JPH08259604A - ヒアルロン酸薬理活性画分、その製造方法および医薬組成物 - Google Patents

ヒアルロン酸薬理活性画分、その製造方法および医薬組成物

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JPH08259604A JP7211646A JP21164695A JPH08259604A JP H08259604 A JPH08259604 A JP H08259604A JP 7211646 A JP7211646 A JP 7211646A JP 21164695 A JP21164695 A JP 21164695A JP H08259604 A JPH08259604 A JP H08259604A
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Abstract

(57)【要約】 【課題】 医薬品として価値のある、非炎症性のヒアル
ロン酸フラクションを提供すること。 【解決手段】 分子ろ過にかけて分子量30,000以下のヒ
アルロン酸フラクションを除去する。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の背景と分野】本発明は、治療的効用を有し、し
かも使用時になんら炎症性を示さないヒアルロン酸（以
下ＨＡと省略する）の特定分子量の画分に関する。本発
明に示すＨＡ画分の一つは創傷治癒を促進するのに有用
であり、また他方、第２のＨＡ画分は眼球内液の代用液
として眼内使用に有用であり、また骨関節の損傷の治療
適用のため関節内注入に有用である。さらにそれらのＨ
Ａ画分は、眼科用薬の賦形薬として角膜上皮とよく適合
し得る製剤を調製し、眼科用薬の活性を高めるのに有用
であることが明らかにされた。
【０００２】
【従来の技術】ヒアルロン酸は、天然に産生され、交互
に並ぶＤ−グルクロン酸残基とＮ−アセチル−Ｄ−グル
コサミン残基から構成されている異種多糖類である。Ｈ
Ａは、一般に約８００万〜１３００万の高い分子量を有
する線状のポリマーで、細胞外皮、脊椎動物の結合組織
の細胞外間質物質、関節の滑液、眼の眼球内液、ヒトの
臍帯組織、および雄鷄のとさかに存在している。
【０００３】ＨＡの利用に関する従来の研究の一つに、
眼球内液に代用され、その他の治療にも適用し得る有用
なＨＡの１画分を示したバラズスの研究がある（米国特
許第４,１４１,９７３号）。然しながら、この特許は平
均分子量が約７５０,０００より大きく、好ましくは約
１,２００,０００より大きいＨＡ画分を特に指定してい
る。バラズスは、平均分子量が７５０,０００より小さ
いＨＡ画分は炎症活性があるので治療用に使用できない
ことを特に指摘している。これらの低級分子量のＨＡ画
分はバラズスによると破棄されている。然しこのため
に、原料組織から入手される利用可能なＨＡの総量の約
９０％は破棄され、利用可能なＨＡの僅かな量（約１０
％）だけが使用される結果となっている。
【０００４】バラズスの指摘した結果と逆に、本発明者
はＨＡの低級分子量の画分が、実際に有用な薬学的活性
を有することを発見した。したがって、本発明によると
種々の材料から入手し得るＨＡの約８０％までが利用さ
れる。特に本発明者は、創傷治癒の促進に有用なＨＡの
１画分、および眼の眼球内液の代用液として眼内に注射
し、損傷された関節の治療用として関節内注射に使用し
得るＨＡの第２の画分を発見した。
【０００５】
【発明の詳細な記載】前述のように、従来のＨＡの研究
では、バラズスの特許に代表される如く、平均分子量が
７５０,０００以上の高分子量の画分を使用するように
指摘している。本発明者は、低分子量を有する画分と、
中間に位置する平均分子量を有するもう一つの画分との
２個の新規なＨＡ画分を単離し、確認した。それらの画
分は高度の純度を示すので実質的に純粋であると考えら
れ、しかも炎症活性を有しない。これらの新規ＨＡ画分
は、ヒアルロン酸の抽出し得る量を含有する種々の結合
組織から入手することができる。本発明に示した特殊画
分は、分子濾過の技術に従って逐次的に分別され、分離
される。
【０００６】本出願方法によって分離される最初の画分
はヒアラスチン（HYALASTIN）と命名され、約５０,００
０〜約１００,０００の平均分子量を有する。このヒア
ラスチン画分は、その創傷治癒活性から獣医用およびヒ
ト用の治療的応用に好適であることが確認された。本出
願方法によって単離された第２の画分はヒアレクチン
（HYALECTIN）と命名され、約５００,０００〜約７３
０,０００の平均分子量を有する。このヒアレクチンは
眼球内液の代用液として眼科手術の際に使用され、また
獣医学領域およびヒトにおける関節の外傷性および退行
性疾患の治療に好適である。ヒアラスチンは皮内注射、
または創傷治癒用の局所剤のいずれでも投与できる。一
方、ヒアレクチンは眼内注射および関節内注射が好適で
ある。
【０００７】本出願方法においてはＨＡの各種画分につ
いて入念な検討を行い、従来の方法と比べて明らかによ
り正確な方法を以て、ＨＡの治療上有用な画分と、炎症
性で利用できないＨＡ画分とを明瞭に決定づけた。これ
らの研究の結果から、本発明者はＨＡ画分に特有な二つ
の性質、即ち細胞可動化（cell mobilization）活性と
固有粘度（intrinsic viscosity）を確認し、検討し
た。動物における創傷治癒の過程は細胞運動性、特に線
維芽細胞の細胞運動性によって促進される。一方、細胞
運動性または増殖能（即ち、有系分裂）は、眼球内側の
手術の場合はできるだけ回避されるべきである。癒合速
度の増大が却って有害な影響をもたらす可能性がある網
膜剥離の矯正手術において、このことは特に事実であ
る。
【０００８】固有粘度もまた、ＨＡ画分の有用性の判定
に際して考慮すべき重要な指標である。固有粘度が高い
画分は、外傷性および退行性の関節疾患の治療における
手術適用に有用であり、また眼球内液の代用液としても
有用である。一方、高い粘度は、創傷治癒を促進する薬
物として使用される画分にとって好ましからぬ特性であ
る。事実、創傷治癒に利用される画分は、実際の適用に
当たって使用し易いように低い粘度であるべきである。
【０００９】本発明においてヒアラスチンと呼ばれる画
分は、良好な運動性、即ち細胞増殖能を有し、且つ低粘
度を有することが確認された。従って、ヒアラスチン
は、創傷治癒の促進に有用な物質として望ましい特性を
有する。同時に一方では、この特性がヒアラスチン画分
の眼内注射療法、または関節内注射法への適用を好まし
くないものにしている。
【００１０】本発明において、ヒアレクチンと呼ばれる
画分は、細胞運動性、即ち増殖能がごく僅かである一
方、同時に高い粘度を有することが確認された。従って
これらの特性から、ヒアレクチン画分は眼内注射療法お
よび関節内注射療法に有用である。然し他方、ヒアレク
チンは細胞運動活性を示さないので、この画分は創傷治
癒法には有用ではない。
【００１１】ヒアルロン酸の有用な画分を分離する場
合、炎症活性を示さない画分を得ることが重要である。
前述のバラズスの特許は、炎症活性がないヒアルロン酸
画分を得るためには、平均分子量がもっぱら７５０,０
００以上の画分だけを使用しなければならないことを教
示している。このように、バラズスは炎症活性の理由か
ら有用でないとして、平均分子量７５０,０００以下の
画分を破棄している。バラズスの教示に反して、本出願
方法はバラズスにより平均分子量７５０,０００以下の
画分に帰せられた炎症活性が、実は平均分子量３０,０
００以下の不純物に由来していることを発見した。従っ
て本発明は、化学的方法に引続き、分子量３０,０００
以下の炎症性画分を除去し得る一連の分子濾過技術から
なる方法を提供する。
【００１２】本発明方法によって、特殊な出発材料から
入手し得る総ヒアルロン酸に対し、両者を併わせ約８０
％の総収率に達する炎症活性のない有用なヒアルロン酸
画分を得ることが可能である。この８０％の収率で入手
し得るヒアルロン酸画分は、ヒアレクチン画分とヒアラ
スチン画分の双方を含んでいる平均分子量約２５０,０
００〜約３５０,０００の混合画分からなる。更に限定
すれば、ヒアレクチン画分は原料組織から入手し得るＨ
Ａの約３０％の収率で得られ、またヒアラクチン画分は
入手し得るＨＡの約５０％の収率で得らる。この要素
は、前述のバラズスの特許方法に対し、利用し得るヒア
ルロン酸の薬学的に有用な量を有意に増大させることを
発見した本発明の重要な改良点である。平均分子量７５
０,０００以上の画分だけを利用するバラズスの特許方
法では、動物臓器から利用し得るもとのヒアルロン酸の
僅かに約１０％だけの収率しか得られず、利用し得るヒ
アルロン酸の約９０％は破棄される。このように本発明
によって、総ヒアルロン酸抽出物の利用度は著しく高め
られた。
【００１３】ヒアルロン酸の各種画分の抽出は相対的収
率の比較を表１に示す。
【表１】
【００１４】添付した図１は、本出願方法で確認された
各種のＨＡ画分を図式的に示したものである。図１の釣
鐘型の曲線は、原料組織から入手し得るＨＡ画分の分布
の概略を表している。図１の「Ｂ」領域は、バラズス
（米国特許第４,１４１,９７３号）によって確認された
薬学的に有用なＨＡ画分を表す。Ａ区分は平均分子量３
０,０００以下の炎症性画分であり、Ｉ領域はヒアラス
チン画分であり、II領域はヒアレクチン画分である。こ
のグラフから、バラズスの方法は平均分子量７５０,０
００以下のＨＡ画分を除去することによって利用し得る
ＨＡ抽出画分の大部分を破棄していることが判る。これ
に対し、発明では平均分子量が３０,０００以下の低分
子量のヒアルロン酸が炎症活性を生じることを、予かじ
め研究者らがＨＡの種々の抽出物について着目していた
ので、入手し得るＨＡの大部分が薬学的に利用できた。
【００１５】本発明者は、特別な治療適応により開示し
た発明技術に従って分離すれば、入手し得る大部分のＨ
Ａが、実際治療目的に利用できることを発見した。バラ
ズスの特許は入手し得るＨＡの約１０％だけの応用を特
定して開示しているが、本発明では創傷治癒の適用に対
しヒアラスチン画分の形で、または眼内適用または関節
内適用に対しヒアレクチン画分の形で、或いは、創傷治
癒の適用に使用できるヒアラスチン画分とヒアレクチン
画分を合わせた形で、入手し得るＨＡの約８０％を利用
できる。
【００１６】確認された画分の化学的および物理的性質
を、本発明で調査し、これらの諸性質を表２にまとめ
た。
【００１７】
【表２】
【００１８】製造方法 実施例１： 炎症活性のないヒアラスチンとヒアレクチ
ン混合物の製造方法 新しい、または冷凍した雌鷄のとさか（3000g）をひき
肉器にかけてミンチにひき、次に機械的ホモジナイザー
で注意深くホモジネートする。得られたペーストを１０
容量の無水アセトンと共に、ステンレススチール製容器
AISI316またはガラス製容器に入れる。次いで全内容物
を、５０g／分の速度で６時間撹拌した後、１２時間静
置して分離し、アセトンをサイフォンで除いて棄てる。
この抽出操作を、破棄する。アセトンが正しい湿度水準
に達するまで（カール・フィッシャー法）反復する。得
られた物質を次に遠心し、好適な温度で５〜８時間真空
乾燥する。この操作により、雌鷄のとさかから約５００
〜６００gの乾燥粉末が得られる。
【００１９】次に、この乾燥粉末３００gを、適量の塩
酸システインの存在下にリン酸バッファー緩衝水性媒質
中で、パパイン（０.２g）により酵素的に消化させる。
次いで、この混合液を６０〜６５℃の一定温度で２４時
間、６０g／分の速さで撹拌する。この全量にセライト
６０gを加えて冷却し、なお１時間撹拌を持続する。得
られた混合物は、透明な濾液が得られるまで濾過する。
次にこの透明な濾液を、分子量の最大端（排出限界）が
３０,０００であるメンブランを用いて限外濾過し、分
子量３０,０００以上の分子をメンブラン上に補足す
る。原液の５〜６倍量を限外濾過し、同時に絶えず生成
物に蒸留水を加える。蒸留水を加えて懸濁させ、原容量
の１／３となるまで生成物を限外濾過する。残った液体
に、０.１モルになるよう塩化ナトリウムを加え、温度
を５０℃に上昇させる。生成物を６０g／分で撹拌しつ
つ、セチルピリジニウムクロリド４５gを加える。この
混合液を６０分間撹拌した後、セライト５０gを加え
る。撹拌しつつ生成物の温度を２５℃まで下げ、生成す
る沈澱を遠心して採取する。このようにして得られた沈
澱を、セチルピリジニウムクロリド０.０５％を含有す
る塩化ナトリウムの０.０１モル溶液（５リットル）に
懸濁させる。この懸濁液をさらに５０℃で６０分間撹拌
する。温度を２５℃に下げ、沈澱を遠心して採取する。
【００２０】次に、洗浄操作を３回反復し、最後に沈澱
物を集めて、セチルピリジニウムクロリド０.０５％を
含有する塩化ナトリウムの０.０５モル溶液を加えた容
器に入れる。これを６０g／分で６０分間撹拌し、内容
物を２５℃の一定温度で２時間放置する。上清を遠沈に
よって除去する。この操作を、０.０５％のセチルピリ
ジニウムクロリドを含有する塩化ナトリウムの０.１モ
ル溶液を用いて、数回反復する。混合物を遠心し、上清
を棄てる。沈澱を０.０５％のセチルピリジニウムクロ
リドを含有する塩化ナトリウムの０.３０モル溶液（３
リットル）に分散させる。混合物を撹拌し、沈澱と透明
な液の双方を採取する。沈澱はさらに３回、それぞれ前
述の溶液０.５リットルを用いて抽出を繰り返す。
【００２１】最後に残った沈澱を除去し、透明な抽出液
を１個の容器にまとめる。撹拌しつつ溶液の温度を５０
℃に上昇させる。次に溶液に塩化ナトリウムを０.２３
モルとなるよう添加する。さらにセチルピリジニウムク
ロリド１gを加え、１２時間撹拌を続ける。混合液を２
５℃に冷却し、最初はセライト充填物、次いでフィルタ
ー（１μ）を通して濾過する。得られた混合液を、次に
分子量の最大端（排出限界）３０,０００のメンブラン
を用い、塩化ナトリウムの０.３３モル溶液を加えて原
容量の３倍とし、分子限外濾過を行う。塩化ナトリウム
溶液の添加を中止し、液量はもとの容量の１／４まで減
少する。
【００２２】このようにして濃縮した溶液は、２５℃で
撹拌（６０g／分）しつつ、エタノール（９５％）の３
倍量を加えて沈澱させる。沈澱を遠心により採取し、上
清は棄てる。沈澱は０.１モルの塩化ナトリウム溶液１
リットルに溶解し、９５％エタノールの３倍量を用いて
沈澱操作を反復する。沈澱を集めて、最初は７５％エタ
ノール（３回)、次に無水エタノール（３回)、最後に無
水アセトン（３回)で洗浄する。このようにして得られ
た生成物（ヒアラスチン＋ヒアレクチン画分）は、２５
０,０００〜３５０,０００の平均分子量を有する。ヒア
ルロン酸の収率は、もとの新しい組織の０.６％に相当
する。
【００２３】実施例２： 実施例１に記載した方法によ
り得られた混合物からヒアラスチン画分を製造する方法 実施例１に記載した方法により得られた混合物を、発熱
物質を含有しない蒸留水に、生成物１０mgに対し水１ml
の割合いで溶解する。このようにして得られた溶液を、
分子量の最大端（排出限界）が２００,０００のメンブ
ランを用い、メンブラン上に水を加えることなく濃縮手
枝を用いて、分子限外濾過に掛ける。分子量の最大端が
２００,０００のメンブランを通して限外濾過の操作を
行うことにより、分子量が２００,０００以上の分子は
通過しないが、一方、それより小さい分子は水と共に膜
を通過しない。濾過操作中は膜の上方部分に水を加えな
いので、この部分の容量は減少すると共に、分子量が２
００,０００以上の分子の濃度は高まる。２回蒸留した
発熱物質を含有しない蒸留水の２倍量を加え、容量が１
／３となるまで溶液を再度限外濾過に掛ける。この操作
をさらに２回反復する。膜を通過した溶液に塩化ナトリ
ウムを加えて１.０モルとし、次に９５％エタノールの
４倍量を加えて沈澱させる。沈澱は７５％エタノールで
３回洗浄し、真空乾燥する。このようにして得られた生
成物（ヒアラスチン画分）は５０,０００〜１００,００
０の平均分子量を有する。ヒアルロン酸収率は、もとの
新しい組織の０.４％に相当する。
【００２４】実施例３： ヒアレクチン画分の製造方法 実施例２に記載した分子量の最大端が２００,０００の
限外濾過メンブランから容器中に集められた濃縮物を、
グルクロン酸を測定する容量分析で、ヒアルロン酸濃度
が５mg／mlの溶液となるまで水で希釈する。溶液に塩化
ナトリウムを加えて０.１モルに調製し、９５％エタノ
ールの４倍量を加えて沈澱させる。沈澱を７５％エタノ
ールで３回洗浄し、真空乾燥する。このようにして得ら
れた生成物（ヒアレクチン画分）は５００,０００〜７
３０,０００の平均分子量を有する。これは、高純度の
約２,５００〜３,５００サッカライド単位の分子鎖長と
規定される特定のヒアルロン酸画分に相当する。ヒアル
ロン酸収率は、もとの新しい組織の０.２％に相当す
る。
【００２５】
【効果】
生物学的および薬学的活性の評価 １．ヒアルロン酸の各画分の生物学的細胞可動化活性 ＨＡ画分の細胞可動化活性を評価する方法として、培養
における線維芽細胞の解離能を測定することからなる方
法を使用した。マウスＢＡＬＢ３Ｔ３細胞を、１０％ウ
シ血清、ペニシリン（２５０単位／ml）およびストレプ
トマイシン（０.２５mg／ml）を添加したダルベッコ修
飾のイーグル培地に発育させ、５％ＣＯ2、９５％空気
中で加湿しながら３７℃でインキュベートした。実験の
ために、細胞は常に６０mm直径のプラスチック製組織培
養皿に接種（６×１０5細胞／皿）された。３Ｔ３細胞
の全面（集密的細胞）単層を傾瀉し、新たにＨＡの各種
分画のそれぞれ２.０mg／mlを含有する媒質を加えた。
一定時間後に、細胞解離の状態を顕微鏡的、並びにコー
ルターカウンターで運動している細胞数を数えることの
両者により観察した。 解離測定：解離速度を測定するため、細胞をプラスック
皿に接否し、２４時間発育させた。この時点で培地を傾
瀉して除き、新たに２.０mg／mlのＨＡを含有する媒質
を加えた。それぞれ１枚づつの試験培養と対照培養から
なる２枚の皿を、２４時間毎に傾瀉し、上清中にある細
胞と付着している細胞とをコールターカウンターでカウ
ントした。表３に、先の実施例１〜３で得られた各画分
を用いて試験した成績を示した。
【００２６】
【表３】
【００２７】表３に報告した成績から、ヒアラスチン画
分は高い細胞可動化活性を有し、この画分が創傷治癒適
用に有用であることが判る。このヒアラスチンの細胞可
動化活性から、この画分の薬学的製剤を障害された組織
部位に適用すれば、新生細胞の移動と増殖を盛んにする
ことになると考えられる。これに対して、ヒアレクチン
画分は細胞可動化活性が非常に小さく、従って創傷には
有用でないと推定される。然し、ヒアレクチンは平均分
子量が高く、内部粘度（inherent viscosity）も高い
ので、眼内注射および関節内注射用として有用であり、
細胞可動化活性が欠除していることは、特に眼内注射お
よび関節内注射にヒアレクチン画分を有用にする、却っ
て重要な特性となっている。
【００２８】ヒアルロン酸各画分の走化性 １．−２ 材料および方法 ヒト血液ＰＭＮ（多核形白血球）はドリス Ｒ．等の
「ラット好中顆粒球に対するヒアルロン酸およびその可
溶性エステル類による走化性作用」（バイオマテリアル
ズ）(Biomaterials)に投稿）に記載の方法に従い使用す
る。約７５０,０００ダルトンの分子量を持つヒアルロ
ン酸の熱分解により、ヒアルロン酸の各画分を調製す
る。得られた試料の分子量を下記の表に示す。
【００２９】
【表４】
【００３０】ヒアルロン酸のイン・ビトロでの走化性活
性は、先行技術のボイデンチャンバー改良型を用いて求
められた。この方法では、標準条件（３７℃で１時間イ
ンキュベーション）で、フィルター下に通過した溶液と
フィルター上に残った細胞の間の勾配の関数により、３
μmの穴をもつミリポールR・フィルター内の細胞の通過
を測定する。
【００３１】細胞の走化性活性は「走化性指数」（Ｃ.
Ｉ.＝Ｃ／Ｒ×１００）によって測定する。このパラメ
ーターは、走化性物質の存在する場合でのフィルター
（μm）内のＰＭＮの細胞移動（Ｃ）と走化性物質がな
い場合の細胞移動（Ｒ＝無秩序移動）との比率×１００
により得られる。
【００３２】負の対照は、緩衝液ＢＳＳ／ＢＳＡであ
り、ＦＭＬＰ（N-fomyl-L-methionyl-L-leucyl-L-pheny
lalanine）１０-7Ｍ溶液であった。ヒアルロン酸の各画
分を３種の異なる濃度、１０-4、１０-2、１mg／mlで試
験した（ジグモンド、Ｓ.Ｈおよびヒルシュ Ｊ.Ｇ.、
白血球移動および走化性、ジャーナル・オブ・イクスペ
リメンタル・メディシン(Ｊ.Ｅxp.Ｍed)、(1973年)、１
７３巻、３７８−４１０頁）。
【００３３】結果 結果は、ヒアルロン酸の走化性が分子量および濃度に依
存していることを示している（下記表）。
【００３４】
【表５】 特に低分子量画分は、正の走化性（細胞移動の増大）を
示し、一方、高分子量画分は、走化性を低減する。正傾
向と負傾向の間の変移点は、分子量約３５０,０００の
画分付近にある（図２参照）。
【００３５】結論として、ヒアルロン酸が、分子量およ
び濃度に依存し、炎症領域内での炎症性細胞の回復を調
節できるということが認められ得る。すなわち、炎症性
細胞の回復が、低分子量では増強され、高分子量では低
減される。ヒアルロン酸のこの調節活性は、異なる症状
でのヒアルロン酸の各画分の臨床的使用を正当化するも
のである。実際、正の走化性は白血球による菌の貧食過
程で要求され、一方、走化性の遮断または低減は抗炎症
作用を示し、骨関節症のような炎症性疾患の処置におけ
るヒアルロン酸の使用が要求され、炎症を抑制する。２
５０,０００から３５０,０００ダルトンのヒアルロン酸
画分は非常に低い走化性活性をもつと示されているが、
画分の濃度を調節することにより、正か、または負かを
調節できることは事実である。この方法では、骨関節症
または炎症性疾患の制御の両方に対し、種々の濃度で、
この画分を用いることが可能である。
【００３６】２．ヒアルロン酸の各画分の炎症活性 この評価には、家兎における眼内投与後の侵襲細胞をカ
ウントする方法を使用する。 方法 体重２kgの、視覚に異常のないことを確かめたニュージ
ーランド系またはカリホルニア系家兎５羽を、この試験
に使用する。家兎の眼の外側の炎症性の経過は肉眼的
に、また内側は検眼鏡を用いて検査する。眼底が明瞭に
見え、正常であれば、試験を実施する。選ばれた動物
は、適宜滅菌した眼科用局所麻酔薬を数滴下して局所麻
酔を施す。眼科用アトロピン溶液の数滴を同時に滴下す
る。
【００３７】試験は無菌条件下に実施する。眼球を圧迫
して突出させ、２６ゲージ針を用い縁から約５〜６mmの
鞏膜を通してガラス体腔の中心に１００μlの溶液を注
射する。もう一つの眼を対照とする。処置後、抗生物質
溶液を２滴滴下した後、動物をそれぞれ単独ケージに収
容する。５０〜６０時間後、さらに試験を続行する。両
眼を、前述の動物を選出した方法と同様にして検査す
る。ペントバルビタールを静注して、動物を屠殺する。
まず最初に、２６ゲージ針のインスリンシリンジを用い
て、眼房水（約０.２ml）を採取する。次に、眼球を摘
出し、すべての異物を除去し、生理食塩液で洗浄し、ビ
ルバララス紙（bilbulous paper）で乾かし、切開して
内容物をペトリ皿にあけ、ガラス体の主要部分を分離
し、それを滅菌シリンジで採取する（約０.７ml）。ガ
ラス体はポリエチレン製の小試験管に採り、５０μlの
ヒアルロニダーゼ（１００uＮＦ／ml）を添加する。混
合物の粘度を低下させるため、約３時間、３７℃の温度
に保つ。
【００３８】顕微鏡下に位相差法（１２０×）により、
白血球数をビュルケル計算板でカウントする。各検体毎
に一連の計算値を記録し、平均値を算出し、結果を白血
球／mm3として表す。その結果、 １）眼になんらの障害の徴候が認められず、 ２）処理した５眼のうち、少なくとも４眼で平均白血球
数が２００／mm3）を超えず、各対照眼において平均白
血球数が５０／mm3を超えない時、試験は陽性と判断す
る。表６に、前述の実施例１〜３で得られたＨＡの各画
分をこの評価に用いて、得られた結果を示す。
【００３９】
【表６】
【００４０】表６に示した成績から、ヒアラスチンおよ
びヒアレクチンの各画分の炎症活性は対照より低く、ま
たヒアラスチンとヒアラクチンの両者を含有する画分が
示した炎症活性の増加は対照に比べて無視し得る程度に
過ぎないことが明らかにされた。従って、ヒアラスチン
画分およびヒアレクチン画分は、好ましからぬ副作用が
なく薬学的に有用である。さらにこれらの結果は、ＨＡ
製剤の炎症活性の原因が、約３０,０００以下の平均分
子量を有するＨＡ画分にあるとする本発明を裏付けるも
のである。スワンの文献（Swan Ｄ.Ａ.，1968，Ｂ.Ｂ.
Ａ.156，１７〜２９）に記載された方法に従い、雄鷄の
とさかから調製したヒアルロン酸は著しい炎症活性を示
す。
【００４１】このようにして、平均分子量が約５０,０
００〜１００,０００のヒアラスチン画分は高い細胞可
動化活性を有し、従って、不快な炎症反応を示すことな
く創傷治癒適応に有用であることが明らかになった。平
均分子量が約５００,０００〜７３０,０００であるヒア
レクチンは、その高い分子量と内部粘度の故に、眼内注
射および関節内注射に有用であることが示され、同時に
これらの薬学的適用では回避すべき不快な副作用である
細胞可動化活性または炎症反応に亢進しなかった。
【００４２】より明確に述べれば、ヒアラスチン画分は
次の特性により、創傷治癒剤として有用であることが見
出された。 １．その製剤によって、通常の治療と比べ、障害部位の
急速な清浄化、潰瘍辺縁の正常化、盛んな肉芽組織の形
成、マクロファージおよび線維芽細胞の細胞遊走の活性
化、および急速な上皮形成を伴う治癒時間の急速な短縮
を促進される。 ２．その製剤によって、重症例における再生手術に対す
る順応の増加が促進される。 ３．瘢痕化組織を最後に仕上げして美容上および機能的
に良好な結果を得ることにより、ケロイドまたは退縮製
の瘢痕形成を残さないこと。
【００４３】ヒアラスチン製剤は、褥瘡傷（床ずれ）、
栄養性潰瘍、火傷、無痛性潰瘍、外傷後潰瘍、静脈およ
び静脈炎後の静脈血腫による潰瘍、皮膚病巣、皮膚移植
および単純ヘルペスに由来する皮膚病変を含む種々の傷
の処置に有用であることが明らかにされた。これらの創
傷治療の処置に、ヒアラスチン製剤、またはそのナトリ
ウム塩はガーゼパッド、クリーム、スプレイまたは皮内
注射用注射剤のような種々の方法により投与できる。ク
リームやガーゼパッドに用いる局所適用には、ヒアラス
チンは、露出している部分から出る滲出物を吸収し、同
時にヒアルロン酸を効果的に拡散させる乳化剤、および
傷の包帯の除去を容易にさせるための水に拡散性の賦形
薬と組合せることが望ましい。
【００４４】ヒアレクチン画分は馬の治療、特に競争馬
の関節障害、および急性または慢性の外傷、感染または
副腎皮質ステロイドの反復した関節内注射に起因する疾
患の治療に有用であることが見出された。特にヒアレク
チンで治療し得る障害を例示すると、炎症症状を伴う、
または無症状の骨関節症、急性または慢性の滑膜炎、関
節軟骨の変性過程、および乾性の関節疾患である。これ
らの疾患に最も良く見受けられる徴候は一般に、疼痛、
関節の機能不全、および関節の屈伸性の減退である。本
発明のヒアレクチン画分は、通常の治療に比べ、そのよ
うな障害馬に対して関節機能の急速で、しかも持続する
改善を早め、また疼痛および跛行を軽減して治癒期間を
著しく短縮するのに効果があることが判明した。これら
の臨床的に好ましい効果は、滑液の粘弾性を回復し、関
節軟骨における組織修復過程を賦活化することにより促
進されるものと考えられる。その上、上記の好ましい効
果は、すべてヒアレクチン画分が局所的および／または
全身的に毒性作用を伴うことからさらに増強される。ヒ
アレクチンを反復して投与しても、アレルギー反応、お
よび何らの有害性または残存性の影響をも生じない。
【００４５】薬学的製剤 前記の知見から、ヒアラスチン画分およびヒアレクチン
画分は薬学的適用に良好な活性を有することが明らかに
された。次に示す製剤例は、ＨＡ画分を実際に生体（イ
ンビボ）へ投与する場合に可能な薬学的製剤を、単に例
示的に記載する目的で提供するものである。
【００４６】Ａ．創傷治癒用製剤
【表７】 製剤例１：皮内注射用注射剤。１アンプル中： ヒアラスチンナトリウム塩 ２mg 塩化ナトリウム １６mg 注射用精製水 適量を加えて２mlとする。 製剤例２：皮内注射用注射剤。１アンプル中： ヒアラスチンカリウム塩 ５mg 塩化ナトリウム ８mg 注射用精製水 適量を加えて１mlとする。 製剤例３：局所適用用スプレー。 １瓶中： ヒアラスチンナトリウム塩 ２０mg 塩化ナトリウム ８０mg 注射用精製水 適量を加えて１０mlとする。 製剤例４：局所適用用スプレー。 １瓶中： ヒアラスチンカリウム塩 ３０mg マンニット １００mg 注射用精製水 適量を加えて１０mlとする。 製剤例５：局所適用用クリーム。１チューブ中： ヒアラスチンカリウム塩 ２５mg ポリエチレングリコール− モノステアレート４００ １０００mg セチオール（オレイン酸 デシルエステル） ５００mg ラネッテＳＸ（セチルステア−リルアル コール＋ラウリル硫酸塩９：１） １５０mg グリセリン ２００mg ソルビット １５０ｍｇ デヒドロ酢酸ナトリウム １０ｍｇ ｐ−オキシメチルベンゾエート ７.５mg ｐ−オキシプロピルベンゾエート ５mg 再蒸留水 適量を加えて１０gとする。 製剤例６：局所適用用クリーム。１チューブ中： ヒアラスチンナトリウム塩 ３０mg パラフィンゼリー ３mg ポリエチレングリコール− モノステアレート４００ １０００mg セチオール（オレフィン酸 デシルエステル） ５００mg ラネッテＳＸ（セチルステアリル−アル コール＋ラウリル硫酸塩９：１） １５０mg グリセリン ２００mg ソルビット １５０mg デヒドロ酢酸ナトリウム １０mg ｐ−オキシメチルベンゾエート ７.５mg Ｐ−オキシプロピルベンゾエート ５mg 再蒸留水 適量を加えて１０gとする。 製剤例７：医薬用ガーゼパット(局所適用)。 １パット中（１０×１０cm）： ヒアラスチンナトリウム塩 ３mg グリセリン １ｇ ポリエチレングリコール ２ｇ 再蒸留水 適量を加えて３gとする。 製剤例８：医療用ガーゼパット(局所適用)。 １パット中（１５×１５cm）： ヒアラスチンカリウム塩 ６mg パラフィンゼリー ０.５ｍｇ グリセリン １ｇ ポリエチレングリコール ２ｇ 再蒸留水 適量を加えて３ｇとする。 製剤例９：創傷治癒用乾燥粉末、乾燥粉末１g中： ヒアラスチンナトリウム塩 １０mg マンニット ０.７５mg グリシン ０.２４mg Ｂ．眼内適用製剤 製剤例１０：１mlバイアル。１バイアル中： ヒアレクチンナトリウム塩 １０mg 塩化ナトリウム ８mg 一塩基リン酸ナトリウム・２Ｈ2Ｏ ０.２５mg 二塩基リン酸ナトリウム・12Ｈ2Ｏ ３mg 注射用精製水 適量を加えて１mlとする。 製剤例１１：５mlバイアル。 １バイアル中： ヒアレクチンカリウム塩 ６０mg マンニット ５０mg 一塩基リン酸ナトリウム・２Ｈ2Ｏ １.２５mg 二塩基リン酸ナトリウム・12Ｈ2Ｏ １５mg 注射用精製水 適量を加えて５mlとする。 製剤例１２：シリンジ製剤。１シリンジ中： ヒアレクチンナトリウム塩 ４０mg 塩化ナトリウム １６mg 一塩基リン酸ナトリウム・２Ｈ2Ｏ ０.８mg 二塩基リン酸ナトリウム・12Ｈ2Ｏ ８.１６mg 注射用精製水 適量を加えて２mlとする。 Ｃ．関節内適用製剤 製剤例１３：２mlバイアル。１バイアル中： ヒアレクチンナトリウム ４０ｍｇ 塩化ナトリウム １６ｍｇ 注射用精製水 適量を加えて２mlとする。 製剤例１４：４mlバイアル。１バイアル中： ヒアレクチンカリウム塩 ６０mg マンニット ３５mg グリシン １０mg 注射用精製水 適量を加えて４mlとする。 製剤例１５：シリンジ製剤。１シリンジ中： ヒアレクチンナトリウム塩 ２５mg 塩化ナトリウム １２mg マンニット １０mg 一塩基リン酸ナトリウム・２Ｈ2Ｏ ０.５mg 二塩基リン酸ナトリウム・12Ｈ2Ｏ ６mg 注射用精製水 適量を加えて２mlとする。
【００４７】上記の製剤は指示的目的を以て記載された
ものであり、本発明者によって発見されたヒアラスチン
画分およびヒアレクチン画分、またはそのカリウム塩ま
たはナトリウム塩を、薬学的に許容し得るその他の基
剤、希釈剤、または賦形薬と組合わせることにより、ま
た特定の使用に応じて種々の投与量製剤として、その他
の薬学的製剤を調製できることも、当然類推できる。
【００４８】創傷治癒に適用するために、ヒアラスチン
画分の製剤は、前述したクリーム、スプレー、ガーゼパ
ット、乾燥粉末、または皮内注射のような投与形式のい
ずれか一つの形で、皮膚の損傷部位に適用される。
【００４９】関節内に適用するためには、ヒアレクチン
製剤は、前述したバイアル製剤またはシリンジに予製し
た製剤のいずれかから、一般に関節に対して１投与量２
mlの割合で投与される。
【００５０】さらにヒアクロン酸は、種々の分子の担体
として使用でき、効果的であることが研究され、特に角
膜表皮に対する耐容性と適合性（即ち、感作現象を起こ
さない）が完全に保証され、眼科用薬基剤として使用さ
れる。ヒアルロン酸は眼科用基剤として特に興味深いも
のと考えられる。前述のように、ＨＡは種々の結合組織
および生物学的液体（例えば滑液、および特にガラス
体）に存在するグリコサミノグリカンであって、その化
学的および物理学的性質、特にその著しい弾粘性によ
り、組織における基本的に重要な構造上の生物学的な役
割を果たしている。
【００５１】このような理由から、種々の分子量のＨＡ
画分、特にヒアラスチン画分とヒアレクチン画分、およ
びそれらの混合画分を、点眼剤、ゲル、クリーム、挿入
剤、または乾燥粉末のような種々の製剤剤型に調製する
応用について研究を行った。特に、各種の眼科用薬の基
剤として、この生物的的ポリマーの種々の画分を積極的
に利用すべく広汎な知識を得るため検討した。
【００５２】以下に報告する実験は、ヒアルロン酸を賦
形薬として含有する製剤が、それらに調合されている主
薬の生物学的利用能（バイオアベイラビリティー）を高
めるかどうか、また主薬と組合わせることによって相乗
効果を生じるかどうかを、特に眼科領域における活性、
若しくは有用性を有する薬物について検討することを目
的としている。
【００５３】ＨＡの基剤として重要なこれらの活性は、
家兎の眼を用い、種類と薬効の異なる４種の眼科用薬、
特にピロカルピン、トリアムシノロン、表皮成長促進因
子（ＥＧＦ）およびストレプトマイシンおよびゲンタマ
イシンのような抗生物質を用いて検討した。これらの薬
物はすべて縮瞳作用、抗炎症作用、治癒作用および抗微
生物作用を有することが知られている。なかでも、ヒア
ルロン酸を基剤とする抗生物質ストレプトマイシンの活
性評価は、この薬剤が眼科領域の感染症に最も広範囲に
使用されている抗生物質の一つである理由から非常に重
要である。
【００５４】研究した実験モデルおよび行った実験を示
す。 １）ヒアルロン酸を基剤とした硝酸ピロカルピンの家兎
の眼における縮瞳活性。 ２）デキストランにより起こした家兎の眼の実験的炎症
に対する、ヒアルロン酸を基剤としたトリアムシノロン
の抗炎症活性。 ３）家兎の角膜表皮の実験的損傷に対するヒアルロン酸
を基剤とした表皮成長促進因子（ＥＧＦ）の治癒活性。 ４）ヒアルロン酸を基剤としたストレプトマイシンの、
寒天培地中におけるバチルス・ズブチリス（Bacillus
subtilis）6633に対する抗菌活性。
【００５５】Ｉ．ヒアルロン酸を基剤とした硝酸ピロカ
ルピンの縮瞳活性 材料 種々の硝酸ピロカルピン製剤の賦形薬として、次の材料
を使用した。ヒアルロン酸ナトリウム塩、ヒアラスチン
画分（分子量約100,000）、濃度１０mg／mlおよび２０m
g／ml；ヒアルロン酸ナトリウム塩、ヒアレクチン画分
（分子量約500,000〜730,000）、濃度１０mg／mlおよび
２０mg／ml；眼科用賦形薬の対照として、５％ポリビニ
ルアルコール。種々の、硝酸ピロカルピンの２％製剤
（点眼薬またはゲル）を、２種類の異なるＨＡナトリウ
ム塩の１０mg／mlおよび２０mg／ml濃度を基剤として調
製した。
【００５６】次の溶液を調製した。 製剤１−硝酸ピロカルピン(PiNO3)（２％）生理食塩液
溶液（対照）。 製剤２−PiNO3（２％）の５％ポリビニルアルコール溶
液（対照）。 製剤３−PiNO3（２％）のヒアラスチン画分ナトリウム
塩（１０mg／ml）溶液。 製剤４−PiNO3（２％）のヒアラスチン画分ナトリウム
塩（２０mg／ml）溶液。 製剤５−PiNO3（２％）のヒアレクチン画分ナトリウム
塩（１０mg／ml）溶液。 製剤６−PiNO3（２％）のヒアレクチン画分ナトリウム
塩（２０mg／ml）溶液。
【００５７】方法 白色ニュージーランド系家兎（２〜２.５kg）を使用し
た。試験する製剤をマイクロシリンジ（１０リットル）
で１眼に滴下し、他の１眼を対照とした。瞳孔の直径
を、適宜時間をおき全例について測定した。各溶液はそ
れぞれ最低８羽の家兎で試験した。各眼の処置は３回を
超えることなく、各処置毎の間に最低１週間の休薬期間
を置いて観察した。
【００５８】測定パラメーター 瞳孔の直径は、時間による縮瞳活性曲線を画くため、種
々の間隔を置いて測定した。次の活性パラメーターは、
縮瞳／時間グラフに基づいて計算した： Ｉmax＝処置眼と対照眼の瞳孔直径の最大差。 ピーク時間＝Ｉmaxに達するまでの時間。 持続時間＝基準条件に回復するまでに要する時間。 プラトー＝絶対縮瞳活性期。 ＡＵＣ＝縮瞳／時間曲線下の面積。
【００５９】結果 試験結果を表８に示す。試験したすべての溶液の、瞳孔
活性／時間曲線から決定された種々のパラメーターの成
績から、２％硝酸ピロカルピン溶液にヒアルロン酸を加
えると、薬物の縮瞳活性の増加が上昇することが判る。
事実、２％硝酸ピロカルピン水溶液（製剤１）に比べ
て、薬物のバイオアベイラビリティーは２.７倍にまで
達する。また、ヒアルロン酸のヒアレクチン画分を基剤
として使用した場合、１０mg／mlおよび２０mg／ml（製
剤５、６）の両者とも、ポリビニルアルコールを基剤と
した硝酸ピロカルピン溶液（製剤２）と比較して統計的
に有意な増加が見られることは注目すべきである。ヒア
ルロン酸を硝酸ピロカルピンの基剤として使用すると、
ピロカルピンの縮瞳活性が一層長く持続することから、
ヒアルロン酸を基剤として利用することは特に興味深
い。即ち、瞳孔の直径が基準条件に回復するまでに要す
る時間は、ピロカルピンの生理食塩液単独溶液（製剤
１）で１１０分であるのに比べ、ヒアルロン酸を含有す
る製剤（製剤６）では１９０分まで延長される。
【００６０】
【表８】
【００６１】II．ヒアルロン酸を基剤としたトリアムシ
ノロンの抗炎症活性 材料 次の検体を使用した：ヒアルロン酸ナトリウム塩−ヒア
レクチン画分（分子量500,000〜730,000）の生理食塩液
溶液（１０mg／ml）。トリアムシノロンの１０％溶液
（生理食塩液）。
【００６２】方法 ニュージーランド系雄性家兎（平均体重１.６kg）で実
験を行った。５日間の予備飼育期間後、デキストラン
（１０％、０.１ml）を眼内注射し、家兎の眼内炎症を
起こさせた。両眼とも４％ノベシーナ（商標、Novesin
a）で局所麻酔し、前眼房の角膜縁から２mmの位置にシ
リンジの針を４mmまで挿入し、投与した。試験は１０羽
で行った。
【００６３】処置 各動物とも、右眼および左眼に次の液を１日３回、１回
３滴づつ滴下し、全例６日間処置した。 左眼（ＬＥ）：１０％トリアムシノロン溶液（生理食塩
液）。 右眼（ＲＥ）：ヒアルロン酸ナトリウム塩、ヒアレクチ
ン溶液（１０mg／ml）＋トリアムシノロン（１０％）。
【００６４】評価方法 デキストランにより生じた炎症反応に対する抗炎症効果
を、デキストラン投与前、１、３、２４、４８時間、３
日、４日、５日および６日目にスリット光源を用いて眼
を観察して評価した。各観察時、眼の検査は次の所見に
よって評価した：角膜および結膜に見られる充血、浮腫
の有無、特に通常、炎症性薬剤の眼内注射後の炎症経過
に敏感な虹彩の所見。濃い、または淡い混濁（片雲）が
見られるチンダル効果は、前眼房に微粒子体が存在する
（炎症）ことを示している。観察結果は、効果の段階的
評価法により主観的に採点（０〜１）して表した。
【００６５】結果 表９に示した結果から、トリアムシノロンの投与は虹彩
に対し抗炎症効果を示し、前眼房の混濁（チンダル効
果）が消失することが判る。炎症の経過は１〜３時間目
から３〜４日間までの間が著しく、その後、徐々に軽快
して、６日目までには殆ど常態に回復し、眼は完全に清
澄となる。これに対して、ヒアルロン酸ナトリウム塩、
ヒアレクチン画分、をトリアムシノロンと一緒に投与す
ると、上述のトリアムシノロンの単独投与に比較して眼
内炎症の期間が短縮される。即ち、虹彩の炎症経過と前
眼房の混濁は２４時間までに減少傾向が見られ、４８時
間目にはかなり軽快し、４日目以後、炎症反応は完全に
消失する。結膜および角膜は、デキストランの眼内注射
後も殆ど注意すべき反応は観察されなかった。
【００６６】以上のように、トリアムシノロンをヒアル
ロン酸画分と共に投与すると、家兎の眼の急速な回復が
見られ薬物の活性が高められる結果を得た。
【００６７】
【表９】
【００６８】III．ヒアルロン酸を基剤とするＥＧＦの
創傷治癒活性材料 材料 次の材料を使用した。製剤Ａ−ＥＧＦ（表皮成長促進因
子)、生理食塩液に溶解（０.５mg／５ml)。製剤Ｂ−ヒ
アルロン酸ナトリウム塩、ヒアラスチン（分子量、約10
0,000）、生理食塩液に溶解（１０mg／ml）。
【００６９】方法 雄性白色ニュージーランド系家兎（平均体重１.８kg）
で実験を行った。約５日間の予備飼育後、ノベシーナ
（４％）による好適な局所麻酔条件下に、角膜表皮の損
傷を実施した。損傷は１眼の光学帯に、鋭い縁を有する
凹型ガラスシリンダー（径３mm）で円形に傷をつけた。
【００７０】処置 動物は、各群５羽づつからなる群に分け、結膜に次の液
を滴下して、薬理学的な処置を施した。
【００７１】
【表１０】 処置は右眼（ＲＥ）に行い、結膜に８時間毎に２滴づつ
滴下し、総計３回投与した。
【００７２】評価方法 角膜表皮の回復は、損傷後、０.８時間後、１６時間
後、２４時間後、３２時間後、４０時間後および４８時
間後に、眼の観察およびスリット光源による写真記録に
より評価した。
【００７３】結果 表１１に示したように、眼科的検査の成績から、対照
（第１群）は損傷後４８時間で完全治癒に到達した（５
／５羽）。ＥＧＦ処置動物（第２群）では、損傷後２４
時間程度まで治癒経過が早まり明らかにやや有効であっ
た（４／５羽）。ヒアルロン酸ナトリウム塩、ヒアレク
チン画分＋ＥＧＦからなる製剤Ｃで処置した動物（第３
群）では、治癒経過はすべての動物（５／５羽）で、損
傷後１６時間程度で完全になった。これらの結果は、角
膜損傷の治療効果をより速やかに促進しており、ヒアル
ロン酸のヒアラスチン画分がＥＧＦの基剤として使用す
ることが治癒過程を速めることを示している。
【００７４】
【表１１】
【００７５】IV．ヒアルロン酸を基剤とするゲンタマイ
シンの抗微生物活性 材料 次の材料を使用した。ゲンタマイシンを生理食塩液に溶
解（５０mg／ml）。ヒアルロン酸ナトリウム塩、ヒアレ
クチン画分（２mg／ml）。
【００７６】方法 １１羽の家兎の両眼に、シュードモナス・エルビノーサ
（Pseudomonas aeruginosa）の一定量浮遊液（０.１m
l）を注入し、敗血症性炎症を起こさせた。敗血症性炎
症を示したそれらの家兎の右眼に、ゲンタマイシンとヒ
アルロン酸、ヒアレクチン画分の組合わせを滴下投与
し、左眼にはゲンタマイシンの生理食塩液の緩衝溶液を
投与した。処置（６時間毎に３滴）は感染菌注入直後か
ら開始し、感染が消失するまで続けた。家兎の眼は毎
日、スリット光源下に観察した。
【００７７】結果 ゲンタマイシンのヒアルロン酸との併用による治療は、
抗生物質の単独投与に比べ、敗血症感染のより速やかな
消失を来たした。この結論は、表１２に示した結果から
明らかである。
【００７８】
【表１２】
【００７９】本発明に示したＨＡ画分を基剤として使用
し得る眼科用薬の例を以下に追加して示す。但し、本発
明はこれらに限定されるものではない。 抗生物質： クロラムフェニコール，ネオマイシン，オ
ーレオマイシン，ミキシンおよびポリミキシン，バシト
ラシン，マイセチン類 ホルモン： ナンドロロンおよび硫酸ナンドロロン 麻酔剤(局所)： ヘノキシネート（henoxinate）および
その塩酸塩 抗ウイルス剤： ヨードデオキシウリジン，ヨードデオ
キシシチジン 抗炎症剤： デキサメサゾンおよびそのリン酸塩および
昇圧剤および血管 収縮剤： シネフリンおよびネオシネフリン
【００８０】結論 以上の実験結果から、ヒアルロン酸ナトリウム塩溶液
（ヒアラスチンおよびヒアレクチンの両画分）は眼科用
薬の基剤として使用でき、異なった生物学的作用を有す
る種々の型の医薬品に対して効果的であると結論でき
る。例えば、縮瞳作用、抗炎症作用、治癒作用および抗
微生物作用がそれぞれ報告されている。硝酸ピロカルピ
ンのような抗線内症薬、トリアムシノロンのような抗ア
レルギーおよび抗炎症薬、ＥＧＦのような眼の組織治癒
を促進させる組織治癒および細胞増殖促進薬、ストレプ
トマイシンおよびゲンタマイシンのような抗生物質から
なる医薬品は、すべてＨＡを基剤として使用し、効果的
に投与できる。
【００８１】種々の分子量のヒアルロン酸画分を基剤と
する眼科用薬製剤は宿主により完全に忍容され、従って
感作現象を高めることなく角膜表皮によく適合すること
が証明された。
【００８２】また、生物学的生成物ヒアルロン酸が、基
剤として使用することにより主薬のインビボのバイオア
ベイラビリティーを高め、それらの薬物の薬理学的活性
を強めることができる有用な基剤であることは、次に示
す実験結果からよく観察できる。
【００８３】硝酸ピロカルピンの作用時間を延長し、縮
瞳活性を増強し、デキストランにより生じた眼内炎症に
対するトリアムシノロンの抗炎症活性を増強し、しかも
トリアムシノロン単独と比較して、より短時間に炎症経
過を軽減し、角膜の表在性損傷に対する表皮成長促進因
子（ＥＧＦ）の防御活性を、明らかな相乗効果によって
増強し、ＥＧＦ単独投与により回復時間に比べ治癒時間
を短縮し、またゲンタマイシンのような抗生物質のイン
ビボの生物学的活性を増強する。この生物学的ポリマ
ー、ヒアルロン酸を、そのような性質と作用の異なる薬
物の基剤として使用することにより、他の多くの眼科用
薬にその活性を導入することができる。
【００８４】下に示すのは、ヒアルロン酸の二つの画
分、ヒアラスチンとヒアレクチンだけを賦形薬として使
用した粉末、点眼剤、ゲル、クリームまたは挿入剤の剤
型をとり得る眼科用薬の製剤例である。
【００８５】
【表１３】 製剤例１：ヒアルロン酸ナトリウム塩ヒアレクチン画分 １０mg リン酸緩衝液pＨ７,６Ｍを含有する生理食塩液 １０ml を含有する“人工涙液”に使用し得る点眼薬。 製剤例２：ヒアルロン酸ナトリウム塩ヒアレクチン画分 ２０mg リン酸緩衝液pＨ７,６Ｍを含有する生理食塩液 １０ml を含有する“人工涙液”に使用し得る点眼薬。 製剤例３：１００g中に； ヒアルロン酸ナトリウム塩ヒアラスチン画分 ５５g ヒアルロン酸ナトリウム塩ヒアレクチン画分 ３０g ＥＧＦ ０.５g 再蒸留水 ２３.５g を有するゲル剤。 製剤例４：ヒアルロン酸ナトリウム塩ヒアラスチン画分 １００mg 硝酸ピロカルピン ２mg を含有する硝酸ピロカルピンの１００mg挿入剤。 製剤例５：粉末１００g中に； ヒアルロン酸ナトリウム塩ヒアラスチン画分 ７０g ヒアルロン酸ナトリウム塩ヒアレクチン画分 ２８.５g ストレプトマイシン １.５ｇ を含有する局所用ストレプトマイシン含有粉末。
【００８６】上記の製剤は代表例を示すべく記載した
が、その他の作用薬と、特殊用途に対する種々の投与剤
型についても、ヒアルロン酸画分、特にヒアレクチンま
たはヒアラスチン画分、またはヒアレクチン／ヒアラス
チンの混合画分、またはそれらのカリウム塩またはナト
リウム塩を組合わせることによっても、薬学的製剤を当
然調製できる。
【００８７】従って、ヒアルロン酸、特に実質的に純粋
なヒアレクチンおよびヒアラスチン画分は、眼科的に有
用性または活性を有する種々の薬物と組合わせて使用す
る効果的な基剤または賦形薬であることが示された。Ｈ
Ａ画分を医薬品基剤として含有する薬学的組成物は、Ｈ
Ａ画分が眼に対する高度の耐容性と、角膜表皮に対する
高度の適合性を有することから特に有用である。さら
に、ＨＡ画分の使用により、眼科用薬のインビボの生物
学的活性を実質的に向上する手段が提供される。特に、
ヒアレクチンおよびヒアラスチンのＨＡ画分を使用する
ことは、これらの画分を眼に投与しても不都合な炎症性
の副作用を示さないことから、一層有用で、しかも重要
である。
【図面の簡単な説明】
【図１】 図１は、本発明者等の固定したヒアルロン酸
画分の種別を示すグラフである。
【図２】 図２は、ヒアルロン酸各画分の走化活性を示
す棒グラフである。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ａ６１Ｋ 47/36 Ａ６１Ｋ 47/36 Ｎ // Ｃ１２Ｓ 3/02 8931−4Ｂ Ｃ１２Ｓ 3/02 (72)発明者 シルヴァナ・ロレンツィ イタリア国35100パドヴァ、ヴィア・エウ ガネア108番

Claims (18)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 ヒアルロン酸を含有する、入手可能な出
    発物質からヒアルロン酸の混合物を抽出し、得られた混
    合物を分子ろ過にかけ平均分子量約30,000〜約730,000
    を有するヒアルロン酸画分を得ることからなり、上記画
    分は、30,000以下の分子量を有するヒアルロン酸を実質
    的に含まないものである、実質的に純粋で、非炎症性の
    ヒアルロン酸画分を製造する方法。
  2. 【請求項２】 ヒアルロン酸の上記混合物を、分子量排
    出限界約30,000を有する膜を用いて分子ろ過にかけ、3
    0,000以上の大きさの分子量を有する分子を分離し、こ
    れによって上記膜上に、30,000以下の分子量を有するヒ
    アルロン酸を実質的に含まない最初のヒアルロン酸画分
    が留どまるものである、請求項１記載の方法。
  3. 【請求項３】 上記最初のヒアルロン酸画分が平均分子
    量約250,000〜約350,000を有するものである、請求項２
    記載の方法。
  4. 【請求項４】 上記最初のヒアルロン酸画分を、分子量
    排除限界約200,000を有する膜を用いて、別の分子限外
    ろ過にかけ、200,000以上の大きさの分子量を有する分
    子を分離し、限外ろ過の対象となる混合物の量が初期量
    の１０％に減少するまで限外ろ過を続け、膜を通過する
    混合物を採取して、その結果平均分子量約50,000〜約10
    0,000を有する２番目のヒアルロン酸画分生成物を得る
    ものである、請求項３記載の方法。
  5. 【請求項５】 請求項４の分子量排除限界約200,000を
    有する膜を用いた限外ろ過後、膜上に残留した混合物を
    採取し、その結果、平均分子量約500,000〜約730,000を
    有する３番目のヒアルロン酸画分生成物を得ることから
    なる、請求項４記載の方法。
  6. 【請求項６】 ヒアルロン酸の上記混合物が、出発組織
    材料を溶媒抽出させることによって得られる、請求項１
    〜５の何れか１項記載の方法。
  7. 【請求項７】 溶媒抽出から得られたヒアルロン酸の混
    合物をついで酵素分解させる、請求項６記載の方法。
  8. 【請求項８】 酵素分解がパパインを用いて行われるも
    のである、請求項７記載の方法。
  9. 【請求項９】 平均分子量約30,000〜約730,000を有
    し、30,000以下の分子量を有するヒアルロン酸を実質的
    に含まない、実質的に純粋で、非炎症性のヒアルロン酸
    画分。
  10. 【請求項１０】 平均分子量約250,000〜約350,000を有
    する、請求項９記載の実質的に純粋で、非炎症性のヒア
    ルロン酸画分。
  11. 【請求項１１】 平均分子量約50,000〜約100,000を有
    する、請求項９記載の実質的に純粋で、非炎症性のヒア
    ルロン酸画分。
  12. 【請求項１２】 請求項９〜１２の何れか１項記載のヒ
    アルロン酸画分のナトリウム塩またはカリウム塩。
  13. 【請求項１３】 平均分子量約30,000〜約730,000を有
    し、30,000以下の分子量を有するヒアルロン酸またはそ
    の塩を実質的に含まない、実質的に純粋で、非炎症性の
    ヒアルロン酸画分から成る、組織傷の回復促進剤。
  14. 【請求項１４】 上記平均分子量が約250,000〜約350,0
    00である、請求項１３記載の剤。
  15. 【請求項１５】 上記平均分子量が約50,000〜約100,00
    0である、請求項１３記載の剤。
  16. 【請求項１６】 平均分子量約30,000〜約730,000を有
    し、30,000以下の分子量を有するヒアルロン酸を実質的
    に含まない、実質的に純粋で、非炎症性のヒアルロン酸
    画分から成る、眼疾患活性を有する薬剤の眼投与用の医
    薬担体。
  17. 【請求項１７】 上記薬剤が硝酸ピロカルピン、トリア
    ムシノロン、表皮成長因子、ストレプトマイシンおよび
    ゲンタマイシンから成る群から選択されたものである、
    請求項１６記載の担体。
  18. 【請求項１８】 上記薬剤が抗生物質、抗緑内障剤、抗
    アレルギー剤、抗炎症剤、または目の治療促進剤であ
    る、請求項１６記載の担体。
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