Patents
Search within
Search within the title, abstract, claims, or full patent document: You can restrict your search to a specific field using field names.
Use TI= to search in the title, AB= for the abstract, CL= for the claims, or TAC= for all three. For example, TI=(safety belt).
Search by Cooperative Patent Classifications (CPCs): These are commonly used to represent ideas in place of keywords, and can also be entered in a search term box. If you're searching forseat belts, you could also search for B60R22/00 to retrieve documents that mention safety belts or body harnesses. CPC=B60R22 will match documents with exactly this CPC, CPC=B60R22/low matches documents with this CPC or a child classification of this CPC.
Learn More
Title
Abstract
Claims
Full Document
Find patents
Keywords and boolean syntax (USPTO or EPO format): seat belt searches these two words, or their plurals and close synonyms. "seat belt" searches this exact phrase, in order. -seat -belt searches for documents not containing either word.
For searches using boolean logic, the default operator is AND with left associativity. Note: this means safety OR seat belt is searched as (safety OR seat) AND belt. Each word automatically includes plurals and close synonyms. Adjacent words that are implicitly ANDed together, such as (safety belt), are treated as a phrase when generating synonyms.
Learn More
Search by
Chemistry searches match terms (trade names, IUPAC names, etc. extracted from the entire document, and processed from .MOL files.)
Substructure (use SSS=) and similarity (use ~) searches are limited to one per search at the top-level AND condition. Exact searches can be used multiple times throughout the search query.
Searching by SMILES or InChi key requires no special syntax. To search by SMARTS, use SMARTS=.
To search for multiple molecules, select "Batch" in the "Type" menu. Enter multiple molecules separated by whitespace or by comma.
Learn More
Patent numbers
Search specific patents by importing a CSV or list of patent publication or application numbers.
Amfoterní materiál na bázi sítované kyseliny hyaluronové, zpusob jeho prípravy, materiály obsahující aktivní cinidla uzavrené v síti hyaluronanu, zpusob jejich prípravy a jejich pouzití
CZ304072B6
Czechia
- Other languages
English - Inventor
Huerta-Angeles@Gloria Chládková@Drahomíra Buffa@Radovan Kettou@Sofiane Velebný@Vladimír
Worldwide applications
Application CZ20110241A events
2011-04-26
2012-11-07
2013-09-25
Description
translated from
Amfoterní materiál na bázi síťované kyseliny hyaluronové, způsob jeho přípravy, materiály obsahující aktivní činidla uzavřené v síti hyaluronanu, způsob jejich přípravy a jejich použití
Oblast techniky
Vynález popisuje nový amfotemí materiál založený na síťované kyselině hyaluronové a způsob přípravy tohoto materiálu. Vynález se dále vztahuje k materiálům obsahujícím zachycení aktivní činidla (například léčiva, růstové faktory atd.) a způsobům jejich přípravy. Dále vynález popisuje použití těchto materiálů jako systémy s řízeným uvolňováním, pro tkáňové inženýrství, krytí ran a regeneraci tkání.
Dosavadní stav techniky
Vynález se týká biokompatibilních materiálů nebo hydrogelů vzniklých z chemicky modifikovaného polyanionického polysacharidu kyseliny hyaluronové. Hyaluronová kyselina neboli hyaluronan (HA) je přírodní mukopolysacharid složený z D-glukuronové kyseliny a V-acetyl-D-glukosaminu spojených s β—1,3 a β—1,4 připojením na lineární polymer s vysokou molekulovou hmotností.
HA se nachází v extracelulámím prostoru a hraje významnou roli v zachování integrity tkáně. HA zlepšuje adhezi a diferenciaci buněk při infekčních procesech, hojení ran a embryonálního vývoje. Ve zvířecích modelech topicky aplikovaná HA zrychluje hojení dermálních ran a snižuje fibrózu a formování jizev. HA se používá jako nosič činidel pro hojení ran a v kosmetických formulacích a v systémech pro dodávání léčiv, protože má velkou schopnost zadržovat vodu a je dobře biodegradabilní. HA je spojená s mnoha biologickými procesy jako jsou tumorogeneze, morfogeneze, záněty a odezva organismu na zranění.
Nativní HA má jednu velkou nevýhodu a to je, že rychle degraduje. Degradace HA modifikuje visko-elastické a mechanické vlastnosti tohoto materiálu, a tudíž i možné aplikace. V předchozích letech je možné sledovat zvýšený zájem o chemicky modifikované deriváty HA, které by měly být méně citlivé na degradaci, enzymatický atak a teplotní změny. HA v chemicky modifikované formě se používá v chirurgii na prevenci adheze tkání po operacích.
Vynález popisuje struktura a syntézu nových amfoterických derivátů HA pro přípravu hydrogelů, které jsou biodegradabilní a biokompatibilní, a tudíž vhodné pro biomedicinální aplikace včetně kontrolovaného uvolňování (Pal, Paulson et al. 2009) tkáňového inženýrství a krytí ran. Vysoce porézní nerozpustné deriváty HA mají rozdílnou difúzi v závislosti na změně okolního pH.
pH - závislé hydrogely jsou druh materiálu, který reaguje na změnu pH a v souladu s tím mění svůj objem. Tyto materiály jsou obzvlášť výhodné pro systémy řízeného uvolňování léčiv (CDDS), protože v různých částech těla se pH mění, jako např. v trávicím traktu, vagíně a cévách (Gupta, Vermani et al. 2002). V předcházejících pracích se věnovala pozornost amfoterickým pH-senzitivním hydrogelům, které nesou kladný i záporný náboj, a proto jsou schopné bobtnání v kyselém i bazickém médiu (Yao, Chen et al. 2003). V tomto vynálezu kontrola bobtnání-smršťování poskytuje konstantní rychlost uvolňování z matrice hydrogelu, což je vhodné pro matrice s trvalým uvolňováním. Proces přípravy finálního materiálu spočívá v chemické modifikaci hyaluronátu sodného (nebo hyaluronanu) pomocí oxidačně-redukční aminace za účelem zavedení sekundárních aminů, které nesou azido nebo alkinovou skupinu, na lineárním polymemím řetězci, a které jsou schopné síťování pomocí click reakce. Tyto chemicky stabilní sekundární aminy hyaluronanu sodného jsou částečně modifikované primární alkoholy glukosaminové části HA.
- 1 CZ 304072 B6
Současná potřeba cílené dopravy do specifických buněk nebo orgánů vyžaduje velmi specifickou lokalizaci cílového místa. Náhlé i prodloužené uvolňování jsou nevyhnutelné v několika pulzních uvolňovacích procesech, aby mohl být aktivní substrát rychle a účinně uvolněn při změně okolních podmínek, které spustí uvolňování. Většina publikovaných prací popisuje formulace, které nemohou kompletně uvolnit aktivní složku.
Dříve popsané reakční podmínky chemicky modifikovaly primární alkoholy polysacharidu, což znamená, že reakce není chemoselektivní. Crescenzi a spol. popsali použití metody click chemie pro získání hydrogelů na bázi hyaluronanu (Crescenzi, Comelio et al. 2007; Těsta, Di Meo et al. 2009). Autoři popsali chemickou modifikaci HA provedené aktivací karboxylových skupin pomocí l-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)karbodiimidu (EDCI).
Jako je známé v literatuře, jednou z hlavních nevýhod aktivace s EDCI je tvorba A-acyl-ΛζΑ'disubstituované močoviny jako vedlejšího produktu reakce. EDCI degraduje ve vodě rychle, a tudíž je nutné použít nadbytek činidla pro získání chemické modifikace, což zvyšuje náklady procesu. Reakční podmínky nemohou být optimalizovány pomocí EDCI s cílem zvýšit stupeň substituce. Crescenzi a spol. připravili hydrogely, které neměly tak dobře organizovanou strukturu. Organizované stěny a poréznost jsou důležité pro aplikaci. Propojená síť podobná přírodní struktuře je charakterizovaná rychlou difúzí a vysokou biokompatibilitou, přičemž Crescenziho materiál tuto vlastnost nemá. Hlavní nevýhodou Crescenziho materiálu je snížená účinnost uvolňování. Je známo, že neúplné uvolňování snižuje biologickou dostupnost terapeutického činidla a mění celkový profil distribuce. Po počátečním prudkém uvolnění autoři nárokují, že nejhustěji síťované hydrogely garantují prodloužené uvolňování, ale neukazují experimentální důkaz pro toto tvrzení a stupeň zesítění nebyl nijak dramaticky zvýšen.
Na druhé straně materiály popsané v patentové přihlášce WO 2008/03525 popisují maximální množství hydrochloridu benzydaminu uvolněné za dobu 3,5 hodin, a to 88 %. V tomto vynálezu je však popsán amfotemí materiál, který je schopný uvolňovat podobné množství hydrochloridu benzydaminu po dobu 8 hodin, a tudíž hydrogel podle vynálezu má strukturu matrice, která umožňuje prodloužené a řízené uvolňování.
V literatuře jsou známy rozdílné práce popisující syntetické hydrogely tvořené zejména polyakrylovou kyselinou a jejími deriváty (Luo, Peng et al.). Tyto materiály nejsou biodegradabilní. Nativní amfoterické hydrogely, např. na bázi chitosanu síťovaného pomocí glutaraldehydu, jsou biokompatibilní a biodegradovatelné. Jejich složení je však nekontrolovatelné a vlastnosti se často mění v jednotlivých šaržích (El-Sherbiny and Smyth; Chen, Tian et al. 2004; Shang, Shao et al. 2008). Také byly navrženy hybridní hydrogely obsahující přírodní i syntetické polymery za účelem kombinace výhod syntetických a přírodních polymerů. Jejich nevýhodou však je, že nejsou kompletně biodegradovatelné (Ferruti, Bianchi et al. 2005).
Použitím click chemie byly vyrobeny a patentovány různé materiály, například patentová přihláška WO 2007/035296 popisuje hydrogenyl, které jsou vytvořeny z hydrofilních polymerů síťovaných bi nebo multifunkčními linkeiy, které jsou schopné cykloadiční reakce. Podobně (Malkoch, Vestberg et al. 2006) připravili hydrogenyl založené na polyethylenglykolu, které se syntetizovaly click chemií za použití tetrafunkčních azidových síťovacích činidel. Potenciální nevýhodou těchto hydrogelů je jejich závislost na bi- nebo multifunkčních, vysoce reaktivních síťovacích činidlech s neznámou biokompatibilitou, což omezuje použití těchto hydrogelů např. v in šitu aplikacích, kde se hydrogel připravuje z reaktantů, které jsou ve styku se živou tkání. Síťování pomocí click chemie bylo také aplikováno přihlašovateli DuPrez a kol. v přihlášce vynálezu EP 2090592-A1, kde se dextran modifikuje pomocí aktivace karbonyldiimidazolem. Deriváty dextran-azidopropylkarbonát a dextran-propargylkarbonát mohou být následně síťované za tvorby chemického hydrogelu. Autoři předpověděli, že karbonátové estery spojené click-chemií mohou rovněž hydrolyzovat při fyziologických podmínkách; přičemž však v přihlášce nepopsali žádnou biologickou kompatibilitu, cytotoxicitu a biodegradabilitu. Další autoři použili click
-2CZ 304072 B6 chemii na polysacharidech jako obecný postup přípravy l->3-(3-D-glukanů, s různými funkčními přídavnými skupinami (Hasegawa, Umeda et al. 2006).
Tankam a spol. demonstrovali, že propargylethery škrobu jsou cennými intermediáty pro přípravu funkčních polysacharidů pro jejich použití v 1,3-dipolámích cykloadicích s benzylazidem („click-chemie“) za vzniku TV-benzyltriazolových derivátů škrobu (Tankam, Míiller et al. 2007).
Podstata vynálezu
Cílem vynálezu je tedy nalézt hydrogely, které vykazují více výhod dříve známých materiálů, a zejména překonat výše uvedené nevýhody. Přesněji řečeno, problém řešený tímto vynálezem je získat netoxický, biokompatibilní materiál na bázi HA, který má vylepšené charakteristiky pro uvolňování léčiv. Tento problém je řešen amfotemím materiálem, kteiý má mnohem organizovanější poréznost, propojené póry, vyšší absorpční a zvlhčovači kapacitu, konstantní rychlost uvolňování léčiva a vyšší uvolňování léčiva uzavřeného v síti hyaluronanu. Další cíle budou zjevné na základě následujícího popisu a nároků.
Nevýhody dosavadního stavu techniky jsou překonány a problém je vyřešen zesíťovaným derivátem HA podle vynálezu, podle obecného vzorce I:
(O kde Ri aR2 jsou nezávisle stejné nebo rozdílné a jsou alifatický, aromatický, arylalifatický, cykloalifatický a heterocyklický zbytek obsahující 3 až 12 uhlíků. Nelimitující příklad pro R, je methyl a nelimitující příklad pro R2 je propyl.
Dále se vynález týká způsobu přípravy tohoto derivátu, obsahujícího tyto kroky:
i) Příprava derivátu sekundárního aminu HA nesoucího alkinovou skupinu, podle vzorce II:
-3 CZ 304072 B6
ii) Příprava derivátu sekundárního aminu HA nesoucího azidovou skupinu, podle vzorce III:
(III) iii) Smíchání derivátu vzorce II a derivátu vzorce III a iv) Cykloadiční reakce derivátu vzorce II a derivátu vzorce III v přítomnosti CuSO4 a askorbátu sodného za vzniku síťovaného derivátu HA.
Krok i) zahrnuje s výhodou kroky a) chemoselektivní oxidace HA v poloze C-6 b) spojení primárního aminu nesoucího terminální alkinovou skupinu na oxidovaný hyaluronan za vzniku alkinyliminu HA c) redukuje alkinyliminu HA za vzniku sekundárního alkinylaminu HA, kde krok a) může být uskutečněný s isolací oxidovaného HA nebo všechny kroky a) až c) jsou provedeny v jedné reakční nádobě (one-pot).
Podobně krok ii) zahrnuje s výhodou krok a) chemoselektivní oxidace HA v poloze C-6 glukosaminové části b) spojení primárního aminu nesoucího azidovou skupinu na oxidovaný hyaluronan za vzniku azid-iminu HA c) redukce azid-iminu HA za vzniku sekundárního azid-aminu HA, kde krok a) může být následován izolací oxidovaného hyaluronanu nebojsou všechny kroky a) až c) provedeny v jedné reakční nádobě (one-pot).
Primárním aminem nesoucím koncovou alkinovou skupinu může být například propargylamin nebo ethinylanilin a primárním aminem nesoucím koncovou azido skupinu může být například 3-azidopropanamin, 1 l-azido-3,6,9-trioxaundekan-l-amin nebo azidoanilin.
Oxidačním činidlem použitým v kroku a) kteréhokoli z kroků i) a ii) může být systém 2,2,6,6tetramethylpiperidin-l-oxylový radikál (TEMPO)/chloman sodný (NaClO) v přítomnosti NaBr nebo NaCl, nebo činidla Dess-Martin Periodinanu (DMP).
Síťovaný derivát získaný v kroku iv) může být ve formě gelu, který je pak lyofilizován, s výhodou kapalným dusíkem nebo ledem.
Krok iii) může dále zahrnovat přidání biologicky aktivních substancí jako jsou léčiva, proteiny, enzymy, biopolymery a biologicky kompatibilní syntetické polymery. Léčiva mohou být vybrána ze skupiny obsahující například analgetika, antibiotika, antimikrobiální látky, cytostatika, protirakovinové látky, protizánětlivé látky, činidla pro hojení ran a anestetika.
-4CZ 304072 B6
Dále krok iv) může být následován osetím vytvořeného síťovaného derivátu růstovými faktory, např. chondrocyty.
Síťovaný derivát HA vzorce I může být např. ve formě gelu nebo skafoldu a může dále zahrnovat v něm uzavřené biologicky aktivní substance vybrané ze skupiny obsahující léčiva, proteiny, růstové faktory, enzymy, biopolymery a biologicky kompatibilní syntetické polymery.
Tento vynález se dále vztahuje na použití síťovaného derivátu pro systémy s řízeným uvolňováním, ve tkáňovém inženýrství, krytí ran nebo v regeneraci tkání.
Přehled obrázků na výkresech
Obr. 1 popisuje chemickou strukturu síťovaného derivátu HA podle vynálezu, podle vzorce I, a jeho amfotemí síť.
Obr. 2 znázorňuje 1 H-NMR spektrum propargyl-2-amin-hyaluronanu (HA-CAPr) v D2O (500 MHz).
Obr. 3 znázorňuje 'H-NMR spektrum azidopropyl-2-amin-hyaluronanu (HA-CAPA) v D2O (500 MHz).
Obr. 4 znázorňuje infračervené spektrum (tenký film) síťovaného materiálu.
Obr. 5 znázorňuje absorpci vody pro hydrogel I v roztocích o rozdílné iontové síle (1M NaCl; 0,1 M NaCl; 0,01 M NaCl; 0,001 M NaCl a 0,0001 M NaCl). Závislosti ukazují vyšší bobtnavost s rostoucí iontovou sílou rozpouštědla.
Obr. 6 znázorňuje fotografii absorpce vody v roztocích o rozdílné iontové síle; zleva doprava: lMNaCl; 0,1 MNaCl; 0,01 MNaCl; 0,001 M NaCl a 0,0001 MNaCl.
Obr. 7 znázorňuje kinetiku bobtnání síťovaného materiálu (I) jako funkci pH.
Obr. 8 znázorňuje kinetiku bobtnání síťovaného materiálu (I) jako funkci iontové síly.
Obr. 9 znázorňuje kumulativní uvolňování benzydaminu ve vodě.
Obr. 10 znázorňuje kumulativní uvolňování benzydaminu v PBS.
Obr. 11 znázorňuje kumulativní uvolňování benzydaminu v pufru při pH=6,0.
Obr. 12 znázorňuje kumulativní uvolňování doxorubicinu ve vodě.
Obr. 13 znázorňuje dostupnost derivátu propargyl 2-amin HA testovanou na 3T3 buňkách v čase.
Obr. 14 znázorňuje dostupnost derivátu azidopropyl-2-amin HA testovanou na 3T3 buňkách v čase.
Obr. 15 znázorňuje cytotoxicitu síťovaného materiálu popsaného v příkladu 9 na 3T3 buňkách v čase.
Obr. 16a-b znázorňuje zastoupení živých i mrtvých buněk chondrocytů osazených ve skafoldu z click-síťovaného hydrogelu. Obrázky z mikroskopu znázorňují povrch skafoldu 6. dne nebo při počátku kultivace (Obrázek 16a) a po 15 dnech kultivace (Obrázek 16b).
Obr. 16c-d znázorňuje obraz z mikroskopu z centrální části skafoldu: 6 den (Obrázek 16c), 15. den kultivace (Obrázek 16d).
Obr. 17 znázorňuje biologickou dostupnost materiálu testovanou na chondrocytech v závislosti na čase. Chondrocyty byly kultivovány 21 dnů.
-5CZ 304072 B6
Obr. 18 znázorňuje povrch materiálu a také řez materiálem v nabobtnalém stavu po lyofilizací kapalným dusíkem. Tento materiál byl získán použitím chemicky modifikované HA s Mw = 200 kDa.
Obr. 19 znázorňuje povrch materiálu a řez materiálem v nabobtnalém stavu po lyofilizací ledem. Tento materiál byl získán použitím chemicky modifikované HA s Mw = 200 kDa.
Obr. 20 znázorňuje SEM mikroobrázek gelu (příčný řez) v nabobtnalém stavu po lyofilizací. Tento hydrogel se inkuboval při 25 °C po dobu 30 dní v pufru při pH=9,0.
Obr. 21 znázorňuje SEM mikroobrázek hydrogelu získaného použitím nízkomolekulové HA (18 kDa), lyofilizovaného v kapalném dusíku (vlevo) nebo v ledu (vpravo).
Příklady provedení vynálezu
V tomto popisu jsou často používány výrazy spojené s důležitými technickými aspekty znaků nebo provedení vynálezu. Pro některé výrazy byly popsány následující definice, které se použijí, pokud konkrétní kontext, v němž jsou použity, nevyžaduje rozdílnou interpretaci.
Kyselina hyaluronová (HA), v rozsahu této přihlášky vynálezu, zahrnuje jak polysacharid ve formě polykarboxylové kyseliny, tak ve formě jejích solí, např. sodnou, draselnou, hořečnatou a vápenatou sůl. HA použitá v tomto vynálezu může pocházet z různých zdrojů; lze ji získat například extrakcí z kohoutích hřebínků (EP 138572 Bl) nebo fermentaci (EP 716688 Bl), a může mít hmotnostně průměrnou molekulovou hmotnost v rozsahu 50 000 až 3 000 000 Da.
Stupeň substituce: v případě polysacharidického řetězce je normálně užitečný stupeň substituce (DS) definován jako počet reaktivních skupin na 100 sacharidických dimerů, v tomto případě HA, tj. představuje počet dimerů, které byly chemicky modifikovány.
Síťovaný materiál, jak je zde používán, je trojrozměrná polymerní síť připravená síťováním jednoho nebo více hydrofilních polymerů. Tento derivát je schopen bobtnání, ale nerozpouští se ve styku s vodou.
Linker, jak je zde používán, je bifunkční chemická struktura (molekula nebo zbytek), která spojuje dva nebo více polymerů kovalentně nebo nekovalentně. Tato přihláška vynálezu popisuje připojení alifatických nebo aromatických aminů odpovídajících vzorci A-R-X kde A= NH2 nebo NH, a R = alifatický, aromatický, arylalifatický, cykloalifatický a heterocyklický substituent obsahující od 3 do 12 uhlíků. X představuje skupinu, která je schopná cykloadiční nebo sigmatropní reakce.
Selektivní oxidace je proces chemoselektivní oxidace v pozici C-6 na hyaluronovém řetězci, který vede ke vzniku geminálního diolu nebo aldehydu neseného řetězcem biopolymeru.
Oxidace a reduktivní aminace v jednom krokuje proces transformace primárního alkoholu polysacharidu na geminální diol nebo aldehyd a přidání primárního nebo sekundárního amino-linkeru a redukce vzniklého imino-intermediátu bez izolace jakékoli reakční složky za účelem vzniku sekundárního a terciárního aminu připojeného na polymerní řetězec.
Cykloadiční reakce: Podle vynálezu má polymer zbytek nebo funkční skupinu, která je schopna cykloadiční reakce. Obzvlášť relevantní jsou cykloadiční reakce, které byly v poslední době středem pozornosti v konceptu nazývaném „click chemie“, neboli tzv. Huisgenova reakce (rovněž nazývaná „Sharpless click reaction“) (Huisgen, R., 1963). Click reakce založená na cykloadici alkinů a azidů je nedávným znovuobjevením reakce, která splňuje mnoho požadavků kladených na připojení linkerů k polymerům procesem po modifikaci, a zahrnuje: a) kvantitativní výtěžky; b) vysokou toleranci funkčních skupin a necitlivost reakce k rozpouštědlům. Základní reakce popsaná v této práci je v současnosti shrnuta pod názvem Sharplessův typ click reakce, která je variací Huisgenovy 1,3-dipolámí cykloadice mezi C-C nebo C-N trojnou vazbou a alkyl—/aryl— nebo sulfonylazidy, popsanou současně Rostovtsevem a Tomoem v roce 2002 (Rostovtsev, Green et al. 2002; Tomoem, Christensen et al. 2002).
-6CZ 304072 B6
Mechanismus uvolňování léčiv: Mechanismus uvolňování léčiv z nabobtnalých matric je určen několika fyzikálně-chemickými jevy. Mezi ty, které jsou považovány za primárně se podílející na modulaci uvolňování léčiv, je kapacita absorpce vody, formování gelové vrstvy a relaxace polymemího řetězce. Rovnice 1 je běžně užívána v analýze procesu uvolňování léčiv z důvodu kategorizace převažujícího mechanismu (Korsmeyer a spol., 1983).
Mt/Mx = kť Rovnice 1, kde Mt/Moo']Q podíl léčiva uvolněného v čase /, A: je kinetická konstanta, a exponent n byl navržen jako indikátor mechanismu uvolňování. V tomto kontextu n = 0,5 indikuje uvolňování dle Fickiana (uvolňování řízené difúzí) a η = 1 indikuje transport řízený čistě relaxací označovaný také jako Čase II transport. Hodnoty mezi 0,5 a 1 indikují anomální chování (ne-Fickianská kinetika odpovídající spojené difuzi/relaxaci polymeru) (Ritger and Peppas 1987). Příležitostně byly pozorovány hodnoty n > 1, které jsou popsány jako kinetika Super Čase II.
Forma s trvalým uvolňováním je prostředek v medicíně charakterizovaný určenou rychlostí uvolňování léčiva pro určitou časovou periodu. Charakterizuje množství léčiva přístupného pro organismus při konstantním uvolňování, které udržuje aktivitu po určitou časovou periodu. Trvalé uvolňování je pomalé, nekontrolované a znamená, že léčivo bude uvolňováno podle kinetiky prvního řádu nezávisle na reakčních parametrech.
Forma řízeného uvolňování: je uvolňování přesně podle kinetiky nultého řádu, a léčivo se tedy uvolňuje nezávisle na své koncentraci.
Amfotemí materiály (AM): Aktivní materiály, které obsahují nebo mají schopnost vytvářet kladně i záporně nabité skupiny při definovaných okolních podmínkách. Jsou schopny vnést do formulace speciální vlastnosti, např. trvalé uvolňování a zvláštní bobtnací vlastnosti. Jejich povaha je předurčuje k použití v aplikacích vyžadujících biologický kontakt. Většina studovaných amfotemích hydrogelů patří do těchto kategorií: syntetické, přírodní a hybridní.
Diferenciace molekulových hmotností („molecular weight cut-off‘) je jev spojený s brzděnou difúzí látek uzavřených v síti, která je spojená s komplikovanější cestou difúze skrz materiál, což v konečném důsledku vede k udržení nízce molekulových komponent uvnitř síťovaného materiálu.
V prvním aspektu vynález popisuje síťovaný derivát HA podle vzorce I:
(I).
kde Ri a R2 je nezávisle stejné nebo rozdílné a jsou alifatický, aromatický arylalifatický, cykloalifatický nebo heterocyklický zbytek s obsahem 3 až 12 uhlíků.
-7CZ 304072 B6
Tento vynález popisuje nový druh materiálu charakterizovaný jako chemicky stabilní, vysoce porézní, necytotoxický a biokompatibilní, který může být použit v různých aplikacích, které odborník zná. Charakteristika materiálu ukázala vysokou propojenost a difúzi, které jsou klíčové pro trvalé a kontrolované uvolňování substancí. Tato přihláška vynálezu popisuje materiál, do kterého mohou být fyzicky inkorporovaný biologicky nebo farmakologicky aktivní molekuly nebo makromolekuly před nebo po samotném síťovacím procesu. Tyto druhy hydrogelů představují materiál s trvalým uvolňováním při změně biologického mikroprostředí. Aplikace těchto materiálů může být obzvlášť výhodná pro hojení ran, kde je nutné, aby po počátečním rychlém uvolnění následoval snižující se další přísun léčiva. Materiály popsané v této přihlášce vynálezu jsou schopny ustanovit specifické acido-bazické interakce, které jim dodávají zvláštní výhody.
Ve druhém aspektu vynález zahrnuje způsob tvorby ve vodě nerozpustného amfotemího materiálu na bázi chemicky modifikované HA (Obrázek 1); kde tento způsob zahrnuje chemickou modifikaci HA založenou na oxidaci a reduktivní animaci ve dvou krocích a reakci označenou ve Schématech 1, 2, 4 a 5, nebo jednokrokový proces (Schéma 3 a 6). Proces vede kamfotemím derivátům polyanionického polysacharidu, kde nejméně jeden řetězec polysacharidu je tvořen kyselinou hyaluronovou síťovanou pomocí 1,3-dipolámí cykloadice. Linkery jsou spojené kovalentně přes sekundární amin na anionický polysacharid. (Obrázek 1), který vykazuje mikroporézní morfologii a vylepšenou mikrostrukturu.
Konkrétněji způsob podle vynálezu obsahuje tyto kroky: i) přípravu derivátu sekundárního aminu hyaluronanu nesoucího alkinovou skupinu; ii) přípravu derivátu sekundárního aminu hyaluronanu nesoucího azidovou skupinu; iii) smíchání derivátu z kroku i) a derivátu z kroku ii); iv) cykloadiční reakci smíchaných derivátů v přítomnosti katalyzátoru za vzniku síťovaného derivátu HA.
Přípravu sekundárního aminu HA nesoucího alkinovou skupinu (krok i) nazývaného jako dipolarofil zahrnující také alkeny, alkiny a molekuly obsahující funkční skupiny s heteroatomem, obecného vzorce II:
lze provést ve dvou krocích, s izolací oxidovaného intermediátu předtím, než proběhne reduktivní aminace, nebo v jednom kroku. Dvoukroková příprava je popsána v schématech 1 nebo 2 (v závislosti na typu použitého oxidantu):
Schéma 1
1) TEMPO; NaCIO; NaBr pH = 9,0; Nz 2) *2%^ reduktivní činidlo, voda
(Π)
-8CZ 304072 B6
Schéma 2
1) DMP; DMSO 2) h2nXrX^ reduktivní činidlo, voda
(li) a zahrnuje a) chemoselektivní oxidaci HA v poloze C-6 glukosaminové části polysacharidů b) navázání primárního aminu nesoucího koncovou alkinovou skupinu na oxidovaný HA za vzniku alkinyl-imin HA c) redukci alkinyl-imin HA za vzniku sekundárního alkinyl-amin HA. Schéma 1 znázorňuje oxidační reakci uskutečněnou s použitím činidla TEMPO, bromidu sodného a chlornanu sodného ve vodě nebo pufru pro selektivní oxidaci C-6. Produkt reakce byl izolován a čištěn. Druhý krok zahrnuje přidání primárního aminu nesoucího alkinovou skupinu za vzniku iminu, který je redukován na sekundární amin. Schéma 2 znázorňuje oxidační reakci provedenou pomocí Dess-Martin Periodinanu v DMSO pro selektivní oxidaci C-6 v poloze 6 glukosaminové části. Produkt reakce byl izolován a čištěn. Druhý krok zahrnuje přidání primárního aminu nesoucího alkinovou skupinu za vzniku iminu, který je redukován na sekundární amin. Příklad jednokrokové přípravy bez nutnosti izolace oxidačního produktu popisuje Schéma 3:
Schéma 3
1) TEMPO; NaCIO; NaBr; pH=9,0; N2
2) NHjRCCH, pH=5,5; 5h 3)reduktivní činidlo
(H)
Schéma 3 ukazuje oxidaci a reduktivní aminaci uskutečněné v jednom kroku pro selektivní modifikaci C-6 nesoucí alkinylovou skupinu, za vzniku derivátu II.
Následující krok ii), tj. příprava derivátu představovaného vzorcem III sekundárního aminu HA nesoucího azidoskupinu nebo 1,3-dipolámí sloučeninu, která může obsahovat jeden nebo více heteroatomů a může být popsána jako obsahující alespoň jednu mesomemí formu s nábojovým dipólem:
(ΠΙ)
-9CZ 304072 B6 může být opět uskutečněna buď ve dvou krocích, s izolací oxidovaného intermediátu před reduktivní aminaci, nebo v jednom kroku. Postup dvoukrokový je popsán ve schématu 4 nebo 5 (v závislosti na typu použitého oxidačního činidla):
(III)
Schéma 5
DMP; DMSO Η2%^Ν3 reduktivní činidlo, voda
(III) a zahrnuje a) chemoselektivní oxidaci HA v poloze C-6 glukosaminové části polysacharidu b) navázání primárního aminu nesoucího koncovou azidovou skupinu na oxidovaný HA za vzniku azidoalkyl-imin HA c) redukci azidoalkyl-imin HA za vzniku sekundárního azidoalkyl-aminu HA. Schéma 4 znázorňuje oxidační reakci uskutečněnou s použitím činidla TEMPO, bromidu sodného a chlornanu sodného ve vodě nebo pufru, pro selektivní oxidaci C-6. Produkt reakce se izoluje a čistí. Druhý krok zahrnuje přidání primárního aminu nesoucího azidovou skupinu za vzniku iminu, který se redukuje na sekundární amin nebo derivát III. Schéma 5 znázorňuje oxidační reakci pomocí Dess-Martin Periodinanu v DMSO pro selektivní oxidaci v poloze 6 glukosaminové části. Produkt reakce sel izoluje a čistí. Druhý krok sestává z přidání primárního aminu nesoucího azidovou skupinu ve vodě za vzniku iminu, který se redukuje na sekundární amin nebo derivát lil.
V případě přípravy v jednom kroku, kde není nutná žádná izolace, proces popisuje následující Schéma 6:
Schéma 6
1) TEMPO/NaClO; NaBr; pH=9,0; N2
2)NHj-R,-N3; pH=5,5;5h 3) Reduktivní činidlo
(1Π)
- 10CZ 304072 B6
Schéma 6 ukazuje oxidaci a reduktivní aminaci uskutečněné v jednom kroku pro selektivní modifikaci polohy 6 s azidyl skupinou (derivát II).
Proces popsaný ve Schématech 3 a 6 se s výhodou provádí následujícím způsobem: HA reaguje 5 s oxidačním činidlem 15 minut při pH 9 až 12, reakce se ukončí změnou pH na 5 až 8 nebo přidáním primárního alkoholu, a pak se k produktu přidá primární amin nesoucí azidovou nebo alkinovou skupinu, což vede ke vzniku chemicky modifikovaných derivátů HA s průměrnou molekulovou hmotností 100 až 200 kDa.
io Cykloadiční reakce derivátu obecného vzorce II a derivátu obecného vzorce III v přítomnosti CuSO4 a askorbátu sodného vede ke vzniku síťovaného derivátu HA podle Schématu 7:
Schéma 7 15
Schéma 7: znázorňuje cykloadiční reakci derivátů propargyl-2-amin-hyaluronanu II a azidopropyl-2-amin hyaluronanu III:
Makroporézní materiál získaný cykloadiční reakcí popsané ve Schématu 7 je zobrazen na Obrázcích 18 až 21. Tyto snímky, získané skenovacím mikroskopem (SEM), ukazují, že materiál má vysoce organizovanou strukturu.
V prvním kroku mohou být použita různá oxidační činidla, např. systém 2,2,6,6-tetramethylpiperidin-l-oxylový radikál (TEMPO)/chloman sodný (NaClO) s přídavkem NaBr nebo NaCl, jak je to znázorněno na Schématech 1, , 4 a 6, nebo Dess-Martin Periodinan (DMP), jak je to znázorněno na Schématech 2 a 5. Oxidace chemoselektivně modifikuje C-6 polohu glukosaminové části hyaluronanu. Vznikající geminální dioly nebo aldehydy mohou reagovat s různými primárními aminy, alifatickými nebo aromatickými, nesoucími koncovou alkinovou nebo azidoskupinu. Nejprve se zavede část nesoucí alkinovou skupinu, například propargyl, jak je to znázorněno v Schématech 1, 2 a 3, postupem chemoselektivní oxidace v poloze C-6 buď procesem oxidace-izolace-reduktivní aminace (Schéma 1 a 2), nebo oxidace-reduktivní aminace v jednom kroku (Schéma 3).
- 11 CZ 304072 B6
Oxidační reakce použitím systému NaClO/TEMPO/NaBr v jednom kroku se provádí ve fosfátovém nebo uhličitanovém pufru při řízeném pH nebo ve vodě při teplotě od 5 °C do 25 °C, s výhodou při 5 °C pod dusíkovou atmosférou, což umožní nižší degradaci modifikovaného polymeru. Reakce se ukončí změnou pH nebo přídavkem isopropylalkoholu nebo ethanolu, za účelem deaktivace oxidačního činidla. Oxidace s použitím DMP se provádí v DMSO. Proces oxidace se provádí na nativní kyselině hyaluronové s různou molekulovou hmotností (od 20 kDa do 2000 kDa). Kompletní proces oxidace a reduktivní aminace dává deriváty o molekulové hmotnosti od 18 do 1000 kDa, s výhodou od 18 do 200 kDa, které poskytují nejstabilnější hydrogely (obrázek 19).
Potom se připraví sekundární amin HA nesoucí azidovou skupinu, například 3-azidylpropyl-2amin-HA, podle popisu ve Schématech 4, 5 a 6 sekvencí chemoselektivní oxidace v poloze C-6 a reduktivní aminace v jednom kroku (Schéma 6) nebo postupem oxidace-izolace-reduktivní aminace (Schémata 4 a 5). Oxidační reakce se provedla ve fosfátovém nebo uhličitanovém pufru při kontrolovaném pH nebo ve vodě při teplotě od 5 °C do 25 °C, s výhodou při 5 °C pod dusíkovou atmosférou. Derivát získaný oxidací pomocí DMP se také podrobí přidání primárního aminu ve vodě nebo fosfátovém pufru. DMP oxidace degraduje významně HA, ale produkované hydrogely jsou stabilní. Zmíněné chemicky modifikované deriváty HA (II a III) mají molekulovou hmotnost od 2 do 1000 kDa, s výhodou od 18 do 200 kDa.
Ve třetí části se provede cykloadiění reakce; aby se mohla provést, musí mít polymer alespoň jednu azidovou nebo alkinovou skupinu na makromolekulu. Stupeň chemické modifikace použitím oxidačně - reduktivní aminace je od 8 do 30 %, v závislosti na reakčních podmínkách. Obrázek 1 znázorňuje 'H NMR spektrum chemicky modifikované HA nesoucí propargylovou skupinu při DS 14 %. Obrázek 2 znázorňuje ’H NMR spektrum chemicky modifikované HA nesoucí 3azidopropylaminovou skupinu při DS 15 %. Výhodný stupeň substituce je 10 až 15 %, který se získá při jednokrokovém postupu. V dalších provedeních se DS může volit z rozmezí 2 až 30, např. 5, 10, 15, 20, 25 a 30.
Reaktivní skupiny cykloadiění reakce jsou spojené s polymerním řetězcem pomocí linkeru obsahujícího stabilní sekundární aminovou vazbu, jejíž získání bylo popsáno v předchozím textu. Zde je sekundární amin představován obecným vzorcem -C-NH-R. Vnesení těchto skupin do makromolekul vázaných sekundárními aminy nebo iminy představuje druhý aspekt tohoto vynálezu.
Amfoterické sekundární aminy začleněné do polymerní sítě (Obrázek 1) poskytují síť se silnějšími interakcemi v rámci materiálu, které mohou zahrnovat vodíkové vazby a hydrofobní interakce, což má vliv na stabilitu výsledného hydrogelu (van Bommel, van der Pol et al. 2004). Vnesení pH citlivých skupin do těchto hydrogelů „click-reakce“ umožňuje nastavitelnost vlastností na molekulární úrovni a vratné „přepínání“ z formy smrštěné na nabobtnanou jako důsledek změny pH (Obrázek 7). Tyto vlastnosti umožňují vytvořit formulace s řízeným uvolňováním, které lze používat pro orální podání podle (Qiu and Park 2001), nebo jako biosenzory nebo jako permeační přepínače (Hoffman 1995).
Materiál připravený tímto způsobem vykazuje vysokou poréznost a dobrou propojenost stěn. Podle výsledků elektronového skenovacího mikroskopu (SEM) má struktura hydrogelu podobu včelích pláství. Vlastnosti materiálu mohou být modifikovány experimentálními parametry jako je molekulová hmotnost HA, stupeň substituce a doba gelace. Při variaci těchto parametrů se získají rozdílné struktury, viz Obrázky 18, 19 a 21.
Použitím amfoterického materiálu podle vynálezu lze spustit uvolňování včleněných činidel, modifikací poréznosti a stability výsledného materiálu. Mezimolekulámí vodíkové vazby mezi sekundárními aminovými zbytky přispívají ke zvýšení stability hydrogelu. Jak ukazuje FT-IR spektrum lyofilizovaných materiálů (xerogelů), NH signály jsou charakteristické pro sekundární aminy vázané vodíkovou vazbou (3320 až 3270 cm4), zatímco signály COO“ aNH2 + skupin jsou mezi 1670 až 1610 cm-1 (Obrázek 4).
- 12CZ 304072 B6
Materiál popsaný v této přihlášce vynálezu je schopen absorbovat téměř 2krát více vody v porovnání s materiálem popsaným Crescenzim a spol. (WO/2008/031525-A1). Absorpce vody dokazuje silnou dipól—dipól interakci v síti. Navíc hydrogely založené na materiálech II a III podporují kultivaci buněk z důvodu jejich vyšší poréznosti a organizovaných stěn. Jak je známo, volný prostor ve skafoldu je nezbytný pro růst tkání a pro rychlou difúzi živin a odpadních produktů.
Materiály byly úspěšně testovány na cytotoxicitu a biodegradovatelnost (Obrázky 13, 14 a 15). Hydrogely se inkubovaly s chondrocyty a bylo zjištěno, že jsou vhodnou matricí pro skafoldy a další pro aplikace ve tkáňovém inženýrství (Obrázek 16a a b). Skutečnost, že hydrogely jsou připraveny z HA, což je biodegradovatelný polymer, zajišťuje jejich biokompatibilitu, což bylo demonstrováno biologickým testováním.
Kromě celkové poréznosti jsou důležitými faktory velikost pórů a vzájemné propojení. Průřez nabobtnaných hydrogelů ukazuje ploché a navzájem propojené póry (Obrázky 18 až 21). Póry mohou mít nepravidelný tvar v závislosti na reakčních podmínkách. Avšak v každém případě jsou stěny propojené.
Materiál na bázi HA mající volné prostory má schopnost nést začleněná léčiva a růstové faktory. Je důležité si uvědomit, že hydrogely nepředstavují kontinuální porézní strukturu na základě kroku lyofilizace, kde je tvorba pórů důsledkem tvorby krystalků ledu a vypuzování molekul vody zachycených v objemu hydrogelu.
Na druhou stranu tento druh materiálu je podobný přírodním sítím (struktura včelího plástve). Průměrný průměr pórů byl stanoven 200 až 300 pm. Pilotní studie ukázaly, že autoklávování nemění geometrii skafoldu, ani nezpůsobuje degradaci. Zavedení kovalentního síťování produkuje 3D síť. Navíc změny v morfologii hydrogelu byly vyhodnoceny po 30 dnech in vitro degradace pomocí SEM. Vzorky se lyofílizovaly v kapalném dusíku, aby se zachovala původní struktura. Všechny gely ukázaly dobrou stabilitu v čase, jelikož nebyly pozorovány žádné změny po 2 měsících v pufrech o různých pH. Tyto závěry byly stanoveny na základě SEM. Struktura byla zachována z důvodu stability sekundárního aminu zavedeného do materiálu (Obrázek 20).
Při navrhování tohoto nového hydrogelu se zvažovala tři klíčová kriteria, u nichž se pak prokázalo, že byla splněna:
i) Vázání přes sekundární amin je stabilní proti degradaci;
ii) Materiál popsaný v tomto patentu nemá žádnou chemickou modifikaci karboxylové skupiny HA, kteráje známá jako rozpoznávací místo hyaluronidázy a HA receptorů. Proto jsou tyto materiály biokompatibilní, jak bylo demonstrováno při kultivaci chondrocytů v příkladu 15;
iii) Složky síťovaného derivátu HA byly testovány jako netoxické, takže vykazují dobrou biokompatibilitu a kontrolovatelné složení hydrogelů.
Věříme, že amfoterismus materiálu podle vynálezu je klíčový pro prodloužené a kompletní uvolňování inkorporovaných látek (řízené trvalé uvolňování). Je to vysvětleno možnými supramolekulámími interakcemi, které řídí uvolňování z hydrogelu, který funguje jako mikronosič. Interakce a geometrie hydrogelu ovlivňuje difúzi molekuly hydrogelem (Kim and Peppas 2002). I když někteří výzkumníci studovali účinek interakcí léčiv a polymeru na uvolňování molekul, nebyl popsán žádný matematický model, který by předpovídal toto chování. Navíc amfoterismus modifikované HA způsobuje samo-uspořádání a intermolekulámí vazby, které vedou k vyšší a lépe organizované poréznosti v hydrogelu. Organizovaná morfologie popsaná v tomto druhu hydrogelu je jedinečná a nezávisí na koncentraci, ale závisí více na samo-uspořádání, které je vysvětleno elektrostatickými interakcemi (dipól—dipól). Při výzkumu bylo zjištěno, že zachycení
-13 CZ 304072 B6 léčiv není řízeno ani stupněm síťování, ani koncentrací léčiva (jak popsal Crescenzi a spol), ale acido-bazickými Lewisovými interakcemi mezi amfoterními hydrogely obsahujícími sekundární aminy a dipólmomentem přítomným v molekulární struktuře různých léčiv. V literatuře je velmi dobře popsáno, že amidy jsou velmi slabé báze, zatímco konjugovaná kyselina k aminu má pKa asi 9,5; konjugovaná kyselina k amidu má pKa asi -0,5. V důsledku toho amidy vykazují ve vodě slabé acido-bazické vlastnosti. Tento nedostatek bazicity se vysvětluje vlastností karbonylové skupiny odebírat elektrony, kde volný elektronový pár na dusíku je delokalizován rezonancí. Materiál podle vynálezu obsahuje sekundární aminy; přítomnost N-H dipólů poskytuje amfotemí funkci při formování donorů i akceptorů vodíkové vazby.
io
Náš způsob poskytuje jasné výhody v porovnání s amidy popsanými v přihlášce vynálezu WO 2008/031525—Al. Tabulka 1 ukazuje porovnání vlastností materiálu popsaného ve WO 2008/031515 „Hyaluronic acid derivatives obtained via click chemistry crosslinking“ a amfoterního materiálu na bázi HA, podle vynálezu, mající porézní morfologii a vylepšenou mik15 rostrukturu. Konkrétně, sekundární aminy se mohou účastnit vázání vody vodíkovou vazbou aktivněji v porovnání s amidovými deriváty. V důsledku těchto acido-bazických interakcí je materiál schopen absorbovat větší množství vody, a tím fungovat jako výhodné zvlhčovači činidlo. Dále, propojené póry umožňují rychlejší absorpci vody difúzí. Tato přihláška vynálezu popisuje způsob přípravy hydrogelů, které jsou schopny překonat pomalou absorpci vody do skelného hydrogelů, protože mají větší schopnost difúze. Konkrétněji,
Tabulka 1 sumarizuje a porovnává uvolňování benzydamin hydrochloridu z materiálu síťovaného click-chemií a popsaného v přihlášce vynálezu WO 2008/031525, a z amfoterního materiálu na bázi HA popsaného v této přihlášce vynálezu.
Tabulka 1
| Médium | tsfl(h) | Í70 (h) | Í88 (h) | |||
| Derivát | WO | AM | WO | AM | WO | AM |
| voda | 1 | 8 | 5 | 15 | ND | 24 |
| PBS pH=7,4 | 1 | 2 | 2 | 4 | 3,5 | 8 |
AM = Amfotemí hydrogel na bázi sloučenin II a III podle vynálezu, kde Ri je methyl a R2 je propyl; WO = materiál popsaný ve WO 2008/031525; ND = nestanoveno; t50 představuje čas v hodinách, po kterém se uvolnilo 50 % benzydamin hydrochloridu, ίγο představuje čas v hodi35 nách, po kterém se uvolnilo 70 % benzydamin hydrochloridu, a ts8 představuje čas v hodinách, po kterém se uvolnilo 88 % původně inkorporovaného benzydamin hydrochloridu.
Materiál popsaný ve WO 2008/031525 zadržuje pouze jednu hodinu 50 % původního benzydamin hydrochloridu inkorporovaného do gelu před gelací, nezávisle na uvolňovacím médiu. Na druhou stranu 50 % toho samého léčiva bylo zadržováno v amfotemím materiálu po dobu 8 hodin, při použití vody jakožto uvolňovacího média, což naznačuje, že jde o „chytrý“ (smart) hydrogel. Navíc, 70 % benzydaminu je uvolněno z WO materiálu po 5 hodinách ve vodě, zatímco to samé množství je uvolněno z amfoterního materiálu podle vynálezu po 15 hodinách, což znamená, že hydrogel je schopen tvořit silnější elektrostatické interakce mezi nabitými moleku45 lamí uvnitř sítě. V PBS vykazuje AM materiál stejné vlastnosti, vyšší retenční čas. Tabulka 1 ukazuje, že Crescenziho materiál (WO) uvolňuje 88 % původně inkorporovaného léčiva po 3,5 hodinách, zatímco AM materiál po 8 hodinách.
- 14CZ 304072 B6
Důležitá charakteristika hydrogelů podle vynálezu je, že polymemí síť obsahuje jak vedlejší COOH skupiny (kompoziční dimery nemodifikované HA), tak i sekundární aminy v hlavním řetězci (-N-), které mohou hydrogelů dodat citlivost na pH (Obrázek 1). Zde v textuje popsána syntéza, charakterizace (obrázky 2, 3 a 4) a charakteristiky bobtnavosti (obrázky 5, 6 a 7) amfotemích hydrogelů na bázi derivátů II a III, kde R| je methyl a R2 je propyl. Obrázek 5 znázorňuje graf popisující absorpci vody hydrogelů na bázi derivátů II a III, kde Ri je methyl a R2 je propyl (pro vzorky znázorněné na obrázku 6). Gely (bez původního sušení) se nechaly 48 hodin bobtnat při teplotě místnosti v mediích s různou a řízenou iontovou silou a výsledky jsou sumarizovány v Obrázku 6. Obrázek 5 znázorňuje, že maximum objemu vody absorbované materiálem je 700 % původní hmotnosti. Ve všech příkladech dosáhly hydrogely maximálního stupně nabobtnání a poté gel začal biodegradovat.
Pro test pH citlivosti se sušené hydrogely daly do média s různým pH při 37 °C na 48 hodin pro dosažení rovnováhy nabobtnání. Pak se hydrogely vyjmuly, utřely navhlčeným filtračním papírem a vážily se každé dvě hodiny až do dosažení rovnováhy. Provedla se i kinetika bobtnání. Vzorky usušeného hydrogelů (xerogelu) se ponořily do média o různém pH: pH = 1,73 (nižší než pKa HA); 7,4 a 9,0 při 37 °C na předem definovaná čas, pak se utřely navlhčeným filtračním papírem a vážily se. Bobtnací média o různém pH se připravila podle evropského lékopisu, iontová síla se udržovala na 1=0,1 M s použitím NaCl v obou testech (kinetika bobtnání i pH citlivost) (Obrázky 7 a 8). Všechny zmíněné experimenty se uskutečnily třikrát a hodnoty bobtnacích poměrů jsou zprůměrované hodnoty tří oddělených experimentů ± SD (n=3).
Kapacita bobtnání hydrogelů (Q), definovaná jako poměr hmotnosti nabobtnaného hydrogelů (Ws) po rozsáhlé dialýze proti destilované vodě nebo roztoku NaCl při různé iontové síle a hmotnosti suchého materiálu, byla zkoumána a vyhodnocena na Obrázku 8. Vzorky se nechaly nabobtnat v destilované vodě nebo v roztocích o různé iontové síle při 25 °C až do dosažení rovnováhy (konstantní hmotnosti).
Pro pH senzitivní hydrogely je transport vody do hydrogelů prvním nevyhnutelným krokem předtím, než může hydrogel fungovat jako senzor nebo jako systém s řízeným uvolňováním. Proto jasné poznání mechanismu transportu vody, a tudíž i samotného bobtnání hydrogelů, je nezbytné pro výběr vhodných léčiv pro zavedení do hydrogelů a pro řízení jejich rychlosti uvolňování. Obrázek 7 znázorňuje účinek pH na kinetiku bobtnání amfoterních hydrogelů na bázi HA jako funkci bobtnacího poměru a času ponoření hydrogelů. Kinetika bobtnání byla studována v různých médiích o pH = 1,73 (nižší než pKa HA), fosfáto-solný pufr pH=7,4 a pH=9,0 při 37 °C. Specifické hodnoty pH byly vybrány proto, že při těchto hodnotách hydrogely vykazovaly nejvyšší stupeň bobtnání. Druhý způsob výpočtu stupně bobtnání, popsaného v této přihlášce vynálezu, byl na základě stanovení objemu; pro tento experiment se experimentálně stanovil objem, který zaujímal 1 g roztoku o 1% w/v koncentraci, na 474 ± 20 mm3 použitím cylindrického modelu. Po 24 hodinách bobtnání v PBS-solném pufru při teplotě místnosti hydrogel zvětšil objem na 677 ± 46 mm3. Po 96 hodinách bobtnání ve stejném médiu měl hydrogel objem 633 ± 44 mm3. Použitím standardní odchylky je možné konstatovat, že hydrogel ztrácí objem, pravděpodobně z důvodu biodegradability. Když je materiál aplikován in vivo, je možné předpokládat urychlení degradace vlivem nativní hyaluronidázy.
Kinetika bobtnání hydrogelů může být přibližně vyjádřená rovnicí 2:
(WS-Wd)/(We-Wd)= k tn Rovnice 2, kde Wd, Ws a We jsou hmotnosti suchého (d), nabobtnaného (s) hydrogelů v čase t a po dosažení rovnováhy (e), v tomto pořadí, kje konstanta související se strukturou sítě hydrogelů, a n je exponent bobtnání indikující mechanismus bobtnání. Když je n < 0,5, hydrogel se řídí podle Fickianovy difúze, ve které je transport vody určen jednoduchým koncentračním gradientem. Když je n = 1, pak je absorpce vody řízena konvekcí, kde relaxace hydrogelů je převažujícím mechanismem pro transport vody. Když je n mezi 0,5 a 1, pak je absorpce vody daná anomální
- 15CZ 304072 B6 difúzí, kde rychlost difúze je srovnatelná s rychlostí relaxace polymeru. Křivky stupně bobtnání v čase byly popsány v logaritmické škále (data nejsou uvedena), kde byla pozorována lineární závislost v počátečních fázích, kde Ws/We < 60 %, podle teorie Peppase o transportu vody do hydrogelů (Ritger and Peppas 1987; Ritger and Peppas 1987). Získané hodnoty n a koeficienty regrese (R2) jsou uvedeny v Tabulce 2.
Tabulka 2
| hodnota pH | n | R2 |
| 1,7 | 0,47 | 0,991 |
| 7,4 | 0,60 | 0,997 |
| 9,0 | 0,73 | 0,994 |
Tabulka 2 vyhodnocuje hodnoty n při rozdílných pH. Nejprve byl vyhodnocen PBS-NaCl pufr o pH=7,4. Vypočtené hodnoty n = 0,6 a 0,73 ve fyziologickém pH, resp. pH 9,0, ukazují, že bobtnání se chová jako anomální difúze. Vypočtená hodnota n = 0,47 při pH=l,7 znamená, že hydrogel se chová podle difúze Fickiana. Jak je naznačené na obrázku 1, při pH=7,4 jsou v hydrogelů přítomny jako -NH2-+ kationty, tak -COO aniony a přítomnost těchto dipólů podporuje další tvorbu vodíkových vazeb v hydrogelů, což následně zabraňuje difúzi vody a stává se krokem omezujícím rychlost bobtnání. Při nižším pH=l,7, kde jsou -NH2 +- kationy a -COOH skupiny protonované, se hydrogel srazí. Silná elektrostatická repulze uvnitř hydrogelů produkuje nabobtnalý hydrogel (Obrázek 7, pH=9,0). Repulze zvyšuje rigiditu a zpomaluje relaxaci. Aby se získalo uvolňování léčiva nultého řáduje nutné zvážit jednak vlastnosti samotného léčiva, které se má inkorporovat do hydrogelů, a jednak velikost a tvar hydrogelů.
Biomateriál podle vynálezu může být ve formě skafoldu pro buněčné kultury a také jako gel obsahující buněčný materiál pro použití ve tkáňovém inženýrství nebo v regeneraci.
Další provedení budou zjevná z následujících příkladů, které ilustrují vynález v některých jeho hlavních aspektech, aniž by omezily jeho rozsah.
Příklady provedení vynálezu
Příklad 1
Příprava oxidovaného hyaluronanu (Ha-ox) g hyaluronanu o různé molekulové hmotnosti odpovídající 125 molámím ekvivalentům monomerní jednotky se rozpouštědlo v 5000 ml denní vody při teplotě místnosti po dobu 24 hodin před reakcí. K tomuto roztoku se přidalo 19,2 g KBr (16,5 mmol) a 10 g Na2HPO4. Reakční směs se ochladila na 0 °C. Reakční směs se evakuovala a naplnila se dusíkem. Pak se k reakční směsi přidal vodný roztok obsahující 10,7 mg 4-acetamido-TEMPO (0,05 mmol), poté se přidalo 0,588 ml (1,25 mmol) chlornanu sodného, (odpovídá 10 % mol přítomného hyaluronanu sodného). Oxidační reakce se prováděla po dobu 2 hodin při 5 °C. Roztok se pak naředil s 5000 ml vody a pH se upravilo na 7,0. Pak se roztok ultrafiltroval za použití centramate kazety (Paal Co) s molekulární cut-off 10 kDa. Produkt se vysrážel pomocí IPA a třikrát se promyl směsí IPA:voda (100:0, 80:20, 60:40). Precipitát se sušil v sušárně při teplotě 60 °C.
-16CZ 304072 B6
Takto získaný produkt z reakce byl charakterizován pomocí analytických metod. Výtěžek reakce: 90 až 99 %. Molekulové hmotnosti získaných produktů jsou popsány níže v tabulce 3 a tabulce 4 jako Mw(0xid0vanáha), protože byly následně použity pro pozdější chemickou modifikaci.
FT-IČ (KBr, cm1): 3419 (υ, -O-H), 2923,2160, 1652, 1614, 1413, 1080, 1939,611.
NMR ’H (500 MHz, NaOD, δ ppm): 3,4 - 4,0 (m, 10H), 4,5 (d, 2H), 5,2 (s, 1H)
DOSY: log D (2,03 ppm C773-CO-NH-Polymer)--10,5 m2/s, log D(5,2 ppm CH2NH-R)~- 10,5 m2/s
Příklad 2
Příprava HA-propylazidoaminu II
Nejprve se připravil linker 3-azidopropanamin následujícím způsobem. 3-Chlorpropylamin hydrochlorid (1,00 g) a azid sodný (2,5016 g, 3 ekv.) se rozpustily ve vodě (10 ml), poté se přidalo katalytické množství KI. Varná baňka se připojila pod zpětný reflux a reakce probíhala při 90 °C po dobu 72 hodin. Po ochlazení směsi na teplotu místnosti se upravilo pH pomocí roztoku hydroxidu sodného na pH 11. Poté se volný amin z reakční směsi vytřepal do etheru. Organická frakce se vysušila pomocí Na2SO4 a zakoncentrovala ve vakuu, aby se zabránilo kompletní suchosti. Aminoazidy s krátkým uhlíkovým řetězcem jsou údajné výbušniny. 'H NMR potvrdila strukturu a čistotu látky. NMR (500,13 MHz, CDC13), 1,41 (2H, bs,-NH2), 1,76 (2H, Q, J = 6,8), 2,81 (2H, t, J = 6,8), 3,38 (2H, t, J = 6,8).
FT-IR (KBr, cm ’): 3363,2941 (o-CH2),2100 (υ-Ν = Ν), 1650, 1593, 1461, 1286.
Potom se připravil HA-propylazidoamin (HA-CAPA) se stupněm substituce 15 % sloučenin linkeru (3-azidopropylaminu) s oxidovanou kyselinou hyaluronovou. Detailní reakční podmínky jsou uvedeny na několika příkladech v tabulce 3. Obecně se oxidovaný hyaluronan rozpustil v baňce s kulatým dnem v 50 ml acetátového pufru (pH=6,0) při teplotě místnosti. Po 24-hodinovém míchání se přidal 3-azidopropylamin a reakce pokračovala při teplotě místnosti po dobu uvedenou v Tabulce 3 jakožto dobu potřebnou pro tvorbu iminu. Pak se k reakční směsi přidal pikolinboran a reakce se nechala probíhat po dobu uvedenou v tabulce 3 jakožto dobu potřebnou pro redukci, zředila se 50 ml vody a nechala se dialyzovat proti směsi 5% NaHCO3/NaCl a buď se lyofilizovala nebo sušila v sušárně při 60 °C. Výtěžky reakce jsou v rozmezí 80 až 95 %. Polydisperzity a příslušné molekulové hmotnosti derivátů jsou shrnuty v tabulce 3.
FT-IČ (KBr, cm '): 3379 (υ, -O-H), 2894, 2008 (υ,Ν3), 1614, 1407, 1078, 613.
NMR *H (500 MHz, NaOD, δ ppm): 2,0 (s, 3H), 2,85 (m, 2H), 3,1 (m, 2H), 3,4 - 4,0 (m, 10H),
4,5 (d, 2H).
DOSY log D (2,03 ppm C//3-CO-NH-Polymer) — 10,5 m2/s log D(2,7 ppm - CH2NH-R) ~ - 10,5 m2/s log D(3,0 ppm - CH2NH-R) — 10,5 m2/s
- 17CZ 304072 B6
Tabulka 3 Reakční podmínky pro syntézu HA-azidopropyl-2-aminu (HA-CAPA)
| M Woxidovaná HA | ^Oxidován | ^linkr | frreduktivni | T A imin | T 1 redukce | SS | MWha- | |
| (kDa)/P | 4 HA (g) | (eq HA) | látka | (h) | (h) | (%) | ČAPA | |
| (eq HA) | (kDa)/P | |||||||
| 1 | 108/1,3 | 0,2 | 0,5 | 3 BCN | 24 | 24 | 15 | 30/1,4 |
| 2 | 300/1,5 | 0,4 | 1 | 3 BCN | 72 | 48 | 15 | 300/1,8 |
| 3 | 300/1,5 | 0,4 | 1 | 3 PB | 72 | 48 | 15 | 31/1,4 |
| 4 | 316/2,0 | 2,0, | 1 | 1 PB | 72 | 48 | 15 | 90/1,4 |
| 5 | 612/1,9 | 2,0, | 1 | 1 PB | 72 | 48 | 15 | 89/1,4 |
| 6 | 612/1,9 | 10,0 | 0,4 | 0,2 PB | 6 | 8 | 15 | 124/1,4 |
| 7 | 755/1,46 | 0,8 | 0,5 | 3 BCN | 24 | 72 | 15 | 170/1,6 |
MW = molekulární hmotnost m = hmotnost n = látkové množství
Timin = doby tvorby iminu
Tredukce ~ doba redukce iminu
PB = pikolinboran
BCN = kyanoborohydrid sodný eq HA = ekvivalent vztažený na dimer HA
SS = stupeň substituce
P = polydispersita
Příklad 3
Příprava HA-propargylaminu (HA-CAPr)
Podrobné podmínky pro přípravu jsou uvedeny na několika příkladech v tabulce 4. Obecně se oxidovaný hyaluronan připravený v příkladu 1 rozpustí ve 40 ml vody při teplotě místnosti po dobu 24 hodin. Do reakční směsi se přidá propargylamin v množství uvedeném v tabulce 4, za účelem tvorby iminu. Tvorba iminu se nechala probíhat po dobu uvedenou v tabulce 4 za současného míchání při teplotě místnosti. Poté se k reakční směsi přidá 1% vodný roztok redukčního činidla (Tabulka 4) a reakce pokračovala po dobu uvedenou jako Tredukce (Tabulka 4). Pak se reakční směs zředila 50 ml vody a buď se důkladně dialyzovala proti vodě a lyofilizovala nebo se přečistila pomocí ultrafiltrace a sušila v sušárně při 60 °C (Tabulka 4).
FT-1Č (KBr, cm’1): 3379 (υ,-0-Η), 2894,2131 (υ, C=C), 1614, 1407, 1078,613.
NMR ’H (500 MHz, NaOD, δ ppm): 2,0 (s, 3H), 2,85 (m, 2H), 3,1 (m, 2H), 3,4 - 4,0 (m, 10H),
4,5 (d, 2H).
DOSY log D (2,03 ppm CH3-CO-NH-Polymer) ~ - 10,5 m2/s log D(2,7 ppm - CH2NH-R) ~ - 10,5 m2/s log D(3,0 ppm - CH2NH-R) ~ - 10,5 m2/s
-18CZ 304072 B6
Tabulka 4 Reakční podmínky pro syntézu HA-CAPr (Schéma 3)
| MWoxidovaná HA (kDa)/ P | ^oxidovaná HA (g) | ^propargylamin (eq HA) | ^reduktivní látka (eq HA) | Timin (h) | Tredukce (h) | ss (%) | MWha-capf (kDa)/ P | |
| 1 | 108/1,3 | 0,2 | 0,5 | 3BCN | 24 | 24 | 19 | 94/1,6 |
| 2 | 108/1,3 | 0,2 | 0,5 | 3BCN | 24 | 24 | 19 | 31/1,4 |
| 3 | 300/1,5 | 0,4 | 1 | 3BCN | 72 | 48 | 21 | 229/1,4 |
| 4 | 300/1,5 | 0,4 | 1 | 3 PB | 72 | 48 | 21 | 165/1,7 |
| 5 | 612/1,9 | 2,0 | 1 | 1 PB | 72 | 48 | 15 | 199/1,6 |
| 6 | 612/1,9 | 2,0 | 1 | 1PB | 72 | 48 | 15 | 199/1,6 |
| 7 | 612/1,9 | 10 | 0,4 | 0,4 PB | 6 | 48 | 12 | 361/1,5 |
| 8 | 612/1,9 | 10 | 0,2 | 0,2 PB | 6 | přes noc | 15 | 124/1,4 |
Příklad 4
Oxidace kyseliny hyaluronové bez sodíku a reduktivní aminace
Ve stručnosti, 5 g kyseliny hyaluronové o průměrné molekulové hmotnosti 1,2 MDa se rozpustilo v 500 ml destilované vody. K rozpuštěnému hyaluronanu se přidal Dowex 50WX8 - pryskyřice (H typu). Po iontové výměně se pryskyřice odstranila centrifugaci při 5000 ot./min po dobu 5 minut. Výsledný roztok se zmrazil na -80 °C a lyofilizoval se. Molekulová hmotnost a polydisperzita polymeru po kationtové výměně se stanovily SEC-MALLS.
1,0 g kyseliny hyaluronové (bez sodíku) o průměrné molekulové hmotnosti 100 kDa se rozpouštělo po dobu 24 hodin při 60°C ve 100 ml DMSO. K reakční směsi se přidalo 0,35 g Dess-Martin Periodinanu odpovídajících 0,8 ekv. kyseliny hyaluronové. Reakce se míchala 6 hodin při teplotě místnosti. Reakční směs se izolovala srážením. Ve stručnosti, směs se pomalu nalila do 2-propanolu (500 ml). Vznikla sraženina, která se zfiltrovala a promyla 4krát 200 ml směsí 2-propanol/DMSO 80:20 a 3krát 2-propanolem (100 ml). Produkt se vakuově sušil přes noc při teplotě 60 °C. Produkt se rozpustil ve vodě a pomalu se nalil do 2-propanolu za míchání. Sraženina se izolovala a charakterizovala. Stupeň substituce podle této metody byl vypočten jako DS = 28 % (DS = [CHjCONH / NH-CH /]).
FT-IR (KBr, cm’1): 3419 (υ,-O-H), 2923,2160, 1710, 1652, 1614, 1413, 1080, 1039,611.
NMR *H (500 MHz, NaOD, δ ppm): 3,4 - 4,0 (m, 10H), 4,5 (d, 2H), 5,2 (s, 1H)
DOSY log D (2,03 ppm C//3-CO-NH-Polymer) ~ -10,5 m2/s log D(5,2 ppm - CH2NH-R) ~ - 10,5 m2/s
Příprava redukovaných derivátů
Obecný syntetický postup je popsán níže. 1 g oxidované kyseliny hyaluronové se rozpustil ve vodě přes noc (100 ml). K tomuto roztoku se přidal propargylamin, kde příslušný amin odpovídá 4,06 ekv. kyseliny hyaluronové přítomné v reakci. Roztok se míchal 48 hodin při teplotě místnosti. Připravil se 1 ekv. roztoku NaBH3CN ve vodě 1 % w/w a přidal se k reakční směsi. Směs se dále míchala 96 h při teplotě místnosti. Po ukončení reakce se roztok dialyzoval proti směsi 0,1% NaCl a 0,1% NaHCO3 a velice proti vodě. Konečný produkt se izoloval lyofilizací.
-19CZ 304072 B6
Redukovaný produkt: propargylový derivát
DS=28% (DS= [CHjCONH/NH-CH]).
FT-IČ (KBr, cm1): 3379 (υ,-0-Η), 2894,2131 (υ, C=C), 1614, 1407, 1078,613.
'H NMR (500 MHz, NaOD, δ ppm): 2,0 (s, 3H), 2,85 (m, 2H), 3,1 (m, 2H), 3,4 - 4,0 (m, 10H),
4,5 (d, 2H).
DOSY log D (2,03 ppm CTfy-CO-NH-Polymer) ~ - 10,5 m2/s log D(2,7 ppm - CH2NH-R) ~ - 10,5 m2/s log D(3,0 ppm - CH2NH-R) ~ - 10,5 m2/s
Molekulová hmotnost izolovaného produktu stanovená SEC-MALLS = 15 kDa, polydisperzita = 1,5
Redukovaný produkt: azidový derivát
DS = 28% (DS= [CH3CONH/NH-CH]).
FT-IČ (KBr, cm’1): 3415 (υ, -O-H), 2921, 2111 (υ, N3), 1614, 1407, 1377, 1078, 613.
'H, HSQC, NMR (500 MHz, NaOD, δ ppm): 2,0 (s, 3H), 2,014 (s, 3H), 2,85 (m, 2H), 3,08 (t, 2H J = 10,95), 3,4 - 4,0 (m, 10H), 4,45 (dd, 1H), 4,53 (dd, 1H).
DOSY log D (2,03 ppm C/Y3-CO-NH-Poiymeru) — 10,5 m2/s log D(2,7 ppm - CH2NH-R) - - 10,5 m2/s log D(3,0 ppm - CH2NH-R) — 10,5 m2/s
Molekulová hmotnost izolovaného produktu stanovená SEC-MALLS = 15 kDa, polydisperzita = 1,5
Příklad 5
Oxidace hyaluronanu a reduktivní aminace v jednom kroku pro získání propargylderivátu
Podrobné podmínky pro několik příkladů syntéz jsou uvedeny v tabulce 5. Obecně, 10,0 g kyseliny hyaluronové s různou molekulovou hmotností, jak je to popsáno v Tabulce 5 jako MWHa, se rozpustilo v 960 ml vody. K tomuto roztoku se přidalo 2,57 g bromidu sodného (2,5 mmol). K reakční směsi se přidalo 38,8 g fosforečnanu sodného za účelem úpravy pH na 9,0. Přidaly se postupně následující reaktanty 53,3 mg 4-acetamido-TEMPO předem rozpuštěného ve vodě (1 ml) a následně 3,0 ml chlornanu sodného. Směs se nechala míchat po dobu uvedenou jako Tjmin (Tabulka 5). Reakční směs se vytemperovala na teplotu místnosti. V tuto chvíli se potenciometricky upravilo pH přidáním kyseliny octové na pH 5,5. Ktéto směsi se následně přidal propargylamin, 0,3 ekv. odpovídajících HA přítomné v reakční směsi. Provedla se reduktivní aminace po dobu uvedenou v Tabulce 5 (Timi„). V tu chvíli se přidalo 0,424 g pikolinboranu, odpovídajících 0,3 ekv. kyseliny hyaluronové. Reakce se nechala pokračovat při teplotě místnosti přes noc. Produkt se přečistil ultrafiltrací. Produkt HA modifikovaná propargylem se zcela charakterizoval běžnými analytickými metodami. Signály použité pro kvantitativní vyhodnocení propargylaminových zbytků navázaných na HA jsou methyly přiřazené HA ve srovnání s methyleny přiřazenými modifikovanému polysacharidu.
DS= (popsáno v Tabulce 5 [CH3CONH/ NH-CH]).
FT-IČ (KBr, cm·'): 3379 (υ,-0-Η), 2894,2131 (υ, C=C), 1614, 1407, 1078,613.
NMR ’H (500 MHz, NaOD, δ ppm): 2,0 (s, 3H), 2,85 (m, 2H), 3,1 (m, 2H), 3,4 - 4,0 (m, 10H),
4,5 (d, 2H).
DOSY log D (2,03 ppm C/Y-CO-NH-Polymer) — 10,5 m2/s log D(2,7 ppm - CH2NH-R) ~ - 10,5 m2/s log D(3,0 ppm - CH2NH-R) --10,5 m2/s
-20CZ 304072 B6
Tabulka 5: Reakční podmínky použité pro syntézu HA-CAPr (Schéma 3)
| MWha | ^oxidovaná HA | filinker | ^redukční látka | Timin | Tredukce | SS | MWha-CAPt | |
| (kDa)/P | (g, %w/w) | (eq HA) | (eq HA) | (h) | (h) | (%) | (kDa)/P | |
| 1 | 19 | (2,0; 1 ) | 0,3 | 0,3 | 5 | 12 | 12 | 17/1,3 |
| 2 | 19 | (2,0; 1) | 0,3 | 0,3 | 5 | 12 | 12 | 17/1,3 |
| 3 | 90 | (10,0; 1) | 0,3 | 0,3 | 5 | 12 | 8 | 84/1,5 |
| 4 | 90 | (10,0; 1) | 0,3 | 0,3 | 5 | 12 | 8 | 83/1,4 |
| 5 | 90 | (20; 1) | 0,3 | 0,3 | 5 | 12 | 12 | 88/1,5 |
| 6 | 90 | (20; 1) | 0,3 | 0,3 | 5 | 12 | 12 | 84/1,5 |
| 7 | 90 | (20; 2) | 0,3 | 0,3 | 5 | 12 | 12 | 87/1,2 |
| 8 | 90 | (20; 3) | 0,3 | 0,3 | 5 | 12 | 12 | 86/1,2 |
| 9 | 90 | (20; 4) | 0,3 | 0,3 | 5 | 12 | 12 | 86/1,2 |
| 10 | 90 | (20; 5) | 0,3 | 0,3 | 5 | 12 | 12 | 86/1,2 |
| 11 | 202 | (10,0; 1 ) | 0,3 | 0;3 | 5 | 12 | 15 | 140/1,2 |
| 12 | 498 | (10,0; 1) | 0,3 | 0,3 | 5 | 12 | 15 | 226/1,8 |
PA: Propargylamin
Příklad 6
Oxidace hyaluronanu a reduktivní aminace v jednom kroku pro přípravu propargyl-derivátu ío (HA-CAPr) při 4 °C (nižší DS).
Podrobné podmínky pro několik příkladů syntéz jsou uvedeny v tabulce 5. Obecně, 10,0 g kyseliny hyaluronové s průměrnou molekulární hmotností 1,8 MDa se rozpustilo v 960 ml vody. K tomuto roztoku se přidalo 2,57 g chloridu sodného (2,5 mmol). K reakční směsi se přidalo
38,8 g hydrogenfosforečnanu sodného za účelem úpravy pH na 9,0. Následně se k roztoku postupně přidaly následující reaktanty: 53,3 mg 4-acetamido-TEMPO předem rozpuštěného ve vodě (1 ml) a 3,0 ml chlornanu sodného. Směs se míchala 15 minut při teplotě 4 °C. Po vytemperování reakční směsi na teplotu místnosti se upravilo potenciometricky pH pomocí přídavku kyseliny octové na pH 5,5. Ktéto směsi se přidal propargylamin (0,3 ekv. odpovídající kyselině hyaluronové v reakční směsi). Reakce reduktivní aminace probíhala 5 hodin. Poté se přidalo 0,424 g pikolinboranu (odpovídá 3,0 ekv. kyseliny hyaluronové) a reakce se nechala probíhat při 4 °C přes noc. Produkt se přečistil pomocí ultrafiltrace. Hyaluronanový produkt modifikovaný propargylem se plně charakterizoval běžnými analytickými metodami. Signály použité pro kvantitativní analýzu propargylaminových zbytků navázaných na HA jsou pro methyly, narozdíl od methylenů, které jsou přiřazeny modifikovanému polysacharidu. Molekulová hmotnost byla stanovena pomocí SEC-MALLS, její průměrná hodnota byla 900 kDa, polydisperzita 1,7.
DS= cca 5% [CH3CONH/ NH-CH/]).
FT-IČ (KBr, cm j: 3379 (υ, -O-H), 2894, 2131 (υ, C=C), 1614, 1407, 1078, 613.
NMR *H (500 MHz, NaOD, δ ppm): 2,0 (s, 3H), 2,85 (m, 2H), 3,1 (m, 2H), 3,4 - 4,0 (m, 10H),
4,5 (d, 2H).
DOSY
-21 CZ 304072 B6 log D (2,03 ppm C//3<O-NH-Polymer) ~ - 10,5 m2/s log D(2,7 ppm - CH2NH-R) ~ - 10,5 m2/s log D(3,0 ppm - CH2NH-R) — 10,5 m2/s
Příklad 7
Oxidace a reduktivní aminace v jednom kroku při teplotě 4 °C HA-azid propyl derivát.
10,0 g hyaluronanu sodného o průměrné molekulové hmotnosti, jak je uvedená v tabulce 6 (MWha) se rozpustilo v 960 ml vody. Roztok se ochladil na 4 °C, k roztoku se přidalo 2,57 g bromidu sodného (2,5mmol). K reakční směsi se přidalo 38,8 g Na2HPO4. Pomocí 0,lM roztoku hydroxidu sodného se upravilo pH reakce na 9,0. Poté se postupně do reakce přidaly následující reaktanty: 53,3 mg 4-acetamid-TEMPO (předem rozpuštěného v 1 ml vody) a následně 3,0 ml chlornanu sodného. Reakce se ponechala za stálého míchání 15 minut při 4 °C. Reakce se udržovala na 4 °C a přidáním kyseliny octové se upravilo její pH na hodnotu 6,0. K této směsi se pak přidal azidpropylamin, v molámím poměru viz tabulka 6 (nnnker) vůči dimeru hyaluronanu sodného přítomnému v reakční směsi. Reakce se prováděla po dobu uvedenou v tabulce 6 jako Tlmin (v hodinách). V tuto chvíli se k reakční směsi přidal pikolinboran v množství podle Tabulky 6 (nreduktivní látka)· Reakce se přečistila ultrafiltrací a opět se vysrážela pomocí různých směsí IPA: H2O. Produkt se sušil při 60 °C a výtěžek byl 95 %. Pomocí SEC-MALLS analýzy se určila molekulová hmotnost, která odpovídala průměrné hodnotě 800 kDa, polydisperzita byla 1,6.
Tabulka 6. Reakční podmínky pro syntézu HA-CAPA.
| MWha | m ha | ttRnker | ^reduktivní látka | Timin | Tredukce | SS | MWha-capa | |
| (kDa)/P | (g, %w/w) | (eq HA) | (eq HA) | (h) | (h) | (%) | (kDa)/P | |
| 1 | 90/1,5 | (10,0; 1) | 0;3 | 0;3 | 2 | přes noc | 10 | 83/1,4 |
| 2 | 90/1,5 | (20,0; 2) | 0;3 | 0;3 | 2 | přes noc | 10 | 85/1,4 |
| 3 | 202/1,5 | (10,0; 1 ) | 1 | 1 | 2 | pres noc | 12 | 127/1,3 |
| 4 | 202/1,5 | (10,0;l ) | 0,3 | 0,3 | 5 | přes noc | 12 | 170/1,2 |
| 5 | 498/1,5 | (10,0;l ) | 0,3 | 0,3 | 5 | přes noc | 15 | 138/1,6 |
| APA: | N3-(CH2),-NH2 |
Příklad 8
Oxidace hyaluronanu a reduktivní aminace v jednom kroku při teplotě 4 °C s 1 l-azido-3,6,9trioxaundekan-2-aminem.
10,0 g hyaluronanu sodného o různých molekulových hmotnostech (viz Tabulka 7) se rozpustilo v 960 ml vody. Roztok se ochladil na 4 °C. Poté se do roztoku přidalo 2,57 g bromidu sodného (2,5 mmol) a 38,8 g Na2HPO4. Pomocí 0,lM hydroxidu sodného se upravilo pH reakce na hodnotu 9,0. Následně se do reakční směsi postupně přidaly 53,3 mg 4-acetamido-TEMPO (předem rozpuštěný v 1 ml vody) a poté 3,0 ml chlornanu sodného. Reakce se ponechala za stálého míchání 15 minut při 4 °C. Reakce se udržovala na 4 °C a pH se upravilo přídavkem kyseliny octové na pH 6,0. Do reakční směsi se následně přidal 1 l-azido-3,6,9-trioxaundekan-l-amin (30 % mol. vzhledem k dimeru hyaluronátu sodného přítomného v reakční směsi). Po 5 hodinách při stejné teplotě se přidalo 0,424 g pikolinboranu (což odpovídalo 30 % mol. dimeru hyaluronátu
-22CZ 304072 B6 sodného). Produkt se sušil při 60 °C a výtěžek reakce byl 95 %. SEC-MALLS analýzou se zjistily molekulové hmotnosti uvedené v Tabulce 7.
DS = [cca 10% CH3CONH / NH-CH/].
FT-IČ (KBr, cm-1): 3379 (υ, -O-H), 2894, 2008 (-N3), 1614, 1407, 1078, 613.
NMR 'H (500 MHz, NaOD, δ ppm): 2,01 (s, 3H), 2,81 (m, 2H), 2,99 (m, IH), 3,36- 3,94 (m, 16H), 4,5 (d,2H).
HSQC (cross-peak): (2,8-50), (3,4-50), (3,7-70), (3,8-70).
DOSY log D (2,03 ppm C7/3-CO-NH-Polymer) — 10,5 m2/s log D(2,7 ppm - CH2NH-R) ~ - 10,5 m2/s log D(3,0 ppm - CH2NH-R) ~ - 10,5 m2/s
Tabulka 7. Reakce s l-azido-3,6,9-trioxaundekan-l-aminem v jednom kroku (HA-CATA).
| MWha | mHA | ^linker | ^reduktivní látka | SS | MW ha-capa | |
| (kDa)/P | (g, %w/w) | (eq HA) | (eq HA) | (%) | (kDa)/P | |
| 1 | 90/1,5 | (1,0; 1 ) | 0;3 | 0;3 | 10 | 89/1,4 |
| 2 | 1300/1,5 | (10,0; 2) | 0;3 | 0;3 | 10 | 268/1,2 |
| 3 | 130/1,5 | (20,0; 1) | 0;3 | 0;3 | 10 | 93/1,5 |
| 4 | 200/1,5 | (20,0;l) | 0;3 | 0;3 | 10 | 170/1,4 |
Příklad 9
Oxidace hyauluronanu a reduktivní aminace v jednom kroku
Příprava 3-azidylanilinového derivátu
5,0 g hyaluronanu (s funkčními aldehydickými skupinami) s průměrnou molekulovou hmotností 611 kDa a polydisperzitou 1,9 se rozpustilo v 500 ml destilované vody při teplotě místnosti po dobu 24 hodin. K tomuto roztoku se přidalo 0,308 g azidoanilinhydrochloridu, což odpovídalo 0,1 ekv. hyaluronátu sodného přítomného v reakční směsi. Roztok se míchal 5 h při teplotě místnosti, poté se do reakce přidal pikolinboran (odpovídá 10 % mol. dimeru kyseliny hyaluronové). Reakce se nechala probíhat při teplotě místnosti přes noc za vzniku HA-azidylanilinového derivátu. Reakce se důkladně dialyzovala proti vodě. Získaný polymer byl analyzován běžnými analytickými metodami. Tato sloučenina se syntetizovala za účelem vyhodnocení reaktivity různých aminů při reduktivní aminaci, aby se vyhodnotila účinnost síťovací reakce elektronickými účinky.
DS = [cca 15% CH3CONH / NH-CH/].
FT-IČ (KBr, cm-1): 3415 (υ, -O-H), 2894, 2121 (υ, -N=N), 1662, 1614, 1407, 1377, 1151, 1078,615.
NMR ’H (500 MHz, NaOD, δ ppm): 2,0 (s, 3H), 2,85 (m, 2H), 3,1 (m, 2H), 3,4 - 4,0 (m, 10H),
4,5 (d, 2H).
DOSY (2,03 ppm C//3—CO—NH-Polymer) = 7,92x10-12) m2/s (3,1 ppm - 4,2 polymer) ~ 7,92x10-12) m2/s (6,85 ppm -o -Ar) ~ 7,92x10-12) m2/s (6,95 ppm —m -Ar) ~ 7,92x10-12) m2/s
-23CZ 304072 B6
Příklad 10
Oxidace a reduktivní aminace v jednom kroku.
Příprava 3-alkinylanilinového derivátu
1,0 g hyaluronanu (s funkčními aldehydickými skupinami) o průměrné molekulové hmotnosti 600 kDa, se rozpustilo ve 100 ml destilované vody při teplotě místnosti po dobu 24 hodin. K. tomuto roztoku se přidalo 0,250 g ethinylanilinu (odpovídá 10 % mol. hyaluronátu sodného v přítomnosti v reakční směsi). Reakce se míchala 5 h při teplotě místnosti. Poté se do reakční směsi přidal pikolinboran suspendovaný ve vodě, což odpovídalo 10 % mol. hyaluronátu sodného. Reakce pokračovala dále po dobu 8 h při teplotě místnosti za vzniku HA-ethinylového derivátu. Reakce se naředila vodou a důkladně se dialyzovala proti vodě. Získaný polymer se analyzoval běžnými analytickými technikami.
DS = [cca 15% CRCONH / NH-CH/].
FT-IČ (KBr, cm j: 3415 (υ, -O-H), 2894, 2121 (o, -N=N), 1662, 1614, 1407, 1377, 1151, 1078,615.
NMR 'H (500 MHz, NaOD, δ ppm): 2,0 (s, 3H), 2,85 (m, 2H), 3,1 (m, 2H), 3,4 - 4,0 (m, 10H),
4,5 (d, 2H).
DOSY (2,03 ppm CH3-CO-NH-Polymeru) = 7,92x10-12) m2/s (3,1 ppm -4,2 polymer) ~ 7,92x10-12) m2/s (6,85 ppm -o -Ar) ~ 7,92x10-12) m2/s (6,95 ppm -m -Ar) ~ 7,92x10-12) m2/s
Příklad 11
Příprava hydrogelů z modifikovaného derivátu II a III ve vodě nebo v PBS
Roztoky připravených derivátů HA-CAPr a HA-CAPA, které měly různou molekulovou hmotnost (od 17 kDa až 900 kDa) a DS, v molámím poměru 1:1, se rozpouštěly přes noc (celkový objem 1,0 ml). Přesná navážka jednotlivých derivátů byla určena na základě jejich stupně substituce (DS) tak, aby se konečná koncentrace obou reagentů udržela na 2 % (w/v) v případě DS = 100 %. Pro studium kinetiky vzniku gelu se ke směsi přidávala různá molámí množství katalyzátoru CuSO4 a askorbátu sodného (Tabulka 8). Po přidání každé látky se vždy směs vortexovala, aby se dosáhlo dobré homogenizace. Pak se reakční roztok několik sekund míchal až do tvorby gelu. Doba gelace se stanovila metodou nakloněné viály podle literatury Domszy et al., 1986. Připravený gel se dialyzoval po dobu 48 hodin proti destilované vodě nebo proti fyziologickému roztoku (fosfátový pufru) obsahujícímu 0,01% (w/v) EDTA za účelem odstranění katalyzátoru. Hydrogely se lyofilizovaly, pak se stanovila hmotnost lyofilizované sítě. Pro analýzu SEM bylo nutné zachovat původní strukturu gelu, proto se gely zamrazily pomocí kapalného dusíku a usušily. Vzorky gelů se před analýzou SEM pozlatily.
-24CZ 304072 B6
Tabulka 8. Vliv reakčních podmínek zesítění různě substituovaných HA-CAPA (DS = 8 až 15 %) a HA-CAPr (DS = 8 až 15 %). Reakce se prováděla v celkovém objemu 1 ml pufru PBS při teplotě 25 °C. Všechny experimenty gelace se nezávisle opakovaly 5krát.
| HA-CAPA | HA-CPr | pokus | c (Cu2')a | c(SA)b | Doba |
| DS (%) | DS (%) | (mM) | (mM) | gelace (s); (%w/v) | |
| 1 | 0,01 | 0,1 | 58±5; (3,5) | ||
| 2 | 0,01 | 0,1 | 85±5 (3,0) | ||
| 3 | 0,01 | 0,1 | 252±5 (2,5) | ||
| 15 | 15 | 4 | 0,01 | 0,1 | |
| 458+20 (2,0) | |||||
| 5 | 2400+60 | ||||
| 0,002 | 0,2 | (2,0) | |||
| 12 | 12 | 6 | 0,02 | 0,5 | 23+2 (2,0) |
| 7 | 0,002 | 0,5 | 30+5 (2,0) | ||
| 8 | 0,002 | 0,02 | 55 ±5 (2,0) | ||
| 9 | 0,001 | 0,02 | NG (2,0) | ||
| 10 | 0,0002 | 0,02 | NG (2,0) | ||
| 10 | 10 | 11 | 0,002 | 0,5 | 37+2 (2,0) |
asíran měďnatý baskorbát sodný NG= negativní gelace
Studie bobtnání různých hydrogelů z příkladů 11
Připravily se různé gely za použití podmínek uvedených v tabulce 8, pokus 3 a 11. Všechny pokusy byly nezávisle opakovány 5krát. Poměr bobtnání je závislý na iontové síle média. Ve vodě dosáhla bobtnavost svého maxima (700 %).
Příklad 12
Uvolňování léčiva benzydamin hydrochloridu z materiálu na bázi síťované kyseliny hyaluronové získaného v příkladu 11
Zavedení léčiva do polymemí sítě se provedlo metodou na základě vytvoření bobtnací rovnováhy a fyzickým inkorporováním. Při prvním postupu se nechaly zesíťované polymery nabobtnat v roztoku léčiva o známé koncentraci po dobu 24, 48 a 72 hodin při 37 °c. Poté se materiály usušily za účelem získání materiálu naplněného léčivem. Změřila se koncentrace odmítnutého roztoku, aby se vypočítalo procento zachycení léčiva v polymemí matrici. Absorpce polymemí sítě však byla velice slabá. Druhá použitá metodika byla fyzická inkorporace. Pro experimenty uvolňování se před gelací vytvořily roztoky benzydaminu o známých koncentracích ve fosfáto-solném pufru s konečnou koncentrací 3, 4 a 5 g/1. 1 ml tohoto připraveného roztoku se použil pro rozpuštění složek (Tabulka 8, pokus 11) v molámím poměru 1:1, které se přes noc hydratovaly (celkový objem 1,0 ml). Přesné množství složek se stanovilo na základě jejich stupně substituce (DS) tak, aby se konečná koncentrace obou reagentů udržela na 2 % (w/v) v případě DS = 100 %.
-25CZ 304072 B6
Destičky hydrogelu se stupněm zesítění 10 % se připravily click-chemií z čerstvě přichystaného roztoku síranu měďnatého (katalyzátoru) a askorbátu sodného (iniciátoru) - viz Tabulka 8, pokus 11. Gelace se nechala probíhat po dobu 2 hodin při teplotě místnosti, a pak započalo stanovení kinetiky. Množství uvolněného léčiva se měřilo u každého případu spektrofotometricky každých 30 minut po dobu dvou dnů, kdy gel dosáhl maximální bobtnavost. Celkové množství uvolněného benzydamin hydrochloridu se vypočítalo na základě kalibrační křivky, která pokrývá koncentraci inkorporovaného léčiva před zesítěním.
Tento příklad ilustruje kinetiku uvolňování benzydamin hydrochloridu zachyceného v materiálu, který se volně uvolňuje z gelů (profily uvolňování léčiv se vyhodnocovaly in vitro a jsou znázorněny na obrázcích 9, 10 a 11). Pro analýzu účinku složek na fyzikální vlastnosti se použily rovnice Higuchi a Ritger-Korsmeyer-Peppas (Korsmeyer, Gumy, Doelker, Buri a Peppas, 1983; Ritger & Peppas, 1987a, b), které jsou metodami nezávislými na modelu. Pro analýzu závislou na modelu jsou tyto dva teoretické modely vhodné pro uvolňování léčiva z polymemích systémů. Korsmeyer-Peppasův model byl použit nejprve k výpočtu korelačního koeficientu pro získané údaje o uvolňování. Korelace kinetických křivek popsané v modelu jsou uvedeny v Tabulce 9, za použití benzydamin hydrochlorid jako modelového léčiva pro uvolnění do média o různém pH.
Tabulka 9.
Korsmeyer-Peppasův model použitý pro vyhodnocení difúzního exponentu (n).
| Pokus | Účinek pH | Difúzní exponent (n) | Model | R2 | t50 doba (min) |
| 1 | 2 | 0,3805 | K-Peppas | 0,9957 | 80± 10 |
| 2 | 4 | 0,4940 | K-Peppas | 0,9999 | 100 ±10 |
| 3 | 6 | 0,5466 | K-Peppas | 0,9953 | 110 ±10 |
| 4 | Destilovaná voda | 0,4840 | K-Peppas | 0,9997 | 480±10 |
| 5 | 7,4 | 0,5323 | K-Peppas | 0,9996 | 120 ±10 |
| 6 | 8 | 0,4707 | K-Peppas | 0,9998 | 95 ±10 |
| 7 | 10 | 0,3389 | K-Peppas | 0,9995 | 7200±20 |
Iso představuje dobu uvolnění 50 % léčiva z počáteční koncentrace inkorporovaného léčiva
R2 znamená koeficient stanovení po lineární regresi.
Na základě nejvhodnějších hodnot parametrů modelu je popsána závislost rychlosti uvolňování. Amfotemí materiál podle vynálezu představuje mechanismus anomální difúze; proto se léčivo uvolňuje v čase nezávisle na koncentraci a ukazuje jasnou závislost na pH uvolňovacího média. Na druhou stranu bylo zjištěno, že hodnota difúzního exponentu (n) se nemění v důsledku koncentrace, což znamená, že transportní mechanismus se nemění v důsledku nehomogenity sítě. Za použití Fickianova modelu, který se běžně aplikuje při stanovování koeficientů zdánlivé difúze, když jsou přítomny intramolekulámí interakce, výsledky ukázaly, že se koeficient zdánlivé difúze uvnitř hydrogelu výrazně liší od koeficientu v roztoku. Tento rozdíl se připisuje bráněné difúzi do hydrogelu, kde látky postupují materiálem obtížnější difúzní cestou. Transportní mechanismus materiálů podle vynálezu probíhá podle ne-Fickianovy difúze a nikoli eroze, a proto lze materiál považovat za stabilní v průběhu doby analýzy. Množství léčiva uvolněného při pH = 2,0 pufru bylo nižší v porovnání s uvolňováním v médiu o pH = 4,0, 6,0, 8,0 a 10,0. Uvolnění 50 % léčiva z celkového množství při pH = 2,0 nastalo po 80 minutách ± 10, při pH 4,0, 6,0, 8,0 nastalo po 100 minut ± 10 minut a při pH 10,0 nastalo po 7200 minut ± 20 minut. Hodnoty difúzního exponentu a uvolnění t50 jsou uvedeny v tabulce 9.
-26CZ 304072 B6
Difúzní exponenty (n) pro pH = 4, 6 a 8 naznačují, že mechanismus vedoucí k uvolnění benzydaminu má anomální transport s konstantní rychlostí uvolňování. Tento druh mechanismu je vhodný pro dávkovou formu s řízeným trvalým uvolňováním.
Příklad 13
Uvolňování doxorubicin-hydrochloridu z materiálu na bázi síťované kyseliny hyaluronové, získaného v příkladu 10
Při experimentu se před gelací připravil fyziologický fosfátový roztok o známé koncentraci doxorubicinu hydrochloridu, což dalo konečnou koncentraci (2 g.l-1)· V 1 ml takto připraveného roztoku se rozpustily jednotlivé složky v molámím poměru 1:1a nechaly se hydratovat přes noc. Přesné množství jednotlivých složek se stanovilo na základě jejich stupně substituce (DS) tak, aby se konečná koncentrace obou reagentů udržela na 2 % (w/v) v případě DS = 100 %. Připravily se destičky hydrogelu se stupněm zesítění 10 %, za podmínek uvedených v Tabulce 8, pokus 11.
Množství uvolněného léčiva se měřilo spektrofotometricky pro každý případ každých 10 hodin, po dobu 30 dnů. Kumulativní uvolňování doxorubicinu se vypočítalo pomocí kalibrační křivky za použití koncentrace, která pokrývá inkorporované množství léčiva před zesítěním, aje znázorněno na obr. 12. Maximální množství doxorubicinu se uvolní do fyziologického fosfátového roztoku během 466 hodin aje rovno 15 % původního množství léčiva v hydrogelu. Při použití vody jakožto uvolňovacího média se opět uvolní maximální množství doxorubicinu ve výši 15 %, ale v kratší době, v tomto případě 186 hodin. V případě doxorubicinu difúzní exponent naznačuje Fickianovu difúzi pro uvolňování v PBS a transportní systém super čase II, n > 1. Podobné tendence byly pozorovány pro další druhy amfotemích hydrogelů již dříve zmíněných v literatuře (Ferrero, Munoz-Ruiz & Jiménez-Castellanos, 2000; Rao, Devi a Buri, 1990). Tento typ mechanismu lze přičíst zvýšení plastifikace na hranici relaxace (gelová vrstva) (Ritger & Peppas, 1987b). Podle SEM nebyl doxorubicin vykrystalizován (údaje nejsou uvedeny).
Příklad 14
Buněčná viabilita, proliferace a diferenciace v chemicky modifikovaném hyaluronanu a v zesítěném materiálu
Chemicky modifikovaná HA
Připravily se roztoky obou derivátů z Tabulky 8, pokus 11 (1% w/v) v případě DS = 100 %. V případě modifikovaného polymeru se stupněm substituce DS = 10 %, je 10 % polymeru modifikováno tak, že obsahuje acetylglukosaminovou část obsahující připojenou azidovou nebo propargylaminovou skupinu, a 90 % nemodifikovanou acetylglukosaminovou část. Proto z každých 10 dimerů HA je 9 nemodifikovaných dimerů a 1 modifikovaný dimer. Přesná množství reagentů jsou vždy stanovena na bázi stupně substituce neboli DS (stanoven pomocí NMR). Koncentrace reagentů se tedy vypočítá na základě modifikované části HA, ale koncentrace polymeru musí být vždy vyjádřena jako % w/v celkového množství polymeru, protože modifikovanou část nelze izolovat z celé makromolekuly. Připravené roztoky se přefiltrovaly za vzniku sterilních roztoků, které se nezávisle testovaly na viabilitu a cytotoxicitu. 2000 (3T3) buněk se osadilo do jamek na 96jamkových destičkách. Buňky se kultivovaly 24 hodin, a pak se ošetřily testovaným roztokem. Pak se do každé jamky přidal testovaný roztok jakožto ředicí médium tak, aby konečná koncentrace testovaného roztoku v jamce 100, 500, 1000 pg/ml. Viabilita buněk se měřila 0, 24, 48, 72 hodin po ošetření, za použití 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-difenyltetrazoliumbromidového testu (MTT). Ke 200 μΐ buněčné kultury v každé jamce se přidalo 20 μΐ zásobního roztoku MTT (5 mg/ml). V tomto testu se MTT redukuje živými buňkami na modrou sůl formazanu, která se
-27CZ 304072 B6 později uvolňuje z buněk a stanovuje se spektrofotometricky. Destičky se inkubovaly při 37 °C v inkubátoru pro buněčné kultury po dobu 2,5 hodin. Pak se odstranil všechen roztok MTT a přidalo se 220 μΐ lysačního roztoku. Buňky se lysovaly 30 minut při teplotě místnosti na třepačce, a pak se změřila optická hustota pomocí čtečky mikrodestiček VERSAmax při 570 nm podle standardního analytického protokolu. Experiment byl doplněn sadou kontrolních buněk kultivovaných v běžném médiu bez ošetření a slepými vzorky. Všechny experimenty byly nezávisle provedeny alespoň šestkrát.
Viabilita a navázání buněk se vyhodnotilo fluorescenčním mikroskopem za použití živé/mrtvé viabilitní sady (Eukolight). Porézní struktury pozorované u zesítěných materiálů naznačují jejich potenciální využití jako skafoldy pro infiltraci a růst buněk. Proto byla testována i viabilita buněk u zesíťovaného materiálu.
Test zesíťovaného materiálu
Připravil se sterilní roztok derivátů o stupni substituce DS = 10 %, za použití PBS pro získání konečné koncentrace 2 % (w/v) pro stupeň substituce 100 %. Materiál se zesíťoval přídavkem CUSO4.5H2O a askorbátu sodného (takové množství CuSO4.5H2O, aby jeho koncentrace ve výsledném roztoku byla 0,002 M a askorbátu sodného 0,02 M). Zesítěné deriváty se promyly 3krát 10 ml PBS a 3x kultivačním médiem. Materiál se zcela rozdrtil a homogenizoval. Pak se materiál sterilně lyofilizoval. 1,0 g nadrceného materiálu (hmotnost sušiny) se opět nechal nabobtnat s použitím 8 ml PBS. Do každé jamky (kterájiž obsahovala buňky) se přidalo 0,5; 1,0; 1,3; 2,0 a 3,0 ml tohoto roztoku a provedl se test na viabilitu a cytotoxicitu stejným způsobem jako u derivátů, přímým stykem s buňkami. Pro získání základních informací o metabolismu a proliferaci buněk při jejich kontaktu se zesíťovaným materiálem se použil MTT test viability. Tento experiment se opakoval třikrát. Změřila se optická hustota a vypočítala se procenta vzhledem ke kontrolnímu vzorku jako poměr hodnot optické hustoty k hodnotě optické hustoty neošetřených buněk, vynásobený lOOkrát, pro každé opakování, a pak se vypočítal průměr.
Závěr
Na základě získaných výsledků z testů viability buněk bylo zjištěno, že deriváty uvedené v Tabulce 8, pokus 11, nebyly cytotoxické pro buněčnou linii 3T3 ve všech testovaných koncentracích (100 μg/ml, 500 μg/ml a 1000 pg/ml). Vypočítala se průměrná procenta vzhledem ke kontrolnímu vzorku a standardní odchylka přístrojů (SEM) a účinek roztoku derivátů je znázorněn na obr. 13 pro propargyl-2-amin-HA a na obr. 14 pro azidopropyl-2-amin-HA. Ani zesítěné deriváty nebyly pro buněčnou linii 3T3 cytotoxické (obr. 15). Viabilita buněk po inkubaci v médiu obsahujícím různé koncentrace derivátů, jakož i zesíťovaných derivátů, se nijak významně nezměnila ve sledovaném čase 24 až 72 hodin po ošetření.
Příklad 15
Biodostupnost chondrocytů a osetí ve skafoldu na bázi derivátů II a III
150 mg HApropargyl-2-aminu a 150 mg HA-azidopropyl-2-aminu (oba sterilní) se rozpustilo ve 3 ml PBS a smíchalo se 3 μΐ lOmM CuSO4 x 5 H2O a 400 μΐ 2,5M askorbátu sodného. Tato směs se rozdělila po 100μ1 alikvotních dílech do 96jamkové testovací destičky. Gelace probíhala v termoboxu při 37 °C po dobu 2 hodin. Nově vytvořené gely se namočily do lázně obsahující v lmM Na2EDTA (Sigma) a 3x se promývaly po dobu 1 hodiny na orbitální třepačce. Poté se gely promývaly 1 hodinu v roztoku PBS pufru, a pak 4x v injekční vodě. Gely se zamrazily na -80 °C a lyofílizovaly za sterilních podmínek. Osetí gelu se provedlo přenosem každého válce lyofilizovaného skafoldu do oddělené jamky 24-jamkové testovací destičky a osely se 200 μΐ suspenze 3T3 buněk (lxlO6 buněk), které se nalily na povrch skafoldu. Suspenze se nechaly stát 1 hodinu, aby se absorbovaly do suchého skafoldu v termoboxu při 37 °C, a pak se celé 24jamkové testovací destičky se skafoldy odstřeďovaly rychlostí 1200 ot. 10 minut. Po centrifugaci se ke každému skafoldu přidal 1 ml kultivačního média a destičky se umístily do termoboxu při 37 °C, 5% CO2 a ve zvlhčené atmosféře. Druhý den se každý skafold přenesl do nové jamky s 1 ml čerstvého média. Médium se vyměnilo každé 2 až 3 dny. Každý skafold se umístil do 5 ml roztoku
-28CZ 304072 B6
PBS pufru se 4 μΐ calcein AM (Sigma) a 1 μΐ ethidium homodimeru a destičky se umístily do orbitální třepačky na 2,5 hodiny. Pak se každý skafold 3x promyl 20 ml PBS a pozoroval se fluorescenčním mikroskopem (Obr. 16a-d). Obr. 17 znázorňuje test viability (ATP) lidských chondrocytů (6P) v přítomnosti skafoldu připraveného ze zesíťovaného materiálu na bázi derivátů II a III, popsaného na schématu 7. Pro toto testování se připravily dva roztoky za použití koncentrací 0,1 a 1 % w/v, n=5, ± SEM. Buňky se osely v hustotě 5000 buněk na cm2 a předem se kultivovaly po dobu 6 dní. Zesíťovaný materiál se testoval po 6. dni a během 15 dní kultivace. Tento graf ukazuje, že aktivita buněk rostla v čase, což znamená, že se buňky množily a rostly do skafoldu.
Další provedení jsou v rozsahu následujících nároků. Například může rozsah reakcí zvýšen pro komerční výrobu kompozice podle vynálezu. Odborník rovněž pochopí, že změnou poměru polyanionického polysacharidu se změní vlastnosti konečného materiálu.
Odkazy používané pro porovnání chemických vlastností
Crescenzi, V., Comelio, L., Di Meo, C., Nardecchia, S., & Lamanna, R. (2007). Novel Hydrogels via Click Chemistry:Synthesis and Potential Biomedical Applications. Biomacromolecules, 8(6), 1844-1850.
El-Sherbiny, I. M., & Smyth, H. D. C. Poly(ethylene glycol)-carboxymethyl chitosan-base pHresponsive hydrogels: photo-induced synthesis, characterization, swelling, and in vitro evaluation as potential drug carriers. Carbohydrate Research, 345(14), 2004-2012.
Ferrero, C., Muňoz-Ruiz, A., & Jiménez-Castellanos, M. R. (2000). Fronts movement as a useful tool for hydrophilic matrix release mechanism elucidation. International Journal of Pharmaceutics, 202(1-2), 21-28.
Ferruti, P., Bianchi, S., Ranucci, E., Chiellini, F., & Caruso, V. (2005). Novel Poly(amidoamine)-Based Hydrogels as Scaffolds for Tissue Engineeringg. Macromolecular Bioscience, 5(7), 613-622.
Gupta, P., Vermani, K., & Garg, S. (2002). Hydrogels: from controlled release to pH-responsive drug delivery. Drug Discovery Today, 7(10), 569-579.
Hasegawa, T., Umeda, M., Numata, M., Li, C., Bae, A.-H., Fujisawa, T., Haraguchi, S., Sakurai, K., & Shinkai, S. (2006). ['JClick chemistry' on polysaccharides: a convenient, generál, and monitorable approach to develop (l->3)-[beta]-d-glucans with various functional appendages. Carbohydrate Research, 341(1), 35—40.
Hoffman, A. S. (1995). „Intelligent“ Polymers in Medicine and Biotechnology. Artificial Organs, 19(5), 458-467.
Chen, L., Tian, Z., & Du, Y. (2004). Synthesis and pH sensitivity of carboxymethyl chitosanbased polyampholyte hydrogels for protein carrier matrices. Biomaterials, 25(17), 3725-3732. Kim, B., & Peppas, N. A. (2002). Complexation Phenomena in pH-Responsive Copolymer Networks with Pendent Saccharides. Macromolecules, 35(25), 9545-9550.
Kosmeyer, R. W., Gumy, R., Doelker, E., Buri, P., & Peppas, N. A. (1983). Mechanisms of solute release from porous hydrophillic polymers. International Journal of Pharmaceutics, 15(1), 25-35.
Luo, Y., Peng, H., Wu, J., Sun, J., & Wang, Y. Novel amphoteric pH-sensitive hydrogels derived from ethylenediaminetetraacetic dianhydride, butanediamine and amino-terminated poly(ethylene glycol): Design, synthesis and swelling behavior. European Polymer Journal, 47(1), 40^17.
Malkoch, M., Vestberg, R., Gupta, N., Mespouille, L., Dubois, P., Mason, A. F., Hedrick, J. L., Liao, Q., Frank, C. W., Kingsbury, K., & Hawker, C. J. (2006). Synthesis of well-defined hydrogel networks using Clicck chemistry. Chemical Communications(26), 2774-2776.
Pal, K., Paulson, A. T., Rousseau, D., Stefan, K., lan, T. N., & Johan, B. U. (2009).
Biopolymers in Controlled-Release Delivery Systems. Modem Biopolymer Science pp. 519— 557). San Diego: Academie Press.
Qiu, Y., & Park, K. (2001). Environment-sensitive hydrogels for drug delivery. Advanced Drug Delivery Reviews, 53(3), 321-339.
-29CZ 304072 B6
Rao, K. V. R., Devi, K. P., & Buri, P. (1990). Influence of molecular size and water solubility of the solute on its release from swelling and erosion controlled polymeric matrices. Journal of Controlled Rellease, 12(2), 133-141.
Ritger, P. L., & Peppas, N. A. (1987a). A simple equation for description of solute release I. Fickian and non-fickian release from non-swellable devices in the form of slabs, spheres, cylinders or discs. Journal of Controlled Release, 5(1), 23-26.
Ritger, P. L., & Peppas, N. A. (1987b). A simple equation for description of solute release II. Fickian and anomalous release from swellable devices. Journal of Controlled Release, 5(1), 3742.
Rostovtsev, V. V., Green, L. G., Fokin, V. V., & Sharpless, K. B. (2002). A Stepwise Huisgen Cycloaddition Process: Copper(I)-Catalyzed Regioselective „Ligation“ of Azides and Terminál Alkynes. Angewandte Chemie International Edition, 41(14), 2596-2599.
Shang, J., Shao, Z., & Chen, X. (2008). Chitosan-based electroactive hydrogel. Polymer, 49(25), 5520-5525.
Tankam, P. F., Miiller, R., Mischnick, P., & Hopf, H. (2007). Alkynyl polysaccharides: synthesis of propargyl potato starch followed by subsequent derivatizations. Carbohydrate Research, 342(14), 2049-2060.
Těsta, G., Di Meo, C., Nardecchia, S., Capitani, D., Mannina, L., Lamanna, R., Barbetta, A., & Dentini, M. (2009). Influence of dialkyne structure on the properties of new click-gels based on hyaluronic acid. International Journal of Pharmaceutics, 378(1-2), 86-92.
Tomoe, C. W., Christensen, C., & Meldal, M. (2002). Peptidotriazoles on Solid Phase: [1,2,3]— Triazoles by Regiospecific Coppe(I)-Catalyzed 1,3-Dipolar Cycloadditions of Terminál Alkynes to Azides. Journal of Organic Chemistry, 67(9), 3057-3064.
van Bommel, K. J. C., van der Pol, C., Muizebelt, L, Friggeri, A., Heeres, A., Meetsma, A., Feringa, B. L., & van Esch, J. (2004). Responsive Cyclohexane-Based Low-Molecular-Weight Hydrogelators with Modular Architecture. Angewandte Chemie International Edition, 43(13), 1663-1667.
Yao, F., Chen, W., Liu, C., & De Yao, K. (2003). A novel amphoteric, pH-sensitive, biodegradable poly[chitosan-g-(L-lactic-co-citric) acid] hydrogel. Journal of Applied Polymer Science, 89(14),3850-3854.
Claims (23)
Hide Dependent
translated from
Claims (23)
Hide Dependent
translated from
1. Síťovaný derivát kyseliny hyaluronové obecného vzorce I:
(I)
-30CZ 304072 B6 kde Rl a R2 jsou nezávisle shodné nebo rozdílné a jsou vybrány ze skupiny zahrnující skupiny alifatické, aromatické, arylalifatické, cykloalifatické, které obsahují od 3 do 12 atomů uhlíků a kde Rl může dále znamenat methyl a R2 může dále znamenat 3,6,9-trioxadekan.
2. Síťovaný derivát podle nároku 1, kde Rl je vybrán ze skupiny zahrnující methyl a fenyl a R2 je vybrán ze skupiny zahrnující propyl, fenyl a 3,6,9-trioxaundekan.
3. Síťovaný derivát podle kteréhokoli z předchozích nároků 1 a 2, mající stupeň substituce DS 1 až 28%, s výhodou 10%, kde DS je definován jako počet substituovaných dimerů na 100 sacharidických dimerů.
4. Způsob přípravy derivátu popsaného v kterémkoli z nároků laž3, vyznačující se tím, že zahrnuje kroky:
i) Příprava derivátu hyaluronanu obecného vzorce II nesoucího alkinovou skupinu navázanou přes sekundární aminoskupinu, kde Ri je definován v nároku 1:
HA-CAPr (Π) ii) Příprava derivátu hyaluronanu obecného vzorce III nesoucího azido skupinu navázanou přes sekundární aminoskupinu, kde Ri je definován v nároku 1:
HA-CAPA (III) iii) Smíchání derivátu vzorce II a derivátu vzorce III, a iv) Cykloadiční reakce derivátu vzorce II a derivátu vzorce III v přítomnosti CuSO4 a askorbátu sodného za vzniku síťovaného derivátu kyseliny hyaluronové obecného vzorce I.
5. Způsob podle nároku 4, vyznačující se tím, že krok i) zahrnuje tyto kroky a) chemoselektivní oxidace hyaluronanu v pozici C-6, b) navázání primárního aminu nesoucího koncovou alkinovou skupinu na oxidovaný hyaluronan za vzniku alkinyl-imin hyaluronanu, c) redukce alkinyl-imin hyaluronanu za vzniku sekundárního alkinyl-amin hyaluronanu.
-31 CZ 304072 B6
6. Způsob podle nároku 5, vyznačující se tím, že po kroku a) se provede izolace oxidovaného hyaluronanu.
7. Způsob podle nároku 5, vyznačující se tím, že každý z kroků a) až c) se provede v té samé reakční nádobě.
8. Způsob podle kteréhokoliv z nároků 4 až 7, vyznačující se tím, že krok ii) zahrnuje kroky a) chemoselektivní oxidace hyaluronanu v pozici C-6, b) navázání primárního aminu nesoucího koncovou azidoskupinu na oxidovaný hyaluronan za vzniku azidoalkyl-imin hyaluronanu, c) redukce azidoalkyl-imin hyaluronanu za vzniku sekundárního azidoalkyl-amin hyaluronanu.
9. Způsob podle nároku 8, vyznačující se tím, že po kroku a) se provede izolace oxidovaného hyaluronanu.
10. Způsob podle nároku 8, vyznačující se tím, že každý z kroků a) až c) se provede v té samé reakční nádobě.
11. Způsob podle kteréhokoli z nároků 5 až 10, v y z n a č u j í c í se t í m , že primární amin nesoucí koncovou alkinovou skupinu je vybrán ze skupiny zahrnující propargylamin a ethinylamin, a primární amin nesoucí koncovou azidoskupinu je vybrán ze skupiny zahrnující 3-azidopropanamin, 1 l-azido-3,6,9-trioxaundekan-l-amin a azidoanilin.
12. Způsob podle kteréhokoliv z nároků 5 až 11, vyznačující se tím, že oxidace hyaluronanu v kroku a) se provede pomocí oxidačního systému 2,2,6,6-tetramethylpiperidin-loxylový radikál (TEMPO)/chloman sodný (NaClO) a s přídavkem aditiv NaX, kde X=Br nebo Cl, nebo pomocí činidla Dess-Martin periodinanu (DMP).
13. Způsob podle kteréhokoliv z nároků 4 až 12, vyznačující se tím, že se provádí v teplotním rozsahu od 0 do 60 °C, s výhodou od 5 do 37 °C.
14. Způsob podle kteréhokoliv z nároků 4 až 13, vyznačující se tím, že síťovaný derivát získaný v kroku iv) je ve formě gelu, který se následně lyofilizuje.
15. Způsob podle nároku 14, vyznačující se tím, že lyofil izace se provede kapalným dusíkem nebo ledem.
16. Způsob podle kteréhokoliv z nároků 4 až 13, vy z n a č uj í c í se t í m , že krok iii) dále zahrnuje přidání biologicky aktivních látek do reakční směsi, kde biologicky aktivní látky jsou vybrány ze skupiny zahrnující léčiva, proteiny, enzymy, biopolymery a biologicky kompatibilní syntetické polymery.
17. Způsob podle nároku 16, vyznačující se tím, že léčiva jsou vybrána ze skupiny zahrnující analgetika, antibiotika, antimikrobiální látky, cytostatika, léčiva proti rakovině, protizánětlivé látky, činidla pro hojení ran a anestetika.
18. Způsob podle kteréhokoliv z nároků 4 až 15, vyznačující se tím, že po kroku iv) následuje očkování vytvořeného síťovaného derivátu růstovými faktory.
19. Způsob podle nároku 18, vyznačující se tím, že růstovými faktory jsou chondrocyty.
20. Farmaceutický prostředek na bázi derivátu kyseliny hyaluronové, vyznačující se tím, že derivátem kyseliny hyaluronové je síťovaný derivát kyseliny hyaluronové vzorce I podle kteréhokoliv z nároků 1 až 3, jenž je ve formě gelu nebo skafoldu.
-32CZ 304072 B6
21. Farmaceutický prostředek podle nároku 20, vyznačující se tím, že dále zahrnuje zachycené biologicky aktivní substance vybrané ze skupiny zahrnující léčiva, proteiny, růstové faktory, biopolymery a biologicky kompatibilní syntetické polymery.
22. Farmaceutický prostředek podle kteréhokoli z nároků 20 nebo 21, vyznačující se tím, že je ve formě gelu a obsahuje prostředky s dlouhodobým uvolňováním.
23. Použití síťovaného derivátu kyseliny hyaluronové vzorce (I) podle kteréhokoliv z nároků 1 ío až 3 pro výrobu systémů s řízeným uvolňováním, prostředků pro tkáňové inženýrství, pro přípravu bandáží a pro přípravu prostředků pro regeneraci tkání.