KR20140034797A - 가교된 히알우론산을 기본으로 하는 양쪽성 재료, 그의 제조 방법, 포획된 활성 제제를 함유하는 재료, 그의 제조 방법, 및 상기 재료의 용도 - Google Patents

가교된 히알우론산을 기본으로 하는 양쪽성 재료, 그의 제조 방법, 포획된 활성 제제를 함유하는 재료, 그의 제조 방법, 및 상기 재료의 용도 Download PDF

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Abstract

본 발명은 화학식 (I)에 따른, 가교된 히알우론산을 기본으로 하는 신규 양쪽성 재료, 및 상기 재료의 제조 방법을 기재한다. 또한, 본 발명은 포획된 활성 제제(예: 약물, 성장 인자 등)를 함유하는 재료 및 그의 제조 방법에 관한 것이다. 추가로, 본 발명은 조직 공학, 상처 드레싱 또는 조직 재생에 있어서 제어된 방출 시스템을 위한 상기 재료의 용도에 관한 것이다.

Description

가교된 히알우론산을 기본으로 하는 양쪽성 재료, 그의 제조 방법, 포획된 활성 제제를 함유하는 재료, 그의 제조 방법, 및 상기 재료의 용도{AMPHOTERIC MATERIALS BASED ON CROSSLINKED HYALURONIC ACID, METHOD OF PREPARATION THEREOF, MATERIALS CONTAINING ENTRAPPED ACTIVE AGENTS, METHOD OF PREPARATION THEREOF, AND USE OF SAID MATERIALS}
본 발명은 가교된 히알우론산을 기본으로 하는 신규 양쪽성 재료, 및 상기 재료의 제조 방법을 기재한다. 또한, 본 발명은 포획된 활성 제제(예: 약물, 성장 인자 등)를 함유하는 재료 및 그의 제조 방법에 관한 것이다. 추가로, 본 발명은 조직 공학, 상처 드레싱 또는 조직 재생에 있어서 제어된 방출 시스템을 위한 상기 재료의 용도에 관한 것이다.
본 발명은 특정 히알우론산이 되는, 화학적으로 개질된 다중음이온성 폴리사카라이드로부터 형성된 생체적합성 재료 또는 하이드로겔에 관한 것이다. 히알우론산 또는 히알우로난(HA)은 교번하는 베타 1-3-글루코론 및 베타 1-4-글루코사민 결합에 의해 연합하여 고분자량의 선형 중합체에 이른, 교번하는 D-글루코론산 및 N-아세틸-D-글루코사민으로 구성된 천연 발생 뮤코폴리사카라이드이다. HA는 세포외 매트릭스에서 발생하며 조직 온전성을 유지하는데 필수적인 역할을 한다. HA는 염증, 상처 회복 및 태아 발달 중에 세포의 유착 및 분화를 촉진한다. 동물 모델에서, 국소적으로 적용된 HA는 랫트 및 햄스터에서 피부 상처 치유를 가속화하고 섬유화 및 흉터 형성을 감소시켰다. HA는 높은 물 보유 용량 및 양호한 생분해성을 나타내기 때문에 화장품 제형 및 약물 전달에 있어서 상처 치유제용 담체로 사용된다. HA는 다양한 생물학적 과정, 예를 들어, 종양발생, 형태발생, 염증 및 상처에 대한 숙주 반응과 연계된다.
천연 히알우론산은 빨리 분해된다는 주요 단점을 나타낸다. 히알우로난 분해는 그의 점탄성 및 기계적 특성을 개질하며, 이는 상기 언급된 응용을 제한한다. 최근에는 분해, 효소 공격 및 온도 변화에 대해 덜 민감한 HA의 화학적으로 개질된 유도체에 대한 관심이 증가하고 있다. 화학적으로 개질된 형태의 HA는 외과 조제로서 유용하며 수술 후 기간의 신체 조직 유착을 방지한다.
본 발명은 방출 제어(Pal, Paulson, Rousseau, Stefan, Ian & Johan, 2009), 조직 공학 및 상처 드레싱을 포함하여 생체의학적 응용에 필요한 생분해성 및 생체적합성과 같은 요건을 충족시키는 하이드로겔의 제조를 위한 히알우론산의 새로운 양쪽성 유도체를 디자인하고 합성하는 것에 대해 기재한다. 히알우론산의 초다공성 불용성 유도체는 환경 pH의 변화에 대한 반응으로서 상이한 수송 시스템(확산), 픽(Fickian), 변칙적인 수퍼 케이스 II 수송(anomalous and super case II transport)을 나타낸다.
pH-반응성 하이드로겔은 환경 pH의 변화에 반응하여 이에 따라 이들의 부피를 변경할 수 있는 종류의 재료이다. 위장관, 질 및 혈관을 포함하여 신체 여러 부위에는 pH 변화가 있으므로 이들은 특히 제어된 약물 전달 시스템(controlled drug delivery system; CDDS)에 적합하다(Gupta, Vermani & Garg, 2002). 최근에, 양성 및 음성 전하 양자 모두를 보유함으로써 산성 및 염기성 매체 내에서 팽윤될 수 있는 양쪽성 pH-감수성 하이드로겔에 특별한 관심이 집중되고 있다(Yao, Chen, Liu & De Yao, 2003). 상기 발명에서는, 팽윤-수축 스위치가 서방성 투여량 매트릭스에 적절한, 일정한 방출 속도를 허용하였다. 상기 발명에 따른 장치를 제조하는 방법에서는 선형 중합체성 골격에 포함된 아지도 또는 알킨 부위 함유 2차 아민을 도입하기 위하여 산화-환원적 아민화 과정에 의해 히알우론산나트륨(또는 히알우로난)을 화학적으로 개질하며, 이는 클릭 화학을 통해 가교될 수 있다. 상기 발명에 보고된, 히알우론산나트륨의 이들 화학적으로 안정한 2차 아민은 히알우론산의 글루쿠론산에서 부분적으로 개질된-1차 알콜이다.
특정 세포 및 기관을 목표로 하는 현재의 필요는 전달 위치가 매우 특이적일 것을 요구한다. 활성 성분이 방출을 촉발하는 환경 조건의 변화에 따라 신속하고 효율적으로 전달될 수 있도록 급속 방출 및 서방 방출이 여러 맥동 방출 프로세스에 필요하다. 대부분의 공개 문헌에서는 활성 성분을 완전히 방출할 수 없는 제형들을 보고하였다.
전술한 반응 조건은 폴리사카라이드의 1차 알콜을 화학적으로 개질하였는데, 이는 반응이 화학선택적이 아님을 의미한다. 크레센지 등(Crescenzi et al.)은 히알우로난을 기본으로 하는 하이드로겔을 획득하는 "클릭 화학" 방법의 용도를 기재하였다(Crescenzi, Cornelio, Di Meo, Nardecchia & Lamanna, 2007; Testa et al., 2009). 저자들은 히알우론산의 화학적 개질이 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카보디이미드(EDCI)에 의한 카복실기의 활성화에 의해 수행됨을 기재하였다.
문헌에 공지된 바와 같이, 카보디이미드 활성화의 주요 단점 중 하나는 반응 부산물로서 N-아실-N-N' 이-치환된 우레아가 형성된다는 것이다. EDCI는 물에서 빠르게 분해되며, 화학적 개질을 달성하기 위해서는 과량의 시약을 사용할 필요가 있고, 이는 공정 비용을 증가시킨다. 치환도를 증가시키기 위하여 EDCI를 사용하여 반응 조건을 최적화할 수는 없다. 크레센지 등은 이와 같이 매우 잘 조직화된 구조를 나타내지 못하는 하이드로겔을 생산하였다. 조직화된 벽 및 다공성은 응용에 있어서 중요하다. 천연 구조를 닮은 상호연결된 네트워크는 빠른 확산 및 높은 생체적합성에 의해 특성화되는데, 크레센지의 재료는 이러한 특성을 결여하고 있다. 크레센지 등의 주요 단점은 이들의 방출 효율 저하에 있다. 불완전 방출은 치료제의 생체이용성을 저하시키며 전반적인 전달 프로파일을 변경하는 것으로 공지되어 있다. 저자들은 초기 급속 방출 후에 대부분의 심하게 가교된 하이드로겔이 서방성을 보장한다고 주장하지만 이러한 단언에 대한 실험적 증거를 보여주지는 못하였으며; 크레센지의 문헌에서 가교도가 급격히 증가하지도 않았다.
한편, 특허 WO-2008/03525호에 기재된 재료는 약 3.5 시간에 걸쳐 88%에 맞먹는 최대량의 벤지다민 하이드로클로라이드를 방출시킨다고 보고되었다. 그러나, 이 특허 출원에 기재된 재료의 경우 양쪽성 유도체를 사용하면 유사한 양의 벤지다민 하이드로클로라이드를 8시간 동안 보유할 수 있다. 따라서, 상기 발명에 따른 하이드로겔은 서방성이고 제어형 방출을 허용하는 매트릭스 구조를 나타낸다.
문헌에 언급된 상이한 보고서의 양쪽성 하이드로겔은 주로 폴리(아크릴산) 및 그의 유도체로 구성된 합성 하이드로겔을 포함한다(Luo, Peng, Wu, Sun & Wang). 이들 재료는 생분해성이 아니다. 천연 양쪽성 하이드로겔, 예컨대 글루타르알데히드에 의해 가교된 키토산-기제의 재료는 생분해성이며 생체적합성이다. 그러나, 조성물은 제어가능하지 않으며 특성은 종종 배치별로 변화한다(El-Sherbiny & Smyth; Chen, Tian & Du, 2004; Shang, Shao & Chen, 2008). 합성 및 천연 중합체를 양자 모두 함유하는 하이브리드 하이드로겔이 합성 및 천연 중합체의 장점을 조합하기 위한 시도에서 제안되었다. 그러나, 이들은 완전히 생분해성이지 않다(Ferruti, Bianchi, Ranucci, Chiellini & Caruso, 2005).
클릭 화학을 이용하여 상이한 재료들이 제조되었고 마찬가지로 특허되었으며, 예를 들어, WO 2007/035296호는 고리화 첨가(cycloaddition) 반응성인 이중 또는 다중작용성 링커에 의해 가교된 친수성 중합체로부터 형성된 하이드로겔을 개시하고 있다. 유사하게(Malkoch et al., 2006), 4작용성 아지드 가교제를 사용하여 클릭 화학에 의해 합성된 폴리에틸렌 글리콜을 기본으로 하는 하이드로겔이 제시되었다. 이들 하이드로겔의 잠재적인 약점은 미지의 생체적합성을 가지며 작은 이중 또는 다중작용성의 고반응성 가교제에 의존한다는 것이며, 이에 따라 예컨대 생체 조직과 접촉할 반응재료로부터 하이드로겔이 제조되는 인-사이투 응용에 대한 이들 하이드로겔의 용도가 제한될 수 있다. "클릭 화학"을 통한 가교는 또한 특허 출원 EP 2090592-A1호에서 듀프레즈(DuPrez) 등에 의해 적용되었다. 여기에서는, 덱스트란이 카보닐디이미다졸 활성화를 이용하여 개질된다. 그 결과로서, 덱스트란-아지도프로필카보네이트 및 덱스트란-프로파길카보네이트 유도체가 가교되어 화학적 하이드로겔이 될 수 있다. 저자들은 클릭-연결된 카보네이트 에스테르가 생리적 조건하에 가수분해될 수도 있다고 예측하였지만, 특허는 어떤 생물학적 적합성, 세포독성 및 생분해성도 보여주지 않았다. 다른 저자들은 다양한 작용성 부속물을 가진 (1→3)-[베타]-D-글루칸을 개발하기 위한 일반적인 접근법으로서 폴리사카라이드에 클릭 화학을 사용하였다(Hasegawa et al., 2006).
탄캄(Tankam) 등은 전분 프로파길 에테르가 벤질 아지드와의 1,3-이극성 고리화 첨가('클릭-화학')에 사용하여 N-벤질트리아졸 유도체화된 전분을 생성하기 위해, 작용성 폴리사카라이드를 제조하기 위한 가치있는 중간체임을 입증하였다(Tankam, Mueller, Mischnick & Hopf, 2007).
따라서, 본 발명의 목적은 기존에 공지된 재료들보다 더 많은 이점을 나타내며, 특히 전술한 단점을 극복한 하이드로겔을 발견하는 것이다. 더욱 구체적으로, 본 발명에 의해 해결하고자 하는 과제는 개선된 약물 방출 특성을 나타내며, HA를 기본으로 하는 비-세포독성의 생체적합성 재료를 얻는 것이다. 이 과제는 훨씬 더 조직화된 다공성, 상호연결된 기공, 더 큰 흡수 용량 및 보습 용량, 일정한 약물 방출 속도 및 포획된 약물의 더 큰 방출을 나타내는, 본 발명에 따른 양쪽성 재료에 의해 해결된다. 추가의 목적은 하기 상세한 설명 및 특허청구범위를 기초로 하여 자명해질 것이다.
화학식 (I)에 따른, 본 발명의 히알우론산의 가교된 유도체에 의해 선행기술의 결점이 극복되고 과제가 해결된다:
Figure pct00001
(I)
상기 식에서, R1 및 R2는 독립적으로 동일하거나 상이하고, 임의로 헤테로원자 O를 함유하며 3-12개 탄소를 함유하는 지방족, 방향족, 아릴지방족 및 사이클로지방족 부위이다. R1의 비제한적 예는 메틸이고, R2의 비제한적 예는 프로필이다.
또한, 본 발명은
i) 화학식 (II)의, 알키닐기를 운반하는 2차 아민 히알우로난 유도체를 제조하는 단계:
Figure pct00002
(II),
ii) 화학식 (III)의, 아지딜기를 운반하는 2차 아민 히알우로난 유도체를 제조하는 단계:
Figure pct00003
(III),
iii) 화학식 (II)의 유도체 및 화학식 (III)의 유도체를 혼합하는 단계, 및
iv) CuSO4 및 아스코르브산나트륨의 존재하에 화학식 (II)의 유도체 및 화학식 (III)의 유도체를 고리화 첨가 반응시켜 히알우론산의 가교된 유도체를 얻는 단계를 포함하는, 상기 유도체의 제조 방법에 관한 것이다.
단계 i)은 바람직하게 a) C-6 위치에서 히알우로난을 화학선택적으로 산화시키는 단계, b) 말단 알키닐기를 운반하는 1차 아민을 산화된 히알우로난과 커플링시켜 알키닐-이민 히알우로난을 형성하는 단계, c) 알키닐-이민 히알우로난을 환원시켜 2차 알키닐-아민 히알우로난을 형성하는 단계를 포함하며, 여기에서 단계 a) 후에 산화된 히알우로난을 분리할 수 있거나 모든 단계 a) 내지 c)는 단일 용기에서 실행된다.
유사하게, 단계 ii)는 바람직하게 a) C-6 위치에서 히알우로난을 화학선택적으로 산화시키는 단계, b) 말단 아지딜기를 운반하는 1차 아민을 산화된 히알우로난과 커플링시켜 아지도알킬-이민 히알우로난을 형성하는 단계, c) 아지도알킬-이민 히알우로난을 환원시켜 2차 아지도알킬 아민 히알우로난을 형성하는 단계를 포함하며, 여기에서 단계 a) 후에 산화된 히알우로난을 분리할 수 있거나 모든 단계 a) 내지 c)는 단일 용기에서 실행된다.
말단 알키닐기를 운반하는 1차 아민은, 예를 들어, 프로파길 아민 또는 에티닐 아닐린일 수 있고, 말단 아지딜기를 운반하는 1차 아민은, 예를 들어, 3-아지도프로판-아민, 11-아지도-3,6,9-트리옥사운데칸-1-아민 또는 아지도-아닐린일 수 있다.
단계 i) 및 ii)의 어느 하나의 단계 a)에서 사용되는 산화제는 NaBr 또는 NaCl 존재하의 시스템 2,2,6,6-테트라메틸피페리딘-1-옥실 라디칼(TEMPO)/하이포아염소산나트륨(NaClO), 또는 데스-마르틴 퍼아이오디난(DMP)일 수 있다.
단계 iv)에서 얻어진 가교된 유도체는 겔의 형태일 수 있으며, 이는 그 다음에 바람직하게 액체 질소 또는 얼음에 의해 냉동-건조된다.
단계 iii)은 반응 혼합물에 생물학적 활성 물질을 첨가하는 단계를 추가로 포함할 수 있으며, 상기 물질은 약물, 단백질, 효소, 생중합체 및 생물학적 적합성의 합성 중합체를 포함하는 그룹 중에서 선택된다. 약물은, 예를 들어, 진통제, 항생제, 항미생물제, 세포정지제, 항암제, 항염증제, 상처 치유제 및 마취제를 포함하는 그룹 중에서 선택될 수 있다.
또한, 단계 iv) 이후에 형성된 가교된 유도체에 연골 세포와 같은 성장 인자를 파종할 수 있다.
화학식 (I)의 히알우론산의 가교된 유도체는, 예를 들어, 겔 또는 스캐폴드(scaffold)의 형태일 수 있으며, 약물, 단백질, 성장 인자, 효소, 생중합체 및 생물학적 적합성의 합성 중합체를 포함하는 그룹 중에서 선택된, 포획된 생물학적 활성 물질을 추가로 포함할 수 있다.
또한, 본 발명은 조직 공학, 상처 드레싱 또는 조직 재생에 있어서 제어된 방출 시스템을 위한 가교된 유도체의 용도에 관한 것이다.
도 1은 화학식 (I)에 따른, 본 발명의 히알우론산의 가교된 유도체 및 그의 양쪽성 네트워크의 화학적 표현을 도시한다.
도 2는 D2O에서 프로파길 2-아민-히알우로난(HA-CAPr)의 1H-NMR 스펙트럼을 보여준다(500　MHz).
도 3은 D2O에서 아지도프로필-2-아민-히알우로난(HA-CAPA)의 1H-NMR 스펙트럼을 보여준다(500　MHz).
도 4는 가교된 재료의 적외선 스펙트럼(얇은 필름)을 보여준다.
도 5는 상이한 이온 세기의 용액(1 M NaCl, 0.1 M NaCl, 0.01 M NaCl, 0.001 M NaCl 및 0.0001 M NaCl)에서 하이드로겔 I에 대한 물 흡수를 나타낸다. 곡선은 매체의 이온 세기가 증가함에 따라 더 큰 팽윤도를 나타내었다.
도 6은 이온 세기의 함수로 물 흡수의 사진을 보여준다; 좌측에서 우측으로: 1 M NaCl, 0.1 M NaCl, 0.01 M NaCl, 0.001 M NaCl 및 0.0001 M NaCl.
도 7은 pH의 함수로 가교된 재료(I)의 팽윤 속도론을 나타낸다.
도 8은 이온 세기의 함수로 가교된 재료(I)의 팽윤 속도론을 나타낸다.
도 9는 물에서 벤지다민의 누적 방출을 나타낸다.
도 10은 PBS에서 벤지다민의 누적 방출을 나타낸다.
도 11은 pH=6.0 완충액에서 벤지다민의 누적 방출을 나타낸다.
도 12는 물에서 독소루비신의 누적 방출을 도시한다.
도 13은 시간에 따라 3T3 세포에서 시험된 유도체 프로파길 2-아민-히알우로난의 이용성을 보여준다.
도 14는 시간에 따라 3T3 섬유아세포에서 시험된 유도체 아지도프로필 2-아민-히알우로난의 이용성을 보여준다.
도 15는 시간에 따라 3T3 세포에서 시험된 실시예 9에서 얻어진 가교된 재료의 세포독성을 보여준다.
도 16a-b는 클릭-화학 기반의 하이드로겔로부터 형성된 스캐폴드 내로 파종된 연골세포의 생-사 세포 분석(live-dead cell analysis)을 나타낸다. 배양 6일째 또는 배양이 시작되었을 때(도 16a) 및 배양 15일째에 스캐폴드 표면으로부터 현미경 이미지를 얻었다. 도 16c-d는 배양 6일째(도 16c) 및 배양 15일째(도 16d)에 스캐폴드 중앙 부분의 현미경 이미지를 보여준다.
도 17은 시간의 함수로 연골 세포에서 시험된 재료의 생체이용성을 보여준다. 연골 세포는 21일간 배양되었다.
도 18은 액체 N2에 의해 냉동-건조된 후 팽윤된 상태에서 재료의 횡단 절단면과 더불어 재료의 표면 이미지를 나타낸다. 이 재료는 200 kDa의 화학적으로 개질된 HA를 사용하여 얻어졌다.
도 19는 얼음에 의해 냉동-건조된 후 팽윤된 상태에서 재료의 횡단 절단면과 더불어 재료의 표면 이미지를 나타낸다. 이 재료는 100 kDa의 화학적으로 개질된 HA를 사용하여 얻어졌다.
도 20은 냉동-건조 후 팽윤된 상태에서 겔의 SEM 마이크로사진(횡단 절단면)을 보여준다. 하이드로겔은 25 ℃에서 30 일간 pH=9.0 완충액 중에서 인큐베이션하였다.
도 21은 저분자량의 개질된 HA(18 kDa)를 사용하여 얻어지고, 액체 N2(좌측) 또는 얼음(우측)에서 냉동-건조된 하이드로겔의 SEM 마이크로사진을 나타낸다.
본 명세서의 상세한 설명에서, 어떤 표현들은 특징부 또는 실시양태의 중요한 기술적 측면과 관련되어 자주 사용된다. 이들 표현의 일부에 대해, 이들이 사용된 특정 맥락에서 상이한 해석을 요구하지 않는 한 하기 정의가 사용되어야 한다.
본 특허 출원의 범위 내에서 히알우론산 은 폴리카복실산 및 나트륨, 칼륨, 마그네슘 및 칼슘염과 같은 그의 염의 양자 모두의 형태인 폴리사카라이드를 지칭한다. 본 발명에 사용된 히알우론산은 임의의 공급원으로부터 유래할 수 있고; 이는 예를 들어 닭 벼슬로부터의 추출(EP 138572 B1), 또는 발효(EP 716688 B1)에 의해 얻을 수 있으며, 50,000 내지 3,000,000 Da 범위의 중량 평균 분자량을 나타낼 수 있다.
치환도: 폴리사카라이드 골격의 경우, 정상적으로 유용한 치환도(DS)는 이 경우에 히알우론산인 100개의 사카라이드 이량체 당 반응성 부위로서 정의되며, 즉, 화학적으로 개질된 이량체의 수를 나타낸다.
본 명세서에서 사용된 가교된 재료 는 하나 이상의 친수성 중합체의 화학적 가교에 의해 제조된 3차원 중합체성 네트워크이다. 이 유도체는 팽윤할 수 있지만 물과 접촉하여 용해되지 않는다.
본 명세서에서 사용된 링커 는 2개 이상의 중합체를 공유적으로 또는 비공유적으로 연결하는 2작용성 화학 구조(분자 또는 부위)이다. 본 특허 출원은 합성단위체(synthon) A-R-X를 함유하는 지방족 또는 방향족 아민의 첨가를 기재하며, 여기에서 A는 NH2, NH이고, R은 3 내지 12개 탄소를 함유하는 지방족, 방향족, 아릴지방족, 사이클로지방족 및 헤테로사이클릭 치환체이며, X는 고리화 첨가 또는 시그마결합(sigmatropic) 반응을 수행할 수 있는 기를 지칭한다.
선택적 산화 는 생중합체에 의해 포함된 같은자리(geminal) 디올 또는 알데히드 부위를 얻기 위해 히알우로난 골격의 C-6 위치에서의 화학선택적 산화 과정이다.
단일 용기 절차에서의 산화 및 환원적 아민화 는 폴리사카라이드에 의해 포함된 1차 알콜을 알데히드 또는 같은자리 디올로 변환시키고, 1차 또는 2차 아미노 링커를 첨가하며, 반응의 임의 구성요소의 분리 없이 이민-중간체를 환원시켜 중합체성 골격에 결합된 2차 또는 3차 아민을 얻는 과정이다.
고리화 첨가 반응: 본 발명에 따라 중합체는 고리화 첨가 반응을 수행할 수 있는 부위 또는 작용기를 갖는다. 특별한 관심의 대상인 고리화 첨가 반응은 소위 후이스겐(Huisgen)-반응(샤플리스(Sharpless) "클릭" 반응으로도 불림)(Huisgen, R., 1963)에 특이적인 것으로 소위 "클릭 화학"의 개념에 있어서 최근에 많은 주목을 받고 있다. 아지드/알킨 클릭 반응은 개질후 공정에 의해 링커를 중합체 내로 부가하기 위한 많은 요건을 충족시키는 반응으로 최근에 재발견된 것으로, a) 정량적 수율; b) 작용기의 고 내성 및 용매에 대한 반응의 불감성을 포함한다. 요즈음 샤플리스-유형 클릭 반응이라는 명명하에 요약된 본 연구에 기재된 기본적인 반응은 2002년 로스토프트세브(Rostovtsev) 및 동시에 토르노에(Tornoe)에 의해 개발된 C-C 삼중결합, C-N 삼중결합 및 알킬-/아릴- 또는 설포닐 아지드 사이의 후이스겐 1,3 이극성 고리화 첨가 반응의 변형이다(Rostovtsev, Green, Fokin & Sharpless, 2002; Tornoe, Christensen & Meldal, 2002).
약물 방출 메카니즘: 팽윤성 매트릭스로부터 약물 방출의 메카니즘은 여러 물리적-화학적 현상에 의해 결정된다. 이들 중에서, 중합체 물 흡수, 겔층 형성 및 중합체성 쇄 이완이 약물 방출의 조정에 주로 관여하는 것으로 간주된다. 우세한 메카니즘을 분류하기 위하여 약물 방출 과정을 분석하는데 수학식(1)이 현재 사용되고 있다(Korsmeyer et al., 1983).
Mt/M∞ = kt n 수학식 (1)
Mt/M∞ 비는 t 시간에 방출된 약물의 비율이고, k는 속도론 상수이며, 지수 n은 방출 메카니즘을 나타내는 것으로 제시되었다. 본 맥락에서, n = 0.5는 픽 방출(Fickian release)(확산적 제어 방출)을 나타내고, n = 1은 케이스 II 수송으로 지칭되는, 순수하게 이완 제어된 전달을 나타낸다. 중간치는 변칙적인 거동을 나타낸다(커플링된 확산/중합체 이완에 상응하는 비-픽 속도론)(Ritger & Peppas, 1987a). 가끔, n > 1의 수치가 관찰되었으며, 이는 수퍼 케이스 II 속도론으로 간주되었다.
서방성 투여량 형태 는 예정된 속도의 약물 방출 또는 특정 기간 동안 일정한 약물 수준을 유지함을 특징으로 하는 의료 장치이다. 이는 목적하는 치료 반응을 유발하기 위해 신체에 일정량의 약물이 초기에 이용가능하도록 한 다음 일정 기간에 걸쳐 활성의 유지를 위해 의약의 일정한 방출을 제공한다. 서방성은 일정 기간에 걸친 약물의 느린 방출을 시사하며, 제어된 방출일 필요는 있거나 없을 수 있다. 서방성은 약물이 1차 반응 속도하에 방출되거나 반응 파라미터에 독립적으로 방출됨을 의미한다.
제어된 방출 투여량 형태 는 완벽하게 제로-차수 방출이므로; 약물은 그의 농도와 무관하게 경시 방출된다.
양쪽성 재료(AM): 결정된 환경 조건하에 양성 및 음성 하전기를 양자 모두 형성하는 특성을 함유하거나 갖는 활성 재료. 이들은 서방성 및 특별한 팽윤 특성과 같은 특별한 특성을 제형에 부여할 수 있다. 이들의 성질은 생물학적 접촉을 필요로 하는 응용에 있어서 이들을 특히 유용하게 만들 수 있다. 대부분의 연구된 양쪽성 하이드로겔은 합성, 천연 및 하이브리드의 3가지 부류중 하나이다.
분자량 컷-오프 는 게스트가 재료를 통해 좀더 왜곡된 확산 경로를 지남에 따라 방해되는 확산에 기인하는 현상으로서, 이는 재료가 소분자량 구성요소를 내부에 보유할 수 있는 네트워크-얽힘 구조를 나타냄을 의미한다.
첫 번째 측면에서, 본 발명은 화학식 (I)에 따른 히알우론산의 가교된 유도체에 관한 것이다:
Figure pct00004
(I)
상기 식에서, R1 및 R2는 독립적으로 동일하거나 상이하고, 3-12개 탄소를 함유하는 지방족, 방향족, 아릴지방족 및 사이클로지방족 및 헤테로사이클릭 부위이다.
본 발명은 화학적으로 안정하고, 매우 다공성이며, 세포독성이 없고 생체적합성임을 특징으로 하며, 당업자에게 공지된 상이한 응용에 사용될 수 있는 새로운 종류의 재료를 제공한다. 상기 재료의 특성 조사에 의해 물질의 서방성 및 제어된 방출에 대한 단서가 되는 고연결성(high connectivity) 및 확산의 증거가 제공되었다. 본 특허 출원은 생물학적으로 또는 약리학적으로 활성인 생리활성 분자 또는 거대분자가 가교 전 또는 후에 물리적으로 혼입될 수 있는 재료를 기재한다. 이러한 종류의 하이드로겔은 생물학적 미세환경이 변화하면 서방성을 나타내었다. 이들 재료를 적용하면 초기 급속 방출 후에 약물에 대한 요구의 감소가 필요한 상처 치료의 경우 특별히 유리할 수 있다. 본 특허 출원에 보고된 재료는 이들에게 특별한 이점을 제공하는 특이적 산-염기 상호작용을 확립할 수 있다.
두 번째 측면에서, 본 발명은 화학적으로 개질된 HA를 기본으로 하는 수불용성 양쪽성 재료를 제조하는 방법에 관한 것이며(도 1); 이 방법은 산화 및 환원적 아민화의 2 단계로 하기 반응식 1, 2, 4 및 5, 또는 단일 용기(반응식 3 및 6)의 반응에 의한 히알우론산의 화학적 개질을 포함한다. 방법의 결과 다중음이온성 폴리사카라이드의 양쪽성 유도체가 생성되며, 여기에서 폴리사카라이드쇄의 적어도 하나는 1,3 이극성 고리화 첨가를 통해 가교된 히알우론산으로 구성된다. 링커는 2차 아민을 통해 음이온성 폴리사카라이드에 공유적으로 결합되며(도 1), 이는 미세다공성 형태 및 맞춤형 미세구조를 가진다.
더욱 구체적으로, 본 발명에 따른 방법은 i) 알키닐기를 운반하는 2차 아민 히알우로난 유도체를 제조하는 단계; ii) 아지딜기를 운반하는 2차 아민 히알우로난 유도체를 제조하는 단계; iii) 단계 i)의 유도체 및 단계 ii)의 유도체를 혼합하는 단계; iv) 촉매 존재하에 혼합된 유도체를 고리화 첨가 반응시켜 히알우론산의 가교된 유도체를 얻는 단계를 포함한다.
화학식 (II)에 따른, 친쌍극자체, 알켄 및 알킨 및 연관된 헤테로원자 작용기를 갖는 분자로도 명명되는, 알키닐기를 운반하는 2차 아민 히알우로난 유도체의 제조(단계 i)는 환원적 아민화가 일어나기 전에 산화된 중간체를 분리하는 두 단계로, 또는 단일 용기에서 수행될 수 있다:
Figure pct00005
(II)
2 단계 제조는 a) C-6 위치에서 히알우로난을 화학선택적으로 산화시키는 단계, b) 말단 알키닐기를 운반하는 1차 아민을 산화된 히알우로난과 커플링시켜 알키닐-이민 히알우로난을 형성하는 단계, c) 알키닐-이민 히알우로난을 환원시켜 2차 알키닐-아민 히알우로난을 형성하는 단계를 포함하는 반응식 1 또는 2에 상응한다(사용된 산화제의 유형에 따라):
반응식 1
Figure pct00006
반응식 2
Figure pct00007
반응식 1은 C-6의 선택적 산화를 위해 물 또는 완충액 중에서 TEMPO, 브롬화나트륨 및 NaClO를 사용하여 수행되는 산화 반응을 보여준다. 반응 생성물을 분리하고 정제하였다. 두 번째 단계는 알키닐기를 운반하는 1차 아민을 첨가하여 이민을 형성하고 이를 2차 아민으로 환원시키는 것으로 구성된다. 반응식 2는 C-6의 선택적 산화를 위해 DMSO에서 데스-마르틴 퍼아이오디난을 사용하여 수행되는 산화 반응을 보여준다. 반응 생성물을 분리하고 정제하였다. 두 번째 단계는 물에서 알키닐기를 포함하는 1차 아민을 첨가하여 이민을 형성하고 이를 2차 아민으로 환원시키는 것으로 구성된다.
분리를 필요로 하지 않는 단일 용기 제조의 경우, 반응식을 하기에 도시하였다:
반응식 3
Figure pct00008
반응식 3은 II로 명명된 알키닐기를 포함하는 C-6의 선택적 개질을 위해 단일 용기에서 수행되는 산화 및 환원적 아민화 과정을 보여준다.
하기 단계 ii), 즉, 아지딜기 또는 하나 이상의 헤테로원자를 함유할 수 있고 하전된 쌍극자를 나타내는 적어도 하나의 공명 구조(mesomeric structure)를 갖는 것으로 기재될 수 있는 화학식 (III)의 1,3-이극성 화합물을 운반하는 2차 아민 히알우로난 유도체의 제조는 다시 환원적 아민화가 일어나기 전에 산화된 중간체를 분리하는 두 단계로, 또는 단일 용기에서 수행될 수 있다:
Figure pct00009
(III).
2 단계 제조는 a) C-6 위치에서 히알우로난을 화학선택적으로 산화시키는 단계, b) 말단 아지딜기를 운반하는 1차 아민을 산화된 히알우로난과 커플링시켜 아지도알킬-이민 히알우로난을 형성하는 단계, c) 아지도알킬-이민 히알우로난을 환원시켜 2차 아지도알킬 아민 히알우로난을 형성하는 단계를 포함하는 반응식 4 또는 5에 상응한다(사용된 산화제의 유형에 따라):
반응식 4
Figure pct00010
반응식 5
Figure pct00011
반응식 4는 C-6의 선택적 산화를 위해 물 또는 완충액 중에서 TEMPO, 브롬화나트륨 및 NaClO를 사용하여 수행되는 산화 반응을 보여준다. 반응 생성물을 분리하고 정제하였다. 두 번째 단계는 아지딜기를 운반하는 1차 아민을 첨가하여 이민을 형성하고 이를 2차 아민 또는 (III)으로 명명된 유도체로 환원시키는 것으로 구성된다. 반응식 5는 C-6의 선택적 산화를 위해 DMSO에서 데스-마르틴 퍼아이오디난을 사용하여 수행되는 산화 반응을 보여준다. 반응 생성물을 분리하고 정제하였다. 두 번째 단계는 물에서 아지딜기를 포함하는 1차 아민을 첨가하여 이민을 형성하고 이를 2차 아민 또는 유도체(III)으로 환원시키는 것으로 구성된다.
분리를 필요로 하지 않는 단일 용기 제조의 경우, 반응식을 하기에 도시하였다:
반응식 6
Figure pct00012
반응식 6은 아지딜기(III)를 포함하는 C-6의 선택적 개질을 위해 단일 용기에서 수행되는 산화 및 환원적 아민화 반응을 보여준다.
반응식 3 및 6에 기재된 방법은 바람직하게 하기 방식으로 수행된다: 히알우론산을 15분간 pH 9 내지 12에서 산화제와 반응시키고, pH를 5-8로부터 변화시키거나 1차 알콜을 첨가하여 반응을 켄칭시킨 다음 아지딜 또는 알키닐 부위를 포함하는 1차 아민과 반응시키면 평균 분자량 100-200 kDa의 히알우론산의 화학적으로 개질된 유도체가 제조된다.
CuSO4 및 아스코르브산나트륨의 존재하에 화학식 (II)의 유도체를 화학식 (III)의 유도체와 고리화 첨가 반응시키면 반응식 7에 따라 히알우론산의 가교된 유도체가 얻어진다:
반응식 7
Figure pct00013
반응식 7은 프로파길-2-아민 히알우로난(II) 및 아지도프로필-2-아민 히알우로난(III) 유도체의 고리화 첨가 반응을 나타낸다.
반응식 7의 고리화 첨가 반응을 사용하여 얻어진 거대다공성 재료를 도 18-21에 도시하였다. 주사 전자 현미경(SEM)에 의해 얻어진 이미지로부터 재료가 매우 조직적인 구조를 가지는 것으로 밝혀졌다.
제1 단계 또는 산화는 상이한 산화제, 예를 들어, 2,2,6,6-테트라메틸피페리딘-1-옥실 라디칼(TEMPO)/하이포아염소산나트륨(NaClO) 시스템과 첨가제로서 NaBr 또는 NaCl을 사용하는 것이 반응식 1, 3, 4 및 6에 도시되고, 데스-마르틴 퍼아이오디난(DMP)을 사용하는 것이 반응식 2 및 5에 도시되어 있다. 산화 화학선택성은 히알우로난 골격상의 C-6을 개질하였다. 형성된 같은자리 디올 또는 "알데히드"는 말단 알킨 또는 아지드기를 포함하는 상이한 1차 아민, 지방족 또는 방향족과 반응할 수 있다. 먼저, 알키닐기를 운반하는 부위, 예를 들어, 프로파길 치환체가 산화-분리-환원적 아민화 공정(반응식 1 및 2) 또는 일단계 과정의 산화-환원적 아민화(반응식 3)로서 C-6에서 일련의 화학선택적 산화에 의해 반응식 1, 2 및 3에 기재한 바와 같이 도입된다.
질소 대기하에 5 ℃ 내지 25 ℃ 범위, 바람직하게 5 ℃에서 제어된 완충 pH를 사용하는 인산 또는 탄산 완충액 또는 물에서 일단계 과정의 NaClO/TEMPO/NaBr 시스템을 사용하는 산화 반응을 수행하였으며, 이에 따라 개질된 중합체의 분해가 감소하였다. 산화제를 불활성화시키기 위하여 pH를 변화시키거나 IPA 또는 에탄올을 첨가하여 반응을 켄칭하였다. DMP를 사용하는 산화를 DMSO에서 수행하였다. 산화 공정은 상이한 분자량(20 kDa 내지 2000 kDa)을 갖는 천연 히알우론산을 사용하여 수행된다. 산화 및 환원적 아민화의 전체 공정에 의해 가장 안정한 하이드로겔을 생성하는 18 내지 1000 kDa, 바람직하게 18 내지 200 kDa의 유도체가 생성된다(도 19).
두 번째로, 일단계에서 일련의 C-6에서의 화학선택적 산화 및 환원적 아민화에 의해(반응식 6) 또는 산화-분리-환원적 아민화 과정에 의해(반응식 4 및 5) 알키닐기를 운반하는 2차 아민 히알우로난 유도체, 예를 들어, 3-아지딜 프로필-2-아민-히알우론산을 반응식 4, 5 및 6에 기재한 바와 같이 제조하였다. 질소 대기하에 5 ℃ 내지 25 ℃ 범위, 바람직하게 5 ℃에서 컨트롤 탐폰 시스템 pH를 사용하는 인산 또는 탄산 완충액 또는 물에서 산화 반응을 수행하였다. DMP 산화에 의해 얻어진 유도체에도 물 또는 인산 완충액 중의 1차 아민을 첨가한다. DMP 산화는 히알우론산을 상당히 분해하지만 생성된 하이드로겔은 안정하다.
상기 화학적으로 개질된 히알우론산 유도체(II 및 III)는 2 내지 1000 kDa, 바람직하게 18 내지 200 kDa 범위의 분자량을 나타낸다.
세 번째로, 고리화 첨가 반응이 수행되며; 이를 실행하기 위하여, 중합체가 거대분자당 적어도 하나의 아지드 또는 알킨기를 가져야 한다. "산화-환원적 아민화" 과정을 사용하는 화학적 개질의 정도는 반응 조건에 따라 8 내지 30% 범위에서 변화한다. 도 1은 14%의 DS 및 프로파길 부위를 포함하는 화학적으로 개질된 HA의 1H NMR 스펙트럼을 보여준다. 도 2는 15%의 DS 및 3-아지도 프로필 2-아민 부위를 포함하는 화학적으로 개질된 HA의 1H NMR 스펙트럼을 보여준다. 바람직한 치환도는 10-15%이며, 이는 일단계 과정의 반응 중에 얻어진다. 추가의 실시양태에서, 치환도는 2 내지 30의 범위, 예를 들어, 5, 10, 15, 20, 25 및 30에서 선택될 수 있다.
고리화 첨가 반응성 부위는 안정한 2차 아민 결합을 포함하는 링커에 의해 중합체성 골격에 연결되며; 이는 전술한 바와 같이 얻어진다. 본 명세서에서 사용된 2차 아민은 화학식 -C-NH-R로 나타낸다. 2차 아민 또는 이민에 의해 결합되어 거대분자로 이러한 부위를 도입하는 것은 본 발명의 두 번째 측면을 나타낸다.
중합체 네트워크 내로 혼입된 양쪽성 2차 아민(도 1)은 재료 내부에 수소 결합 및 소수성 상호작용을 포함할 수 있는 더 강한 상호작용을 지닌 네트워크를 제공함으로써 본 발명자들이 생성된 하이드로겔의 안정성에 영향을 미칠 수 있도록 허용한다(van Bommel et al., 2004). pH-민감성 기를 이 클릭 화학 하이드로겔에 도입함으로써 분자 수준에서 특성을 조율하고 pH의 변화에 대한 반응으로서 수축에서 팽윤으로의 가역적인 변환이 가능해진다(도 7). 이 특성으로 인하여, (Qiu & Park, 2001)에 따른 경구 투여를 위해, 또는 바이오센서 또는 투과 스위치(Hoffman, 1995)로 사용될 수 있는 제어된 방출 제형의 생산이 가능해진다.
이러한 방식으로 제조된 재료는 고다공성 및 양호한 벽(wall) 상호연결성을 보인다. 주사 전자 현미경(SEM)에 따르면 하이드로겔 구조는 벌집과 유사하다. 재료의 특성은 히알우로난의 분자량, 치환도 및 겔화 시간과 같은 실험 파라미터를 변화시켜 개질될 수 있다. 전술한 파라미터를 변화시킴으로써 도 18, 19 및 21에 나타낸 바와 같은 상이한 구조들이 얻어진다.
본 특허 출원에 보고된 양쪽성 재료를 사용함으로써, 생성된 재료의 다공성 및 안정성을 바꾸면서 혼입된 제제의 방출을 촉발하는 것이 가능하다. 2차 아민 부위 사이의 분자간 수소 결합은 하이드로겔의 안정성 증가에 기여한다. 냉동-건조된 재료(제로겔; xerogel)의 FT-IR 스펙트럼으로부터 입증되는 바와 같이, NH 신호가 수소 결합된 2차 아민의 특징인 반면(3320-3270 cm-1), COO- 및 NH2 + 부위로부터의 신호는 모두 1670-1610 cm-1 사이에 들어간다(도 4).
본 특허 출원에 기재된 재료는 크레센지 등(WO/2008/031525-A1)에 의해 보고된 재료와 비교하여 물의 최대량의 거의 2배를 흡수할 수 있다. 물 흡수는 네트워크 내의 강한 쌍극자-쌍극자 상호작용의 존재를 입증하였다. 또한, II 및 III를 기본으로 하는 재료에 기초한 하이드로겔은 이들의 고다공성 및 조직화된 벽으로 인하여 세포 배양을 촉진한다. 알려진 바와 같이, 스캐폴드 네트워크 내부의 빈 공간은 조직의 성장을 허용하고, 영양소 및 노폐물의 빠른 확산을 허용하기 위해 필요하다.
재료는 세포독성이 없고 생분해성인 것으로 시험되었다(도 13, 14 및 15). 하이드로겔을 연골세포와 함께 인큐베이션하였으며 스캐폴드 또는 조직 공학에 있어서의 추가 응용에 대해 효과적인 매트릭스인 것으로 밝혀졌다(도 16a 및 b). 하이드로겔이 생분해성 생중합체인 히알우론산으로 만들어진다는 사실은 생물학적 시험에 의해 입증된 그의 생체적합성을 보장한다.
총 다공성에 추가하여 고려하여야 하는 중요한 인자는 기공 크기와 상호연결성이다. 팽윤된 하이드로겔의 내부 단면은 평평하고 상호연결된 기공을 나타내었다(도 18-21). 기공은 반응 조건에 따라 불규칙 형상을 나타낼 수 있다. 그러나, 모든 경우에 벽들은 상호연결된다.
빈 공간을 포함하는, 히알우로난을 기본으로 하는 재료는 약물과 성장 인자를 혼입하는 능력을 나타낸다. 하이드로겔은 냉동-건조 단계 공정에 의해 연속적인 다공성 구조를 제공하지 않으며, 기공의 형성은 얼음 결정 형성 및 대부분의 하이드로겔에 갇힌 물 분자 축출의 결과임을 지적하는 것이 중요하다.
한편, 이런 종류의 재료는 천연 네트워크(벌집 구조)를 닮았다. 기공 직경은 평균 200-300 ㎛로 결정되었다. 파일럿 연구는 가압 멸균 처리가 스캐폴드 기하형태를 변경하거나 분해를 유도하지 않음을 보여주었다. 공유적 가교결합을 도입하면 3차원 네트워크가 생성되었다. 또한, 30일의 시험관내 분해 후에 표면 전자 현미경으로 평가하였다. 원래 구조를 유지하기 위하여 시편들을 액체 질소에서 냉동-건조시켰다. 상이한 pH 완충액 중에서 2달 후에 어떤 변화도 관찰되지 않았으므로 모든 겔이 양호한 경시안정성을 나타내었다. 이들 결과는 SEM을 기초로 하여 판단하였다. 재료 내로 도입된 2차 아민의 안정성으로 인하여 구조가 보존되었다(도 20).
상기 새로운 하이드로겔의 디자인에 있어서 고려되어야 하는 3가지의 주요 기준이 있으며, 이는 충족된 것으로 입증되었다:
i) 2차 아민 결합이 분해에 대해 안정하다;
ii) 본 특허에 기재된 재료는 히알우로니다제 및 HA 수용체의 인식 부위로 공지된 히알우론산의 카복실기에 있어서 임의의 화학적 개질을 나타내지 않았다. 따라서, 이들 재료는 실시예 15에 기재된 연골세포 배양으로 입증되는 바와 같이 생체적합성이다;
iii) 가교된 히알우로난 유도체의 구성 성분은 무독성으로 시험되었으며, 따라서 이들은 양호한 생체적합성 및 제어가능한 하이드로겔 조성을 나타낸다.
또한, 본 특허에 기재된 재료의 양쪽성이 물질의 연장되고 완벽한 방출(제어된 서방성)에 대한 단서인 것으로 믿어진다. 이는 미세담체로서 작용하는 하이드로겔로부터의 방출을 제어하는 가능한 초분자(supramolecular) 상호작용에 의해 설명된다. 하이드로겔의 상호작용 및 기하형태가 하이드로겔의 통한 분자의 확산을 통제한다(Kim & Peppas, 2002). 여러 연구자들이 분자 방출에 대한 약물 중합체 상호작용의 효과를 연구하였지만, 거동을 예측하기 위한 어떤 수학적 모델도 기재되어 있지 않다. 또한, 개질된 HA의 양쪽성은 하이드로겔 내의 더 크고 조직화된 다공성을 생성하는 자기-조립 및 분자간 결합을 유발한다. 상기 종류의 하이드로겔에 있어서 기재된 조직화된 형태는 독특하고 농도에 무관하지만 자기 조립에 더욱 의존적이며, 이는 정전기 상호작용(쌍극자-쌍극자)에 의해 설명된다. 개발 과정 중에, 네트워크 내 약물의 포획(entrapment)은 가교 정도에 의해서도 약물 농도에 의해서도 제어되지 않고(크레센지 등에 의해 기재됨) 양쪽성 2차 아민-함유 하이드로겔 사이의 산-염기 루이스 상호작용 및 상이한 약물의 분자 구조에 제공된 쌍극자 모멘트에 의해 제어됨이 발견되었다. 아미드는 매우 약한 염기인 반면, 아민의 짝산은 약 9.5의 pKa를 나타내고; 아미드의 짝산은 -0.5 부근의 pKa를 나타낸다는 것이 문헌에 매우 잘 작성되어 있다. 그 결과, 아미드는 물에서 열등한 산-염기 특성을 나타낸다. 이러한 염기성의 결여는 위치된 비공유 전자쌍이 공명에 의해 비편재화된 카보닐기의 전자-흡인 성질에 의해 설명된다. 본 특허에 기재된 재료는 2차 아민을 함유하며; N-H 쌍극자의 존재는 수소 결합 공여체 뿐아니라 수용체를 형성하는 양쪽성 작용을 허용한다.
기존에 특허 출원 WO/2008/031525-A1호에 보고된 아미드와 비교하여 본 발명의 방법론은 명백한 이점을 제공한다. 표 1은 WO2008/031525호 "클릭 화학 가교를 통해 얻어진 히알우론산 유도체"에 보고된 재료와 다공성 형태 및 맞춤형 미세구조를 보유하는 본 발명의 히알우론산을 기본으로 하는 양쪽성 재료의 특성을 비교한 데이터를 보여준다. 더욱 구체적으로, 2차 아민은 아미드 유도체보다 더 활발하게 물과의 수소 결합에 참여할 수 있다. 이러한 산-염기 상호작용의 결과, 생성된 재료는 더 많은 양의 물을 흡수할 수 있으며, 따라서 바람직한 보습제로 작용한다. 또한, 상호연결된 기공은 확산에 의한 물의 빠른 흡수를 허용한다. 본 특허 출원은 더 큰 확산능을 나타내기 때문에 유리질 하이드로겔 내로 물의 느린 흡수를 극복할 수 있는 하이드로겔을 제조하는 방법을 개시한다. 더욱 구체적으로, 표 1은 클릭 화학을 통해 가교되고 특허 출원 WO2008/031525호에 보고된 재료와 본 특허 출원에 기재된 히알우로난을 기본으로 하는 양쪽성 재료로부터 벤지다민 하이드로클로라이드의 방출을 요약하고 비교한다.
매체
t 50 (h) t 70 (h) t 88 (h)
유도체 WO AM WO AM WO AM
물 1 8 5 15 ND 24
PBS pH=7.4 1 2 2 4 3.5 8
AM은 본 특허 출원에 기재된 화합물 (II) 및 (III)을 기본으로 하는 양쪽성 하이드로겔이며, 여기에서 R1은 메틸이고 R2는 프로필이며; WO는 WO2008/ 031525호에 따른 재료이고; ND는 결정되지 않음이며; t50은 50%의 벤지다민 하이드로클로라이드가 방출되는 시간(h)을 나타내고, t70은 70%의 벤지다민 하이드로클로라이드가 방출되는 시간(h)을 나타내며, t88은 88%의 초기 혼입된 벤지다민 하이드로클로라이드가 방출되는 시간(h)을 나타낸다.
WO2008/031525호에 보고된 재료는 방출 매체와 무관하게 겔화되기 전에 겔 내로 혼입된 초기 벤지다민 하이드로클로라이드의 50%를 단지 1시간 동안 보유하였다. 한편, 동일 약물의 50%가 방출 매체로 물을 사용하여 8시간 동안 양쪽성 재료 내에 보유되었는데, 이는 훌륭한 하이드로겔임을 나타낸다. 또한, 70%의 벤지다민이 물에서 5시간 후에 WO 재료로부터 방출된 반면, 상기 작용에서 동일 양이 본 발명의 양쪽성 재료로부터는 15시간 후에 방출되었는데, 이는 하이드로겔이 네트워크 내부의 하전된 분자 사이에 더 강한 정전기적 상호작용을 생성할 수 있음을 의미한다. PBS에서도 AM 재료는 더 큰 체류 시간의 동일 거동을 보여주었다. 표 1은 크레센지의 재료(WO)가 원래 혼입된 약물의 88%를 3.5시간 후에 방출하였고, 여기에서 AM 재료는 8시간 후에 방출하였음을 보여준다.
본 발명에 따른 하이드로겔의 중요한 특성은 중합체 네트워크가 하이드로겔에 양쪽성 pH-감수성을 부여할 수 있는 펜던트 -COOH기(조성적으로 개질되지 않은 히알우론산 이량체) 및 골격 2차 아민(-N-)을 양자 모두 갖는다는 사실에 있다(도 1). 본 명세서에서, 본 발명자들은 II 및 III(여기에서 R1은 메틸이고 R2는 프로필임)을 기본으로 하는 양쪽성 하이드로겔의 합성, 특성조사(도 2, 3 및 4) 및 팽윤 거동(도 5, 6 및 7)을 보고하였다. 도 5는 II 및 III(여기에서 R1은 메틸이고 R2는 프로필임)을 기본으로 하는 하이드로겔의 물 흡수를 설명하는 플롯을 보여준다(도 6에 물리적으로 나타낸 시료의 경우). 상이하고 제어된 이온 세기를 갖는 매체 중의 실온에서 48시간 동안 (초기 건조 없는) 겔이 팽윤되도록 하였으며, 그 결과를 도 6에 요약하였다. 도 5는 재료에 의해 흡수된 최대 물 부피가 이들의 초기 중량의 700%임을 보여준다. 모든 실시예에서, 하이드로겔은 최대 정도의 팽윤에 도달하였으며 이 지점 이후에는 겔이 생-분해되기 시작하였다.
pH-감수성 시험에서, 건조된 하이드로겔을 37 ℃에서 48시간 동안 다양한 pH 값을 갖는 매체 내에 넣어 팽윤 평형에 도달하도록 하였다. 하이드로겔을 꺼내어 가습된 여과지로 닦고 평형에 도달할 때까지 매 2시간마다 중량을 재었다. 마찬가지로 팽윤 속도론 연구를 수행하였다. 건조된 하이드로겔 시료(제로겔)를 37 ℃에서 예정된 시간 동안 상이한 pH=1.73(HA의 pKa 미만), 7.4 및 9.0의 특징을 갖는 매체 중에 침지시킨 다음 가습된 여과지로 닦고 중량을 재었다. 변화하는 pH 값의 팽윤 매체는 유럽 약전을 참조하여 제조하였으며, 팽윤 속도론 및 pH 감수성 시험 양자 모두에 있어서 NaCl을 사용하여 I=0.1 M로 이온 세기를 유지하였다(도 7 및 8). 상기 모든 실험을 3회 반복하여 수행하였으며, 팽윤비를 3회 분리된 실험의 평균 ± SD(n=3)로 보고하였다.
상이한 이온 세기의 NaCl 용액 또는 증류수에 대한 철저한 투석 후에 팽윤된 겔의 중량(Ws)과 건조 네트워크의 중량 사이의 비로서 정의되는, 하이드로겔의 팽윤 용량(Q)를 연구하고 도 8에 요약하였다. 시료를 평형(일정한 중량)에 도달할 때까지 25 ℃에서 증류수 또는 상이한 이온 세기의 용액에서 팽윤시켰다.
pH 감수성 하이드로겔의 경우, 하이드로겔 내로의 물 수송은 하이드로겔이 센서 또는 제어된 방출 시스템으로 작용할 수 있기 전의 필수불가결한 제1 단계이다. 따라서, 하이드로겔 내의 물 수송 메카니즘 및 유도된 하이드로겔 팽윤 메카니즘에 대한 분명한 지식은 적재할 적절한 약물의 선택을 유도하고 약물 방출 및 속도를 제어하는데 필요하다. 도 7은 하이드로겔의 팽윤비 대 침지 시간의 함수로 표현된, 히알우론산을 기본으로 하는 양쪽성 하이드로겔의 팽윤 속도론에 대한 pH 값의 효과를 설명한다. 37 ℃에서 pH=1.73(HA의 pKa 미만), 인산-식염수 완충액 pH=7.4 및 pH=9.0의 상이한 매체에서 팽윤 속도론을 조사하였다. 특정 pH 값을 선택하였는데, 왜냐하면 이들 값에서 하이드로겔이 가장 큰 팽윤 정도를 나타내었기 때문이다. 본 특허에 기재된 팽윤 정도를 계산하기 위한 제2 중량은 부피 결정에 의해 얻어졌는데; 이 실험의 경우 1% w/v 농도의 용액 1 g에 의해 점유된 부피는 실린더 방정식을 사용하여 실험적으로 474 ± 20 ㎣로 결정되었다. 실온의 PBS-식염수 완충액에서 팽윤시킨지 24시간 후에 하이드로겔은 677 ± 46 ㎣로 부피가 증가하였다. 동일 매체에서의 팽윤 96시간 후, 하이드로겔은 633 ± 44 ㎣의 부피를 나타내었다. 표준 편차를 사용할 때, 하이드로겔의 부피가 감소하였으며, 이는 그의 생분해성 때문일 수 있다고 믿을 수 있다. 재료를 생체내에 적용하는 경우, 본 발명자들은 천연 히알우로니다제가 분해 과정을 증가시킬 것이라고 추정할 수 있었다.
하이드로겔의 팽윤 속도론은 대략적으로 하기 수학식을 사용하여 표현될 수 있다:
(Ws-Wd)/(We-Wd)=ktn 수학식 (2)
상기 식에서 Wd, Ws 및 We는 각각 건조된(d), t 시간에서의 팽윤된(s) 및 평형에 도달한(e) 하이드로겔의 중량이고, k는 하이드로겔 네트워크 구조에 관련된 상수이며, n은 팽윤 메카니즘을 표시하는 팽윤 지수이다. n ≤ 0.5인 경우, 하이드로겔은 픽 확산을 따르며, 여기에서 물 수송은 단순한 농도 구배에 의해 통제된다. n = 1이면, 물 흡수는 대류에 의해 제어되며, 여기에서 하이드로겔 이완은 물 수송에 대한 우세한 메카니즘이 된다. n이 0,5 내지 1 사이에 있으면, 물 흡수는 변칙적인 확산에 따를 것이며, 여기에서 물 확산 속도는 중합체 이완 속도에 필적한다. 팽윤 메카니즘에 대한 식견을 갖기 위하여, 시간에 대한 팽윤 정도의 곡선을 로그자로 도시하고(데이터는 나타내지 않음) 하이드로겔 내로의 물의 수송에 대한 페파스(Peppas) 이론에 따라 Ws/We = 60%의 초기 단계에서 선형 근사(linear fitting)를 실행하였다(Ritger & Peppas, 1987a, b). 얻어진 n 값과 결정계수(R2)를 표 2에 요약하였다.
pH 값 n R2
1.7 0.47 0.991
7.4 0.60 0.997
9.0 0.73 0.994
표 2는 상이한 pH에서의 n 값을 요약한다. pH=7.4의 인산-식염수 완충액을 처음에 평가하였다. 생리적 pH 및 pH=9.0에서 각각 n=0.6 및 0.73의 계산값은 팽윤이 변칙적인 확산을 따르고 있음을 암시한다. pH=1.7에서의 n=0.47의 계산값은 하이드로겔이 픽 확산을 따르고 있음을 의미한다. 도 1에 나타낸 바와 같이, -NH2-+ 양이온 및 -COO- 음이온이 양자 모두 pH=7.4에서 하이드로겔에 존재하며, 쌍극자의 존재로 인하여 하이드로겔 내로 수소 결합의 부가적인 형성이 촉진되며, 이는 결과적으로 물 확산을 방지하여 팽윤의 속도-제한 단계가 된다. -NH2-+ 양이온 및 -COOH가 양성자화되는 더 낮은 pH=1,7에서 하이드로겔이 수축한다. 하이드로겔 내부의 강한 정전기적 반발이 팽윤된 하이드로겔을 생성한다(도 7 참조, pH=9.0). 반발은 강도를 증진시키고 이완을 둔화시킨다. 제로 차수의 약물 방출을 얻기 위해서는 적재될 약물의 특성 및 하이드로겔 크기 및 형상도 고려되어야 한다.
본 발명에 따른 생재료는 세포 배양용 스캐폴드 뿐아니라 조직 공학 또는 재생에 사용하기 위한 겔 함유 다공질 재료(gel containing cellular material)의 형태일 수 있다.
추가의 실시양태는 본 발명의 주요 측면의 일부를 범위의 제한없이 설명하고 있는 후술하는 실시예로부터 자명해질 것이다.
실시예
실시예 1. 산화된 히알우로난(HA-Ox)의 제조 및 분리
단량체성 단위 125 몰당량에 상응하는 상이한 분자량의 히알우로난 10 g을 실험 전에 24시간 동안 실온에서 5000 ml의 물에 용해시켰다. 19.2 g의 KBr(16.5mmol) 및 10 g의 NaH2PO4을 이 용액에 가하였다. 반응 혼합물을 0 ℃로 냉각시켰다. 반응액을 진공화하고 질소로 재충전시켰다. 그 후, 10.7 mg의 4-아세트아미도-TEMPO(0.05 mmol)를 함유하는 수용액을 반응 혼합물에 가한 다음, 존재하는 히알우론산나트륨 몰의 10%에 상응하는 0.588 mL(1,25 mmol)의 하이포아염소산나트륨를 가하였다. 산화 반응을 5 ℃에서 2시간 동안 수행하였다. 그 후, 용액을 5000 ml의 물로 희석하고 pH를 7.0으로 조정하였다. 10 kDa의 분자량 컷-오프를 가진 센트라메이트 카세트(centramate cassette; Paal Co)를 사용하여 용액을 한외여과하였다. 생성물을 IPA로 침전시키고 IPA:water(100:0, 80:20, 60:40)로 3회 세척하였다. 침전을 60 ℃의 오븐에서 건조시켰다.
이와 같이 얻어진 반응 생성물을 분석적 방법론에 의해 완전히 특성조사하였다. 반응 수율은 90-99%였다. 얻어진 생성물들의 분자량은 이후의 화학적 개질에 사용되기 때문에 Mw(산화된 HA)로서 하기 표 3 및 표 4에 기재하였다.
FT-IR (KBr, cm-1): 3419 (υ, -O-H), 2923, 2160, 1652, 1614, 1413, 1080, 1039, 611.
NMR 1H (500 MHz, NaOD, δppm): 3.4-4.0 (m, 10H), 4.5 (d, 2H), 5.2 (s, 1H)
DOSY:
log D (2,03 ppm CH 3 -CO-NH-중합체) ~ - 10,5 ㎡/s
log D (5,2 ppm -CH2NH-R) ~ - 10,5 ㎡/s
실시예 2. HA-프로필 아지도아민(II)의 제조
먼저, 하기 방법대로 링커 3-아지도프로판아민을 합성하였다. 3-클로로-프로필아민 하이드로클로라이드(1.00 g) 및 아지드화나트륨(2,5016 g, 3 당량)을 물(10 mL)에 용해시킨 다음 촉매량의 KI를 가하였다. 플라스크를 물 컨덴서에 부착시키고 반응 혼합물을 72시간 동안 90 ℃에서 가열하였다. 실온으로 냉각시킨 후, pH 11이 될 때까지 수산화나트륨을 가하였다. 에테르를 사용하여 유리 아민을 반응 혼합물로부터 추출하였다. 유기 분획을 황산나트륨으로 건조시키고 완전한 건조를 피하면서 진공하에 농축하였다. 짧은 탄소쇄의 아미노-아지드는 폭발성인 것으로 의심되었다. 1H NMR에 의해 화합물의 구조 및 순도를 확인하였다. NMR (500.13 MHz, CDCl3); 1,41 (2H, bs, -NH2), 1,76 (2H, q, J=6,8), 2,81 (2H, t, J=6,8), 3,38 (2H, t, J=6,8). FT-IR (KBr, cm-1): 3363, 2941 (υ -CH2), 2100 (υ -N≡N), 1650, 1593, 1461, 1286.
다음에, 링커(3-아지도프로필아민)를 산화된 히알우론산과 커플링시켜 15%의 치환도를 갖는 HA-프로필 아지도아민(HA-2APA)를 제조하였다. 구체적인 제조 조건은 표 3의 다수 실시예에 대해 제공되어 있다. 일반적으로, 산화된 히알우로난은 둥근 바닥 플라스크에서 실온의 50 ml의 아세테이트 완충액(pH=6.0)에 용해되었다. 24시간의 교반 후, 3-아지도프로필아민을 가하고, 이민 형성을 위한 시간으로서 표 3에 제시된 시간 동안 실온에서 반응을 진행하였다. 그 후, 피콜린-보란을 반응 혼합물에 가하고, 환원을 위한 시간으로서 표 3에 제시된 시간 동안 반응을 수행하고, 50 ml의 물에 희석하고, 5% NaHCO3 /NaCl 용액에 대해 투석하고, 냉동-건조시키거나 한외여과하고, 60 ℃의 오븐에서 건조하였다. 반응 수율은 80-95% 범위였다. 유도체의 다분산도 및 각각의 분자량을 표 3에 요약하였다.
FT-IR (KBr, cm-1): 3379 (υ, -O-H), 2894, 2008 (υ, N3), 1614, 1407, 1078, 613.
NMR 1H (500 MHz, NaOD, δ ppm): 2,0 (s, 3H), 2,85 (m, 2H), 3,1 (m, 2H), 3,4-4,0 (m, 10H), 4,5 (d, 2H).
DOSY
log D (2,03 ppm CH 3 -CO-NH-중합체) ~ - 10,5 ㎡/s
log D(2,7 ppm -CH2 NH-R) ~ - 10,5 ㎡/s
log D(3,0 ppm -CH2NH-R) ~ - 10,5) ㎡/s
HA-아지도프로필-2-아민(HA-CAPA)의 합성에 사용된 반응 조건
항목 Mw산화된 HA
(kDa)/P		 m산화된 HA (g) n링커
(당량 HA)		 n환원제
(당량 HA)		 T이민
(h)		 T환원
(h)		 DS(%) MwHA-CAPA
(kDa)/P
1 108/1.3 0.2 0.5 3 BCN 24 24 15 30/1.4
2 300/1.5 0.4 1 3 BCN 72 48 15 300/1.8
3 300/1.5 0.4 1 3 PB 72 48 15 31/1.4
4 316/2.0 2.0, 1 1 PB 72 48 15 90/1.4
5 612/1.9 2.0, 1 1 PB 72 48 15 89/1.4
6 612/1.9 10.0 0.4 0.2 PB 6 8 15 124/1.4
7 755/1.46 0.8 0.5 3 BCN 24 72 15 170/1.6
Mw = 분자량
m = 중량
n = 몰량
T이민 = 이민 형성 시간
T환원 = 이민 환원 시간
PB= 피콜린 보란
BCN= 소듐 시아노보로하이드리드
당량 HA = HA 이량체에 대한 당량
DS = 치환도
P= 다분산도
실시예 3. HA-프로파길 아민(HA-CAPr)의 제조
여러 실시예에 대한 구체적인 제조 조건이 표 4에 요약되어 있다. 일반적으로, 실시예 1에서 제조된 산화 히알우로난을 실온에서 24시간 동안 40 ml의 물에 용해시켰다. 표 4에 제시된 일정량의 프로파길아민을 반응 혼합물에 가하여 이민을 형성하였다. 반응용액을 실온에서 교반하면서 표 4에 특정된 시간(T이민) 동안 이민이 형성되도록 하였다. 이 시간 후에, 1% 환원제 수용액(표 4)을 반응 혼합물에 가하고 T환원(표 4)으로 배정된 시간 동안 반응이 진행되게 하였다. 그 후, 반응 혼합물을 50 ml의 물로 희석하고, 물에 대해 철저히 투석하고, 냉동-건조시키거나 한외여과하고, 60 ℃의 오븐에서 건조시켰다(표 4).
FT-IR (KBr, cm-1): 3379 (υ, -O-H), 2894, 2131 (υ, C≡C), 1614, 1407, 1078, 613.
NMR 1H (500 MHz, NaOD, δ ppm): 2,0 (s, 3H), 2,85 (m, 2H), 3,1 (m, 2H), 3,4-4,0 (m, 10H), 4,5 (d, 2H).
DOSY
log D (2,03 ppm CH 3 -CO-NH-중합체) ~ - 10,5 ㎡/s
log D (2,7 ppm -CH2 NH-R) ~ - 10,5 ㎡/s
log D (3,0 ppm -CH2NH-R) ~ - 10,5) ㎡/s
HA-CAPr의 합성에 사용된 반응 조건(반응식 3)
항목 MW산화된 HA
(kDa) P		 m산화된 HA (g) n프로파길아민
(당량 HA)		 n환원
(당량 HA)		 T이민
(h)		 T환원
(h)		 DS (%) MWHA-CAPr
(kDa)/ P
1 108/1.3 0.2 0.5 3BCN 24 24 19 94/1.6
2 108/1.3 0.2 0.5 3BCN 24 24 19 31/1.4
3 300/1.5 0.4 1 3BCN 72 48 21 229/1.4
4 300/1.5 0.4 1 3 PB 72 48 21 165/1.7
5 612/1.9 2.0 1 1 PB 72 48 15 199/1.6
6 612/1.9 2.0 1 1 PB 72 48 15 199/1.6
7 612/1.9 10 0.4 0.4 PB 6 48 12 361/1.5
8 612/1.9 10 0.2 0.2 PB 6 밤새 15 124/1.4
실시예 4. 나트륨이 없는 히알우론산의 산화, 산화 및 환원적 아민화
약술하면, 평균 분자량 1.2 MDa인 5 g의 히알우론산을 500 ml의 증류수에 용해시켰다. DOWEX 50WX8 수지 양이온 수지 교환(H 유형)을 혼합물에 가하였다. 이온 교환 후에, 5000 rpm에서 5분간 원심분리하여 수지를 제거하고 생성된 용액을 -80 ℃에서 냉동시키고 동결건조시켰다. 양이온 교환 후 중합체의 분자량 및 다분산도를 SEC-MALLS에 의해 결정하였다.
평균 분자량 100 kDa인 1.0 g의 히알우론산(나트륨이 없음)을 100 ml의 DMSO에 60 ℃에서 24시간 동안 용해시켰다. 0.8 당량의 히알우론산에 상응하는 0.35 g의 데스-마르틴 퍼아이오디난을 반응 혼합물에 가하였다. 실온에서 6시간 동안 반응을 수행하였다. 반응 혼합물을 침전에 의해 분리하였다. 약술하면, 반응 혼합물을 서서히 2-프로판올(500 ml)에 부었다. 침전이 형성되면 이를 여과하고 200 ml의 2-프로판올/DMSO 80:20으로 4회 및 2-프로판올(100 ml)로 3회 세척하였다. 생성물을 60 ℃에서 밤새 진공 건조시켰다. 생성물을 물에 용해시키고 일정한 교반하에 2-프로판올에 서서히 부었다. 침전을 분리하고 특성조사하였다. 이 방법론에 의해 치환도를 DS = 28%(DS=[CH3CONH/NH-CH/].)로 계산하였다
FT-IR (KBr, cm-1): 3419 (υ, -O-H), 2923, 2160, 1710, 1652, 1614, 1413, 1080, 1039, 611.
NMR 1H (500 MHz, NaOD, δ ppm): 3.4-4.0 (m, 10H), 4.5 (d, 2H), 5.2 (s, 1H)
DOSY:
log D (2,03 ppm CH 3 -CO-NH-중합체) ~ - 10,5 ㎡/s
log D (5,2 ppm -CH2NH-R) ~ - 10,5 ㎡/s
환원된 유도체의 수득
후술하는 바와 같이 일반적인 합성 과정을 수행하였다. 1 g의 산화된 히알우론산을 밤새 물에 용해시켰다(100 ml). 이 용액에 프로파길 아민을 가하였고, 0.46 당량의 히알우론산에 상응하는 각각의 아민이 반응액에 존재하였다. 용액을 실온에서 48시간 동안 교반하였다. 1 당량의 NaBH3CN 수용액 1 % w/w를 제조하고 반응 혼합물에 가하였다. 혼합물을 실온에서 96시간 동안 교반하였다. 반응 완결 후, 용액을 0.1% NaCl 및 0.1% NaHCO3 혼합물에 대해 투석하고 물에 대해 철저히 투석하였다. 최종 생성물을 동결건조에 의해 분리하였다.
환원된 생성물: 프로파길 유도체
DS=28% (DS=[CH3CONH/ NH-CH/].
FT-IR (KBr, cm-1): 3379 (υ, -O-H), 2894, 2131 (υ, C≡C), 1614, 1407, 1078, 613.
1H NMR (500 MHz, NaOD, δ ppm): 2,0 (s, 3H), 2,85 (m, 2H), 3,1 (m, 2H), 3,4-4,0 (m, 10H), 4,5 (d, 2H).
DOSY
log D (2,03 ppm CH 3 -CO-NH-중합체) ~ - 10,5 ㎡/s
log D (2,7 ppm -CH2 NH-R) ~ - 10,5 ㎡/s
log D (3,0 ppm -CH2NH-R) ~ - 10,5) ㎡/s
SEC MALS에 의해 결정된 분리 생성물의 분자량은 15 kDa이고 다분산도는 1.5이다.
환원된 생성물: 아지도 유도체
DS=28% (DS=[CH3CONH/ NH-CH/].
FT-IR (KBr, cm-1): 3415 (υ, -O-H), 2921, 2111 (υ, N3), 1614, 1407, 1377, 1078, 613.
1H, HSQC, NMR (500 MHz, NaOD, δ ppm): 2,0 (s, 3H), 2,014 (s, 3H), 2,85 (m, 2H), 3,08 (t, 2H, J=10.95), 3,4-4,0 (m, 10H), 4.45 (dd, 1H), 4.53 (dd 1H).
DOSY
log D (2,03 ppm CH 3 -CO-NH-중합체) ~ - 10,5 ㎡/s
log D (2,7 ppm -CH2 NH-R) ~ - 10,5 ㎡/s
log D (3,0 ppm -CH2NH-R) ~ - 10,5) ㎡/s
SEC MALS에 의해 결정된 분리 생성물의 분자량은 15 kDa이고 다분산도는 1.5이다.
실시예 5. 프로파길 유도체를 얻기 위한 단일 용기에서의 히알우로난의 산화 및 환원적 아민화
다수의 실시예에 대한 구체적인 제조 조건을 표 5에 나타내었다. 일반적으로, MWHA로서 표 5에 기재한 상이한 분자량을 지닌 10.0 g의 히알우론산나트륨을 960 ml의 물에 용해시켰다. 이 용액에 2.57 g의 브롬화나트륨(2,5 mmol)을 가하였다. pH=9.0에 도달하도록 반응 혼합물에 38.8 g의 인산나트륨을 가하였다. 하기 반응물을 순서대로 가하였다: 미리 물(1 ml)에 용해시킨 53.3 mg의 4-아세트아미도-TEMPO 및 그 뒤에 3.0 ml의 하이포아염소산나트륨. T이민(표 5)으로 기재된 시간 동안 교반하에 혼합물을 방치하였다. 반응액이 실온에 도달하도록 하였다. 이 순간에, pH=5.5에 도달하도록 아세트산을 가하여 pH를 전위차적으로(potentiometrically) 조정하였다. 이후에, 반응 혼합물에 존재하는 히알우론산에 상응하는 0.3 당량의 프로파길 아민을 상기 혼합물에 가하였다. 표 5에 기재된 시간 동안 환원적 아민화를 수행하였다. 이 순간, 0.3 당량의 히알우론산에 상응하는 0.424 g의 피콜린 보란을 가하였다. 실온에서 밤새 반응이 진행되도록 하였다. 생성물을 한외여과로 정제하였다. 통상의 분석 기술에 의해 프로파길-개질된 HA 생성물을 완전히 특성조사하였다. HA에 결합된 프로파길 아민 부위의 정량적 평가를 위해 사용된 신호는 개질된 폴리사카라이드에 대해 할당된 메틸렌과 비교하여 HA에 대해 할당된 메틸이었다.
DS=[표 5에 기재된 CH3CONH/ NH-CH/].
FT-IR (KBr, cm-1): 3379 (υ, -O-H), 2894, 2131 (υ, C≡C), 1614, 1407, 1078, 613.
NMR 1H (500 MHz, NaOD, δ ppm): 2,0 (s, 3H), 2,85 (m, 2H), 3,1 (m, 2H), 3,4-4,0 (m, 10H), 4,5 (d, 2H).
DOSY
log D (2,03 ppm CH 3 -CO-NH-중합체) ~ - 10,5 ㎡/s
log D (2,7 ppm -CH2 NH-R) ~ - 10,5 ㎡/s
log D (3,0 ppm -CH2NH-R) ~ - 10,5 ㎡/s
HA-CAPr의 합성에 사용된 반응 조건(반응식 3)
항목 MW HA
(kDa)/P		 m산화된 HA
(g, %w/w)		 n링커
(당량 HA)		 n환원제
(당량 HA)		 T이민
(h) 		T환원
(h)		 DS(%) MWHA-CAPr
(kDa)/P
1 19 (2.0, 1 ) 0.3 0.3 5 밤새 12 17/1.3
2 19 (2.0, 1) 0.3 0.3 5 밤새 12 17/1.3
3 90 (10.0, 1) 0.3 0.3 5 밤새 8 84/1.5
4 90 (10.0, 1) 0.3 0.3 5 밤새 8 83/1.4
5 90 (20, 1) 0.3 0.3 5 밤새 12 88/1.5
6 90 (20, 1) 0.3 0.3 5 밤새 12 84/1.5
7 90 (20, 2) 0.3 0.3 5 밤새 12 87/1.2
8 90 (20, 3) 0.3 0.3 5 밤새 12 86/1.2
9 90 (20, 4) 0.3 0.3 5 밤새 12 86/1.2
10 90 (20, 5) 0.3 0.3 5 밤새 12 86/1.2
11 202 (10.0, 1) 0.3 0,3 5 밤새 15 140/1.2
12 498 (10.0, 1) 0.3 0.3 5 밤새 15 226/1.8
PA: 프로파길 아민
실시예 6. 4 ℃에서 프로파길 유도체(HA-CAPr)를 얻기 위한 단일 용기에서의 히알우로난의 산화 및 환원적 아민화(저급 DS)
다수의 실시예에 대한 구체적인 제조 조건을 표 5에 나타내었다. 일반적으로, 1.8 MDa의 평균 분자량을 지닌 10.0 g의 히알우론산나트륨을 960 ml의 물에 용해시켰다. 이 용액에 2.57 g의 염화나트륨(2,5 mmol)을 가하였다. pH=9.0에 도달하도록 반응 혼합물에 38.8 g의 인산나트륨을 가하였다. 하기 반응물을 순서대로 가하였다: 미리 물(1 ml)에 용해시킨 53.3 mg의 4-아세트아미도-TEMPO 및 그 뒤에 3.0 ml의 하이포아염소산나트륨을 용액에 가하였다. 4 ℃에서 15분간 교반하에 혼합물을 방치하였다. 반응액이 실온에 도달하도록 하였다. 이 순간에, pH=5.5에 도달하도록 아세트산을 가하여 pH를 전위차적으로 조정하였다. 이후에, 반응 혼합물에 존재하는 히알우론산에 상응하는 0.3 당량의 프로파길 아민을 상기 혼합물에 가하였다. 5시간 동안 환원적 아민화를 수행하였다. 이 순간, 0.3 당량의 히알우론산에 상응하는 0.424 g의 피콜린 보란을 가하였다. 4 ℃에서 밤새 반응이 진행되도록 하였다. 생성물을 한외여과로 정제하였다. 통상의 분석 기술에 의해 프로파길-개질된 HA 생성물을 완전히 특성조사하였다. HA에 결합된 프로파길 아민 부위의 정량적 평가를 위해 사용된 신호는 개질된 폴리사카라이드에 대해 할당된 메틸렌과 비교하여 HA에 대해 할당된 메틸이었다. SEC-MALLS에 의해 분자량을 결정한 결과, 900 kDa의 평균 분자량 및 1.7의 다분산도를 얻었다.
DS=[circa 5% CH3CONH/ NH-CH/].
FT-IR (KBr, cm-1): 3379 (υ, -O-H), 2894, 2131 (υ, C≡C), 1614, 1407, 1078, 613.
NMR 1H (500 MHz, NaOD, δ ppm): 2,0 (s, 3H), 2,85 (m, 2H), 3,1 (m, 2H), 3,4-4,0 (m, 10H), 4,5 (d, 2H).
DOSY
log D (2,03 ppm CH 3 -CO-NH-중합체) ~ - 10,5 ㎡/s
log D (2,7 ppm -CH2 NH-R) ~ - 10,5 ㎡/s
log D (3,0 ppm -CH2NH-R) ~ - 10,5 ㎡/s
실시예 7. HA-아지드 프로필 유도체를 얻기 위한 4 ℃ 단일 용기에서의 히알우로난의 산화 및 환원적 아민화
표 6(MW HA)에 기재된 평균 분자량을 지닌 10.0 g의 히알우론산나트륨을 960 ml의 물에 용해시켰다. 용액을 4 ℃로 냉각시켰다. 이 용액에 2.57 g의 브롬화나트륨(2.5 mmol)을 가하였다. 반응 혼합물에 38.8 g의 Na2HPO4를 가하였다. 0.1 M의 수산화나트륨 용액으로 반응액의 pH를 9.0으로 조정하였다. 그 다음에 하기 반응물을 순서대로 가하였다: 미리 물(1 ml)에 용해시킨 53.3 mg의 4-아세트아미도-TEMPO 및 그 뒤에 3.0 ml의 하이포아염소산나트륨을 반응 혼합물에 가하였다. 4 ℃에서 15분간 교반하에 반응액을 방치하였다. 아세트산을 첨가하여 4 ℃로 유지된 반응액이 pH=6.0에 도달하도록 하였다. 그 후, 반응 혼합물에 존재하는 히알우론산나트륨 이량체에 대해 표 6(n링커)에 기재된 몰비로 아지드 프로필 아민을 상기 혼합물에 가하였다. 표 6에 T(이민)(h)로 표시된 시간 동안 반응을 수행하였다. 이 순간, n(환원제)로 표 6에 기재된 퍼센트에 상응하는 양의 피콜린 보란을 반응 혼합물에 가하였다. 반응액을 한외여과로 정제하고 IPA:H2O의 상이한 혼합물을 사용하여 다시 침전시켰다. 생성물을 60 ℃에서 건조시켰으며, 회수율이 95%인 것으로 결정되었다. SEC-MALLS 분석 결과, 800 kDa의 평균 분자량 및 1.6의 다분산도를 얻었다.
HA-CAPA의 합성에 사용된 반응 조건
항목 MW HA
(kDa)/P		 mHA
(g, %w/w)		 n링커
(당량 HA)		 n환원제
(당량 HA)		 T이민 (h) T환원
(h)		 DS(%) MWHA-CAPA
(kDa)/P
1 90/1.5 (10.0, 1) 0,3 0,3 2 밤새 10 83
1.4
2 90/1.5 (20.0, 2) 0,3 0,3 2 밤새 10 85
1.4
3 202/1.5 (10.0, 1) 1 1 2 밤새 12 127
1.3
4 202/1.5 (10.0, 1) 0.3 0.3 5 밤새 12 170
1.2
5 498/1.5 (10.0, 1) 0.3 0.3 5 밤새 15 138
1.6
APA: N3-(CH2)3-NH2
실시예 8. 단일 용기에서 11-아지도-3,6,9-트리옥사운데칸-2-아민을 얻기 위한 4 ℃에서의 히알우로난의 산화 및 환원적 아민화
여러 분자량(표 7)을 보유하는 10.0 g의 히알우론산나트륨을 960 ml의 물에 용해시켰다. 용액을 4 ℃로 냉각시켰다. 이 용액에 2.57 g의 브롬화나트륨(2.5 mmol)을 가하였다. 38.8 g의 Na2HPO4를 반응 혼합물에 가하였다. 0.1 M 수산화나트륨 용액을 사용하여 반응액의 pH를 9.0으로 조정하였다. 그 다음에 하기 반응물을 순서대로 가하였다: 미리 물(1 ml)에 용해시킨 53.3 mg의 4-아세트아미도-TEMPO 및 그 뒤에 3.0 ml의 하이포아염소산나트륨을 반응 혼합물에 가하였다. 4 ℃에서 15분간 교반하에 반응액을 방치하였다. 아세트산을 첨가하여 4 ℃로 유지된 반응액이 pH=6.0에 도달하도록 하였다. 그 후, 반응 혼합물 내의 히알우론산나트륨 이량체에 대해 30 몰%로 11-아지도-3,6,9-트리옥사운데칸-1-아민을 상기 혼합물에 가하였다. 동일 온도에서 5시간 후, 히알우론산나트륨 이량체의 30 몰%에 상응하는 0.424 g의 피콜린 보란을 가하였다. 생성물을 60 ℃에서 건조시켰으며, 회수율이 95%인 것으로 결정되었다. SEC-MALLS 분석 결과, 표 7에 나타낸 분자량이 얻어졌다.
DS= [circa 10% CH3CONH/ NH-CH/].
FT-IR (KBr, cm-1): 3379 (υ, -O-H), 2894, 2008 (-N3), 1614, 1407, 1078, 613.
NMR 1H (500 MHz, NaOD, δ ppm): 2.01 (s, 3H), 2.81 (m, 2H), 2.99 (m, 1H), 3.36-3.94 (m, 16H), 4,5 (d, 2H).
HSQC (교차-피크): (2.8-50), (3.4-50) , (3.7-70), (3.8-70).
DOSY
log D (2,03 ppm CH 3 -CO-NH-중합체) ~ - 10,5 ㎡/s
log D (2,7 ppm -CH2 NH-R) ~ - 10,5 ㎡/s
log D (3,0 ppm -CH2NH-R) ~ - 10,5 ㎡/s
단일 용기에서 1-아지도-3,6,9-트리옥사운데칸-1-아민과의 반응(HA-CATA)
항목 MW HA
(kDa)/P		 mHA
(g, %w/w)		 n링커
(당량 HA)		 n환원제
(당량 HA)		 DS(%) MWHA-CAPA
(kDa)/P
1 90/1.5 (1.0, 1) 0,3 0,3 10 89/1.4
2 1300/1.5 (10.0, 2) 0,3 0,3 10 268/1.2
3 130/1.5 (20.0, 1) 0,3 0,3 10 93/1.5
4 200/1.5 (20.0, 1) 0,3 0,3 10 170/1.4
실시예 9. 단일 용기에서 히알우로난의 산화 및 환원적 아민화. 3-아지딜 아닐린 유도체의 수득
611 kDa의 평균 분자량 및 1.9의 다분산도를 지닌 5.0 g의 알데히드 작용기화된 히알우로난을 실온에서 24시간 동안 500 ml의 증류수에 용해시켰다. 반응 혼합물에 존재하는 0.1 당량의 히알우론산나트륨에 상응하는 0.308 g의 아지도-아닐린 하이드로클로라이드를 이 용액에 가하였다. 용액을 실온에서 5시간 교반하였다. 그 후, 10몰%의 히알우론산 이량체에 상응하는, 물에 현탁된 피콜린 보란을 반응 혼합물에 가하였다. 실온에서 밤새 반응이 진행되도록 하여 HA-아지딜 아닐린 유도체를 얻었다. 반응액을 물에 대해 철저히 투석하였다. 얻어진 중합체를 전형적인 분석 기술에 의해 분석하였다. 전자 효과에 의한 가교 반응의 효능을 평가할 뿐아니라 환원적 아민화에 대한 상이한 아민의 반응성을 평가하기 위하여 이 화합물을 합성하였다.
DS= [15% CH3CONH/ NH-CH/].
FT-IR (KBr, cm-1): 3415 (υ, -O-H), 2894, 2121 (υ -N≡N), 1662, 1614, 1407, 1377, 1151, 1078, 615.
NMR 1H (500 MHz, NaOD, δ ppm): 2.0 (s, 3H), 2,85 (m, 2H), 3,1 (m, 2H), 3,4-4,0 (m, 10H), 4,5 (d, 2H).
DOSY
(2.03 ppm CH 3 -CO-NH-중합체)=7.92x10-12) ㎡/s
(3.1 ppm- 4,2 중합체) ~7.92x10-12) ㎡/s
(6.85 ppm -o-Ar) ~7.92x10-12) ㎡/s
(6.95 ppm -m-Ar) ~7.92x10-12) ㎡/s
실시예 10. 단일 용기에서 히알우로난의 산화 및 환원적 아민화. 3-알키닐 아닐린 유도체의 수득
600 kDa의 평균 분자량을 지닌 1.0 g의 알데히드 작용기화된 히알우로난을 실온에서 24시간 동안 100 ml의 증류수에 용해시켰다. 반응 혼합물에 존재하는 히알우론산나트륨에 대해 10몰%에 상응하는 0.250 g의 에티닐 아닐린을 이 용액에 가하였다. 실온에서 5시간 동안 용액을 교반하였다. 그 후, 히알우론산나트륨에 대해 10몰%에 상응하는, 물에 현탁된 피콜린 보란을 반응 혼합물에 가하였다. 실온에서 8시간 동안 반응이 진행되도록 하여 HA-에티닐 유도체를 얻었다. 반응액을 물로 희석하고 물에 대해 철저히 투석하였다. 얻어진 중합체를 전형적인 분석 기술에 의해 분석하였다.
DS= [15% CH3CONH/ NH-CH/].
FT-IR (KBr, cm-1): 3415 (υ, -O-H), 2894, 2121 (υ, -N≡N), 1662, 1614, 1407, 1377, 1151, 1078, 615.
NMR 1H (500 MHz, NaOD, δ ppm): 2.0 (s, 3H), 2.85 (m, 2H), 3.1 (m, 2H), 3.4-4.0 (m, 10H), 4.5 (d, 2H).
DOSY
(2,03 ppm CH 3 -CO-NH-중합체) = -7.92x10-12) ㎡/s
(3,1 ppm- 4,2 중합체) ~-7.92x10-12) ㎡/s
(6,85 ppm -o-Ar) ~-7.92x10-12) ㎡/s
(6,95 ppm -m-Ar) ~-7.92x10-12) ㎡/s.
실시예 11. 물 또는 PBS에서 개질된 II 및 III로부터 하이드로겔의 형성
1:1 몰비로, 17 kDa에서 900 kDa으로 변화하는 상이한 분자량의 유도체 (HA-CAPr) 및 (HA-CAPA)와 DS로부터 제조된 용액을 밤새 용해시켰다(총 부피 1.0 ml). 이들의 치환도(DS)를 기본으로 하여 시약의 정확한 양을 결정하여 양쪽 시약의 최종 농도가 DS = 100%인 경우 2% (w/v)로 유지되도록 하였다. 그 후, 겔화의 속도론을 연구하기 위하여 변화하는 몰량의 촉매 CuSO4 및 아스코르브산나트륨을 혼합물에 가하였다(표 8). 각 구성요소의 첨가 후에 볼텍싱을 사용하여 양호한 균질화를 확보하였다. 그 후, 겔이 형성될 때까지 몇 초간 반응액을 교반하였다. 겔화 시간을 바이알 기울이기 방법(vial tiling methodology; Domszy et al, 1986)에 의해 결정하였다. 촉매를 제거하기 위해 0.01%(w/v) EDTA를 함유하는 인산 식염수 완충액 또는 증류수에 대해 48시간 동안 제조된 겔을 투석하였다. 하이드로겔을 냉동-건조하고, 냉동건조된 네트워크의 질량을 결정하였다. SEM 실험의 경우 원래 구조를 보존하기 위해 액체 질소를 사용하여 겔을 냉동시키고 건조시켰다. 겔 시료는 SEM 분석 전에 금으로 방사되었다(sputtered with gold).
상이하게 치환된 HA-CAPA(DS=8-15%) 및 HA-CAPr(DS=8-15%)에 대한 가교 반응 조건의 영향. 25 ℃에서 총 부피 1 ml의 PBS 완충액에서 반응을 수행하였다. 모든 겔화 실험을 5회 독립적으로 수행하였다.
HA-CAPA
DS (%) 		HA-CAPr
DS (%) 		항목 c(Cu 2+ ) a (mM) c(SA) b (mM) 겔화 시간(s);
(% w/v)
15 15 1 0.01 0.1 58±5; (3.5)
2 0.01 0.1 85±5 (3.0)
3 0.01 0.1 252±5 (2.5)
4 0.01 0.1 458±20 (2.0)
5 0.002 0.2 2400±60 (2.0)
12 12 6 0.02 0.5 23±2 (2.0)
7 0.002 0.5 30±5 (2.0)
8 0.002 0.02 55±5 (2.0)
9 0.001 0.02 NG (2.0)
10 0.0002 0.02 NG (2.0)
10 10 11 0.002 0.5 37±2 (2.0)
a황산구리
b아스코르브산나트륨
NG=겔화가 관찰되지 않음
실시예 11에 보고된 상이한 하이드로겔의 팽윤 연구
표 8의 항목 3 및 11에 기재된 조건을 사용하여 상이한 겔을 제조하였다. 모든 팽윤 실험을 독립적으로 5회 수행하였다. 팽윤비는 매체의 이온 세기에 의존적이었다. 물에서, 팽윤비는 그의 최대치에 도달한다(700%).
실시예 12. 실시예 11에서 얻은 가교된 히알우론산을 기본으로 하는 재료로부터 약물 벤지다민 하이드로클로라이드의 방출 측정
중합체 네트워크 내로의 약물 적재를 팽윤-평형 방법에 의해 그리고 물리적 혼입에 의해 수행하였다. 첫 번째 과정에서는, 37 ℃에서 24, 48 및 72시간 동안 기지 농도의 약물 용액에서 가교된 중합체가 팽윤되도록 하였다. 약물-적재된 장치를 얻기 위하여 그 후에 재료를 건조시켰다. 배제된 용액의 농도를 측정하여 중합체 매트릭스 내의 포획 퍼센트를 계산하였다. 그러나, 중합체 네트워크의 흡수는 매우 열등하였다. 두 번째 시험된 방법론은 물리적 혼입이었다. 방출 실험을 위해, 겔화 전에 기지 농도의 벤자디민 용액을 인산 식염수-완충액 중에서 제조하여 3, 4 및 5 g/L의 최종 농도를 얻었다. 이렇게 제조된 용액 1 ml를 1:1의 몰비로 구성요소(표 8, 항목 11)를 용해시키기 위해 사용하였으며 이를 밤새 수화시켰다(총 부피 1.0 ml). DS=100%의 경우 양쪽 시약의 최종 농도가 2%(w/v)로 유지되도록 이들의 치환도(DS)를 기초로 하여 정확한 양을 결정하였다. 각각 촉매 및 개시제로서 황산구리 및 아스코르브산나트륨의 새로 제조된 용액을 사용하는 클릭 화학에 의해 10% 가교도의 하이드로겔 평판(slab)을 제조하였다(표 8, 항목 11). 속도론 결정을 시작하기 전에 실온에서 2시간 동안 겔화가 진행되도록 하였다. 시료가 최대 팽윤 평형에 도달하였을 때, 각 경우에 2일간 매 30분마다 방출된 약물의 양을 분광광도법으로 측정하였다. 가교 전 혼입된 약물의 농도를 포괄하는 농도를 사용한 보정 곡선을 기초로 하여 벤지다민 하이드로클로라이드의 누적 방출을 계산하였다.
본 실시예는 겔로부터 자유롭게 방출되는 재료 내에 포획된 벤지다민 하이드로클로라이드의 방출 속도론을 설명한다(약물 방출 프로파일은 시험관내 평가되었으며 도 9, 10 및 11에 나타내었다). 히구치(Higuchi) 및 리트거-코르스메이어-페파스(Ritger-Korsmeyer-Peppas) 수학식(Korsmeyer, Gurny, Doelker, Buri & Peppas, 1983; Ritger & Peppas, 1987a, b)을 사용하여 물리적 특성에 대한 구성요소의 효과를 분석하였으며, 이는 모델-독립적인 방법이다. 모델-의존적인 분석의 경우, 이들 2가지 이론적 모델은 중합체성 시스템으로부터의 약물 방출에 적합된다. 코르스메이어-페파스 모델을 먼저 사용하여 얻어진 방출 데이터에 대한 상관 계수를 계산하였다. 표 9에 요약한 바와 같이 상이한 pH를 나타내는 매체 내로의 방출에 대한 약물 모델로서 벤지다민 하이드로클로라이드를 사용하여, 모델에 의해 기재된 속도 곡선의 상관성을 표 9에 나타내었다.
확산 지수(n)를 평가하기 위해 사용된 코르스메이어-페파스 모델
항목 pH의 효과 확산 지수(n) 모델 R2 t50
시간(분)
1 2 0.3805 K-페파스 0.9957 80±10
2 4 0.4940 K-페파스 0.9999 100±10
3 6 0.5466 K-페파스 0.9953 110±10
4 증류수 0.4840 K-페파스 0.9997 480±10
5 7.4 0.5323 K-페파스 0.9996 120±10
6 8 0.4707 K-페파스 0.9998 95±10
7 10 0.3389 K-페파스 0.9995 7200±20
t50은 초기 혼입된 약물의 50%가 방출되는 시간을 나타낸다.
R2는 선형 회귀(regression) 후의 결정 계수를 의미한다.
가장 잘 적합된 모델 파라미터 값을 기초로 하여, 방출속도의 의존성을 기재하였다. 본 발명에 기재된 양쪽성 재료는 변칙적인 확산 메카니즘을 나타내었으므로; 약물은 농도와 무관하게 경시 방출되었으며 방출 매체의 pH에 대한 명백한 의존성을 보여주었다. 한편, n값이 농도에 따라 유의하게 변화하지 않은 것으로 관찰되었는데, 이는 네트워크 비균질성으로 인하여 수송 메카니즘이 변화하지 않음을 의미한다. 분자내 상호작용이 존재하는 경우 겉보기 확산 계수를 결정하기 위해 보통 적용되는 픽 모델을 사용하면, 결과는 하이드로겔 내부의 겉보기 확산 계수가 용액 내에서의 것과 유의적으로 상이함을 보여주었다. 이 차이는 게스트가 재료를 통해 왜곡된 확산 경로를 지남에 따라 하이드로겔 내로의 방해된 확산에 기인한다. 본 특허에 보고된 재료에 대한 수송 메카니즘은 비-픽 확산을 따르고 침식(erosion)을 따르지 않으므로 재료는 분석 기간 동안 안정한 것으로 간주될 수 있다. pH=2.0 완충액에서 방출된 약물의 양은 pH=4.0, 6.0, 8.0 및 10.0의 방출 매체와 비교하여 더 적다. pH=2.0에서 50%의 약물 총 방출은 80분±10에 발생하였으며, 100분±10분(4.0, 6.0, 8.0) 및 pH=10.0의 경우 7200분±20분이었다. 방출에 대한 확산 지수값을 표 9에 나타내었다.
pH=4, 6 및 8에 대한 확산 지수(n)는 벤지다민의 방출에 이르는 메카니즘이 일정한 방출 속도로 변칙적인 수송을 나타냄을 암시한다. 이런 종류의 메카니즘은 제어된 서방성 투여 형태에 적절하다.
실시예 13. 실시예 10에서 얻은 가교된 히알우론산을 기본으로 하는 재료로부터 독소루비신 하이드로클로라이드의 방출 측정
방출 실험을 위해, 겔화 전에 기지 농도의 독소루비신 하이드로클로라이드를 인산 식염수-완충액에서 제조하여 최종 농도 2 g/L를 얻었다. 상기 제조된 용액 1 ml를 1:1 몰비로 구성요소를 용해시키기 위해 사용하였으며 이를 밤새 수화시켰다. DS=100%의 경우 양쪽 시약의 최종 농도가 2%(w/v)로 유지되도록 이들의 치환도(DS)를 기초로 하여 정확한 양을 결정하였다. 표 8, 항목 11에 보고된 조건을 사용하여 10% 가교도의 하이드로겔 평판을 제조하였다.
각 경우에 30일간 매 10시간마다 방출된 약물의 양을 분광광도법으로 측정하였다. 가교 전 혼입된 약물의 양을 포괄하는 농도를 사용한 보정 곡선을 기초로 하여 독소루비신의 누적 방출을 계산하였으며, 이를 도 12에 나타내었다. 독소루비신의 최대량이 식염수-인산 완충액 매체를 사용하여 466 h의 기간에 걸쳐 방출되었으며 하이드로겔에 적재된 초기량의 15%에 해당하였다. 방출 매체로서 물을 사용하면 방출된 독소루비신의 최대량은 다시 15%이지만 더 짧은 기간에 방출되어 이 경우에 186 h였다. 독소루비신의 경우 확산 지수는 PBS 매체에서의 방출에 대한 픽 확산 및 수퍼 케이스 II 수송 시스템 n > 1을 나타낸다. 기존에 문헌(Ferrero, Munoz-Ruiz & Jimenez-Castellanos, 2000; Rao, Devi & Buri, 1990) 보고된 다른 종류의 양쪽성 하이드로겔에 대해서도 유사한 경향이 관찰되었다. 이런 유형의 메카니즘은 이완 경계(relaxing boundary)(겔 층)에서 가소화의 증가로 인한 것일 수 있다(Ritger & Peppas, 1987b). SEM에 따르면 독소루비신은 결정화되지 않았다(데이터는 나타내지 않음).
실시예 14. 화학적으로 개질된 히알우로난 및 가교된 재료에서의 세포 생존력, 증식 및 분화
화학적으로 개질된 HA
DS=100%의 경우에 표 8, 항목 11의 양쪽 유도체 용액을 제조하였다(1% w/v). DS=10%의 개질된 중합체의 경우, 10%의 중합체가 아지드 또는 프로파길 결합기를 함유하는 아세틸 글루코사민 부분을 함유하도록 개질되고 90%의 중합체가 개질되지 않은 아세틸 글루코사민 부분을 나타낸다. 따라서, 히알우론산의 10개 이량체마다 9개의 개질되지 않은 이량체와 1개의 개질된 이량체가 존재한다. 시약의 정확한 양은 항상 치환도 또는 DS(NMR에 의해 결정)를 기초로 하여 결정된다. 따라서, 시약 농도는 HA의 개질된 부분을 기초로 하여 계산되지만, 개질된 부분이 전체 거대분자로부터 분리될 수 없기 때문에 중합체 농도는 항상 모든 중합체의 %w/v로서 표현되어야 한다. 제조된 용액을 여과하여 생존력 및 세포독성을 독립적으로 시험하기 위한 멸균 용액을 제조하였다. 2　000(3T3) 세포를 96-웰 시험 플레이트의 웰에 파종하였다. 세포를 24시간 동안 배양한 다음 시험 용액으로 처리하였다. 그 후, 희석 매체로 사용하여, 웰 내의 시험 용액 최종 농도가 100, 500, 1000　㎍/mL로 되도록 시험 용액을 각 웰에 가하였다. 3-(4,5-디메틸티아졸-2-일)-2,5-디페닐 테트라졸리움 브로마이드(MTT) 검정을 사용하여 처리 후 0, 24, 48, 72시간에 세포 생존력을 측정하였다. 20 ㎕의 MTT 원액(stock solution)(5 mg/ml)을 각 웰의 세포 배양 배지 200 ㎕에 가하였다. 검정에서, MTT가 생존가능한 세포에 의해 블루 포르마잔염으로 환원되었으며, 이는 후에 세포로부터 방출되어 분광광도법으로 결정되었다. 2.5시간 동안 37 ℃의 세포 배양 인큐베이터에서 플레이트를 인큐베이션하였다. 그 후, 모든 MTT 용액을 제거하고 220 ㎕의 용해 용액을 가하였다. 세포를 진탕기 위의 실온에서 30분간 용해시킨 다음 표준 분석 프로토콜에 따라 570 nm에서 마이크로플레이트 리더 VERSAmax에 의해 광학 밀도를 측정하였다. 보통의 배지에서 처리 없이 배양된 일련의 대조군 세포 및 바탕 시료에 의해 실험 디자인을 완성하였다. 모든 실험은 적어도 6회 독립적으로 반복하여 수행하였다.
생/사(Eukolight) 생존력 키트를 사용하는 형광 현미경에 의해 세포 생존력 및 부착을 산정하였다. 가교된 재료의 경우 관찰된 다공성 구조는 세포 침윤 및 성장에 대한 스캐폴드로서 이들의 잠재적인 용도를 암시한다. 따라서, 가교된 재료의 생존력도 시험하였다.
가교된 재료 시험
PBS를 사용하여 치환도가 DS=10%인 유도체의 멸균 용액을 제조하여 100% 치환도의 경우 2%(w/v)의 최종 농도를 얻었다. CuSO4.5H2O 및 아스코르브산나트륨을 첨가하여 재료를 가교시켰다(생성된 용액내 이들의 농도가 CuSO4.5H2O는 0.002M이고 아스코르브산나트륨은 0.02M이 되도록 하는 양). 가교된 유도체를 10 ml의 PBS를 사용하여 3회 세척하고 세포 배양 배지를 사용하여 3회 세척하였다. 재료를 완전히 으깨고 균질화시켰다. 그 후, 재료를 멸균 동결건조시켰다. 8 ml의 PBS를 사용하여 1.0 g의 으깬 재료(건조 중량)가 다시 팽윤되도록 하였다. 상기 용액 0.5, 1.0, 1,3, 2.0 및 3.0 ml를 각 웰에 가하고(이는 이미 세포를 함유한다) 세포와 직접 접촉시킨 유도체의 경우와 동일한 방식으로 생존력 및 세포독성 시험을 실행하였다. 가교된 재료 "위"에 대한 세포 대사 및 증식에 관한 기본적인 정보를 얻기 위하여 생존력 시험 MTT를 사용하였다. 이 실험을 3회 반복하였다. 광학 밀도를 측정하고, 비처리 세포의 광학 밀도 값에 대한 광학 밀도 값의 비로서 대조군에 대한 퍼센트를 계산하고 각각의 반복에 대해 정기적으로 100배로 곱한 다음 평균을 계산하였다.
결론
세포 생존력으로부터 얻어진 결과에 기초할 때, 표 8, 항목 11에 개시된 유도체는 모든 시험된 농도(100 ㎍/ml, 500 ㎍/ml, 및 1000 ㎍/ml)에서 세포주 3T3에 대해 세포독성을 나타내지 않았다. 대조군에 대한 평균 퍼센트 및 평균의 표준 오차(SEM)을 계산하고 유도체 용액의 효과를 프로파길-2-아민-HA의 경우 도 13에; 그리고 아지도프로필-2-아민-HA의 경우 도 14에 나타내었다. 가교된 유도체도 세포주 3T3에 대해 세포독성이 없었다(도 15). 상이한 농도의 유도체 뿐아니라 가교된 유도체를 함유하는 배지에서 인큐베이션한 후 세포의 생존력은 전체 감시 간격(처리 후 24-72시간) 내에서 유의적으로 변화하지 않았다.
실시예 15. II 및 III를 기본으로 하는 스캐폴드에서의 연골세포 생체이용성 및 파종
150 mg의 HA-프로파길-2-아민 및 150 mg의 HA-아지도프로필-2-아민(양자 모두 멸균됨)을 3 ml의 PBS에 용해시키고 3 ㎕의 10 mM CuSO4 x 5 H2O 및 400 ㎕의 2,5 M 아스코르브산나트륨과 혼합하였다. 이 혼합물을 96-웰 시험 플레이트 내로 100 ㎕ 알리코트씩 나누었다. 37 ℃의 써모박스(thermobox)에서 2시간 동안 겔화를 수행하였다. 새로 형성된 겔을 1 mM Na2EDTA(시그마) 배스에 담그고 회전 진탕기 위에서 1시간 동안 3회 세척하였다. 그 후, 겔을 PBS 완충액에서 1시간 동안 세척하고 다음 4회를 주사용수에서 세척하였다. 겔을 -80 ℃에서 냉동시키고 멸균 조건하에 동결건조시켰다. 각각의 동결건조된 스캐폴드 실린더를 24-웰 시험 플레이트의 분리된 웰로 이전시키고 200 ㎕의 3T3 세포 현탁액(1 x 106 세포/ml)을 스캐폴드 상단 위에 부어 파종함으로써 겔 파종을 달성하였다. 37 ℃의 써모박스에서 건조 스캐폴드 내로 흡수되도록 1시간 동안 현탁액을 방치한 다음, 스캐폴드를 지닌 전체 24-웰 시험 플레이트를 10분간 1200 rpm으로 회전시켰다. 원심분리 후, 1 ml의 배양 배지를 각각의 스캐폴드에 가하고 37 ℃, 5% CO2 및 가습된 대기하의 써모 박스에 넣었다. 다음날 각각의 스캐폴드를 1 ml의 신선한 배지와 함께 새로운 웰로 옮겼다. 배지를 2-3일마다 교체하였다. 각각의 스캐폴드를 4 ㎕의 칼세인 AM(시그마) 및 1 ㎕의 에티듐 단일이량체와 함께 5 ml의 PBS 완충액 내에 넣고 2.5시간 동안 회전 진탕기 내에 넣었다. 그 후, 각각의 스캐폴드를 20 ml의 PBS로 3회 세척하고 형광 현미경으로 관찰하였다(도 16a-d). 도 17은 반응식 7에 기재된, 유도체 II 및 III을 기본으로 하는 가교된 재료로 만들어진 스캐폴드의 존재하에 인간 연골세포(6P)의 생존력 시험(ATP)을 보여준다. 이 시험을 위하여, 0.1 및 1%w/v의 농도, n=5, ±SEM을 사용하여 2가지 용액을 제조하였다. 세포를 ㎠당 5000개 세포의 밀도로 파종하고 6일간 예비배양하였다. 제6일 이후에 15일의 배양 기간 동안 가교된 재료를 시험하였다. 이 그래프는 시간에 따라 세포 활성이 증가함을 보여주며, 이는 세포가 증식하였고 스캐폴드 내로 성장하였음을 의미한다.
기타 실시양태들도 후술하는 특허청구범위 내에 있다. 예를 들어, 본 발명의 조성물의 상업적 생산을 위해 반응 규모가 커질 수 있다. 또한, 다중음이온성 폴리사카라이드의 비를 변화시키면 최종 재료의 특성이 변화됨을 당업자는 잘 이해할 것이다.
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Claims (23)

  1. 화학식 (I)에 따른 히알우론산의 가교된 유도체:
    Figure pct00014
    (I)
    상기 식에서, R1 및 R2는 독립적으로 동일하거나 상이하고, 임의로 헤테로원자 O를 함유하며 3-12개 탄소를 함유하는 지방족, 방향족, 아릴지방족 및 사이클로지방족 부위를 포함하는 그룹 중에서 선택되고, 여기에서 유도체의 DS는 1 내지 28%이며, DS는 100개 사카라이드 이량체당 치환된 이량체의 수로 정의된다.
  2. 제1항에 있어서,
    R1이 메틸 및 페닐을 포함하는 그룹 중에서 선택되고, R2가 프로필, 페닐 및 3,6,9-트리옥사운데칸으로 구성된 그룹 중에서 선택되는 가교된 유도체.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    10%의 DS를 나타내는 가교된 유도체.
  4. i) 2차 아민기를 통해 결합된 알키닐기를 운반하는 화학식 (II)의 히알우로난 유도체(여기에서 R1은 제1항에 정의된 바와 같다)를 제조하는 단계:
    Figure pct00015
    (II),
    ii) 2차 아민기를 통해 결합된 아지딜기를 운반하는 화학식 (III)의 히알우로난 유도체(여기에서 R1은 제1항에 정의된 바와 같다)를 제조하는 단계:
    Figure pct00016
    (III),
    iii) 화학식 (II)의 유도체 및 화학식 (III)의 유도체를 혼합하는 단계, 및
    iv) CuSO4 및 아스코르브산나트륨의 존재하에 화학식 (II)의 유도체 및 화학식 (III)의 유도체를 고리화 첨가 반응시켜 화학식 (I)의 히알우론산의 가교된 유도체를 얻는 단계를 포함하는, 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 개시된 유도체의 제조 방법.
  5. 제4항에 있어서,
    단계 i)이 a) C-6 위치에서 히알우로난을 화학선택적으로 산화시키는 단계, b) 말단 알키닐기를 운반하는 1차 아민을 산화된 히알우로난과 커플링시켜 알키닐-이민 히알우로난을 형성하는 단계, c) 알키닐-이민 히알우로난을 환원시켜 2차 알키닐-아민 히알우로난을 형성하는 단계를 포함하는 방법.
  6. 제5항에 있어서,
    단계 a) 후에 산화된 히알우로난을 분리하는 방법.
  7. 제5항에 있어서,
    각각의 단계 a) 내지 c)가 단일 용기에서 실행되는 방법.
  8. 제4항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서,
    단계 ii)가 a) C-6 위치에서 히알우로난을 화학선택적으로 산화시키는 단계, b) 말단 아지딜기를 운반하는 1차 아민을 산화된 히알우로난과 커플링시켜 아지도알킬-이민 히알우로난을 형성하는 단계, c) 아지도알킬-이민 히알우로난을 환원시켜 2차 아지도알킬 아민 히알우로난을 형성하는 단계를 포함하는 방법.
  9. 제8항에 있어서,
    단계 a) 후에 산화된 히알우로난을 분리하는 방법.
  10. 제8항에 있어서,
    각각의 단계 a) 내지 c)가 단일 용기에서 실행되는 방법.
  11. 제5항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서,
    말단 알키닐기를 운반하는 1차 아민이 프로파길 아민 및 에티닐 아닐린을 포함하는 그룹 중에서 선택되고, 말단 아지딜기를 운반하는 1차 아민이 3-아지도프로판-아민, 11-아지도-3,6,9-트리옥사운데칸-1-아민 및 아지도-아닐린을 포함하는 그룹 중에서 선택되는 방법.
  12. 제5항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서,
    단계 a)에서 히알우로난의 산화가, 산화 시스템 2,2,6,6-테트라메틸피페리딘-1-옥실 라디칼(TEMPO)/하이포아염소산나트륨(NaClO) 및 첨가제로서 NaX(여기에서 X는 Br 또는 Cl임)를 사용하거나, 데스-마르틴 퍼아이오디난(DMP)을 사용하여 실행되는 방법.
  13. 제4항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서,
    0 내지 60 ℃, 바람직하게 5 내지 37 ℃ 범위의 온도에서 수행되는 방법.
  14. 제4항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서,
    단계 iv)에서 얻어진 가교된 유도체가 겔의 형태이며, 이는 그 후 냉동-건조되는 방법.
  15. 제14항에 있어서,
    냉동-건조가 액체 질소 또는 얼음에 의해 실행되는 방법.
  16. 제4항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서,
    단계 iii)이 반응 혼합물에 생물학적 활성 물질을 첨가하는 단계를 추가로 포함하며, 상기 물질이 약물, 단백질, 효소, 생중합체 및 생물학적 적합성의 합성 중합체를 포함하는 그룹 중에서 선택되는 방법.
  17. 제16항에 있어서,
    약물이 진통제, 항생제, 항미생물제, 세포정지제, 항암제, 항염증제, 상처 치유제 및 마취제를 포함하는 그룹 중에서 선택되는 방법.
  18. 제4항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서,
    단계 iv) 이후에 형성된 가교된 유도체를 성장 인자로 파종하는 방법.
  19. 제18항에 있어서,
    성장 인자가 연골세포인 방법.
  20. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
    겔 또는 스캐폴드(scaffold)의 형태인 화학식 (I)의 히알우론산의 가교된 유도체.
  21. 제20항에 있어서,
    약물, 단백질, 성장 인자, 효소, 생중합체 및 생물학적 적합성의 합성 중합체를 포함하는 그룹 중에서 선택된, 포획된 생물학적 활성 물질을 추가로 포함하는 히알우론산의 가교된 유도체.
  22. 제20항 또는 제21항에 있어서,
    겔의 형태이며 장기 방출 장치를 포함하는 히알우론산의 가교된 유도체.
  23. 조직 공학, 상처 드레싱 또는 조직 재생에 있어서 제어된 방출 시스템을 위한 화학식 (I)에 따른 가교된 유도체의 용도.
KR1020137031065A 2011-04-24 2012-04-19 가교된 히알우론산을 기본으로 하는 양쪽성 재료, 그의 제조 방법, 포획된 활성 제제를 함유하는 재료, 그의 제조 방법, 및 상기 재료의 용도 KR20140034797A (ko)

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