CZ20011651A3

CZ20011651A3 - Způsob výroby zesítěných polysacharidů

Info

Publication number: CZ20011651A3
Application number: CZ20011651A
Authority: CZ
Inventors: Rolando Barbucci; Giancarlo Sportoletti
Original assignee: Aquisitio S. P. A.
Priority date: 1998-11-11
Filing date: 1999-11-09
Publication date: 2001-12-12
Also published as: EP1137670B1; HUP0104075A3; JP2002529549A; CN1325409A; HK1041010A1; PT1137670E; HK1041010B; AU1380300A; DK1137670T3; ZA200103800B; KR20010101002A; ES2237971T3; BR9915238A; CN1144818C; HU227731B1; IL143064A0; DE69924407D1; KR100685454B1; NZ511308A; WO2000027886A1

Description

Způsob výroby zesítěných polysacharidů

Oblast techniky

Předkládaný vynález se týká způsobu zesítění karboxylovaných sacharidů. Způsob podle vynálezu poskytuje vysoký stupeň reprodukovatelnosti získaných výrobků vzhledem ke stupni zesítění, stejnorodosti rozdělení zesítěných řetězců, fyzikálně chemickým charakteristikám výrobků a technologickým charakteristikám z nich získaných částí.

Reprodukovatelnost je zvláště důležitá pro používání v lékařských, farmaceutických a dermato-kosmetických oborech.

Vynález se dále vztahuje k výrobkům, získatelným uvedeným způsobem, a k jejich použití v lékařských, farmaceutických a dermato-kosmetických oborech.

Dosavadní stav techniky

Použití makromolekul v lékařsko-farmaceutickém oboru a v pozdější době i v dermatologicko-kosmetickém oboru je dobře zavedeno. Pro přípravu farmaceutických prostředků jsou makromolekuly používány jako zahušťovadla, kluzná činidla, povlékací činidla v podobě filmů, odolných vůči žaludečním šťávám, zvláště pak při přípravě tobolek, gelu, koloidů a různých zařízení (např. kontaktních čoček, gázy a podobně). Makromolekuly se rovněž používají při přípravě prostředků s řízeným uvolňováním aktivních složek.

Souborné články, týkající se jejich charakteristik a farmaceutických použití, jsou uvedeny v:

1) C. Hansch se spol., vydavatelé, Comprehensive Medicinal Chemistry,

Pergamon Press, Oxford, 1990, díly 1-6;

• ·

2) A. Wade a P.J. Wellers, vydavatelé, Handbook of Pharmaceutical Excipients, vydání 1994, The Pharmaceutical Press.

Uvedené makromolekuly patří do různých chemických rodů a mohou být buď syntetické, nebo přírodní či polosyntetické.

Příklady syntetických makromolekul zahrnují polyvinylpyrrolidon, polyoxyethylenalkylethery, polyvinylalkoholy a polymethakryláty. Příklady přírodních makromolekul zahrnují přírodní kyselinu hyaluronovou (HY) a celulózu.

Příklady polosyntetických makromolekul zahrnují karboxyalované alkylcelulózy, široce používané v potravinářském průmyslu a v průmyslu vyrábějícím prostředky pro osobní péči. Tyto makromolekuly jsou charakterizovány přímou nebo jen slabě větvenou strukturou.

Velmi důležitá modifikace pro zvýšení chemické, enzymatické a mechanické síly se provádí zesítěním, které lze provádět jak u syntetických, tak i u přírodních (více či méně již modifikovaných) polymerů.

Příklady zesítěných polymerů zahrnují polymery chránící tablety nebo tobolky před žaludečními šťávami (polymethakryláty), stejně jako polymery, používané jako emulgační činidla, suspenzní činidla, látky vytvrzující tablety (Carbopol), a zesítěné hyaluronové kyseliny, diskutované dále.

Pro uvažovaná použití a zejména pro přípravu invasivních lékařských zařízení, která musí být podávána parenterálně, musejí zmíněné polymery vyhovovat množství požadavků technického a regulačního rázu.

Technické požadavky zahrnují:

1) vysokou biologickou slučitelnost;

2) odolnost vůči enzymovým systémům jak tkáňovým, tak i plasmatickým (u injikovatelných prostředků) a gastrointestinálním (u prostředků podávaných orálně);

3) zformovatelnost do různých tvarů (gelů, fimů, houbiček a podobně);

4) možnost chemické sterilizace nebo fyzikální sterilizace bez změny struktury výrobku.

V některých případech může být žádoucí postupné odbourávání, například pro řízené uvolňování léčiva;

Odolnost vůči enzymovým systémům je zvláště důležitá, pokud je makromolekula přítomna v prostředcích/částech, které musejí vydržet dlouhou dobu, např. v náhradách synoviální tekutiny, tenkých filmech, houbách nebo gelech používaných jako tkáňový protipřilnavý materiál v různých oborech chirurgie; v tkáňovém inženýrství (umělé orgány); jako umělá kůže; v léčbě popálenin a obecně v estetické chirurgii.

Podle regulačních požadavků musí být prostředekrůzných výrobních šarží neměnný ve velmi úzkých mezích; to znamená, že výrobní postupy jsou standardizovány a že základní složky mají velmi nízkou vnitřní variabilitu.

Možná příčina nestejnorodosti makromolekul vyplývá z rozptylu molekulových hmotností. Uvedená nestejnorodost se stává dokonce ještě vyšší v důsledku zesítění, což může být vážnou nevýhodou v závislosti na oblasti použití a účelu použití konečného výrobku.

EP-A-566118 (Kimberly-Clark) uvádí zesítěné polysacharidy pro použití jako superabsorbenty pro pleny a podobné výrobky.

Způsob zde popsaný se zakládá na zesítění celulózy vytvářením intermolekulárních amidů, esterů nebo etherů mezi polyaminy, polyoly nebo směsemi takových látek a karboxylovou skupinou polysacharidů.

Reakce se provádí zahřátím směsi polysacharidu s polyolem a/nebo polyaminem na přibližně 80°C. Tento postup je jistě výnosný a vhodný pro výrobu ve velkém měřítku tam, kde jsou méně přísné požadavky na reprodukovatelnost.

US 5465055 předkládá zesítěné polysacharidy (kyselinu hyaluronovou a kyselinu alginovou), získané esterifikací karboxylu polysacharidu a hydroxylových skupin jiných molekul, bez vsunutí síťujících ramének.

WO 91/9119 předkládá mikrotobolky pro Langerhansovy ostrůvky jako hybridní orgány, sestávající z kyseliny alginové, zesítěné ionty baria.

EP 190 215 předkládá zesítění různých polymerů (karboxylovaných škrobů, dextranu, celulóz) pomocí di- nebo polyfunkčních epoxidů.

Pro kyselinu hyaluronovou byla navržena následující síťovací činidla:

polyfunkční epoxidy jsou uvedeny v US 4 716 224, 4 772 419 a 4 716 154; polyalkoholy jsou uvedeny v US 4 957 744;

divinylsulfon je uveden v US 4 605 691 a 4 636 524; aldehydy jsou uveden yv US 4 713 448 a 4 582 865;

karboxamidy jsou uvedeny v US 5 356 833; polykarboxylové kyseliny jsou uvedeny v EP-A-718 312.

Podstata vynálezu

Vynález se týká způsobu výroby zesítěných polysacharidu obsahujících karboxylové skupiny, umožňujícího úplnou kontrolu stupně zesítění, stejně jako vysokou reprodukovatelnost pokud se jedná o neměnné (konstantní) charakteristiky konečného výrobku.

Způsob podle vynálezu zahrnuje kroky, v nichž:

a) karboxylové skupiny polysacharidu se aktivují reakcí s vhodným aktivačním činidlem karboxylových skupin v bezvodém aprotickém rozpouštědle;

b) polysacharid s aktivovanými karboxylovými skupinami se ponechá reagovat s polyaminem.

Takto získaný zesítěný polysacharid může být, pokud je to žádoucí, podroben sulfataci nebo hemisukcinylaci volných hydroxylových skupin.

Výrobky, získatelné postupem podle vynálezu, mohou být také komplexovány kovovými ionty jako jsou ionty zinku, mědi nebo železa.

Polysacharid obsahující karboxylové skupiny, který lze použít podle vynálezu, může být syntetického, polosyntetického nebo přírodního původu. Příklady takových polysacharidů zahrnují hyaluronové kyseliny (získané z tkání nebo bakterií), karboxymethylovaný dextran, karboxymethylovanou celulózu, karboxymethylovaný škrob, alginové kyseliny, celulózovou kyselinu, N-karboxymethyl- nebo butylglukany či chitosany, hepariny o různých molekulových hmotnostech, volitelně desulfatované a sukcinylované, dermatansulfáty, chondroitinsulfáty, heparansulfáty a polyakrylové kyseliny.

Zvláště se upřednostňují hyaluronové kyseliny, karboxymethylované celulózy, hepariny, alginové kyseliny a polyakrylové kyseliny.

Uvedené zesítěné polymery, získané různými postupy, jsou známé a byly navrženy pro různá použití (viz například EP 566 118, WO 91/9119, US 5 465 055, EP 190215, EP 718312, US 4 716 224, diskutované výše).

Aktivačními činidly karboxylu jsou obvykle ta, používaná v chemii peptidu: příklady vhodných činidel zahrnují karbonyldiimidazol, karbonyltriazol, chlormethylpyridyliumjodid (CMP-J), hydroxybenzotriazol, p-nitrofenol p-nitro fenyltrifluoracetátu, N-hydroxysukcinimid a podobně. Zvláště se upřednostňuje použití chlormethylpyridyliumjodidu.

Polyaminy mají s výhodou následující obecný vzorec:

Rj-NH-A-NH-R₂ kde Rj a R₂ stejné nebo odlišné, jsou vodíkový atom, C]-C₆ alkylové, fenylové nebo benzylové skupiny, A je C₂-C₁₀ alkylenový řetězec, s výhodou C₂-C₆alkylenový řetězec, volitelně substituovaný hydroxylovými, karboxylovými, halogenovými, alkoxylovými či aminovými skupinami; polyoxyalkylenový řetězec o vzorci [(CH₂)_n-O-(CH₂)_n]_m kde n je 2 nebo 3 a m je celé číslo od 2 do 10; C₅-C₇ cykloalkylová skupina; arylová nebo heteroarylová skupina, s výhodou 1,3- nebo 1,4-substituovaný benzen. A je s výhodou C₂-C₆ rovný alkylenový řetězeco vzorci [(CH₂)_n-O-(CH₂)_n]_m

Síťující reakce se s výhodou provádí v rozpouštědle, zvoleném z tetrahydrofuranu, dimethylformamidu nebo dimethylsulfoxidu a polysacharid je s výhodou převeden do podoby soli s lipofilním kationtem; například se jedná o tetraalkylamonnou sůl nebo jiné lipofilní organické báze.

Převedení anorganických solí, jako sodných solí, na vhodné organické lipofilní sole, se může provádět známými postupy iontové výměny v homogenní fázi nebo vysrážením kyselé složky, jejím následujícím shromážděním a převedením na sůl působením vhodné organické báze.

Reakce aktivování karboxylových skupin se provádí v homogenní fázi a v bezvodém polárním aprotickém rozpouštědle.

K roztoku aktivovaného esteru se přidá polyamid, rozpuštěný v tomtéž bezvodém rozpouštědle, za udržování teploty v rozmezí od 0°C do 30°C. Doba • · · · ·· ·· 9 9 · • ·· · · ♦♦ 9 9 9 9 9 ·· 9 9 9 9 9 9 9 · ·· 999 999999 9 9

9 9 9 9 9 9 9 9 ···· ·· ·· ·· 99 999 zesítění se pohybuje od 1 do 12 hodin, rovněž v závislosti na případné přítomnosti vhodných zásaditých látek (např. triethylaminu).

Obecně se konečný produkt shromáždí vysrážením organické soli přidáním odlišného rozpouštědla k reakčnímu rozpouštědlu nebo odpařením reakčního rozpouštědla a následným odstředěním, promytím destilovanou vodou, opakovaným rozptýlením v roztocích požadované alkalické látky (například sodíku, draslíku), následným promytím vodou a konečným vysušením alkalické soli pod vakuem nebo lyofilizací.

Stupeň zesítění (CLD, cross-linking degree) se může pohybovat v širokých mezích a může být upraven změnou množství aktivačních činidel karboxylu, neboť aktivace a síťovací reakce jsou v podstatě kvantitativní.

Zesítěné polysacharidy, získané způsobem podle vynálezu, mohou být podrobeny sulfataci hydroxylových skupin které mohou být přítomny, obvykle reakcí s komplexem pyridin-oxid sírový v dimethylformamidu.

Reakce se provádí v heterogenní fázi při teplotě 0°C až 10°C po dobu v rozmezí přibližně od 0,5 do 6 hodin.

Získaný stupeň sulfatace se pohybuje v širokém rozmezí s ohledem na veškeré hydroxylové skupiny a může být upraven změnou teploty a reakční doby. Obecně se stupeň sulfatace (definovaný jako ekvivalenty sulfátových skupin/g) může pohybovat od 1 x 10'⁶ do 6 x 10'⁶ a s výhodou činí 2 x 10'⁶ekv./g pro stupeň zesítění 0,5.

Zesítěné polymery, získané způsobem podle vynálezu, volitelně sulfatované, jsou schopné komplexace s kovovými ionty jako jsou ionty zinku, mědi nebo železa.

• · ·

Uvedené komplexy mohou být získány rozpouštěním nebo rozptylováním, (disperzí) ve vodě, dokud neskončí bobtnání produktu, a přidáním za míchání, s výhodou při teplotě místnosti, zahuštěného roztoku anorganické nebo organické kovové soli, např. chloridu měďnatého, chloridu zinečnatého či síranu železnatého; po míchání po dobu 12 až 24 hodin se komplex shromáždí odstředěním nebo vysrážením po přidání odlišného rozpouštědla (například ethanolu nebo acetonu), anebo odpařením pod vakuem; získaný surový produkt je důkladně promyt destilovanou vodou k odstranění přebytku iontů. Poté jsou komplexy lyofilizovány. Obsah kovových iontů se mění v závislosti na použitých reakčnich podmínkách, zejména na molárních poměrech polymeru a iontů; na koncentraci a pH roztoků; na reakční době a zvláště na stupni zesítění.

Způsob podle vynálezu umožňuje vhodnou úpravou stupně zesítění a/nebo stupně sulfatace, přípravu zesítěných karboxylovaných polysacharidů v široké škále tvarů, charakterizovaných různými vlastnostmi jako viskoelastičností, stupňem hydratace, schopností komplexace vzhledem ke kovovým iontům, schopností tvořit hydrogely, formovatelností do podoby filmů nebo houby, mechanickou pevností konečných materiálů.

To umožňuje jejich použití v mnoha lékařských oborech, v humánní i veterinární medicíně, a v dermato-kosmetických oborech.

Následující příklady vynález dále dokreslují.

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1

Karboxymethylcelulózový gel, 100% zesítěný 1,3-diaminopropanem.

V 30 ml dimethylformamidu (DMF) bylo pod dusíkovou atmosférou a za míchání rozpuštěno 1,2 χ 10'³ mol, vzhledem k disacharidové jednotce, • · tributylamonné (TBA) soli karboxymethylcelulózy. K roztoku bylo po kapkách přidáno 0,32 g chlormethylpyridyliumjodidu (1,2 x 10'³ mol), rozpuštěného ve 2 ml DMF, za udržování teploty pomocí ledu na 0°C.

Molární poměr byl 1:1, neboť karboxymethylcelulóza má jednu funkční karboxylovou skupinu na disacharidovou jednotku. Po 20 minutách byly do roztoku přidány 2 ml síťujícího 1,3-diaminopropanu (0,006 mol) a bezprostředně poté rovněž 0,5 ml triethylaminu. Vzniklý pevný, rosolovitý produkt byl promyt DMF a vložen do vody k úplnému nabobtnání.

Poté byl střídavě promýván ethanolem a vodou. Po posledním promytí ethanolem byl produkt lyofilizován.

- infračervená spektra (IR), (film; cm'¹): 1650 (-CO-NH-); nezakřivující

-COO~ přibližně při 1 400.

- SD: 7 000 (stupeň nabobtnání, ve vodě a při teplotě místnosti; po 15 minutách; gravimetrické stanovení; počítáno podle vztahu:

100 kde W_s= hmotnost hydratovaného gelu; Wd = hmotnost suchého gelu).

- SEM (srovnávací elektronová mikroskopie): struktura vyhlíží kompaktně, s 15-35 pm póry.

- Povrch výrobku, při vystavení králičí PRP (plasmě s vysokým obsahem destiček; Platelet Rrich Plasma), vykazuje velmi sníženou přítomnost destiček či agregátů ve srovnání s ekvivalentním výrobkem, získaným za použití polypropylenu o nízké hustotě (srovnávací standard EC)).

Příklad 2

Karboxymethylcelulózový gel 50% zesitěný 1,3-diaminopropanem.

• · • · * · .:

• φ

φ φφφ • ·

I í • φ

- 10 V 30 ml dimethylformamidu (DMF) bylo pod dusíkovou atmosférou a za míchání rozpuštěno 1,2 x 10' mol, vzhledem k disacharidové jednotce, tributylamonné (TBA) soli karboxymethylcelulózy. K roztoku bylo po kapkách přidáno 0,24 g chlormethylpyridyliumjodidu (0,9 x 10'³ mol), rozpuštěného ve 2 ml DMF, za udržování teploty pomocí ledu na 0°C. Molární poměr byl 2:1.

Po 20 minutách byly do roztoku přidány 2 ml síťujícího

1,3-diaminopropanu (3 x 10^-3 mol) a bezprostředně poté rovněž 0,5 ml triethylaminu. Vzniklý pevný, rosolovitý produkt byl promyt DMF a vložen do vody k úplnému nabobtnání.

IR, (film; cm'¹): 1650 (-CO-NH-); nezakřivující -COO' přibližně při

400.

- SD: 8 000

- SEM : přítomnost pórů 15-35 pm.

- Adhese destiček: jak byla uvedena v Příkladu 1.

Příklad 3

Gel kyseliny alginové, 50% (100 vzhledem k disacharidovým jednotkám) zesíťený 1,3-diaminopropanem

Tributylamonná sůl kyseliny alginové byla připravena ze sodné soli iontovou výměnou na silně kationtové pryskyřici (Dovex) v H⁺ formě (tj. kyselé formě) a následnou neutralizací hydroxidem tetrabutylamonným (TBA-OH) a konečnou lyofilizací.

- 11 V 30 ml dimethylformamidu (DMF) bylo pod dusíkovou atmosférou a za míchání rozpuštěno 1,2 x 10'³ mol, vzhledem k disacharidové jednotce, vzniklé soli. K roztoku bylo po kapkách přidáno 0,36 g chlormethylpyridyliumjodidu (1,2 x 10’³ mol), rozpuštěného ve 2 ml DMF, za udržování teploty pomocí ledu na 0°C. Molární poměr byl 1:1.

Po 20 minutách bylo do roztoku přidáno 6 x 10'³ mol síťujícího

1,3-diaminopropanu (0,024 mol) a bezprostředně poté rovněž 0,5 ml triethylaminu. Vzniklý pevný, rosolovitý produkt byl promyt DMF a vložen do vody k úplnému nabobtnání.

IR, (film; cm’¹): 1635 (široký) (-CO-NH-); (-COO'1 přibližně při

400.

- SD: 5 000

- SEM : struktura vyhlíží kompaktní a bez pórů.

Příklad 4

Příprava kyseliny hyaluronové, zesítěné na stupeň zesítění (CLD) = 0,05 (5% dostupných karboxylových skupin). Síťující činidlo =

1,3-propandiamin

Sodná sůl kyseiny hyaluronové (1 x 10’³ mol; vzhledem k disacharidovým jednotkám) byla převedena na TBA sůl podle jedné z následujících metod:

a) 1% vodný roztok hyaluronátu sodného se převede do H⁺ formy pomocí H⁺ silné kationtové pryskyřice (Amberlite IR 120); na konečný roztok se působí 0,5 % roztokem TBA-OH do pH přibližně 9,0.

- 12 • · ·· 9 · 9 9 ·· * » * · · · · 9 9 9 ·9 9

9 9 · 9 9 9 9 fl

9 9 · 999999 99

9 9 9 9 9 9 99 •999 99 99 99 99···

b) 1% vodný roztok hyaluronátu sodného se převede na roztok TBA soli působením slabé kationtové pryskyřice v TBA⁺ formě (Amberlite IRC

50).

V obou případech se konečné roztoky lyofilizují. TBA sůl se poté pod dusíkovou atmosférou rozpustí v 15 ml bezvodého dimethylformamidu (DMF) a při 0 °C se k uchovávanému roztoku TBA soli přidá po kapkách roztok 0,02 g chlormethylpyridylium jodidu (CMPJ) ve 2 ml bezvodého DMF.

Poté bylo do reakční směsi přidáno 0,1 ml triethylaminu a následně, po kapkách, roztok 1,3-diaminopropanu (d=0,88, ve velkém nadbytku, k usnadnění zesítění aktivovaných karboxylových skupin) ve 2 ml bezvodého DMF. Po skončení adice byla reakční směs míchána po dobu alespoň 30 minut a rozpouštědlo bylo následně odstraněno za sníženého tlaku. Zbytek byl rozpuštěn v DMF, který byl následně odstraněn destilací a zbytek byl promyt ethanolem, soustavou ethanol-voda a konečně vodou.

Poté byl produkt lyofilizován a lyofilozovaný zbytek byl podroben analýze.

- IR, (film; cm'¹): 1630 (-CO-NH-): 1740 (-COOH. polysacharid); 3 200 (-NH-).

- SD: 31 000 (stupeň nabobtnání, ve vodě a při teplotě místnosti; po 15 minutách; gravimetrické stanovení; počítáno podle vztahu:

SD = W - Wd

Wd”

100 kde W_s= hmotnost hydratovaného gelu; Wd = hmotnost suchého gelu).

- Stupeň zesítění: 0,05 (5 % původně dostupných karboxylových skupin).

- 13 Příklad 5

Příprava kyseliny hyaluronové, zesítěné na CLD (stupeň zesítění) = 0,05 (5% dostupných karboxylových skupin). Síťující činidlo = 1,6-diaminohexan. Aktivátor: chlormethylpyridyliumjodid.

Zesítěný derivát byl získán postupem popsaným v Příkladu 4, za podmínek jako v Příkladu 4 a za použití stejné kyseliny hyaluronové a stejného aktivátoru, pouze za použití 1,6-diaminohexanu místo 1,3-diaminopropanu.

- IR, (film; cm'¹): 1630 (-CO-NH-); 1740 (-COOH. polysacharid); 3 200 (-NH-).

Příklad 6

Příprava zesítěné kyseliny hyaluronové, s CLD = 0,05 (5% dostupných karboxylových skupin). Síťující činidlo = 0,0'-bis(2-aminopropyl)polyethylenglykol 500. Aktivátor: chlormethylpyridyliumjodid.

Zesítěný derivát byl získán postupem popsaným v Příkladu 4, za podmínek jako v Příkladu 4 a za použití stejné kyseliny hyaluronové a stejného aktivátoru, pouze za použití 0,0'-bis(2-aminopropyl)polyethylenglykolu 500 místo 1,3-diaminopropanu.

- IR, (film; cm'¹): 1630 (-C0-NH-); 1740 (-COOH, polysacharid); 3 200 (-NH-).

- SD: 31 000

Příklad 7

Příprava zesítěné kyseliny hyaluronové, s CLD = 0,3 (30% dostupných karboxylových skupin). Síťující činidlo = 1,3-propandiamin. Aktivátor: chlormethylpyridyliumjodid.

- 14 0,6 g tributylamonné soli kyseliny hyaluronové (1 x 10'³ mol vzhledem k disacharidové jednotce) bylo pod dusíkovou atmosférou za míchání rozpuštěno ve 30 ml DMF. K míchanému roztoku bylo po kapkách přidáno 0,08 g chlormethylpyridyliumjodidu (3,5 x 10'⁴ mol), rozpuštěného ve 2 ml DMF, za udržování teploty pomocí ledu na 0°C. Molární poměr byl 3:1.

Po 20 minutách byly do roztoku přidány 2 ml 1,3-diaminopropanu (0,024 mol) a bezprostředně poté rovněž 0,5 ml triethylaminu. Vzniklý pevný, želatinovitý produkt byl vložen do vody k úplnému nabobtnání a opět promyt ethanolem.

Konečný produkt vykazoval po lyofilizaci ve srovnávacím mikroskopu nepravidelný vzorek s hladkými zónami, které se střídaly s houbovitými zónami.

Stupeň zesítění byl 0,3 (30% dostupných karboxylových skupin).

- IR, (film; cm'¹): 1740 (-COOH); 1630 Í-CO-NH-); 1610 (-COO-);

1560 (-CO-NH-)

Příklad 8

Příprava zesítěné kyseliny hyaluronové, s CLD = 0,5 (50% dostupných karboxylových skupin). Síťující Činidlo = 1,3-propandiamin. Aktivátor: chlormethylpyridyliumjodid.

0,6 g tributylamonné soli kyseliny hyaluronové (HY TBA) (1 x 10’³ mol vzhledem k disacharidové jednotce) bylo pod dusíkovou atmosférou za míchání rozpuštěno ve 30 ml DMF. K míchanému roztoku bylo po kapkách přidáno 0,15 g chlormethylpyridyliumjodidu (CMPJ) (6 x 10'⁶ mol), rozpuštěného ve 2 ml DMF, za udržování teploty pomocí ledu na 0°C. Molární poměr byl 2 HY TBA :1CMPJ.

Po 20 minutách bylo do roztoku přidány 2 ml 1,3-diaminopropanu (0,024 mol) a bezprostředně poté rovněž 0,5 ml triethylaminu. Vzniklý pevný, želatinovitý produkt byl důkladně promyt dimethylformamidem.

Po odpaření DMF byl produkt ponechán nabobtnat ve vodě a před lyofilizací byl promyt ethanolem.

Získaný produkt měl stupeň zesítění 0,5 a ve srovnávacím mikroskopu vykazoval zrnité oblasti, oddělenou širokou síťovinou. Při větších zvětšeních se obě morfologie zdály být totožné a vykazovaly okrouhlé výstupky o průměru několika mikrometrů.

- IR, (film; cm’¹): 1740 (-COOH); 1630 (-CO-NH-); 1560 (-CO-NH-);

Gely byly podrobeny bobtnání v PBS (fosfátem pufrovaný solný roztok) a byla stanovena jejich schopnost maximálního bobtnání.

SD = 23 500

NMR = (¹³C; části z milionu, tj. ppm): 29,3 a 39,8 (-CH₂-CH₂-CH₂

-propandiaminové spojení); 172,5 (-C-NH-CH₂-CH₂-CH₂-)

Rheologické vlastnosti, stanovované na Bohlinově VOR Rheometru při teplotě 23±0,l°C, ukázaly, že dynamický modul pružnosti G' (100 Pa při 10 Hz), stejný při dvou uvažovaných koncentracích (10 a 20 mg/ml) je vždy vyšší než modul dynamické viskozity G (40 Pa pro 20 mg při 10 Hz a 20 Pa pro 10 mg při 10 Hz).

Příklady 9 až 12

Způsoby, popsanými v předcházejících příkladech, byly získány zesítěné deriváty hyaluronové kyseliny, jejichž charakteristiky jsou shrnuty v následující

- 16 Tabulce 1, vycházejíce z 1 x 10’³ mol (0,6 g) tributylamonné soli hyaluronové kyseliny.

Získané deriváty měly následující vlastnosti:

Tabulka 1

SD = stupeň nabobtnání IR = infračervená spektra • ·

- 18 Příklad 13

Sulfatace 50% zesítěné hyaluronové kyseliny

Derivát získaný v Příkladu 8 byl za silného míchání a pod dusíkovou atmosférou rozptýlen v 5 ml DMF.

Při 0°C byl přidán roztok lg SO₃/pyridinu v mol DMF a míchán 3 hodiny. Reakce byla skončena přidáním přebytku H₂O (50 ml) a hodnota pH byla upravena pomocí 0,1 mokl’¹ roztoku NaOH na 9,0.

Výsledný produkt byl důkladně promyt ethanolem a H₂O a poté byl lyofilizován.

Infračervené spektrum ukazuje, kromě pásů výchozího produktu, maximum (pík) při 1260 cm'¹ a silnější pruh při 1025 cm'¹.

Gely bobtnají v PBS se stupněm nabobtnání SD = 33 000. ¹³C NMR s vyšší rozlišovací schopností vykazuje signály v H₂O při 37 °C, uvedené v Tabulce 2. Intenzita NMR signálů při 29,3 a 38,8 ppm (-CH₂-) a signál při 172,5 ppm (CONH) potvrzují stupeň zesítění přibližně 50 %.

Rheologické vlastnosti jsou charakterizovány dynamickými moduly pružnosti G' (2 500 Pa s 20 mg a 1 000 Pa s 10 mg při 10 Hz), které jsou vždy vyšší než moduly dynamické viskozity G (600 Pa pro 20 mg při 10 Hz a 150 Pa pro 10 mg při 10 Hz) a mnohem vyšší než odpovídající hodnoty, získané s nesulfatovanou kyselinou hyaluronovou (13 při 50 % - Příklad 5). Tato sloučenina má thrombinovou dobu (TT, thrombin time) vyšší (61±5) než kontrola (14,0) a odpovídající nezesítěná sloučenina (14,6).

• n ·

- 19 Sloučenina byla rovněž aktivní v PRP testu, využívajícím stresované králíky.

Tabulka 2 : ¹³C chemický posun

C-l	C-2	C-3	C-4	C-5	x-C=O	y-CH₃
103,5	57,3	85,4	71,3	78,7	178,0	25,3	ppm
c-r	C-2'	C-3'	C-4'	C-5'	6-C=O
105,9	75,2	76,4	82,8	78,6	176,2		ppm
1-CH2	2-CH2	3-CH2	6'-C=O	z e s í t ě n í
39,8	29,3	39,8	172,5	ppm

Příklad 14

Sulfatace gelu alginové kyseliny

Zesítěný produkt byl po promytí ethanolem lyofilizován k úplnému odstranění vlhkosti a podroben sulfataci alkoholových skupin.

100 mg zesítěného produktu rozptýleného v 5 ml DMF bylo doplněno roztokem SO₃/pyridinu (800 mg ve 2 ml DMF). Reakce by měla být prováděna při teplotě 0 °C, pod dusíkovou atmosférou a za stálého míchání po dobu 2 hodin.

Produkt nesmí adsorbovat vlhkost, neboť ta reakci inhibuje.

Po 2 hodinách byla po přídavku H₂O upravena hodnota pH na 9,0 pomocí 1 mol.l'¹ roztoku NaOH k uvolnění pyridinu. Takto sulfatovaný produkt byl čištěn v EtOH.

- 20 ·« »· «« *· «» · • ♦ · * ···« * t ·· » ♦ · · · 4 φ φ ·· • ♦ ΦΦΦ · ΦΦ* · ·9 φ ·«··« a · «9 ♦ ··» ·· φφ ·» »φ * »φ

Analýza vyčištěných produktů ukázala:

- IR (film; cm“¹) 1263 (protažení SO)

- ekvivalenty S0₃ skupin/g gelu (podle toluidinových komplexů):

5% zesítěný gel:	6 x 10“⁵
50% zesítěný gel:	2 x 10“⁵
100% zesítěný gel:	3 x 10“⁵
SD: 5% zesítěný gel:	19 x 10³
50% zesítěný gel:	9 x 10“³
100% zesítěný gel	:7 x ΙΟ'³

Příklad 15

Za použiti shodné metodologie byly syntetizovány sulfatované deriváty 50% zesítěných produktů podle Příkladů 10, 11 a 12.

Kolorimetrické charakteristiky sulfatovaných derivátů jsou uvedeny v Tabulce 3 společně s charakteristikami produktů, získaných z Příkladů 8 a 13.

Tabulka 3

zesítěný polymer (50% CLD)	AHa [J/g]	Tg [°C]	AHb [J/g]	hm. % vody
zesíť. hyal-1,3 (př. 8)	276	51	42	12
zesíť. hyalS-1,3 (př. 13)	357	64	53	16
zesíť. hyal-1,6 (př. 12)	327	64	58	16
zesíť. hyalS-1,6	465	64	65	20
5 zesíť. hyal-P500.2NH₂ (př. 10)	239	45	72	10
6 zesíť. hyalS-P500.2NH₂	384	69	113	16

- 21 ·· «<· *♦ »9 44 _β • · O · · · · ·9··«

4 4 4 4 4 ·4 Λ * *4 · · 4 4 44· 4 · 44 ····· 4 4 44 • •44 44 1« 4« ··444

7 zesíť. hyal-P800.2NH₂ (př. 11)	179	73	30	10
8 zesíť. hyalS-P800.2NH₂	206	76	52	10
hyal ITBA	164	-	130	5

AHa [J/gJ: entalpie odpařování vody

Tg [°C] : entalpie procesu tepelné degradace

AHb [J/g]: přechodová teplota sklovatění hm. % vody: procentní obsah vody na základě AHa

Příklad 16

Sulfatace karboxymethylcelulózového gelu

Podle postupu a podmínek, popsaných v Příkladu 14, byl získán sulfatovaný derivát.

- ekvivalenty SO₃ skupin/g gelu:

a-CMC 5% zesítěná: 8 χ 10’⁶ (CMC = karboxymethylcelulóza) b-CMC 50% zesítěná: 7 χ 10'⁶ c-CMC 100% zesítěná: 4 χ 10’⁶

- SD: a: 20 χ 10³ b: 12 x 10'^: c: 9 χ 10'³

Zastupuje:

Claims

PATENTOVÉ NÁROKY

1. Způsob výroby zesítěných polysacharidů s obsahem karboxylových skupin, vyznačující se tím, že zahrnuje kroky, v nichž:

a) karboxylové skupiny polysacharidu se aktivují reakcí s vhodným aktivačním činidlem karboxylových skupin v bezvodém aprotickém rozpouštědle;

b) polysacharid s aktivovanými karboxylovými skupinami se ponechá reagovat s polyaminem.
2. Způsob výroby podle nároku 1, vyznačující se tím, že se polysacharid zvolí z hyaluronových kyselin (získaných z tkání nebo z bakterií), karboxymethylovaného dextranu, karboxymethylované celulózy, karboxymethylovaného škrobu, alginových kyselin, celulosové kyseliny, N-karboxymethylovaných nebo butylovaných glukanů či chitosanů; heparinů s různými molekulovými hmotnostmi, volitelně desulfatovaných a sukcinylovaných, dermatansulfátů, chondroitinsulfátů, heparansulfátů a polyakrylových kyselin.
3. Způsob podle nároku 1 nebo 2, vyznačující se tím, že se aktivační činidlo karboxylových skupin zvolí z karbonyldiimidazolu, karbonyltriazolu, chlormethylpyridyliumjodidu, hydroxybenzotriazolu, p-nitrofenolu p-nitrofenyl- trifluoracetátu a N-hydroxysukcinimidu.
4. Způsob podle kteréhokoli z nároků laž3, vyznačující se tím, že polyaminy se vyjadřují následujícím obecným vzorcem

R₁-NH-A-NH-R₂ kde Rj a R₂ stejné nebo odlišné, jsou vodíkový atom, Cj-C₆ alkylové, fenylové nebo benzylové skupiny, A je C₂-C₁₀ alkylenový řetězec, s výhodou C₂-C₆alkylenový řetězec, volitelně substituovaný hydroxylovými, karboxylovými, halogenovými, alkoxylovými či aminovými skupinami; polyoxyalkylenový řetězec o vzorci [(CH₂)_n-O-(CH₂)_n]_m kde n je 2 nebo 3 a m je celé číslo od 2 do 10; C₅-C₇ cykloalkylová skupina; arylová nebo heteroarylová skupina, s výhodou 1,3- nebo 1,4-substituovaný < benzen.
5. Způsob podle kteréhokoli z nároků 1 až 4, vyznačující se tím, že polysacharid se převede do formy sole s lipofilními kationty.
6. Způsob výroby podle nároku 5, vyznačující se tím, že se lipofilním kationtem rozumí tributylamonný nebo tetraalkylamonný kationt.
7. Způsob podle kteréhokoli z nároků lažó, vyznačující se tím, že síťovací reakce se provádí v bezvodém dimethylformamidu nebo tetrahydrofuranu.
8. Způsob podle kteréhokoli z nároků laž7, vyznačující se tím, že získaný zesítěný polysacharid se dále podrobí sulfataci hydroxylových skupin reakcí s komplexem pyridin/oxid sírový.
9. Způsob podle nároku 8, vyznačující se tím, že sulfatační reakce se provádí v dimethylformamidu v heterogení fázi při teplotě 0 až 10 °C po dobu přibližně 0,5 až 6 hodin.
10. Způsob podle kteréhokoli z nároků laž9, vyznačující se t í m, že zesítěný, volitelně sulfatovaný polysacharid se dále podrobí komplexační reakci s vodnými roztoky iontů mědi, zinku nebo železa.
11. Zesítěné polysacharidy, vyznačující se tím, že je lze získat způsobem podle nároků 1 až 10.