분 99.13±
0.05b
99.73±
0.11a
99.39±
0.43ab
98.70±
0.00c
98.30±
0.17d
96.91±
0.29e
98.71±
0.17c
96.34±
0.10f
96.27±
0.22f
지방 0.00±
0.00b
0.00±
0.00b
0.00±
0.00b
0.02±
0.00b
0.03±
0.01b
0.02±
0.01b
0.04±
0.06b
0.19±
0.11a
0.14±
0.06a
회분 0.07±
0.00a
0.01±
0.00d
0.01±
0.00d
0.05±
0.00b
0.06±
0.00ab
0.05±
0.01b
0.02±
0.00c
0.03±
0.00c
0.05±
0.01b
단백질 0.78±
0.05e
0.25±
0.11f
0.58±
0.43ef
1.21±
0.00d
1.60±
0.17c
3.00±
0.30b
1.19±
0.21d
3.48±
0.09a
3.52±
0.17a
T6: 65℃-4h, T7: 65℃-8h, T8: 65℃-12h, T9: 80℃-4h, T10: 80℃-8h, T11: 80℃-12h, T12: 100℃-4h, T13: 100℃-8h, T14: 100℃-12h
a- i각 처리구간 서로 다른 머릿글자는 유의적인 차이가 있음(p<0.05).
<2-2> 돈피 추출액의 추출시간과 온도에 따른 화학적특성
각 처리구별 샘플 추출액의 저장특성을 조사하였다. 화학적특성으로 pH, VBN 및 TBA 측정은 상기 실시예 <1-2>와 동일한 방식으로 진행하였다.
돈피 추출액의 추출시간과 온도에 따른 화학적특성
처리구 T6 T7 T8 T9 T10 T11 T12 T13 T14
pH 7.26
±0.02c
7.16
±0.03c
7.18
±0.02c
7.45
±0.04b
7.60
±0.06b
7.74
±0.02b
8.39
±0.51a
7.75
±0.01b
6.64
±0.01d
VBN
(mg%)
7.68
±1.92c
4.30
±0.31d
6.68
±1.40c
19.03±0.88a 19.58±0.83a 6.95
±1.14c
20.22±1.65a 10.61±0.41b 20.95±0.96a
TBA
(mg malonaldehyde/ 1,000g)
0.18
±0.02f
0.18
±0.04f
0.11
±0.00f
0.83
±0.11c
0.75
±0.06c
0.55
±0.12d
3.03
±0.06a
0.42
±0.06e
1.04
±0.12b
T6: 65℃-4h, T7: 65℃-8h, T8: 65℃-12h, T9: 80℃-4h, T10: 80℃-8h, T11: 80℃-12h, T12: 100℃-4h, T13: 100℃-8h, T14: 100℃-12h
a- f각 처리구간 서로 다른 머릿글자는 유의적인 차이가 있음(p<0.05).
<2-3> 돈피 추출액의 추출시간과 온도에 따른 콜라겐 함량
각 처리구별 샘플 추출액의 콜라겐 함량을 조사하였다. 콜라겐 함량 측정은 상기 실시예 <1-3>과 동일한 방식으로 진행하였다.
돈피 추출액의 추출시간과 온도에 따른 콜라겐 함량
처리구 T6 T7 T8 T9 T10 T11 T12 T13 T14
콜라겐 0.96
±0.04d
1.16
±0.01c
0.65
±0.03f
1.22
±0.05c
0.93
±0.02d
2.04
±0.01a
0.80
±0.02e
1.40
±0.03c
1.20
±0.01b
수용성 콜라겐 0.16
±0.04c
0.14
±0.00a
0.02
±0.03e
0.02
±0.05cd
0.26
±0.02b
0.04
±0.01e
0.14
±0.02c
0.05
±0.03e
0.14
±0.01d
T6: 65℃-4h, T7: 65℃-8h, T8: 65℃-12h, T9: 80℃-4h, T10: 80℃-8h, T11: 80℃-12h, T12: 100℃-4h, T13: 100℃-8h, T14: 100℃-12h
a- f처리구간 서로 다른 머릿글자는 유의적인 차이가 있음(p<0.05).
상기에서 나타낸 바와 같이, T10 처리구에서 가장 높은 수용성 콜라겐의 함량을 보여주었다.
< 실시예 3>
천연 단백질 분해효소 발굴
본 실험에서는 돈피 콜라겐 추출에 유용한 천연 단백질 분해효소를 발굴하기 위하여 돈피 추출액(80℃에서 8시간 동안 추출) 50g에 천연 단백질 분해효소를 60℃에서 24시간 처리한 후 가수분해하여 생성되는 콜라겐의 분자량을 측정하였다. 이때 첨가되는 천연 단백질 분해효소는 돈피 추출액의 1중량%이다.
생성되는 콜라겐의 분자량 크기는 전기영동 패턴을 통해 확인하였다. SDS-PAGE는 Laemmli(1970)의 방법을 일부 변형하여 이용하였다. Prosi prestained protein marker(GenDEPOT, USA)를 사용하여, 5% stacking gel과 12% separating gel을 만들어 사용하였으며, 시료는 단백질 함량 정량 후, 2X 샘플 버퍼와 1:1로 혼합한 후 95 ℃에서 5분간 열처리하여 사용하였다. 전기영동장치(page Run, AE-6531, ATTO, Japan)를 이용하여 100 V로 전기영동 하였으며, 젤의 염색액(0.25% Coomassie brilliant blue R-250, 5% methanol and 7.5% acetic acid)을 이용하였고, 7.5% 아세트산과 25% 메탄올로 만든 탈색하여 분리된 단백질 밴드를 확인하였다.
이때 기존 추출액과 천연 단백질 분해효소를 첨가한 시료들의 차이를 확인하기 위하여 대조구(무첨가구)를 사용하였으며, 한편, 종래 알려진 단백질 분해효소와 본 발명의 천연 단백질 분해효소의 차이를 확인하기 위하여 파파인(바이오시스, Papain T 100MG)을 사용하였다. 이때, 파파인 처리량은 돈피 추출액의 1중량%이다.
처리구
Treatments T15 T16 T17 T18 T19 T20 T21
처리구 파파인 키위 파인애플 무화과 부추 고추 생강
본 실험에서 사용된 조효소액(천연 단백질 분해효소)은 하기와 같은 방법으로 제조할 수 있다.
시료의 가식 부분만을 갈아 2배의 증류수를 가하여 2분동안 균질화한 후 두겹의 거즈로 2회 여과한 후, 위의 여과액을 5℃에서 30분 동안 3,000 rpm(2200 X g)에서 원심분리하여 상등액을 기본 조효소액으로 사용할 수 있다.
그 결과 천연 단백질 분해효소는 채소보다 과일에서 더 좋은 효과를 나타내었으며, 그 중 천연 단백질 분해효소로써는 키위, 파인애플 및 무화과가 상대적으로 우수한 효과를 나타내었다(도 1 참조). 대조구(무처리구)에서는 130kD의 콜라겐 분자량이 확인되었으며, 키위, 파인애플 및 무화과에서는 130kD이하로 분자량이 작아지는 것을 확인하였다.
또한, 하기 표 10에서는 각 처리구별 수용성 콜라겐의 함량을 나타내었으며, 채소보다 과일에서 수용성 콜라겐의 함량이 높게 나타났다.
천연 단백질 분해효소 종류에 따른 콜라겐 함량
처리구 T15 T16 T17 T18 T19 T20 T21
콜라겐 1.88
±0.01c
1.98
±0.01b
2.12
±0.01a
1.18
±0.02e
1.98
±0.02b
1.50
±0.05e
1.82
±0.01d
수용성 콜라겐 0.28
±0.01c
0.30
±0.00b
0.32
±0.00a
0.28
±0.02c
0.26
±0.05e
0.27
±0.02d
0.28
±0.02c
T15: 파파인, T16: 키위, T17: 파인애플, T18: 무화과, T19: 부추, T20: 고추, T21: 생강
a- f처리구간 서로 다른 머릿글자는 유의적인 차이가 있음(p<0.05).
< 실시예 4>
천연 단백질 분해효소의 최적화
본 실험에서는 천연 단백질 분해효소로 키위, 파인애플, 무화과의 조합에 따른 Soluble Collagen의 함량 변화를 알아보았다. 돈피 추출액(80℃에서 8시간 동안 추출)에 천연 단백질 분해효소를 60℃에서 24시간 처리한 후 가수분해하여 생성되는 콜라겐의 분자량을 측정하였다. 이때 첨가되는 천연 단백질 분해효소는 돈피 추출액의 1중량%이다.
처리구
조성비/조합 키위+파인애플 파인애플+무화과 키위+무화과
1:1 T22 T23 T24
2:1 T25 T26 T27
1:2 T28 T29 T30
천연 단백질 분해효소 조합에 따른 콜라겐 함량
처리구 T22 T23 T24 T25 T26 T27 T28 T29 T30
Collagen 2.08
±0.01a
2.01
±0.00bc
2.02
±0.01b
1.80
±0.05e
2.08
±0.01a
1.82
±0.01d
2.08
±0.01a
1.98
±0.02c
2.00
±0.02bc
Soluble Collagen 0.30
±0.01d
0.32
±0.00c
0.28
±0.00e
0.30
±0.05c
0.59
±0.02a
0.30
±0.01d
0.36
±0.02b
0.32
±0.01c
0.28
±0.02e
T22: 키위+파인애플(1:1), T23: 파인애플+무화과(1:1), T24: 키위+무화과(1:1), T25: 키위+파인애플(2:1), T26: 파인애플+무화과(2:1), T27: 키위+무화과(2:1), T28: 키위+파인애플(1:2), T29: 파인애플+무화과(1:2), T30: 키위+무화과(1:2)
a- f처리구간 서로 다른 머릿글자는 유의적인 차이가 있음(p<0.05).
그 결과 상기 표 12에서 나타낸 바와 같이, 다른 처리구 대비 파인애플과 무화과를 2:1의 중량비로 혼합한 처리구(T 26)에서 두드러지게 높은 수용성 콜라겐 함량을 보여주었다. 따라서 파인애플+무화과를 2:1의 중량비로 혼합한 혼합물의 경우 돈피로부터 콜라겐 추출을 위한 최적화된 단백질 분해효소로 유용하게 사용될 수 있음을 확인하였다.
이제까지 본 발명에 대하여 그 바람직한 실시예들을 중심으로 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 특허청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.

Claims (8)

  1. (a) 돈피를 압력추출기에 넣고 60~100℃에서 4~8시간 동안 추출하는 단계; 및
    (b) 상기 돈피 추출물에 천연 단백질 분해효소액을 처리한 후 가수분해시키는 단계를 포함하는, 돈피 콜라겐의 제조방법.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 (a) 단계는 돈피를 압력추출기에 넣고 80℃에서 8시간 동안 추출하는 단계인 것을 특징으로 하는 돈피 콜라겐의 제조방법.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 천연 단백질 분해효소액은 키위, 파인애플 및 무화과로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 과즙액인 것을 특징으로 하는 돈피 콜라겐의 제조방법.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 천연 단백질 분해효소액은 파인애플 및 무화과 2종의 혼합 과즙액인 것을 특징으로 하는 돈피 콜라겐의 제조방법.
  5. 제4항에 있어서,
    상기 혼합 과즙액은 파인애플과 무화과가 2:1의 중량비로 혼합된 것을 특징으로 하는 돈피 콜라겐의 제조방법.
  6. 상기 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항의 방법으로 제조된 돈피 콜라겐.
  7. 상기 제6항의 돈피 콜라겐을 유효성분으로 포함하는 조성물.
  8. 제7항에 있어서,
    상기 조성물은 식품 조성물, 의약품 조성물 또는 화장품 조성물인 것을 특징으로 하는 조성물.
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