KR20170033622A - 돈피, 우피 및 어피로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상에서 유래된 콜라겐 분자량을 낮추는 방법 및 이에 따라 제조된 돈피 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 돈피, 우피 및 어피로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상에서 유래된 콜라겐 분자량을 낮추는 방법 및 이에 따라 제조된 콜라겐의 분자량을 낮춘 돈피에 관한 것으로 돈피를 절단한 후 단백질 분해효소 및 미생물 효소가 혼합된 혼합효소를 첨가하여 30 내지 50 ℃에서 1차 교반한 다음 60 내지 90 ℃에서 2차 교반하는 단계;를 포함함으로써, 돈피 유래 콜라겐의 분자량을 낮추어 체내 흡수율을 높인다.
Description
본 발명은 고분자량 콜라겐의 분자량을 낮추어 체내 흡수율을 높일 수 있는 돈피, 우피 및 어피로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상에서 유래된 콜라겐의 분자량을 낮추는 방법 및 이에 따라 제조된 콜라겐의 분자량을 낮춘 돈피에 관한 것이다.
돼지를 도축하는 방법은 크게 탕박(탕박조와 탈모기를 이용하여 털만 제거하는 방법, 족을 제거하지 않을 수 있음)과 박피(박피기를 이용하여 가죽을 벗기는 방법)로 구분되며, 지육율은 탕박 77%, 박피 70% 정도이다.
돼지껍데기라 부르는 돈피는 선입견, 특유의 냄새와 질긴 조직으로 인한 문제점을 보유하고 있으며, 돈피를 구이요리 등을 통해 즉석에서 섭취하지 않는다면 온도가 떨어지면서 조직이 질겨지고 수분이 증발하면서 딱딱해지는 단점이 있어 식품으로서의 제한되고 있다.
국내에서 생산되는 돈피의 일부가 세척, 절단 등의 단순가공을 통해 동남아지역으로 냉동 상태로 수출한 경험이 있으나, 국내에서 질병발생, 생체가격의 변동 등으로 많은 영향을 받고 있을 뿐 아니라 가공비용, 저장비용, 수입국의 규제 등으로 인해 어려움이 따르고 있는 실정이다.
상기 돈피를 이용한 대표적인 가공제품으로는 돈피스낵이 있으며, 이는 동남아시아 및 중남미 지역에서 인기있는 품목으로 알려져 있다.
아트킨스 박사는 '다이어트 혁명'이라는 책을 통해 돈피를 섭취하면 탄수화물 공급을 제한하기 때문에 인체는 체지방을 분해해서 에너지원으로 이용하게 된다는 주장을 하였듯이, 돈피는 다이어트 식품으로도 손색이 없다.
최근에는 피부미용에 도움을 주기 위하여 돈피 내의 콜라겐 성분을 섭취하는 제품 뿐만 아니라 콜라겐 마스크팩 등, 돈피 내의 콜라겐을 이용한 미용용품이 출시되고 있다.
콜라겐은 피부와 모발을 구성하는 성분 중 하나로서, 최근 미용식품 소재로도 주목을 받고 있는 물질이며, 이를 활용하여 다양한 산업적인 적용이 시도 중이다. 돈피 유래 콜라겐은 분자량 300천 정도의 크기여서 다른 동물성 유래 콜라겐 소재에 비해 체내 흡수가 상대적으로 제한적이라는 평가를 받고 있다.
이에 따라 상기 돈피 유래 콜라겐에 물리화학적인 처리를 통해서 분자량을 낮추는 가공기술이 필요하다.
돈피는 콜라겐을 다량 함유하고 있는 원료물질로서, 어떤 소재보다 연중 공급량이 많고 안정적인 장점이 있다. 따라서 돈피유래 콜라겐의 원료특성 및 가공적성 등을 파악하고 이를 활용하는 기술을 개발한다면 저급 원료로 취급되던 돈피가 새로운 가치를 창출할 수 있는 원료물질로 각광받을 수 있을 것으로 판단된다.
따라서, 본 연구에서는 돈피의 가공적성 향상을 위해 효소처리 등을 통해 콜라겐의 분자량을 낮추고, 생산수율을 향상시키면서 콜라겐 함량을 향상시키는 방법이 요구되고 있다.
본 발명의 목적은 돈피, 우피 및 어피로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상에서 유래된 콜라겐의 분자량을 낮추어 체내 흡수율을 높일 수 있는 콜라겐 분자량을 낮추는 방법을 제공하는데 있다.
또한, 본 발명의 다른 목적은 상기 방법에 따라 제조된 콜라겐의 분자량을 낮춘 돈피, 우피 및 어피를 제공하는데 있다.
상기한 목적을 달성하기 위한 본 발명의 돈피, 우피 및 어피로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상에서 유래된 콜라겐 분자량을 낮추는 방법은 돈피, 우피 및 어피로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 절단한 후 브로멜라인 및 미생물 효소가 혼합된 혼합효소를 첨가하여 30 내지 50 ℃에서 1차 교반한 다음 60 내지 90 ℃에서 2차 교반하는 단계;를 포함할 수 있다.
상기 돈피, 우피 및 어피로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상은 혼합효소와 혼합되기 전에, 증류수와 1 : 0.8 내지 3(돈피 : 증류수)의 중량비로 혼합될 수 있다.
상기 브로멜라인과 미생물 효소는 1 : 0.5 내지 2의 중량비, 바람직하게는 1 : 1의 중량비로 혼합될 수 있다.
상기 브로멜라인과 미생물 효소는 돈피, 우피 및 어피로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상 100 중량부에 대하여 각각 0.3 내지 0.8 중량부로 혼합될 수 있다.
상기 미생물 효소는 미생물유래 단백질 분해 효소로서, 바람직하게는 아스퍼질루스 오리자에(Aspergillus oryzae) 유래 단백질 분해 효소일 수 있다.
상기 1차 교반시 온도는 40 내지 55 ℃이고, 2차 교반시 온도는 상기 1차 교반 온도보다 5 내지 10 ℃ 향상된 것일 수 있다.
상기 혼합효소로 교반한 후에, 혼합효소로 처리된 돈피, 우피 및 어피로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 원심분리법 또는 용매추출법으로 처리하여 탈지를 수행하는 단계를 추가할 수 있다.
상기 탈지 처리된 돈피, 우피 및 어피로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상에 수산화나트륨, 수산화칼슘 및 탄산나트륨으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 알칼리 물질을 첨가하여 비콜라겐성 단백질을 제거하는 단계를 추가할 수 있다.
상기 알칼리 물질은 0.05 N 내지 0.2 N의 수산화나트륨일 수 있다.
상기 탈지 처리된 돈피, 우피 및 어피로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상 100 중량부에 대하여 알칼리 물질 0.5 내지 5 중량부가 첨가될 수 있다.
상기 알칼리 물질로 처리된 돈피, 우피 및 어피로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상은 여과된 후 세척되고 원심분리한 다음 원심분리된 침전물을 동결건조할 수 있다.
또한, 본 발명의 콜라겐의 분자량을 낮춘 돈피, 우피 및 어피는 상기 방법에 따라 제조될 수 있다.
본 발명의 고분자량 콜라겐의 분자량을 낮춘 돈피, 우피 및 어피로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상은 돈피 유래 콜라겐의 분자량을 낮추어 체내 흡수율을 높일 수 있으며, 고형분 함량 및 수율이 우수할 뿐만 아니라, 100 g당 콜라겐 함량이 많다.
또한, 본 발명의 고분자량 콜라겐의 분자량을 낮춘 돈피는 지방이 많이 제거되어 지방함량이 매우 낮은 돈피로 수득된다. 이와 같은 돈피는 식품, 미용 용품 등 다양한 곳에 적용이 가능하다.
도 1은 본 발명의 일 실시예 및 비교예에 따라 제조된 돈피의 SDS-PAGE이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따라 제조된 돈피를 MALDI-TOF 질량분석기로 측정한 그래프이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따라 제조된 돈피를 MALDI-TOF 질량분석기로 측정한 그래프이다.
본 발명은 고분자량 콜라겐의 분자량을 낮추어 체내 흡수율을 높일 수 있는 돈피, 우피 및 어피로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상에서 유래된 콜라겐 분자량을 낮추는 방법 및 이에 따라 제조된 콜라겐의 분자량을 낮춘 돈피에 관한 것이다.
상기 돈피 및 우피는 외피층, 피하지방층 및 진피층을 포함한다.
이하, 본 발명을 상세하게 설명한다.
본 발명의 돈피, 우피 및 어피로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상에 함유된 콜라겐 분자량을 낮추는 방법은 (A) 돈피, 우피 및 어피로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 절단한 후 브로멜라인 및 미생물 효소가 혼합된 혼합효소를 첨가하여 40 내지 55 ℃에서 1차 교반한 다음 온도를 높여 2차 교반하는 단계;를 포함한다. 또한, 상기 (A)단계 이후에, (B) 상기 혼합효소로 교반된 돈피, 우피 및 어피로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 원심분리법 또는 용매추출법으로 처리하여 탈지를 수행하는 단계; 및 (C) 상기 탈지 처리된 돈피, 우피 및 어피로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상에 알칼리 물질을 첨가하여 비콜라겐 물질을 제거하는 단계;를 더 포함할 수 있다.
먼저, 상기 (A)단계에서는 돈피, 우피 및 어피로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상과, 증류수를 혼합하여 용액을 제조한 후 상기 용액에 브로멜라인 및 미생물 효소가 혼합된 혼합효소를 첨가하여 40 내지 55 ℃에서 1차 교반한 후 상기 1차 교반 온도보다 5 내지 10 ℃ 향상시켜 2차 교반한다.
상기 돈피로는 흑돈피에 비하여 전단력이 우수하며, 아미노산 함량이 높은 백돈피를 사용하는 것이 바람직하다.
상기 돈피, 우피 및 어피로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 1 내지 2 ㎠로 세절한 후, 효소처리를 보다 용이하게 수행시키기 위하여 돈피, 우피 및 어피로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상과, 증류수를 1 : 0.8 내지 3의 중량비, 바람직하게는 1 : 1.2 내지 1.5의 중량비로 혼합한다.
상기 돈피, 우피 및 어피로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 기준으로 증류수의 함량이 상기 범위를 벗어나는 경우에는 효소가 제대로 처리되지 않아 콜라겐의 분자량을 낮출 수 없고 고형분 함량 및 수율이 저하될 수 있다.
본 발명에 이용되는 혼합효소 중에서 브로멜라인은 파인애플에 함유되어 있는 프로테아제이다.
또한, 상기 미생물 효소는 미생물유래 단백질 분해 효소로서, 바람직하게는 아스퍼질루스 오리자에(Aspergillus oryzae) 유래 단백질 분해 효소이며, 더욱 바람직하게는 아스파라긴산 프로테아제(aspartic protease), 금속 프로테아제(metalloprotease), 세린 프로테아제(serine protease) 및 카복시펩티다아제(carboxypeptidase)의 혼합물이다. 이러한 혼합물은 상용명칭으로 Aspergillus oryzae 프로테아제, 다까 디아스타아제(taka diastase), 수미자임 LP(sumyzyme LP), 베론 P(veron p), 파나자임(panazyme), 프로자임(prozyme), 바이오자임 A(biozyme A) 및 산자임(sanzyme)으로 사용되고 있으며, 본 발명에서는 미생물 효소로 프로자임을 사용하는 것이 바람직하다.
상기 혼합효소는 브로멜라인 및 미생물 효소가 1 : 0.5 내지 2의 중량비, 바람직하게는 1 : 0.8 내지 1.1의 중량비, 더욱 바람직하게는 1 : 1의 중량비로 혼합된 효소이다. 브로멜라인을 기준으로 미생물 효소의 함량이 상기 하한치 미만인 경우에는 고분자량의 콜라겐을 저분자량의 콜라겐으로 가공할 수 없으며, 상기 상한치 초과인 경우에는 고형분 함량, 수율 및 콜라겐 함량이 낮아질 수 있다.
또한, 상기 브로멜라인과 미생물 효소는 돈피, 우피 및 어피로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상 100 중량부에 대하여 각각 0.3 내지 0.8 중량부, 바람직하게는 각각 0.4 내지 0.5 중량부로 혼합된다. 브로멜라인과 미생물 효소의 함량이 각각 상기 하한치 미만인 경우에는 고형분 함량, 수율 및 콜라겐 함량이 저하되며, 상기 상한치 초과인 경우에는 색도가 우수하지 못하고 고형분 함량 및 수율이 급격히 저하될 수 있다.
상기 브로멜라인과 미생물 효소를 혼합한 혼합효소가 아니라 브로멜라인 및 미생물 효소를 단독으로 사용하는 경우에는 지방이 제거되지 못하고, 고형분 함량, 수율 및 콜라겐 함량이 저하될 뿐만 아니라 고분자량 콜라겐이 전부 저분자량 콜라겐으로 가공되지 못하여 고분자량 콜라겐과 저분자량 콜라겐이 함께 공존한다.
또한, 본 발명은 혼합효소에 의해 고분자량의 콜라겐을 거의 대부분 저분자량으로 변화시키고 콜라겐의 함량을 향상시키기 위하여 상기 돈피, 우피 및 어피로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상이 함유된 용액에 혼합효소를 첨가한 후 상이한 온도에서 두 번에 걸쳐 교반한다. 만약, 교반을 1회만 수행하는 경우에는 저분자량의 콜라겐이 적게 형성되며 콜라겐의 함량이 향상되지 못할 뿐만 아니라 색도가 저하되어 소비자가 선호하지 않을 수 있다.
상기 1차 교반은 40 내지 55 ℃에서 1 내지 5시간, 바람직하게는 4 내지 5시간 동안 수행되며; 2차 교반은 상기 1차 교반 온도보다 5 내지 10 ℃ 향상시킨 온도하에서 1 내지 5시간, 바람직하게는 4 내지 5시간 동안 수행된다.
1차 교반시 온도 및/또는 시간이 상기 하한치 미만인 경우에는 효소처리가 수행되지 못할 수 있으며, 상기 상한치 초과인 경우에는 색도가 저하될 수 있다.
또한, 2차 교반시 온도 및/또는 시간이 상기 하한치 미만인 경우에는 저분자량의 콜라겐이 적게 형성될 수 있으며, 상기 상한치 초과인 경우에는 콜라겐의 함량이 줄어들 수 있다.
다음으로, 상기 (B)단계에서는 혼합효소로 처리된 돈피, 우피 및 어피로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 원심분리법 또는 용매추출법으로 처리하여 탈지를 수행한다.
상기 혼합효소로 처리된 돈피, 우피 및 어피로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상은 탈지가 추가로 수행됨으로써 콜라겐 수율이 더욱 향상된다.
상기 원심분리법은 혼합효소로 처리된 돈피, 우피 및 어피로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 3000 내지 5000xg로 2 내지 5 ℃에서 10 내지 20분 동안 원심분리하여 상등액으로 분리된 지방을 제거하는 방법이다.
또한, 상기 용매추출법은 혼합효소로 처리된 돈피, 우피 및 어피로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 클로로포름과 메탄올이 1-3 : 1의 부피비로 혼합된 혼합용액에 넣고 균질기로 처리한 후 여과하고 잔사부분을 상기 혼합용액으로 추출한 다음 염화칼륨 용액과 혼합하여 10 내지 15시간 동안 방치한 후 상등액으로 분리된 지방을 제거하는 방법이다.
상기 원심분리법 및 용매추출법으로 생산된 콜라겐 함량, 수율 등은 유사하지만 작업성 면에서 원심분리가 우수하므로 원심분리법을 이용하는 것이 바람직하다.
다음으로, 상기 (C)단계에서는 상기 탈지 처리된 돈피, 우피 및 어피로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상에 알칼리 물질을 첨가하여 비콜라겐성 단백질을 제거한다.
상기 알칼리 물질을 이용하여 탈지 처리된 돈피, 우피 및 어피로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상에 함유된 비콜라겐성 단백질을 제거하여 무게 당 순수 콜라겐 함량을 향상시키는 것으로서, 알칼리 물질로는 수산화나트륨, 수산화칼슘 및 탄산나트륨으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 들 수 있으며, 바람직하게는 0.05 N 내지 0.2 N의 수산화나트륨이다.
상기 알칼리 물질은 돈피, 우피 및 어피로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상 100 중량부에 대하여 알칼리 물질 0.5 내지 5 중량부, 바람직하게는 1 내지 3 중량부로 첨가된다.
알칼리 물질의 함량이 상기 하한치 미만인 경우에는 비콜라겐성 단백질이 제거되지 않을 수 있으며, 상기 상한치 초과인 경우에는 콜라겐 함량이 오히려 줄어들 수 있다.
상기 알칼리 물질로 12 내지 20 시간, 바람직하게는 15 내지 18시간 동안 교반하여 처리한다. 처리시간이 상기 하한치 미만인 경우에는 비콜라겐성 단백질이 제거되지 않을 수 있으며, 상기 상한치 초과인 경우에는 색도가 저하되고 콜라겐 함량이 오히려 줄어들 수 있다.
상기 탈지 처리된 돈피, 우피 및 어피로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 알칼리 물질로 교반한 후에는 여과하고, 잔존 알칼리 성분을 제거하기 위해 증류수로 3 내지 5회 세척한 다음 4000 내지 6000xg로 15 내지 30분 동안 원심분리를 수행하여 수득된 침전물을 동결 건조함으로써 콜라겐의 분자량을 낮춘 돈피, 우피 및 어피로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 수득한다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시하나, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 범주 및 기술사상 범위 내에서 다양한 변경 및 수정이 가능함은 당업자에게 있어서 명백한 것이며, 이러한 변형 및 수정이 첨부된 특허청구범위에 속하는 것도 당연한 것이다.
실시예 1.
강원도 소재 K 도축장에서 구입한 1+ 등급, 170일령 3원 교잡 거세돈에서 생산된 백돈피 100 중량부를 가로 X 세로가 1 X 1 ㎠가 되도록 세절한 후 돈피와 증류수가 1 : 1.5 중량비가 되도록 혼합한 다음 브로멜라인(Bromelain 1,200GDU)과 프로자임(Prozyme 2000P)이 1 : 1 중량비(돈피 100 중량부에 대하여 각 0.5 중량부)로 혼합된 혼합효소를 첨가하여 50 ℃에서 4시간 동안 1차 교반한 후 60 ℃에서 4시간 동안 2차 교반하여 돈피를 제조하였다.
실시예 2.
혼합효소 1 : 2 중량비
상기 실시예 1과 동일하게 실시하되, 브로멜라인 0.35 중량부 및 프로자임 0.7 중량부로 혼합된 혼합효소를 이용하여 돈피를 제조하였다.
실시예 3.
혼합효소 각 0.25 중량부
상기 실시예 1과 동일하게 실시하되, 브로멜라인 0.25 중량부 및 프로자임 0.25 중량부로 혼합된 혼합효소를 이용하여 돈피를 제조하였다.
실시예 4.
혼합효소 각 0.8 중량부
상기 실시예 1과 동일하게 실시하되, 브로멜라인 0.8 중량부 및 프로자임 0.8 중량부로 혼합된 혼합효소를 이용하여 돈피를 제조하였다.
실시예 5. 탈지 추가
상기 실시예 1과 동일하게 실시하되, 혼합효소로 처리된 돈피를 4000xg로 4 ℃에서 15분 동안 원심분리한 후 상등액이 제거된 돈피를 수득하였다.
실시예 6. 알칼리 물질 처리 추가
상기 실시예 5와 동일하게 실시하되, 원심분리한 돈피 100 중량부에 0.1 N의 수산화나트륨 1 중량부 및 증류수 1000 중량부를 첨가하여 16시간 동안 교반한 후 여과하여 증류수로 5회 세척한 다음 5000 xg로 20분 동안 원심분리한 후 상등액이 제거된 돈피를 수득하였다.
비교예 1. 브로멜라인만 사용
상기 실시예 1과 동일하게 실시하되, 브로멜라인 1.0 중량부를 사용하여 돈피를 제조하였다.
비교예 2. 프로자임만 사용
상기 실시예 1과 동일하게 실시하되, 프로자임 1.0 중량부를 사용하여 돈피를 제조하였다.
비교예 3. 2차 교반 생략
상기 실시예 1과 동일하게 실시하되, 혼합효소를 첨가하여 50 ℃에서 4시간 동안 1차 교반만 수행하여 돈피를 제조하였다.
비교예
4. 다른 효소 사용
상기 실시예 1과 동일하게 실시하되, 브로멜라인과 프로자임 대신에 알카레이즈(alcalase)와 프로타맥스(protamex)를 사용하여 돈피를 제조하였다.
<
시험예
>
시험예
1. 고형분 함량 및 수율 측정
1-1. 고형분의 함량(Brix): 수용액 속의 함유된 용질의 양을 무게비로 나타내는 브릭스(Brix)를 측정하기 위하여 당도계(N1, ATAGO, Japan)를 사용하여 고형분의 함량을 측정하였다.
1-2. 수율(%): 수율은 건조 전의 중량 대비 동결건조 후 하기 [수학식 1]을 이용하여 중량의 백분율로 표시하였다.
[수학식 1]
수율(%) = (건조 후 중량 / 건조 전 중량) x 100
구분 | 실시예1 | 실시예2 | 실시예3 | 실시예4 | 실시예5 | 실시예6 | 비교예1 | 비교예2 | 비교예3 | 비교예4 |
고형분 함량 (Brix) |
21.80 | 12.1 | 13.6 | 14.8 | 33.0 | 31.2 | 6.0 | 12.0 | 5.1 | 6.4 |
수율 (%) |
37.20 | 17.69 | 18.08 | 20.5 | 41.04 | 37.7 | 6.37 | 17.48 | 3.75 | 5.39 |
위 표 1에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 실시예 1 내지 6에 따라 제조된 돈피는 비교예 1 내지 4에 비하여 고형분 함량 및 수율이 높은 것을 확인하였다. 특히, 실시예 1, 실시예 5 및 실시예 6의 돈피는 다른 돈피에 비하여 고형분 함량 및 수율이 월등히 높은 것을 확인하였다.
상기 실시예 6의 돈피는 실시예 5에 비하여 고형분 함량 및 수율이 줄어드는데, 이는 비콜라겐성 단백질이 제거되었기 때문이다.
또한, 약 1 : 2의 중량비로 혼합된 혼합효소를 이용한 실시예 2는 비교예 2와 거의 유사한 정도의 고형분 함량 및 수율을 보이는 것으로 확인되었다.
시험예
2. 단백질 및 콜라겐 함량 측정
2-1. 단백질 함량(mg/g)(BCA법): 효소처리에 의한 단백질 분해 정도를 판단하기 위한 목적으로 단백질을 구성하는 펩타이드 결합 측정을 통하여 단백질 함량을 정량하는 방법으로 bicinchoninic acid(BCA) protein assay kit(Sigma Chemical Co., USA)를 이용하여 측정하였고, 이때 표준용액으로서 BSA(bovine serum albumin)를 이용하였다.
2-2. 콜라겐 함량(g/단백질100g): 실시예 및 비교예에서 제조된 돈피 2 g에 7 N HCl 15 mL을 첨가하여 105 ℃ 드라이 오븐에서 16 시간 산가수분해 한 후 250 mL로 정용하고 여과하였다. 가수분해물을 희석한 다음 희석액 2 mL에 oxidant 용액 1 mL을 첨가하고, 실온에서 20분간 정치시켰다. 발색시약(Ehrlichs reagent solution) 1 mL을 첨가한 후, 60 ℃에서 15분간 반응시켜 UV/VIS spectrophotometer(Mecasys, Optizen 2120UV, Korea)를 사용하여 558 nm에서 흡광도를 측정하였다. 단백질 100 g 내 함유된 콜라겐 함량은 콜라겐에 존재하는 hydroxyproline 함량을 표준곡선으로부터 측정하였고 여기에 상수 8을 곱하여 콜라겐 함량으로 계산하였다.
구분 | 실시예1 | 실시예2 | 실시예3 | 실시예4 | 실시예5 | 실시예6 | 비교예1 | 비교예2 | 비교예3 | 비교예4 |
단백질 함량 (mg/g) |
108.83 | 194.38 | 240.79 | 216.08 | 98.00 | 95.46 | 234.17 | 251.30 | 226.90 | 218.47 |
콜라겐함량 (g/100g) |
43.76 | 36.39 | 37.73 | 33.11 | 46.37 | 98.24 | 24.28 | 30.63 | 26.81 | 28.64 |
위 표 2에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 실시예 1, 5 및 6에 따라 제조된 돈피는 다른 처리구의 돈피에 비하여 단백질 함량이 낮으며 콜라겐 함량이 높은 것을 확인하였다. 특히, 실시예 6은 비콜라겐성 단백질이 제거되어 단백질 100 g 당 콜라겐 함량이 월등히 높아진 것을 확인하였다.
반면, 실시예 2 내지 4 및 비교예 1 내지 4의 돈피는 실시예 1, 5 및 6에 비하여 단백질 함량이 높으며 콜라겐 함량이 낮은 것을 확인하였다.
단백질에 효소를 처리할 때 효소에 의한 분해가 많이 이루어질수록 펩타이드 결합이 비례적으로 끊어지는 현상이 발생하기 때문에 펩타이드 결합을 기준으로 단백질 함량을 측정하는 BCA법에서는 효소에 의한 분해가 많이 이루어질수록 단백질 함량이 감소한다. 즉, 단백질 함량이 감소한다는 것은 펩타이드 결합이 많이 끊어졌다는 것을 의미하고 이는 저분자량의 콜라겐이 수득되었다는 것이다.
시험예
3.
조지방
함량 측정
시료 약 3 g 원통여지에 넣어 지방추출용 사이폰관에 넣고 지방수기를 장착한 다음 유기용매를 사용하여 16시간 추출 후 수기내 남아있는 유기용매(ethyl ether)를 evaporator로 1차로 제거한 다음 수기에 남아있는 용매를 2차로 완전 건조하여 desiccator에서 30분간 방냉시킨 다음 무게를 측정하여 지방함량을 하기 [수학식 2]에 따라 계산하였다.
[수학식 2]
조지방(%) = {(추출후 수기+지방) - 추출 전 수기}/시료무게 x 100
구분 | 실시예1 | 실시예2 | 실시예3 | 실시예4 | 실시예5 | 실시예6 | 비교예1 | 비교예2 | 비교예3 | 비교예4 |
조지방 (%) |
11.12±0.84 | 30.56±0.94 | 27.38±0.62 | 33.16±0.19 | 2.12±0.8.3 | 1.01±0.31 | 56.14±0.53 | 44.39±0.71 | 35.17±0.49 | 28.46±0.55 |
위 표 3에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 실시예 1, 5 및 6에 따라 제조된 돈피는 다른 처리구의 돈피에 비하여 지방이 더 많이 제거된 것을 확인하였다.
시험예 4. 전기영동 패턴(SDS-PAGE electrophoresis)
SDS-PAGE는 Laemmli(1970)의 방법을 일부 변형하여 이용하였다. Prosi prestained protein marker(GenDEPOT, USA)를 사용하여, 5% stacking gel과 12% separating gel을 만들어 사용하였으며, 시료는 단백질 함량 정량 후, 2X 샘플 버퍼와 1:1로 혼합한 후 95 ℃에서 5분간 열처리하여 사용하였다. 전기영동장치(page Run, AE-6531, ATTO, Japan)를 이용하여 100 V로 전기영동 하였으며, 젤의 염색액(0.25% Coomassie brilliant blue R-250, 5% methanol and 7.5% acetic acid)을 이용 하였고, 7.5% 아세트산과 25% 메탄올로 만든 탈색하여 분리된 단백질 밴드를 확인하였다.
도 1은 본 발명의 실시예 1 및 비교예 1 내지 2에 따라 제조된 돈피의 SDS-PAGE이다. 대조구로는 무처리한 돈피를 사용하였다.
도 1에 도시된 바와 같이, 대조구는 분자량이 큰 130 kDa 및 170 kDa 범위에서 밴드가 관찰되었으나, 실시예 1의 돈피는 28 kDa 이하의 작은 분자량 단백질로 관찰되었다. 또한, 비교예 1의 돈피 역시 작은 분자량 단백질이 관찰되었지만 고형분 함량, 수율 및 콜라겐 함량이 낮았다.
반면, 비교예 1의 돈피는 분자량이 큰 단백질 및 분자량이 작은 단백질 모두 관찰되었다.
시험예
5. 분자량 분포도 측정(
MALDI
-
TOF
)
말디토프 질량분석기(MALDI-TOF MS, matrix-assisted laser desorption-ionization time-of-flight mass spectrometer)를 이용한 분석은 시료에서 발생된 이온을 검출하여 질량을 예측하는 방법으로 레이저를 시료에 조사하여 이온화시킨 후 이로 인해 발생하는 레이저 파장이 시료 매트릭스의 온도를 급격히 상승하게 하면서 발생하는 방출되는 이온을 검출하여 분자량 등을 측정하는 방법으로 가벼운 이온이 무거운 이온보다 먼저 검출기에 도착하는 이론을 통해 비행시간(time of flight)을 측정하는 원리를 이용한다. 본 연구에서는 측정된 기기는 말디토프(Voyager-DE STR, Applied Biosystems, USA)이며, 측정조건은 Resolution(FWHM), Reflector: External calibration < 50 ppm, Internal calibration < 5 ppm, MS-product Ions : < 0.15%, Sensitivity > 20:1 SNR on 1 fmol, Mass Range Neurotensin > 450 kDa이었다.
MALDI-TOF 질량분석기는 분자량이 비교적 큰 시료와 매트릭스가 혼합된 결정체에 레이저를 조사하여 이온화시킨 후 전하를 띤 이온들을 질량분석기에 통과시켜 검출기까지의 도달시간을 측정하여 분자량을 분석하는 장치로서 돈피가 저분자화되는 분해 패턴을 측정하기 위한 목적으로 수행되었다. 탈지 돈피 효소분해물의 분자량 분포도를 측정하기 위한 MALDI-TOF 시험 결과는 대상 물질을 개별적으로 판별할 수 없으나 SDS-PAGE에 비해 작은 크기의 분자 등을 판단할 수 있는 기능을 갖고 있다.
도 2는 본 발명의 실시예 5에 따라 제조된 돈피를 MALDI-TOF 질량분석기로 측정한 그래프이다.
도 2에 도시된 바와 같이, 실시예 2의 돈피는 저분자량 범위에만 피크가 분포된 것을 알 수 있으며, 이에 따라 고분자량의 콜라겐을 함유하는 돈피가 본 발명의 방법에 따라 처리되어 저분자량의 콜라겐을 함유하는 돈피로 제조되었음을 확인하였다.
Claims (15)
- 돈피, 우피 및 어피로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 브로멜라인 및 미생물 효소가 혼합된 혼합효소를 첨가하여 1차 교반한 다음 상기 1차 교반시 보다 온도를 높여 2차 교반하는 단계;를 포함하는 것을 특징으로 하는 돈피, 우피 또는 어피로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상에서 유래된 콜라겐 분자량을 낮추는 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 돈피, 우피 및 어피로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상은 혼합효소와 혼합되기 전에, 증류수와 1 : 0.8 내지 3의 중량비로 혼합되는 것을 특징으로 하는 돈피, 우피 및 어피로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상에서 유래된 콜라겐 분자량을 낮추는 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 브로멜라인과 미생물 효소는 1 : 0.5 내지 2의 중량비로 혼합되는 것을 특징으로 하는 돈피, 우피 및 어피로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상에서 유래된 콜라겐 분자량을 낮추는 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 브로멜라인과 미생물 효소는 1 : 1의 중량비로 혼합되는 것을 특징으로 하는 돈피, 우피 및 어피로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상에서 유래된 콜라겐 분자량을 낮추는 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 브로멜라인과 미생물 효소는 돈피, 우피 및 어피로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상 100 중량부에 대하여 각각 0.3 내지 0.8 중량부로 혼합되는 것을 특징으로 하는 돈피, 우피 및 어피로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상에서 유래된 콜라겐 분자량을 낮추는 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 미생물 효소는 아스퍼질루스 오리자에(Aspergillus oryzae) 유래 단백질 분해 효소인 것을 특징으로 하는 돈피, 우피 및 어피로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상에서 유래된 콜라겐 분자량을 낮추는 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 1차 교반시 온도는 40 내지 55 ℃이고, 2차 교반시 온도는 상기 1차 교반 온도보다 5 내지 10 ℃ 향상된 것을 특징으로 하는 돈피, 우피 및 어피로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상에서 유래된 콜라겐 분자량을 낮추는 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 혼합효소로 교반한 후에, 혼합효소로 처리된 돈피, 우피 및 어피로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 원심분리법 또는 용매추출법으로 처리하여 탈지를 수행하는 단계를 추가하는 것을 특징으로 하는 돈피, 우피 및 어피로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상에서 유래된 콜라겐 분자량을 낮추는 방법.
- 제8항에 있어서, 상기 탈지 처리된 돈피, 우피 및 어피로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상에 수산화나트륨, 수산화칼슘 및 탄산나트륨으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 알칼리 물질을 첨가하여 비콜라겐성 단백질을 제거하는 단계를 추가하는 것을 특징으로 하는 돈피, 우피 및 어피로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상에서 유래된 콜라겐 분자량을 낮추는 방법.
- 제9항에 있어서, 상기 알칼리 물질은 0.05 N 내지 0.2 N의 수산화나트륨인 것을 특징으로 하는 돈피, 우피 및 어피로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상에서 유래된 콜라겐 분자량을 낮추는 방법.
- 제9항에 있어서, 상기 탈지 처리된 돈피, 우피 및 어피로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상 100 중량부에 대하여 알칼리 물질 0.5 내지 5 중량부가 첨가되는 것을 특징으로 하는 돈피, 우피 및 어피로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상에서 유래된 콜라겐 분자량을 낮추는 방법.
- 제9항에 있어서, 상기 알칼리 물질로 처리된 돈피, 우피 및 어피로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 여과한 후 세척하고 원심분리한 다음 침전물을 동결건조하는 것을 특징으로 하는 돈피, 우피 및 어피로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상에서 유래된 콜라겐 분자량을 낮추는 방법.
- 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항의 방법에 따라 제조된 콜라겐의 분자량을 낮춘 돈피.
- 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항의 방법에 따라 제조된 콜라겐의 분자량을 낮춘 우피.
- 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항의 방법에 따라 제조된 콜라겐의 분자량을 낮춘 어피.
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