CN101385874B - 一种含有高分子透明质酸的生物滑液的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种含有高分子透明质酸的生物滑液的制备方法，该方法首先培养动物或人的能够产生透明质酸的滑膜细胞，然后从培养液中提取滑膜细胞分泌的高分子透明质酸，并将提取了高分子透明质酸后的培养液经过超滤后浓缩得沉集物，最后将提取的高分子透明质酸与所得沉集物按药用量溶解于生理盐水中即制得含有高分子透明质酸的生物滑液。本发明由于原料的来源与细胞的培养均为生理状态下，故制备的人工滑液的生物学活性、物理性状、流变学性能均与天然滑液极为接近。
Description
技术领域
本发明涉及润滑液领域，具体涉及一种新型医用生物滑液的制备方法
背景技术
透明质酸(hyaluronic acid，HA)，又称玻璃酸，是Meyer和Palmer于1934年最先从牛眼玻璃体中分离出来的一种高粘性物质。后来又有学者对HA的生理功能、化学结构和临床上的应用进行了大量的研究。盐形式的HA可以包括透明质酸钠、透明质酸钾、透明质酸镁、透明质酸钙或其他的透明质酸盐。
透明质酸是一种生物来源的粘多糖，在自然界分布广泛。已知的透明质酸存在于各种动物组织中，例如脐带、滑液、玻璃体液、公鸡冠和各种结缔组织中。
人体中关节滑液是由关节滑膜细胞分泌，滑液覆盖在关节表面。HA是构成关节软骨和滑液的主要成分。对关节生理功能的发挥起着至关重要的作用。在关节中，关节盘、滑液、关节软骨均参与关节润滑，在生理负荷之下，滑液构成的液膜在关节润滑中起主要作用，而在高负荷之下关节面之间可以发生接触，滑液构成的边界润滑系统起主要作用。正常的关节软骨表面覆盖着很薄的表面活性磷脂层，各个磷脂分子借助氢键相连形成了一层保护膜，在边界润滑中起主要作用。高分子量的透明质酸作为一种液态薄膜与表面活性磷脂层相连，以保护其不受磷脂酶A2的攻击，在边界润滑系统中起间接作用。另外，在滑液中还存在一种粘性糖蛋白—润滑素，它被认为是表面活性磷脂的水溶性载体，是人类滑膜成纤维细胞的巨核细胞刺激因子基因的表达产物，它和磷脂一起以脂蛋白的形式由滑膜B型细胞分泌至滑液中，在磷脂从滑液沉积至关节软骨表面的过程中起到了载体的作用。当发生骨性关节炎(OA)、类风湿性关节炎(RA)等其他感染性和非感染性关节疾病时，HA在关节内的产生和代谢发生异常，滑液中HA的浓度和相对分子质量(Mr)明显降低，软骨发生降解和破坏，导致关节生理障碍。应用透明质酸进行关节病的关节腔内注射治疗，旨在通过补充外源性HA，恢复滑液的润滑功能，促进软骨的修复，改善关节功能。
迄今为止，大量的临床研究使用结果表明，HA对OA、RA等关节疾病治疗效果明确、安全，具有很好的临床应用前景。
目前，HA原料普遍采用的生产方法主要有两种：一种是从动物组织中提取；另一种是微生物发酵法。提取法主要利用鸡冠、人脐带、牛眼的玻璃体等为原料，进行生产，而且组织必须是新鲜采集，这样不但动物组织来源困难，且价格昂贵，成本高，这给HA的生产带来了一定的困难；发酵法生产HA，是利用链球菌将廉价的葡萄糖转化为HA，不依赖于动物器官，产量不受限制，但发酵法HA的产量不高，生物相容性不如前者。本发明提供的通过细胞培养的方法提取透明质酸的新方法，能够制备出具有更好的润滑功能、生物理化性能、生物安全性能的含有高分子透明质酸的新型生物滑液。
发明内容
本发明的目的是针对传统的透明质酸的来源、成本、生物相容性、理化性能等方面的不足而提出的一种新型含有高分子透明质酸的生物滑液的制备方法。该方法的特点是通过培养动物或人的滑膜细胞、提取滑膜细胞分泌的透明质酸，经过超滤后浓缩，制备成具有更好的润滑功能、生物理化性能、生物安全性能的含有高分子透明质酸的新型生物滑液。
实现本发明目的的技术方案是：这种含有高分子透明质酸的生物滑液的制备方法是首先培养动物或人的能够产生透明质酸的滑膜细胞，然后从培养液中提取滑膜细胞分泌的高分子透明质酸，并将提取了高分子透明质酸后的培养液经过超滤后浓缩得沉集物，将提取的高分子透明质酸与所得沉集物按药用量溶解于生理盐水中即制得含有高分子透明质酸的生物滑液。
该方法包括如下具体步骤：
(1)培养动物或人的能够产生透明质酸的滑膜细胞：取需要量的滑膜组织，用组织块法培养滑膜细胞，然后用单细胞克隆法对滑膜细胞进行分型，得单细胞群体悬液；
(2)微载体培养：将单细胞群体悬液接种入装有微载体的容器中培养；
(3)滑膜细胞微载体培养上清中透明质酸的提取：将TGF-β、TNF-α、EGF、rhEGF或者HGF加入培养基，刺激后换液，留取培养上清液，并对培养上清液进行离心，收集离心后的上清液，取需要量的上清液，经高效液相色谱提取分子量大于100万的大分子透明质酸；
(4)对提取了大分子透明质酸后的滑膜细胞微载体培养上清的处理：对提取后的上清液进行充分离心、沉集处理，收集沉集样品，然后将收集的沉集样品超滤浓缩；
(5)按药用量将提取的大分子透明质酸和超滤浓缩的沉集样品溶解于生理盐水中，低温保存，制得含有高分子透明质酸的生物滑液。
其中所用动物或人的滑膜组织为兔、羊、小鼠、小型猪或人的关节的滑膜组织。
由上述技术方案可知，本发明提供的含有高分子透明质酸的生物滑液的制备方法是通过细胞培养的方法提取透明质酸的新方法，其的优点是：
1.利用高分子透明质酸的镇痛、保护软骨细胞、促进滑膜合成透明质酸、抑制出血与纤维蛋白沉着等作用，可有效的保护关节紊乱病中的受损的滑膜并改善滑液的分泌。
2.本发明制备的生物滑液组合将保护滑膜、修复关节滑膜与改善滑液的分泌结合在一起，是一种理想的生物滑液组合，可以用于将来制备成非常具有开发和应用前景的生物滑液。
3.本发明制备的生物滑液具有更好的关节润滑功能、生物理化性能、流变学性能、生物安全性能。
4.本发明方法中的高分子HA经过高效液相色谱提取，通过离心、沉集后超滤保证了提取的HA的纯度。
5.将本发明中的细胞培养法生产HA与动物组织提取法生产HA，及细菌发酵法提取法生产HA进行比较，比较结论分别见下列两表：
动物组织提取法和细胞培养法生产HA的比较
细菌发酵法和细胞培养法生产HA的比较
附图说明
图1为乳兔细胞培养后提取的HA图。
图2为正常人的滑膜培养后高效液相色谱提取的HA图。
图中纵坐标表示信号大小，横坐标表示时间。
具体实施方式
因细胞培养在具体操作中会涉及到较多数据条件，本发明无法一一列举，下面实施例仅用于对本发明的具体操作步骤进行详细说明。
实施例1：
一、乳兔关节滑膜细胞的分离、培养、鉴定
1、取出生24小时乳兔颞下颌关节关节盘双板区处的滑膜组织，组织块法培养。
2、单细胞克隆法对滑膜细胞进行分型。
(1)单细胞克隆
收集适应性培养基培养滑膜细胞至半汇合状态，吸出所有培养液离心，直径0.22μm滤孔的滤膜过滤。取一瓶处于对数生长期的细胞常规消化、离心、计数。细胞稀释成每100μL约含50个细胞，打匀，点种。在倒置显微镜下观察96孔板，将只有单个细胞的序号记录下来，然后仅给单个细胞孔加培养液150～200μL，置CO2培养箱培养。培养86～96小时后进行观察。挑选生长良好的单细胞克隆孔，先吸除旧培养液，用平衡盐溶液Hanks洗1～2次，用需要量胰蛋白酶消化。置于倒置显微镜下观察，当细胞离开底物悬浮后，一并吸入管中，移入另一瓶中，再补加需要量克隆培养液，置CO2温箱中继续培养、增量，使之形成新的细胞群体。
(2)滑膜细胞的鉴定
光镜观察 常规HE染色，显微镜下观察细胞形态，倒置显微镜下观察细胞的形态及生长状况。
细胞免疫化学 1∶100的鼠抗人Vimentin单克隆抗体、鼠抗人CD68单克隆抗体免疫反应，显微镜下观察细胞形态。
透射电镜观察细胞 2.5％戊二醛前固定，1.0％四氧化锇后固定，梯度脱水，环氧树脂包埋，超薄切片，乙酸双氧铀和枸橼酸铅染，40kV透射电镜观察。
流式细胞仪检测 细胞经FACS缓冲液重悬，离心，去上清，分别与鼠抗人Fibronectin单克隆抗体、鼠抗人CD14单克隆抗体及对应的同型对照IgG(阴性对照)，于4℃孵育45min，洗涤细胞，对应加入FITC标记的羊抗鼠IgG，4℃避光条件下孵育30min，洗涤细胞，加入2％多聚甲醛固定，流式细胞仪检测。
(3)于微载体中培养的滑膜细胞分泌的生物滑液中含有的HA的含量与牙周膜细胞分泌的滑液中HA的含量的比较：
由于牙周膜细胞为典型的成纤维细胞，而滑膜细胞为成纤维样细胞，故采用放射免疫试剂法通过试剂盒检测将两者进行比较。
结果为：于微载体中培养的滑膜细胞分泌的生物滑液的上清液中可以测得HA的含量为3.9～7.7mg/ml
提取培养的牙周膜细胞分泌的滑液的上清液中可以测得HA的含量为0.7～1.5mg/ml
通过与典型的成纤维细胞的比较后，能够证明培养的滑膜细胞分泌HA的功能较强。
二、微载体培养
将100ml浓度为2×107/L的细胞悬液，接种入含500mg微载体的搅拌培养瓶中间歇搅拌培养8h后持续搅拌培养。微载体培养细胞1、5、7、9天生长形态观察、摄影及计数，每隔1d取样以结晶紫法计数细胞密度绘制生长曲线。将1ng/ml的TGF-β加入培养基。微载体培养细胞扫描电镜观察，于培养7d在均匀的状态下取细胞培养样品，扫描电子显微镜观察细胞生长情况并摄影。
三、滑膜细胞微载体培养上清中透明质酸(HA)的提取
TGF-β刺激4天后换液，留取培养上清，1000g，4℃离心10～30分钟，取25
μL上清样品采用放射免疫抗原竞争法检测培养HA含量。取10mL上清样品经高效液相色谱提取分子量大于100万的大分子HA。所提HA见附图1，图1中纵坐标为用示差折光标测器测得的信号大小，横坐标表示时间，图中显示出峰时间为5.868分钟。
四、对提取了大分子透明质酸后的滑膜细胞微载体培养上清的处理
将10mL上清样品首先在密度1.6g/cm3的氯化铯溶液中220,000g离心10～54h，沉集样品在密度1.45g/cm3的氯化铯溶液中220,000～420,000g离心4～48h，相同条件下重复一次。沉集样品收集后用Amicon PM-10膜超滤浓缩作为润滑素。
五、将从10mL上清中提取的大分子HA和经超滤浓缩后的沉集样品溶解于生理盐水中，加生理盐水至总体积10mL，过滤除菌后-20℃低温保存。多次提取的大分子HA和润滑素混合液经简便超滤器超滤后浓缩50倍，-20℃低温保存。
实施例2：
一、人颞下颌关节滑膜细胞的分离、培养、鉴定
1、取人一侧颞下颌关节关节盘双板区处的滑膜组织，组织块法培养。
2、单细胞克隆法对滑膜细胞进行分型。
(1)单细胞克隆
收集适应性培养基培养滑膜细胞至半汇合状态，吸出所有培养液离心，直径0.22μm滤孔的滤膜过滤。取一瓶处于对数生长期的细胞常规消化、离心、计数。细胞稀释成每100μL含45～50个细胞，打匀，点种。在倒置显微镜下观察96孔板，将只有单个细胞的序号记录下来，然后仅给单个细胞孔加培养液150～200μL，置CO2培养箱培养。培养86～96小时后进行观察。挑选生长良好的单细胞克隆孔，先吸除旧培养液，用Hanks洗1～2次，用少许胰蛋白酶消化。置于倒置显微镜下观察，当细胞离开底物悬浮后，一并吸入管中，移入另瓶中，再补加一定量克隆培养液，置CO2温箱中继续培养、增量，使之形成新的细胞群体。
(2)滑膜细胞的鉴定
光镜观察常规HE染色，显微镜下观察细胞形态，倒置显微镜下观察细胞的形态及生长状况。
细胞免疫化学1∶100的鼠抗人Vimentin单克隆抗体、鼠抗人CD68单克隆抗体免疫反应，显微镜下观察细胞形态。
透射电镜观察细胞2.5％戊二醛前固定，1.0％四氧化锇后固定，梯度脱水，环氧树脂包埋，超薄切片，乙酸双氧铀和枸橼酸铅染，40kV透射电镜观察。
流式细胞仪检测细胞经FACS缓冲液重悬，离心，去上清，分别与鼠抗人Fibronectin单克隆抗体、鼠抗人CD14单克隆抗体及对应的同型对照IgG(阴性对照)，于4℃孵育45min，洗涤细胞，对应加入FITC标记的羊抗鼠IgG，4℃避光条件下孵育30min，洗涤细胞，加入2％多聚甲醛固定，流式细胞仪检测。
(3)于微载体中培养的滑膜细胞分泌的生物滑液中含有的HA的含量与牙周膜细胞分泌的滑液中HA的含量的比较：
由于牙周膜细胞为典型的成纤维细胞，而滑膜细胞为成纤维样细胞，故采用放射免疫试剂法通过试剂盒检测将两者进行比较。
结果为：于微载体中培养的滑膜细胞分泌的生物滑液的上清液中可以测得HA的含量为1.0~1.9μg/ml。
提取培养的牙周膜细胞分泌的滑液的上清液中可以测得HA的含量为0.7～1.5μg/ml
通过与典型的成纤维细胞的比较后，能够证明培养的滑膜细胞分泌HA的功能较强。
二、微载体培养
将100ml浓度为4×107/L的细胞悬液，接种入含500mg微载体的搅拌培养瓶中间歇搅拌培养12h后持续搅拌培养。微载体培养细胞1、5、7、9天生长形态观察、摄影及计数，每隔1d取样以结晶紫法计数细胞密度绘制生长曲线。将10～50ng/ml的TNF-α(也可用EGF、rhEGF或者HGF)加入培养基。微载体培养细胞扫描电镜观察，于培养7d在均匀的状态下取细胞培养样品，扫描电子显微镜观察细胞生长情况并摄影。
三、滑膜细胞微载体培养上清中透明质酸(HA)的提取
TNF-α刺激7天后换液，留取培养上清，1000g，4℃离心10～30分钟，取25μL上清样品采用放射免疫抗原竞争法检测培养HA含量。取10mL上清样品经高效液相色谱提取分子量大于100万的大分子HA，所提HA见附图2，图2中纵坐标为用示差折光标测器测得的信号大小，横坐标表示时间，图中显示出峰时间为5.875分钟。
四、对提取了大分子透明质酸后的滑膜细胞微载体培养上清的处理
将10mL上清样品首先在密度1.6g/cm3的氯化铯溶液中220,000～420,000g离心4～48h，沉集样品在密度1.45g/cm3的氯化铯溶液中220,000g离心48h，相同条件下重复一次。沉集样品收集后用Amicon PM-10膜超滤浓缩作为润滑素。
五、将从10mL上清中提取的大分子HA和经超滤浓缩后的沉集样品溶解于生理盐水中，加生理盐水至总体积10mL，过滤除菌后-20℃低温保存。
实施例3：
一、人膝关节滑膜细胞的分离、培养、鉴定
1、取人膝关节关节盘双板区处的滑膜组织，组织块法培养。
2、单细胞克隆法对滑膜细胞进行分型。
(1)单细胞克隆
收集适应性培养基培养滑膜细胞至半汇合状态，吸出所有培养液离心，直径0.22μm滤孔的滤膜过滤。取一瓶处于对数生长期的细胞常规消化、离心、计数。细胞稀释成每100μL约含45～55个细胞，打匀，点种。在倒置显微镜下观察96孔板，将只有单个细胞的序号记录下来，然后仅给单个细胞孔加培养液150～200μL，置CO2培养箱培养。培养86～96小时后进行观察。挑选生长良好的单细胞克隆孔，先吸除旧培养液，用平衡盐溶液Hanks洗1～2次，用需要量的胰蛋白酶消化。置于倒置显微镜下观察，当细胞离开底物悬浮后，一并吸入管中，移入另一瓶中，再补加需要量克隆培养液，置CO2温箱中继续培养、增量，使之形成新的细胞群体。
(2)滑膜细胞的鉴定
光镜观察 常规HE染色，显微镜下观察细胞形态，倒置显微镜下观察细胞的形态及生长状况。
细胞免疫化学 1∶100的鼠抗人Vimentin单克隆抗体、鼠抗人CD68单克隆抗体免疫反应，显微镜下观察细胞形态。
透射电镜观察细胞 2.5％戊二醛前固定，1.0％四氧化锇后固定，梯度脱水，环氧树脂包埋，超薄切片，乙酸双氧铀和枸橼酸铅染，40kV透射电镜观察。
流式细胞仪检测 细胞经FACS缓冲液重悬，离心，去上清，分别与鼠抗羊Fibronectin单克隆抗体、鼠抗羊CD14单克隆抗体及对应的同型对照IgG(阴性对照)，于4℃孵育45min，洗涤细胞，对应加入FITC标记的兔抗鼠IgG，4℃避光条件下孵育30min，洗涤细胞，加入2％多聚甲醛固定，流式细胞仪检测。
提取培养的牙周膜细胞分泌的滑液的上清液中可以测得HA的含量为0.7～1.5μg/ml
通过与典型的成纤维细胞的比较后，能够证明培养的滑膜细胞分泌HA的功能较强。
二、微载体培养
将100ml浓度为2～5×107/L的细胞悬液，接种入含500mg微载体的搅拌培养瓶中间歇搅拌培养12h后持续搅拌培养。微载体培养细胞1、5、7、9天生长形态观察、摄影及计数，每隔1d取样以结晶紫法计数细胞密度绘制生长曲线。TNF-α(10～50ng/ml)加入培养基。微载体培养细胞扫描电镜观察，于培养7d在均匀的状态下取细胞培养样品，扫描电子显微镜观察细胞生长情况并摄影。
三、滑膜细胞微载体培养上清中透明质酸(HA)的提取
TNF-α刺激4天后换液，留取培养上清，1000g，4℃离心10～30分钟，取25μL上清样品采用放射免疫抗原竞争法检测培养HA含量。取10mL上清样品经高效液相色谱提取分子量大于100万的大分子HA，所提HA见附图。
四、对提取了大分子透明质酸后的滑膜细胞微载体培养上清的处理
离心后的10mL上清样品首先在密度1.6g/cm3的氯化铯溶液中220,000g离心54h，沉集样品在密度1.45g/cm3的氯化铯溶液中220,000～420,000g离心4～48h，相同条件下重复一次。沉集样品收集后用Amicon PM-10膜超滤浓缩作为润滑素。
五、将从10mL上清中提取的大分子HA和经超滤浓缩后的沉集样品溶解于生理盐水中，加生理盐水至总体积10mL，过滤除菌后-20℃低温保存。
Claims (6)
1.一种含有高分子透明质酸的生物滑液的制备方法，其特征在于：首先培养动物或人的能够产生透明质酸的滑膜细胞，然后从培养上清液中提取滑膜细胞分泌的高分子透明质酸，并将提取了高分子透明质酸后的培养上清液经过超滤后浓缩得沉积物，将提取的高分子透明质酸与所得沉积物按药用量溶解于生理盐水中即制得含有高分子透明质酸的生物滑液，具体步骤为：
（1）培养动物或人的能够产生透明质酸的滑膜细胞：取需要量的滑膜组织，用组织块法培养滑膜细胞，然后用单细胞克隆法对滑膜细胞进行分型，得单细胞群体悬液；
（2）微载体培养：将单细胞群体悬液接种入装有微载体的容器中培养；
（3）滑膜细胞微载体培养上清液中透明质酸的提取：将TGF-β、TNF-α、EGF、rhEGF或者HGF加入培养上清液，刺激后换液，留取培养上清液，并对培养上清液进行离心，收集离心后的培养上清液，取需要量的培养上清液，经高效液相色谱提取分子量大于100万的高分子透明质酸；
（4）对提取了高分子透明质酸后的滑膜细胞微载体培养上清液的处理：对提取后的培养上清液进行充分离心、沉集处理，收集沉积物，然后将收集的沉积物超滤浓缩；
（5）按药用量将提取的高分子透明质酸和超滤浓缩的沉积物溶解于生理盐水中，低温保存，制得含有高分子透明质酸的生物滑液。
2.根据权利要求1所述的含有高分子透明质酸的生物滑液的制备方法，其特征在于：所用动物或人的滑膜组织为兔、羊、小鼠、小型猪或人的关节的滑膜组织。
3.根据权利要求1所述的含有高分子透明质酸的生物滑液的制备方法，其特征是用单细胞克隆法对滑膜细胞进行分型的具体步骤为：收集适应性培养基培养滑膜细胞至半汇合状态，吸出所有培养上清液离心，用直径0.22μm滤孔的滤膜过滤；取一瓶处于对数生长期的细胞常规消化、离心、计数；将细胞稀释成每100μL含45～55个细胞，打匀，点种；在倒置显微镜下观察96孔板，将只有单个细胞的序号记录下来，然后仅给单个细胞孔加培养上清液，置CO2培养箱培养；培养86~96小时后进行观察；挑选生长良好的单细胞克隆孔，先吸除旧培养上清液，用平衡盐溶液洗1~2次，用需要量胰蛋白酶消化，置于倒置显微镜下观察，当细胞离开底物悬浮后，一并吸入管中，移入另一瓶中，再补加需要量克隆培养液，置CO2温箱中继续培养、增量，使之形成新的细胞群体。
4.根据权利要求1所述的含有高分子透明质酸的生物滑液的制备方法，其特征是微载体培养的具体步骤为：将浓度为1×107--108/L的50-200ml细胞悬液，接种入含微载体的搅拌培养瓶中间歇搅拌培养8～24小时后持续搅拌培养。
5.根据权利要求1所述的含有高分子透明质酸的生物滑液的制备方法，其特征是滑膜细胞微载体培养上清液中透明质酸的提取的具体步骤为：将TGF-β、TNF-α、EGF、rhEGF或者HGF加入培养上清液，刺激24～220小时后换液,留取需要量的培养上清液，4oC离心10~30分钟，取需要量培养上清液，采用放射免疫抗原竞争法检测透明质酸含量，再取需要量培养上清液经高效液相色谱提取分子量大于100万的高分子透明质酸。
6.根据权利要求1所述的含有高分子透明质酸的生物滑液的制备方法，其特征是对提取了高分子透明质酸后的滑膜细胞微载体培养上清液的处理的具体步骤为：将提取后的培养上清液首先在密度1.6g/ cm3的氯化铯溶液中220,000g～420,000g离心力下离心10～54h,再将沉积物在密度1.45g/ cm3的氯化铯溶液中220,000～420,000g离心力下离心4～48 h，相同条件下重复一次，然后沉积物收集后用Amicon PM-10膜超滤浓缩。
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| 鲁念慈，等.透明质酸的制备及其应用.《功能高分子学报》.2001,第14卷(第3期),370-376. * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN101385874A (zh) | 2009-03-18 |
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