KR860001148B1

KR860001148B1 - 약리학적 작용을 가진 히알루론산의 제조방법

Info

Publication number: KR860001148B1
Application number: KR1019840006280A
Authority: KR
Inventors: 델라 발레 프란세스코; 로메오 아우렐리오; 로렌찌 실바나
Original assignee: 피디아 에스. 피. 에이; 델라 발레 프란세스코
Priority date: 1983-10-11
Filing date: 1984-10-11
Publication date: 1986-08-18
Also published as: CA1205031A; FI79554C; AR231992A1; PT79339B; DE3482812D1; HK66091A; FR2553099B1; EP0138572A3; NO844054L; IE57931B1; HUT36834A; KR850002957A; BE900810A; PT79339A; EP0138572B1; DK485384A; ES8507573A1; NO169637C; HU195523B; SG59491G

Abstract

내용 없음.

Description

약리학적 작용을 가진 히알루론산의 제조방법

제1도는 본 발명자에 의해 확인된 히알루론산의 상이한 분획물을 나타낸 것이다.

본 발명은 치료에 사용할 때 항염증성을 나타내는 특정한 분자량의 히알루론산 분획물에 관한 것이다.

본 발명의 히알루론산 분획물 중 일종은 상처 치유를 촉진시키는데 유용한 반면에 제2히알루론산 분획물은 안구내 유액을 대치하기 위해 안구내 사용이나 손상된 골관절의 치료를 위해 사용하는데 관절내 주사용으로 유용하다. 더우기, 히알루론산 분획물은 각막 상피세포에 적합한 제제를 제공하며, 안과용 약제의 작용을 증강시키는 안과용 약제를 위한 부형제로 유용함이 밝혀졌다.

히알루론산은 D-글루쿠론산과 N-아세틸-D-글루코사민의 교대잔기로 구성된 천연산헤테로 폴리사카라이드로서, 일반적으로 약 8-13백만의 고분자량을 가진 선상 중합체이며, 척추동물의 결합조직의 세포의 기초물질인 세포피막, 관절의 활액, 눈의 안구내 유액, 인체의 탯줄 조직및 숫탉의 벼슬에서 발견되었다.

종래의 히알루론산 사용에 관한 발명은 미국특허 제4,141,973호(발명자 : 발라즈) 등이 있으며, 이 발명은 안구내 유액의 대치뿐 아니라 기타의 치료적 응용에 유용한 히알루론산의 분획물에 관한 것이다. 그러나 이 특허는 특히 평균 분자량 약 750,000 이상 바람직하기로는 약 1,200,000 이상을 가진 히알루론산 분획물에 관한 것이다.

특히 상기 특허의 발명자는 평균 분자량이 750,000 이하인 히알루론산의 분획물일 경우 염증성 작용 때문에 치료적으로 유용하지 않음을 지적하고 있다.

이 때문에 상기 특허의 발명자는 이러한 저분자량이 히알루론산의 분획물을 폐기하고 있다.

그러나, 이것은 공급조직으로부터 얻을 수 있는 이용가능한 히알루론산의 약 90%을 폐기해야 하기 때문에 결과적으로 이용 가능한 히알루론산의 소량(약 10%)만이 사용 가능하다.

상기 특허의 발명자의 지적과는 달리, 본 발명자는 저분자량의 히알루론산 분획물일지라도 유용한 약리학적 작용을 가지고 있음을 발견하게 되었는 바, 본 발명에 따르면 여러 공급원으로부터 얻을 수 있는 히알루론산의 약 80%가 이용될 수 있다.

특히, 본 발명자는 상처치유를 촉진시키는데 유용한 일종의 히알루론산 분획물과 눈의 안구내 유액을 대치하기 위한 안내 주사용 및 손상된 관절의 치료제로서 관절내 주사용으로 유용한 히알루론산의 제2분획물을 발견하게 되었다.

상술한 바와 같이, 미국 특허 제4,141,973호의 예와 같은 종래의 발명은 평균 분자량 750,000 이상을 가진 고분자량의 분획물에 관한 것이었다. 본 발명은 2종의 새로운 히알루론산 분획물, 즉 저분자량을 가진 일종의 분획물과 중간 범위의 평균 분자량을 가진 또 하나의 분획물을 단리시킨데 특징이 있는 바, 이 분획물은 고순도이므로 실질적으로 순수하여 염증작용을 나타내지 않는 것으로 고려된다. 이 새로운 히알루론산 분획물은 추출가능한 양의 히알루론산을 함유한 각종의 결합조직으로부터 얻을 수 있다.

본 발명자에 의해 단리된 제1분획물은 히알라스틴으로 명명하였고 약 50,000-100,000의 평균 분자량을 갖는다. 이 히일라스틴 분획물은 상처 치유작용이 있으므로 가축 및 인체의 치료용으로 적합한 것으로 판명 되었다. 본 발명자에 의해 단리된 제2분획물은 히알렉틴으로 명명하였고 약 500,000-730,000의 평균 분자량을 갖는다.

이 히알렉틴 분획물은 안구내 유액의 대치용으로서 안구 수출과 관절의 외상 및 퇴행성 질환의 가축 및 인체 치료용으로 적합하다.

히알라스틴은 피내 주사로서 투여하거나 상처 치유를 위해 국소제로서 적용될 수 있다. 다른 한편, 히알렉틴은 안구내 및 관절내 주사용으로 적합하다.

본 발명자는 여러 히알루론산 분획물에 대해 집중적인 연구를 실시하고 종래보다 더욱 정밀한 방법으로 특히 치료적으로 유용한 히알루론산 분획물과 염증성 및 유용하지 않은 히알루론산 분획물을 결정하였다. 이런 연구 결과 본 발명자는 2개의 특이한 히알루론산 분획물 특성, 즉 세포 이동작용과 고유점성을 확인 조사하였다. 동물에서 상처 치유과정은 세로 이동, 특히 섬유아 세포의 이동에 의해 촉진된다. 다른 한편, 세포 이동이나 증식작용(즉, 유사분열)은 안구내의 수술일 경우 피해야 되며, 이것은 치유 증가율이 유해한 영향을 일으킬 경우 망막박리를 교정하는 수술시에 특히 그러하다.

고유점성도 역시 중요한 매개변수로서 히알루론산 분획물의 이용을 결정하는데 고려된다.

높은 고유점성을 가진 분획물은 외상 및 퇴행성 관절 질환의 치료에 수술용 및 안구내 유액의 대치용으로 유용하다. 다른 한편, 높은 점성은상처 치유를 촉진시키는데 이용되는 분획물을 위해서는 바람직하지 못한 특성이다. 실제로 상처 치유에 이용되는 분획물은 적용에 보다 용이하도록 낮은 점도를 가져야 한다.

본 발명자에 의해 확인된 히알라스틴 분획물은 양호한 이동성이나 세포 증식작용 및 낮은 점성 특성을 가진 것으로 판명되었다. 따라서, 히알라스틴은 상처 치유를 촉진시키는데 유용한 물질로 바람직한 특성을 갖는다. 동일한 특성은 안구내 및 관절내 주사용으로 바람직하지 못하다.

본 발명자에 의해 확인된 히알렉틴 분획물은 세포 이동이나 세포 증식작용이 무시할 정도인 반면 동시에 높은 점성을 가지고 있음이 판명되었다. 그러므로 이러한 특성은 히알렉틴을 안구내 및 관절내 주사용으로 유용하게 만든다. 그러나 다른 한편, 히알렉틴은 이 분획물이 세포 이동작용을 나타내지 아니하므로 상처 치유에는 유용하지 못하다.

히알루론산의 유용한 분획물을 단리시키는데 있어서 염증 작용을 갖지 아니한 분획물을 얻는 것도 역시 중요하다.

상기 미국 특허에는 염증작용을 갖지 아니한 히알루론산 분획물을 얻기 위하여 평균 분자량 750,000 이상을 가진 분획물이 절대적으로 사용되어야 함을 지적하고 있다.

이 때문에 상기 특허의 발명자는 염증 작용 때문에 유용하지 못한 평균 분자량 750,000 이하를 가진 분획물을 폐기한다. 이와 달리 본 발명자에 의해 평균 분자량 750,000 이하의 분획물에 대해 지적된 염증 작용은 사실상 평균 분자량 30,000 이하를 가진 불순물 때문인 것으로 밝혀졌다.

따라서 본 발명은 평균 분자량 30,000 이하를 가진 염증성 분획물을 제거할 수 있는 화학적 방법과 관련된 일련의 분자 여과기술로 구성된 방법을 제공한다.

본 발명의 방법에 의하면, 특정한 출발물질로부터 얻을 수 있는 총 히알루론산의 약 80%의 총수율을 획득하는 염증 작용을 나타내지 아니하는 히알루론산의 유용한 분획물을 얻는 것이 가능하다. 이와같이 이용 가능한 히알루론산의 80% 수율은 히알렉틴과 히알라스틴 분획물의 배합물이며, 평균 분자량 약 250,000-350,000을 가진 혼합 분획물로 구성된다. 좀 더 상세히 말하면 히알렉틴 분획물은 출발조직으로부터 이용가능한 히알루론산의 약 30% 수율로 얻어지고 히알스틴 분획물은 이용 가능한 히알루론산의 약 50% 수율로 얻어진다. 이 요소는 본 발명자가 이용 가능한 히알루론산의 상당히 증가된 양을 약리학적으로 유용한 것으로 발견했다는 점에서 상술한 종래의 특허방법보다 중대한 개량인 것이다. 상기 종래 방법은 평균 분자량 750,000 이상을 가진 분획물만을 이용함으로써 동물기관으로부터 이용 가능한 본래의 히알루론산 중 약10%만의 수율을 얻고 가능한 히알루론산의 약 90%를 폐기한다. 따라서 본 발명에 따라 총 히알루론산의 유용성이 크게 증가되었다.

이알루론산의 여러 분획물의 상대 추출 수율을 비교하면 아래 표 1에 표시된 바와 같다.

[표 1]

제1도는 본 발명자에 의해 확인된 상이한 히알루론산 분획물을 나타낸 것으로 실선 표시의 곡선은 출발조직으로부터 이용에 가능한 히알루론산 분획물의 대략적인 분포 상태를 나타낸 것이다.

제1도중 B부분은 미국 특허 제4,141,973호에서 발라즈에 의해 확인된 제약적으로 유용성이 있는 것으로 확인된 히알루론산 분획물을 나타낸 것이다.

제1도에서 "A", I 및 II부분은 본 발명에 따라 확인된 분획물을 나타내고 이 중 A부분은 평균 분자량 30,000 이하의 염증성 분획물이고, I부분은 히알라스틴 분획물이며, II부분은 히알렉틴 분획물에 해당한다. 이 좌표에서 알 수 있는 바와 같이 상기 미국 특허의 방법에 의하면 평균 분자량 750,000 이하를 가진 히알루론산 분획물을 제거함으로써 이용 가능한 대부분의 히알루론산 분획물을 제거한다.

본 발명은 평균 분자량 30,000 이하의 낮은 분자량을 가진 히알루론산이 종래의 발명자에 의해 히알루론산의 여러 추출물에서 지적한 바 있는 염증 작용을 일으키지만 이용 가능한 히알루론산의 대부분을 약리학 작용도로 사용 가능케 한다.

본 발명자는 특후한 치료 적용에 따라 본 발명의 방법으로 분리된다면 실제로 대부분의 이용 가능 하얀 루론산이 치료 목적으로 이용될 수 있음을 발견하였다.

상기 미국 특허는 특히 이용 가능한 히알루론산 중 10%만의 사용을 지적하고 있는 반면에 본 발명은 상처 치료를 위한 히알라스틴 분획물의 형태나 안구내와 관절내 투여를 위한 히알렉틴, 또는 역시 상처 치료를 위한 히알라스틴과 히알렉틴의 혼합 분획물의 형태로서 이용 가능한 히알루론산의 약 80%를 실제로 이용 가능케 한다.

본 발명자에 의해 확인 조사된 분획물의 화학적 및 물리적 특성을 요약하면 아래 표 2에 표시된 바와 같다.

[표 2]

화학적 물리적 특성

* a값은 물을 제거시킨 후의 히알루론산 역가를 나타내는 것으로, 예를 들어 96%의 역가는 물을 제거시킨 뒤 그 분말이 4%의 불순물과 96%이 히알루론산을 함유하고 있다는 것을 의미한다.

이하 본 발명에 따른 이용 가능한 히알루론산의 추출방법을 실시예를 들어 상세히 설명하면 다음과 같다.

[실시예 1]

염증 작용을 갖지 아니한 히알라스틴과 히알렉틴 혼합물을 만드는 방법 :

신선하거나 냉동 처리된 3,000g의 암탉 벼슬을 고기연합기로 다진 다음 기계적인 균질기로 조심스럽게 균질화시킨다. 이렇게 해서 얻어진 페이스트를 10배로 용량의 무수아세톤과 함께 ATSI316 스테인레스 스틸 용기나 유리용기 안에 넣고 50g/분의 속도로 6시간 동안 교반한 다음 아세톤을 흡수 제거 후 12시간 동안 방치분리시킨다.

이 추출과정은 제거된 아세톤이 적정한 습도에 도달할 때까지(칼-휫셔방법) 반복한다.

이렇게 해서 얻어진 물질을 원심분리해서 적당한 온도에서 5-8시간 동안 진공 건조시킨다. 이 과정으로 약 500-600g의 건조 분말이 암탉 벼슬으로부터 얻어진다. 얻어진 건조 분말 300g을 적당량의 시스테인 하이드로클로라이드 존재하에서 인산염 완충용액으로 완충된 수성 배양액을 이용하여 0.2g의 파파인과 함께 효소 소화작용을 시킨다. 그 다음 이 혼합물을 60°-65℃의 항온에서 60g/분의 속도로 24시간 동안 교반한 후 60g의 셀라이트(R)를 넣어 가면서 25℃로 식히고 이것을 1시간 더 저어준 다음 얻어진 혼합물을 투명한 액체가 나올 때까지 여과시킨다. 여과된 투명한 액을 분자량이 30,000보다 큰 분자가 박막 위에 남도록 액체가 나올 때까지 여과시킨다. 여과된 투명한 액을 분자량이 30,000보다 큰 분자가 박막 위에 남도록 30,000의 분자 추출 제한을 가진 박막을 이용해 분자한외여과를 시킨 다음, 본래 용량의 5-6배를 한외여과시키면서 생성물에 증류수를 첨가하여 현탁시키고 생성물에 증류수를 첨가하여 현탁시키고 생성물을 원래 용량의 1/3로 감소될 때까지 한외여과를 시행한다.

여과된 잔영액체에 염화나트륨을 첨가하여 0.1M로 되게 하고 온도를 50℃로 조절한 다음 염화세틸피리디늄 45g을 첨가하면서 생성물을 60g/분의 속도로 교반한다.

이 혼합물을 60분 동안 교반 후 셀라이트(R) 50g을 첨가하고 생성물의 온도를 교반하에 25℃로 감소시켜 형성된 침전물을 원심분리에 의해 모은다. 이와같이 하여 얻어진 침전물을 0.05% 염화세틸피리디움을 함유한 0.01M 염화나트륨액(5l)에 현탁시키고 50℃에서 60분 동안 더 교반한 후 온도를 25℃로 저하시켜서 침전물을 원심분리한다.

그 다음 세척과정을 3회 반복하고 최종적으로 침전물을 0.05% 염화세틸피리디늄을 함유한 0.05M 염화나트륨용액 3l를 함유한 용기중에 모아서 60분 동안 60g/분의 속도로 교반하고 2시간 동안 25℃의 항온으로 유지시킨 다음 상등액을 원심분리기로 제거시킨다.

이 과정은 0.05% 염화세틸피리디늄을 함유하는 0.1M 염화나트륨 용액으로 몇 번 되풀이한 후 원심분리해서 상등액을 제거하고 침전물을 0.05% 염화 세틸피리디늄(3l)을 포함하는 0.03M 염화나트륨에 분산시키고 교반하여 침전물과 투명한 액체를 모은다. 추출은 침전물에 대해 3회 더 반복하고 매번 동일한 수용액 0.5l을 사용한다.

마지막으로, 나머지 침전물을 제거하고 투명액체를 하나의 용기에 합친다. 액체의 온도는 교반하는 동안에 50℃로 증가시키고 염화나트륨을 사용하여 액체를 0.23M 로 만든 후 1g의 염화세틸피리디늄을 첨가시켜 12시간 동안 저어준다. 그 다음이 용액을 25℃로 식힌 후 설라이트(R) 팩을 통과시키고 이어서 여과기(1μ)를 통해서 여과시킨다.

다음에 생성된 혼합물을 0.33M 염화나트륨용액의 첨가하여 원부피의 3배가 되도록 한외여과시키는 분자 추출 제한이 30,000인 박막으로 한번 더 한외여과시킨다. 이렇게 하면 염화나트륨용액의 첨가로 현탁이 되고 액체부피가 원부피의 4분의 1로 감소된다.

이와같이 농축된 용액을 3배 용량의 95% 에탄올로 25℃에서 60g/분 속도로 저어주면서 침전시킨다. 그 침전물을 원심분리로 모으고 상등액은 버린다. 그 다음 모아진 침전물을 0.1M 염화나트륨용액 1l에 녹이고 3배 용량의 95% 에탄올을 이용하여 침전과정을 되풀이 한다.

이렇게 하여 침전된 침전물을 모두 모아서 첫번째는 3배 용량의 75% 에탄올로, 두번째는 3배 용량의 순수 에탄올로, 세번째는 3배 용량의 순수 아세톤으로 씻어낸다.

그렇게 해서 얻어진 생성물(히알라스틴+히알렉틴)은 250,000에서 350,000의 평균 분자량을 갖고 있다.

히알루론산의 수율은 처음 사용된 신선한 조직에 대해 0.6%에 해당한다.

[실시예 2]

실시예 1과 같은 방법으로 얻어진 혼합물로부터 히알라스틴을 얻는 방법 :

실시예 1에서 설명한 방법으로 얻은 혼합물을 물 1ml에 대해 10mg의 생성물만큼이 되도록 발열성 물질이 없는 증류수에 용해시킨 다음, 그 용액을 200,000의 분자 추출 제한 크기의 막을 이용하여 막에 물이 첨가되지 않도록 농축시키는 방법으로 분자 한외여과를 실시한다.

이 한외여과를 실시하는 동안 200,000 이상의 분자는 막에 걸리고 더 작은 분자는 물과 함께 여과된다. 이 여과 과정 동안에 막 위에 걸러진 부분에다 물을 넣지 않도록 하며, 이에 따라 이 부분의 부피는 감소되게 되고 상대적으로 200,000 분자량 이상의 분자 농도는 증가하게 된다.

이렇게 하여 박막 위에 걸러진 부분의 용량이 처음의 10%로 감소될 때까지 한외여과를 계속한다. 그 다음, 분획물의 발열성 물질이 없는 두번 증류한 물을 2배 용량 정도로 첨가시켜 용량이 1/3로 감소될 때까지 다시 한외여과시키고 이 작업을 두 번 더 반복한다. 이렇게 여과된 용액을 1.0M이 되도록 염화나트륨과 혼합하고 4배 용량의 95% 에탄올로 침전시켜 그 침전물을 3배 용량의 75% 에탄올로 씻어낸 후 진공 건조시킨다.

그렇게 해서 생긴 생성물(히알라스틴)은 평균 분자량이 50,000에서 100,000의 범위였고 히알루론산 생산량은 본래 신선한 조직이 0.4%에 해당하는 것으로 나타났다.

[실시예 3]

히알레틸 분획물을 얻는 방법 :

실시예 2에서 설명된 분자 추출 제한 크기 200,000의 한외여과막으로부터 용기로 모아진 농축된 용액을 글루쿠론산의 추척에 의한 정량분석으로 히아루론산 5mg/ml를 함유하는 용액이 얻어질 때까지 물로 희석시킨다.

그 다음에, 이 용액을 0.1M이 되도록 염화나트륨과 혼합하여 4매 용량의 95% 에탄올로 침전시킨 다음 3배 용량의 75% 에탄올로 씻고 진공 건조시킨다.

그렇게 해서 생긴 생성물(히알렉틴)은 평균 분자량이 500,000내지 730,000이었고 순도가 높은 경우 2,500 내지 3,500개의 당이 연결된 분자로써, 독특한 히알루론산분획물에 해당한다. 이때 히알루론산수율은 원래 신선한 조직의 0.2%에 해당된다.

본 발명에 따라 얻어진 히알루론산에 대한 생물학적 및 약리학적 작용의 평가결과를 상세히 설명하면 다음과 같다.

1. 히알루론산분획물의 세포이동이 생물학적 작용도 :

배양액내에서 섬유아세포의 박리작용을 결정하는 방법은 히알루론산분획물의 세포 이동작용을 평가하기 위한 방법으로 사용되었다.

마우스의 BALB 3T3 세포를 10% 송아지혈청, 페니실린(250 Units/ml)과 스트렙토마이신(0.25mg/ml)이 첨가된 둘베코(Dulbecco)의 변형된 이글(Eagle) 배지 안에서 증식시키고, 37℃로 습기가 있는 5% 이산화탄소, 95% 공기내에서 배양시켰다.

실험목적을 위해 세포를 직경 60mm의 조직배양접시(6×10⁵세포/접시)에 일정하게 접종시켰다.

3T3 세포의 융합성 단일층을 가만히 기울여 버리고 2.0mg/ml의 일반적으로 직접 채취된 히알루론산의 신선한 배지를 첨가하였다. 일정한 간격으로 세포 박리를 현미경으로 관찰하고 카운터를 이용하여 이동된 세포를 계산하였다.

박리평가 : 박리역할을 측정하기 위해 세포를 조직배양접시에 접종하고 24시간 동안 증식시킨 후 배양액을 기울여버리고 2.0mg/ml의 히알루론산을 함유하는 신선한 배지를 첨가시켰다. 24시간마다 2개의 접시, 즉 실험용 배양과 다른 하나의 대조용 배양액의 각각 하나를 기울여버리고 상등액의 세포와 달라붙은 세포를 컬러 카운터로 계산하였다.

상기 실시예 1 내지 3으로부터 얻어진 분획물을 이용한 실험결과는 아래 표 3에 표시된 바와 같다.

[표 3]

이동 연구의 결과

표 3에서 히알라스틴 분획물이 상처 치유에 유용한 높은 세포 이동작용을 나타내고 있다. 히알라스틴의 이런 세포 이동작용은 분획물의 약제가 손상된 조직부위에 적용되었을 때 새로운 세포의 이동과 증식을 촉진시킬 것이다.

한편, 히알렉틴 분획물은 매우 작은 세포 이동작용을 나타내어 상처 치료에 유용하지 못하지만 높은 평균 분자량과 고유점성 때문에 히알렉틴은 안내 및 관절내로 주사용으로 유용하며, 세포 이동작용의 결핍은 안구내 및 관절내 주사용으로 특히유용하게 하는 히알렉틴 분획물의 중요한 특성이다.

2. 히알루론산 분획물의 생물학적 염증 작용 :

평가를 위해 토끼에서 조제를 안구내 투여 후 침투되는 세포수의 계산법이 이용된다.

방 법

완전한 시력을 가진 뉴질랜드 또는 캘리포니아산 체중 2kg의 토기 5마리가 본 실험에 이용된다.

토끼눈의 바깥쪽은 육안으로 염증 과정을 조사할 수 있고 안쪽은 검안경으로 조사할 수 있는데, 안구 기저가 깨끗이 볼 수 있고 정상 상태라면 이 실험을 실행할 수 있다. 대상동물에다 적당히 살균된 안과용 마취제 몇 방울을 주입시켜 국부 마취를 시키고 또한 안과용액 내에 몇 방울의 아트로핀이 함유되어 있는 것을 주입시킨다.

본 실험은 멸균 조건하에서 실시하고 안구를 주사할 수 있는 정도까지 압력을 돌출되게 한다. 유리체강의 중시에서 림버스(Limbus)로부터 약 5-6mm 떨어진 곳의 공막에다 26G 바늘을 이용해 100μl의 용액을 주사할 수 있게 한다. 이 때 다른 안구는 제어용으로 사용하며, 항생물질용액 2방울을 실험용 눈에 넣고 동물들을 한 우리 안에 가두어 두었다.

그 후 50-60시간 후에 좀 더 실험을 계속하는 바, 그 안구는 위와 같은 방법으로 조사해서 대싱동물을 선정한다. 대상동물을 펜토탈 혈관내 주사용으로 이용하고, 우선 약 0.2ml의 수성체액을 26G 바늘을 이용해 인슐린 주사기로 모은다. 안구를 떼어내고, 이 물질을 제거시킨 다음 식염수로 씻어내고, 빌뷰러스 종이로 탈수시킨 후 페트리 접시에서 절개하여 유리체액의 대부분을 분리해내고 살균한 약 0.7ml짜리 주사기로 분리된 유리체액을 모은다. 모아진 유리체액을 작은 폴리에틸렌 실험용기에 넣고 50μl의 히아루로니다제(100UNF/ml)를 첨가시킨다. 그 다음, 이 혼합물을 37℃에서 3시간 동안 유지시켜서 용액의 점성이 약해지게 만든다.

이 용액을 버커 챔버 안에서 위상차 120배의 현미경으로 관찰하여 백혈구 숫자를 센다. 이 때 평균값의 계산과 mm³당 백혈구를 나타내는 데는 여러 번에 걸쳐 백혈구 숫자를 세는 것이 필요하다.

이러한 실험은 다음과 같은 경우에 좋은 결과를 갖는다.

1) 실험용 안구가 상처 받은 적이 없을 때,

2) 5개의 실험용 안구 중 평균 백혈구 수가 mm³당 200을 초과하지 않고 각 대조용 안구의 백혈구 수가 mm³당 50을 초과하지 않는 것이 최소한 4개가 있을 때.

다음 표4는 앞서 설명한 실시예 1 내지 3까지에서 얻어진 히알루론산을 이용하여 이와 같은 측정을 한 결과이다.

[표 4]

염증 작용의 연구 결과

표 4에 나타난 결과를 보면 히알라스틴과 히알렉틴으로 된 분획물은 각각의 대조용 분획물보다 염증작용이 적게 나타났고 히알라스틴과 히알렉틴의 혼합분획물은 대조용 분획물보다 무시할 수 있을 정도로 약간의 증가를 보인다.

따라서, 히알라스틴과 히알렉틴으로 된 분획물은 염증작용을 나타내지 않으면서도 약리적으로 유용하다. 이런 결과는 생성된 히알루론산 중에서 염증작용을 나타내는 것은 분자량이 30,000 이하의 작은 값을 갖는 히알루론산이라는 본 발명자의 연구 결과를 다시 한 번 확인하는 것이다. 스완의 참고문헌(swan D.A. 1986, B.B.A. 156, 17-29)에서 설명된 방법으로 생성된 수탉의 벼슬로부터 단리해낸 히알루론산은 상당한 염증작용을 나타낸다.

이것은 평균 번자량이 약 50,000에서 100,000되는 히알라스틴이 높은 세포 이동작용을 나타낸다는 것과 이로 인하여 염증작용을 나타내지 않고 상처 치표제로서 유용하다는 것을 보여준다. 그리고 평균 분자량이 약 50,000에서 730,000되는 히알렉틴은 큰 분자량과 고유점성 때문에 안구와 관절내 투여에 유용하다는 것을 보여줌과 동시에 이런 약제 투여를 방해하는 세포 이동작용이나 염증 반응을 더하게 하지 않는다. 좀 더 상세히 말하자면, 히알라스틴이 다음과 같은 특성으로 인해 상처 치료제로서 유용하다는 것이 밝혀졌다.

첫째, 상기 히알라스틴은 종래의 치료에 비해 상처 받은 곳이 빨리 회복되므로 치료 기간이 상당히 단축되었고, 종기 난곳 언저리의 정상화, 새살조직의 빠른 성장, 대식세포와 섬유 아세포의 세포 이동의 활성화, 빠른 상피세포화를 좋게 한다.

둘째, 이것은 좀 더 심한 경우에는 재생적 외과수술에 효과가 있다.

셋째, 미용상으로나 기능적으로 좋은 결과를 억게 하기 위해 흉터 조직을 최종적으로 교정 생성시킬 때 흉터 형성을 막거나 켈로이드를 없게 한다.

상기 히알라스틴 분획물은 욕창, 영양성 궤양, 화상, 통증 없는 상처, 후외상성 궤양, 정맥 혈액재료로부터의 정맥류와 후정맥성 궤양, 피부병, 피부 이식과 단순 포진에 의한 피부병 등의 다양한 상처 치료에 효과적인 것으로 알려졌다. 이런 상처 치료를 위해 히알라스틴 분획물이 그의 나트륨염을 두툼한 가제나 크림 분무기, 앰플과 같은 것을 이용해 투여할 수 있다. 국소 투여를 하기 위해서는 히알라스틴을 미리 유화제와 섞어서 상처 치료용 약품이 수비게 흡수될 수 있도록 물에 잘 분산되는 부형제와 히알루론산의 분산을 용이하게 하고 크림이나 두툼한 가제 같은 것을 이용하여 노출부분으로부터 분비물을 흡수하게 한다.

히알렉틴은 관절염, 급만성외상, 감염이나 관절내로 코티코스테로이드를 계속적으로 주사함으로 인해 통증이 있는 말, 특히 경주용 말의 치료에 좋다고 알려져 있다.

히알렉틴으로 치료할 수 있는 병을 특별히 예로 들면 염증성 또는 비염증성 골관절염, 급만성활막염, 관절연골의 퇴행성 질환, 관절건조병 등이 있는데, 이런 병의 가장 흔한 증상은 고통스럽고 관절기능이 손상을 입으며 관절의 굴곡작용이 감퇴되는 것이다.

본 발명에 따르면 히알렉틴은 종래의 치료에 비해 그 상처입은 말에 대하여 관절 기능에 신속하고도 지속적인 촉진을 도모할 뿐 아니라, 고통과 불안정성을 줄이는데 따른 치료시간을 눈에 띄게 단축시킨다는 것으로 알려졌다. 이와 같은 임상적으로 유용한 효과는 활액의 점성 탄력성의 정상화와 관절내 연골의 조직 치료과정에 활성화를 촉진시켜 주는 것으로 추측된다.

그뿐만 아니라 상기한 히알렉틴의 효과는 국소혹은 전신적으로 독성이 없는 점에서 더욱 촉진된다. 이러한 히알렉틴을 여러번 투여하면 알레르기 반응과 같은 부작용을 일으키지 않고도 지속적인 효과를 나타낸다.

약제 조성물

상기와 같이 히알라스틴과 히알렉틴은 좋은 약리학적 효과를 갖고 있다는 것을 나타내고 있는 바, 다음 예들은 실제적으로 히알루론산의 생체내 투여를 위해 조제 가능한 것을 설명하기 위한 것이다.

A. 상처 치료를 위한 체제

예 1 : 피하주사용 앰플-각 앰플의 함유량 :

-히알스틴 나트륨 염 mg 4

-염화나트륨 mg 16

-주사용 증류수 q.s.a ml 2

예 2 : 피하주사용 앰플-각 앰플의 함유량 :

-히알스틴 나트륨 염 mg 5

-염화나트륨 mg 8

-주사용 증류수 q.s.a ml 1

예 3 : 국소 투여를 위한 스프레이병-병당 함유량 :

-히알스틴 칼륨 염 mg 20

-염화나트륨 mg 80

-주사용 증류수 q.s.a ml 10

예 4 : 국소 투여를 위한 스프레이병-병당 함유량 :

-히알스틴 칼륨 염 mg 30

-만니톨 mg 100

-주사용 증류수 q.s.a ml 10

예 5 : 국소 투여를 위한 스프레이병-크림 함유 튜브당 함유량 :

-히알스틴 나트륨 염 mg 20

-폴리에틸렌글리콜 모노스테레이트 400 mg 1000

-세티올(올레인산의 데실에스테르) mg 500

-라네트 에스엑스(세틸-스테아릴알콜+ mg 150

라우릴설페이트 9 : 1)

-글리세롤 mg 200

-소르비톨 mg 150

-나트륨-디하이드로아세테이트 mg 10

-파라-옥시메틸벤조에이트 mg 7.5

-파라-옥시프로필벤조에이트 mg 5

-재증류수 q.s.a.g 10

예 6 : 국소 투여를 위한 크림-크림함유 튜브당 함유량 :

-히알스틴 나트륨 염 mg 30

-파라핀 젤리 g 3

-폴리틸렌글리콜 모노스테레이트 400 mg 1000

-세티올(올레인산의 데실에스테르) mg 500

-라네트 에스엑스(세틸-스테아릴알콜+ mg 150 라우릴설페이트 9 : 1)

-글리세롤 mg 200

-소르비톨 mg 150

-나트륨-디하이드로아세테이트 mg 10

-파라-옥시메틸벤조에이트 mg 7.5

-파라-옥시프로필벤조에이트 mg 5

-재증류수 q.s.a.g 10

예 7 : 국소 투여를 위한 의양용 가제-10×10cm 가제당 함유량 :

-히알스틴 나트륨 염 mg 3

-글리세롤 g 1

-폴리에틸렌글리콜 g 2

-재증류수 q.s.a.g 3

예 8 : 국소 투여를 위한 의양용 가제-15×15cm 가제당 함유량 :

-히알라스틴 칼륨 염 mg 6

-파라핀 젤리 mg 0.5

-글리세롤 g 1

-폴리에틸렌글리콜 g 2

-재증류수 q.s.a.g 3

예 9 : 상처 치료를 위한 건조분말-건조분말 g당 함유량 :

-히알라스틴 나트륨 염 mg 10

-만니틀 g 0.75

-글라이신 g 0.24

B. 안구내에서 사용하기 위한 제제

예 10 : 1-ml 바이알-각 바이알의 함유량 :

-히알렉틴 나트륨 염 mg 10

-염화나트륨 mg 8

-제1염기성 인산나트륨 2H₂O mg 0.25

-제2염기성 인산나트륨 12H₂O mg 3

-주사용 증류수 q.s.a ml 1

예 11 : 5-ml 바이알-바이알당 함유량 :

-히알렉틴 칼륨 염 mg 60

-만니톨 mg 50

-제1염기성 인산나트륨 2H₂O mg 1.25

-제2염기성 인산나트륨 12H₂O mg 15

-주사용 증류수 mg 5

예 12 : 사전 충전용 주사기-주사기당 함유량 :

-히알렉틴 나트륨 염 mg 40

-염화나트륨 mg 16

-제1염기성 인산나트륨 2H₂O mg 0.8

-제2염기성 인산나트륨 12H₂O mg 8.16

-주사용 증류수 q.s.a.ml 2

C. 관절내에 사용하기 위한 제제

예 13 : 2-ml 바이알-바이알당 함유량 :

-히알렉틴 나트륨 염 mg 40

-염화나트륨 mg 16

-주사용 증류수 q.s.a ml 2

예 14 : 4-ml 바이알-바이알당 함유량 :

-히알렉틴 칼륨 염 mg 60

-만니톨 mg 35

-글라이신 mg 10

-주사용 증류수 q.s.a.ml 4

예 15 : 사전 충전용 주사기-주사기당 함유량 :

-히알렉틴 나트륨 염 mg 25

-만니톨 mg 12

-제1염기성 인산나트륨염 mg 0.5

-제2염기성 인산나트륨염 mg 5

-주사용 증류수 q.s.a.ml 2

이상에서와 같은 실시예는 하나의 실험적인 목적으로 나열되었지만 여기서 본 발명가에 의해서 발견된 히알라스틴산과 히알텍틴의 혼합물이 약제 조성물로 효능이 있음을 알 수 있으며, 희석제나 부형제와 같은 약리적 성질을 가진 칼륨이나 나트륨염은 특별히 조제할 경우 제재을 위해 사용됨을 알 수 있다.

히알라스틴이 상처를 치료하는데 사용될 경우에 분말이나 크림을 가제패드에 묻히거나 뿌려서 상처난 피부 부위에 붙이거나 피하주사로 투여시킨다.

히알렉틴이 관절내에 사용될 경우, 상기와 같은 양만큼을 준비된 주사기나 약병으로부터 관절당 2ml의 비율로 취해 관절에 투여하게 된다.

여러가지 분자들의 부형제로써 히알루론산의 효능은 이미 알려졌으며, 안약의 부형제로 사용될 때에는 각막 상피세포에 적합하고 완전한 효력을 가진다.

히알루론산은 안약의 부형제로 사용하기에 가장 적합하며, 생물학적 액체와 여러가지의 결합조직(관절낭액과 특히 유리체액)으로 존재하는 글리코사미노클리칸이므로 히알루론산의 화학적, 물리적 성질과 타점탄성은 기초적 요체의 구조적인 역활과 생물학적인 역활을 하게 된다. 따라서 히알루론산은 특히 히알라스틴과 히알렉틴은 상이한 분자량을 가지며, 서로 다른 제형 즉 콜리리움이나 겔, 크림, 분말 형태로 만들어지도록 혼합된다.

그러므로, 서로 다른 형태의 안약은 부형제와 같이 상이한 부분에서 생물학적 중합체의 양호한 사용을 위해 만들어지며 연구되고 있다.

부형제와 같은 히알루론산을 함유하는 제제들은 부형제나 특히 안약의 효능과 유용성을 가지는 약과 혼합되어 상승효과를 발휘하며 부형제의 생물학적 효율성을 증대시킨다.

부형재로서 이러한 히알루론산의 잠재성은 특히필로카르핀 질산염, 트티암시놀론, 표피생장인자와 켄타마이신이나 스트렙토마이신과 같은 항생물같은 네 가지의 다른 형태의 안약을 가지고 토끼의 눈에 실험한 결과 그 효능이 입증되었으며, 이러한 약들은 모두 축동성, 함염증성, 치유 및 항균효과를 가지고 있음이 알려져 있다.

더욱이 히알루론산을 부형제로 사용한 스트렙토마이신 항생제의 효능 평가는 안구에 가장 널리 사용되는 항생물질의 하나이므로 대단히 중요하다.

실험 모델과 실험 효과는 다음과 같다.

1) 토끼눈에서 히알루론산을 부형제로 사용한 필로카르핀 질산염의 축동 작용

2) 토끼눈의 덱스트란 유발염증의 모델에서 히알루론산을 부형제로 사용한 트리암시놀론의 소염작용

3) 토끼 각막의 표피세포 손상의 모델에서 히알루론산을 부형제로 사용한 표피생장인자(EGF)의 치유작용

4) 한천 평판 배지에서 바실루스 서브틸리스 6633에 대한 히알루론산을 부형제로 사용한 스트렙토마이신의 항균작용

I. 히알루론산을 부형제로 사용한 필로카르핀 질산염의 축동작용

물질

다음의 물질들은 여러 가지의 필로카르핀 나이트레이트 제제들에 대패 필로카르핀의 부형제로 사용되었음.

-히알루로산 나트륨염 10mg/ml농도, 히알라스틴(M.W., 약 100,000) 20mg/ml 농도.

-히알루로산 나트륨염 10mg/ml농도, 히알렉틴(M.W., 500,000-730,000) 20mg/ml 농도.

-대조용 안과용 부형제로 5% 폴리비닐알콜.

필로카르핀나이트레이트의 2%제제(콜리리움 혹은 겔)를 조제하고 부형제로서 2종의 상이한 히알루론산나트륨염 분획물을 10mg/ml 농도와 20mg/ml 농도로 첨가하였다.

제제 1-필로카르핀 나이트레이트(PiNO₃)(2%)를 함유한 식염수. (참고용으로 사용)

제제 2-5%의 폴리비닐알콜을 부형제로 사용한 필로카르핀 나이트레이트용액(2%).(참고용으로 사용)

제제 3-히알라스틴나트륨염(10mg/ml)을 부형제로 사용한 필로카르핀 나이트레이트용액(2%).

제제 4-히알라스틴 나트륨염(20mg/ml)을 부형제로 사용한 필로카르핀 나이트레이트용액(2%).

제제 5-히알렉틴 나트륨염(10mg/ml)을 부형제로 사용한 필로카르핀 나이트레이트용액(2%).

제제 6-히알렉틴 나트륨염(20mg/ml)을 부형제로 사용한 필로카르핀 나이트레이트용액(2%).

방 법

알비노 뉴질랜드 토끼(2-2.5kg)를 사용하여 토끼의 한쪽 눈에는 시험용 제제를 마이크로주사기(10ml)로 투여하고 다른 한쪽 눈에는 참고용 제제를 투여한 후 눈동자의 직경을 적당한 간격으로 측정하였다. 각각의 시료 용액은 적어도 8마리의 토끼에 대해 시험을 실시하였고 각 눈은 3회 이하로 처리하였으며 각 처리마다 적어도 일주일의 휴식 기간을 두었다.

매개변수 측정

눈동자의 직경은 시간당 축동작용 곡선을 결정하기 위하여 여러 간격으로 측정하고 부수되는 작용변수를 축동/시간그라프로부터 계산하였다.

I_max=처리된 눈과 참고용 눈 사이의 눈동자 직경의 최대 차이

피크타임=I_max에 도달되는데 걸리는 시간

기간=기본 상태를 회복하는데 걸리는 시간

프레토우=절대 축동작용의 기간

AUC=축동/시간 곡선 아래의 면적

결 과

시험 결과를 표 5와 같으며 표 5에서 여러 가지 매개변수를 결정하기 위한 데이타를 볼 수 있으며, 모든 시험 용액에 대한 축동작용시간 곡선으로부터 2% 피르카르핀 나이트레이트용액에 히알루론산의 첨가가 안약의 축정작용을 증가시키는데 기여한다는 것을 알 수 있다.

사실상 안약의 생물학적 효용성은 2% 필로카르핀 나이트레이트(제제 1)을 함유하는 수용액보다 2.7배 이상이 될 수도 있다.

[표 5]

하일루론산을 부형제로 사용한 필로카르핀 나이트레이트의 생물학적 효능

a는 8회 실험의 평균치

히알루론산의 히아렉틴 10-20ml/ml이 부형제(제제 5-6)로 사용될 때 폴리비닐알콜(제제 2)로 부형된 필로카르핀 나이트레이트용액과는 대조적으로 효능이 현저하게 증가됨을 알 수 있다.

부형제로서의 히알루론산사용은 히알루론산을 부형제로 사용할 때 필로카르핀 나이트레이트의 축동효능이 좋아지기 때문에 특히 흥미로우며, 히알루론산을 함유하는 제제(제제 6)들이 기저 상태를 회복하는데 걸리는 시간은 190분 이상인데 반하여 식염만 함유하는 필로카르핀(제제 1)은 11분임을 알 수 있다.

II. 히알루론산을 부형제로 사용한 트리암신놀론의 소염 효능

물질

-식염에 히알루론산 나트륨염-히알렉틴(m.w. 500,000-730,000) 10mg/ml를 녹인 용액.

-트리암시놀론(식염에 10%) 용액

방 법

실험은 뉴질랜드산 숫토끼(평균 무게 1.6kg)를 사용.

텍스트란(10%, 0.1ml)의 눈 내부 주사에 의해 토끼들에게 눈 내부 염증을 유발시킨 후 5일간 반응.

4% 노베시나로 국부 마취를 하고 각막의 팀브스로부터 2mm 떨어진 거리에 있는 전안방으로 주사기의 바늘을 4mm 삽입하여 양쪽 눈에 투여한다.

이 실험은 10마리의 토끼에게 반응시킨다.

치 료

치료는 다음의 물질을 1일 3회에 걸쳐 1회에 3방울씩 각 토끼의 오른쪽과 왼쪽 눈에 6일 동안 투여한다.

-트리암시놀론용액(식염에 10% 용해)을 왼쪽 눈에 투여.

-히알루론산 나트륨염과 히알렉틴(10mg/ml) 및 트리암시놀론(10%) 용액을 오른쪽 눈에 투여.

매개 변수

텍스트란에 의해 유발한 프로지스트 작용에 대한 소염 효과는 1시간, 3시간, 24시간, 48시간, 3일, 4일, 5일, 6일의 간격으로 슬릿램프를 이용하여 눈을 관찰함으로서 알 수 있으며 각 시간에 대해 다음과 같은 관찰을 통해 측정된 눈 실험 결과는 언급된 효과의 상승에 대해 주관적 간격(0에서부터 3까지)으로 표시했다.

-염증제를 안구내에 투여한 후 일반적으로 프로지스트 작용에 민감한 조리개의 관찰과, 부종, 충혈에 대한 연결액과 각막 상태

-틴탈효과 관찰, 불투명한 상태가 다소 과다하면 전안방에 염증인자가 존재하고 있는 것을 의미한다.

결 과

표 6에 보고된 결과로부터 알 수 있는 바와 같이 트리암시놀론의 투여는 홍채에서 항염증효과를 나타내며 전안실에서 박태소실(틴달 효과)를 가져온다. 1-3시간으로부터 3-4일 째까지 명백한 염증과정은 거의 정상상태가 회복될 때까지 점차적으로 감소하여 6일째까지는 눈의 완전한 시력을 갖는다. 다른 한편, 트리암시놀론과 함께 히알루론산 소디움염 히알렉틴 분획물의 투여는 트리암시놀론만의 단독 투여에 관하여 상술했을 때 관찰된 안내염증을 감소시킨다.

즉, 홍채의 염증과정과 전안실의 백태는 24시간까지 감소되고 48시간에서 점차적인 감소를 나타내며 4일째부터 염증반응이 아주 없는 것으로 보여진다.

결막과 각막에서는 텍스트란의 안내투여 후 전혀 현저한 반응이 관찰되지 않았다.

따라서, 히알루론산과 함께 트리암시놀론의 투여는 토끼눈의 보다 신속한 회복에 의해 입증된 바와 같이 약제의 작용을 증량시키는 결과를 가져왔다.

[표 6]

덱스트란에 의해 야기되는 안구내 제제에서의 히알루론산 및 트리암시놀온의 조합효과

* 좌측=트리암시놀온으로 처리된 좌측 눈,

우측=트리암시놀온과 히알렉틴으로 처리된 우측 눈.

a값은 모든 대상 동물에서 일곱차례 관찰한 것으로서 0 내지 3 사이의 값으로 표시한 것이다.

III. 히알루론산을 부형제로 사용한 EGF의 치유작용

물 질

본 실험에는 다음 제제를 사용하였다.

제제 A-식염수에 용해시킨 EGF(표피세포 성장인자)(0.5mg/5ml)

제제 B-식염수에 용해시킨 히알루론산 나트륨염, 히알라스틴(분자량 약 100,000)(10mg/ml)

방 법

실험은 수컷의 뉴우질랜드 토끼(평균무게 1.8kg)를 대상으로 시행하였다. 약 5일간 적응실험을 한 후 대상동물을 적당한 조건에서 노베시아(4%)를 이용하여 국소 마취시키고 상피조직에 장해를 주었다. 이러한 장해는 한쪽 눈의 안쪽에 둥글게 방혈되도록 날카로운 끝을 가진 오목한 유리실린더(ψ3mm)로 생성시켰다.

처 리

대상동물 각각 5마리로 무리져진 그룹에서 다시 세분되었고, 다음과 같이 각막에 한방울씩 떨어뜨려서 약물학적 처리를 하였다.

처리는 매 8시간마다 두 방울씩 각막에 떨어뜨리는 방법으로 총 3번을 오른쪽 눈(RE)에 투약한다.

매개변수

각막의 상피세포를 치료하는 것은 방혈 후에 8시간, 16시간, 24시간, 32시간, 40시간 및 48시간마다 간격을 두고 슬릿램프로 눈을 관찰하고 사진 조사를 하여서 평가한다.

결 과

표 7에서 나타낸 것과 같은 안과실험 1은 눈에 장해를 준 후 완전히 치료한 조사대상(그룹 1)에서 조사한 결과를 나타낸 것이다.

EGF로 처리한 동물(그룹 2)에서 치료 상태는 방혈을 시킨 후 24시간 이내에 괄목할만한 효능(5마리 중 4마리의 대상동물에서)이 나타났다.

히알루론산나트륨염, 히알라스틴 +EGF으로 이루어진 제제 3으로 처리시킨 동물(그룹 3)에서 치료 상태는 방혈시킨 후 모든 대상동물(5마리 모두)에서 완결되었다.

이러한 결과, EGF 부형제로 히알루론산을 사용하면 각막 장해에 대하여 더욱 빠른 치료 효과를 나타내므로서 치료 상태를 높혀주게 되는 것이다.

[표 7]

각막 상피세포에서의 조직 장해의 치료

* 표 7에서, +는 치료되지 않은 눈, -는 치료된 눈을 나타낸다.

Ⅳ. 히알루론산을 부형제로 사용한 겐타마이신의 항균작용

물질

다음과 같은 물질이 사용된다.

○ 식염수에 용해된 겐타마이신(50mg/ml)

○히알루론산 나트륨염 히알렉틴(2mg/ml)

방법

패혈증성 플로고시스(Phlogosis)를 청록색 슈우도모나스의 역가현탁액을 눈 내부로 주입시키므로서 11마리의 토끼양쪽눈에 형성시켰다. 그 다음 패혈증성 플로고시스를 나타내는 토끼들의 오른쪽눈에 겐타마이신이 혼합된 히알루론산 및 히알렉틴을 한방울씩 떨어뜨리고, 왼쪽눈에는 완충된 살린부형제중의 겐타마이신으로 상기와 같이 처리하였다. 이러한 처리(매 6시간마다 3방울씩 처리)는 감염제를 혼입 시킨직후 즉시 시행하기 시작하였으며, 감염균이 없어질때까지 계속하였다.

토끼의 눈을 슬릿램프 하에서 매일때일 관찰하였다.

결과

히알루론산과 겐타마이신의 혼합물로 처리한 결과 항생물질로 처리함에 따라 패혈증성 감염균이 더욱 빨리 없어지는 것으로 나타났으며, 이러한 실험결과는 표 8에서 나타낸 데이타로부터 명백히 알 수 있다.

[표 8]

히알루론산을 부형제로 사용한 겐타마이신의 안내패혈증성 단독(丹毒)에 대한효과

○ 수치는 %를 표시함(단독을 처리한 눈의 수에 대한 치유된 눈의 수)

○ +는 완충부형제에 대한 주요차이값임(0.05이하, 핏셔 정밀 T-Test)

본 발명에 따른 히알루론산을 부형제로 사용한 안약을 예시하여보면 이에 한정하는 것은 아니지만 다음과 같다.

항생제 : 클로람페니콜 믹신(myxin) 및 폴리믹신

네오마이신 바시트라인

오레오마이신 마이세린

호르몬제 : 난드로론 및 난드로론 설페이트

마취제(국소 마취제) : 헤녹시네이트 및 그 염산염.

항바이러스 제 : 요도 데옥시유리딘

요도 데옥시시티닌

소염제 : 덱사메타손 및 그 인산염.

혈관수축제 : 신네프린 및 네오신네프린

결론

상술한 바와같이 실험을 해본 결과, 히알루론산 나트륨염 용액(히알라스틴 및 히알렉틴 둘다에서)은 안약의 부형제로서 사용될 수 있을뿐 아니라, 생물학적으로 다른 활동을 하는 여러형태의 약에 사용될 수 있도록 하는데 효과가 있는 것으로 결론 지울 수 있다.

예컨데, 여기서 말하는 약은 트리암시놀론과 같은 소염제 EGF와 같은 눈의 조직을 치료하는 조직치료제 및 세포분열증식촉진제 그리고 스트렙토마이신 및 겐타마이신과 같은 항생제를 함유하는 것인데, 이 약이 축동제, 소염제, 치료제 및 살균제로서의 효능이 있는 것은 비교적 알려져 있으며, 부형제로서 히알루론산이 효과적으로 사용되고 있다고 말할 수 있다.

또한 여러가지의 분자량을 갖는 히알루론산으로 부형된 안약제제는 숙주에서 완전히 내약성이 있을 뿐 아니라 각막상피의 감광현상에 이상이 생기지도 않는것으로 입증되었다.

그 뿐만아니라 데이타에 의하여 알수 있듯이, 부형제효과가 있는 이러한 생물학적 생산물 즉, 히알루론산은 부형된 약의 생체학적인 유용성을 향상시켜주며, 그러한 약의 의약학적인 효능도 향상시켜 줄 수 있는 것이다.

따라서 이와같은 의약 부형제로서 히알루론산을 사용할 경우의 결과를 살펴동보면 다음과 같은 바, 즉

-약이 효험을 발휘하는 기간동안 필로카르핀 나이트레이트의 축동작용이 증가하고,

-부형시켜 얻어진 것에따라 트리암시놀온이 비교적 짧은 시간에 열소를 없애주므로써 텍스트란에 의해 증가되는 눈 내부의 염증에 대해 트리암시놀론의 소염효능이 증가하고,

-명백한 상승작용이 일어나는 각막에서의 표면장해에 대하여 표피세포성장인자(EGF)가 활동하는 것을 억제하는 현상이 증가하며, 회복시간에 비하여 EGF의 치료시간이 감소되고,

-겐타마이신과 같은 항생물질의 생체학적인 효능이 증가한다.

이러한 여러가지 성질과 작용을 가진 약제용 부형제로서의 생물학적 중합체인 히알루론산을 사용하여 얻어진 결과는 수많은 기타의 안과약제용 부형제로서의 그 잠재개발을 가능케한다.

아래실시예는 상이한 분획물인 히알라스틴 및 히알렉틴중 히알루론산이 사용된 유일한 부형제인 산제, 콜리리움, 겔, 크림, 또는 삽입제의 형태로된 안과용 약제의 상이한 제형의 예를 나타낸 것이다.

[실시예 1]

인공누액으로 사용되는 콜리리움의 처방

-히알루론산소디움염 히알렉틴분획물 10mg

-인산염 pH 7.6M으로 완충된 식염수 10ml

[실시예 2]

인공누액으로 사용되는 콜리리움의 처방

-히알루론산 소디움염 히알렉틴분획물 20mg

-인산염 pH 7.6M으로 완충된 식염수 10ml

[실시예 3]

EGF를 함유한 겔100g의 처방

-히알루론산 소디움염 히알라스틴분획물 55g

-히알루론산소디움염 히알렉틴분획물 30g

-EGF 0.5g

-중복증류수 23.5l

[실시예 4]

필로르핀핀 질산염을 함유한 100mg삽입제의 처방

-히알루론산소디움염 히알라스틴 분획물 100mg

-필로카르핀 질산염 2m

[실시예 5]

스트렙토마이신을 함유한 국소용 산제 100g의 처방

-히알루론산소디움염 히알라스틴분획물 70g

-히알루론산소디움염 히알파스틴 분획물 28.5g

-스트렙토마이신 1.5g

상술한 제제는 예를 든 것이지만 히알루론산분획물 특히 히알렉틴이나 히알라스틴 또는 히알렉틴/히알라스틴 혼합분획물, 또는 그 칼리움 또는 나트륨염류를 기타의 활성 약제와 배합하여 제형을 위한 특수용도에 따라 여러가지 용량으로 약제를 조제할수 있음은 유의할 바이다.

그러므로 특히 실질적으로 순수한 히알렉틴과 히알라스틴분획물에서 히알루론산은 안과이용이나 작용을 가진 여러약제와 배합하여 사용하기 위한 유효한 부형제임이 밝혀졌다.

약제부형제로서 히알루로산분획물을 함유한 약제조성물은 히알루론산분획물이 눈에 대한 고도의 내약성과 각막상피세포와의 높은 배합성을 나타내므로 특히 유용하다.

더우기 히알루론산분획물의 사용은 안과용 약제의 생체내 생물학적 작용을 실제적으로 증강시키기 위한 수단을 제공한다.

특정한 히알렉틴과 히알라스틴 히알루론산분획물의 사용은 눈에 투여할때 이들 분획물이 바람직하지 못한 염증부작용을 나타내지 아니하므로 더욱 유용하고 중요하다.

Claims

실질적으로 순수한 비염증성 히알루론산분획물을 제조하는 방법으로, 이용가능한 양을 함유한 히알루론산의 조직을 탈수시키고, 탈수된 조직을 효소 소화시킨 후, 얻어진 혼합물을 분자 여과하여 평균분자량 약 50,000 내지 100,000,250,000 내지 350,000 또는 500,000 내지 730,000을 가진 히알루론산분획물을 얻어내므로써 약리학적 작용을 가진 히알루론산을 제조하는 방법.
실질적으로 순수한 비염증성 히알루론산 분획물을 제조하는 방법으로, 히알루론산의 추출에 이용가능한 조직을 탈수시키고, 탈수된 조직을 효소 소화 시킨후, 얻어진 혼합물을 30,000의 분자량 추출제한을 가진 박막으로 분자 한외여과시켜 30,000 이상의 분자량을 가진 분자를 추출하며, 상술한 박막에 체류된 혼합물을 모아서 약 250,000 내지 350,000의 평균분자량을 가진 제1 히알루론산분획물을 얻어내므로써, 약리학적 작용을 갖는 히알루론산을 제조하는 방법.
제2항에 있어서, 상술한 제1 히알루론산분획물을 약 200,000의 분자량 추출제한을 가진 박막으로 더 분자 한외여과시켜 200,000이상의 분자량을 가진 분자를 추출하되 혼합물의 용량이 최초용량의 10%로 감소될때까지 한외여과를 계속한후, 박막을 통과하는 혼합물을 모아서 약 50,000 내지 100,000의 평균분자량을 가진 제2 히알루론산분획물을 얻어내는 방법.
제3항에 있어서, 약 200,000의 분자량 추출제한을 가진 박막으로 한외여과단계를 거친후, 박막에 체류된 혼합물을 모아서 약 50,000 내지 730,000의 평균분자량을 가진 제3 히알루론산분획물을 얻어내는 방법.