CZ303879B6

CZ303879B6 - Deriváty na bázi kyseliny hyaluronové schopné tvorit hydrogely, zpusob jejich prípravy, hydrogely na bázi techto derivátu, zpusob jejich prípravy a pouzití

Info

Publication number: CZ303879B6
Application number: CZ20120136A
Authority: CZ
Inventors: Wolfová@Lucie; Pravda@Martin; Foglarová@Marcela; Nemcová@Miroslava; Niedoba@Krzysztof; Velebný@Vladimír
Original assignee: Contipro Biotech S.R.O.
Priority date: 2012-02-28
Filing date: 2012-02-28
Publication date: 2013-06-05
Also published as: PL2820051T3; DK2820051T3; BR112014020156A8; HUE028115T2; CZ2012136A3; WO2013127374A1; KR101953709B1; RU2586931C2; KR20140127286A; BR112014020156B1; RU2014138544A; EP2820051B1; JP2015508118A; ES2549668T3; EP2820051A1; BR112014020156A2; US20150000561A1; JP6247645B2; US9492586B2

Abstract

Resení se týká derivátu hyaluronanu podle obecného vzorce (I), kde Ar je fenyl a R.sub.1.n. je ethylen, nebo Ar je indol a R.sub.1.n. je ethylen, nebo Ar je indol a R.sub.1.n. je karboxyethylen, a kde R.sub.2.n. je alkyl o poctu uhlíku 3 az 7, a kde n je v rozmezí od 1 do 7500. Dále je popsán zpusob jeho prípravy, hydrogel na bázi tohoto derivátu, zpusob prípravy hydrogelu a pouzití hydrogelu ve tkánovém inzenýrství, kosmetice, medicíne nebo regenerativní medicíne, zejména ve forme scaffoldu pro lécbu defektu kloubní chrupavky nebo kostních tkání.

Description

Řešení se týká derivátu hyaluronanu podle obecného vzorce (1), kde Ar je fenyl a R, je ethylen, nebo Ar je indol a R] je ethylen, nebo Ar je indol aR, je karboxyethylen, a kde R₂je alkyl o počtu uhlíků 3 až 7, a kde n je v rozmezí od 1 do 7500. Dále je popsán způsob jeho přípravy, hydrogel na bázi tohoto derivátu, způsob přípravy hydrogelu a použití hydrogelu ve tkáňovém inženýrství, kosmetice, medicíně nebo regenerativní medicíně, zejména ve formě scaffoldů pro léčbu defektů kloubní chrupavky nebo kostních tkání.

'OH

Deriváty na bázi kyseliny hyaluronové schopné tvořit hydrogely, způsob jejich přípravy, hydrogely na bázi těchto derivátů, způsob jejich přípravy a použití

Oblast techniky

Vynález se týká nového derivátu hyaluronanu vhodného pro přípravu hydrogelů a způsobu jeho přípravy. Dále hydrogelů na bázi tohoto derivátu, jejich vlastností, využití a způsobu přípravy.

Dosavadní stav techniky

Hyaluronan je polysacharid, který se skládá z disacharidických jednotek složených z D-glukuronové kyseliny a D-ÝV-acetylglukosaminu vázaných alternujícími β—1,4 a β-1,3 glykosidickými vazbami. Hmotnostní průměr molekulové hmotnosti (pokud bude v dalším textu zmiňována molekulová hmotnost, bude se vždy jednat o hmotnostní průměr molekulové hmotnosti) in vivo bývá v rozsahu 3 kDa až 20 MDa. Jedná se o polysacharid, který je snadno rozpustný ve vodném prostředí, kde v závislosti na molekulové hmotnosti a koncentraci vytváří velmi viskózní roztoky.

Hydrogely jsou materiály, které jsou tvořeny ve vodě nerozpustnou sítí alespoň částečně hydrofilních polymerů¹. Cest, kterými lze vytvořit nerozpustnou síť původně hydrofilního polymeruje několik. Jedná se o hydrofobizaci polymeru² či využití ve vodě rozpustného derivátu polymeru nesoucího reaktivní funkční skupiny, které se mohou účastnit dalších chemických reakcí vedoucích ke vzniku trojrozměrné polymerní sítě^3-5.

Příprava rozpustných derivátů hyaluronanu a jejich následné zesítění bylo popsáno řadou autorů³’⁶. Rovněž bylo v minulosti popsáno využití fenolického derivátu hyaluronanu pro síťovací reakce a přípravu hydrogelů. Calabro et al.^4,1,9 popisují způsob přípravy fenolických derivátů hyaluronanu reakcí karboxylů, přítomných ve struktuře D-glukoronové kyseliny hyaluronanu, s aminoalkyl-deriváty fenolu. Produktem této reakce jsou amidy hyaluronanu. Pro popsaný průběh syntézy je klíčová aktivace karboxylu hyaluronanu, ke které je v tomto případě využita reakce s dehydratačními činidly typu karbodiimidů (např. EDC). Jako aminoalkylfenol je nejčastěji využíván tyramin⁶.

Obecně je zesítění fenolických derivátů hyaluronanu iniciováno přídavkem peroxidázy (např. křenové peroxidázy - HRP) a zředěného roztoku peroxidu vodíku. Křenová peroxidáza (Horseradish peroxidase, HRP, E.E. 1.11.1.7) je v současné době široce využívána jako katalyzátor organických a biotransformačních reakcí⁹ ¹³. Vyznačuje se velmi širokou substrátovou specifitou, a je proto schopna oxidovat řadu organických a anorganických sloučenin¹³ ¹⁵.

Jedná se o enzym obsahující jako prostetickou skupinu hem s obsahem železa. To se v neaktivovaném enzymu nachází v oxidačním stupni (III). Při reakci s peroxidy dochází ke vzniku intermediátu, který je označován jako HRP-I. Železo hernu Fe^íul) je oxidováno oxyferrylovou skupinou (Fe^(IV)=O) a na porfyrinovém kruhu zároveň dochází ke vzniku katonického π-radikálu. Takto aktivovaný enzym je schopen vytvářet komplexy s molekulami substrátu, který během této interakce podléhá oxidaci^14,16 ¹⁸

Přeměna oxidované formy enzymu zpět do jeho výchozí podoby probíhá ve dvou stupních. V první fázi dochází k reakci mezi molekulou substrátu (S) a HRP-I za vzniku radikálu substrátu (R·) a částečně redukované formy enzymu HRP-II. HRP-Π si stále zachovává oxyferrylovou skupinu (Fe^(IV-O), ale již neobsahuje porfyrinový π-radikál. Během přechodu tronu a porfyrinový radikál je zároveň protein přebrán jeden H⁺. HRP-Π opět podstupuje reakci se substrátem za vzniku R·. Oxyferrylová skupina (Fe^(IV-O) je během této reakce redukována zpět na Fe^(Ill). Tento proces je spojen s transferem 2 H⁺ na kyslík oxyferrylové skupiny. Jeden proton

- 1 CZ 303879 B6 pochází ze substrátu (nebo solventu), druhý z proteinu. Výsledkem je vznik molekuly vody (Rovnice I a Schéma I).

HRP + H₂O₂ -*

HRP-l + S HRP-II + S —

R.

HRP-I + H₂O HRP-ll + RHRP + R-+ H₂O R-R

Rovnice I: Základní popis mechanismu katalýzy oxidace substrátu pomocí HRP

Vzniklé radikály substrátu jsou v řadě případů schopné vzájemně reagovat za vzniku dimerů RR. Tento proces již není enzymaticky ovlivněn a souvisí se stabilitou a reaktivitou vzniklých radikálů.¹⁴·^{16 26}.

V případě enzymatické síťovací reakce fenolického derivátu polysacharidu je tedy substrát (fenol - reaktivní ligand vázaný na polymer) přeměňován enzymem na reaktivní radikál. Tento radikál následně může reagovat s dalším fenolickým radikálem za vzniku dityraminu. Předpokládáme-li volnou pohyblivost molekul substrátu (ligandu) enzymatické reakce a průběh reakce přesně kopírující rovnici I, měl by enzym (je-li použito dostatečné množství peroxidu) postupně přeměnit všechny molekuly substrátu na reaktivní radikály a ty by, při dostatečně dlouhém reakčním čase, postupně všechny podlehly dimerizaci (např. oligomerizaci). V případě vazby substrátu (ligandu) na polymer, by stupeň zesítění polymeru měl vždy dosáhnout stejné hodnoty, i když doba dosažení této hodnosty by se lišila podle množství použitého enzymu. V praxi tomu tak však není. V literatuře²⁷ jsou podrobněji popsány vztahy mezi očekávaným poměrem intramolekulárních a intermolekulámích zesítění a molekulovou hmotností polymemích segmentů mezi místy zesítění (hustot zesítění, délkou mezi uzly sítě), přičemž intramolekulámí interakce vedoucí k zesítění jsou, na rozdíl od intermolekulámích zesítění, uváděny jako elasticky neefektivní.

Dále je z literatury známo, že v případě využití fenolických derivátů HA množství enzymu ovlivňuje nejen rychlost síťovací reakce, ale výrazným způsobem ovlivňuje i výsledné mechanické vlastnosti hydrogelů^4,6’^7,28. Literatura uvádí, že reologickými měřeními bylo zjištěno, že modul pružnosti ve smyku (G‘) je vyšší, pokud je použita vyšší koncentrace enzymu. Autoři tento jev zdůvodňují vyšší hustotou zesítění hydrogelů. Pokud je nutno připravit maximálně tuhý hydrogel, musí síťovací reakce probíhat za relativně vysoké koncentrace peroxidázy a tedy i rychleji. Příliš rychlý průběh reakce pak ale může vést ke vzniku nehomogenně zesítěného hydrogelů. Ve vzorcích se tak mohou vyskytnout místa, která nejsou zesítěna vůbec. Příliš rychlý průběh reakce může také působit problémy při umísťování gelu do místa jeho finální aplikace apod.

Příčinou je malá vzdálenost reaktivního centra od základního řetězce polymeru. Malá pohyblivost ligandu snižuje pravděpodobnost efektivní srážky radikálů ligandů za vzniku dityraminu. Proto, je-li v systému malá koncentrace enzymu, vznikne za časovou jednotku malé množství reaktivních forem ligandu. Síťovací reakce tedy jednak probíhá pomalu a jednak je málo efektivní.

Park et. al.²⁹ se pokusil zvýšit reaktivitu ligandů vázaných na polymeru vložením vhodného spaceru mezi reaktivní ligand a řetězec polymeru. Spis popisuje vložení hydrofilního řetězce mezi řetězec polysacharidu a fenolické či anilinové jádro za účelem zvýšení reaktivity těchto substituentů. Hlavním důvodem pro zavedení hydrofilního řetězce do struktury polymeru bylo zlepšení jeho rozpustnosti a zlepšení přístupnosti reaktivních center (fenolické či anilinové jádro). Snadnější prostorová přístupnost reakčních center zvyšuje pravděpodobnost reakce mezi ligandy. Tento krok vede nejčastěji, při zachování stejné aktivity enzymu, k vyššímu stupni substituce, vyšší koncentraci a lepší homogenitě zesítění hydrogelů. Díky zavedení tohoto hydrofilního

-2CZ 303879 B6 řetězce do struktury hydrogelu je navíc dle autora zvýšena jeho biostabilita a mechanické vlastnosti. Park et al. však jako „spacer“ používají hydrofilní polymer PEG o molekulové hmotnosti 3500 Da, a proto se ve výsledku spíše jedná o kopolymer. Takovým zásahem do struktury hydrogelu, i při malém stupni substituce, však dochází k zásadním změnám fyzikálních vlastností původního polymeru. Navíc v případě hyaluronanu vede sice vyšší koncentrace zesítění ke zvýšení tvrdosti hydrogelu, ale současně i ke zvýšení jeho křehkosti, což je pro zamýšlené použití ve tkáňovém inženýrství nežádoucí. U materiálu určeného pro scaffoldy, například, ale nejen pro scaffoldy do kloubní chrupavky, se klade velký důraz na to, aby byl dostatečně pevný a odolný, přičemž materiál, který je křehký, se při větším zatížení ihned nevratně deformuje a v případě io hydrogelů dochází i kjeho úplné destrukci.

Podstata vynálezu

Cílem vynálezu tedy je nalézt takový materiál, který by byl dostatečně pevný a současně i houževnatý a u něhož by nedošlo k nijak zásadním změnám biologických a fyzikálních vlastností oproti původnímu polymeru. Pevnost hydrogenu na bázi hyaluronanu lze obecně zvýšit zvýšením koncentrace zesítění, a to například zvýšením koncentrace polymeru v roztoku, z něhož se hydrogel tvoří, nebo zvýšením stupně substituce polymeru. Oba tyto způsoby však v dosavadním stavu techniky vedly v případě hyaluronanu i ke zvýšení křehkosti výsledného hydrogelu, což výrazně omezuje možnost použití hydrogelu.

Problém, který řeší tento vynález, spočívá v nalezení takových derivátů, které by vedly ke zvýšení reaktivity ligandů a zvýšení tuhosti hydrogelů, při zachování fyzikálních a biologických vlastností původního polymeru. Překvapivě bylo zjištěno, že zavedením poměrně krátkého spaceru (o molekulové hmotnosti přibližně 130 Da) podle vynálezu mezi reaktivní ligand a HA má za následek již při velmi nízkém stupni substituce výrazné zvýšení houževnatosti výsledného hydrogelu.

V jednom aspektu se tedy vynález týká derivátu HA nesoucího reaktivní ligandy vázané prostřednictvím hydrofobních spacerů, s cílem zvýšit pohyblivost ligandů a zvýšit tak pravděpodobnost jejich efektivní srážky a to i v případě, kdy je jich v systému malá koncentrace (nízký stupeň substituce a malá aktivita enzymu). Bylo zjištěno, že i přes velice nízké hmotnostní zastoupení spaceru v hydrogelu, tvoří např. pouhá 0,01 až 0,02 %, dochází k výraznému navýšení houževna35 tosti a pevnosti tohoto hydrogelu oproti hydrogelu z analogického HA derivátu bez vloženého spaceru (tzn. stejná koncentrace, moiámí hmotnost a stupeň substituce/zesítění). Vynález se tedy týká tohoto nového derivátu hyaluronanu vhodného pro přípravu hydrogelů a způsobu jeho přípravy. Dále se týká hydrogelů na bázi toho derivátu, jejich využití a postupu přípravy.

Hydrogel je připraven způsobem využívajícím zesítění řetězců modifikovaného hyaluronanu reakcí, která je katalyzována křenovou peroxidázou či jejími analogy. Vhodné deriváty hyaluronanu obsahují ve své struktuře fenolická či heteroarylfenolická jádra kovalentně vázaná k základnímu řetězci polysacharidu. Proces zesítění lze popsat jako kaskádu na sebe navazujících chemických reakcí, která začíná vznikem reaktivních forem kyslíku (ROS) v systému. Ty jsou ke směsi přidány nebo je jejich vznik umožněn přítomností chemických sloučenin, které slouží jako jejich „generátor“. ROS aktivují enzym peroxidázu, či její analoga, která následně katalyzují dimerizaci (popř. oligomerizaci) aromatických či heteroaromatických jader přítomných ve struktuře derivátu hyaluronanu. Tím dochází ke vzniku trojrozměrné polymemí sítě.

Dle tohoto vynálezu je k přípravě hydrogelu používán hyaluronan modifikovaný navázáním ligandů obsahujícího aminoalkylfenol či aminoalkylheteroarylfenol (např. tyramin, 5-hydroxytryptofan, serotonin). Deriváty hyaluronanu popisované v tomto vynálezu obsahují ligand, který je navázán na polysacharid prostřednictvím spaceru. Přítomnost tohoto spaceru ve struktuře derivátu HA vede díky jeho flexibilitě k navýšení elasticity a volnosti možností konformačních uspořádání zúčastněných segmentů polymeru a tím i možnosti disipace deformační energie.

-3 CZ 303879 B6

Zavedení spaceru také zvětšuje vzdálenost reaktivního aromatického centra (fenolu, heteroaryl fenolu) od základního řetězce polymeru, zlepšuje jeho přístupnost pro interakci s enzymem a zásadním způsobem ovlivňuje průběh síťovací reakce a vlastnosti vzniklého hydrogelu.

Ve svém prvním aspektu se vynález týká derivátu na bázi kyseliny hyaluronové podle obecného vzorce (I)

kde Ar je fenyl a R| je ethylen, nebo Ar je indol a Ri je ethylen, nebo Ar je indol a R] je karboxyethylen, a kde R₂ je alkyl o počtu uhlíků 3 až 7, a kde n je v rozmezí od 1 do 7500. V dalším aspektu se vynález týká způsobu přípravy derivátu podle obecného vzorce (I), kde se nejprve připraví aldehydický derivát kyseliny hyaluronové podle vzorce (II),

(II), kde aldehydický derivát se připraví s použitím oxidačního systému 4-acetamidováTEMPO/NaClO v protickém prostředí a má stupeň substituce 5 až 15 % a molekulovou hmotnost v rozmezí 10 000 g/mol až 2 000 000 g/mol, dále se zvlášť připraví sloučenina obecného vzorce (ΙΠ) η₂ν^ /Ri_x /^0HO^Z NH Ar (III), kde Ar je fenyl a R¹ je ethylen, nebo Ar je indol a R] je ethylen, nebo Ar je indol a R] je karboxyethylen, a kde R₂ je alkyl o počtu uhlíků 3 až 7, a kde n je v rozmezí od 1 do 7500, přičemž sloučenina obecného vzorce (III) se připraví reakcí prekurzoru spaceru podle vzorce (IV)

Z-N-R₂-COOH (IV), kde Z je chránící skupina běžně používaná k ochraně primární aminoskupiny, s ligandem podle vzorce (V)

HOAr

NH₂ (V),

-4CZ 303879 B6 v aprotickém prostředí při teplotě v rozmezí 40 °C až 150 °C po dobu 1 až 24 hodin v přítomnosti činidla aktivujícího karboxylové funkční skupiny, za vzniku sloučeniny obecného vzorce (VI)

Z-NH-R₂-CO-NH-R,-Ar-OH (VI), ze které se sloučenina obecného vzorce (III) připraví odstraněním chránící skupiny Z, a pak se aldehydický derivát kyseliny hyaluronové podle vzorce (II) nechá reagovat se sloučeninou obecného vzorce (III) při pH v rozmezí 3 až 8 při laboratorní teplotě po dobu 1 až 72 hodin v přítomnosti pikolin-boranového komplexu za vzniku derivátu podle vzorce (I).

Derivát podle vynálezu tedy obsahuje ligand, schopný postupovat oligomerizaci působením vhodného činidla, a flexibilní spacer, který je vložen mezi řetězec hyaluronanu a ligand. Ligand dle obecného vzorce (V) podle vynálezu je s výhodou vybrán ze skupiny zahrnující tyramin, serotonin a 5-hydroxytryptofan. Sloučenina obecného vzorce (IV), tj. prekurzor spaceru, je s výhodou vy brána ze skupiny aminokyselin zahrnující deriváty ro-[(ter/-butoxykarbonyl)aminojkarboxylových kyselin, kde R₂ je alkyl o počtu uhlíků 3 až 7.

Podle ještě dalšího výhodného provedení způsobu podle vynálezu probíhá reakce prekurzoru spaceru s ligandem v prostředí THF nebo DMF při teplotě 50 °C po dobu 2 až 6 hodin v přítomnosti 1,1 ‘-karbodiimidazolu.

Dále je výhodné, když se odstranění chránící skupiny Z provede prostřednictvím trifluoroctové nebo chlorovodíkové kyseliny.

Pro potřeby vynálezu jsou jako meziprodukt spacer-ligand označovány sloučeniny obecného vzorce:

HO-Ar-R,-NH-CO-R₂-NH₂.

S výhodou je jako spacer použita sloučenina obecného vzorce:

-CO-R₂-NH₂

- kde R₂ je alkyl o počtu uhlíků 3 až 7.

Způsob přípravy derivátu podle vynálezu může být charakterizován schématem 1:

-5CZ 303879 B6

Boc \

nh-r₂ ^=0 +

HO

spacer - ligand reduktivní amínace

Schéma 1Příklad možného způsobu přípravy derivátu HA-spacer-ligand dle vynálezu

Dále se vynález týká hydrogelu vzniklého zesítěním derivátu podle obecného vzorce (I) a způsob jeho přípravy. Tento způsob přípravy hydrogelu spočívá v tom že se na derivát podle obecného vzorce (I) působí generátorem reaktivních fenoxyradikálů, s výhodou systémem křenová peroxidáza a zdroj hydroxylových radikálů, kterým může být roztok peroxidu vodíku ve vodě, nebo systémem oxidáza-kyslík-substrát, např. galaktózooxidáza-galaktóza nebo glukózooxidázaglukóza, při pH v rozmezí 4 až 10.

K oligomerizaci reaktivních ligandů je tedy využíváno činidel, které jsou schopná vyvolat vznik fenoxyradikálů z aromatických jader ligandů. Dle tohoto vynálezu je s výhodou využíváno systému peroxid/křenová peroxidáza. Peroxid může být do systému přidáván ve formě ředěného roztoku, nebo je generován chemickou reakcí in šitu. Peroxid vodíku je možné ve směsi generovat pomocí různých druhů enzymů (oxidáz) z kyslíku, jako akceptoru elektronů a příslušného donoru elektronů v oxidačně - redukční reakci. S výhodou lze použít kombinaci galaktóza oxidáza nebo glukóza oxidáza a jejich substráty: galaktóza a glukóza. Jinými činidly, která jsou schopná vyvolat vznik fenoxyradikálů v přítomnosti molekulárního kyslíku, jsou enzymy tyrozináza, laktáza atd.

Vlastnosti těchto hydrogelů jsou, jak je obecně známo, ovlivňovány jak chemickou strukturou polymeru a jeho koncentrací, tak zvanými typy síťovacích činidel a jejich použitých množství. Fyzikálně-chemické vlastností polymeru (derivátu HA) jsou především ovlivňovány strukturou monomeru, konformací segmentů polymerního řetězce, stupněm zesítění a molámí hmotností. Tímto jsou také ovlivněny mechanické vlastnosti polymeru. Při mechanickém namáhání polymeru dochází kjeho deformaci, kdy se část absorbované deformační energie disipuje - spotřebuje na změnu konformací uzlů sítě a segmentů polymerního řetězce a část energie se nevratně přemění na teplo. Velikost disipované energie a tím i možnost zaujmutí různých konformačních uspořádání v rámci struktury polymeru souvisí s tuhostí makromolekulámích řetězců a odráží míru

-6CZ 303879 B6 elektrického odporu materiálu proti deformaci. Polymemí materiály složené z tuhých neohebných řetězců a jejich segmentů pak mohou vykazovat malou míru elastického odporu proti deformaci a křehkost.

Navýšení elasticity těchto polymerů se provede způsobem podle vynálezu, kde se zavedou flexibilní segmenty do struktury polymeru. Ty se vyznačují vyšší volností pohybu jednotlivých molekul kolem svých vazeb, a tím dosahují navýšení možností jejich konformačních uspořádání při působení deformační energie a možnosti její disipace. Zavedení vhodného flexibilního spaceru mezi ligand a základní řetězec hyaluronanu tak vede k dosažení vyšší elasticity, houževnatosti a pevnosti výsledného materiálu, což je velice přínosné např. u hydrogelů cílených pro scaffoldy v rámci léčby defektů některých tkání vystavených vyšším zátěžím, jako je např. kloubní chrupavka nebo kosti. Jak bylo popsáno výše, zavedení flexibilního spaceru mezi ligand a základní řetězec hyaluronanu může být s výhodou také použito v případě, kdy jsou mechanické vlastnosti hydrogelů závislé na koncentraci enzymu použitého jako katalyzátoru síťovací reakce. Zavedením flexibilního spaceru mezi ligand a základní řetězec hyaluronanu je u reaktivních skupin derivátu polymeru zajištěna, a to i po částečném zesítění polymeru, dostatečná sterická přístupnost reaktivních skupin pro vzájemnou dimerizaci.

Toto řešení má za následek zefektivnění síťovací reakce, což se projevuje dosažením vyšší homogenity připravených hydrogelů a vede tak k překonání technologických problémů spojených se zasítěním hyaluronanu modifikovaného hydroxyfenylem či heteroarylfenolem (tyraminem, serotoninem aj.) v případě, že síťovacími činidly jsou křenová peroxidáza a peroxid vodíku (či jiný typ generátoru fenoxyradikálů).

Překvapivě jsme ale navíc zjistili, že zavedení námi zvolených spacerů mezi ligand a základní řetězec hyaluronanu vede i při velice nízkém stupni substituce k výraznému navýšení hodnot elasticity, houževnatosti a pevnosti výsledného hydrogelů na bázi tohoto derivátu HA.

Dále se vynález týká využití hydrogelů na bázi derivátů podle vynálezu, a to především v oblasti tkáňového inženýrství, kosmetice, medicíně a regenerativní medicíně. Využití hydrogelů popisovaných v tomto vynálezu je cíleno zejména na základní materiál pro tvorbu scaffoldů ve tkáňovém inženýrství, především do oblasti léčby kloubních a kostních defektů, jako krytí pro hojení ran, jako biodegradabilní bariéra bránící vzniku pooperačních srůstů, k augmentaci měkkých tkání a výplně tkáňových defektů apod. Při použití hydrogelů jakožto materiálu pro scaffoldy se může jednat o scaffoldy oseté nebo neoseté. U osetých scaffoldů se typ buněk, které se zabudují do scaffoldů, volí dle cíleného místa aplikace.

Přehled obrázků na výkresech

Obr. 1 Znázorňuje deformaci vlastnosti („stress-strain“ křivky) získané v rámci měření deformace hydrogelů na bázi derivátů připravených dle příkladu VII, IX, XI a XII v kompresi.

Příklady provedení vynálezu

1. Příklad syntézy derivátů

Syntéza derivátů hyaluronanu probíhala v několika krocích (viz schéma 1). Prvním žních je příprava aldehydického derivátu hyaluronanu (příklad 1.7). Dalším krokem je syntéza různých meziproduktů spacer-ligand (příklady 1.1 až 1.6), které byly následně navázány na hyaluronan procesem reduktivní aminace (příklady 1.9 až 1.14).

-7CZ 303879 B6

Součástí příkladů je i syntéza derivátů hyaluronanu, ve kterých je ligand (tyramin, hydroxytryptofan) vázán přímo na polysacharid bez využití spaceru (příklady VIII). Tento derivát a z něj připraveného hydrogelu sloužily k porovnání vlastností s deriváty popisovanými v tomto vynálezu (deriváty HA-spacer-ligand- deriváty IX až XIV).

Příklad 1.1: Syntéza 6-amino-A-[2-(4-hydroxyfenyl)ethyl]hexanamidu (meziprodukt spacerligand (I))

6-[(Zerí-butoxykarbonyl)amino]hexanová kyselina (1,00 g, 4,3 mmol) byla rozpuštěna v 50 ml tetrahydrofuranu (THF). K roztoku kyseliny byl přidán 1,1‘-karbodiimidazol (0,70 g, 4,3 mmol). Směs byla zahřívána na 50 °C po dobu šedesáti minut. Poté byla reakční nádoba promyta inertním plynem. K reakční směsi byl přidán tyramin (0,59 g, 4,3 mmol). Směs byla dále zahřívána další 2 hodiny. Poté byl destilací za sníženého tlaku odstraněn THF. Odparek byl rozpuštěn v 50 ml ethylacetátu. Roztok byl promyt 150 ml čištěné vody (rozděleno do tří dílů). Organická vrstva byla vysušena nad molekulovým sítem. Ethylacetát byl odstraněn destilací za sníženého tlaku. Odparek byl rozpuštěn v 50 ml MeOH a k roztoku byly přidány 2 ml trifluoroctové kyseliny (TFA). Roztok byl zahříván 6 hodin pod zpětným chladičem. Rozpouštědlo bylo odstraněno destilací za sníženého tlaku. Odparek byl rozpouštěn v 50 ml ethylacetátu. Roztok byl promyt 150 ml čištěné vody (rozděleno do tří dílů). Organická vrstva byla vysušena nad molekulovým sítem. Ethylacetát byl odstraněn destilací za sníženého tlaku.

m = 0,75 g (70 % teorie).

’H NMR (D₂O, pm) δ: 1,17 (m, 2H, y-CH₂-hexanové kyseliny); 1,48 (m, 2 H, [3-CH₂-hexanové kyseliny); 1,58 (m, 2 H, 6-CH₂-hexanové kyseliny); 2,17 (t, 2 H,-CH₂-CO-); 2,73 (m, 2 H, -CH₂-Ph); ,91 (m, 2 H, -CH₂-NH₂); 3,42 (m, 2 H, -CH₂-NH-CO-); 6,83 (d, 2 H, arom.); 7,13 (d, 2 H, arom.).

¹³C NMR (D₂O, ppm) δ: 24 (γ-C-hexanové kyseliny); 26 (δ-C-hexanové kyseliny); 33 (β-Chexanové kyseliny); 35 (-C-CO-); 39 (C-NH₂); 40 (C-Ph); 63 (-C-NH-CO-); 115 (C3 arom.); 126 (Cl AROM); 130 (C2 arom.); 153 (C4 arom.); 176 (-CO-).

Příklad 1.2: Syntéza 4-amino-2V-[2-(4-hydroxyfenyl)ethyl]butanamidu (meziprodukt spacerligand (II))

4-[(fórt-butoxykarbonyl)amino]butonová kyselina (0,50 g, 2,5 mmol) byla rozpuštěna v 25 ml tetrahydrofuranu (THF). K roztoku kyseliny byl přidán 1,1‘-karbodiimidazol (0,40 g, 25 mmol). Směs byla zahřívána na 50 °C po dobu šedesáti minut. Poté byla reakční nádoba promyta inertním plynem. K reakční směsi byl přidán tyramin (0,34 g, 25 mmol). Směs byla dále zahřívána další 2 hodiny. Poté byl destilací za sníženého tlaku odstraněn THF. Odparek byl rozpuštěn v 50 ml ethylacetátu. Roztok byl promyt 150 ml čištěné vody (rozděleno do tří dílů). Organická vrstva byla vysušena nad molekulovým sítem. Ethylacetát byl odstraněn destilací za sníženého tlaku. Odparek byl rozpuštěn v 50 ml MeOH a k roztoku byly přidány 2 ml trifluoroctové kyseliny (TFA). Roztok byl zahříván 6 hodin pod zpětným chladičem. Rozpouštědlo bylo odstraněno destilací za sníženého tlaku. Odparek byl rozpouštěn v 50 ml ethylacetátu. Roztok byl promyt 150 ml čištěné vody (rozděleno do tří dílů). Organická vrstva byla vysušena nad molekulovým sítem. Ethylacetát byl odstraněn destilací za sníženého tlaku.

m = 0,44 g (80 % teorie)

-8CZ 303879 B6 *H NMR (D₂O, ppm) δ: 1,75 (m, 2 H, p-CH₂-butanové kyseliny); 2,16 (t, 2 H, -CH₂-CO-); 2,59 (m, 2H, -CH₂-In); 2,78 (m, 2 H, -CH₂-NH₂); 3,20 (m, 2 H, -CH₂-NH-CO-); 6,69 (d, 2 H, arom.); 6,99 (d, 2 H, arom.).

¹³C NMR (D₂O, ppm) δ: 23 (β-C-butanové kyseliny); 25 (t, 2 H, -C-CO-); 32 (-C-NH₂); 45 (CH₂-Ar); 60 (-C-NH-CO-); 115 (C3 arom.); 117 (Cl arom.); 129 (C2 arom.); 155 (C4 arom.); 171 (-CO-).

Příklad 1.3: Syntéza 8-amino-A-[2-(4-hydroxyfenyl)ethyl]oktanamidu (meziprodukt spacerligand (III))

8-[(/er/-butoxykarbonyl)amino]oktanová kyselina (0,50 g, 1,9 mmol) byla rozpouštěna v 25 ml tetrahydrofuranu (THF). K roztoku kyseliny byl přidán l,l‘-karbodiimidazol (0,31 g, 1,9 mmol). Směs byla zahřívána na 50 °C po dobu šedesáti minut. Poté byla reakční nádoba promyta inertním plynem. K reakční směsi byl přidán tyramin (0,26 g, 1,9 mmol). Směs byla dále zahřívána dalších 6 hodin. Poté byl destilací za sníženého tlaku odstraněn THF. Odparek byl rozpuštěn v 50 ml ethylacetátu. Roztok byl promyt 150 ml čištěné vody (rozděleno do tří dílů). Organická vrstva byla vysušena nad molekulovým sítem. Ethylacetát byl odstraněn destilací za sníženého tlaku. Odparek byl rozpuštěn v 50 ml MeOH a k roztoku byly přidány 2 ml trifluoroctové kyseliny (TFA). Roztok byl zahříván 6 hodin pod zpětným chladičem. Rozpouštědlo bylo odstraněno destilací za sníženého tlaku. Odparek byl rozpuštěn v 50 ml ethylacetátu. Roztok byl promyt 150 ml čištěné vody (rozděleno do tří dílů). Organická vrstva byla vysušena nad molekulovým sítem. Ethylacetát byl odstraněn destilací za sníženého tlaku.

m = 0,40 g (75 % teorie) 'H NMR (CDC1₃, ppm) δ: 1,16-1,34 (m, 6 H, C4 až C6 -CH₂-oktanové kyseliny); 1,56-1,44 (m, 4 H, 3C a C7 oktanové kyseliny); 2,58 (m, 2 H, -CH₂-Ar); 2,78 (m, 2 H, -CH₂-NH₂); 3,19 (m, 2 H, -CH2-NH-CO-); 6,68 (d, 2 H, arom.); 6,98 (d, 2 H, arom.).

¹³C NMR (CDCI3, ppm) δ: 21 (C7 oktanové kyseliny); 24 (C4 oktanové kyseliny); 26 (C6oktanové kyseliny); 28 (C5-oktanové kyseliny); 33 (C3-oktanové kyseliny); 35 (-C-CO-); 39 (-C-NH₂); 40 (C-Ph); 63 (-C-NH-CO-); 115 (C3 arom.); 126 (Cl arom.); 130 (C2 arom.); 153 (C4 arom.); 176 (-CO-).

Příklad 1.4: Syntéza 4-amino-V-[2-(5-hydroxy-l H-indol-3-yl)ethyl]butanamidu (meziprodukt spacer-ligand (IV))

4-[(/er/-butoxykarbonyl)amino]butanová kyselina (0,50 g, 2,5 mmol) byla rozpouštěna ve 25 ml VW-dimethylformamidu (DMF). K roztoku kyseliny byl přidán 1,1‘-karbodiimidazol (0,40 g, 2,5 mmol). Směs byla zahřívána na 50 °C po dobu šedesáti minut. Poté byla reakční nádoba promyta inertním plynem. K reakční směsi byl přidán roztok 5-hydroxytryptamin hydrochloridu (0,52 g, 2,5 mmol) a triethylaminu (0,68 ml; 4,9 mmol) ve 25 ml DMF. Směs byla dále zahřívána další 2 hodiny. Směs zředěna přídavkem ethylcetátu (100 ml). Vzniklý roztok byl promyt 300 ml čištěné vody (rozděleno do tří dílů). Organická vrstva byla vysušena nad molekulovým sítem. Ethylacetát byl odstraněn destilací za sníženého tlaku. Odparek byl rozpuštěn v 50 ml MeOH a k roztoku byly přidány 2 ml trifluoroctové kyseliny (TFA). Roztok byl zahříván 6 hodin pod zpětným chladičem. Rozpouštědlo bylo odstraněno destilací za sníženého tlaku. Odparek byl rozpouštěn v 50 ml ethylacetátu. Roztok byl promyt 150 ml čištěné vody (rozděleno do tří dílů). Organická vrstva byla vysušena nad molekulovým sítem. Ethylacetát byl odstraněn destilací za sníženého tlaku.

-9CZ 303879 B6 m = 0,43 g (65 % teorie) 'M NHR: (DMSO, ppm) δ: 1,77 (m, 2 H, (3-CH₂-butanové kyseliny); 2,20 (t, 2 H, -CH₂-CO-); 2,73 (m, 2 H, -CH₂-In); 2,81 (m, 2 H, -CH₂-NH₂); 3,30 (m, 2 H, -CH₂-NH-CO-); 6,60 (d, 1 H, C6-arom); 6,82 (s, 1 H, C4-arom); 7,03 (s, 1 H, C2-arom); 7,13 (d, 1 H, C7-arom).

¹³C NMR (DMSO, ppm) δ: 23 (β-C-butanové kyseliny); 25 (t, 2 H, -C-CO—); 32 (-C-NH₂); 39 (CH₂-In); 60 (-C-NH-CO-); 102 (C4 arom.); 110 (C6 arom.); 111 (C7 arom.); 111 (C3 arom.); 123 (C2 arom.); 127 (C7- C-NH-arom); 113 (C4-C-C3- arom.); 150 (C5 arom.); 171 (-CO-).

Příklad 1.5: Syntéza 6-amino-V-[2-(5-hydroxy-lH-indol-3-yl)ethyl]hexanamidu (meziprodukt spacer-ligand (V))

6-[(fór/-butoxykarbonyl)amino]hexanová kyselina (1,00 g, 4,3 mmol) byla rozpuštěna v 50 ml VV-dimethylformamidu (DMF). K roztoku kyseliny byl přidán 1,1‘-karbodiimidazol (0,70 g, 4,3 mmol). Směs byla zahřívána na 50 °C po dobu šedesáti minut. Poté byla reakční nádoba promyta inertním plynem. K reakční směsi byl přidán roztok 5-hydroxytryptamin hydrochloridu (0,91 g, 4,3 mmol) a triethylaminu (0,68 ml, 49 mmol) ve 25 ml DMF. Směs byla dále zahřívána dalších 6 hodin. Směs byla zředěna přídavkem ethylacetátu (100 ml). Vzniklý roztok byl promyt 300 ml čištěné vody (rozděleno do tří dílů). Organická vrstva byla vysušena nad molekulovým sítem. Ethylacetát byl odstraněn destilací za sníženého tlaku. Odparek byl rozpouštěn v 50 ml MeOH a k roztoku byly přidány 2 ml trifluoroctové kyseliny. (TFA). Roztok byl zahříván 6 hodin pod zpětným chladičem. Rozpouštědlo bylo odstraněno destilací za sníženého tlaku. Odparek byl rozpuštěn v 50 ml ethylacetátu. Roztok byl promyt 150 ml čištěné vody (rozděleno do tří dílů). Organická vrstva byla vysušena nad molekulovým sítem. Ethylacetát byl odstraněn destilací za sníženého tlaku.

m = 0,75 g (60 % teorie) ’H NMR: (DMSO, ppm) δ 1,17 (m, 2 H, y-CH₂-hexanové kyseliny); 1,48 (m, 2 H, (3-CH₂hexanové kyseliny); 1,58 (m, 2 H, ó-CH₂-hexanové kyseliny); 2,17 (t, 2 H, -CH₂-CO-); 2,73 (m, 2 H, -CH₂-In); 2,91 (m, 2 H, -CH₂-NH₂); 3.42 (m, 2 H, -CH₂-NH-CO-); 6,60 (d, 1 H, C6arom); 6,82 (s, 1 H, C4-arom); 7,03 (s, 1 H, C2-arom); 7,13 (d, 1 H, C7-arom).

^I3C NMR (DMSO, ppm) δ: 24 (γ-C-hexanové kyseliny); 26 (δ-C-hexanové kyseliny); 33 (β-Chexanové kyseliny); 35 (-C-CO-); 39 (-C-NH₂); 40 (C-In); 63 (-C-NH-CO-); 102 (C4 arom.); 110 (C6 arom.); 111 (C7 arom.); 111 (C3 arom.); AS3 (C2 arom.); 127 (C7- C-NH-arom); 131 (C4-C-C3-arom); 150 (C5 arom.); 171 (-CO-).

Příklad 1.6: Příprava 2-[(6-aminohexanoyl)amino]-3-(5-hydroxy-l/7-indol-3-yl)-propanové kyseliny (meziprodukt spacer-ligand VI)

6-[(ter/-butoxykarbonyl)amino]hexanová kyselina (0,50 g, 2,2 mmol) byla rozpuštěna v 50 ml tetrahydrofuranu (THF). K roztoku kyseliny byl přidán 1,1‘-karbodiimidazol (0,35 g, 2,2 mmol). Směs byla zahřívána na 50 °C po dobu šedesáti minut. Poté byla reakční nádoba promyta inertním plynem. K reakční směsi byl přidán 5-hydroxytryptofan (0,48 g, 2,2 mmol). Směs byla dále zahřívána dalších 6 hodin. Směs byla zředěna přídavkem ethylacetátu (100 ml). Vzniklý roztok byl promyt 300 ml čištěné vody (rozděleno do tří dílů). Organická vrstva byla vysušena nad molekulovým sítem. Ethylacetát byl odstraněn destilací za sníženého tlaku.

-10CZ 303879 B6

Odparek byl rozpuštěn v 50 ml MeOH a k roztoku byly přidány 2 ml trifluoroctové kyseliny (TFA). Roztok byl zahříván 6 hodin pod zpětným chladičem. Rozpouštědlo bylo odstraněno destilací za sníženého tlaku. Odparek byl rozpuštěn v 50 ml ethylacetátu. Roztok byl promyt 150 ml čištěné vody (rozděleno do tří dílů). Organická vrstva byla vysušena nad molekulovým sítem. Ethylacetát byl odstraněn destilací za sníženého tlaku.

m = 0,62 g (85 % teorie) 'HNMR: (DMSO, ppm) δ: 1,17 (m, 2 H, y-CH₂-hexanové kyseliny); 1,48 (m, 2H, fi-CH₂hexanové kyseliny); 1,58 (m, 2 H, 8-CH₂-hexanové kyseliny); 2,19 (t, 2 H, -CH₂-CO-); 2,51 (m, 2 H, -CH₂-In); 2,90 (m, 2 H, -CH₂-NH₂); 3,81 (m, 2 H, -CH₂-NH-CO-); (m, 2 H, -CH₂-NHCO-); 6,61 (d, 1 H, C6-arom); 6,95 (s, 1 H, C4-arom); 7,02 (s, 1 H, C2-arom); 7,13 (d, 1 H, C7arom).

¹³C NMR (DMSO, ppm) δ: 24 (γ-C-hexanové kyseliny); 26(ó-C-hexanové kyseliny; 33 (β-Chexanové kyseliny); 35 (-C-CO-); 39 (-C-NH₂); 40 (C-Ph); 55 (-C-NH-CO-); 102 (C4 arom.); 110 (C6 arom.); 111 (C7 arom.); 111 (C3 arom.); 123 (C2 arom.); 127 (C7 - C-NHarom.); 131 (C4-C-C3-arom.); 150 (C5 arom.); 171 (-CO-).

Příklad 1.7: Příprava aldehydického derivátu (HA-CHO) - obecný postup (VII)

Hylauronan (10,00 g, M_w = 2 MDa) byl rozpuštěn v 750 ml 2,5% (w/w) roztoku Na₂HPO4. 12 H₂O. Roztok byl vychlazen na 5 °C. K vzniklému roztoku bylo přidáno 2,60 g NaBr a 0,05 g 4acetamido-2,2,6,6-tetramethylpiperidin-l-oxylu. Po důkladné homogenizaci roztoku byly k reakční směsi přidány 3 ml roztoku NaClO (10-15 % dostupného Cl₂). Reakce pokračovala za stálého míchání 15 minut. Reakce byla ukončena přídavkem 100 ml 40% roztoku propan-2-olu. Produkt byl přečištěn ultrafiltrací a izolován precipitací propan-2-olem.

IČ (KBr): 3417, 2886, 2152, 1659, 1620, 1550, 1412, 1378, 1323, 1236, 1204, 1154, 1078, 1038, 945, 893 cm'¹ *H NMR (D₂O) δ: 2,01 (s, 3 H, CH3-); 3,37 - 3,92 (m, skelet hyaluronanu), 4,46 (s, 1H, anomer.), 4,54 (s, 1H anomer., -O-CH(OH)-), 5,27 (geminální glykol-CH-(OH)₂).

Příklad 1.8: Syntéza tyraminového derivátu (VIII)

Aldehydický derivát HA (VII) (5,00 g) byl rozpuštěn v 500 ml demineralizované vody. Pomocí kyseliny octové bylo pH roztoku upraveno na 3. Následně byl k reakční směsi přidán tyramin (1,70 g) ve formě roztoku ve 100 ml 40% propan-2-olu. Směs byla dále míchána po dobu 1 hodiny při laboratorní teplotě. Dále byl ke směsi přidán roztok pikolin-boran komplexu (0,50 g) v 50 ml 40% propan-2-olu. Reakční směs byla dále míchána 12 hodin při laboratorní teplotě. Nízkomolekulámí balastní látky byly z produktu odstraněny ultrafiltrací. Produkt byl získán precipitací propan-2-olem. Precipitát byl zbaven vlhkosti a zbytkového propan-2-olu sušením v horkovzdušné sušárně (40 °C, 3 dny).

IČ (KBr):: 3400, 2893, 2148, 1660, 1620, 1549, 1412, 1378, 1323, 1236, 1204, 1154, 1078, 1038, 945, 893 cm'¹ ’H NMR (D₂O) δ: 2,01 (s, 3 H, CH₃,2,66-2,77 (m, 4 H, -CH₂-CH₂-NH~), 3,00 (s, 1H, H-CHNH-), 3,37-3,93 (m, skelet hyaluronanu), 4,46 (s, 1H, anomer.), 4,54 (s, 1H anomer., -OCH(OH)-), 6,59 (d, 2H, arom.), 7,04 (d, 2H, arom.).

-11 CZ 303879 B6

Příklad 1.9: Příprava tyraminováného derivátu HA s C₆ spacerem (IX)

Aldehydický derivát HA (VII) (5,00 g) byl rozpuštěn v 500 ml demineralizované vody. Pomocí kyseliny octové bylo pH roztoku upraveno na 3. K roztoku HA-CHO byl přidán 6-amino-V-[2-(4-hydroxyfenyl)ethyl]hexanamid (meziprodukt (I)) (0,625 g,

2,5 mmol). Směs byla míchána 2 hodiny při laboratorní teplotě. Poté byl do reakční směsi přidán komplex pikolin-boran (0,270 g, 2,5 mmol). Směs byla míchána dalších 12 hodin při laboratorní teplotě. Produkt byl přečištěn ultrafiltrací a izolován z retentátu precipitací propan-2-olem. Precipitát byl zbaven vlhkosti a zbytkového propan-2-olu sušením v horkovzdušné sušárně (40 °C, 3 dny).

IČ (KBr):: 3425, 2893, 2148, 1660, 1620, 1549, 1412, 1378, 1323, 1236, 1204, 1154, 1078, 1038, 945,893 cm’¹.

'Η NMR (D₂O) δ 1,25 (t, 2 H, y-CH₂-aminohexanové kyseliny), 1,48 (m, 2 Η, δ -CH₂aminohexanové kyseliny) 1,51 (m, 2 H, f3-CH₂-aminohexanové kyseliny), 2,01 (s, 3 H CH3-),

2,65 (m, 2H, Ph-CH₂_), 2,73 (m, 2H, e-CH₂-aminohexanové kyseliny), 3,37-3,93 (m, skelet hyaluronanu), 4,46 (s, 1H, anomer.), 4,54 (s, 1H anomer., -O-CH(OH)-), 6,59 (D, 2H, arom.), 7,01 (d, 2H. arom.).

Příklad 1.10: Příprava derivátu HA s C₄ spacerem a 5-hydroxytryptaminem (X)

Aldehydický derivát HA (VII) (3,00 g) a Na₂HPO₄. 12 H₂O (7,50 g) byl rozpouštěn v 300 ml demiralizované vody. K roztoku Ha-CHO byl přidán 4-amino-A-[2-(5-hydroxy-l A-indol-3yl)ethyl]butanamid (0,40 g, 1,5 mmol) - (meziprodukt (IV)). Směs byla míchána 2 hodiny při laboratorní teplotě. Poté byl do reakční směsi přidán komplex pikolin-boran (0,16 g, 1,5 mmol). Směs byla míchána dalších 12 hodin při laboratorní teplotě. Produkt byl přečištěn ultrafiltrací a izolován z retentátu precipitací propan-2-olem. Precipitát byl zbaven vlhkosti a zbytkového propan-2-olu sušením v horkovzdušné sušárně (40 °C, 3 dny).

IČ (KBr):: 3400, 2893, 2148, 1660, 1620, 1549, 1412, 1323, 1236, 1204, 1154, 1078, 1038, 945,893 cm'¹.

'Η NMR (D₂O) δ: 1,73 (m, 2H, β -CH₂-aminobutanové kyseliny), 2,01 (s, 3 H, CH₃), 2,60 (m, 2H, y-CH₂-aminobutanové kyseliny), 2,93 (m, 2H, Ind-CH₂-), 3,37-3,93 (m, skelet hyaluronanu), 4,46 (s, 1H, anomer.), 4,54 (s, 1H anomer., -O-CH(OH)-), 6,85 (d, 1H, arom.), 7,09 (s, 1H. arom.), 7,21 (s, 1H. arom.), 7,40 (s, 1H. arom.).

Příklad 1.11: Příprava tyraminového derivátu HA s C₄ spacerem (XI)

Aldehydický derivát HA (VII) (3,50 g) byl rozpuštěn v 350 ml demineralizované vody. Pomocí kyseliny octové bylo pH roztoku upraveno na 3. K roztoku HA-CHO byl přidán 4-amino-V-[2(4-hydroxyfenyl)ethyl]butanamid (0,40 g, 1,8 mmol) - (meziprodukt (II)). Směs byla míchána 2 hodiny při laboratorní teplotě. Poté byl do reakční směsi přidán komplex pikolin-boran (0,19 g, 1,8 mmol). Směs byla míchána dalších 12 hodin při laboratorní teplotě. Produkt byl přečištěn ultrafiltací a izolován z retentátu precipitací propan-2-olem. Precipitát byl zbaven vlhkosti a zbytkového propan-2-olu sušením v horkovzdušné sušárně (40 °C, 3 dny).

IČ (KBr):: 3425, 2893, 2148, 1600, 1620, 1549, 1412, 1378, 1323, 1236, 1204, 1154, 1078, 1038, 945,893 cm'¹.

- 12CZ 303879 Β6 *Η NMR (D₂O) δ: 1,25 (t, 2 H, y-CH₂-aminohexanové kyseliny), 1,48, (m, 2H, δ-Ο1₂aminohexanové kyseliny), 1,51 (m, 2 H, p-CH₂-aminohexanové kyseliny), 2,01 (s, 3H, CH₃-),

2,65 (m, 2H, pH-CH₂-), 2,73 (m, 2H, s-CH₂-aminohexanové kyseliny), 3,37 -3,93 (m, skelet hyaluronanu), 4,46 (s, IH, anomer.), 4,54 (s, IH anomer., -O-CH(OH)-), 6,59 (d, 2H, arom.), 7,01 (d, 2H. arom.).

Příklad 1.12: Příprava tyraminovaného derivátu HA s C₈ spacerem (XII)

Aldehydický derivát HA (VII) (2,90 g) byl rozpuštěn ve 300 ml demineralizované vody. Pomocí kyseliny octové bylo pH roztoku upraveno na 3. K roztoku HA-CHO byl přidán 8-amino-V-[2(4-hydroxyfenyl)ethyl]oktanamid (0,40 g, 1,4 mmol) - (meziprodukt (III)). Směs byla míchána 2 hodiny při laboratorní teplotě. Poté byl do reakční směsi přidán komplex pikolin-boran (0,15 g, 1,4 mmol). Směs byla míchána dalších 12 hodin při laboratorní teplotě. Produkt byl přečištěn ultrafiltrací a izolován z retentátu precipitací propan-2-olem. Precipitát byl zbaven vlhkosti a zbytkového propan-2-olu sušením v horkovzdušné sušárně (40 °C, 3 dny).

IČ (KBr).. 3425, 2893,2148, 1660, 162é, 1549, 1412, 1378, 1323, 1236, 1204, 1154, 1078, 1038, 945, 893 cm'¹ ’HNMR (D₂O) δ: 1,16-1,34 (m, 6 H, C4 až C6 -CH₂-oktanové kyseliny); 1,56-1,44 (m, 4H, C3 a C7 oktanové kyseliny); 2,01 (s, 3H, CH₃-), 2,58 (m, 2H, -CH₂-Ar); 2,78 (m, 2H -CH₂-NH-), 3,37 -3,93 (m, skelet hyaluronanu), 4,46 (s, IH, anomer.), 4,54 (s, IH, anomer., -O-CH(OH)-), 6,59 (d, 2H, arom.), 7,01 (d, 2H. arom.).

Příklad 1.13: Příprava derivátu HA s Có spacerem a 5-hydroxytryptaminem (XIII)

Aldehydický derivát HA (VII) (5,00 g) a Na₂HPO4. 12 H₂O (12,5 g) byl rozpuštěn v 500 ml demineralizované vody. K roztoku NA-CHO byl přidán 6-amino-V-[2-(5-hydroxy-l//-indol3-yl)ethyl]hexanamid (0,73 g, 2,5 mmol) - (meziprodukt (V)). Směs byla míchána 2 hodiny při laboratorní teplotě. Poté byl do reakční směsi přidán komplex pikolin-boran (0,27 g, 2,5 mmol). Směs byla míchána dalších 12 hodin při laboratorní teplotě. Produkt byl přečištěn ultrafiltrací a izolován z retentátu precipitací propan-2-olem. Precipitát byl zbaven vlhkosti a zbytkového propan-2-olu sušením v horkovzdušné sušárně (40 °C, 3 dny).

IČ (KBr):: 3400, 2893, 2148, 1660, 1620, 1549, 1412, 1378, 1323, 1236, 1204, 1154, 1078, 1038, 945, 893 cm'¹.

’H NMR (D₂O) δ: 1,25 (t, 2 H, y-CH₂-aminohexanové kyseliny), 1,48 (m, 2 Η, δ -CH₂aminohexanové kyseliny) 1,51 (m, 2 H, 3-CH₂-aminohexanové kyseliny), 2,01 (s, 3 H, CH₃-),

2,65 (m, 2H, Ph-CH₂-), 2,73 (m, 2H, a-CH₂- aminohexanové kyseliny), 3,37-3,92 (m, skelet hyaluronanu), 4,46 (s, IH, anomer.), 4,54 (s, IH anomer., -O-CH(OH)-), 6,85 (d, IH, arom.), 7,09 (s, IH, arom.)., 7,21 (s, IH, arom.), 7,40 (s, IH, arom.).

Příklad 1.14: Příprava derivátu HA s C₆ spacerem a 5-hydroxytryptofanem (XIV)

Aldehydický derivát HA (VII) (3,50 g) a Na₂HPO₄ . 12 H₂O (8,75 g) byl rozpouštěn v 350 ml demineralizované vody. K roztoku HA-CHO byl přidán 2-[(6-aminohexanoyl)amino]-3-(5hydroxy-lH-indol-3-yl)propanové kyseliny (0,60 g, 1,8 mmol) - (meziprodukt (VI)). Směs byla míchána 2 hodiny při laboratorní teplotě. Poté byl po reakční směsi přidán komplex pikolinboran (0,19 g, 1,8 mmol). Směs byla míchána dalších 12 hodin při laboratorní teplotě. Produkt

-13CZ 303879 B6 byl přečištěn ultrafiltrací a izolován z retentátu precipitací propan-2-olem. Precipitát byl zbaven vlhkosti a zbytkového propan-2-olu sušením v horkovzdušné sušárně (40 C, 3 dny).

IČ (KBr):: 3400, 2893, 2148, 1660, 1620, 1549, 1412, 1378, 1323, 1236, 1204, 1154, 1078, 1038, 945,893 cm'¹.

'H NMR (D₂O) δ: 1,25 (t, 2H, y-CH₂-aminohexanové kyseliny), 1,48 (m, 2H, 6-CH₂-aminohexanové kyseliny) 1,51 (m, 2 H, (3-CH₂-aminohexanové kyseliny), 2,01 (s, 3H, CH₃-), 2,65 (m, 2H, Ph-CH₂-), 2,73 (m, 2H, 8-CH₂-aminohexanové kyseliny), 3,37-3,93 (m, skelet hyaluronanu), 4,46 (s, 1H, anomer.), 4,54 (s, 1H, anomer., -O-CH(OH)-), 6,85 (d, 1H, arom.), 7,09 (s, 1H. arom.), 7,21 (s, 1H. arom.). 7,40 (s, 1H, arom.)

Příklad 1.15: Obecný postup přípravy hydrogelu na bázi derivátu HA se spacerem a 5-hydroxytryptofanem a na bázi tyraminovaného derivátu

Vybraný derivát HA je rozpuštěn v 0,lM PBS pH 7,4. Množství derivátu je voleno dle požadované koncentrace. K roztoku derivátu je přidáno požadované množství enzymu. Po důkladné homogenizaci je přidán zředěný roztok peroxidu vodíku. Směs je opět homogenizována a dochází ke vzniku transparentního gelu.

Příklad 1.16: Příprava hydrogelu na bázi tyraminového derivátu až 60 mg (dle požadované koncentrace roztoku polymeru) derivátu HA připraveného dle příkladu 1.8 (VIII) je rozpouštěno ve 2 ml 0,lM PBS o Ph 7,4. K roztoku derivátu je přidáno 20 μΐ roztoku enzymu HRP (24 mg enzymu HRP rozpuštěné v 1 ml 0,1 M PBS o PH 7,4). Po důkladné homogenizaci je přidáno 100 μΐ roztok H₂O₂ (33 μΐ 30% H₂O₂ rozpuštěno v 10 ml 0,lM PBS o PH 7,4). Směs je zhomogenizována a dochází ke vzniku transparentního gelu

Příklad 1.17 Příprava hydrogelu na bázi tyraminového derivátu HA se spacerem až 60 mg (dle požadované koncentrace roztoku polymeru) derivátu HA připraveného dle příkladu 1.9 (IX), 1.11 (XI) nebo 1.12 (XII) je rozpuštěn v 2 ml 0,lM PBS o PH 7,4. K roztoku derivátu je přidáno 10μ1 roztoku enzymu HPR (2,4mg enzymu HRP rozpuštěné v lml 0,lM PBS o pH 7,4). Po důkladné homogenizaci je přidáno 100 μΐ roztoku H₂O₂ (33μ1 30% H₂O₂ rozpuštěno v 10 ml 0,lM PBS o pH 7,4). Směs je zhomogenizována a dochází ke vzniku transparentního gelu.

2. Rozdíly ve vlastnostech hydrogelů

Příklad 2.1: Rozdíl v mechanických vlastnostech hydrogelu v závislosti na typu použitého derivátu HA a množství přidaného enzymu

V závislosti na typu použitého derivátu byly dle příkladů 1.16 nebo 1.17 připraveny vzorky hydrogelů z derivátů VIII (tyraminový bez vložení spaceru), IX, XI a XII (s vloženým spacerem). Vzorky byly po důkladné homogenizaci ponechány po dobu 120 minut dozrát při laboratorní teplotě. Anology derivátů použité pro přípravu porovnávaných hydrogelů se vždy vyznačovaly srovnatelnou molekulovou hmotností a stupněm substituce. Všechny vzorky měly stejné rozměry a byly proměřovány za konstantních laboratorních podmínek (teplota, tlak, vlhkost).

- 14CZ 303879 B6

U vzorků byl stanovován Youngův modul pružnosti v kompresi, houževnatost, mez pevnosti v kompresi a odpovídající deformace vzorku; rámci viskoelastických vlastností vzorků potom modul pružnosti ve smyku a ztrátový úhel.

Ze získaných výsledků jasně vyplývá, že zavedení flexibilního spaceru mezi ligand a základní řetězec hyaluronanu vede k dosažení vyšší elasticity, houževnatosti a pevnosti hydrogelů na bázi těchto derivátů, oproti hydrogelům na bázi analogických derivátů hyaluronanu bez spaceru.

Tab. 1 Znázorňuje porovnání mechanických vlastností hydrogelu v závislosti na typu použitého derivátu pro jeho přípravu. Koncentrace (%) znamená koncentrace polymeru v roztoku, z nějž se hydrogel připravil, stupeň substituce (%) udává stupeň substituce reaktivním/síťovacím ligandem, tj. počet navázaných ligandů na 100 strukturních jednotek polymeru, kde v případě HA je strukturní jednotkou polymeru míněn disacharid (neboli dimer) glykosamin+kyselina glukuronová.

Tab. 1

Typ použitého derivátu	Derivát HA dle příkladu vra	Derivát HA dle příkladu IX	Derivát HA dle příkladu vra	Derivát HA dle příkladu XI	Derivát HA dle příkladu XII
Mw (kDa) / koncentrace (%)	320/3	250/3	280/2	280/2	285/2
Stupeň substituce (%)		3	llliill!	1	1
Youngův modul pružnosti v kompresi (kPa)	IliOlllli	5,68	8,99	3,87	8,19
Mez pevnosti (kPa)		310	108	167	218
Deformace v mezi pevnosti (%)		68		65	65
Houževnatost (J/m³)	9150	23460	8050	9670	13650
Ztrátový úhel (°)	0,12	0,18	0,19	0,96	0,43
Modul pružnosti ve smyku (Pa)	1861	1534	lilflllllll	504	1105

1. Slaughter, B.V.,; Khurshid, S.S.; Fisher, O.Z.; Khademhosseini, A.; Peppas, N.A., Hydrogels in Regenerative Medicine. Advanced Materials 2009,21 (32-33), 3307-3329.

2. Benedetti, F.; Cortivo, R.; Berti, T.; Berti, A.; Pea, F.; Mazzo, M.; Moras, M.; Abatangelo, G., Biocompatibility and biodegradation of different hyaluronan derivatives (Hyaff) implanted in rats. Biomaterials 1993,14 (15), 1154-1160.

3. Calabro, A.,; Gross, R.A.; Darr, A.B. Hydroxyphenyl cross-linked macromolecular network and applications thereof. 2004.

4. Calabro, A.; Akst, L.; Alam, D.; Chán, J.; Darr, A.B.; Fukamachi, K.; Gross, R.A.; Haynes, D.; Kamohara, K.; Knott, D.P.; Fewis, H.; Melamund, A.; Miniaci, A.; Strome, M. Hydroxyphenyl cross-linked macromolecular network and applications thereof. 2008 (W02006/010066).

- 15CZ 303879 B6

5. Tan, H.; Chu, C. R.; Payne, K.A.; Marra,K.G., Injectable in šitu forming biodegradable chitosan-hyaluronic acid based hydrogels for cartilage tissue engineering. Biomaterials 2009, 30 (13), 2499-2506.

6. Darr, A.; Calabro, A., Synthesis and characterization of tyramine-based hyaluronan hydrogels. Journal of Materials Science: Materials in Medicine 2009, 20 (1), 33-44.

7. Kurisawa, M.; Lee, F.; Chung, J.E. Formation of Hydrogel in the Presence of Peroxidase and Low Concentration of Hydrogen Peroxide 2009 (W02009/148405).

8. Lee, F.; Chung, J.E.; Kurisawa, M. An injectable enzymatically crosslinked hyaluronic acidtyramine hydrogel systém with independent tuníng of mechanical strength and gelation rate. Soft Matter 2008, 4, 880-887.

9. Akkara, J.A.; Senecal, K.J.; Kaplan, D.L., Synthesis and characterization of polymers produced by horseradish peroxidase in dioxane. Journal of Polymer Science Part A: Polymer Chemistry 1991, 29 (11), 1561-1574.

10. Shutava, T.; Zheng, Z.; John, V.; Lvov, Y., Micorcapsule modification with peroxidasecatalyzed phenol polymerízation. Biomacromolecules 2004, 5 (3), 914-21.

11. Ghan, R.; Shutava, T.; Patel, A.; John, V. T.; Lvov, Y.; Enzyme-Catalyzed Polymerízation of Phenols within Polyelectrolyte Microcapsule. Macromolecules 2004, 37 (12), 4519 4524.

12. Higashimura, H.; Kobayashi, S., Oxidative Polymerízation. John Wiley & Sons, lne.: 2002.

13. Veitch, N.C., Horseradish peroxidase: a modem view of a clasic enzyme. Phytochemistry 2004, 65 (3), 249-259.

14. Gilabert, M.A.; Fenoll, L.G.; Garcia-Molina, F.; Garcia-Ruiz, P.A.; Tudela, J.; GarciaCanovas, F.; Rodriguez-Lopaz, J.N., Stereospecificity of horseradish peroxidase. Biol Chem 2004, 385 (12), 1177-84.

15. Uyama, H.; Kobayashi, S., Enzymatic Synthesis of Polyphenols. Current Organic Chemistry 2003, 7, 1387.

16. Gilabert, M.A.; Fenoll, L.G.; Garcia-Molina, F.; Tudela, J.; Garcia-Canovas, F.; Rodriguez-Lopez, J.N., Kinetic characterization of phenol and aniline derivates as substrates of peroxidase. Biol. Chem. 2004, 385 (9), 795-800.

17. Gilabert, M.A.; Hiner, A.N.; Garcia-Ruiz, P.A.; Tudela, J.; Garcia-Molina; F.; Acosta, M.; Garcia-Canovas, F.; Rodriguez-Lopez, J.N., Differential substráte behaviour of phenol and aniline derivatives during oxidation by horseradish peroxidase: kinetic evidence for a two-step mechanism. Biochim. BiophysTeto 2004,1699(1-2), 235-43.

18. Hewson, W.D.; Dunford, H.B., Oxidation of p-cresol by horseradish peroxidase compound

I. J. Biol Chem. 1976, 251 (19), 6036-42.

19. Burner, U.; Obinger, C., Transient-state and steady-state kinetics of the oxidation of aliphatic and aromatic thiols by horseradish peroxidase. FEBS Letters 1997, 411 (2-3), 269-274.

20. Patel. P.K.; Mondal, M.S.; Módi, S.; Behere, D.V., Kinetic studies on the oxidation of phenols by the horseradish peroxidase compound II. Biochim Biophys Acta 1997,1339 (1), 79-87.

-16CZ 303879 B6

21. Hewson, W.D.; Dunford, H.B., Stoichiometry ofthe reaction between horseradish peroxidase and p-cresol. J. Biol.Chem. 1976, 257 (19), 6043-52.

22. Job, D.; Dunford, H.B., Substituent effect on the oxidation of phenols and aromatic amines by horseradish peroxidase compound I. Eur JBiochem. 1976, 66 (3), 607-14.

23. Dunford, H.B.,; Cotton, M.L., Kinetics of the oxidation of p-aminobenzoic acid catalyzed by horseradish peroxidase compounds I and II. J. Biol Chem 1975, 250 (8), 2920-32.

ío 24. Kalyanaraman, B.; Felix, C.C.; Sealy, R.C., Peroxidatic oxidation of catecholamines. A kinetic electron spin resonance investigation using the spin stabilization approach. Journal of Biological Chemistry, 1984, 259 (12), 7584-7589.

25. Won, K.: Kim Y. H.; An, E.S.; Lee, Y.S.; Song, B.K., Horseradish Peroxidase Catalyzed

Polymerization of Cardanol in the Presence of Redox Mediators. Biomacromolecules 2003, 5(1), 1-4.

26: Xu, Y.-P.; Hung, G.-L.; Yu, Y.-T. Kinetics of phenolic polymerization catalyzed by peroxidase in organic media. Biotechnology and Bioengineering 1995, 47 (1), 117-119.

27. Tonelli, A. E., Effects of crosslink density and length on the number of intramolecular crosslinks (defects) introduced into a rubbery network. Polymer 1974, 75 (4), 194-196.

28. Jin, R.; Hiemstra, C.; Zhong, Z.; Feijen, J., Enzyme-mediated fast in šitu formation of hydrogels from dextran-tyramine conjugates. Biomaterials 2007, 28 (18), 2791-2800.

29. Park, K.-D.; Joung, Y.-K:; Park, K.-M. In šitu Forming Hydrogel and Biomedical Use Thereof2011 (WO2011/028031).

PATENTOVÉ NÁROKY

Claims

1. Derivát na bázi kyseliny hyaluronové podle obecného vzorce (I)

40 kde Ar je fenyl a Ri je ethylen, nebo Ar je indol a Ri je ethylen, nebo Ar je indol a R, je karboxyethylen, a kde R₂ je alkyl o počtu uhlíku 3 až 7, a kde n je v rozmezí od 1 do 7500.

2. Způsob přípravy derivátu podle obecného vzorce (I), vyznačující se tím, že se nejprve připraví aldehydický derivát kyseliny hyaluronové podle vzorce (II)

- 17CZ 303879 B6

Ac (II), kde aldehydický derivát se připraví s použitím oxidačního systému 4-acetamido-TEMPO/NaClO v protickém prostředí a má stupeň substituce 5 až 15 % a molekulovou hmotnost v rozmezí 10 000 g/mol až 2 000 000 g/mol, dále se zvlášť připraví sloučenina obecného vzorce (III)

R.

kde Ar je fenyl a R, je ethylen, nebo Ar je indol a Rj je ethylen, nebo Ar je indol a Ri je karboxyethylen, a kde R₂ je alkyl o počtu uhlíků 3 až 7, a kde n je v rozmezí od 1 do 7500, přičemž sloučenina obecného vzorce (III) se připraví reakcí prekurzoru spaceru podle vzorce (IV)

Z-NH-R₂-COOH (IV), kde Z je chránící skupina běžně používaná k ochraně primární aminoskupiny, s ligandem podle vzorce (V) v aprotickém prostředí při teplotě v rozmezí 40 °C až 150 °C po dobu 1 až 24 hodin v přítomnosti činidla aktivujícího karboxylové funkční skupiny, za vzniku sloučeniny obecného vzorce (VI)

3. Způsob přípravy podle nároku 2, vyznačující se tím, že ligand dle obecného vzorce (V) je vybrán ze skupiny zahrnující tyramin, serotonin a 5-hydroxytryptofan.

4. Způsob přípravy podle kteréhokoli z nároků 2 až 3, vyznačující se tím, že sloučenina obecného vzorce (IV), tj. prekurzor spaceru, je vybrána ze skupiny aminokyselin zahrnující deriváty ft>-[(/év7-butoxykarbonyl)amino]karboxylových kyselin, kde R₂ je alkyl o počtu uhlíků 3 až 7.

5. Způsob přípravy podle kteréhokoli z nároků 2 až 4, vyznačující se tím, že reakce prekurzoru spaceru s ligandem probíhá v prostředí THF nebo DMF při teplotě 50 °C po dobu 2 až 6 hodin v přítomnosti 1,1 ‘-karbodiimidazolu.

-18CZ 303879 B6

6. Způsob přípravy podle kteréhokoli z nároků 2 až 5, vyznačující se tím, že odstranění chránící skupiny Z se provede prostřednictvím trifluoroctové nebo chlorovodíkové kyseliny.

5

7. Hydrogel na bázi zesíťovaného derivátu podle obecného vzorce (I) kde Ar je fenyl a Ri je ethylen, nebo Ar je indol a Ri je ethylen, nebo Ar je indol a Ri je karboxyío ethylen, a kde R₂ je alkyl o počtu uhlíků 3 až 7, a kde n je v rozmezí od 1 do 7500.

8. Způsob výroby hydrogelů definovaného v nároku 7, vyznačující se tím, že se na derivát podle obecného vzorce (I) působí generátorem reaktivních fenoxyradikálů při pH v rozmezí 4 až 10.

9. Způsob výroby podle nároku 8, vyznačující se tím, že generátor reaktivních fenoxyradikálů je vybrán ze skupiny zahrnující systém křenová peroxidáza a zdroj hydroxylových radikálů, kde zdrojem hydroxylových radikálů může být roztok peroxidu vodíku ve vodě, nebo systém oxidáza-kyslík-substrát, např. galaktózooxidáza-galaktóza nebo glukózooxidáza20 glukóza.

10. Použití hydrogelů definovaného v nároku 7 pro výrobu přípravků pro kosmetiku, medicínu, či regenerativní medicínu.

25

11. Použití podle nároku 10, kde přípravky zahrnují krytí pro hojení ran, biodegradabilní bariéiy bránící vzniku pooperačních srůstů, přípravky pro augmentaci měkkých tkání, výplně tkáňových defektů, scaffoldy pro tkáňové inženýrství.

12. Použití podle nároku 10, kde přípravky zahrnují oseté nebo neoseté scaffoldy pro léčbu

30 defektů kloubní chrupavky a kostních defektů.

1 výkres

-19CZ 303879 B6

Stress-strain křivky HA hydrogelů