JP7457390B2 - 点眼組成物 - Google Patents
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Description
ドライアイ疾患（ＤＥＤ）は、不快感、視覚障害、及び涙液層不安定性の症状を引き起こし、眼表面に損傷を与える可能性がある涙液及び眼表面の多因子性疾患である。ドライアイはヒト及びイヌの両方によく見られる。ヒトでのドライアイ疾患の有病率は７．４％～３３．７％の範囲であるが、イヌでの発生率は２０％までに達し得る。さらに、レンズ装用者の５０％もがコンタクトレンズの不快感（ＣＬＤ）に見舞われ、これはレンズウェアが脱落する主な理由である。
人工涙液及びコンタクトレンズの再湿潤化／潤滑化用の滴剤は、ドライアイ及び／又はＣＬＤの治療に広く使用されている。しかしながら、涙流及び瞬目動作による迅速な角膜前クリアランスのため、しばしば頻繁な点眼が必要とされる。乾燥が深刻である場合に、患者は１日当たり７回以上にわたり人工涙液を適用する必要がある。軟膏及びゲルを含む他の形態のビヒクルは、より長い角膜前保持時間を有するものの、刺激感及び不所望な美容的外観により日常生活でのそれらの使用は大幅に制限される。
したがって、点眼組成物であるのに望ましい特性を有するヒドロゲルを作製することが求められている。
本開示は、少なくとも３ｄＬ／ｇの固有粘度［η］（例えば、ウベローデ粘度計によって測定される）を組成物中で有する１つ以上のヒドロゲル形成ポリマーを含む点眼組成物であって、組成物中のヒドロゲル形成ポリマーの濃度ＣＴが多くとも約５ｍｇ／ｍｌである、点眼組成物を提供する。点眼組成物は、以下の特性のうちの少なくとも１つを示し得る：１）より長い角膜前滞留時間、２）より長い薬物作用時間（例えば、１時間以上）での点眼組成物からの薬物のより良好な制御放出、３）より良好な生体適合性、４）より長い貯蔵時間、５）良好な臨床試験結果、６）所要絞り出し力に関して負荷を与えないこと。本開示による点眼組成物のヒドロゲルは、比較的低いＧ’（例えば、約１０．０Ｐａ未満のＧ’）、Ｇ’’と比較して高いＧ’（例えば、Ｇ’’／Ｇ’＜１）を有する一方で、比較的大きい降伏歪み（例えば、１０％以上）を有することができる。したがって、本開示に従って形成されるヒドロゲルは、表面上での展延に適している。加えて、点眼組成物のヒドロゲルは、高剪断速度で低粘度（例えば、約０．２Ｐａ・ｓ以下の複素粘度）を有することができ、僅かな力で表面全体に容易に展延し得ることが示される。加えて、点眼組成物のヒドロゲルの粘度は、低い剪断速度に向かって指数関数的に増大し得ることから、静止状態では安定し得ることが示される。さらに、点眼組成物のヒドロゲルは、溶解することなく水中で自由に動くことが可能であり得て、長期間（例えば、２４時間以上）水中に浸された後であっても、依然としてこの特性を示すことができた。
一態様では、本開示は、組成物中で少なくとも３ｄＬ／ｇ（例えば、少なくとも５ｄＬ／ｇ、少なくとも８ｄＬ／ｇ、少なくとも１０ｄＬ／ｇ、少なくとも１２ｄＬ／ｇ、少なくとも１５ｄＬ／ｇ、少なくとも１６ｄＬ／ｇ、少なくとも１７ｄＬ／ｇ、少なくとも１８ｄＬ／ｇ、少なくとも１９ｄＬ／ｇ、少なくとも２０ｄＬ／ｇ、少なくとも２５ｄＬ／ｇ、又はそれ以上）の固有粘度［η］を有する１つ以上のヒドロゲル形成ポリマーを含む点眼組成物であって、組成物中のかかるヒドロゲル形成ポリマーの濃度ＣＴが多くとも約５ｍｇ／ｍｌ（例えば、多くとも約４ｍｇ／ｍｌ、多くとも約３ｍｇ／ｍｌ、多くとも約２ｍｇ／ｍｌ、多くとも約１．５ｍｇ／ｍｌ、多くとも約１ｍｇ／ｍｌ、多くとも約０．９ｍｇ／ｍｌ、多くとも約０．８ｍｇ／ｍｌ、多くとも約０．７ｍｇ／ｍｌ、多くとも約０．６ｍｇ／ｍｌ、多くとも約０．５ｍｇ／ｍｌ、多くとも約０．４ｍｇ／ｍｌ、多くとも約０．３ｍｇ／ｍｌ、多くとも約０．２ｍｇ／ｍｌ、多くとも約０．１ｍｇ／ｍｌ、又はそれ以下）である、点眼組成物を提供する。固有粘度［η］は、ウベローデ粘度計によって測定されるようなものであり得る。
幾つかの実施の形態では、前記ヒドロゲル形成ポリマーの少なくとも一部が、前記組成物において形成されたヒドロゲル中に含まれる。ヒドロゲルは、以下のうち少なくとも１つを有し得る：
１）動的振動剪断試験において測定される、約１０．０Ｐａ以下（例えば、約８．０Ｐａ以下、約７．０Ｐａ以下、約６．０Ｐａ以下、約５．０Ｐａ以下、約４．０Ｐａ以下、約３．０Ｐａ以下、約２．０Ｐａ以下、約１．０Ｐａ以下、約０．８Ｐａ以下、約０．７Ｐａ以下、約０．６Ｐａ以下、約０．５Ｐａ以下、又はそれ以下）の貯蔵弾性率Ｇ’、
２）動的振動剪断試験において測定される、約１０．０Ｐａ以下（例えば、約８．０Ｐａ以下、約７．０Ｐａ以下、約６．０Ｐａ以下、約５．０Ｐａ以下、約４．０Ｐａ以下、約３．０Ｐａ以下、約２．０Ｐａ以下、約１．０Ｐａ以下、約０．８Ｐａ以下、約０．７Ｐａ以下、約０．６Ｐａ以下、約０．５Ｐａ以下、又はそれ以下）の損失弾性率Ｇ’’、
３）約１００ｒａｄ／ｓ未満（例えば、約９０ｒａｄ／ｓ未満、約８０ｒａｄ／ｓ未満、約７０ｒａｄ／ｓ未満、約５０ｒａｄ／ｓ未満、約４０ｒａｄ／ｓ未満、約３０ｒａｄ／ｓ未満、約２０ｒａｄ／ｓ未満、約１０ｒａｄ／ｓ未満、又はそれ以下）の振動数で動的振動剪断試験において測定される、約０．２Ｐａ・ｓ以下（例えば、約０．１Ｐａ・ｓ以下、約０．０８Ｐａ・ｓ以下、約０．０７Ｐａ・ｓ以下、約０．０６Ｐａ・ｓ以下、約０．０５Ｐａ・ｓ以下又は約０．０４Ｐａ・ｓ以下）の複素粘度、
４）ヒドロゲルをＴｅａｒｓ Ｎａｔｕｒａｌｅ Ｆｒｅｅ ０．６ｍｌの成形同時充填（ＢＦＳ）使い捨てボトルから絞り出す場合の、約４Ｎ～約４５Ｎ（例えば、約４Ｎ～約４５Ｎ、約５Ｎ～約４５Ｎ、約６Ｎ～約４５Ｎ、約７Ｎ～約４５Ｎ、約８Ｎ～約４５Ｎ、約９Ｎ～約４５Ｎ、約１０Ｎ～約４５Ｎ、約１２Ｎ～約４５Ｎ、約１５Ｎ～約４５Ｎ、約２０Ｎ～約４５Ｎ、約２５Ｎ～約４５Ｎ、約３０Ｎ～約４５Ｎ、約３５Ｎ～約４５Ｎ又は約４０Ｎ～約４５Ｎ）の押出力、及び、
５）動的振動歪み掃引試験（dynamic oscillatory strain sweep test）において測定される、少なくとも約１０％（例えば、少なくとも約１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％、０．５％、０．２％又は０．１％）の降伏歪み。
１）動的振動剪断試験において測定される、約１０．０Ｐａ以下（例えば、約８．０Ｐａ以下、約７．０Ｐａ以下、約６．０Ｐａ以下、約５．０Ｐａ以下、約４．０Ｐａ以下、約３．０Ｐａ以下、約２．０Ｐａ以下、約１．０Ｐａ以下、約０．８Ｐａ以下、約０．７Ｐａ以下、約０．６Ｐａ以下、約０．５Ｐａ以下、又はそれ以下）の貯蔵弾性率Ｇ’、
２）動的振動剪断試験において測定される、約１０．０Ｐａ以下（例えば、約８．０Ｐａ以下、約７．０Ｐａ以下、約６．０Ｐａ以下、約５．０Ｐａ以下、約４．０Ｐａ以下、約３．０Ｐａ以下、約２．０Ｐａ以下、約１．０Ｐａ以下、約０．８Ｐａ以下、約０．７Ｐａ以下、約０．６Ｐａ以下、約０．５Ｐａ以下、又はそれ以下）の損失弾性率Ｇ’’、
３）約１００ｒａｄ／ｓ未満（例えば、約９０ｒａｄ／ｓ未満、約８０ｒａｄ／ｓ未満、約７０ｒａｄ／ｓ未満、約５０ｒａｄ／ｓ未満、約４０ｒａｄ／ｓ未満、約３０ｒａｄ／ｓ未満、約２０ｒａｄ／ｓ未満、約１０ｒａｄ／ｓ未満、又はそれ以下）の振動数で動的振動剪断試験において測定される、約０．２Ｐａ・ｓ以下（例えば、約０．１Ｐａ・ｓ以下、約０．０８Ｐａ・ｓ以下、約０．０７Ｐａ・ｓ以下、約０．０６Ｐａ・ｓ以下、約０．０５Ｐａ・ｓ以下又は約０．０４Ｐａ・ｓ以下）の複素粘度、
４）ヒドロゲルをＴｅａｒｓ Ｎａｔｕｒａｌｅ Ｆｒｅｅ ０．６ｍｌの成形同時充填（ＢＦＳ）使い捨てボトルから絞り出す場合の、約４Ｎ～約４５Ｎ（例えば、約４Ｎ～約４５Ｎ、約５Ｎ～約４５Ｎ、約６Ｎ～約４５Ｎ、約７Ｎ～約４５Ｎ、約８Ｎ～約４５Ｎ、約９Ｎ～約４５Ｎ、約１０Ｎ～約４５Ｎ、約１２Ｎ～約４５Ｎ、約１５Ｎ～約４５Ｎ、約２０Ｎ～約４５Ｎ、約２５Ｎ～約４５Ｎ、約３０Ｎ～約４５Ｎ、約３５Ｎ～約４５Ｎ又は約４０Ｎ～約４５Ｎ）の押出力、及び、
５）動的振動歪み掃引試験（dynamic oscillatory strain sweep test）において測定される、少なくとも約１０％（例えば、少なくとも約１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％、０．５％、０．２％又は０．１％）の降伏歪み。
幾つかの実施の形態では、ヒドロゲルは、動的振動剪断試験において測定される、その貯蔵弾性率Ｇ’の約１００％以下の損失弾性率Ｇ’’を有する。
幾つかの実施の形態では、前記ポリマーは親水性及び／又は水溶性である。
幾つかの実施の形態では、前記ポリマーは多糖、ポリアクリル酸、ポリヒドロキシエチルメタクリレート、エラスチン、コラーゲン、それらの誘導体及びそれらの任意の組合せからなる群から選択される。
幾つかの実施の形態では、前記ポリマーはヒアルロン酸、グアーガム、デンプン、キトサン、コンドロイチン硫酸、アルギネート、カルボキシメチルセルロース、それらの誘導体及びそれらの任意の組合せからなる群から選択される。
幾つかの実施の形態では、前記ポリマーはヒアルロン酸、その誘導体及びそれらの任意の組合せからなる群から選択される。
幾つかの実施の形態では、ポリマーはアクリレート、マレイミド、ビニルスルホン、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミド、アルデヒド、ケトン、カルボジイミド、カーボネート、ヨードアセチル、メルカプトニコチンアミド（mercaptonicotinamide）、キノン、チオール、アミン及びそれらの任意の組合せからなる群から選択される１つ以上の修飾で修飾された誘導体を含む。
幾つかの実施の形態では、前記誘導体は約３％～約５０％（例えば、約４％～約４５％、約５％～約４０％、約６％～約４０％、約７％～約４０％、約８％～約３９％、約８％～約３８％、約８％～約３５％、約９％～約３２％、約８％～約３０％、約１０％～約３０％、約１２％～約３０％、約１３％～約３０％、約１４％～約３０％、約１５％～約３５％、又は約１５％～約３０％）の平均修飾度（ＤＭ）を有する。
幾つかの実施の形態では、点眼組成物は、少なくとも第１のポリマー誘導体と第２のポリマー誘導体とを含み、前記第１のポリマー誘導体が第１の修飾を含み、前記第２のポリマー誘導体が第２の修飾を含み、該第１の修飾が前記第２の修飾とは異なり、前記第１のポリマー誘導体が前記第２のポリマー誘導体と反応して前記ヒドロゲルを形成することが可能である。
幾つかの実施の形態では、組成物中の第１のポリマー誘導体と第２のポリマー誘導体との質量比は、約１０：１～約１：１０（例えば１０：２、１０：３、１０：４、１０：５、１０：６、１０：７、１０：８、１０：９、１：１、１：２、１：３、１：４、１：５、１：６、１：７、１：８、１：９又は１：１０）である。
幾つかの実施の形態では、組成物中の第１のポリマー誘導体と第２のポリマー誘導体とのモル比は、約１０：１～約１：１０（例えば１０：２、１０：３、１０：４、１０：５、１０：６、１０：７、１０：８、１０：９、１：１、１：２、１：３、１：４、１：５、１：６、１：７、１：８、１：９又は１：１０）である。
幾つかの実施の形態では、組成物中の第１のポリマー誘導体と第２のポリマー誘導体との体積比は、約１０：１～約１：１０（例えば１０：２、１０：３、１０：４、１０：５、１０：６、１０：７、１０：８、１０：９、１：１、１：２、１：３、１：４、１：５、１：６、１：７、１：８、１：９又は１：１０）である。
幾つかの実施の形態では、第１のポリマー誘導体が第１のＤＭを有し、第２のポリマー誘導体が第２のＤＭを有し、第１のＤＭと第２のＤＭとの比率は、約１０：１～約１：１０（例えば１０：２、１０：３、１０：４、１０：５、１０：６、１０：７、１０：８、１０：９、１：１、１：２、１：３、１：４、１：５、１：６、１：７、１：８、１：９又は１：１０）である。
幾つかの実施の形態では、前記第１の修飾及び前記第２の修飾は、各々独立してアクリレート、マレイミド、ビニルスルホン、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミド、アルデヒド、ケトン、カルボジイミド、カーボネート、ヨードアセチル、メルカプトニコチンアミド、キノン、チオール、アミン及びそれらの任意の組合せからなる群から選択される。
幾つかの実施の形態では、１つ以上のポリマーがヒアルロン酸誘導体であり、第１のポリマー誘導体は、１つ以上のビニルスルホン基で修飾されたヒアルロン酸であり、第２のポリマー誘導体は、１つ以上のチオール基で修飾されたヒアルロン酸であり、第１のポリマー誘導体が第２のポリマー誘導体と反応してヒドロゲルを形成することが可能である。
幾つかの実施の形態では、ポリマーは、約１０００００ダルトン～約５００００００ダルトン（例えば、約１２００００ダルトン～約５００００００ダルトン、約２０００００ダルトン～約５００００００ダルトン、約３０００００ダルトン～約５００００００ダルトン、約４０００００ダルトン～約５００００００ダルトン、約５０００００ダルトン～約５００００００ダルトン、約６０００００ダルトン～約５００００００ダルトン、約６７００００ダルトン～約５００００００ダルトン、約１００００００ダルトン～約５００００００ダルトン、約１５０００００ダルトン～約５００００００ダルトン、約２００００００ダルトン～約５００００００ダルトン、約２５０００００ダルトン～約５００００００ダルトン、約２６０００００ダルトン～約５００００００ダルトン、約３００００００ダルトン～約５００００００ダルトン、約３５０００００ダルトン～約５００００００ダルトン、約３６０００００ダルトン～約５００００００ダルトン、約２００００００ダルトン～約４００００００ダルトン、約２５０００００ダルトン～約３５０００００ダルトン、約２６０００００ダルトン～約３６０００００ダルトン、約１００００００ダルトン～約２６０００００ダルトン、約８０００００ダルトン～約２６０００００ダルトン、約７０００００ダルトン～約２５０００００ダルトン、約６７００００ダルトン～約２６０００００ダルトン、又は約６０００００ダルトン～約２５０００００ダルトン）の平均分子量を有する。
幾つかの実施の形態では、点眼組成物は、１つ以上のポリマーとは異なる架橋剤（例えば、組成物中のポリマーとは異なる架橋剤）を更に含み、ここで、架橋剤は、小分子架橋剤、高分子架橋剤又はそれらの組合せである。
幾つかの実施の形態では、前記架橋剤は、アクリレート、マレイミド、ビニルスルホン、ヒドロキシスクシンイミド、アルデヒド、ケトン、多価カルボジイミド（multi-carbodiimide）、カーボネート、ヨードアセチル、メルカプトニコチンアミド、キノン、チオール、アミン及びそれらの任意の組合せから選択される基を有する分子を含む小分子架橋剤である。
幾つかの実施の形態では、前記架橋剤は、アクリレート、マレイミド、ビニルスルホン、ヒドロキシスクシンイミド、アルデヒド、ケトン、多価カルボジイミド、カーボネート、ヨードアセチル、メルカプトニコチンアミド、キノン、チオール、アミン及びそれらの任意の組合せから選択される基を有する高分子を含む高分子架橋剤である。
幾つかの実施の形態では、前記架橋剤は、ジチオトレイトール、ジシステイン、ＰＥＧ－ジチオール、４又は８アームＰＥＧチオール、ジビニルスルホン、ビス（ビニルスルホニル）メタン、ＰＥＧ－ＶＳ、及び４又は８アームＰＥＧＶＳからなる群から選択される。
幾つかの実施の形態では、点眼組成物は、前記１つ以上のポリマーとは異なる架橋剤を含まない。
幾つかの実施の形態では、点眼組成物はリン酸緩衝液を含む。
幾つかの実施の形態では、点眼組成物は、約３．５～約９．０（例えば、約４．０～約９．０、約４．５～約９．０、約５．０～約９．０、約５．５～約９．０、約６．０～約９．０、約６．５～約９．０、約７．０～約９．０、約７．５～約９．０、約８．０～約９．０、約８．５～約９．０、約７．０～約７．８、又は約７．４）のｐＨを有する。
幾つかの実施の形態では、ヒドロゲルは生体適合性である。
幾つかの実施の形態では、点眼組成物は、人工涙液、コンタクトレンズ再湿潤剤、又は潤滑剤である。
幾つかの実施の形態では、点眼組成物は、治療的活性剤を更に含む。
別の態様では、本開示は、眼の障害又は病態の治療又は緩和を必要とする被験体における眼の障害又は病態を治療又は緩和する方法であって、前記被験体に有効量の点眼組成物を投与することを含む、方法を提供する。
幾つかの実施の形態では、前記眼の障害又は病態は、ドライアイ症候群及びコンタクトレンズの不快感からなる群から選択される。
別の態様では、本開示は、眼の快適さの改善又は眼の乾燥の軽減を必要とする被験体における眼の快適さを改善する又は眼の乾燥を軽減する方法であって、前記被験体に有効量の点眼組成物を投与することを含む、方法を提供する。
別の態様では、本開示は、眼の障害又は病態を治療又は緩和するための製品の製造における点眼組成物の使用を提供する。
幾つかの実施の形態では、前記眼の障害又は病態は、ドライアイ症候群及びコンタクトレンズの不快感からなる群から選択される。
別の態様では、本開示は、眼の快適さを改善する又は眼の乾燥を軽減するための製品の製造における点眼組成物の使用を提供する。
本開示の付加的な態様及び利点は、本開示の例示的な実施形態のみを示し、説明する以下の発明を実施するための形態から当業者に容易に明らかとなる。認識されるように、本開示では他の種々の実施形態が可能であり、その幾つかの細部を全て本開示から逸脱することのない様々な明白な点で変更することが可能である。したがって、図面及び本明細書は限定的なものではなく、本質的に例示的なものであるとみなされる。
参照による援用
本明細書に記載の全ての刊行物、特許及び特許出願は、それぞれ個々の刊行物、特許又は特許出願が具体的に及び個々に引用することにより本明細書の一部をなすことが示された場合と同じ程度において引用することにより本明細書の一部をなす。
本明細書に記載の全ての刊行物、特許及び特許出願は、それぞれ個々の刊行物、特許又は特許出願が具体的に及び個々に引用することにより本明細書の一部をなすことが示された場合と同じ程度において引用することにより本明細書の一部をなす。
本発明の新規の特徴は添付の特許請求の範囲に詳細に記載される。本発明の特徴及び利点は、本発明の原理が利用される例示的な実施形態を記載する以下の発明を実施するための形態及び添付の図面（さらに、本明細書での「図」（"figure" and "FIG."））を参照することによってより良好に理解される。
本明細書では本発明の様々な実施形態を示して説明したが、かかる実施形態は例としてのみ提供されていることは当業者には明らかであろう。当業者は、本発明から逸脱することなく、多数の変形、変更、及び置換を想到するであろう。本明細書に記載される本発明の実施形態の様々な代替物を使用できることを理解されたい。
「ポリマー」という用語は、本明細書で使用される場合、概して、重合によって形成され、反復構造単位から本質的になる化学化合物又は化合物の混合物を指す。
「ヒドロゲル」という用語は、本明細書で使用される場合、概して、水溶液（例えば、水）に懸濁された１つ以上のポリマーを含むゲル又はゲル状構造を指す。
「粘度」という用語は、本明細書で使用される場合、概して、流体又は半流体（semifluid）中の流れに対する抵抗の特性を指す。
「固有粘度」という用語は、本明細書で使用される場合、概して、系（例えば、溶液）の粘度への物質（例えば、ポリマー）の寄与の尺度を指す。本開示では、固有粘度［η］は、ウベローデ粘度計又は示差粘度計によって測定することができる。代替的には、固有粘度［η］は、固有粘度と分子量との間の確立された関係によるマーク－フウィンクの式から算出することができる。
「ヒドロゲル形成ポリマー」という用語は、本明細書で使用される場合、概して、ヒドロゲルの形成に関与するポリマーを指す。ヒドロゲル形成ポリマーは、ヒドロゲルを形成することが可能な天然ポリマー又は合成ポリマーであり得る。ヒドロゲル形成ポリマーは、ヒドロゲル形成に寄与するポリマー（複数の場合もある）を含み得る。幾つかの実施形態では、ヒドロゲル形成ポリマーは、本開示の点眼組成物中に存在する場合であっても、ヒドロゲル形成に関与することが可能でないポリマー、及び／又はヒドロゲルを形成することができないポリマーを含まない。場合によっては、ヒドロゲル形成ポリマーは、「骨格ポリマー」とも称され得る。
「ＣＴ」という用語は、本明細書で使用される場合、概して、組成物中のポリマー（単数又は複数）の全濃度を指す。例えば、ヒドロゲル形成ポリマーのＣＴは、本開示のヒドロゲルを形成する及び／又は形成したポリマーの全濃度を指し得る。例えば、ＣＴは、本開示の点眼組成物中に存在するヒドロゲル形成ポリマーの全濃度を指し得る。場合によっては、本開示の点眼組成物は、既にヒドロゲルを形成したヒドロゲル形成ポリマー、及び／又は未だヒドロゲル中に組み込まれていないヒドロゲル形成ポリマーを含んでいてもよく、ヒドロゲル形成ポリマーのＣＴは、点眼組成物中に存在するヒドロゲル形成ポリマー（例えば、既にヒドロゲル中に組み込まれたポリマー及び未だ組み込まれていないポリマーの両方を含む）の全濃度を指し得る。別の例では、少なくとも３ｄＬ／ｇの固有粘度［η］を有するヒドロゲル形成ポリマーのＣＴは、少なくとも３ｄＬ／ｇの固有粘度［η］を有するヒドロゲル形成ポリマーの全濃度を指し得る。
「点眼組成物」という用語は、本明細書で使用される場合、概して、様々な元素又は成分の点眼製品（例えば、液体状態）を指す。例えば、点眼組成物は、１つ以上のポリマーによって形成されたヒドロゲルを含み得て、点眼組成物は容器から押し出すことができる。場合によっては、点眼組成物はヒドロゲル形成ポリマーを含み得る。
「貯蔵弾性率Ｇ’」という用語は、本明細書で使用される場合、概して、測定される貯蔵エネルギーを指し、弾性部分を表す。
「損失弾性率Ｇ’’」という用語は、本明細書で使用される場合、概して、測定される損失エネルギーを指し、粘性部分を表す。
「押出力」という用語は、本明細書で使用される場合、概して、容器から材料を押し出すのに必要な力、例えば、本開示の組成物又はヒドロゲルをボトルから絞り出すのに必要な力を指す。
「降伏歪み」という用語は、本明細書で使用される場合、概して、材料が塑性変形し始める歪みを指し、降伏点は、非線形（弾性及び塑性）変形が始まる点である。降伏点より前では、材料は弾性変形し、加えられた応力が除去されると、その元の形状に戻る。
「親水性」という用語は、本明細書で使用される場合、概して、水に対する親和性を有し、水を吸収するか又は水で濡れることが可能であることを指す。親水性の分子又は分子の一部分は、水及び他の極性物質との相互作用が油又は他の疎水性溶媒との相互作用より熱力学的に有利なものである。
「平均修飾度（ＤＭ）」という用語は、本明細書で使用される場合、概して、ポリマー中のペンダント基を有する反復単位のパーセンテージを指す。ＤＭは、ヒドロゲル形成ポリマー誘導体の修飾の程度を反映し得る。
「架橋剤」という用語は、本明細書で使用される場合、概して或るポリマー鎖を結合により別のポリマー鎖に連結する作用物質を指す。架橋剤は、共有結合又は非共有結合を介した架橋を達成することができる。「ポリマー鎖」は、合成ポリマー又は天然ポリマー（タンパク質等）を指す場合がある。高分子化学では、合成ポリマーが「架橋される」場合、通常はポリマーのバルク全体が架橋法に曝されたことを意味する。生じる機械的特性の変更は、架橋密度に強く依存する。架橋は熱、圧力、ｐＨの変化又は放射線によって開始する化学反応によって形成することができる。
「眼の障害又は病態」という用語は、本明細書で使用される場合、概して、眼の疾患及びその障害を指す。眼の障害又は病態は、限定されるものではないが、赤目、夜盲症、弱視、斜視、眼振、色盲、ブドウ膜炎、老視、飛蚊症、ドライアイ、過剰涙液、白内障、緑内障、網膜障害（例えば、加齢黄斑変性、糖尿病網膜症、網膜剥離）、結膜炎、角膜疾患、眼瞼の問題、視力変化、及びコンタクトレンズによる問題からなる群から選択され得る。場合によっては、眼の障害又は病態は、ドライアイ症候群及び／又はコンタクトレンズの不快感であり得る。
「生体適合性」という用語は、本明細書で使用される場合、概して、毒性でなく、有害でなく、又は生理学的に反応性ではなく、及び／又は免疫学的拒絶反応を引き起こさないことによって、生体組織又は生体系と適合性である状態を指す。
「約」という用語は、数値との関連で使用される場合、概して、指定の値を１％未満～１５％未満（例えば、１％未満、２％未満、３％未満、４％未満、５％未満、６％未満、７％未満、８％未満、９％未満、１０％未満、１１％未満、１２％未満、１３％未満、１４％未満又は１５％未満）上回る又は下回る値を指す。
値の範囲（例えば、数値範囲）が提示される場合、文脈上明らかに別段の指示がない限り、下限の単位の１０分の１までの、その範囲の上限と下限との間にある各々の値、及びその提示の範囲内の任意の他の提示される又は間にある値が本発明に包含されることが理解される。提示の範囲内の限界が具体的に除外される場合、これらのより小さな範囲の上限及び下限を、独立してこのより小さな範囲内に含めることができ、同様に本発明に包含される。提示の範囲が一方又は両方の限界を含む場合、これらの含まれる限界の一方又は両方を除外する範囲も本発明に含まれる。
他に規定のない限り、本明細書で使用される全ての技術用語及び科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般に理解されるものと同じ意味を有する。本明細書に記載されるものと同様又は同等の方法及び材料も本発明の実施又は試験に使用することができ、好適な方法及び材料を次に説明する。本明細書で言及される全ての刊行物は、それによって引用される刊行物と関連して上記方法及び／又は材料を開示及び説明するため引用することにより本明細書の一部をなす。
本明細書で使用される場合、文脈上他に明らかに指示されない限り、数量を特定していない単数形（the singular forms "a," "and" and "the"）は、複数の指示対象を含む。このため、例えば、「粒子（a particle）」への言及は、複数のかかる粒子を含み、「配列（the sequence）」への言及は、１つ以上の該配列及び当業者に既知のその均等物等への言及を含む。
本開示を読むことで当業者に理解されるように、本明細書に記載及び説明される個々の実施形態は各々、本発明の範囲又は趣旨を逸脱しない限り、他の幾つかの実施形態のいずれかの特徴部から容易に分離するか又はそれと組み合わせることができる個別の構成要素及び特徴部を有する。任意の記載の方法を記載の事象の順序又は論理的に可能な任意の他の順序で行うことができる。これは、全てのかかる組合せを支持することを意図したものである。
本開示は、点眼組成物、及びこの組成物を使用して眼の障害又は病態を治療又は緩和する方法、並びに上記組成物を作製及び使用する方法を提供する。より具体的には、本開示は、ヒドロゲルを形成することが可能なポリマーを含む組成物、並びにそれを作製及び使用する方法を提供する。
一態様では、本開示は、点眼組成物を提供する。点眼組成物は、１つ以上のヒドロゲル形成ポリマーを含んでもよい。かかるヒドロゲル形成ポリマーは、組成物中で少なくとも３ｄＬ／ｇ（例えば、少なくとも約５ｄＬ／ｇ、少なくとも約８ｄＬ／ｇ、少なくとも約１０ｄＬ／ｇ、少なくとも約１２ｄＬ／ｇ、少なくとも約１５ｄＬ／ｇ、少なくとも約１６ｄＬ／ｇ、少なくとも約１７ｄＬ／ｇ、少なくとも約１８ｄＬ／ｇ、少なくとも約１９ｄＬ／ｇ、少なくとも約２０ｄＬ／ｇ、少なくとも約２５ｄＬ／ｇ、又はそれ以上）の固有粘度［η］（例えば、ウベローデ粘度計によって測定される）を有し得る。幾つかの実施形態では、固有粘度［η］は、示差粘度計によって測定される。代替的には、固有粘度［η］は、固有粘度と分子量との間の確立された関係によるマーク－フウィンクの式から算出することができる。
組成物中のヒドロゲル形成ポリマー（複数の場合もある）（例えば、少なくとも３ｄＬ／ｇの固有粘度［η］を有するヒドロゲル形成ポリマー）の全濃度は、ＣＴである。ＣＴは、多くとも約５ｍｇ／ｍｌ（例えば、多くとも約４ｍｇ／ｍｌ、多くとも約３ｍｇ／ｍｌ、多くとも約２ｍｇ／ｍｌ、多くとも約１．５ｍｇ／ｍｌ、多くとも約１ｍｇ／ｍｌ、多くとも約０．９ｍｇ／ｍｌ、多くとも約０．８ｍｇ／ｍｌ、多くとも約０．７ｍｇ／ｍｌ、多くとも約０．６ｍｇ／ｍｌ、多くとも約０．５ｍｇ／ｍｌ、多くとも約０．４ｍｇ／ｍｌ、多くとも約０．３ｍｇ／ｍｌ、多くとも約０．２ｍｇ／ｍｌ、多くとも約０．１ｍｇ／ｍｌ、又はそれ以下）であり得る。例えば、ＣＴは、約０．０５ｍｇ／ｍｌ～約５ｍｇ／ｍｌ（例えば、約０．１ｍｇ／ｍｌ～約５ｍｇ／ｍｌ、約０．２ｍｇ／ｍｌ～約５ｍｇ／ｍｌ、約０．３ｍｇ／ｍｌ～約５ｍｇ／ｍｌ、約０．４ｍｇ／ｍｌ～約５ｍｇ／ｍｌ、約０．５ｍｇ／ｍｌ～約５ｍｇ／ｍｌ、約０．６ｍｇ／ｍｌ～約５ｍｇ／ｍｌ、約０．７ｍｇ／ｍｌ～約５ｍｇ／ｍｌ、約０．８ｍｇ／ｍｌ～約５ｍｇ／ｍｌ、約０．９ｍｇ／ｍｌ～約５ｍｇ／ｍｌ、約１．０ｍｇ／ｍｌ～約５ｍｇ／ｍｌ、約１．０ｍｇ／ｍｌ～約４ｍｇ／ｍｌ、約１．０ｍｇ／ｍｌ～約３ｍｇ／ｍｌ、約１．０ｍｇ／ｍｌ～約２ｍｇ／ｍｌ、約０．３ｍｇ／ｍｌ～約０．８ｍｇ／ｍｌ、約０．３ｍｇ／ｍｌ～約０．６ｍｇ／ｍｌ、又は約０．３ｍｇ／ｍｌ～約０．５ｍｇ／ｍｌ）であり得る。
例えば、点眼組成物は、様々なポリマーを含み得て、それらの幾つかは、ヒドロゲル形成に関与することができる（例えば、ヒドロゲル形成ポリマー）。ヒドロゲル形成ポリマーのうち、一部が少なくとも３ｄＬ／ｇの固有粘度［η］を有し、少なくとも３ｄＬ／ｇの固有粘度［η］を有するヒドロゲル形成ポリマーの全濃度ＣＴは、多くとも約５ｍｇ／ｍｌ（例えば、多くとも約４ｍｇ／ｍｌ、多くとも約３ｍｇ／ｍｌ、多くとも約２ｍｇ／ｍｌ、多くとも約１．５ｍｇ／ｍｌ、多くとも約１ｍｇ／ｍｌ、多くとも約０．９ｍｇ／ｍｌ、多くとも約０．８ｍｇ／ｍｌ、多くとも約０．７ｍｇ／ｍｌ、多くとも約０．６ｍｇ／ｍｌ、多くとも約０．５ｍｇ／ｍｌ、多くとも約０．４ｍｇ／ｍｌ、多くとも約０．３ｍｇ／ｍｌ、多くとも約０．２ｍｇ／ｍｌ、多くとも約０．１ｍｇ／ｍｌ、又はそれ以下）であり得る。例えば、少なくとも３ｄＬ／ｇの固有粘度［η］を有するヒドロゲル形成ポリマーの全濃度ＣＴは、約０．０５ｍｇ／ｍｌ～約５ｍｇ／ｍｌ（例えば、約０．１ｍｇ／ｍｌ～約５ｍｇ／ｍｌ、約０．２ｍｇ／ｍｌ～約５ｍｇ／ｍｌ、約０．３ｍｇ／ｍｌ～約５ｍｇ／ｍｌ、約０．４ｍｇ／ｍｌ～約５ｍｇ／ｍｌ、約０．５ｍｇ／ｍｌ～約５ｍｇ／ｍｌ、約０．６ｍｇ／ｍｌ～約５ｍｇ／ｍｌ、約０．７ｍｇ／ｍｌ～約５ｍｇ／ｍｌ、約０．８ｍｇ／ｍｌ～約５ｍｇ／ｍｌ、約０．９ｍｇ／ｍｌ～約５ｍｇ／ｍｌ、約１．０ｍｇ／ｍｌ～約５ｍｇ／ｍｌ、約１．０ｍｇ／ｍｌ～約４ｍｇ／ｍｌ、約１．０ｍｇ／ｍｌ～約３ｍｇ／ｍｌ、約１．０ｍｇ／ｍｌ～約２ｍｇ／ｍｌ、約０．３ｍｇ／ｍｌ～約０．８ｍｇ／ｍｌ、約０．３ｍｇ／ｍｌ～約０．６ｍｇ／ｍｌ、又は約０．３ｍｇ／ｍｌ～約０．５ｍｇ／ｍｌ）であり得る。
場合によっては、初めに、点眼組成物中のヒドロゲル形成ポリマーは、非架橋形態で存在していてもよく（例えば、ヒドロゲルが未だ形成されていない）、或る特定の処理の後に（例えば、或る特定の期間、例えば１２時間以上にわたって例えば３７℃でインキュベートした後に）、ヒドロゲル形成ポリマーの一部が化学的及び／又は物理的に架橋してヒドロゲルを形成することができる。或る特定の実施形態では、ほぼ全てのヒドロゲル形成ポリマーが化学的及び／又は物理的に架橋してヒドロゲルを形成する。
このため、場合によっては、点眼組成物は、形成されたヒドロゲルを含んでいてもよい。このような場合には、ヒドロゲル形成ポリマーの少なくとも一部が組成物において形成されたヒドロゲル中に含まれる。例えば、点眼組成物中のヒドロゲル形成ポリマーは、既にヒドロゲルを形成したポリマー、及び未だヒドロゲル中に組み込まれていないが、或る特定の反応条件下で（例えば、３７℃で或る期間、例えば１２時間にわたってインキュベートした後に）ヒドロゲルを形成することが可能なポリマーの両方を含むことができる。このような場合には、既にヒドロゲルに含まれるヒドロゲル形成ポリマー及び未だヒドロゲル中に組み込まれていないヒドロゲル形成ポリマーの両方の全濃度ＣＴは、多くとも約５ｍｇ／ｍｌであり得る。
場合によっては、点眼組成物中のほぼ全てのヒドロゲル形成ポリマーが、ヒドロゲルを形成していてもよい（例えば、化学的及び／又は物理的架橋による）。
本開示によるヒドロゲルは、１つ以上の特定の特徴／特性を有し得る。
例えば、ヒドロゲルは、動的振動剪断試験において測定される、約１０．０Ｐａ以下（例えば、約８．０Ｐａ以下、約７．０Ｐａ以下、約６．０Ｐａ以下、約５．０Ｐａ以下、約４．０Ｐａ以下、約３．０Ｐａ以下、約２．０Ｐａ以下、約１．０Ｐａ以下、約０．８Ｐａ以下、約０．７Ｐａ以下、約０．６Ｐａ以下、約０．５Ｐａ以下、又はそれ以下）の貯蔵弾性率Ｇ’を有し得る。
本開示のヒドロゲルは、動的振動剪断試験において測定される、約１０．０Ｐａ以下（例えば、約８．０Ｐａ以下、約７．０Ｐａ以下、約６．０Ｐａ以下、約５．０Ｐａ以下、約４．０Ｐａ以下、約３．０Ｐａ以下、約２．０Ｐａ以下、約１．０Ｐａ以下、約０．８Ｐａ以下、約０．７Ｐａ以下、約０．６Ｐａ以下又は約０．５Ｐａ以下、又はそれ以下）の損失弾性率Ｇ’’を有し得る。
本開示のヒドロゲルは、約１００ｒａｄ／ｓ未満（例えば、約９０ｒａｄ／ｓ未満、約８０ｒａｄ／ｓ未満、約７０ｒａｄ／ｓ未満、約５０ｒａｄ／ｓ未満、約４０ｒａｄ／ｓ未満、約３０ｒａｄ／ｓ未満、約２０ｒａｄ／ｓ未満、約１０ｒａｄ／ｓ未満、又はそれ以下）の振動数で動的振動剪断試験において測定される、約０．２Ｐａ・ｓ以下（例えば、約０．１Ｐａ・ｓ以下、約０．０８Ｐａ・ｓ以下、約０．０７Ｐａ・ｓ以下、約０．０６Ｐａ・ｓ以下、約０．０５Ｐａ・ｓ以下又は約０．０４Ｐａ・ｓ以下）の複素粘度を有し得る。
本開示のヒドロゲルは、ヒドロゲルをボトル（例えば、Ｔｅａｒｓ Ｎａｔｕｒａｌｅ Ｆｒｅｅ ０．６ｍｌの成形同時充填（ＢＦＳ）使い捨てボトル）から絞り出す場合に、約４Ｎ～約４５Ｎ（例えば、約４Ｎ～約４５Ｎ、約５Ｎ～約４５Ｎ、約６Ｎ～約４５Ｎ、約７Ｎ～約４５Ｎ、約８Ｎ～約４５Ｎ、約９Ｎ～約４５Ｎ、約１０Ｎ～約４５Ｎ、約１２Ｎ～約４５Ｎ、約１５Ｎ～約４５Ｎ、約２０Ｎ～約４５Ｎ、約２５Ｎ～約４５Ｎ、約３０Ｎ～約４５Ｎ、約３５Ｎ～約４５Ｎ又は約４０Ｎ～約４５Ｎ）の押出力を有し得る。
本開示のヒドロゲルは、動的振動歪み掃引試験において測定される、少なくとも約１０％（例えば、少なくとも約１０％、少なくとも約１１％、少なくとも約１２％、少なくとも約１３％、少なくとも約１４％、少なくとも約１５％、少なくとも約１６％、少なくとも約１７％、少なくとも約１８％、少なくとも約１９％、少なくとも約２０％、少なくとも約５０％、少なくとも約８０％、又はそれ以上）の降伏歪みを有し得る。
例えば、動的振動剪断試験では、正弦波力（sinusoidal force）（例えば、応力）を材料に加えることができ、生じる変位（歪み）を測定することができる。完全弾性の固体については、生じる歪み及び応力は、完全に位相が一致し得る。純粘性流体については、応力に対する歪みの９０度の位相遅れが存在し得る。中間の特徴を有する粘弾性ポリマーは、試験中に位相遅れを有する場合があり、それに応じて貯蔵弾性率を算出することができる。
押出力は、点眼組成物（例えば、本開示のヒドロゲルを含む）を点眼ボトル等の容器から押し出す（例えば、絞り出す）ことによって試験することができる。点眼ボトルは、少なくとも約０．１ｍｌ（例えば、少なくとも約０．２ｍｌ、少なくとも約０．３ｍｌ、少なくとも約０．４ｍｌ、少なくとも約０．５ｍｌ、少なくとも約０．６ｍｌ、少なくとも約０．７ｍｌ、少なくとも約０．８ｍｌ、少なくとも約０．９ｍｌ、少なくとも約１．０ｍｌ、少なくとも約１．１ｍｌ、少なくとも約１．２ｍｌ、少なくとも約１．３ｍｌ、少なくとも約１．４ｍｌ、少なくとも約１．５ｍｌ、少なくとも約２．０ｍｌ又はそれ以上）の容量を有し得る。点眼ボトルは、ＰＥＴ、アセタール、ＨＤＰＥ、ＬＤＰＥ、ナイロン、ＰＢＴ、ＰＥＥＫ、ポリプロピレン、ＰＰＳ、ＰＴＦＥ、ＰＶＤＦ及びＵＨＭＷ－ＰＥからなる群から選択される材料から作製され得る。点眼ボトルは、少なくとも約０．０１ｍｍ（例えば、少なくとも約０．０５ｍｍ、少なくとも約０．１ｍｍ、少なくとも約０．１５ｍｍ、少なくとも約０．２ｍｍ、少なくとも約０．２５ｍｍ、少なくとも約０．３ｍｍ、少なくとも約０．３５ｍｍ、少なくとも約０．４ｍｍ、少なくとも約０．４５ｍｍ、少なくとも約０．５ｍｍ、少なくとも約０．５５ｍｍ、少なくとも約０．６ｍｍ、少なくとも約０．７ｍｍ、少なくとも約０．８ｍｍ、少なくとも約０．９ｍｍ、少なくとも約１．０ｍｍ又はそれ以上）の口径を有し得る。点眼ボトルは、スクリューキャップ、ニードルキャップ、又は他の適切なタイプのキャップを有し得る。幾つかの実施形態では、点眼ボトルは、Ｔｅａｒｓ Ｎａｔｕｒａｌｅ Ｆｒｅｅ ０．６ｍｌの成形同時充填（ＢＦＳ）使い捨てボトルである。
動的機械分析装置（ＤＭＡ）を貯蔵弾性率の測定に使用することができ、動的振動剪断試験に使用することができる。別の例では、ＤＭＡ分析装置は、計器プローブが磁気コアを通過することで生じる電圧の変化を測定することができる変位センサー（線形可変差動変圧器等）を備えていてもよい。ＤＭＡ分析装置は、温度制御システム又は炉、駆動モーター（例えば、加えられた力のローディングをもたらすことができるプローブローディングのためのリニアモーター）、ドライブシャフト支持体、及びモーターからサンプルへの力のガイドとして働く誘導システム、及び試験されるサンプルを保持するための１つ以上のサンプルクランプを更に備えていてもよい。
様々なタイプのＤＭＡ分析装置を使用することができる。例えば、強制共鳴（forced resonance）分析装置又は自由共鳴（free resonance）分析装置を使用することができる。自由共鳴分析装置では、サンプルを保持し（suspending：吊り下げ）揺動させることにより、試験されるサンプルの減衰の自由振動を測定することができる。強制共鳴分析装置では、サンプルを或る特定の振動数で振動させることができ、温度掃引を確実に行うことができる。分析装置は、応力（力）及び歪み（変位）制御の両方のためのものであってもよい。例えば、歪み制御では、プローブを動かすことができ、生じるサンプルの応力を、異なる軸を用いることができる力平衡変換器を実装することによって測定することができる。応力制御では、一定の力を加えることができ、幾つかの他の実験条件（温度、振動数又は時間）を変更することができる。応力及び歪みは、ねじり（torsional）又は軸（axial）分析装置により加えることができる。ねじり分析装置では、力がねじり運動で加えられる。軸分析装置は曲げ、引張及び／又は圧縮試験に用いることができる。
温度掃引試験、振動数掃引試験、歪み掃引試験又はそれらの組合せ等の様々な試験モードを用いてポリマーの粘弾性特性を精査することができる。例えば、歪み掃引試験では、振動振幅を漸増させることにより、歪み掃引測定を行うことができる。歪みの増大に伴う貯蔵弾性率及び損失弾性率の変動を材料の特性評価に用いることができ、材料の線形応力－歪みレジームの上限を決定するために用いることができる。
様々な機械的特性をＤＭＡによって決定することができる。これらの特性としては、貯蔵弾性率（Ｇ’）、損失弾性率（Ｇ’’）、複素弾性率（Ｇ＊）、損失角（ｔａｎ（δ））、複素粘度（η＊）、その同相分（η’）及び異相分（η’’）、複素コンプライアンス（Ｊ＊）、貯蔵コンプライアンス（Ｊ’）、損失コンプライアンス（Ｊ’’）等が挙げられる。
場合によっては、ヒドロゲルは、動的振動剪断試験において測定される、その貯蔵弾性率Ｇ’の約１００％以下（例えば、約１００％以下、約９０％以下、約８０％以下、約７０％以下、約６０％以下、約５０％以下、約４０％以下、約３０％以下、約２０％以下、約１０％以下、約５％以下、約３％以下、約２％以下、約１％以下又はそれ以下）の損失弾性率Ｇ’’を有し得る。
場合によっては、ポリマーは、親水性及び／又は水溶性であり得る。
場合によっては、ポリマー（例えば、ヒドロゲル形成ポリマー）は、多糖、ポリアクリル酸、ポリヒドロキシエチルメタクリレート、エラスチン、コラーゲン、それらの誘導体及びそれらの任意の組合せからなる群から選択され得る。例えば、点眼組成物中のポリマー（例えば、ヒドロゲル形成ポリマー）は、以下の１つ以上を含み得る：多糖、１種類以上のポリアクリル酸誘導体、ポリヒドロキシエチルメタクリレート、１種類以上のポリヒドロキシエチルメタクリレート誘導体、エラスチン、１種類以上のエラスチン誘導体、コラーゲン及び１種類以上のコラーゲン誘導体。
場合によっては、ポリマー（例えば、ヒドロゲル形成ポリマー）は、ヒアルロン酸、グアーガム、デンプン、キトサン、コンドロイチン硫酸、アルギネート、カルボキシメチルセルロース、それらの誘導体及びそれらの任意の組合せからなる群から選択され得る。例えば、点眼組成物中のポリマー（例えば、ヒドロゲル形成ポリマー）は、以下の１つ以上を含み得る：ヒアルロン酸、１種類以上のヒアルロン酸誘導体、グアーガム、１種類以上のグアーガム誘導体、デンプン、１種類以上のデンプン誘導体、キトサン、１種類以上のキトサン誘導体、コンドロイチン硫酸、１種類以上のコンドロイチン硫酸誘導体、アルギネート、１種類以上のアルギネート誘導体、カルボキシメチルセルロース及び１種類以上のカルボキシメチルセルロース誘導体。幾つかの実施形態では、点眼組成物中のポリマー（例えば、ヒドロゲル形成ポリマー）は、以下の１つ以上を含む：ヒアルロン酸及び１種類以上のヒアルロン酸誘導体。
本開示のポリマー（例えば、ヒドロゲル形成ポリマー）は、アクリレート、マレイミド、ビニルスルホン、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミド、アルデヒド、ケトン、カルボジイミド、カーボネート、ヨードアセチル、メルカプトニコチンアミド、キノン、チオール、アミン及びそれらの任意の組合せからなる群から選択される１つ以上の修飾で修飾された誘導体を含んでいてもよい。例えば、ポリマーは、アクリレート、マレイミド、ビニルスルホン、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミド、アルデヒド、ケトン、カルボジイミド、カーボネート、ヨードアセチル、メルカプトニコチンアミド、キノン、チオール及び／又はアミンで修飾された多糖であり得る１つ以上の多糖誘導体を含んでいてもよい。場合によっては、ポリマーは、アクリレート、マレイミド、ビニルスルホン、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミド、アルデヒド、ケトン、カルボジイミド、カーボネート、ヨードアセチル、メルカプトニコチンアミド、キノン、チオール及び／又はアミンで修飾されたポリアクリル酸であり得る１つ以上のポリアクリル酸誘導体を含んでいてもよい。場合によっては、ポリマーは、アクリレート、マレイミド、ビニルスルホン、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミド、アルデヒド、ケトン、カルボジイミド、カーボネート、ヨードアセチル、メルカプトニコチンアミド、キノン、チオール及び／又はアミンで修飾されたポリヒドロキシエチルメタクリレートであり得る１つ以上のポリヒドロキシエチルメタクリレート誘導体を含んでいてもよい。場合によっては、ポリマーは、アクリレート、マレイミド、ビニルスルホン、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミド、アルデヒド、ケトン、カルボジイミド、カーボネート、ヨードアセチル、メルカプトニコチンアミド、キノン、チオール及び／又はアミンで修飾されたエラスチンであり得る１つ以上のエラスチン誘導体を含んでいてもよい。場合によっては、ポリマーは、アクリレート、マレイミド、ビニルスルホン、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミド、アルデヒド、ケトン、カルボジイミド、カーボネート、ヨードアセチル、メルカプトニコチンアミド、キノン、チオール及び／又はアミンで修飾されたコラーゲンであり得る１つ以上のコラーゲン誘導体を含んでいてもよい。
一実施形態では、ポリマーは、１つ以上のチオール基で修飾されたヒアルロン酸の誘導体（ＨＡ－ＳＨ）を含み、場合によっては、ＨＡ－ＳＨは、ＨＡ－ＳＨ系ポリマー－ポリマー型ヒドロゲルを適当な条件下で形成することができる。別の実施形態では、ポリマーは、１つ以上のビニルスルホン基で修飾されたヒアルロン酸の誘導体（ＨＡ－ＶＳ）を含み、場合によっては、ＨＡ－ＶＳは、ＨＡ－ＶＳ系ポリマー－ポリマー型ヒドロゲルを適当な条件下で形成することができる。別の実施形態では、ポリマーは、１つ以上のチオール基で修飾されたヒアルロン酸の誘導体と１つ以上のビニルスルホン基で修飾されたヒアルロン酸の誘導体とを含み、場合によっては、ＨＡ－ＳＨ及びＨＡ－ＶＳは、適当な条件下で互いに反応して、ポリマー－ポリマー型ヒドロゲルを形成することができる。
場合によっては、誘導体は、約３％～約５０％（例えば、約３％～約５０％、約４％～約５０％、約５％～約５０％、約６％～約５０％、約７％～約５０％、約８％～約５０％、約９％～約５０％、約１０％～約５０％、約２０％～約５０％、約３０％～約５０％、約４０％～約５０％等）の平均修飾度（ＤＭ）を有することができる。
場合によっては、点眼組成物は、少なくとも第１のポリマー誘導体と第２のポリマー誘導体とを含み得る。第１のポリマー誘導体が第１の修飾を含み、第２のポリマー誘導体が第２の修飾を含み得る。第１の修飾は、第２の修飾とは異なっていてもよい。第１のポリマー誘導体が第２のポリマー誘導体と反応してヒドロゲルを形成することが可能であり得る。例えば、第１のポリマー誘導体は、１つ以上のビニルスルホン基で修飾されたポリマー（例えば、ヒアルロン酸）であり得る。第２のポリマー誘導体は、１つ以上のチオール基で修飾されたポリマー（例えば、ヒアルロン酸）であり得る。
場合によっては、組成物中の第１のポリマー誘導体と第２のポリマー誘導体との質量比は、約１０：１～約１：１０（例えば１０：２、１０：３、１０：４、１０：５、１０：６、１０：７、１０：８、１０：９、１：１、１：２、１：３、１：４、１：５、１：６、１：７、１：８、１：９又は１：１０）であり得る。
場合によっては、組成物中の第１のポリマー誘導体と第２のポリマー誘導体とのモル比は、約１０：１～約１：１０（例えば１０：２、１０：３、１０：４、１０：５、１０：６、１０：７、１０：８、１０：９、１：１、１：２、１：３、１：４、１：５、１：６、１：７、１：８、１：９又は１：１０）であり得る。
場合によっては、組成物中の第１のポリマー誘導体と第２のポリマー誘導体との体積比は、約１０：１～約１：１０（例えば１０：２、１０：３、１０：４、１０：５、１０：６、１０：７、１０：８、１０：９、１：１、１：２、１：３、１：４、１：５、１：６、１：７、１：８、１：９又は１：１０）であり得る。
場合によっては、第１のポリマー誘導体が第１のＤＭを有し、第２のポリマー誘導体が第２のＤＭを有し、第１のＤＭと第２のＤＭとの比率は、約１０：１～約１：１０（例えば１０：２、１０：３、１０：４、１０：５、１０：６、１０：７、１０：８、１０：９、１：１、１：２、１：３、１：４、１：５、１：６、１：７、１：８、１：９又は１：１０）であり得る。
場合によっては、組成物中の第１のポリマー誘導体及び第２のポリマー誘導体は、本開示において規定される質量比、本開示において規定されるモル比、本開示において規定される体積比及び／又は本開示において規定されるＤＭ比を有し得る。
場合によっては、第１の修飾及び第２の修飾が各々独立してアクリレート、マレイミド、ビニルスルホン、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミド、アルデヒド、ケトン、カルボジイミド、カーボネート、ヨードアセチル、メルカプトニコチンアミド、キノン、チオール、アミン及びそれらの任意の組合せからなる群から選択され得る。第１の修飾及び第２の修飾は、互いに異なっていてもよい。
場合によっては、第１のポリマー誘導体は、１つ以上のビニルスルホン基（又は１つ以上のビニルスルホン基を含む分子）で修飾された本開示のポリマーであってもよく、第２のポリマー誘導体は、１つ以上のチオール基（又は１つ以上のチオール基を含む分子）で修飾された本開示のポリマーであってもよい。第１のポリマー誘導体が第２のポリマー誘導体と反応してヒドロゲルを形成することが可能であり得る。
一例では、第１のポリマー誘導体は、１つ以上のビニルスルホン基で修飾されたヒアルロン酸であってもよく、第２のポリマー誘導体は、１つ以上のチオール基で修飾されたヒアルロン酸であってもよく、第１のポリマー誘導体が第２のポリマー誘導体と反応してヒドロゲルを形成することが可能であり得る。
場合によっては、第１のポリマー誘導体は、１つ以上のチオール基（又は１つ以上のチオール基を含む分子）で修飾された本開示のポリマーであってもよく、第２のポリマー誘導体は、１つ以上のビニルスルホン基（又は１つ以上のビニルスルホン基を含む分子）で修飾された本開示のポリマーであってもよい。第１のポリマー誘導体が第２のポリマー誘導体と反応してヒドロゲルを形成することが可能であり得る。
一例では、第１のポリマー誘導体は、１つ以上のチオール基で修飾されたヒアルロン酸であってもよく、第２のポリマー誘導体は、１つ以上のビニルスルホン基で修飾されたヒアルロン酸であってもよく、第１のポリマー誘導体が第２のポリマー誘導体と反応してヒドロゲルを形成することが可能であり得る。
場合によっては、ポリマーは、約１０００００ダルトン～約５００００００ダルトン（例えば、約１２００００ダルトン～約５００００００ダルトン、約２０００００ダルトン～約５００００００ダルトン、約３０００００ダルトン～約５００００００ダルトン、約４０００００ダルトン～約５００００００ダルトン、約５０００００ダルトン～約５００００００ダルトン、約６０００００ダルトン～約５００００００ダルトン、約６７００００ダルトン～約５００００００ダルトン、約１００００００ダルトン～約５００００００ダルトン、約１５０００００ダルトン～約５００００００ダルトン、約２００００００ダルトン～約５００００００ダルトン、約２５０００００ダルトン～約５００００００ダルトン、約２６０００００ダルトン～約５００００００ダルトン、約３００００００ダルトン～約５００００００ダルトン、約３５０００００ダルトン～約５００００００ダルトン、約３６０００００ダルトン～約５００００００ダルトン、約２００００００ダルトン～約４００００００ダルトン、約２５０００００ダルトン～約３５０００００ダルトン、約２６０００００ダルトン～約３６０００００ダルトン、約１００００００ダルトン～約２６０００００ダルトン、約８０００００ダルトン～約２６０００００ダルトン、約７０００００ダルトン～約２５０００００ダルトン、約６７００００ダルトン～約２６０００００ダルトン、又は約６０００００ダルトン～約２５０００００ダルトン）の平均分子量を有し得る。
場合によっては、点眼組成物は、１つ以上のポリマーとは異なる架橋剤を更に含み得る。例えば、架橋剤は、小分子架橋剤、高分子架橋剤又はそれらの組合せであり得る。
場合によっては、架橋剤は、小分子架橋剤であり得る。小分子架橋剤は、アクリレート、マレイミド、ビニルスルホン、ヒドロキシスクシンイミド、アルデヒド、ケトン、多価カルボジイミド、カーボネート、ヨードアセチル、メルカプトニコチンアミド、キノン、チオール、アミン、及びそれらの任意の組合せから選択される基を有する分子を含み得る。
場合によっては、架橋剤は、高分子架橋剤であり得る。高分子架橋剤は、アクリレート、マレイミド、ビニルスルホン、ヒドロキシスクシンイミド、アルデヒド、ケトン、多価カルボジイミド、カーボネート、ヨードアセチル、メルカプトニコチンアミド、キノン、チオール、アミン、及びそれらの任意の組合せから選択される基を有する高分子を含み得る。
場合によっては、架橋剤は、ジチオトレイトール、ジシステイン、ＰＥＧ－ジチオール、４又は８アームＰＥＧチオール、ジビニルスルホン、ビス（ビニルスルホニル）メタン、ＰＥＧ－ＶＳ及び４又は８アームＰＥＧＶＳからなる群から選択され得る。
特定の例では、ポリマーは、１つ以上のビニルスルホン基で修飾されたヒアルロン酸（例えば、ＨＡ－ＶＳ）である。架橋剤は、多価チオール小分子、例えば、ＤＴＴ、ジシステイン等、又はチオールで官能化された末端基を有する高分子、例えば、ＰＥＧ－ジチオール又は４若しくは８アームＰＥＧチオールである。或る特定の反応条件が満たされるときにＨＡ－ＶＳを架橋剤と反応させることにより、ＨＡ－ＶＳヒドロゲル－架橋剤型ヒドロゲルが形成され得る。
特定の例では、ポリマーは、１つ以上のチオール基で修飾されたヒアルロン酸（例えば、ＨＡ－ＳＨ）である。架橋剤は、多価ビニルスルホン小分子、例えば、ＤＶＳ、ビス（ビニルスルホニル）メタン等、又はＶＳで官能化された末端基を有する高分子、例えば、ＰＥＧ－ＶＳ又は４若しくは８アームＰＥＧＶＳである。或る特定の反応条件が満たされるときにＨＡ－ＳＨを架橋剤と反応させることにより、ＨＡ－ＳＨヒドロゲル－架橋剤型ヒドロゲルが形成される。
場合によっては、点眼組成物は、その中のポリマー（例えば、ヒドロゲル形成ポリマー）とは異なる架橋剤を一切含み得ない。例えば、本開示のポリマー（例えば、ヒドロゲル形成ポリマー）は、これらの間で化学的及び／又は物理的な架橋を形成することができ、点眼組成物中には追加の架橋剤は含まれないこととなる。幾つかの実施形態では、点眼組成物は、小分子架橋剤を一切含まない。
点眼組成物は、リン酸緩衝液を含み得る。例えば、リン酸緩衝液は、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）であり得る。
点眼組成物は、約３．５～約９．０（例えば、約４．０～約９．０、約４．５～約９．０、約５．０～約９．０、約５．５～約９．０、約６．０～約９．０、約６．５～約９．０、約７．０～約９．０、約７．５～約９．０、約８．０～約９．０、約８．５～約９．０、約７．０～約７．８又は約７．４）のｐＨを有し得る。
場合によっては、点眼組成物は生体適合性であり得る。例えば、点眼組成物は、生物学的（生体）組織又は生物学的（生体）系において、重大な毒性、損傷、又は免疫学的拒絶反応を示さない。
本開示では、点眼組成物は、以下の方法、すなわち、少なくとも第１のポリマー誘導体と第２のポリマー誘導体とを含み、第１のポリマー誘導体が第１の修飾を含み、第２のポリマー誘導体が第２の修飾を含み、第１の修飾が第２の修飾とは異なる組成物を準備することによって作製され得て、第１のポリマー誘導体は第２のポリマー誘導体と反応してヒドロゲルを形成することができる。上記方法は、上記組成物をヒドロゲルの形成を可能にする条件に曝露することを更に含み得る。
幾つかの実施形態では、上記曝露は、上記組成物を約３０℃～約４５℃で（例えば、約３２℃～約４０℃で、約３５℃～約４０℃で、例えば、約３７℃で）インキュベートすることを含む。
場合によっては、上記方法は、上記組成物中のポリマーを架橋させて、本開示の点眼組成物中に含まれるヒドロゲルを作製することを含み得る。例えば、ヒドロゲルの形成を可能にする条件は、上記組成物中のポリマーの架橋も可能にし得る。場合によっては、架橋は、組成物中のポリマーを約２０℃～約５０℃、約２５℃～約５０℃、約３０℃～約５０℃、約３１℃～約５０℃、約３２℃～約５０℃、約３３℃～約５０℃、約３４℃～約５０℃、約３５℃～約５０℃、約３６℃～約５０℃、約３７℃～約５０℃、約３８℃～約５０℃、約３９℃～約５０℃、約４０℃～約５０℃又は約４５℃～約５０℃でインキュベートすることを含み得る。幾つかの実施形態では、架橋は、組成物中のポリマーを約３０℃～約４０℃、例えば約３５℃～約３９℃、例えば約３７℃の温度でインキュベートすることを含む。場合によっては、架橋は、組成物中のポリマーを少なくとも約１時間、例えば少なくとも約２時間、少なくとも約３時間、少なくとも約４時間、少なくとも約５時間、少なくとも約６時間、少なくとも約７時間、少なくとも約８時間、少なくとも約９時間、少なくとも約９．５時間、少なくとも約１０時間、少なくとも約１０．５時間、少なくとも約１１時間、少なくとも約１２時間、少なくとも約１３時間、少なくとも約１４時間、少なくとも約１５時間、少なくとも約１６時間、少なくとも約１７時間、少なくとも約１８時間、少なくとも約１９時間、少なくとも約２０時間、少なくとも約２４時間、又はそれ以上インキュベートすることを含み得る。
例えば、方法は、１）第１のポリマー集団（又は第１のポリマー誘導体）及び第２のポリマー集団（又は第２のポリマー誘導体）（例えば、第１のポリマー集団中のポリマーは、１つ以上のビニルスルホン基で修飾されたヒアルロン酸を含んでいてもよく、第２のポリマー集団中のポリマーは、１つ以上のチオール基で修飾されたヒアルロン酸を含んでいてもよい）を水中で作製し、ｐＨを調整する（例えば、緩衝溶液を添加することによる）ことと、２）第１のポリマー集団（又は第１のポリマー誘導体）のポリマーと第２のポリマー集団（又は第２のポリマー誘導体）のポリマーとを事前に設定した比率で混合することと（組成物中のポリマーの濃度は、本開示において規定される通りである）、３）混合物を本開示によるヒドロゲルの形成を可能にする条件下でインキュベートすることとを含み得る。
場合によっては、点眼組成物は、人工涙液、コンタクトレンズ再湿潤剤、又は潤滑剤であり得る。
場合によっては、点眼組成物は、治療的活性剤、例えば、眼の障害又は病態を治療又は緩和する作用物質を更に含み得る。
別の態様では、本開示は、眼の障害又は病態の治療又は緩和を必要とする被験体における眼の障害又は病態を治療又は緩和する方法であって、上記被験体に有効量の本開示の点眼組成物を投与することを含む、方法に関する。
別の態様では、本開示は、眼の快適さの改善又は眼の乾燥の軽減を必要とする被験体における眼の快適さを改善する又は眼の乾燥を軽減する方法であって、上記被験体に有効量の点眼組成物を投与することを含む、方法に関する。
投与は、被験体の眼の領域上に又は領域へと点眼組成物の１滴以上の液滴を適用することを含み得る。場合によっては、上記方法は、有効量の点眼組成物を点眼ボトルから被験体の角膜表面へと絞り出すことによって点眼組成物を投与することを含み得る。
被験体は、人間及びイヌ、ウサギ又は他の動物等の非ヒト動物を含み得る。
別の態様では、本開示は、目の障害若しくは病態の治療若しくは緩和を必要とする被験体における眼の障害若しくは病態を治療若しくは緩和する、及び／又は眼の快適さの改善若しくは眼の乾燥の軽減を必要とする被験体における眼の快適さを改善する若しくは眼の乾燥を軽減する、点眼組成物に関する。
別の態様では、本開示は、眼の快適さを改善する若しくは眼の乾燥を軽減する及び／又は眼の障害若しくは病態を治療若しくは緩和する製品の製造における点眼組成物の使用に関する。
場合によっては、眼の障害又は病態は、ドライアイ症候群及びコンタクトレンズの不快感からなる群から選択される。
本開示の点眼組成物は、より長い作用時間、より良好な生体適合性、より長い貯蔵時間、及び／又は良好な臨床試験結果を伴う、作用物質（例えば、薬学的活性剤）のより良好な制御放出の優れた特性を有し得る。
以下の実施例は、当業者に本発明の製造方法及び使用方法の完全な開示及び説明を提供するために記載されており、本発明者らが自身の発明とみなす範囲を限定することを意図するものではなく、また以下の実験は行われる全て又は唯一の実験であることを表すことを意図するものでもない。使用される数値（例えば、量、温度等）に関して正確性を確保するための努力がなされたが、幾らかの実験誤差及び偏差を考慮しなくてはならない。特に明記しない限り、部は重量部であり、分子量は重量平均分子量であり、温度は摂氏度であり、圧力は大気圧又はほぼ大気圧である。標準の略語、例えばｋｂ、キロベース（複数の場合もある）；ｐｌ、ピコリットル（複数の場合もある）；ｓ又はｓｅｃ、秒（複数の場合もある）；ｍｉｎ、分（複数の場合もある）；ｈ又はｈｒ、時間（複数の場合もある）等が使用される場合もある。
実施例１ ＨＡサンプルの測定
１．１． ［η］の測定
［η］は、毛細管粘度計を用いて直接測定することができる。例えば、３つのＨＡサンプル、すなわちサンプルＡ、サンプルＢ及びサンプルＣをウベローデ粘度計によって測定した。これらのＨＡサンプルは、Bloomage Freda Biopharm Co. Ltd.（中国山東省）から購入した。ポリマーは、供給業者により欧州薬局方に従って測定された。表１にウベローデ粘度計によって測定されたサンプルＡ、サンプルＢ及びサンプルＣの固有粘度（［η］）を示す。
１．１． ［η］の測定
［η］は、毛細管粘度計を用いて直接測定することができる。例えば、３つのＨＡサンプル、すなわちサンプルＡ、サンプルＢ及びサンプルＣをウベローデ粘度計によって測定した。これらのＨＡサンプルは、Bloomage Freda Biopharm Co. Ltd.（中国山東省）から購入した。ポリマーは、供給業者により欧州薬局方に従って測定された。表１にウベローデ粘度計によって測定されたサンプルＡ、サンプルＢ及びサンプルＣの固有粘度（［η］）を示す。
１．２ ポリマーの分子量の推定
ポリマーの分子量（ＭＷ）を、ウベローデ粘度計によって測定された固有粘度値から、マーク－フウィンク－桜田の式：
［η］＝ＫＭ（ＭＷ）ａ
（式中、ＫＭ及びａ（マーク－フウィンク－桜田の指数）は、所与のポリマー－溶媒対についての定数である）を用いて算出した。
ポリマーの分子量（ＭＷ）を、ウベローデ粘度計によって測定された固有粘度値から、マーク－フウィンク－桜田の式：
［η］＝ＫＭ（ＭＷ）ａ
（式中、ＫＭ及びａ（マーク－フウィンク－桜田の指数）は、所与のポリマー－溶媒対についての定数である）を用いて算出した。
サンプルＡ、Ｂ及びＣのＭＷは、その結果、サンプルＡ、Ｂ及びＣについて２．６ＭＤａ、６７０ｋＤａ及び１２０ｋＤａであることが算出された。
実施例２ ポリマー誘導体の作製
２．１ ＨＡ－ＶＳの作製
ヒアルロン酸（ＨＡ）を、Yu and Chau（Biomacromolecules 2015, 16（1), 56-65）に記載されるようにペンダントＶＳで修飾した。簡潔に述べると、ＨＡを脱イオン水（ＤＩ水）に溶解した。濃度は、ＨＡの分子量（ＭＷ）に応じて１ｍｇ／ｍｌ～４０ｍｇ／ｍｌであった。高ＭＷ ＨＡ（例えば、ＭＷ＞５００ｋＤａ）では、濃度がより低く（例えば、１ｍｇ／ｍｌ～５ｍｇ／ｍｌ）、低ＭＷ ＨＡ（例えば、ＭＷ＜５００ｋＤａ）では、濃度がより高かった（例えば、５ｍｇ／ｍｌ～４０ｍｇ／ｍｌ）。
２．１ ＨＡ－ＶＳの作製
ヒアルロン酸（ＨＡ）を、Yu and Chau（Biomacromolecules 2015, 16（1), 56-65）に記載されるようにペンダントＶＳで修飾した。簡潔に述べると、ＨＡを脱イオン水（ＤＩ水）に溶解した。濃度は、ＨＡの分子量（ＭＷ）に応じて１ｍｇ／ｍｌ～４０ｍｇ／ｍｌであった。高ＭＷ ＨＡ（例えば、ＭＷ＞５００ｋＤａ）では、濃度がより低く（例えば、１ｍｇ／ｍｌ～５ｍｇ／ｍｌ）、低ＭＷ ＨＡ（例えば、ＭＷ＜５００ｋＤａ）では、濃度がより高かった（例えば、５ｍｇ／ｍｌ～４０ｍｇ／ｍｌ）。
完全な溶解後に、５Ｍ ＮａＯＨをポリマー溶液に０．１Ｍの最終濃度で滴加した。ジビニルスルホン（ＤＶＳ）を即座に激しく混合しながら添加した。代替的には、ＤＶＳを初めにＤＩ水に１ｍｇ（ＤＶＳ）／８ｍｌ（水）で溶解し、即座に激しく混合しているポリマーに添加した。ＤＶＳとＨＡのヒドロキシル基（ＯＨ）とのモル比は、少なくとも１．２５：１であった。低濃度のＨＡでは、モル比は６：１以上であった。反応時間は、標的修飾度（ＤＭ）に応じて選択した。所与の反応時間について、修飾度もＨＡ及びＤＶＳの両方の濃度、温度、並びに最終ＮａＯＨ濃度によって決まるものであった。
ＨＡサンプルＣ（分子量１２０ｋＤａ）では、ＨＡ濃度は２０ｍｇ／ｍｌであり、ＤＶＳとＨＡのＯＨとのモル比は１．５：１であり、ＨＡサンプルＢ（分子量６７０ｋＤａ）では、ＨＡ濃度は１０ｍｇ／ｍｌであり、ＤＶＳとＨＡのＯＨとのモル比は約３：１であり、ＨＡサンプルＡ（分子量２．６ＭＤａ）では、ＨＡ濃度は２．５ｍｇ／ｍｌであり、ＤＶＳとＨＡのＯＨとのモル比は約６：１であった。
反応を６Ｍ ＨＣｌの添加によって停止させた。ポリマーを、透析袋を用いた膜分離、又はＤＩ水（ｐＨ約５．５）若しくはＨＣｌによって調整したｐＨ約４の酸性ＤＩ水に対するタンジェンシャルフロー濾過によって精製した。精製したポリマーを溶液として４℃で保管した。修飾度（ＤＭ）の測定のために、ＨＡ－ＶＳを凍結乾燥し、１ＨＮＭＲによって測定した。
２．２ ＨＡ－ＳＨの作製
ヒアルロン酸（ＨＡ）を、Yu and Chau（Biomacromolecules 2015, 16（1), 56-65に記載されるようにペンダントＳＨ基で修飾した。簡潔に述べると、ＨＡを初めにＨＡ－ＶＳへと修飾した（実施例２．１に記載の通り）。ＨＡ－ＶＳ溶液をＮ２で少なくとも２０分間パージした。ＶＳ基の１０倍モル過剰又は０．０５Ｍ ＤＴＴ溶液を作製するのに必要とされる量のジチオトレイトール（ＤＴＴ）（どちらのＤＴＴ濃度が高いかによる）を水（ｐＨ約５．５）に約４００ｍｇ／ｍｌで溶解し、Ｎ２で少なくとも５分間パージし、ＨＡ－ＶＳ溶液に添加した。ＨＡ－ＶＳ／ＤＴＴ溶液のｐＨは、およそ４であり、系をＮ２でパージし続けた。その後、ＨＡ－ＶＳの容量の１／１０の０．５Ｍリン酸緩衝液（ＰＢ）をＮ２で少なくとも５分間パージし、ＨＡ－ＶＳ／ＤＴＴ溶液に添加した。反応を少なくとも２５分間行った。反応を、１Ｍ ＨＣｌを添加してｐＨを３．５～４．５まで低下させることによって停止した。ポリマーを、透析袋を用いた膜分離、又はＤＩ水若しくはＨＣｌによって調整したｐＨ４のＤＩ水に対するタンジェンシャルフロー濾過によって精製した。精製したポリマーを溶液として４℃で保管した。修飾度（ＤＭ）を１ＨＮＭＲ及びエルマンアッセイ（Ellmans' assay）によってＨＡ－ＳＨについて決定した。
ヒアルロン酸（ＨＡ）を、Yu and Chau（Biomacromolecules 2015, 16（1), 56-65に記載されるようにペンダントＳＨ基で修飾した。簡潔に述べると、ＨＡを初めにＨＡ－ＶＳへと修飾した（実施例２．１に記載の通り）。ＨＡ－ＶＳ溶液をＮ２で少なくとも２０分間パージした。ＶＳ基の１０倍モル過剰又は０．０５Ｍ ＤＴＴ溶液を作製するのに必要とされる量のジチオトレイトール（ＤＴＴ）（どちらのＤＴＴ濃度が高いかによる）を水（ｐＨ約５．５）に約４００ｍｇ／ｍｌで溶解し、Ｎ２で少なくとも５分間パージし、ＨＡ－ＶＳ溶液に添加した。ＨＡ－ＶＳ／ＤＴＴ溶液のｐＨは、およそ４であり、系をＮ２でパージし続けた。その後、ＨＡ－ＶＳの容量の１／１０の０．５Ｍリン酸緩衝液（ＰＢ）をＮ２で少なくとも５分間パージし、ＨＡ－ＶＳ／ＤＴＴ溶液に添加した。反応を少なくとも２５分間行った。反応を、１Ｍ ＨＣｌを添加してｐＨを３．５～４．５まで低下させることによって停止した。ポリマーを、透析袋を用いた膜分離、又はＤＩ水若しくはＨＣｌによって調整したｐＨ４のＤＩ水に対するタンジェンシャルフロー濾過によって精製した。精製したポリマーを溶液として４℃で保管した。修飾度（ＤＭ）を１ＨＮＭＲ及びエルマンアッセイ（Ellmans' assay）によってＨＡ－ＳＨについて決定した。
ビニルスルホン化ヒアルロン酸（ＨＡ－ＶＳ）の合成を図１に示した。また、チオール化ヒアルロン酸（ＨＡ－ＳＨ）を図２に従って合成した。
実施例３ ヒドロゲル形成
３．１． ＨＡ－ＶＳ／ＨＡ－ＳＨ系ポリマー－ポリマー型ヒドロゲルの形成
ＨＡ－ＶＳ及びＨＡ－ＳＨの濃度を初めに決定した。既知の容量のポリマー溶液を凍結乾燥し、ポリマーの乾燥重量を測定した。乾燥ポリマーは、正確な測定を確実にするには少なくとも４ｍｇであった。代替的には、ポリマー濃度を以前に記載のようにＣＴＡＢアッセイによって測定した（Oueslati et al., CTAB turbidimetric method for assaying hyaluronic acid in complex environments and under cross-linked form, Carbohydrate Polymers, 2014）。次いで、既知の濃度のＨＡ－ＶＳ及びＨＡ－ＳＨを０．５Ｍ ＰＢの添加によってｐＨ７．４に調整した。ＰＢの最終濃度は約０．０２Ｍ～０．０５Ｍであった。次いで、２５％ＮａＣｌを用いてオスモル濃度を調整した。次いで、ポリマーを様々な標的体積比及び質量比で混合し、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）を添加することによって標的濃度に調整した。
３．１． ＨＡ－ＶＳ／ＨＡ－ＳＨ系ポリマー－ポリマー型ヒドロゲルの形成
ＨＡ－ＶＳ及びＨＡ－ＳＨの濃度を初めに決定した。既知の容量のポリマー溶液を凍結乾燥し、ポリマーの乾燥重量を測定した。乾燥ポリマーは、正確な測定を確実にするには少なくとも４ｍｇであった。代替的には、ポリマー濃度を以前に記載のようにＣＴＡＢアッセイによって測定した（Oueslati et al., CTAB turbidimetric method for assaying hyaluronic acid in complex environments and under cross-linked form, Carbohydrate Polymers, 2014）。次いで、既知の濃度のＨＡ－ＶＳ及びＨＡ－ＳＨを０．５Ｍ ＰＢの添加によってｐＨ７．４に調整した。ＰＢの最終濃度は約０．０２Ｍ～０．０５Ｍであった。次いで、２５％ＮａＣｌを用いてオスモル濃度を調整した。次いで、ポリマーを様々な標的体積比及び質量比で混合し、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）を添加することによって標的濃度に調整した。
ポリマーをヒドロゲル形成のために３７℃で少なくとも１０時間インキュベートした。ヒドロゲル形成反応を図３に示す。
約２．６ＭＤａの平均分子量を有し、約３９．２ｄＬ／ｇの固有粘度［η］（ウベローデ粘度計によって測定される）を有するＨＡポリマーについて、本開示のＨＡ－ＶＳ／ＨＡ－ＳＨ系ポリマー－ポリマー型ヒドロゲルの形成のためのＨＡポリマー（ＨＡ－ＳＨ及びＨＡ－ＶＳの両方を含む）の濃度は、約０．４ｍｇ／ｍｌと低くすることができる（すなわち、ヒドロゲル中の含水率は約９９．９６％超である）。
本開示では、ＨＡ－ＳＨ／ＨＡ－ＶＳポリマー－ポリマー型ヒドロゲルのサンプルＡ１、Ａ２、Ａ３、Ａ４、Ａ５、Ａ６、Ａ７、Ａ８及びＡ９を、実施例１．１におけるサンプルＡのＨＡポリマー（約２．６ＭＤａの平均分子量及び約３９．２ｄＬ／ｇの固有粘度［η］を有する）に基づいて作製した。サンプルＡ１、Ａ２、Ａ３及びＡ４については、ヒドロゲル形成ポリマーのＣＴ（例えば、ＨＡ－ＶＳ及びＨＡ－ＳＨの全濃度）は、それぞれ約１．２ｍｇ／ｍｌ、０．８ｍｇ／ｍｌ、０．５ｍｇ／ｍｌ及び０．２７ｍｇ／ｍｌであり、ＨＡ－ＶＳ及びＨＡ－ＳＨのＤＭは、それぞれ約１０％であり、ＨＡ－ＶＳとＨＡ－ＳＨとのモル比及び質量比は１：１であった。サンプルＡ５については、ＨＡ－ＶＳとＨＡ－ＳＨとを１：１のＤＭ比及び１：１の質量比で混合することによってヒドロゲルを形成し、組成物中のヒドロゲル形成ポリマーの全濃度ＣＴは、約０．５ｍｇ／ｍｌであり、ＨＡ－ＶＳ及びＨＡ－ＳＨのＤＭは、それぞれ約２０％であった。サンプルＡ６については、ＨＡ－ＶＳ（８％のＤＭ）とＨＡ－ＳＨ（８％のＤＭ）とを１：１のＤＭ比及び１：１の質量比で混合することによってヒドロゲルを形成し、組成物中のヒドロゲル形成ポリマーの全濃度ＣＴは、約０．４５ｍｇ／ｍｌであった。サンプルＡ７については、ＨＡ－ＶＳ（３０％のＤＭ）とＨＡ－ＳＨ（３０％のＤＭ）とを１：１のＤＭ比及び１：１の質量比で混合することによってヒドロゲルを形成し、組成物中のヒドロゲル形成ポリマーの全濃度ＣＴは、約０．４ｍｇ／ｍｌであった。サンプルＡ８については、ＨＡ－ＶＳ（約１０％のＤＭ及び０．６ｍｇ／ｍｌ）とＨＡ－ＳＨ（約５％のＤＭ及び０．３ｍｇ／ｍｌ）とを混合することによってヒドロゲルを形成した。ＣＴは約０．９ｍｇ／ｍｌである。サンプルＡ９については、ＨＡ－ＶＳ（１５％のＤＭ及び０．６ｍｇ／ｍｌ）とＨＡ－ＳＨ（１０％のＤＭ及び０．３ｍｇ／ｍｌ）とを混合することによってヒドロゲルを形成した。ＣＴは約０．９ｍｇ／ｍｌである。
ＨＡ－ＳＨ／ＨＡ－ＶＳポリマー－ポリマー型ヒドロゲルのサンプルＢ１及びＢ２を、実施例１．１におけるサンプルＢのＨＡポリマー（約６７０ｋＤａの平均分子量及び約１４ｄＬ／ｇの固有粘度［η］を有する）に基づいて作製した。サンプルＢ１及びＢ２につては、ＨＡポリマー（ＨＡ－ＳＨ及びＨＡ－ＶＳの両方を含む）のＣＴは、それぞれ約１．８ｍｇ／ｍｌ及び１．０８ｍｇ／ｍｌであった。ＨＡ－ＳＨ及びＨＡ－ＶＳのＤＭは３０％であり、ＨＡ－ＳＨとＨＡ－ＶＳとのモル比及び質量比は１：１であった。
ＨＡ－ＳＨ／ＨＡ－ＶＳポリマー－ポリマー型ヒドロゲルのサンプルＣ１を、実施例１．１におけるサンプルＣのＨＡポリマー（約１２０ｋＤａの平均分子量及び約３．７ｄＬ／ｇの固有粘度［η］を有する）に基づいて作製した。サンプルＣ１については、ＨＡポリマー（ＨＡ－ＳＨ及びＨＡ－ＶＳの両方を含む）のＣＴは、約３．９６ｍｇ／ｍｌであった。ＨＡ－ＳＨ及びＨＡ－ＶＳのＤＭは３０％であり、ＨＡ－ＳＨとＨＡ－ＶＳとのモル比及び質量比は１：１であった。
３．２ ＨＡ－ＳＨ系ポリマー－ポリマー型ヒドロゲルの形成
ＨＡポリマーのサンプルＡ（約２．６ＭＤａの重量平均分子量及び約３９．２ｄＬ／ｇの固有粘度［η］を有する）を使用した。ＨＡ－ＳＨを実施例２．２に従って作製した。ＨＡ－ＳＨを０．５Ｍ ＰＢの添加によってｐＨ７．４に調整した。ＰＢの最終濃度は、約０．０２Ｍ～０．０５Ｍであった。ポリマーのＤＭは約１０％であった。次いで、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）を添加することによってポリマーを標的濃度に調整した。ＨＡ－ＳＨポリマー－ポリマー型ヒドロゲルのサンプルＦを約１．７ｍｇ／ｍｌのＣＴで作製した。
ＨＡポリマーのサンプルＡ（約２．６ＭＤａの重量平均分子量及び約３９．２ｄＬ／ｇの固有粘度［η］を有する）を使用した。ＨＡ－ＳＨを実施例２．２に従って作製した。ＨＡ－ＳＨを０．５Ｍ ＰＢの添加によってｐＨ７．４に調整した。ＰＢの最終濃度は、約０．０２Ｍ～０．０５Ｍであった。ポリマーのＤＭは約１０％であった。次いで、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）を添加することによってポリマーを標的濃度に調整した。ＨＡ－ＳＨポリマー－ポリマー型ヒドロゲルのサンプルＦを約１．７ｍｇ／ｍｌのＣＴで作製した。
ポリマーをヒドロゲル形成のために３７℃で少なくとも１０時間インキュベートした。
３．３． ポリマー－小分子架橋剤型ヒドロゲルの形成
ＤＴＴをＨＡ－ＶＳ（ＨＡ－ＶＳは、サンプルＡのＨＡポリマーに基づいて作製した）と３：１のモル比（ＤＴＴ：ＶＳ）で混合した。ヒドロゲルが３０分後に形成された。ヒドロゲルを二重脱イオン水（double deionized water）に対して２日間透析し、回収した。ＨＡ－ＶＳは、約１．９ＭＤａの重量平均分子量、約２４．５ｄＬ／ｇの固有粘度［η］及び約３．８ｍｇ／ｍｌの全ポリマー（例えば、ヒドロゲル形成ポリマー）濃度ＣＴを有する。ＨＡ－ＶＳのＤＭは２０％であった。得られたＨＡ－ＳＨ／ＤＴＴヒドロゲルをＨＡ－ＳＨ／ＤＴＴヒドロゲルのサンプルＨと名付けた。
ＤＴＴをＨＡ－ＶＳ（ＨＡ－ＶＳは、サンプルＡのＨＡポリマーに基づいて作製した）と３：１のモル比（ＤＴＴ：ＶＳ）で混合した。ヒドロゲルが３０分後に形成された。ヒドロゲルを二重脱イオン水（double deionized water）に対して２日間透析し、回収した。ＨＡ－ＶＳは、約１．９ＭＤａの重量平均分子量、約２４．５ｄＬ／ｇの固有粘度［η］及び約３．８ｍｇ／ｍｌの全ポリマー（例えば、ヒドロゲル形成ポリマー）濃度ＣＴを有する。ＨＡ－ＶＳのＤＭは２０％であった。得られたＨＡ－ＳＨ／ＤＴＴヒドロゲルをＨＡ－ＳＨ／ＤＴＴヒドロゲルのサンプルＨと名付けた。
実施例４ ヒドロゲルの特性評価
４．１ 作製されたヒドロゲルサンプルの弾性率
（１）測定用のヒドロゲルサンプルの作製
ヒドロゲル形成ポリマーを実施例３に記載のように混合した後、混合したポリマーを５０ｍｍ（Ｄ）×１ｍｍ（Ｈ）のモールド上に均一に塗布した。プレートをパラフィルムで覆うことによりモールドを金属プレートに密着させた。ポリマーの付いたモールドを加湿チャンバー内に入れ、ヒドロゲルを形成させた。ヒドロゲル形成のために、ポリマーを３７℃で２４時間維持した。ヒドロゲル（すなわち、ＨＡ－ＶＳ／ＨＡ－ＳＨ系ポリマー－ポリマー型ヒドロゲル）の形成後に、パラフィルム－モールド－ゲルの集合体全体を金属プレートから分離し、５０ｍｍプレートフィクスチャー（fixture）上に取り付けた。次いで、パラフィルム及び形成されたヒドロゲルをフィクスチャー上に残してモールドを取り外した。次いで、パラフィルムを下部プレートに固く巻き付けた。この一式をＤＭＡ装置（ＡＲＥＳレオメーター、TA Instruments、デラウェア州ニューキャッスル）に導入し、直径５０ｍｍの平行プレートを用いて機械的特性を測定した。
４．１ 作製されたヒドロゲルサンプルの弾性率
（１）測定用のヒドロゲルサンプルの作製
ヒドロゲル形成ポリマーを実施例３に記載のように混合した後、混合したポリマーを５０ｍｍ（Ｄ）×１ｍｍ（Ｈ）のモールド上に均一に塗布した。プレートをパラフィルムで覆うことによりモールドを金属プレートに密着させた。ポリマーの付いたモールドを加湿チャンバー内に入れ、ヒドロゲルを形成させた。ヒドロゲル形成のために、ポリマーを３７℃で２４時間維持した。ヒドロゲル（すなわち、ＨＡ－ＶＳ／ＨＡ－ＳＨ系ポリマー－ポリマー型ヒドロゲル）の形成後に、パラフィルム－モールド－ゲルの集合体全体を金属プレートから分離し、５０ｍｍプレートフィクスチャー（fixture）上に取り付けた。次いで、パラフィルム及び形成されたヒドロゲルをフィクスチャー上に残してモールドを取り外した。次いで、パラフィルムを下部プレートに固く巻き付けた。この一式をＤＭＡ装置（ＡＲＥＳレオメーター、TA Instruments、デラウェア州ニューキャッスル）に導入し、直径５０ｍｍの平行プレートを用いて機械的特性を測定した。
代替的には、ヒドロゲル形成ポリマーを実施例３に記載のように混合した後、３７℃で少なくとも１０時間（例えば、指定のない限り２４時間）、遠心分離管内でインキュベートした。次いで、形成されたヒドロゲル（すなわち、ＨＡ－ＶＳ／ＨＡ－ＳＨ系ポリマー－ポリマー型ヒドロゲル）をコーンプレート、二重ギャップ又は同心円筒フィクスチャーの下部プレート又は下部バケットに導入し、機械的特性をAnton Paarのレオメーターによって測定した。
（２）ＨＡ－ＶＳ／ＨＡ－ＳＨ系ポリマー－ポリマーヒドロゲルの弾性率
ＨＡポリマーの３つのサンプル（すなわち、上記実施例１．１及び１．２に記載のサンプルＡ、Ｂ及びＣ）を実施例２．１及び２．２に従って修飾し、修飾ポリマーを使用して、実施例３．１に従って本開示のヒドロゲルを形成し、形成されたヒドロゲルを実施例４．１に従って測定した。ポリマーがポリマー溶液として残留するのではなくヒドロゲルを形成するかを調べるために、ＤＭＡ測定及び／又は直接観察（サンプルが水のように流れ、ＤＭＡ装置に取り付けることができないか否かを確かめるため）を用いた。ＤＭＡ測定については、線形粘弾性領域（linear viscoelastic region；ＬＶＲ）領域でのＧ’’値と比較して高いＧ’値（例えば、Ｇ’’／Ｇ’＜１）をヒドロゲル形成の指標として用いた。
ＨＡポリマーの３つのサンプル（すなわち、上記実施例１．１及び１．２に記載のサンプルＡ、Ｂ及びＣ）を実施例２．１及び２．２に従って修飾し、修飾ポリマーを使用して、実施例３．１に従って本開示のヒドロゲルを形成し、形成されたヒドロゲルを実施例４．１に従って測定した。ポリマーがポリマー溶液として残留するのではなくヒドロゲルを形成するかを調べるために、ＤＭＡ測定及び／又は直接観察（サンプルが水のように流れ、ＤＭＡ装置に取り付けることができないか否かを確かめるため）を用いた。ＤＭＡ測定については、線形粘弾性領域（linear viscoelastic region；ＬＶＲ）領域でのＧ’’値と比較して高いＧ’値（例えば、Ｇ’’／Ｇ’＜１）をヒドロゲル形成の指標として用いた。
結果を下記表２にまとめる。ゲルのＬＶＲ領域で機械的特性を測定した。本発明者らは、驚くべきことに、組成物中のヒドロゲル形成ポリマーの固有粘度［η］が比較的高く（例えば、少なくとも約３ｄＬ／ｇ、ウベローデ粘度計によって測定される）、組成物中のヒドロゲル形成ポリマー（例えば、ＨＡ－ＶＳ及びＨＡ－ＳＨ）の全濃度ＣＴが比較的低い（例えば、約５ｍｇ／ｍｌ未満、例えば１．２ｍｇ／ｍｌ、０．８ｍｇ／ｍｌ、０．５ｍｇ／ｍｌ、１．８ｍｇ／ｍｌ、１．０８ｍｇ／ｍｌ及び３．９６ｍｇ／ｍｌ）場合、ヒドロゲルのＧ’及びＧ’’によって示されるように、非常に柔らかいヒドロゲルが形成され得ることを見出した。Ｇ’及びＧ’’は１０．０Ｐａ以下であり、Ｇ’’はＧ’未満であり、ヒドロゲルの形成が示された。
図４に、実施例３．１に従って作製されたＨＡ－ＶＳ／ＨＡ－ＳＨ系ポリマー－ポリマー型ヒドロゲルのサンプルＡ１、Ａ２及びＡ３の弾性率（振動数掃引試験を用いた）を示すが、ヒドロゲルの弾性率は、Anton PaarのＭＣＲ５０２レオメーターにより、同心円二重ギャップフィクスチャーを用いて測定した。歪みは、全試験について１％であった。
図５に、Anton PaarのＭＣＲ５０２を使用し、同心円二重ギャップフィクスチャーを用いた、実施例３．１に従って作製されたＨＡ－ＶＳ／ＨＡ－ＳＨ系ポリマー－ポリマー型ヒドロゲルのサンプルＡ８の弾性率（歪み掃引試験を用いた）を示す。振動数は１ｒａｄ／ｓであった。ＨＡ－ＶＳ／ＨＡ－ＳＨ系ポリマー－ポリマー型ヒドロゲルのサンプルＡ８のＣＴは０．９ｍｇ／ｍｌであり、５ｍｇ／ｍｌよりも低かった。Ｇ’及びＧ’’の両方が１０．０Ｐａ以下であった。また、Ｇ’’はＧ’未満であり、ヒドロゲルの形成が示された。
図６Ａ及び図６Ｂに、Anton PaarのＭＣＲ３０２を使用し、５０ｍｍコーンプレートフィクスチャーを用いた、実施例３．１に従って作製されたＨＡ－ＶＳ／ＨＡ－ＳＨ系ポリマー－ポリマー型ヒドロゲルのサンプルＡ９の弾性率及び複素粘度（歪み及び振動数掃引試験を用いた）を示す。歪み掃引試験についての振動数は５ｒａｄ／ｓであり、振動数掃引試験についての歪みは５％であった。ＨＡ－ＶＳ／ＨＡ－ＳＨ系ポリマー－ポリマー型ヒドロゲルのサンプルＡ９のＣＴは０．９ｍｇ／ｍｌであり、５ｍｇ／ｍｌよりも低かった。Ｇ’及びＧ’’の両方が１０．０Ｐａ以下であった。また、Ｇ’’はＧ’未満であり、ヒドロゲルの形成が示された。
（３）ＨＡ－ＳＨポリマー－ポリマーヒドロゲルの弾性率
図７Ａ及び図７Ｂに、実施例３．２に従って作製された１０％ＤＭのＨＡ－ＳＨポリマー－ポリマー型ヒドロゲルのサンプルＦの歪み掃引試験及び振動数掃引試験を示す。図７において、Ｇ’、Ｇ’’及びＥｔａ＊は、それぞれ貯蔵弾性率、損失弾性率及び複素粘度を指す。ヒドロゲルは、Anton PaarのＭＣＲ ３０２レオメーターを使用し、５０ｍｍコーンプレートフィクスチャーを用いて測定した。歪み掃引試験では５ｒａｄ／ｓで測定し、振動数掃引試験では５％の歪みで測定した。ＨＡ－ＳＨポリマー－ポリマー型ヒドロゲルのサンプルＦのＣＴは１．７ｍｇ／ｍｌであり、５ｍｇ／ｍｌよりも低かった。Ｇ’及びＧ’’の両方が１０．０Ｐａ以下であった。また、Ｇ’’はＧ’未満であり、ヒドロゲルの形成が示された。
図７Ａ及び図７Ｂに、実施例３．２に従って作製された１０％ＤＭのＨＡ－ＳＨポリマー－ポリマー型ヒドロゲルのサンプルＦの歪み掃引試験及び振動数掃引試験を示す。図７において、Ｇ’、Ｇ’’及びＥｔａ＊は、それぞれ貯蔵弾性率、損失弾性率及び複素粘度を指す。ヒドロゲルは、Anton PaarのＭＣＲ ３０２レオメーターを使用し、５０ｍｍコーンプレートフィクスチャーを用いて測定した。歪み掃引試験では５ｒａｄ／ｓで測定し、振動数掃引試験では５％の歪みで測定した。ＨＡ－ＳＨポリマー－ポリマー型ヒドロゲルのサンプルＦのＣＴは１．７ｍｇ／ｍｌであり、５ｍｇ／ｍｌよりも低かった。Ｇ’及びＧ’’の両方が１０．０Ｐａ以下であった。また、Ｇ’’はＧ’未満であり、ヒドロゲルの形成が示された。
（４）ＨＡ－ＳＨポリマー－小分子架橋剤型ヒドロゲルの弾性率
図８Ａ及び図８Ｂに、実施例３．３に従って作製されたＨＡ－ＳＨ／ＤＴＴヒドロゲルのサンプルＨの歪み掃引試験及び振動数掃引試験を示す。歪み掃引試験では１ｒａｄ／ｓで測定し、振動数掃引試験では５％の歪みで測定した。ここで、Ｇ’、Ｇ’’及びＥｔａ＊は、それぞれ貯蔵弾性率、損失弾性率及び複素粘度を指す。ＨＡ－ＳＨ／ＤＴＴヒドロゲルのサンプルＨのＣＴは３．８ｍｇ／ｍｌであり、５ｍｇ／ｍｌよりも低かった。Ｇ’及びＧ’’の両方が１０．０Ｐａ以下であった。また、Ｇ’’はＧ’未満であり、ヒドロゲルの形成が示された。
図８Ａ及び図８Ｂに、実施例３．３に従って作製されたＨＡ－ＳＨ／ＤＴＴヒドロゲルのサンプルＨの歪み掃引試験及び振動数掃引試験を示す。歪み掃引試験では１ｒａｄ／ｓで測定し、振動数掃引試験では５％の歪みで測定した。ここで、Ｇ’、Ｇ’’及びＥｔａ＊は、それぞれ貯蔵弾性率、損失弾性率及び複素粘度を指す。ＨＡ－ＳＨ／ＤＴＴヒドロゲルのサンプルＨのＣＴは３．８ｍｇ／ｍｌであり、５ｍｇ／ｍｌよりも低かった。Ｇ’及びＧ’’の両方が１０．０Ｐａ以下であった。また、Ｇ’’はＧ’未満であり、ヒドロゲルの形成が示された。
上記の結果から、試験した全てのヒドロゲルについて、約０．１ｒａｄ／ｓ～約１０ｒａｄ／ｓの振動数での動的振動剪断試験において貯蔵弾性率（Ｇ’）がその対応する損失弾性率（Ｇ’’）よりも高く、Ｇ’の値が比較的一定であることが示され、材料が実際に粘性の溶液ではなく、ゲル（すなわち、非常に柔らかい固体状の架橋ネットワーク）であることが示される。
４．２ ヒドロゲルの降伏歪み
降伏歪みは、歪み掃引試験によって評価することができる（図５～図８）。例えば、図５及び図７の結果から、ヒドロゲルが低い降伏応力（約０．１Ｐａ～約１Ｐａ）と共に比較的高い降伏歪み（約３０％）を有することが示される。
降伏歪みは、歪み掃引試験によって評価することができる（図５～図８）。例えば、図５及び図７の結果から、ヒドロゲルが低い降伏応力（約０．１Ｐａ～約１Ｐａ）と共に比較的高い降伏歪み（約３０％）を有することが示される。
４．３ 本開示の眼用組成物を押し出すための所要力
この実施例では、実施例３．１に従って作製されたＨＡ－ＶＳ／ＨＡ－ＳＨ系ポリマー－ポリマー型ヒドロゲルのサンプルＡ５を使用して、本開示の眼用組成物を押し出すための所要力を試験した。
この実施例では、実施例３．１に従って作製されたＨＡ－ＶＳ／ＨＡ－ＳＨ系ポリマー－ポリマー型ヒドロゲルのサンプルＡ５を使用して、本開示の眼用組成物を押し出すための所要力を試験した。
市販の人工涙液（例えば、Ｒｅｆｒｅｓｈ Ｐｌｕｓ（商標）及びＴｅａｒｓ Ｎａｔｕｒａｌｅ Ｆｒｅｅ（商標））又は本開示の点眼組成物を、それぞれ、Ｔｅａｒｓ Ｎａｔｕｒａｌｅ Ｆｒｅｅ ０．６ｍｌの成形同時充填（ＢＦＳ）使い捨てボトル中に詰めた。本開示の人工涙液又は点眼組成物をボトルから絞り出すのに必要な圧縮力を、Ｉｎｓｔｒｏｎ ５５６７ Ｈ１５４０によって測定した。圧縮試験は１００Ｎの荷重で実施した。最初の液滴がボトルから絞り出されるまで力を増加させ、この時点で試験を直ちに停止した。それぞれのボトルから２番目の液滴及び３番目の液滴を絞り出すのに必要な力を同様に実施した。図９Ａ～図９Ｃは、それぞれ、Ｒｅｆｒｅｓｈ Ｐｌｕｓ（商標）、Ｔｅａｒｓ Ｎａｔｕｒａｌｅ Ｆｒｅｅ（商標）、及び本開示の点眼組成物の最初の液滴、２番目の液滴、及び３番目の液滴をボトルから絞り出すための所要力を示している。本開示の点眼組成物をＴｅａｒｓ Ｎａｔｕｒａｌｅ Ｆｒｅｅ ０．６ｍｌの成形同時充填（ＢＦＳ）使い捨てボトルから絞り出す押出力は約７Ｎ～１６Ｎであることが分かった。これらの結果は、本開示の点眼組成物を押し出すのに必要な押出力が、市販の人工涙液を押し出すのに必要な押出力と同様であることを示している。
４．４ ヒドロゲルの降伏からの回復
（１）歪み掃引試験
低い降伏点から、本開示のヒドロゲルが機械的に不安定であることが予測され得た。驚くべきことに、本開示のヒドロゲルの機械的特性は、破壊の前後で同様であり得る。本実施例では、実施例３．１に従って作製されたＨＡ－ＶＳ／ＨＡ－ＳＨ系ポリマー－ポリマー型ヒドロゲルのサンプルＡ３を使用して、歪み掃引試験によるヒドロゲルの降伏からの回復を試験した。
（１）歪み掃引試験
低い降伏点から、本開示のヒドロゲルが機械的に不安定であることが予測され得た。驚くべきことに、本開示のヒドロゲルの機械的特性は、破壊の前後で同様であり得る。本実施例では、実施例３．１に従って作製されたＨＡ－ＶＳ／ＨＡ－ＳＨ系ポリマー－ポリマー型ヒドロゲルのサンプルＡ３を使用して、歪み掃引試験によるヒドロゲルの降伏からの回復を試験した。
ＨＡ－ＶＳ／ＨＡ－ＳＨ系ポリマー－ポリマー型ヒドロゲルのサンプルＡ３を、Anton PaarのＭＣＲ５０２上の同心円二重ギャップフィクスチャーに導入した。歪み掃引試験を０％から５０００％まで行い、ヒドロゲルを破壊する前後に、時間掃引試験（１％の歪み及び１ｒａｄ／ｓ）を行い、ヒドロゲルの弾性率を評価した。ヒドロゲルを各測定の前に約５分間平衡化した。破壊前のＧ’及びＧ’’は約０．１１Ｐａ及び０．０２Ｐａであり、破壊後は０．１１Ｐａ及び０．０５Ｐａであった。結果から、弾性率が破壊の前後でほぼ同一であったことが示される。
（２）現実のシナリオをシミュレートするための点眼ボトルを通じた押出
また、現実のシナリオをシミュレートするために、点眼ボトルを通じた押出によりヒドロゲルを機械的に破壊した。この実施例では、最悪なシナリオを提示するためにNemeraの特別な多回投与用点眼ボトル（Ｐｕｒｅｆｌｏｗ １５００）を使用した。特殊なデザインのボトルのキャップは、点眼薬がボトルから外側に移動するための、通常のボトルと比較して狭い長く蛇行した流路を有する。ヒドロゲルの降伏点は非常に低いため、押出の間に起こる大きな変形によりヒドロゲル構造が破壊されると予想される。また、この実施例では、以下のヒドロゲルを使用した：（１）実施例３．１に従って作製されたＨＡ－ＶＳ／ＨＡ－ＳＨ系ポリマー－ポリマー型ヒドロゲルのサンプルＡ３、（２）実施例３．１に従って作製されたＨＡ－ＳＨ／ＨＡ－ＶＳポリマー－ポリマー型ヒドロゲルサンプルのサンプルＥ。
また、現実のシナリオをシミュレートするために、点眼ボトルを通じた押出によりヒドロゲルを機械的に破壊した。この実施例では、最悪なシナリオを提示するためにNemeraの特別な多回投与用点眼ボトル（Ｐｕｒｅｆｌｏｗ １５００）を使用した。特殊なデザインのボトルのキャップは、点眼薬がボトルから外側に移動するための、通常のボトルと比較して狭い長く蛇行した流路を有する。ヒドロゲルの降伏点は非常に低いため、押出の間に起こる大きな変形によりヒドロゲル構造が破壊されると予想される。また、この実施例では、以下のヒドロゲルを使用した：（１）実施例３．１に従って作製されたＨＡ－ＶＳ／ＨＡ－ＳＨ系ポリマー－ポリマー型ヒドロゲルのサンプルＡ３、（２）実施例３．１に従って作製されたＨＡ－ＳＨ／ＨＡ－ＶＳポリマー－ポリマー型ヒドロゲルサンプルのサンプルＥ。
押出による破壊がヒドロゲルの機械的特性に及ぼす影響を評価するために、ＨＡ－ＳＨ／ＨＡ－ＶＳポリマー－ポリマー型ヒドロゲルサンプルのサンプルＡ３及びサンプルＥを、点眼ボトル（Ｐｕｒｅｆｌｏｗ １５００）から１滴ずつ二重ギャップフィクスチャーへと絞り出し、機械的特性を、Anton Paarのレオメーターによって測定した。ＨＡ－ＳＨ／ＨＡ－ＶＳポリマー－ポリマー型ヒドロゲルサンプルのサンプルＡ３及びサンプルＥの結果は、それぞれ図１０Ａ及び図１０Ｂに示される。「押出前」は、ヒドロゲルの弾性率が直接測定されたことを示している。「押出後」は、ヒドロゲルが点眼ボトルから押し出された後にヒドロゲルの弾性率が測定されたことを示している。これらの結果は、本開示のヒドロゲルをボトルから絞り出しても、その弾性率は大幅に変化しないことを示している。
４．５ ヒドロゲルの複素粘度
図６～図８に示されるヒドロゲルの振動数掃引試験から、ヒドロゲルの複素粘度が比較的遅い振動数で小さくなる（例えば、約１０ｒａｄ／ｓ～１００ｒａｄ／ｓの振動数でＥｔａ＊＜０．０１）ことが示される。瞬目の剪断速度は約５０ｓ－１～１２００ｓ－１と高いので（Jossic et al., The fluid mechanics of shear-thinning tear substitutes, J. Non-Newtonian Fluid Mech. 161 (2009) 1-9）、これらのデータは、本開示の実施例に従って作製されたヒドロゲルが、眼に適用された後に瞬目によって容易に展延することを示している。
図６～図８に示されるヒドロゲルの振動数掃引試験から、ヒドロゲルの複素粘度が比較的遅い振動数で小さくなる（例えば、約１０ｒａｄ／ｓ～１００ｒａｄ／ｓの振動数でＥｔａ＊＜０．０１）ことが示される。瞬目の剪断速度は約５０ｓ－１～１２００ｓ－１と高いので（Jossic et al., The fluid mechanics of shear-thinning tear substitutes, J. Non-Newtonian Fluid Mech. 161 (2009) 1-9）、これらのデータは、本開示の実施例に従って作製されたヒドロゲルが、眼に適用された後に瞬目によって容易に展延することを示している。
実施例５ 本開示の点眼組成物の角膜前保持
５．１． ＶＳ反応性色素の合成
本開示のヒドロゲルを、蛍光色素を本開示のポリマー上にタグ付けすることによって蛍光性にした。チオール修飾フルオレセインを色素の例として使用した。色素は、ＨＯＢＴ／ＨＢＴＵによって触媒されるＤＭＦ中でのアミノフルオレセインとＮ－アセチル－Ｓ－トリチル－Ｌ－システインとの反応によって作製した。生成物をエーテル中で３回沈殿させ、真空乾燥させた。乾燥させた生成物をＴＦＡ：Ｈ２Ｏ：ＴＩＰＳの混合物（１８：１：１）で１時間脱保護した。最終生成物をエーテル中で沈殿させ、真空乾燥させ、４℃で保管した。反応の進行を質量分析によって調べた。
５．１． ＶＳ反応性色素の合成
本開示のヒドロゲルを、蛍光色素を本開示のポリマー上にタグ付けすることによって蛍光性にした。チオール修飾フルオレセインを色素の例として使用した。色素は、ＨＯＢＴ／ＨＢＴＵによって触媒されるＤＭＦ中でのアミノフルオレセインとＮ－アセチル－Ｓ－トリチル－Ｌ－システインとの反応によって作製した。生成物をエーテル中で３回沈殿させ、真空乾燥させた。乾燥させた生成物をＴＦＡ：Ｈ２Ｏ：ＴＩＰＳの混合物（１８：１：１）で１時間脱保護した。最終生成物をエーテル中で沈殿させ、真空乾燥させ、４℃で保管した。反応の進行を質量分析によって調べた。
５．２． 蛍光色素コンジュゲーション
一例では、ＨＡ－ＶＳを、ｐＨ８．８の１．５Ｍ Ｔｒｉｓ緩衝液を０．１５Ｍの最終緩衝液濃度まで添加することによってｐＨ８．８に調整した。溶液をＮ２で少なくとも３０分間パージした。その後、実施例５．１に従って作製された又はGL Biochem（Shanghai） Ltd.から購入したビニルスルホン反応性色素（リシン側鎖のアミノ基がフルオレセインとコンジュゲートし、アミノ末端基がアミドでキャップされたシステイン－リシンジペプチド、すなわちＡＣ－Ｃｙｓ－Ｌｙｓ（ＦＡＭ））をＴｒｉｓ緩衝液に溶解し、ポリマーに添加して１２時間反応させた。コンジュゲーション効率が高くなく、反応により全てのＶＳ基が覆われないため、色素とＶＳ基とのモル比は、低ＤＭ（例えば、ＤＭ＝８％）ポリマーについては最大１：１とすることができる。理想的には、ＶＳ基の少なくとも８０％が反応後に色素で覆われないものとする。次いで、ポリマーを、ＨＣｌを用いてｐＨ約４に調整したＤＩ水に対して透析した。精製した蛍光標識ポリマーの保管条件は、ＨＡ－ＶＳと同じであった。次いで、蛍光標識ＨＡ－ＶＳをＨＡ－ＳＨと混合し、ヒドロゲルを形成させた（実施例３に記載の通り）。
一例では、ＨＡ－ＶＳを、ｐＨ８．８の１．５Ｍ Ｔｒｉｓ緩衝液を０．１５Ｍの最終緩衝液濃度まで添加することによってｐＨ８．８に調整した。溶液をＮ２で少なくとも３０分間パージした。その後、実施例５．１に従って作製された又はGL Biochem（Shanghai） Ltd.から購入したビニルスルホン反応性色素（リシン側鎖のアミノ基がフルオレセインとコンジュゲートし、アミノ末端基がアミドでキャップされたシステイン－リシンジペプチド、すなわちＡＣ－Ｃｙｓ－Ｌｙｓ（ＦＡＭ））をＴｒｉｓ緩衝液に溶解し、ポリマーに添加して１２時間反応させた。コンジュゲーション効率が高くなく、反応により全てのＶＳ基が覆われないため、色素とＶＳ基とのモル比は、低ＤＭ（例えば、ＤＭ＝８％）ポリマーについては最大１：１とすることができる。理想的には、ＶＳ基の少なくとも８０％が反応後に色素で覆われないものとする。次いで、ポリマーを、ＨＣｌを用いてｐＨ約４に調整したＤＩ水に対して透析した。精製した蛍光標識ポリマーの保管条件は、ＨＡ－ＶＳと同じであった。次いで、蛍光標識ＨＡ－ＶＳをＨＡ－ＳＨと混合し、ヒドロゲルを形成させた（実施例３に記載の通り）。
５．３ 動物の準備
ｉｎ ｖｉｖｏでの角膜前保持研究のために１．５歳のＮＺＷウサギを使用した。ウサギを、最初に２％キシラジン／１０％ケタミンの１：１の比率の混合物の筋肉内注射（０．８ｍＬ／ｋｇ（体重））によって麻酔した。実験を１時間より長く行う場合に、ウサギを更に、キシラジン／ケタミン混合物の毎時０．６ｍＬ／ｋｇ（体重）での注射によって麻酔した。
ｉｎ ｖｉｖｏでの角膜前保持研究のために１．５歳のＮＺＷウサギを使用した。ウサギを、最初に２％キシラジン／１０％ケタミンの１：１の比率の混合物の筋肉内注射（０．８ｍＬ／ｋｇ（体重））によって麻酔した。実験を１時間より長く行う場合に、ウサギを更に、キシラジン／ケタミン混合物の毎時０．６ｍＬ／ｋｇ（体重）での注射によって麻酔した。
５．４． 蛍光画像化システム
図１１に示されるように、画像化システムは、励起モジュール（Ａ、Ｂ、Ｃ及びＤを含む）及び発光検出モジュール（Ｅを含む）を備える。レンズを除く全ての構成部品は、Edmund Optics Singapore Pte. Ltd.（シンガポール）から購入した。全てのレンズはNewport Corp（米国）により寄贈された。励起モジュールは、調整可能な強度レベル（Ｂ）でフルスペクトル光を照射する光源（Ａ）、光透過用の光ファイバーケーブル（Ｃ）、集束レンズ、及び４６７ｎｍ～４９８ｎｍのバンドパスフィルター（Ｄ）を備える。励起モジュールは、ウサギの目全体を照射する集束青色光を放出する。波長の４６７ｎｍ～４９８ｎｍ帯域は、ＦＩＴＣのピーク励起波長をカバーしている。発光検出モジュール（Ｅ）は、５２４ｎｍ～５４４ｎｍのバンドパスフィルター（ＦＩＴＣの発光波長をカバーしている）、集束レンズ、及び１．３メガピクセルのモノクロＣＣＤカメラを備える。
図１１に示されるように、画像化システムは、励起モジュール（Ａ、Ｂ、Ｃ及びＤを含む）及び発光検出モジュール（Ｅを含む）を備える。レンズを除く全ての構成部品は、Edmund Optics Singapore Pte. Ltd.（シンガポール）から購入した。全てのレンズはNewport Corp（米国）により寄贈された。励起モジュールは、調整可能な強度レベル（Ｂ）でフルスペクトル光を照射する光源（Ａ）、光透過用の光ファイバーケーブル（Ｃ）、集束レンズ、及び４６７ｎｍ～４９８ｎｍのバンドパスフィルター（Ｄ）を備える。励起モジュールは、ウサギの目全体を照射する集束青色光を放出する。波長の４６７ｎｍ～４９８ｎｍ帯域は、ＦＩＴＣのピーク励起波長をカバーしている。発光検出モジュール（Ｅ）は、５２４ｎｍ～５４４ｎｍのバンドパスフィルター（ＦＩＴＣの発光波長をカバーしている）、集束レンズ、及び１．３メガピクセルのモノクロＣＣＤカメラを備える。
５．５． 画像化システムの検出範囲
モノクロＣＣＤカメラの蛍光シグナル検出範囲は限られている。シグナルが強すぎると光センサーは飽和し、その一方で、弱すぎるシグナルは捕らえることができない。検出範囲を最大化するために、発光強度が低いものの依然として検出限界を上回っている場合に、少なくとも２つの励起強度（１つは以前の時点と同じであり、１つはそれより高い）を使用して画像を取得した。発光強度は全ての励起強度レベルで色素濃度と線形に相関するため、この手順を使用して検出範囲を拡張することができる。図１２Ａ～図１２Ｃは、画像化システムからの検量線を示している。白抜きの三角形：照度（Ｉｉ）＝４を示し、白抜きの丸：Ｉｉ＝５を示し、白抜きの菱形：Ｉｉ＝最大を示す。蛍光シグナル強度をフルオレセイン濃度に対してプロットした。０．１ＭのＰＢ（リン酸緩衝液）中に溶解されたＦ－ＨＡ－ＶＳ（蛍光ＨＡ－ＶＳ、ＨＡ－ＶＳのＭＷは２９ｋＤａであった）を使用して連続希釈液を作製することで、検量線を作成した。画像化システムによる蛍光測定のために、５０μＬの溶液を９６ウェルプレートに分注した。
モノクロＣＣＤカメラの蛍光シグナル検出範囲は限られている。シグナルが強すぎると光センサーは飽和し、その一方で、弱すぎるシグナルは捕らえることができない。検出範囲を最大化するために、発光強度が低いものの依然として検出限界を上回っている場合に、少なくとも２つの励起強度（１つは以前の時点と同じであり、１つはそれより高い）を使用して画像を取得した。発光強度は全ての励起強度レベルで色素濃度と線形に相関するため、この手順を使用して検出範囲を拡張することができる。図１２Ａ～図１２Ｃは、画像化システムからの検量線を示している。白抜きの三角形：照度（Ｉｉ）＝４を示し、白抜きの丸：Ｉｉ＝５を示し、白抜きの菱形：Ｉｉ＝最大を示す。蛍光シグナル強度をフルオレセイン濃度に対してプロットした。０．１ＭのＰＢ（リン酸緩衝液）中に溶解されたＦ－ＨＡ－ＶＳ（蛍光ＨＡ－ＶＳ、ＨＡ－ＶＳのＭＷは２９ｋＤａであった）を使用して連続希釈液を作製することで、検量線を作成した。画像化システムによる蛍光測定のために、５０μＬの溶液を９６ウェルプレートに分注した。
実際には、実験は通常、照度レベル４で開始され、これにより実施者は、フルオレセインシグナルがその初期蛍光強度の約１％に減少するまで追跡することができた。フルオレセインについての検出限界は、最大照度で０．０１ｎｍｏｌ／ｍｌであった。各実験について、ｔ＝０での蛍光シグナル強度を１００％と定義した。時間の経過に伴うポリマーのクリアランスを、時間の経過に伴う変化のパーセンテージとして表した。蛍光シグナルがその初期蛍光強度の１０分の１に低下するのに必要な時間量であるＴ１／１０を、一次消失動態を前提としてカーブフィッティングに基づいて計算した。
５．６． ヒドロゲルの適用並びに蛍光シグナルの検出及び定量化
予め決められた照度及び時点で眼の表面を画像化することによって、フルオレセイン標識されたヒドロゲルの保持を監視した。実験は暗室内で実施した。ヒドロゲル又は溶液を点眼する前に、各眼のバックグラウンド蛍光を照度レベル４、５及び最大で測定した。その後に、５０μｌのヒドロゲルを角膜の中央に点眼した。点眼後に、手動で眼をしばたかせて、溶液又はヒドロゲルを眼表面上に一様に展延させた。蛍光シグナル強度に基づいて適切な照度を選択した。例えば、通常、０分は照度４を使用して画像化された。蛍光シグナルが７分で弱かった場合は、それぞれ照度レベル４及び５で画像が記録され、１５分の画像は照度レベル５及び最大で記録される。各強度－時点で、ＦｌｙＣａｐｔｕｒｅ ２．７（Point Grey Research, Inc.、米国）を使用して３６枚の写真を撮影し、蛍光シグナルの定量化のために無作為に５枚を選択した。画像をＩｍａｇｅＪ １．８４ｖによって処理した。角膜及び結膜を含む眼全体の面積平均グレースケールシグナルを測定した。
予め決められた照度及び時点で眼の表面を画像化することによって、フルオレセイン標識されたヒドロゲルの保持を監視した。実験は暗室内で実施した。ヒドロゲル又は溶液を点眼する前に、各眼のバックグラウンド蛍光を照度レベル４、５及び最大で測定した。その後に、５０μｌのヒドロゲルを角膜の中央に点眼した。点眼後に、手動で眼をしばたかせて、溶液又はヒドロゲルを眼表面上に一様に展延させた。蛍光シグナル強度に基づいて適切な照度を選択した。例えば、通常、０分は照度４を使用して画像化された。蛍光シグナルが７分で弱かった場合は、それぞれ照度レベル４及び５で画像が記録され、１５分の画像は照度レベル５及び最大で記録される。各強度－時点で、ＦｌｙＣａｐｔｕｒｅ ２．７（Point Grey Research, Inc.、米国）を使用して３６枚の写真を撮影し、蛍光シグナルの定量化のために無作為に５枚を選択した。画像をＩｍａｇｅＪ １．８４ｖによって処理した。角膜及び結膜を含む眼全体の面積平均グレースケールシグナルを測定した。
この実施例では、実施例３．１に従って作製されたＨＡ－ＳＨ／ＨＡ－ＶＳポリマー－ポリマー型ヒドロゲルのサンプルＡ６が使用されたが、但し、ヒドロゲル形成の前にポリマーに蛍光色素をタグ付けした。さらにまた、２つのＨＡ系配合物、すなわち５ｍｇ／ｍｌの１５００ｋＤａのＨＡを含有するより濃い配合物（ＨＡ溶液１）及び０．４ｍｇ／ｍｌの２．６ＭＤａのＨＡを含有するより薄い配合物（ＨＡ溶液２）のクリアランス挙動を最新の画像化システムを使用して研究した。結果は図１３に示される。図１３から分かるように、ＨＡ－ＳＨ／ＨＡ－ＶＳポリマー－ポリマー型ヒドロゲルのサンプルＡ６は、他の人工涙液（例えば、ＨＡ溶液１及びＨＡ溶液２）よりも大幅に低いクリアランス速度を有する。ＨＡ－ＳＨ／ＨＡ－ＶＳポリマー－ポリマー型ヒドロゲルのサンプルＡ６の約３５％は、５時間後にも依然として角膜前の空間に残留していた。Greavesらによれば、人工涙液は通常、約３０秒間のクリアランス半減期を示す（Greaves et al., A comparison of the precorneal residence of an artificial tear preparation in patients with keratoconjunctivitis sicca and normal volunteer subjects using gamma scintigraphy, ACTA OPHTHALMOLOGICA, 69 (1991) 432-43）。上記の結果は、本開示の眼用組成物が、他の人工涙液又はＨＡ系配合物よりも低いクリアランス速度を示すことを示している。図１４Ａ～図１４Ｄは、種々の時点でのＨＡ－ＳＨ／ＨＡ－ＶＳポリマー－ポリマー型ヒドロゲルの蛍光標識されたサンプルＡ６の代表的な画像を示す。少なくとも３時間にわたって強い蛍光シグナルが見られた。
実施例６ ヒドロゲルからの薬物の制御放出
予め決められた照度及び時点で眼の表面を画像化することによって、ヒドロゲル内に封入されたモデル薬物フルオレセインの保持を監視した。ヒドロゲル形成前に非反応性フルオレセイン分子を添加したことを除いて実施例３．１に従って、ＨＡ－ＳＨ／ＨＡ－ＶＳポリマー－ポリマー型ヒドロゲルのサンプルＡ７の蛍光標識されていないヒドロゲルを作製した。実験を行い、実施例５に従って蛍光シグナルを測定した。保持データを、２つのコントロール、すなわち、ヒドロゲル内に封入するのではなくＰＢＳ及びＨＡ溶液中に溶解されたフルオレセイン分子（ヒドロゲルと同様のＣＴ）と比較した。図１５Ａ～図１５Ｉは、ＨＡ－ＳＨ／ＨＡ－ＶＳポリマー－ポリマー型ヒドロゲルのサンプルＡ７の試験結果を示し、図１６Ａ～図１６Ｄは、ＰＢＳ及びＨＡ溶液中に溶解されたフルオレセイン分子の試験結果を示している。図１７は、ＨＡ－ＳＨ／ＨＡ－ＶＳポリマー－ポリマー型ヒドロゲルのサンプルＡ７並びにＰＢＳ及びＨＡ溶液中に溶解されたフルオレセイン分子の蛍光強度を示している。図１５は、サンプルＡ７の蛍光シグナルが少なくとも５時間にわたって眼表面上で維持されたことを示しているのに対して、図１６は、ＰＢＳ及びＨＡ溶液中に溶解されたフルオレセインの蛍光シグナルが眼表面上で５分以内に消失したことを示している。図１５～図１７は、本開示のヒドロゲル内に封入された小分子が、ＰＢＳ緩衝液又はＨＡの水溶液中に溶解された分子よりも長い薬物の保持を示すことを示している。
予め決められた照度及び時点で眼の表面を画像化することによって、ヒドロゲル内に封入されたモデル薬物フルオレセインの保持を監視した。ヒドロゲル形成前に非反応性フルオレセイン分子を添加したことを除いて実施例３．１に従って、ＨＡ－ＳＨ／ＨＡ－ＶＳポリマー－ポリマー型ヒドロゲルのサンプルＡ７の蛍光標識されていないヒドロゲルを作製した。実験を行い、実施例５に従って蛍光シグナルを測定した。保持データを、２つのコントロール、すなわち、ヒドロゲル内に封入するのではなくＰＢＳ及びＨＡ溶液中に溶解されたフルオレセイン分子（ヒドロゲルと同様のＣＴ）と比較した。図１５Ａ～図１５Ｉは、ＨＡ－ＳＨ／ＨＡ－ＶＳポリマー－ポリマー型ヒドロゲルのサンプルＡ７の試験結果を示し、図１６Ａ～図１６Ｄは、ＰＢＳ及びＨＡ溶液中に溶解されたフルオレセイン分子の試験結果を示している。図１７は、ＨＡ－ＳＨ／ＨＡ－ＶＳポリマー－ポリマー型ヒドロゲルのサンプルＡ７並びにＰＢＳ及びＨＡ溶液中に溶解されたフルオレセイン分子の蛍光強度を示している。図１５は、サンプルＡ７の蛍光シグナルが少なくとも５時間にわたって眼表面上で維持されたことを示しているのに対して、図１６は、ＰＢＳ及びＨＡ溶液中に溶解されたフルオレセインの蛍光シグナルが眼表面上で５分以内に消失したことを示している。図１５～図１７は、本開示のヒドロゲル内に封入された小分子が、ＰＢＳ緩衝液又はＨＡの水溶液中に溶解された分子よりも長い薬物の保持を示すことを示している。
実施例７ ｉｎ ｖｉｖｏでの生体適合性
本開示の点眼組成物のｉｎ ｖｉｖｏでの生体適合性を、齧歯類（２４時間）及びウサギ（１週間）の眼表面上で評価した。試験結果は図１８に示される。図１８Ａ及び図１８Ｂに示されるように、ＨＡ－ＳＨ／ＨＡ－ＶＳポリマー－ポリマー型ヒドロゲルのサンプルＡ７を含む点眼組成物は忍容性が良好であった。具体的には、角膜及び水晶体は透明であり、炎症は観察されず、眼の不快感の兆候は検出されなかった。
本開示の点眼組成物のｉｎ ｖｉｖｏでの生体適合性を、齧歯類（２４時間）及びウサギ（１週間）の眼表面上で評価した。試験結果は図１８に示される。図１８Ａ及び図１８Ｂに示されるように、ＨＡ－ＳＨ／ＨＡ－ＶＳポリマー－ポリマー型ヒドロゲルのサンプルＡ７を含む点眼組成物は忍容性が良好であった。具体的には、角膜及び水晶体は透明であり、炎症は観察されず、眼の不快感の兆候は検出されなかった。
同様に、実施例３．１に従って作製されたＨＡ－ＳＨ／ＨＡ－ＶＳポリマー－ポリマー型ヒドロゲルのサンプルＡ７を含む点眼組成物の適用前及び適用後に、マウスの眼を視覚的に検査した。図１９Ａ～図１９Ｄに示されるように、ヒドロゲル点眼後２４時間まで眼を監視したところ、充血又は角膜の白化等の肉眼的な応答は観察されなかった。
実施例８ ヒドロゲルのｉｎ ｖｉｔｒｏでの生体適合性
ｉｎ ｖｉｔｒｏでの生体適合性を評価するために、本開示と同様のヒドロゲルを眼球細胞ＡＲＰＥ１９と一緒にインキュベートし、生死アッセイによって試験した。生体適合性を調べるために、２９ｋＤａ、２０％ＤＭのＨＡ－ＶＳ及びＨＡ－ＳＨを用いてヒドロゲルを作製し、ＨＡ－ＶＳとＨＡ－ＳＨとの間の質量比／モル比及び体積比は１：１であり、ＣＴは約１５％の濃度であった。そして次に、得られたヒドロゲルを細胞と一緒に１日間インキュベートした。濃度は、動物研究で使用された本開示の濃度よりも約３００倍高かった。ヒドロゲルは眼球細胞と適合性であることが判明し、図２０Ａ～図２０Ｃに示されるように、９９．５％を超える細胞が５回の全ての反復で生染色された。
ｉｎ ｖｉｔｒｏでの生体適合性を評価するために、本開示と同様のヒドロゲルを眼球細胞ＡＲＰＥ１９と一緒にインキュベートし、生死アッセイによって試験した。生体適合性を調べるために、２９ｋＤａ、２０％ＤＭのＨＡ－ＶＳ及びＨＡ－ＳＨを用いてヒドロゲルを作製し、ＨＡ－ＶＳとＨＡ－ＳＨとの間の質量比／モル比及び体積比は１：１であり、ＣＴは約１５％の濃度であった。そして次に、得られたヒドロゲルを細胞と一緒に１日間インキュベートした。濃度は、動物研究で使用された本開示の濃度よりも約３００倍高かった。ヒドロゲルは眼球細胞と適合性であることが判明し、図２０Ａ～図２０Ｃに示されるように、９９．５％を超える細胞が５回の全ての反復で生染色された。
実施例９ 健康な被験体におけるヒドロゲルの生体適合性研究
この研究は、獣医眼科の専門家によって実施された。研究のために５匹の健康なイヌを募集した。実施例３．１に従って作製されたＨＡ－ＳＨ／ＨＡ－ＶＳポリマー－ポリマー型ヒドロゲルのサンプルＡ９を使用した。イヌに、ＨＡ－ＳＨ／ＨＡ－ＶＳポリマー－ポリマー型ヒドロゲルのサンプルＡ９を含む点眼組成物を１日２回、すなわち、朝に１回及び晩に１回で６日間にわたり点眼した。適用される点眼組成物の量を、それぞれ１日目～２日目には２５０μｌ、３日目～４日目には２００μｌ、及び５日目～６日目には８０μｌと変化させた。また、試験される点眼組成物のレジメンの主観的評価のために、図２１に示される調査質問をペットの飼い主に配布した。
この研究は、獣医眼科の専門家によって実施された。研究のために５匹の健康なイヌを募集した。実施例３．１に従って作製されたＨＡ－ＳＨ／ＨＡ－ＶＳポリマー－ポリマー型ヒドロゲルのサンプルＡ９を使用した。イヌに、ＨＡ－ＳＨ／ＨＡ－ＶＳポリマー－ポリマー型ヒドロゲルのサンプルＡ９を含む点眼組成物を１日２回、すなわち、朝に１回及び晩に１回で６日間にわたり点眼した。適用される点眼組成物の量を、それぞれ１日目～２日目には２５０μｌ、３日目～４日目には２００μｌ、及び５日目～６日目には８０μｌと変化させた。また、試験される点眼組成物のレジメンの主観的評価のために、図２１に示される調査質問をペットの飼い主に配布した。
調査結果は図２２Ａ～図２２Ｄに示される。本開示のヒドロゲルを含む点眼組成物は、イヌによる忍容性が良好であり、ペットの飼い主によって十分に受け入れられることが分かった。有害事象に関して、或る飼い主は点眼組成物の適用後に緑がかった分泌物を観察したが、これは、獣医専門家によって本開示のヒドロゲル／点眼組成物の適用とは無関係であると判断された。さらに、殆どのペットの飼い主は、ヒドロゲルをパッケージから絞り出すのが簡単であると感じた。そして、全てのペットの飼い主は、ヒドロゲルが眼表面の大部分を覆うことができると感じた。
実施例１０ 点眼組成物のイヌの臨床試験
この研究は、獣医眼科の専門家によって実施された。ドライアイ症候群と診断され、シクロスポリン治療と組み合わせて１年以上にわたって人工涙液を１日４回～６回投与されているイヌの患者が研究に登録された。以前のシクロスポリン治療の臨床転帰に基づいて、患者をシクロスポリン応答群及びシクロスポリン非応答群の２つの群に分けた。両方の群を、シクロスポリンと組み合わせて、１日２回の本開示の点眼ヒドロゲル（実施例３．１に従って作製されたＨＡ－ＳＨ／ＨＡ－ＶＳポリマー－ポリマー型ヒドロゲルサンプルのサンプルＡ９を含む）に切り替えた。眼瞼痙攣、分泌物、角膜染色及びシルマーテストを含む７つの臨床徴候を、研究の開始時及びヒドロゲルによる１ヶ月の治療直後に専門家によって採点した。評価スケールを表３に示す。
この研究は、獣医眼科の専門家によって実施された。ドライアイ症候群と診断され、シクロスポリン治療と組み合わせて１年以上にわたって人工涙液を１日４回～６回投与されているイヌの患者が研究に登録された。以前のシクロスポリン治療の臨床転帰に基づいて、患者をシクロスポリン応答群及びシクロスポリン非応答群の２つの群に分けた。両方の群を、シクロスポリンと組み合わせて、１日２回の本開示の点眼ヒドロゲル（実施例３．１に従って作製されたＨＡ－ＳＨ／ＨＡ－ＶＳポリマー－ポリマー型ヒドロゲルサンプルのサンプルＡ９を含む）に切り替えた。眼瞼痙攣、分泌物、角膜染色及びシルマーテストを含む７つの臨床徴候を、研究の開始時及びヒドロゲルによる１ヶ月の治療直後に専門家によって採点した。評価スケールを表３に示す。
本開示の点眼組成物／ヒドロゲルは、全てのイヌによる忍容性が良好であり、イヌの飼い主によって十分に受け入れられることが分かった。それというのも、本開示の点眼組成物は、より少ない点眼の頻度しか必要とせず、点眼の回数が１日６回から１日２回へと減少したからである。臨床結果は、ヒドロゲルが試験期間にわたって治療効果を維持することができたことを示している（図２３に示される）。図２３Ａ～図２３Ｇにおいて、「Ｒｅｓ ｂｅｆｏｒｅ」は、本開示の点眼組成物の適用前のシクロスポリン応答性患者を指す。「Ｒｅｓ ａｆｔｅｒ」は、本開示の点眼組成物の適用後のシクロスポリン応答性患者を指す。「Ｎｏｎ ｂｅｆｏｒｅ」は、本開示の点眼組成物の適用前のシクロスポリン非応答性患者を指す。「Ｎｏｎ ａｆｔｅｒ」は、本開示の点眼組成物の適用前のシクロスポリン非応答性患者を指す。各患者の評価は図に示されており、バーは全ての患者の平均値を示している。少なくとも数匹のイヌについては、１ヶ月の治療後に臨床徴候が改善したことが判明した。
細胞レベルでの新しい治療の効果を評価するために、インプレッションサイトロジー（ＩＣ）を利用することにより、イヌの患者から結膜細胞を収集した。半円形状に切断した濾紙をオートクレーブにより滅菌した。治療前及び治療１ヶ月後に、濾紙を患者の結膜上に約１秒間押し当て、４％パラホルムアルデヒド中で直ちに固定した。収集された細胞を、ドライアイ疾患に関連する炎症マーカーであるＭＭＰ－９について免疫化学的に染色した。これらの結果は図２４Ａ～図２４Ｃに示される。「Ｎｏｎｅ ｂｅｆｏｒｅ」は、本開示の点眼組成物の適用前のシクロスポリン非応答性患者を指す。「Ｎｏｎｅ ａｆｔｅｒ」は、本開示の点眼組成物の適用後のシクロスポリン非応答性患者を指す。各患者の評価は図２４Ａに示されており、バーは全ての患者の平均値を示している。図２４Ａは、シクロスポリン非応答性のイヌの場合でさえも、ヒドロゲルが、炎症のレベルを僅かに減少させることができたことを示している。図２４Ｂ及び図２４Ｃは、１ヶ月間のヒドロゲル適用前及び適用後の１匹のイヌの細胞（核が強い蛍光シグナルで染色された）における炎症マーカー（細胞核の強い蛍光シグナルの周りの弱い蛍光シグナル）の染色画像を示している。炎症細胞の大幅な減少が観察された。
本発明の好ましい実施形態が本明細書において示され、説明されたが、かかる実施形態は例としてのみ提供されることは当業者には明らかであろう。本発明が本明細書内で提供される具体的な例によって限定されることを意図するものではない。上記の明細書を参照して本発明を説明したが、本明細書の実施形態の記載及び実例は、限定的な意味で解釈されることを意図していない。ここで、当業者は本発明から逸脱することなく、多数の変形、変更、及び置換を想到するであろう。さらに、本発明の全ての態様は、様々な条件及び変項に依存する本明細書に規定される具体的な描写、構成又は相対的割合に限定されないことを理解されたい。本明細書に記載される本発明の実施形態に対する様々な代替物が、本発明を実施する際に利用され得ることを理解されたい。したがって、本発明は、任意のかかる代替、修正、変形又は均等物も網羅することが企図される。添付の特許請求の範囲は、本発明の範囲を定義し、特許請求の範囲内の方法及び構造、並びにそれらの同等物がそれによって網羅されることが意図される。
Claims (18)
- ウベローデ粘度計によって測定される、少なくとも３ｄＬ／ｇの固有粘度［η］を組成物中で有する１つ以上のヒドロゲル形成ポリマーを含む点眼組成物であって、
該組成物中の前記ヒドロゲル形成ポリマーの濃度ＣＴが多くとも５ｍｇ／ｍｌであり、 前記ヒドロゲル形成ポリマーの少なくとも一部が、前記組成物において形成されたヒドロゲル中に含まれ、
前記ヒドロゲルが、以下の少なくとも１つを有する、点眼組成物：
１）動的振動剪断試験において測定される、１０．０Ｐａ以下の貯蔵弾性率Ｇ’、
２）動的振動剪断試験において測定される、１０．０Ｐａ以下の損失弾性率Ｇ’’、
３）１００ｒａｄ／ｓ未満の振動数で動的振動剪断試験において測定される、０．２Ｐａ・ｓ以下の複素粘度、
４）前記ヒドロゲルをＴｅａｒｓ Ｎａｔｕｒａｌｅ Ｆｒｅｅ ０．６ｍｌの成形同時充填（ＢＦＳ）使い捨てボトルから絞り出す場合の、４Ｎ～４５Ｎの押出力、及び、
５）動的振動歪み掃引試験において測定される、少なくとも１０％の降伏歪み。 - 前記ポリマーが親水性及び／又は水溶性である、請求項１に記載の点眼組成物。
- 前記ポリマーが多糖、ポリアクリル酸、ポリヒドロキシエチルメタクリレート、エラスチン、コラーゲン、それらの誘導体及びそれらの任意の組合せからなる群から選択される、請求項１又は２に記載の点眼組成物。
- 前記ポリマーがヒアルロン酸、グアーガム、デンプン、キトサン、コンドロイチン硫酸、アルギネート、カルボキシメチルセルロース、それらの誘導体及びそれらの任意の組合せからなる群から選択される、請求項１～３のいずれか一項に記載の点眼組成物。
- 前記ポリマーがヒアルロン酸、その誘導体及びそれらの任意の組合せからなる群から選択される、請求項１～４のいずれか一項に記載の点眼組成物。
- 前記ポリマーがアクリレート、マレイミド、ビニルスルホン、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミド、アルデヒド、ケトン、カルボジイミド、カーボネート、ヨードアセチル、メルカプトニコチンアミド、キノン、チオール、アミン及びそれらの任意の組合せからなる群から選択される１つ以上の修飾で修飾された誘導体を含む、請求項１～５のいずれか一項に記載の点眼組成物。
- 前記誘導体が３％～５０％の平均修飾度（ＤＭ）を有する、請求項６に記載の点眼組成物。
- 少なくとも第１のポリマー誘導体と第２のポリマー誘導体とを含み、該第１のポリマー誘導体が第１の修飾を含み、前記第２のポリマー誘導体が第２の修飾を含み、前記第１の修飾が前記第２の修飾とは異なり、前記第１のポリマー誘導体が前記第２のポリマー誘導体と反応して前記ヒドロゲルを形成することが可能である、請求項１～７のいずれか一項に記載の点眼組成物。
- 前記組成物中の前記第１のポリマー誘導体と前記第２のポリマー誘導体とのモル比が１０：１～１：１０である、請求項８に記載の点眼組成物。
- 前記第１のポリマー誘導体が第１のＤＭを有し、前記第２のポリマー誘導体が第２のＤＭを有し、
前記第１のＤＭと前記第２のＤＭとの比率が１０：１～１：１０である、請求項８又は９に記載の点眼組成物。 - 前記第１の修飾及び前記第２の修飾が各々独立してアクリレート、マレイミド、ビニルスルホン、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミド、アルデヒド、ケトン、カルボジイミド、カーボネート、ヨードアセチル、メルカプトニコチンアミド、キノン、チオール、アミン及びそれらの任意の組合せからなる群から選択される、請求項８～１０のいずれか一項に記載の点眼組成物。
- 前記１つ以上のポリマーがヒアルロン酸誘導体であり、前記第１のポリマー誘導体が１つ以上のビニルスルホン基で修飾されたヒアルロン酸であり、前記第２のポリマー誘導体が１つ以上のチオール基で修飾されたヒアルロン酸であり、前記第１のポリマー誘導体が前記第２のポリマー誘導体と反応して前記ヒドロゲルを形成することが可能である、請求項１１に記載の点眼組成物。
- 前記１つ以上のポリマーとは異なる架橋剤を更に含み、該架橋剤が小分子架橋剤、高分子架橋剤又はそれらの組合せである、請求項１～１２のいずれか一項に記載の点眼組成物。
- 前記架橋剤がアクリレート、マレイミド、ビニルスルホン、ヒドロキシスクシンイミド、アルデヒド、ケトン、多価カルボジイミド、カーボネート、ヨードアセチル、メルカプトニコチンアミド、キノン、チオール、アミン及びそれらの任意の組合せから選択される基を有する分子を含む小分子架橋剤である、請求項１３に記載の点眼組成物。
- 前記架橋剤がアクリレート、マレイミド、ビニルスルホン、ヒドロキシスクシンイミド、アルデヒド、ケトン、多価カルボジイミド、カーボネート、ヨードアセチル、メルカプトニコチンアミド、キノン、チオール、アミン及びそれらの任意の組合せから選択される基を有する高分子を含む高分子架橋剤である、請求項１３に記載の点眼組成物。
- 前記点眼組成物が前記１つ以上のポリマーとは異なる架橋剤を含まない、請求項１～１２のいずれか一項に記載の点眼組成物。
- 眼の障害又は病態の治療又は緩和を必要とする被験体における眼の障害又は病態を治療又は緩和するための、請求項１～１６のいずれか一項に記載の点眼組成物。
- 眼の快適さの改善又は眼の乾燥の軽減を必要とする被験体における眼の快適さを改善する又は眼の乾燥を軽減するための、請求項１～１６のいずれか一項に記載の点眼組成物。
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