CZ303485B6

CZ303485B6 - Zpusob výroby zesítených polysacharidu

Info

Publication number: CZ303485B6
Application number: CZ20011651A
Authority: CZ
Inventors: Barbucci@Rolando; Sportoletti@Giancarlo
Original assignee: Sigmar Italia S.P.A.
Priority date: 1998-11-11
Filing date: 1999-11-09
Publication date: 2012-10-17
Also published as: DE69924407D1; DK1137670T3; TR200101325T2; HK1041010B; NO20012316D0; HU227731B1; EP1137670B1; RU2230073C2; AU756158B2; EP1137670A1; JP2002529549A; KR20010101002A; CN1325409A; IL143064A0; HUP0104075A3; BR9915238A; HK1041010A1; HUP0104075A2; WO2000027886A1; US6734298B1

Abstract

Zpusob výroby zesítených polysacharidu, obsahujících karboxyskupiny, zvolených ze skupiny zahrnující hyaluronové kyseliny, získané napríklad z tkání nebo z bakterií, karboxymethyldextran, karboxymethylcelulózu, karboxymethylškrob, alginovou kyselinu, karboxycelulózu, N-karboxymethylované nebo butylované glukany nebo chitosany, hepariny s ruznou molekulovou hmotností, poprípade desulfatované a sukcinylované, dermatansulfáty, chondroitinsulfáty nebo heparansulfáty, spocívá v tom, že se a) karboxylové skupiny polysacharidu aktivují reakcí s aktivacním cinidlem karboxylových skupin, zvoleným ze skupiny zahrnující karbonyldiimidazol, karbonyltriazol, chlormethylpyridylium-jodid, hydroxybenzotriazol, p-nitrofenol, p-nitrofenyltrifluoracetát a N-hydroxysukcinimid v bezvodém dimethylformamidu nebo tetrahydrofuranu; a b) polysacharid s aktivovanými karboxylovými skupinami se uvede do reakce s polyaminem.

Description

Oblast techniky 5

Předkládaný vynález se týká způsobu zesítění karboxylových sacharidů. Způsob podle vynálezu poskytuje vysoký stupeň reprodukovatelnosti získaných výrobků vzhledem ke stupni zesítění, stejnorodosti rozdělení zesítěných řetězců, fyzikálně chemickým charakteristikám výrobků a technologickým charakteristikám z nich získaných částí.

Reprodukovatelnost je zvláště důležitá pro používání v lékařských, farmaceutických a dermatokosmetických oborech.

Vynález se dále vztahuje k výrobkům, získatelným uvedeným způsobem, a k jejich použití 15 v lékařských, farmaceutických a dermato-kosmetických oborech.

Dosavadní stav techniky

Použití makromolekul v lékařsko-farmaceutickém oboru a v pozdější době i v dermatologickokosmetickém oboru je dobře zavedeno. Pro přípravu farmaceutických prostředků jsou makromolekuly používány jako zahušťovadla, kluzná činidla, povlékací činidla v podobě filmů, odolných vůči žaludečním šťávám, zvláště pak při přípravě tobolek, gelu, koloidů a různých zařízení (např. kontaktních čoček, gázy a podobně). Makromolekuly se rovněž používají při přípravě pro25 středků s řízeným uvolňováním aktivních složek.

Souborné články, týkající se jejich charakteristik a farmaceutických použití, jsou uvedeny v:

1) C. Hansch a spol., vydavatelé, „Comprehensive Medicinal Chemistry“, Pergamon Press,

Oxford, 1990, díly 1 až 6;

2) A. Wade a P. J. Wellers, vydavatelé, „Handbook of Pharmaceutical Excipients“, vydání

1994, The Pharmaceutical Press.

Uvedené makromolekuly patří do různých chemických rodů a mohou být buď symetrické, nebo přírodní či polosyntetické.

Příklady syntetických makromolekul zahrnují polyvinylpyrrolidon, polyoxyethylenalkylethery, polyvinylalkoholy a polymethakryláty. Příklady přírodních makromolekul zahrnují přírodní kyselinu hyaluronovou (HY) a celulózu.

Příklady polosyntetických makromolekul zahrnují karboxylované alkylcelulózy, široce používané v potravinářském průmyslu a v průmyslu vyrábějícím prostředky pro osobní péči. Tyto makromolekuly jsou charakterizovány přímou nebo jen slabě větvenou strukturou.

Velmi důležitá modifikace pro zvýšení chemické, enzymatické a mechanické síly se provádí zesítěním, které lze provádět jak u syntetických, tak i u přírodních (více či méně již modifikovaných) polymerů.

Příklady zesítěných polymerů zahrnují polymery chránící tablety nebo tobolky před žaludečními Šťávami (polymethakryláty), stejně jako polymery, používané jako emulgační činidla, suspenzní činidla, látky vytvrzující tablety (Carbopol), a zesítěné hyaluronové kyseliny, diskutované dále.

Pro uvažovaná použitá a zejména pro přípravu invazivních lékařských zařízení, která musí být podávána parenterálně, musejí zmíněné polymery vyhovovat množství požadavků technického a regulačního rázu.

- 1 CZ 303485 B6

Technické požadavky zahrnují:

1) vysokou biologickou slučitelnost;

2) odolnost vůči enzymovým systémům jak tkáňovým, tak i plasmatickým (u injikovatelných prostředků) a gastrointestinálním (u prostředků podávaných orálně);

3) zformovatelnost do různých tvarů (gelů, filmů, houbiček a podobně);

4) možnost chemické sterilizace nebo fyzikální sterilizace bez změny struktury výrobku.

V některých případech může být žádoucí postupné odbourávání, například pro řízené uvolňování léčiva;

io

Odolnost vůči enzymovým systémům je zvláště důležitá, pokud je makromolekula přítomna v prostředcích/částech, které musejí vydržet dlouhou dobu, např. v náhradách synoviální tekutiny, tenkých filmech, houbách nebo gelech používaných jako tkáňový protipřilnavý materiál v různých oborech chirurgie; v tkáňovém inženýrství (umělé orgány); jako umělá kůže; v léčbě popálenin a obecně v estetické chirurgii.

Podle regulačních požadavků musí být prostředek různých výrobních šarží neměnný ve velmi úzkých mezích, to znamená, že výrobní postupy jsou standardizovány a že základní složky mají velmi nízkou vnitřní variabilitu.

Možná příčina nestejnorodosti makromolekul vyplývá z rozptylu molekulových hmotností. Uvedená nestejnorodost se stává dokonce ještě vyšší v důsledku zesítění, což může být vážnou nevýhodou v závislosti na oblasti použití a účelu použití konečného výrobku.

EP-A 566 118 (Kimberly-Clark) uvádí zesítěné polysacharidy pro použití jako superabsorbéry pro pleny a podobné výrobky.

Způsob zde popsaný se zakládá na zesítění celulózy vytvářením i ntermo leku lamích amidů, esterů nebo etherů mezi polyaminy, polyoly nebo směsmi takových látek a karboxylovou skupinou póly sacharidů.

Reakce se provádí zahrátím směsi polysacharidů spolyolem a/nebo polyaminem na přibližně 80 °C. Tento postup je jistě výnosný a vhodný pro výrobu ve velkém měřítku tam, kde jsou méně přísné požadavky na reprodukovatelnost.

US 5 465 055 předkládá zesítěné polysacharidy (kyselinu hyaluronovou a kyselinu alginovou), získané esterifikaci karboxylu polysacharidů a hydroxylových skupin jiných molekul, bez vsunutí síťujících ramének.

WO 91/9119 předkládá mikrotobolky pro Langerhansovy ostrůvky jako hybridní orgány, sestávající z kyseliny alginové, zesítěné ionty baria.

EP 190 215 předkládá zesítění různých polymerů (karboxyiovaných škrobů, dextranu, celulóz) pomocí di- nebo polyfunkčních epoxidů.

Pro kyselinu hyaluronovou byla navržena následující síťovací činidla: polyfunkční epoxidy jsou uvedeny v US 4 716 224, US 4 772 419 a US 4 716 154; polyalkoholy jsou uvedeny v US 4 957 744;

divinylsulfon je uveden v US 4 605 691 a US 4 636 524;

aldehydy jsou uvedeny v US 4 713 448 a US 4 582 865;

karboxamidy jsou uvedeny v US 5 356 833;

póly karboxy lově kyseliny jsou uvedeny v EP-A 718 312,

-2CZ 303485 B6

Zveřejněná Česká přihláška vynálezu PV 1989-7144 popisuje navázání biologicky účinných látek s obsahem aminoskupiny na polysacharid s karboxytovými skupinami. K umožnění této vazby jsou karboxylové skupiny aktivovány pomocí aktivačního činidla (isobutylchlorformiátu) v bezvodém prostředí dimethylformamidu.

Podstata vynálezu

Podstatu vynálezu tvoří způsob výroby zesítěných póly sacharidů, zvolených ze skupiny zahrnuj íio cí hyaluronové kyselin, získané například z tkání nebo z bakterií, karboxymethyldextran, karboxymethylcelulózu, karboxymethylškrob, alginovou kyselinu, karboxycelulózu, N-karboxymethylované nebo butylované glukany nebo chitosany, hepariny s různou molekulovou hmotností, popřípadě desulfatované a sukcinylované, dermatansulfáty, chondroitinsulfáty nebo heparansulfáty, a obsahujících karboxyskupiny, přičemž postup spočívá v tom, že se

a) karboxylové skupiny polysacharidu aktivují reakcí s aktivačním činidlem karboxy lových skupin, zvolených ze skupiny zahrnující karbonyIdiimidazol, karbonyltriazol, chlormethylpyridylium-jodid, hydroxy benzotriazol, p-nitrofenol, p-nitrofenyltrifluoracetát a N-hydroxysukcinimid v bezvodém dimethylformamidu nebo tetrahydrofiiranu; a

b) polysacharid s aktivovanými karboxylovými skupinami se uvede od reakce s polyaminem obecného vzorce

Rj-NH-A-NH-R, kde R_l a R₂, stejné nebo odlišné, znamenají atom vodíku, Ci-C₆-aIkyl, fenyl nebo benzyl, A zna25 mená Cr-Cio-alky lenový řetězec, s výhodou C2—C₆-alkylenový řetězec, popřípadě substituovaný hydroxylovými, karboxylovými, halogenovými, alkoxylovými nebo aminovými skupinami; polyoxyalkylenový řetězec vzorce [(CHzK-CHC^Xlm kde n=2 nebo 3 a m je celé číslo 2 až 10; Cs-Cr-cykloalkylovou skupinu; arylovou nebo heteroarylovou skupinou, s výhodou 1,3- nebo 1,4-substituovaný benzen.

Uvedené zesítěné polymery, získané různými postupy, jsou známé a byly navrženy pro různá použití (viz například EP 566 118, WO 91/9119, US 5 465 055, EP 190 215, EP 718 312, US 4 716 224, diskutované výše).

Aktivačními činidly karboxylu jsou obvykle ta, používaná v chemii peptidu; příklady vhodných činidel zahrnují karbony Idiimidazol, karbonyltriazol, chlormethylpyridyliumjodid (CMP-J), hyd40 roxybenzotriazol, p-nitrofenol p-nitrofenyltrifluoracetátu, N-hydroxysukcínimid a podobně. Zvláště se upřednostňuje použití chlormethylpyridyliumjodidu.

Polyaminy mají s výhodou následující obecný vzorec:

R,-NH-A-NH-R₂ kde R) a R₂, stejné nebo odlišné, jsou vodíkový atom, Ci-C₆ alkylové, fenylové nebo benzylové skupiny, A je C₂-Cio alkylenový řetězec, s výhodou C₂-C₆ alkylenový řetězec, volitelně substituovaný hydroxylovými, karboxylovými, halogenovými, alkoxylovými Či aminovými skupinami;

polyoxyalkylenový řetězec o vzorci [(CH₂)_n-O-(CH₂)_n]_m

-3CZ 303485 B6 kde n je 2 nebo 3 a m je celé číslo od 2 do 10; C₅-C₇ cykloalkylová skupina; arylová nebo heteroarylová skupina, s výhodou 1,3- nebo 1,4-substituovaný benzen. A je s výhodou C2-C6 rovný alkylenový řetězec o vzorci [(CH₂)_n-(HCH₂)_n]_m.

Síťující reakce se s výhodou provádí v rozpouštědle, zvoleném z tetrahydrofuran u, dimethylformamidu nebo dimethylsulfoxidu a póly sacharid je s výhodou převeden do podoby soli s lipofilním kationtem; například se jedná o tetraalkylamonnou sůl nebo jiné lipofilní organické báze.

Převedení anorganických solí, jako sodných solí, na vhodné organické lipofilní sole, se může provádět známými postupy iontové výměny v homogenní fázi nebo vysrážením kyselé složky, jejím následujícím shromážděním a převedením na sůl působením vhodné organické báze.

Reakce aktivování karboxylových skupin se provádí v homogenní fázi a v bezvodém polárním aprotickém rozpouštědle.

K roztoku aktivovaného esteru se přidá polyamid, rozpuštěný v tomtéž bezvodém rozpouštědle, za udržování teploty v rozmezí od 0 do 30 °C. Doba zesítění se pohybuje od 1 do 12 hodin, rov20 něž v závislosti na případné přítomnosti vhodných zásaditých látek (např. triethylaminu).

Obecně se konečný produkt shromáždí vysrážením organické soli přidáním odlišného rozpouštědla k reakčnímu rozpouštědlu nebo odpařením reakčního rozpouštědla a následným odstředěním, promytím destilovanou vodou, opakovaným rozptýlením v roztocích požadované alkalické látky (například sodíku, draslíku), následným promytím vodou a konečným vysušením alkalické soli pod vakuem nebo lyofilizací.

Stupeň zesítění (CLD, cross-linking degree) se může pohybovat v širokých mezích a může být upraven změnou množství aktivačních činidel karboxylu, neboť aktivace a síťovací reakce jsou v podstatě kvantitativní.

Zesítěné póly sacharidy, získané způsobem podle vynálezu, mohou být podrobeny sulfataci hydroxylových skupin které mohou být přítomny, obvykle reakcí s komplexem pyridin-oxid sírový v dimethylformamidu.

Reakce se provádí v heterogenní fázi při teplotě 0 až 10 °C po dobu v rozmezí přibližně od 0,5 do 6 hodin.

Získaný stupeň sulfatace se pohybuje v širokém rozmezí s ohledem na veškeré hydroxy love sku40 piny a může být upraven změnou teploty a reakční doby. Obecně se stupeň sulfatace (definovaný jako ekvivalenty sulfátových skupin/g) může pohybovat od 1 x 10'⁶ do 6 x 10⁶ a s výhodou činí 2X10“⁶ ekv./g pro stupeň zesítění 0,5.

Zesítěné polymery, získané způsobem podle vynálezu, volitelně sulfatované, jsou schopné kom45 plexace s kovovými ionty jako jsou ionty zinku, mědi nebo železa.

Uvedené komplexy mohou být získány rozpouštěním nebo rozptylováním, (disperzí) ve vodě), dokud neskončí bobtnání produktu, a přidáním za míchání, s výhodou při teplotě místnosti, zahuštěného roztoku anorganické nebo organické kovové soli, např. chloridu měďnatého, chlori50 du zinečnatého či síranu železnatého; po míchání po dobu 12 až 24 hodin se komplex shromáždí odstředěním nebo vysrážením po přidání odlišného rozpouštědla (například ethanolu nebo acetonu), anebo odpařením pod vakuem; získaný surový produkt je důkladně promyt destilovanou vodou k odstranění přebytků iontů. Poté jsou komplexy lyofilizovaný. Obsah kovových iontů se mění v závislosti na použitých reakčních podmínkách, zejména na molámích poměrech polymeru a iontů; na koncentraci a pH roztoků; na reakční době a zvláště na stupni zesítění.

-4 CZ 303485 B6

Způsob podle vynálezu umožňuje vhodnou úpravou stupně zesítění a/nebo stupně sulfatace, přípravu zesítěných karboxy lovaných póly sacharidů v široké škále tvarů, charakterizovaných různými vlastnostmi jako viskoelastičností, stupněm hydratace, schopností komplexace vzhledem ke kovovým iontům, schopností tvořit hydrogely, formovatelností do podoby filmů nebo houby, mechanickou pevností konečných materiálů.

To umožňuje jejich použití v mnoha lékařských oborech, v humánní i veterinární medicíně, a v dermato-kosmetických oborech.

Následující příklady vynález dále dokreslují.

Příklady provedeni vynálezu 15

Příklad 1

Karboxymethylcelulózový gel, 100% zesítěný 1,3-diaminopropanem.

V 30 ml dimethylformamidu (DMF) bylo pod dusíkovou atmosférou a za míchání rozpuštěno

1,2 x 10³mol, vzhledem k disacharidové jednotce, tributylamonné (TBA) soli karboxymethylcelulózy. K roztoku bylo po kapkách přidáno 0,32 g chlormethylpyridyliumjodidu (1,2 x 10' ³ mol), rozpuštěného ve 2 ml DMF, za udržování teploty pomocí ledu na 0 °C.

Molární poměr byl 1:1, neboť karboxymethylcelulóza má jednu funkční karboxylovou skupinu na disacharidovou jednotku. Po 20 minutách byly do roztoku přidány 2 ml síťujícího 1,3-diaminopropanu (0,006 mol) a bezprostředně poté rovněž 0,5 ml triethylaminu. Vzniklý pevný, rosolovitý produkt byl promyt DMF a vložen do vody k úplnému nabobtnání.

Poté byl střídavě promýván ethanolem a vodou. Po posledním promytí ethanolem byl produkt lyofilizován.

- infračervená spektra (IR), (film; cm^-1): 1650 (-CO-NH-); nezakřivující -COO' přibližně při 1400.

- SD: 7000 (stupeň nabobtnání, ve vodě a při teplotě místnosti; po 15 minutách; gravimetrické stanovení; počítáno podle vztahu:

W_s-Wd

SD= -.100

Wd kde W_s = hmotnost hydratovaného gelu; Wd = hmotnost suchého gelu).

- SEM (srovnávací elektronová mikroskopie): struktura vyhlíží kompaktně, s 15 až 35 pm póry.

- Povrch výrobku, při vystavení králičí PRP (plasmě s vysokým obsahem destiček; Platelet

Rrich Plasma), vykazuje velmi sníženou přítomnost destiček či agregátů ve srovnání s ekvivalentním výrobkem, získaným za použití polypropylenu o nízké hustotě (srovnávací standard

EC)).

Příklad 2

Karboxymethylcelulózový gel 50% zesítěný 1,3-diaminopropanem.

-5I

1,2 x 10^_3mol, vzhledem k disacharidové jednotce, tributylamonné (TBA) soli karboxy methy 1celulózy. K roztoku bylo po kapkách přidáno 0,24 g chlonmethylpyridyliumjodidu (0,9 x 10'³ mol), rozpuštěného ve 2 ml DMF, za udržování teploty pomocí ledu na 0 °C. Molámí poměr byl 2:1.

Po 20 minutách byly do roztoku přidány 2 ml síťujícího 1,3-diaminopropanu (3 x 10“³ mol) a bezprostředně poté rovněž 0,5ml triethylaminu. Vzniklý pevný, rosolovitý produkt byl promyt DMF a vložen do vody k úplnému nabobtnání.

io

- IR, (film; cm“¹): 1650 (-CO-NH-): nezakřivující -COO přibližně při 1400.

- SD: 8000

- SEM: přítomnost pórů 15 až 35 gm.

- Adhese destiček: jak byla uvedena v Příkladu 1.

Příklad 3

Gel kyseliny alginové, 50% (100 vzhledem k disacharidovým jednotkám) zesítěný 1,3-diaminopropanem

Tributylamonná sůl kyseliny alginové byla připravena ze sodné soli iontovou výměnou na silně 25 kationtové pryskyřici (Dovex) v H⁺ formě (tj. kyselé formě) a následnou neutralizací hydroxidem tetrabutylamonným (TBA-OH) a konečnou lyofilizací.

1,2 x 10^-3 mol, vzhledem k disacharidové jednotce, vzniklé soli. K roztoku bylo po kapkách při30 dáno 0,36 g chlormethylpyridyliumjodidu (1,2 x 10^-3 mol), rozpuštěného ve 2 ml DMF, za udržování teploty pomocí ledu na 0 °C. Molámí poměr byl 1:1.

Po 20 minutách bylo do roztoku přidáno 6 x 10^-3 mol síťujícího 1,3-diaminopropanu (0,024 mol) a bezprostředně poté rovněž 0,5 ml triethylaminu. Vzniklý pevný, rosolovitý produkt byl promyt

DMF a vložen do vody k úplnému nabobtnání.

- IR, (film; cm¹): 1635 (široký) (-CO-NH-); (-COCT) přibližně při 1400.

- SD: 5000

- SEM: struktura vyhlíží kompaktní a bez pórů.

Příklad 4

Příprava kyseliny hyaluronové, zesítěné na stupeň zesítění (CLD) = 0,05 (5 % dostupných karboxylových skupin). Síťující činidlo = 1,3-propandiamin

Sodná sůl kyseliny hyaluronové (1 x 10'³ mol; vzhledem k disacharidovým jednotkám) byla pře50 vedena na TBA sůl podle jedné z následujících metod:

a) 1% vodný roztok hyaluronátu sodného se převede do H⁺ formy pomocí H⁺ silné kationtové pryskyřice (Amberlite IR 120); na konečný roztok se působí 0,5% roztokem TBA-OH do pH přibližně 9,0.

-6CZ 303485 B6

b) 1% vodný roztok hyaluronátu sodného se převede na roztok TBA soli působením slabé kationtové pryskyřice v TBA⁺ formě (Amberlite IRC 50).

V obou případech se konečné roztoky lyofilizují. TBA sůl se poté pod dusíkovou atmosférou rozpustí v 15 ml bezvodého dimethylformamidu (DMF) a při 0 °C se k uchovávanému roztoku TBA soli přidá po kapkách roztok 0,02 g chlormethylpyridylium jodidu (CMPJ) ve 2 ml bezvodého DMF.

Poté bylo do reakční směsi přidáno 0,1 ml triethylaminu a následně, po kapkách, roztok 1,310 diaminopropanu (d=0,88, ve velkém nadbytku, k usnadnění zesítění aktivovaných karboxylových skupin) ve 2 ml bezvodého DMF. Po skončení adice byla reakční směs míchána po dobu alespoň 30 minut a rozpouštědlo bylo následně odstraněno za sníženého tlaku. Zbytek byl rozpuštěn v DMF, který byl následně odstraněn destilací a zbytek byl promyt ethanolem, soustavou ethanol-voda a konečně vodou.

Poté byl produkt lyofilizován a lyofilizovaný zbytek byl podroben analýze.

- IR, (film; cm¹)': 1630 (-CO-NH-); 1740 (-COOH, polysacharid); 3200 (-NH-).

- SD: 31 000 (stupeň nabobtnání, ve vodě a při teplotě místnosti; po 15 minutách; gravimetrické stanovení; počítáno podle vztahu:

W_s-Wd

SD = -.100

Wd kde W_s = hmotnost hydratovaného gelu; Wd = hmotnost suchého gelu).

- Stupeň zesítění: 0,05 (5 % původně dostupných karboxylových skupin).

Příklad 5 ³⁰

Příprava kyseliny hyaluronové, zesítěné na stupeň CLD (stupeň zesítění) = 0,05 (5 % dostupných karboxylových skupin). Síťující činidlo - 1,6-Áiiaminohexan. Aktivátor: chlormethylpyridyliumjodid,

Zesítěný derivát byl získán postupem popsaným v Příkladu 4, za podmínek jako v příkladu 4 a za použití stejné kyseliny hyaluronové a stejného aktivátoru, pouze za použití 1,6-diaminohexanu místo 1,3-diaminopropanu.

- IR, (film; cm¹)': 1630 (-CO-NH-); 1740 (-COOH, polysacharid); 3 200 (-NH-).

Příklad 6

Příprava zesítěné kyseliny hyaluronové, s CLD = 0,05 (5 % dostupných karboxylových skupin). Síťující činidlo = 0,0-bis(2-aminopropyl)polyethylenglykol 500. Aktivátor: chlormethylpyridy45 liumjodid.

Zesítěný derivát byl získán postupem popsaným v Příkladu 4, za podmínek jako v příkladu 4 a za použití stejné kyseliny hyaluronové a stejného aktivátoru, pouze za použití 0,0'-bis(2-aminopropyl)polyethylenglykolu 500 místo 1,3-diaminopropanu.

- IR, (film; cm¹)': 1630 (-CO-NH-); 1740 (-COOH, polysacharid); 3 200 (-NH-).

- SD:3l 000.

-7CZ 303485 B6

Příklad 7

Příprava zesítěné kyseliny hyaluronové, s CLD = 0,3 (30 % dostupných karboxylových skupin). 5 Síťující činidlo = Ι,Γ-propandiamin. Aktivátor: chlormethylpyridyliumjodid.

0,6 g tributylamonné soli kyseliny hyaluronové (1 x IQ^-3 mol vzhledem k disacharidové jednotce) bylo pod dusíkovou atmosférou za míchání rozpuštěno ve 30 ml DMF. K míchanému roztoku bylo po kapkách přidáno 0,08 g chlormethylpyridyliumjodidu (3,5 x 10^-4 mol), rozpuštěného ve ío 2 ml DMF, za udržování teploty pomocí ledu na 0 °C. Molámí poměr byl 3:1.

Po 20 minutách byly do roztoku přidány 2 ml 1,3-diaminopropanu (0,024 mol) a bezprostředně poté rovněž 0,5 ml triethylaminu. Vzniklý pevný, želatinovitý produkt byl vložen do vody k úplnému nabobtnání a opět promyt ethanolem.

Konečný produkt vykazoval po lyofilizaci ve srovnávacím mikroskopu nepravidelný vzorek s hladkými zónami, které se střídaly s houbovitými zónami.

Stupeň zesítění byl 0,3 (30 % dostupných karboxylových skupin).

- IR, (film; cm¹)': 1740 (-CQOH); 1630 (-CO-NH-); 1610 (-CQO-); 1560 f-CO-NH-í

Příklad8

Příprava zesítěné kyseliny hyaluronové, s CLD = 0,5 (50 % dostupných karboxylových skupin). Síťující činidlo = 1,3-propandiamin. Aktivátor: chlormethylpyridyliumjodid.

0,6 g tributylamonné soli kyseliny hyaluronové (HY TBA) (1 x 10³ mol vzhledem k disacharidové jednotce) bylo pod dusíkovou atmosférou za míchání rozpuštěno ve 30 ml DMF. K míchané30 mu roztoku bylo po kapkách přidáno 0,15 g chlormethylpyridyliumjodidu (CMPJ) (6 x 10^-6 mol), rozpuštěného ve 2 ml DMF, za udržování teploty pomocí ledu na 0 °C. Molámí poměr byl 2 HY TBA: 1CMPJ.

Po 20 minutách byly do roztoku přidány 2 ml 1,3-diaminopropanu (0,024 mol) a bezprostředně poté rovněž 0,5 ml triethylaminu. Vzniklý pevný, želatinovitý produkt byl důkladně promyt dimethylform amidem.

Po odpaření DMF byl produkt ponechán nabobtnat ve vodě a před lyofilizaci byl promyt ethanolem.

Získaný produkt měl stupeň zesítění 0,5 a ve srovnávacím mikroskopu vykazoval zrnité oblasti, oddělenou širokou síťovinou. Pri větších zvětšeních se obě morfologie zdály být totožné a vykazovaly okrouhlé výstupky o průměru několika mikrometrů.

- IR, (film; cm¹)': 1740(-COOH); 1630 (-CO-NH-); 1560(-CO-NH-);

Gely byly podrobeny bobtnání v PBS (fosfátem pufrovaný solný roztok) a byla stanovena jejich schopnost maximálního bobtnání.

SD = 23 500

NMR = (^l3C; části z milionu, tj. ppm): 29,3 a 39,8 (-CH₂-CH₂-CH₂-propandiaminové spojení);

172,5 (-C-NHCH₂-CH₂-CH₂-)

II

O

-8CZ 303485 B6

Rheologické vlastnosti, stanovené na Bohlinově VOR Rheometru při teplotě 23±0,1 °C, ukázaly, že dynamický modul pružnosti G' (100 Pa při 10 Hz), stejný při dvou uvažovaných koncentracích (10 a 20 mg/ml) je vždy vyšší než modul dynamické viskozity G (40 Pa pro 20 mg při 10 Hz a 20 Pa pro 10 mg při 10 Hz).

Příklady 9 až 12

Způsoby, popsanými v předcházejících příkladech, byly získány zesítěné deriváty hyaluronové io kyseliny, jejichž charakteristiky jsou shrnuty v následující Tabulce 1, vycházejíce z 1 x 10 ³ mol (0,6 g) tributylamonné soli hyaluronové kyseliny.

Získané deriváty měly následující vlastnosti;

-9CZ 303485 B6

4) ‘5, o

w

O

W

CZ5 *4J c

>

N

-rt

Ό

O ka o

c «Γ rt o

*3>

o

Vrt o

E >1 «ί z£ .. β XU '5 ^c £ >Q •rj O '3, rt ~ >

Ξ « ό ^rt £ « '5 o •a S χ 3 2 rt o 24 =t rt o

>ω a

rt

O

-X >ϊ u

'3) o

o

E

Cl

CL >1 c

*©

N '4>

C xn i

O u

>v •a rt 'rt <rt

G

XU

C >

N

	»«·	93 Vrt
»		M
E rt u	rt _c	O 2Í	<U E o
3	o		ba
«-»	u>	>
24	>
2	O	o	s
	O.	X	rt
rt	>.	24	24
	24	>5
E	Ό	G	O
	rt	*O	24
w • >	2=		*41 fi

Tabulka 1

E o

ε tc <-Xcd

E

a.

íj

Ad

S

X

Q

CC “§ s

a. -= <U OT N

CO rt »N

O c

E o

£ £

O _o

T3 a

>o o

rt > « O o e rt 'v*

Cl

X

CJ·

X u· r*

X

Q

I f* o

Cl

ΓΊ

Os

Cl

O

Cl

Cl o

I c

rt

Cl o

O

CL δ

x o

> X ! =?

§ .ó—O

-o « Λ § s

Cu Wo o

o o

O

ΙΛ

X

Cl rtcl

O w-i i—i

R

O

X sO ^c)

O* ci ?c O fX

Cl

O

SO

O ι/Ί

	X	Cl Cl C3
Cl	Q.
	o	o
I	u.
rt	Cl	o
ÍO	O	o
i	C	oo
t	E	o
o	rt	ω
o	y	CL,

O O O O rt* ci — so r- so so »n

G *41

4—1 a

N

X

Z i

O u

so

TT

Os sO o

o o

O©

O

IZ1 rt xř ·>

o oo

Cl o

« so crt<3 rt* cco 2 »/i o'

X so

O	Cl
G	O
ε	cT
rt
-5 ]	c rt
sO~	X v

E rt

O

-G

H—<

O rt >

O rt %

X

GJ

SD - stupeň nabobtnání IR = infračervená spektra

Příklad 13

Sulfatace 50% zesítěné hyaluronové kyseliny

Derivát získaný v Příkladu 8 byl za silného míchání a pod dusíkovou atmosférou rozptýlen v 5 ml DMF.

Při 0 °C byl přidán roztok 1 g SO₃/pyridinu v mol DMF a míchán 3 hodiny. Reakce byla skončena přidáním přebytku H₂O (50 ml) a hodnota pH byla upravena pomocí 0,1 mol.t“’ roztoku NaOH io na 9,0.

Výsledný produkt byl důkladně promyt ethanolem a H₂O a poté byl lyofilizován.

Infračervené spektrum ukazuje, kromě pásů výchozího produktu, maximum (pík) při 1260 cm'¹ a 15 silnější pruh při 1025 cm¹.

Gely bobtnají v PBS se stupněm nabobtnání SD = 33 000. ¹³C NMR s vyšší rozlišovací schopností vykazuje signály v H₂O při 37 °C, uvedené v Tabulce 2. Intenzita NMR signálů při 29,3 a 38,8 ppm (-CH2-) a signál při 172,5 ppm (CONH) potvrzují stupeň zesítění přibližně 50 %.

Rheologické vlastnosti jsou charakterizovány dynamickými moduly pružnosti G' (2 500 Pa s 20 mg a 1000 Pa s 10 mg při 10 Hz), které jsou vždy vyšší než moduly dynamické viskozity G (600 Pa pro 20 mg při 10 Hz a 150 Pa pro 10 mg při 10 Hz) a mnohem vyšší než odpovídající hodnoty, získané s nesulfatovanou kyselinou hyaluronovou (13 při 50 % - Příklad 5). Tato slou25 ěenina má thrombinovou dobu (TT, thrombin time) vyšší (6t±5) než kontrola (14,0) a odpovídající nezesítěná sloučenina (14,6).

Sloučenina byla rovněž aktivní v PRP testu, využívajícím stresované králíky.

Tabulka 2: ^,3C chemický posun

C-l	C-2	C-3	C-4	C-5	x-C=O	y-CH,
103,5	57,3	85,4	71,3	78,7	178,0	25,3	ppm
1 C-l·	C-2'	C-3’	C-4’	C-5’	6-C=O
105,9	75,2	76,4	82,8	78,6	176,2		ppm
1-CH2	2-CH2	3-CH2	6-C=O	zesítění
39,8	29,3	39,8	172,5	ppm

Příklad 14

Sulfatace gelu alginové kyseliny

Zesítěný produkt byl po promytí ethanolem lyofilizován k úplnému odstranění vlhkosti a podroben sulfataci alkoholových skupin.

-11 CZ 303485 B6

100 mg zesítěného produktu rozptýleného v 5 ml DMF bylo doplněno roztokem SO₃/pyridinu (800 mg ve 2 ml DMF). Reakce by měla být prováděna při teplotě 0 °C, pod dusíkovou atmosférou a za stálého míchání po dobu 2 hodin.

Produkt nesmí adsorbovat vlhkost, neboť ta reakci inhibuje.

Po 2 hodinách byla po přídavku H₂O upravena hodnota pH na 9,0 pomocí 1 mokr¹ roztoku NaOH k uvolnění pyridinu. Takto sulfatovaný produkt byl čištěn v EtOH.

i o Analýza vyčištěných produktů ukázala:

- IR (film; cm'¹) 1263 (protažení SO)

- ekvivalenty SO₃ skupin/g gelu (podle toluidinových komplexů):

5% zesítěný gel: 6x10^-5

50% zesítěný gel: 2 x 10~⁵

100% zesítěný gel: 3 x 10~³

- SD: 5% zesítěný gel: 19 x 10³

50% zesítěný gel: 9 x 10^-3100% zesítěný gel: 7 x 10“³

Příklad 15

Za použití shodné metodologie byly syntetizovány sulfatované deriváty 50% zesítěných produktů podle Příkladů 10, 11 a 12.

Kolorimetrické charakteristiky sulfatovaných derivátů jsou uvedeny v Tabulce 3 společně s charakteristikami produktů, získaných z Příkladů 8 a 13.

Tabulka 3

zesítěný polymer (50% CLD)	AHa [J/g]	Tg [°C]	AHb [J/g]	hm. % vody
zesíť. hyal-1,3 (př. 8)	276	51	42	12
zesíť. hyalS-1,3 (př. 13) ...	357	64	53	16
zesíť. hyal-1,6 (př. 12)	327	64	58	16
zesíť. hyalS-1,6	465	64	65	20
\|5 zesíť. hyal-P500.2NH₂ (př. 10)	239	45	72	10
jó zesíť. hyalS-P500.2NH_:	384	69	113	16
7 zesíť. hyal-P800.2NH₂ (př. 11)	179	73	30	10
8 zesíť. hyalS-P800.2NH,	206	76	52	10
hyal ITBA	164	-	130	5

AHa [J/g]: entalpie odpařování vody

Tg [°C]: entalpie procesu tepelné degradace

AHb [J/g]: přechodová teplota sklovatění hm. % vody: procentní obsah vody na základě AHa

- 12CZ 303485 B6

Příklad 16

Sulfatace karboxymethylcelulózového gelu

Podle postupu a podmínek, popsaných v příkladu 14, byl získán sulfatovaný derivát.

- ekvivalenty SO₃ skupin/g gelu;

a-CMC 5 % zesítěná: b-CMC 50 % zesítěná:

c-CMC 100% zesítěná:

-SD; a; 20x10³b: 12xt0^-3c: 9xl0“³ x 10^{4 * 6} (CMC = karboxymethylcelulóza) 7x IO⁶4x ΚΓ⁶

Claims

PATENTOVÉ NÁROKY

1. Způsob výroby zesítěných polysacharidů, obsahujících karboxyskupiny, zvolených ze skupiny zahrnující hyaluronové kyseliny, získané například z tkání nebo z bakterií, karboxymethyldextran, karboxymethylcelulózu, karboxymethyl škrob, alginovou kyselinu, karboxycelulózu, Nkarboxymethylované nebo butylované glukany nebo chitosany, hepariny s různou molekulovou

25 hmotností, popřípadě desulfatované a sukcinylované dermatansulfáty, chondroitinsulfáty nebo heparansulfáty, vyznačující se tím,

a) karboxylové skupiny polysacharidů aktivují reakcí s aktivačním činidlem karboxylových skupin, zvoleným ze skupiny zahrnující karbonyldiímidazol, karbonyltriazol, chlormethylpyridylium-jodid, hydroxybenzotriazol, p-nitrofenol, p-nitrofenyltrifluoracetát a N-hydroxysukcinimid

30 v bezvodém dimethylformamidu nebo tetrahydrofuranu; a

b) polysacharid s aktivovanými karboxylovými skupinami se uvede do reakce s polyaminem obecného vzorce

R,-NH-A-NH-R, kde Ri a R₂, stejné nebo odlišné, znamenají atom vodíku, Ci-C₆-alkyl, fenyl nebo benzyl, A znamená C2-Cio-alkylenový řetězec, s výhodou Cr-Có-alky lenový řetězec, popřípadě substituovaný hydroxylovými, karboxylovými, halogenovými, alkoxylovými nebo aminovými skupinami; polyoxyalkylenový řetězec vzorce [(CH₂)_n-O-(CH₂)_n]_m kde n=2 nebo 3 a m je celé číslo 2 až 10; C₅-Cr-cykloalkylovou skupinu; aiylovou nebo heteroarylovou skupinou, s výhodou 1,3- nebo 1,4-substituovaný benzen.

⁴⁵

2. Způsob podte nároku 1, vyznačující se tím, že se polysacharid převede na sůl s lipofilními kationty.

3. Způsob podle nároku 2, vyznačující se tím, že lipofilním kationtem je tributyl50 amonný nebo tetraalkylamonný kation.

4. Způsob podle kteréhokoliv z nároků laž3, vyznačující se tím, že získaný zesítěný polysacharid se dále podrobí sulfataci hydroxylových skupin reakcí s komplexem pyridin/oxid sírový.

- 13CZ 303485 B6

5. Způsob podle nároku 4, vyznačující se tím, že se sulfatace provádí v heterogenní fázi v dimethylformamidu při teplotě 0 až 10 °C po dobu 0,5 až 6 hodin.

5

6. Způsob podle kteréhokoliv z nároků laž5, vyznačující se tím, že zesítěný, popřípadě sulfatovaný polysacharid se dále podrobí komplexaění reakci s vodnými roztoky mědi, zinku nebo železa.