JP5122436B2 - 新規なヘパリン代替材料およびその製造方法 - Google Patents
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Description
本発明は、抗血液凝固作用およびヘパリン結合性成長因子用貯蔵および徐放材としての機能を有する新規なヘパリン代替材料およびその製造方法、並びにそれを用いた医療用製剤または医療用物品または化粧料に関する。
近年、体外循環装置や人工腎臓等の人工装置および人工機器が頻繁に使用されるようになりつつある。これらの人工装置および人工機器に含まれる人工材料には、血液と人工材料との材料表面で生じる血液凝固を抑えるための処理を行う必要がある。このため、抗血液凝固剤の需要が高まりつつあり、そして各種の抗血液凝固剤が使用されている。このような抗血液凝固剤としてはヘパリンがよく知られている。ヘパリンは、長年、生体内あるいは人工材料を含む医療器具に抗血液凝固性を付与するため使用されてきた。
ヘパリンは、このような抗血液凝固作用以外にも、ヘパリン結合性成長因子の安定化機能、およびその貯蔵、放出、会合などを調節する調節機能、を有することが知られている。代表的なヘパリン結合性成長因子として、塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、骨形成因子（ＢＭＰ）などが挙げられる。ヘパリン結合性成長因子は、各種の細胞に対して強力な増殖促進作用および分化促進作用を有しており、創傷治療、骨折の治療、血管や神経、肝臓の再生修復に有用であることが期待されている。非特許文献１では、ヘパリンを共有結合したアルギン酸ゲルにｂＦＧＦを含侵したマトリックスが、ｂＦＧＦ徐放能と血管新生作用を持つことが報告されている。
このようにヘパリンは非常に重要な機能を有する医療用材料であるが、従来知られているヘパリンは以下のような問題点を有している。
（１）ヘパリンは動物由来のムコ多糖体硫酸塩であり、哺乳動物（牛、豚、子羊など）の腸または肺から抽出精製することにより得られる。そのため、ウイルスやプリオンの混入を完全に排除することはできない。さらに、牛海綿状脳症（ＢＳＥ）の流行以来、牛臓器由来のヘパリンの使用が禁止されており、安全性が確保されていない。
（２）ヘパリンは、血中において、抗凝固作用を有するアンチトロンビンＩＩＩを何百倍にも促進させ、瞬間的にトロンビンを失活させる機能を有する。その一方で、ヘパリンは血中ではほとんど分解されない。そのため、血中においてヘパリンの抗凝固機能が持続してしまい、これにより血液本来の凝固能までも低下させてしまう危険性がある。
（１）ヘパリンは動物由来のムコ多糖体硫酸塩であり、哺乳動物（牛、豚、子羊など）の腸または肺から抽出精製することにより得られる。そのため、ウイルスやプリオンの混入を完全に排除することはできない。さらに、牛海綿状脳症（ＢＳＥ）の流行以来、牛臓器由来のヘパリンの使用が禁止されており、安全性が確保されていない。
（２）ヘパリンは、血中において、抗凝固作用を有するアンチトロンビンＩＩＩを何百倍にも促進させ、瞬間的にトロンビンを失活させる機能を有する。その一方で、ヘパリンは血中ではほとんど分解されない。そのため、血中においてヘパリンの抗凝固機能が持続してしまい、これにより血液本来の凝固能までも低下させてしまう危険性がある。
ヘパリンの有する、以上２つの問題を解決するための手段が報告されている。このような手段の一例として、低分子化したヘパリンを利用する方法が挙げられる。低分子化したヘパリンはトロンビンとの結合が非常に弱くなり、これにより大量出血のリスクを低下させることができる。しかし、この低分子化ヘパリンにも血中分解性はほとんどないため、依然として、血中においてヘパリンの抗凝固機能が持続してしまう問題がある。また、この方法によっては、動物組織由来成分であることに基づく病原性ウイルス混入のリスクの問題は解決されていない。
一方、ヘパリンの機能を代替する高分子材料の開発も行われている。例えば、硫酸化ジェラン（特許文献１）や硫酸化セルロース（特許文献２）、硫酸化フィブロインまたはセリシン（特許文献３）が報告されている。これらの方法で得られたヘパリンの機能代替高分子によって、動物由来成分による病原性ウイルス混入のリスクの問題を解決することができる。しかしながらこれらのヘパリンの機能代替高分子材料もまた、血中でほとんど分解されないと考えられる。そのため、血中において抗凝固機能が持続してしまい、血液本来の凝固能までも低下させてしまう問題は未解決のままである。このように、ヘパリンの有する２つの問題を同時に解決可能な、安全性が高く、かつ血中での分解性に優れたヘパリン代替材料の開発が求められていた。
一方で、近年、皮膚の老化を抑制する目的で、上皮細胞増殖因子（ＥＧＦ）または繊維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）といった細胞増殖因子を含有する化粧料が市販されている。しかしながらこれらの細胞増殖因子は安定性が低く、種々の原料と混合して長期間保存することが前提の化粧料において細胞増殖活性を保つことは困難である。
特開２００４‐２３５５号公報
特表２００１‐５００１８４号公報
特開平９‐２２７４０２号公報
J.Biomed.Mater.Res., 216-221（2001）
抗血液凝固剤として従来使用されているヘパリンは、哺乳動物（牛、豚、子羊）から抽出しているため安全性に問題がある。また、ヘパリンは生体内での分解性が低いため、多量に使用した場合、大量出血の危険性がある。そのため、安全であり、かつ抗凝固機能を発揮した後、速やかに分解されるヘパリン代替材料が望まれている。本発明は、上記のような医療用材料として従来使用されているヘパリンの有する問題点を解決し、安全性および生体内分解性に優れた新規なヘパリン代替材料およびその製造方法、並びにそれを用いた医療用製剤または医療用物品あるいは化粧料を提供することを目的とする。
α‐１，４‐グルカンは、血中および組織中に存在するα‐アミラーゼにより速やかに分解されるため、生体内分解性に最も優れた多糖類である。更にα‐１，４‐グルカンは酵素反応により合成可能であるため、動物由来の天然抽出物に比べて安全性にも優れている。本発明者等は上記目的を達成すべく鋭意検討を行った結果、酵素合成α‐１，４‐グルカンを用いることによって、安全性および生体内分解性に優れた新規なヘパリン代替材料が提供できることを見出した。また酵素合成α‐１，４‐グルカンにスルホン酸基および／またはカルボン酸基両方を存在させることにより、ヘパリン様機能がより高められることを見出し、本発明を完成するに至った。
即ち、本発明は、酵素合成α‐１，４‐グルカン誘導体から成ることを特徴とするヘパリン代替材料、を提供するものであり、これにより上記目的を達成することができる。
上記酵素合成α‐１，４‐グルカン誘導体がスルホン酸基またはカルボン酸基を有するのが好ましい。
上記酵素合成α‐１，４‐グルカン誘導体がスルホン酸基およびカルボン酸基を有するのがより好ましい。
本発明はまた、抗血液凝固機能を有するヘパリン代替材料も提供する。
本発明はまた、上記酵素合成α‐１，４‐グルカン誘導体を含有する抗血液凝固製剤も提供する。
本発明はまた、上記酵素合成α‐１，４‐グルカン誘導体を含有する皮膚外用剤または化粧料も提供する。
本発明はまた、酵素合成α‐１，４‐グルカン誘導体を表面にコーティングした、医療用具も提供する。
上記医療用具は、採血用注射器、人工臓器、ゲル、糸、フィルム、スポンジ、不織布、ガーゼ、バイパス、膜から成る群から選択される何れかであるのが好ましい。
本発明はまた、ヘパリン結合性成長因子徐放機能を有するヘパリン代替材料も提供する。
本発明はまた、上記酵素合成α‐１，４‐グルカン誘導体およびヘパリン結合性成長因子を含有する、ヘパリン結合性成長因子徐放用組成物も提供する。
本発明はまた、上記酵素合成α‐１，４‐グルカン誘導体およびヘパリン結合性成長因子を含有する、ヘパリン結合性成長因子徐放用成型物も提供する。
本発明はまた、化学的に架橋された酵素合成α‐１，４‐グルカン誘導体およびヘパリン結合性成長因子を含有する、ヘパリン結合性成長因子徐放用ゲルも提供する。
本発明はさらに、ヘパリン代替材料用酵素合成α‐１，４‐グルカン誘導体の製造方法も提供する。この製造方法の一例として、下記工程
酵素合成α‐１，４‐グルカンと、二塩基酸とを反応させて、酵素合成α‐１，４‐グルカンにカルボン酸基を導入する、カルボン酸基導入工程、
を包含する製造方法が挙げられる。
酵素合成α‐１，４‐グルカンと、二塩基酸とを反応させて、酵素合成α‐１，４‐グルカンにカルボン酸基を導入する、カルボン酸基導入工程、
を包含する製造方法が挙げられる。
ヘパリン代替材料用酵素合成α‐１，４‐グルカン誘導体の製造方法の他の一例として、さらに下記工程
カルボン酸基導入工程により得られたカルボン酸基を有する酵素合成α‐１，４‐グルカン誘導体と、アミノ基およびスルホン酸基含有化合物とを反応させて、カルボン酸基の全てまたは一部にスルホン酸基を導入する、スルホン酸基導入工程
を包含する製造方法が挙げられる。
カルボン酸基導入工程により得られたカルボン酸基を有する酵素合成α‐１，４‐グルカン誘導体と、アミノ基およびスルホン酸基含有化合物とを反応させて、カルボン酸基の全てまたは一部にスルホン酸基を導入する、スルホン酸基導入工程
を包含する製造方法が挙げられる。
本発明はまた、上記製造方法により得られる酵素合成α‐１，４‐グルカン誘導体も提供する。
α‐１，４‐グルカンは酵素反応により合成可能であるため、動物由来の天然抽出物に比べて安全性に優れているという利点を有する。またこのα‐１，４‐グルカンは、血中および組織中に存在するα‐アミラーゼによってより速やかに分解される、生体内分解性に最も優れた多糖類である。本発明においては、α‐１，４‐グルカンを、例えばスルホン酸化することによって得られる酵素合成α‐１，４‐グルカン誘導体を用いることにより、安全性および生体内分解性に優れた新規なヘパリン代替材料を提供することができる。
用語の説明
用語「α‐１，４‐グルカン」とは、本明細書中で用いられる場合、Ｄ−グルコースを構成単位とする糖であって、α−１，４−グルコシド結合のみによって連結された糖単位を少なくとも２糖単位以上有する糖をいう。α‐１，４‐グルカンは、直鎖状の分子であり、直鎖状グルカンとも呼ばれる。
用語「α‐１，４‐グルカン」とは、本明細書中で用いられる場合、Ｄ−グルコースを構成単位とする糖であって、α−１，４−グルコシド結合のみによって連結された糖単位を少なくとも２糖単位以上有する糖をいう。α‐１，４‐グルカンは、直鎖状の分子であり、直鎖状グルカンとも呼ばれる。
また、用語「分散度Ｍｗ／Ｍｎ」とは、重量平均分子量Ｍｗに対する数平均分子量Ｍｎの比（すなわち、Ｍｗ÷Ｍｎ）である。高分子化合物は、タンパク質のような特別の場合を除き、その由来が天然または非天然のいずれであるかに関わらず、その分子量は単一ではなく、ある程度の幅を有している。そのため、高分子化合物の分子量の分散程度を示すために、高分子化学の分野では通常、分散度Ｍｗ／Ｍｎが用いられている。この分散度は、高分子化合物の分子量分布の幅広さの指標である。分子量が完全に単一な高分子化合物であればＭｗ／Ｍｎは１であり、分子量分布が広がるにつれてＭｗ／Ｍｎは１よりも大きな値になる。本明細書中で「分子量」という用語は、特に断りのない限り重量平均分子量（Ｍｗ）を指す。
酵素合成α‐１，４‐グルカン
本発明で用いられる酵素合成α‐１，４‐グルカンは、当該分野で公知の方法によって作製することができる。本発明において「酵素合成α‐１，４‐グルカン」とは、酵素反応により糖を結合させることによって得られるα‐１，４‐グルカンを意味する。酵素合成α−１，４−グルカンは、当該分野で公知の方法によって作製することができる。
本発明で用いられる酵素合成α‐１，４‐グルカンは、当該分野で公知の方法によって作製することができる。本発明において「酵素合成α‐１，４‐グルカン」とは、酵素反応により糖を結合させることによって得られるα‐１，４‐グルカンを意味する。酵素合成α−１，４−グルカンは、当該分野で公知の方法によって作製することができる。
このような酵素合成法の例としては、グルカンホスホリラーゼ（α−ｇｌｕｃａｎ ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｓｅ、ＥＣ ２．４．１．１；通常、ホスホリラーゼという）を用いる方法が挙げられる。ホスホリラーゼは、加リン酸分解反応を触媒する酵素である。ホスホリラーゼを用いた酵素合成法の一例は、ホスホリラーゼを作用させて、基質であるグルコース−１−リン酸（以降、Ｇ−１−Ｐという）のグルコシル基を、プライマーとして用いられる例えばマルトヘプタオースに転移する方法（以降、ＧＰ法という）である。ＧＰ法は、原料であるＧ−１−Ｐが高価であるため、α−１，４−グルカンを工業的に生産するのにはコストがかかるが、糖単位をα−１，４−グルコシド結合のみで逐次結合させることにより１００％直鎖のα−１，４−グルカンが得られるという顕著な利点がある。ＧＰ法は、当該分野で公知である。
ホスホリラーゼを用いた酵素合成法の別の例は、スクロ−スを基質とし、例えば、マルトオリゴ糖をプライマーとして用い、これらに無機リン酸の存在下でスクロースホスホリラーゼ（ｓｕｃｒｏｓｅ ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｓｅ、ＥＣ ２．４．１．７）とグルカンホスホリラーゼとを同時に作用させることによってα−１，４−グルカンを酵素合成する方法（以降、ＳＰ−ＧＰ法という）である。ＳＰ−ＧＰ法は、ＧＰ法と同様１００％直鎖のα−１，４−グルカンの分子量を自由に制御して製造できることに加え、安価なスクロ−スを原料とすることで、製造コストをより低くできるという利点を有する。ＳＰ−ＧＰ法は当該分野で公知である。ＳＰ−ＧＰ法の効率的な生産方法は、例えば、国際公開第ＷＯ０２／０９７１０７号パンフレットに記載される。本発明で用いられる酵素合成α−１，４−グルカンは、このパンフレットに記載される方法に従って製造され得る。
なお「プライマー」とは、グルカン合成の出発材料として機能する物質をいう。このようなプライマーとしてオリゴ糖を用いることができる。プライマーとして、マルゴオリゴ糖、例えばマルトトリオース、マルトテトラオース、マルトペンタオース、マルトヘキサオース、またはアミロース（α−１，４−グルカン）など、を用いるのが好ましい。プライマーとして、単一化合物を用いてもよく、２種以上の化合物の混合物を用いてもよい。このプライマーの量を変化させることによって、得られるα−１，４−グルカンの平均分子量を調整することができる。例えば、プライマーの量を多くすることによって、より低分子量のα−１，４−グルカンを得ることができる。このように用いるプライマーの量を変化させることによって、平均分子量の異なるα−１，４−グルカンを容易に調製することができる。
一方、ＡＭＳＵ法も、酵素を用いたα−１，４−グルカン合成法ではあるが、得られるα−１，４−グルカンは、極めて低重合度（約９ｋＤａ未満）となり、酵素合成α−１，４−グルカンの製造には適さない。
上記ＧＰ法および／またはＳＰ−ＧＰ法によって得られる酵素合成α−１，４−グルカンは次のような特徴を有する：
（１）分子量分布が狭い（Ｍｗ／Ｍｎが１．１以下）。このため、物性の制御が容易であり、そして性能が安定したα−１，４−グルカンを得ることができる。
（２）製造条件を適切に制御することによって所望の分子量を有するものを得ることができる。これにより、必要とされる生理活性に応じた分子量を有するα−１，４−グルカンを作製することができる。
（３）完全に直鎖であり、天然澱粉から分画したアミロ−スに認められるわずかな分岐構造をも含まない。つまり全てα−１，４結合により結合されており、α−１，６結合を全く含まない。これにより、分岐構造部分に基づく生理活性への影響を排除することができる。
（４）分岐構造を含まないため立体障害による反応障害がなく、より穏やかな条件下においてスルホン酸基および／またはカルボン酸基などの官能基を導入することができる。
（５）天然澱粉と同様にグルコース残基のみで構成されているため、動物性原料に起因する毒性などのリスクがない。α−１，４−グルカンも、その分解中間体も、そして最終分解物に至るまで生体に対して毒性がない。
（１）分子量分布が狭い（Ｍｗ／Ｍｎが１．１以下）。このため、物性の制御が容易であり、そして性能が安定したα−１，４−グルカンを得ることができる。
（２）製造条件を適切に制御することによって所望の分子量を有するものを得ることができる。これにより、必要とされる生理活性に応じた分子量を有するα−１，４−グルカンを作製することができる。
（３）完全に直鎖であり、天然澱粉から分画したアミロ−スに認められるわずかな分岐構造をも含まない。つまり全てα−１，４結合により結合されており、α−１，６結合を全く含まない。これにより、分岐構造部分に基づく生理活性への影響を排除することができる。
（４）分岐構造を含まないため立体障害による反応障害がなく、より穏やかな条件下においてスルホン酸基および／またはカルボン酸基などの官能基を導入することができる。
（５）天然澱粉と同様にグルコース残基のみで構成されているため、動物性原料に起因する毒性などのリスクがない。α−１，４−グルカンも、その分解中間体も、そして最終分解物に至るまで生体に対して毒性がない。
本発明で用いられる酵素合成α−１，４−グルカンは、分子量分布が１．２５以下であるのがより好ましい。α−１，４−グルカンは、その分子量に依存して溶解性などの性質が異なる。そのため、分子量分布が狭い酵素合成α−１，４−グルカンを用いることによって、溶解性などの物性をより良好に制御することができるからである。
また本発明で用いられる酵素合成α−１，４−グルカンは、数平均分子量が３ｋＤａ〜２０００ｋＤａであるのがより好ましい。数平均分子量が上記範囲であることによって、カルボン酸基およびスルホン酸基導入時にα‐１，４‐グルカンの反応溶媒への溶解性が高くなり、粘度も適切な範囲となるため、反応効率が高くなるという利点がある。
なお、酵素合成方法以外のα‐１，４‐グルカンの作製方法としては、澱粉からの分画による方法が挙げられる。しかし、澱粉から分画されたα‐１，４‐グルカンは、分子量分布が広く、さらに分岐構造を含む。例えば、天然澱粉に含まれるアミロ−スは、通常分子量分布（Ｍｗ／Ｍｎ）が１．３以上と広い。このため、得られるα−１，４−グルカン誘導体の生理活性が安定しないという問題がある。このような分画により得られるα‐１，４‐グルカンはさらに、分岐構造を含む。この分岐構造は、スルホン酸基および／またはカルボン酸基を導入する際の立体障害となり、これらの基の導入を妨げてしまうという問題がある。
酵素合成α‐１，４‐グルカン誘導体
本明細書において「酵素合成α‐１，４‐グルカン誘導体」とは、酵素合成α‐１，４‐グルカンに官能基が導入された化合物を意味する。α‐１，４‐グルカンに導入されうる官能基として、例えばカルボン酸基、スルホン酸基などが挙げられる。なお本明細書中におけるα‐１，４‐グルカン誘導体が有するカルボン酸基、そしてスルホン酸基の記載に関しては、これらの塩の形態のもの（カルボン酸塩、スルホン酸塩など）も含まれるものとする。
本明細書において「酵素合成α‐１，４‐グルカン誘導体」とは、酵素合成α‐１，４‐グルカンに官能基が導入された化合物を意味する。α‐１，４‐グルカンに導入されうる官能基として、例えばカルボン酸基、スルホン酸基などが挙げられる。なお本明細書中におけるα‐１，４‐グルカン誘導体が有するカルボン酸基、そしてスルホン酸基の記載に関しては、これらの塩の形態のもの（カルボン酸塩、スルホン酸塩など）も含まれるものとする。
本発明においては、酵素合成α‐１，４‐グルカン誘導体は、スルホン酸基およびカルボン酸基の少なくとも一方を有するのが好ましい。これらの基を有する酵素合成α‐１，４‐グルカン誘導体は、優れた抗血液凝固活性を有するからである。スルホン酸基およびカルボン酸基両方を有する酵素合成α‐１，４‐グルカン誘導体は、より優れた抗血液凝固活性を有し、さらに好ましい。
本発明における酵素合成α‐１，４‐グルカン誘導体は、スルホン酸基、カルボン酸基などの官能基の置換度が０．５〜２．８であるのがより好ましい。なお本明細書における「置換度」は、α−１，４−グルカン誘導体における、無水グルコース残基あたりの平均置換水酸基数を表わす。無水グルコース残基の水酸基は３つあり、それがすべて化学修飾によって置換された場合、置換度は３、平均して２個の水酸基が置換された場合は置換度が２となる。この置換度はあくまでも平均値であり、その中間の値も取り得る。
本発明における酵素合成α‐１，４‐グルカン誘導体の調製方法の一例として、
酵素合成α‐１，４‐グルカンと、二塩基酸とを反応させて、酵素合成α‐１，４‐グルカンにカルボン酸基を導入する、カルボン酸基導入工程、
を包含する方法が挙げられる。この方法によって、酵素合成α‐１，４‐グルカンに、カルボン酸基を、より簡便に導入することができる。
この反応で用いることができる二塩基酸として、例えば、コハク酸、マレイン酸、フタル酸、シュウ酸、アジピン酸、ピメリン酸、スベリン酸、アゼライン酸、セバシン酸、ウンデカン二酸、ドデカン二酸、トリデカン二酸、テトラデカン二酸、ペンタデカン二酸、オクタデカン二酸、ノナデカン二酸、エイコサン二酸、および酸無水物、例えば、無水コハク酸、無水マレイン酸、無水フタル酸、オクテニルコハク酸無水物、ドデセニルコハク酸無水物、ヘキサデセニルコハク酸無水物、オクタデセニルコハク酸無水物など、が挙げられる。この方法において、二塩基酸として無水コハク酸、無水マレイン酸、無水フタル酸、オクテニルコハク酸無水物などを用いるのがより好ましい。これらの二塩基酸を用いることによって、安全性に優れた、カルボン酸基を有する酵素合成α‐１，４‐グルカン誘導体を、より穏やかな条件下において作製することができる。
酵素合成α‐１，４‐グルカンと、二塩基酸とを反応させて、酵素合成α‐１，４‐グルカンにカルボン酸基を導入する、カルボン酸基導入工程、
を包含する方法が挙げられる。この方法によって、酵素合成α‐１，４‐グルカンに、カルボン酸基を、より簡便に導入することができる。
この反応で用いることができる二塩基酸として、例えば、コハク酸、マレイン酸、フタル酸、シュウ酸、アジピン酸、ピメリン酸、スベリン酸、アゼライン酸、セバシン酸、ウンデカン二酸、ドデカン二酸、トリデカン二酸、テトラデカン二酸、ペンタデカン二酸、オクタデカン二酸、ノナデカン二酸、エイコサン二酸、および酸無水物、例えば、無水コハク酸、無水マレイン酸、無水フタル酸、オクテニルコハク酸無水物、ドデセニルコハク酸無水物、ヘキサデセニルコハク酸無水物、オクタデセニルコハク酸無水物など、が挙げられる。この方法において、二塩基酸として無水コハク酸、無水マレイン酸、無水フタル酸、オクテニルコハク酸無水物などを用いるのがより好ましい。これらの二塩基酸を用いることによって、安全性に優れた、カルボン酸基を有する酵素合成α‐１，４‐グルカン誘導体を、より穏やかな条件下において作製することができる。
このカルボン酸基導入工程において用いられる二塩基酸の量は、酵素合成α‐１，４‐グルカンに導入するカルボン酸基の置換度に応じて種々の量に変更することができる。例えば、α‐１，４‐グルカンを構成する単糖単位に含まれる３個の水酸基に対して、カルボン酸基の置換度２以上のα‐１，４‐グルカン誘導体を作製する場合は、単糖単位１モルに対して２〜９モルの二塩基酸を用いることができる。α‐１，４‐グルカンと二塩基酸の無水物との反応においては、反応性を高めるために、ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＰＥＡ）、トリエチルアミン、ピリジン、ジメチルアミノピリジンなどの塩基性試薬を用いることができる。また、α‐１，４‐グルカンと、無水物以外の二塩基酸との反応においては、縮合剤として１−エチル−３−(３−ジメチルアミノプロピル)−カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ・ＨＣｌ）、ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）、ジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＣ）などのカルボジイミド系縮合剤、４−（４，６−ジメトキシ−１，３，５−トリアジン−２−イル）−４−メチルモルホリン塩酸塩などのトリアジン系縮合剤など、さらにはアミニウム系縮合剤、ホスホニウム系縮合剤、ジヒドロキノン系縮合剤などを用いることができる。これらの反応において、１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢｔ）、１−ヒドロキシ−７−アザベンゾトリアゾール（ＨＯＡｔ）、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＨＯＳｕ）などの脱水縮合添加剤を用いてもよい。
このカルボン酸基導入工程に用いられる溶媒の具体例としては、例えば、メチルエチルケトン、アセトン、メチルイソブチルケトン、シクロヘキサノンなどのケトン系溶媒；ジエチルエーテル、イソプロピルエーテル、テトラヒドロフラン、ジオキサン、エチレングリコールジメチルエーテル、エチレングリコールジエチルエーテル、ジエチレングリコールジメチルエーテル、ジエチレングリコールジエチルエーテル、プロピレングリコールモノメチルエーテル、アニソール、フェネトールなどのエーテル系溶媒；酢酸エチル、酢酸ブチル、酢酸イソプロピル、エチレングリコールジアセテートなどのエステル系溶媒；ジメチルホルムアミド、ジエチルホルムアミド、ジメチルスルホキシド、Ｎ−メチルピロリドンなどのアミド系溶媒；などが挙げられる。これらの溶媒は単独で用いてもよく、また混合して用いてもよい。
このカルボン酸基導入工程により、カルボン酸基を有する酵素合成α‐１，４‐グルカン誘導体が得られることとなる。酵素合成α‐１，４‐グルカンを用いて上記カルボン酸基導入工程により酵素合成α‐１，４‐グルカン誘導体を作製することによって、より穏やかな条件下において均一性および安全性に優れた、カルボン酸基を有する酵素合成α‐１，４‐グルカン誘導体を作製することができる。さらにこのカルボン酸基を有する酵素合成α‐１，４‐グルカン誘導体を、下記するスルホン酸基導入工程などに用いることによって、他の官能基を容易に導入することができる。
酵素合成α‐１，４‐グルカン誘導体の調製方法の他の一例として、
上記のカルボン酸基導入工程により得られたカルボン酸基を有する酵素合成α‐１，４‐グルカン誘導体と、アミノ基およびスルホン酸基含有化合物とを反応させて、カルボン酸基の全てまたは一部にスルホン酸基を導入する、スルホン酸基導入工程、
を包含する方法が挙げられる。
上記のカルボン酸基導入工程により得られたカルボン酸基を有する酵素合成α‐１，４‐グルカン誘導体と、アミノ基およびスルホン酸基含有化合物とを反応させて、カルボン酸基の全てまたは一部にスルホン酸基を導入する、スルホン酸基導入工程、
を包含する方法が挙げられる。
この反応で用いることができるアミノ基およびスルホン酸基含有化合物として、例えば、アミノメタンスルホン酸、２−アミノエタンスルホン酸、３−アミノプロパンスルホン酸、４−アミノ−３−ヒドロキシ−１−ナフタレンスルホン酸、１−アミノ−８−ナフトール−２，４−ジスルホン酸、２−アミノベンゼンスルホン酸、３−アミノベンゼンスルホン酸、４−アミノベンゼンスルホン酸などが挙げられる。この方法において用いられるアミノ基およびスルホン酸基含有化合物として、アミノメタンスルホン酸、２−アミノエタンスルホン酸を用いるのがより好ましい。またこのスルホン酸基導入工程において、上記カルボン酸基導入工程に用いられる溶媒を同様に用いることができる。
なお本発明の方法において、アミノ基およびスルホン酸基含有化合物以外の化合物を、スルホン酸導入工程と同様の方法で用いることもできる。例えば、ニトロエタンアミンのようなアミノ基およびニトロ基含有化合物を用いてスルホン酸導入工程と同様の方法で反応させることによって、ニトロ基を有する酵素合成α‐１，４‐グルカン誘導体を容易に得ることができる。同様にシステアミンのようなチオール基含有化合物によるチオール基の導入や、アミノエタンホスホン酸のようなリン酸基含有化合物によってリン酸基を導入することができる。またジアミン化合物を用いてスルホン酸導入工程と同様の方法で反応させることによって、架橋構造を形成させることができる。
このカルボン酸基導入工程においては、酵素合成α‐１，４‐グルカン誘導体が有するカルボン酸基と、アミノ基およびスルホン酸基含有化合物とを反応させることによって、カルボン酸基とアミノ基とが縮合結合し、これによりスルホン酸基が導入されることとなる。この反応において、１−エチル−３−(３−ジメチルアミノプロピル)−カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ・ＨＣｌ）、ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）ジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＣ）などのカルボジイミド系縮合剤、４−（４，６−ジメトキシ−１，３，５−トリアジン−２−イル）−４−メチルモルホリン塩酸塩などのトリアジン系縮合剤など、さらにはアミニウム系縮合剤、ホスホニウム系縮合剤、ジヒドロキノン系縮合剤などを用いることができる。さらに縮合添加剤として、１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢｔ）、１−ヒドロキシ−７−アザベンゾトリアゾール（ＨＯＡｔ）、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＨＯＳｕ）などを用いることができる。
このスルホン酸基導入工程においては、用いるアミノ基およびスルホン酸基含有化合物の量を変更することによって、導入されるスルホン酸基の量を容易に変更することができる。例えば、酵素合成α‐１，４‐グルカン誘導体が有するカルボン酸基１モルに対して１モル当量以上の量のアミノ基およびスルホン酸基含有化合物を用いることによって、酵素合成α‐１，４‐グルカン誘導体が有する全てのカルボン酸基を、スルホン酸基に導入することができる。また、例えば、酵素合成α‐１，４‐グルカン誘導体が有するカルボン酸基１モルに対して１モル当量未満の量のアミノ基およびスルホン酸基含有化合物を用いることによって、カルボン酸基およびスルホン酸基両方を有する酵素合成α‐１，４‐グルカン誘導体を容易に作製することができ、さらには二つの置換基の導入比率を変えることもできる。そしてこのカルボン酸基およびスルホン酸基両方を有する酵素合成α‐１，４‐グルカン誘導体は、非常に優れたヘパリン代替機能を有することが本発明者らの実験によって見いだされており、より好ましい誘導体である。さらに、カルボン酸基を有することで他の官能基の導入や架橋反応が容易であり、生理活性や物性を変化させることができる。
なおスルホン酸基を有するα‐１，４‐グルカン誘導体の製造方法として、上記製造方法以外にも、例えばα−１，４−グルカンの水酸基にエチレンイミンを反応させてアミノエチルエーテル化グルカンとし、次いでクロロスルホン酸または無水硫酸等のスルホン酸化試薬を反応させてスルホン酸基を導入する方法などが挙げられる。本発明におけるα‐１，４‐グルカン誘導体は、このような製造方法を用いて調製することもできる。しかしながらこのような方法は、工程が複雑であり、さらにα‐１，４‐グルカン誘導体が有するスルホン酸基およびカルボン酸基の置換度の容易な調整が困難になるおそれもある。
ところで、糖鎖の水酸基にスルホン酸基を導入する方法として、一般に、無水硫酸、硫酸、クロロスルホン酸等のスルホン化剤を用いて、水酸基をスルホン酸基に置き換える方法が挙げられる。しかしながらこの反応は、硫酸、クロロスルホン酸といった反応性が非常に高いスルホン化剤を用いる方法である。これらのスルホン化剤は、糖鎖の水酸基をスルホン酸基に置き換えるのみならず、糖鎖のグリコシド結合の切断や糖骨格の変化を伴う副反応が起こるおそれがある。これに対して本発明の方法は、非常に穏やかな条件下において、カルボキシル基および／またはスルホン酸基などの官能基をより多く導入することができるという非常に優れたものである。本発明の方法は、糖鎖の切断や糖骨格の変化のおそれを伴うことなく、非常に穏やかな条件下において簡易に官能基を導入することができる。
本発明における酵素合成α‐１，４‐グルカン誘導体は、上記酵素合成α‐１，４‐グルカンにおける利点に加えて、さらに、下記利点も有している：
（１）酵素合成α‐１，４‐グルカン誘導体の作製に用いられる酵素合成α‐１，４‐グルカンは、分岐構造を含まないため立体障害がない。そのため、より多くのスルホン酸基および／またはカルボン酸基を有する酵素合成α‐１，４‐グルカン誘導体を作製することができる。
（２）α‐１，４‐グルカンに導入する官能基の種類および量を調節することによって、酵素合成α‐１，４‐グルカン誘導体の生理活性および分解時間をコントロールすることが可能である。
（１）酵素合成α‐１，４‐グルカン誘導体の作製に用いられる酵素合成α‐１，４‐グルカンは、分岐構造を含まないため立体障害がない。そのため、より多くのスルホン酸基および／またはカルボン酸基を有する酵素合成α‐１，４‐グルカン誘導体を作製することができる。
（２）α‐１，４‐グルカンに導入する官能基の種類および量を調節することによって、酵素合成α‐１，４‐グルカン誘導体の生理活性および分解時間をコントロールすることが可能である。
抗血液凝固作用
上記より得られる酵素合成α‐１，４‐グルカン誘導体は、ヘパリン代替材料として用いられる。本発明における酵素合成α‐１，４‐グルカン誘導体が有するヘパリン代替機能の一つは、抗血液凝固作用である。本発明によって得られる、酵素合成α‐１，４‐グルカン誘導体は、抗血液凝固作用を有しており、抗血液凝固製剤として用いることができる。また、本発明の酵素合成α‐１，４‐グルカン誘導体を医療用具にコーティングすることにより、医療用具に抗血液凝固作用を持たせることができる。医療用具の例としては、採血用注射器、人工臓器、ゲル、糸、フィルム、スポンジ、不織布、ガーゼ、バイパス、膜などが挙げられる。
上記より得られる酵素合成α‐１，４‐グルカン誘導体は、ヘパリン代替材料として用いられる。本発明における酵素合成α‐１，４‐グルカン誘導体が有するヘパリン代替機能の一つは、抗血液凝固作用である。本発明によって得られる、酵素合成α‐１，４‐グルカン誘導体は、抗血液凝固作用を有しており、抗血液凝固製剤として用いることができる。また、本発明の酵素合成α‐１，４‐グルカン誘導体を医療用具にコーティングすることにより、医療用具に抗血液凝固作用を持たせることができる。医療用具の例としては、採血用注射器、人工臓器、ゲル、糸、フィルム、スポンジ、不織布、ガーゼ、バイパス、膜などが挙げられる。
酵素合成α‐１，４‐グルカン誘導体を医療用具にコーティングする方法として、例えば、ポリ（２-メトキシエチルアクリレート）（ＰＭＥＡ）、ポリ（２-ヒドロキシエチルメタクリレート）（ＰＨＥＭＡ））などの生体適合性高分子を形成するコーティング組成物を用いて、本発明における酵素合成α‐１，４‐グルカン誘導体を、共有結合、静電相互作用、水素結合などで結合させる方法などが挙げられる。このような方法によって、上記の医療用具の表面上に、本発明における酵素合成α‐１，４‐グルカン誘導体をコーティングすることができる。
ヘパリン結合性成長因子徐放機能
本発明における酵素合成α‐１，４‐グルカン誘導体が有するヘパリン代替機能の他の一つは、ヘパリン結合性成長因子徐放機能である。本発明における酵素合成α‐１，４‐グルカン誘導体およびヘパリン結合性成長因子を含むヘパリン代替材料は、ヘパリン結合性成長因子を徐々に放出するという機能を有している。このようなヘパリン代替材料を生体内に導入し、そして生体内でヘパリン結合性成長因子を徐放させることによって、生体内において細胞の増殖促進作用および／または分化促進作用を発現させることができる。ヘパリン代替材料に含めることができるヘパリン結合性成長因子の例としては、塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、骨形成因子（ＢＭＰ）などが挙げられる。
本発明における酵素合成α‐１，４‐グルカン誘導体が有するヘパリン代替機能の他の一つは、ヘパリン結合性成長因子徐放機能である。本発明における酵素合成α‐１，４‐グルカン誘導体およびヘパリン結合性成長因子を含むヘパリン代替材料は、ヘパリン結合性成長因子を徐々に放出するという機能を有している。このようなヘパリン代替材料を生体内に導入し、そして生体内でヘパリン結合性成長因子を徐放させることによって、生体内において細胞の増殖促進作用および／または分化促進作用を発現させることができる。ヘパリン代替材料に含めることができるヘパリン結合性成長因子の例としては、塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、骨形成因子（ＢＭＰ）などが挙げられる。
本発明における酵素合成α‐１，４‐グルカン誘導体およびヘパリン結合性成長因子を含有する組成物を調製することによって、ヘパリン結合性成長因子徐放用組成物を得ることができる。そしてこのヘパリン結合性成長因子徐放用組成物を用いて成型などを行うことによって、ヘパリン結合性成長因子徐放用成型物を得ることができる。このヘパリン結合性成長因子徐放用成型物はヘパリン代替機能を有している。ヘパリン結合性成長因子徐放用成型物を生体内に導入し、そして生体内でヘパリン結合性成長因子を徐放させることによって、生体内において細胞の増殖促進作用および／または分化促進作用を発現させることができる。
本発明のヘパリン代替材料、ヘパリン結合性成長因子徐放用組成物そしてヘパリン結合性成長因子徐放用成型物において、含まれる酵素合成α‐１，４‐グルカン誘導体は化学的に架橋されていてもよい。酵素合成α‐１，４‐グルカン誘導体を化学的に架橋することによって、誘導体は３次元構造を有することとなり、より優れた徐放機能などを得ることができる。酵素合成α‐１，４‐グルカン誘導体を化学的に架橋する方法としては、例えばエチレンジアミン２Ｎ−ヒドロキシコハク酸イミド塩（ＥＤＡ・２ＨＯＳｕ）、エピクロロヒドリン、グルタルアルデヒドなどの架橋剤を用いて、架橋構造を形成する方法などが挙げられる。このような化学的に架橋された酵素合成α‐１，４‐グルカン誘導体を含む例として、化学的に架橋された酵素合成α‐１，４‐グルカン誘導体およびヘパリン結合性成長因子を含む、ヘパリン結合性成長因子徐放用ゲルなどが挙げられる。
本発明における酵素合成α‐１，４‐グルカン誘導体は、皮膚外用剤または化粧料に含めることもできる。本発明における酵素合成α‐１，４‐グルカン誘導体は、ヘパリン代替機能の他にも、抗炎症作用、血行促進作用、そして皮膚の角質中における水分保持を助力する作用を有している。本発明における酵素合成α‐１，４‐グルカン誘導体を用いることによって、このような抗炎症作用、血行促進作用、そして水分保持助力作用を有する皮膚外用剤および化粧料を提供することができる。さらに、本発明における酵素合成α‐１，４‐グルカン誘導体およびヘパリン結合性成長因子を含む皮膚外用剤または化粧料を調製することによって、成長因子の活性を長期間保つことができ、これにより皮膚に有効に作用させることができる。具体的な化粧料として、例えばスキンケア用化粧料、頭皮用化粧料などが挙げられる。
製造例１ 平均分子量５ｋＤａのα‐１，４‐グルカンの調製
スクロース３％、スクロースホスホリラーゼ１２００Ｕ／Ｌ、グルカンホスホリラーゼ１２００Ｕ／Ｌ、無機リン酸１５ｍＭ、テトラップＨ（株式会社林原製）９０００μＭ、となるように混合した水溶液４Ｌを、４５℃で８時間酵素反応させた。反応終了後、反応液を１０℃で１４時間冷却し、α‐１，４‐グルカンを沈澱させた。得られた沈澱を熱風乾燥により乾燥させ、約５０ｇのα‐１，４‐グルカンを得た。このようにして得られたα‐１，４‐グルカンは、重量平均分子量約５ｋＤａ、分散度Ｍｗ／Ｍｎが１．０５であった。
スクロース３％、スクロースホスホリラーゼ１２００Ｕ／Ｌ、グルカンホスホリラーゼ１２００Ｕ／Ｌ、無機リン酸１５ｍＭ、テトラップＨ（株式会社林原製）９０００μＭ、となるように混合した水溶液４Ｌを、４５℃で８時間酵素反応させた。反応終了後、反応液を１０℃で１４時間冷却し、α‐１，４‐グルカンを沈澱させた。得られた沈澱を熱風乾燥により乾燥させ、約５０ｇのα‐１，４‐グルカンを得た。このようにして得られたα‐１，４‐グルカンは、重量平均分子量約５ｋＤａ、分散度Ｍｗ／Ｍｎが１．０５であった。
製造例２ 平均分子量３０ｋＤａのα‐１，４‐グルカンの調製
スクロース３％、スクロースホスホリラーゼ１２００Ｕ／Ｌ、グルカンホスホリラーゼ１２００Ｕ／Ｌ、無機リン酸１５ｍＭ、テトラップＨ（株式会社林原製）１５００μＭ、となるように混合した水溶液４Ｌを、４５℃で８時間酵素反応させた。反応終了後、反応液を１０℃で１４時間冷却し、α‐１，４‐グルカンを沈澱させた。得られた沈澱を熱風乾燥により乾燥させ、約５０ｇのα‐１，４‐グルカンを得た。このようにして得られたα‐１，４‐グルカンは、重量平均分子量約３０ｋＤａ、分散度Ｍｗ／Ｍｎが１．０２であった。
スクロース３％、スクロースホスホリラーゼ１２００Ｕ／Ｌ、グルカンホスホリラーゼ１２００Ｕ／Ｌ、無機リン酸１５ｍＭ、テトラップＨ（株式会社林原製）１５００μＭ、となるように混合した水溶液４Ｌを、４５℃で８時間酵素反応させた。反応終了後、反応液を１０℃で１４時間冷却し、α‐１，４‐グルカンを沈澱させた。得られた沈澱を熱風乾燥により乾燥させ、約５０ｇのα‐１，４‐グルカンを得た。このようにして得られたα‐１，４‐グルカンは、重量平均分子量約３０ｋＤａ、分散度Ｍｗ／Ｍｎが１．０２であった。
製造例３ 平均分子量９０ｋＤａのα‐１，４‐グルカンの調製
スクロース３％、スクロースホスホリラーゼ１２００Ｕ／Ｌ、グルカンホスホリラーゼ１２００Ｕ／Ｌ、無機リン酸１５ｍＭ、テトラップＨ（株式会社林原製）５００μＭ、となるように混合した水溶液４Ｌを、４５℃で８時間酵素反応させた。反応終了後、反応液を１０℃で１４時間冷却し、α‐１，４‐グルカンを沈澱させた。得られた沈澱を熱風乾燥により乾燥させ、約４５ｇのα‐１，４‐グルカンを得た。このようにして得られたα‐１，４‐グルカンは、重量平均分子量約９０ｋＤａ、分散度Ｍｗ／Ｍｎが１．０３であった。
スクロース３％、スクロースホスホリラーゼ１２００Ｕ／Ｌ、グルカンホスホリラーゼ１２００Ｕ／Ｌ、無機リン酸１５ｍＭ、テトラップＨ（株式会社林原製）５００μＭ、となるように混合した水溶液４Ｌを、４５℃で８時間酵素反応させた。反応終了後、反応液を１０℃で１４時間冷却し、α‐１，４‐グルカンを沈澱させた。得られた沈澱を熱風乾燥により乾燥させ、約４５ｇのα‐１，４‐グルカンを得た。このようにして得られたα‐１，４‐グルカンは、重量平均分子量約９０ｋＤａ、分散度Ｍｗ／Ｍｎが１．０３であった。
製造例４ 平均分子量５００ｋＤａのα‐１，４‐グルカンの調製
スクロース６％、スクロースホスホリラーゼ１２００Ｕ／Ｌ、グルカンホスホリラーゼ１２００Ｕ／Ｌ、無機リン酸３０ｍＭ、テトラップＨ（株式会社林原製）８０μＭ、となるように混合した水溶液４Ｌを、４５℃で８時間酵素反応させた。反応終了後、反応液に３３％になるようにエタノールを加え、α‐１，４‐グルカンを沈澱させた。得られた沈澱を熱風乾燥により乾燥させ、約９５ｇのα‐１，４‐グルカンを得た。このようにして得られたα‐１，４‐グルカンは、重量平均分子量約５００ｋＤａ、分散度Ｍｗ／Ｍｎが１．０３であった。
スクロース６％、スクロースホスホリラーゼ１２００Ｕ／Ｌ、グルカンホスホリラーゼ１２００Ｕ／Ｌ、無機リン酸３０ｍＭ、テトラップＨ（株式会社林原製）８０μＭ、となるように混合した水溶液４Ｌを、４５℃で８時間酵素反応させた。反応終了後、反応液に３３％になるようにエタノールを加え、α‐１，４‐グルカンを沈澱させた。得られた沈澱を熱風乾燥により乾燥させ、約９５ｇのα‐１，４‐グルカンを得た。このようにして得られたα‐１，４‐グルカンは、重量平均分子量約５００ｋＤａ、分散度Ｍｗ／Ｍｎが１．０３であった。
製造例５ 平均分子量１０００ｋＤａのα‐１，４‐グルカンの調製
スクロース６％、スクロースホスホリラーゼ１２００Ｕ／Ｌ、グルカンホスホリラーゼ１２００Ｕ／Ｌ、無機リン酸３０ｍＭ、テトラップＨ（株式会社林原製）１８μＭ、となるように混合した水溶液４Ｌを、４５℃で８時間酵素反応させた。反応終了後、反応液に３３％になるようにエタノールを加え、α‐１，４‐グルカンを沈澱させた。得られた沈澱を熱風乾燥により乾燥させ、約９０ｇのα‐１，４‐グルカンを得た。このようにして得られたα‐１，４‐グルカンは、重量平均分子量約１,０００ｋＤａ、分散度Ｍｗ／Ｍｎが１．０２であった。
スクロース６％、スクロースホスホリラーゼ１２００Ｕ／Ｌ、グルカンホスホリラーゼ１２００Ｕ／Ｌ、無機リン酸３０ｍＭ、テトラップＨ（株式会社林原製）１８μＭ、となるように混合した水溶液４Ｌを、４５℃で８時間酵素反応させた。反応終了後、反応液に３３％になるようにエタノールを加え、α‐１，４‐グルカンを沈澱させた。得られた沈澱を熱風乾燥により乾燥させ、約９０ｇのα‐１，４‐グルカンを得た。このようにして得られたα‐１，４‐グルカンは、重量平均分子量約１,０００ｋＤａ、分散度Ｍｗ／Ｍｎが１．０２であった。
参考例１ カルボン酸基を有するα‐１，４‐グルカン誘導体の調製
製造例１により得られた、平均分子量５ｋＤａの酵素合成α‐１，４‐グルカン２ｇを、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）４０ｍＬに溶解した。Ｎ，Ｎ‐ジイソプロピルエチレンアミン（ＤＩＰＥＡ）６.３ｍＬと無水コハク酸３.６ｇを添加し、２０℃で１時間撹拌した。反応終了後、１６０ｍＬの超純水で希釈し、透析を行った。３日間の透析後、凍結乾燥を行い、カルボン酸基を有するα‐１，４‐グルカン誘導体を得た。得られた試料の赤外吸収スペクトルにおいて、１７３０〜１７３５ｃｍ−１にエステルに帰属される新たな吸収の出現を確認し、カルボン酸基が導入されたことが確認された。
製造例１により得られた、平均分子量５ｋＤａの酵素合成α‐１，４‐グルカン２ｇを、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）４０ｍＬに溶解した。Ｎ，Ｎ‐ジイソプロピルエチレンアミン（ＤＩＰＥＡ）６.３ｍＬと無水コハク酸３.６ｇを添加し、２０℃で１時間撹拌した。反応終了後、１６０ｍＬの超純水で希釈し、透析を行った。３日間の透析後、凍結乾燥を行い、カルボン酸基を有するα‐１，４‐グルカン誘導体を得た。得られた試料の赤外吸収スペクトルにおいて、１７３０〜１７３５ｃｍ−１にエステルに帰属される新たな吸収の出現を確認し、カルボン酸基が導入されたことが確認された。
実施例１ カルボン酸基およびスルホン酸基を有するα‐１，４‐グルカン誘導体の調製
参考例１により得られたα‐１，４‐グルカン誘導体２ｇを、１３８ｍＬのＤＭＳＯに溶解した。タウリン０．６４ｇ（得られたα‐１，４‐グルカン誘導体のカルボン酸基１モルに対して０．５モル当量）を添加し撹拌した。溶解後、Ｎ‐ヒドロキシコハク酸イミド（ＨＯＳｕ）０．５９ｇ（得られたα‐１，４‐グルカン誘導体のカルボン酸基１モルに対して０．５モル当量）、Ｎ,Ｎ‐ジイソプロピルエチレンアミン（ＤＩＰＥＡ）０．８９ｍＬ（得られたα‐１，４‐グルカン誘導体のカルボン酸基１モルに対して０．５モル当量）を添加しさらに撹拌した。１‐エチル‐３‐(３−ジメチルアミノプロピル)‐カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ・ＨＣｌ）１．９６ｇ（得られたα‐１，４‐グルカン誘導体のカルボン酸基１モルに対して１．０モル当量）を添加し２０℃で一晩撹拌した。反応終了後、５５２ｍＬの超純水で希釈し、透析を行った。３日間の透析後、凍結乾燥を行い、カルボン酸基およびスルホン酸基を有するα‐１，４‐グルカン誘導体を得た。得られた試料の赤外吸収スペクトルにおいて、１７３０〜１７３５ｃｍ−１にエステルに帰属される吸収の存在を確認しカルボン酸基の存在を確認し、さらにアミドＩに帰属される１６４０〜１６６０ｃｍ−１、アミドＩＩに帰属される１５６０〜１５６５ｃｍ−１、スルホン酸に帰属される１０３７〜１０４１ｃｍ−１、１１７４〜１１８１ｃｍ−１、１２１１〜１２１５ｃｍ−１にそれぞれ新たな吸収の出現を確認し、スルホン酸基が導入されたことを確認した。
参考例１により得られたα‐１，４‐グルカン誘導体２ｇを、１３８ｍＬのＤＭＳＯに溶解した。タウリン０．６４ｇ（得られたα‐１，４‐グルカン誘導体のカルボン酸基１モルに対して０．５モル当量）を添加し撹拌した。溶解後、Ｎ‐ヒドロキシコハク酸イミド（ＨＯＳｕ）０．５９ｇ（得られたα‐１，４‐グルカン誘導体のカルボン酸基１モルに対して０．５モル当量）、Ｎ,Ｎ‐ジイソプロピルエチレンアミン（ＤＩＰＥＡ）０．８９ｍＬ（得られたα‐１，４‐グルカン誘導体のカルボン酸基１モルに対して０．５モル当量）を添加しさらに撹拌した。１‐エチル‐３‐(３−ジメチルアミノプロピル)‐カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ・ＨＣｌ）１．９６ｇ（得られたα‐１，４‐グルカン誘導体のカルボン酸基１モルに対して１．０モル当量）を添加し２０℃で一晩撹拌した。反応終了後、５５２ｍＬの超純水で希釈し、透析を行った。３日間の透析後、凍結乾燥を行い、カルボン酸基およびスルホン酸基を有するα‐１，４‐グルカン誘導体を得た。得られた試料の赤外吸収スペクトルにおいて、１７３０〜１７３５ｃｍ−１にエステルに帰属される吸収の存在を確認しカルボン酸基の存在を確認し、さらにアミドＩに帰属される１６４０〜１６６０ｃｍ−１、アミドＩＩに帰属される１５６０〜１５６５ｃｍ−１、スルホン酸に帰属される１０３７〜１０４１ｃｍ−１、１１７４〜１１８１ｃｍ−１、１２１１〜１２１５ｃｍ−１にそれぞれ新たな吸収の出現を確認し、スルホン酸基が導入されたことを確認した。
参考例２ スルホン酸基を有するα‐１，４‐グルカンの調製方法
参考例１により得られたα‐１，４‐グルカン誘導体２ｇを、１３８ｍＬのＤＭＳＯに溶解した。タウリン３．８４ｇ（得られたα‐１，４‐グルカン誘導体のカルボン酸基１モルに対して３．０モル当量）を添加し撹拌した。溶解後、Ｎ‐ヒドロキシコハク酸イミド（ＨＯＳｕ）３．５４ｇ（得られたα‐１，４‐グルカン誘導体のカルボン酸基１モルに対して３．０モル当量）、Ｎ,Ｎ‐ジイソプロピルエチレンアミン（ＤＩＰＥＡ）５．３６ｍＬ（得られたα‐１，４‐グルカン誘導体のカルボン酸基１モルに対して３．０モル当量）を添加しさらに撹拌した。１‐エチル‐３‐(３−ジメチルアミノプロピル)‐カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ・ＨＣｌ）１１．８ｇ（得られたα‐１，４‐グルカン誘導体のカルボン酸基１モルに対して６．０モル当量）を添加し２０℃で一晩撹拌した。反応終了後、５５２ｍＬの超純水で希釈し、透析を行った。３日間の透析後、凍結乾燥を行い、スルホン酸基を有するα‐１，４‐グルカン誘導体を得た。得られた試料の赤外吸収スペクトルにおいて、アミドＩに帰属される１６４０〜１６６０ｃｍ−１、アミドＩＩに帰属される１５６０〜１５６５ｃｍ−１、スルホン酸に帰属される１０３７〜１０４１ｃｍ−１、１１７４〜１１８１ｃｍ−１、１２１１〜１２１５ｃｍ−１にそれぞれ新たな吸収の出現を確認し、スルホン酸基が導入されたことを確認した。
参考例１により得られたα‐１，４‐グルカン誘導体２ｇを、１３８ｍＬのＤＭＳＯに溶解した。タウリン３．８４ｇ（得られたα‐１，４‐グルカン誘導体のカルボン酸基１モルに対して３．０モル当量）を添加し撹拌した。溶解後、Ｎ‐ヒドロキシコハク酸イミド（ＨＯＳｕ）３．５４ｇ（得られたα‐１，４‐グルカン誘導体のカルボン酸基１モルに対して３．０モル当量）、Ｎ,Ｎ‐ジイソプロピルエチレンアミン（ＤＩＰＥＡ）５．３６ｍＬ（得られたα‐１，４‐グルカン誘導体のカルボン酸基１モルに対して３．０モル当量）を添加しさらに撹拌した。１‐エチル‐３‐(３−ジメチルアミノプロピル)‐カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ・ＨＣｌ）１１．８ｇ（得られたα‐１，４‐グルカン誘導体のカルボン酸基１モルに対して６．０モル当量）を添加し２０℃で一晩撹拌した。反応終了後、５５２ｍＬの超純水で希釈し、透析を行った。３日間の透析後、凍結乾燥を行い、スルホン酸基を有するα‐１，４‐グルカン誘導体を得た。得られた試料の赤外吸収スペクトルにおいて、アミドＩに帰属される１６４０〜１６６０ｃｍ−１、アミドＩＩに帰属される１５６０〜１５６５ｃｍ−１、スルホン酸に帰属される１０３７〜１０４１ｃｍ−１、１１７４〜１１８１ｃｍ−１、１２１１〜１２１５ｃｍ−１にそれぞれ新たな吸収の出現を確認し、スルホン酸基が導入されたことを確認した。
参考例３ スルホン酸基を有するα‐１，４‐グルカン誘導体の調製
平均分子量５ｋＤａの酵素合成α‐１，４‐グルカンの代わりに、製造例２により得られた平均分子量３０ｋＤａの酵素合成α‐１，４‐グルカン２ｇを用いたこと以外は参考例１と同様にして、カルボン酸基を有するα‐１，４‐グルカン誘導体を得た。
こうして得られたカルボン酸基を有するα‐１，４‐グルカン誘導体を、実施例１により得られたα‐１，４‐グルカン誘導体の代わりに用いたこと以外は実施例３と同様にして、スルホン酸基を有するα‐１，４‐グルカン誘導体を得た。
平均分子量５ｋＤａの酵素合成α‐１，４‐グルカンの代わりに、製造例２により得られた平均分子量３０ｋＤａの酵素合成α‐１，４‐グルカン２ｇを用いたこと以外は参考例１と同様にして、カルボン酸基を有するα‐１，４‐グルカン誘導体を得た。
こうして得られたカルボン酸基を有するα‐１，４‐グルカン誘導体を、実施例１により得られたα‐１，４‐グルカン誘導体の代わりに用いたこと以外は実施例３と同様にして、スルホン酸基を有するα‐１，４‐グルカン誘導体を得た。
参考例４ カルボン酸基を有するα‐１，４‐グルカン誘導体の調製
平均分子量５ｋＤａの酵素合成α‐１，４‐グルカンの代わりに、製造例３により得られた平均分子量９０ｋＤａの酵素合成α‐１，４‐グルカン２ｇを用いたこと以外は参考例１と同様にして、カルボン酸基を有するα‐１，４‐グルカン誘導体を得た。
平均分子量５ｋＤａの酵素合成α‐１，４‐グルカンの代わりに、製造例３により得られた平均分子量９０ｋＤａの酵素合成α‐１，４‐グルカン２ｇを用いたこと以外は参考例１と同様にして、カルボン酸基を有するα‐１，４‐グルカン誘導体を得た。
実施例２ カルボン酸基およびスルホン酸基を有するα‐１，４‐グルカン誘導体の調製
参考例１により得られたα‐１，４‐グルカン誘導体の代わりに、参考例４より得られた平均分子量９０ｋＤａの酵素合成α‐１，４‐グルカン誘導体２ｇを用いたこと以外は実施例１と同様にして、カルボン酸基およびスルホン酸基を有するα‐１，４‐グルカン誘導体を得た。
参考例１により得られたα‐１，４‐グルカン誘導体の代わりに、参考例４より得られた平均分子量９０ｋＤａの酵素合成α‐１，４‐グルカン誘導体２ｇを用いたこと以外は実施例１と同様にして、カルボン酸基およびスルホン酸基を有するα‐１，４‐グルカン誘導体を得た。
参考例５ スルホン酸基を有するα‐１，４‐グルカン誘導体の調製
参考例１により得られたα‐１，４‐グルカン誘導体の代わりに、参考例４より得られた平均分子量９０ｋＤａの酵素合成α‐１，４‐グルカン誘導体２ｇを用いたこと以外は参考例２と同様にして、スルホン酸基を有するα‐１，４‐グルカン誘導体を得た。
参考例１により得られたα‐１，４‐グルカン誘導体の代わりに、参考例４より得られた平均分子量９０ｋＤａの酵素合成α‐１，４‐グルカン誘導体２ｇを用いたこと以外は参考例２と同様にして、スルホン酸基を有するα‐１，４‐グルカン誘導体を得た。
参考例６ スルホン酸基を有するα‐１，４‐グルカン誘導体の調製
平均分子量５ｋＤａの酵素合成α‐１，４‐グルカンの代わりに、製造例４により得られた平均分子量５００ｋＤａの酵素合成α‐１，４‐グルカン２ｇを用いたこと以外は参考例１と同様にして、カルボン酸基を有するα‐１，４‐グルカン誘導体を得た。
こうして得られたカルボン酸基を有するα‐１，４‐グルカン誘導体を、参考例１により得られたα‐１，４‐グルカン誘導体の代わりに用いたこと以外は参考例２と同様にして、スルホン酸基を有するα‐１，４‐グルカン誘導体を得た。
平均分子量５ｋＤａの酵素合成α‐１，４‐グルカンの代わりに、製造例４により得られた平均分子量５００ｋＤａの酵素合成α‐１，４‐グルカン２ｇを用いたこと以外は参考例１と同様にして、カルボン酸基を有するα‐１，４‐グルカン誘導体を得た。
こうして得られたカルボン酸基を有するα‐１，４‐グルカン誘導体を、参考例１により得られたα‐１，４‐グルカン誘導体の代わりに用いたこと以外は参考例２と同様にして、スルホン酸基を有するα‐１，４‐グルカン誘導体を得た。
参考例６ カルボン酸基を有するα‐１，４‐グルカン誘導体の調製
平均分子量５ｋＤａの酵素合成α‐１，４‐グルカンの代わりに、製造例５により得られた平均分子量１０００ｋＤａの酵素合成α‐１，４‐グルカン２ｇを用いたこと以外は参考例１と同様にして、カルボン酸基を有するα‐１，４‐グルカン誘導体を得た。
平均分子量５ｋＤａの酵素合成α‐１，４‐グルカンの代わりに、製造例５により得られた平均分子量１０００ｋＤａの酵素合成α‐１，４‐グルカン２ｇを用いたこと以外は参考例１と同様にして、カルボン酸基を有するα‐１，４‐グルカン誘導体を得た。
実施例３ カルボン酸基およびスルホン酸基を有するα‐１，４‐グルカン誘導体の調製
参考例１により得られたα‐１，４‐グルカン誘導体の代わりに、参考例７により得られた平均分子量１０００ｋＤａの酵素合成α‐１，４‐グルカン誘導体２ｇを用いたこと以外は実施例１と同様にして、カルボン酸基およびスルホン酸基を有するα‐１，４‐グルカン誘導体を得た。
参考例１により得られたα‐１，４‐グルカン誘導体の代わりに、参考例７により得られた平均分子量１０００ｋＤａの酵素合成α‐１，４‐グルカン誘導体２ｇを用いたこと以外は実施例１と同様にして、カルボン酸基およびスルホン酸基を有するα‐１，４‐グルカン誘導体を得た。
参考例８ スルホン酸基を有するα‐１，４‐グルカン誘導体の調製
参考例１により得られたα‐１，４‐グルカン誘導体の代わりに、参考例７により得られた平均分子量１０００ｋＤａの酵素合成α‐１，４‐グルカン２ｇを用いたこと以外は参考例２と同様にして、スルホン酸基を有するα‐１，４‐グルカン誘導体を得た。
参考例１により得られたα‐１，４‐グルカン誘導体の代わりに、参考例７により得られた平均分子量１０００ｋＤａの酵素合成α‐１，４‐グルカン２ｇを用いたこと以外は参考例２と同様にして、スルホン酸基を有するα‐１，４‐グルカン誘導体を得た。
以下の表１〜４に、本発明または参考例のα‐１，４‐グルカン誘導体が有するカルボン酸基および／またはスルホン酸基の置換度について記載する。なおこれらのα‐１，４‐グルカン誘導体の置換度は、核磁気共鳴法（ＮＭＲ）により求めた。重水素置換した各試料を重ＤＭＳＯに溶解し、ＮＭＲ（ＥＣＰ６００、日本電子製）を用いて１Ｈ−ＮＭＲ測定をした。得られたスペクトルのα‐１，４‐グルカン由来のプロトン、カルボン酸基由来のプロトンおよびスルホン酸基由来のプロトンの面積比から置換度を計算した。α‐１，４‐グルカン誘導体の置換度を下記表に示す。
上記表１〜３中、「＊」はデータを測定していない。
参考例９ スルホン酸基を有するα‐１，４‐グルカン誘導体の抗血液凝固活性試験の方法と結果
参考例３で得られたスルホン酸基を有するα‐１，４‐グルカン誘導体（平均分子量：３０ｋＤａ）０.０１ｇ、および参考例６で得られたスルホン酸基を有するα‐１，４‐グルカン誘導体（平均分子量：５００ｋＤａ）０.０１ｇを、それぞれ１ｍＬの生理食塩水溶液中に溶解した。
上記とは別途、血漿（ドライへマト血液凝固コントロール血漿レベル１、和光純薬製）を０.５ｍＬの超純水に溶解して血漿溶液を調製した。
また、Ｂｏｃ−ＶＰＲ−ＭＣＡ（１０ｍＭのＤＭＳＯ溶液）１０μＬをトリスバッファー９０μＬで希釈した、１０倍希釈Ｂｏｃ−ＶＰＲ−ＭＣＡ溶液を調製した。
また、ＡＭＣ（１０ｍＭのＤＭＳＯ溶液）５ｍＬをトリスバッファー４５μＬで希釈した、トリスバッファー溶液を調製した。
さらに、０.１ｇの塩化カルシウムを１０ｍＬの超純水で溶解し、１重量％の塩化カルシウム溶液を調製した。
参考例３で得られたスルホン酸基を有するα‐１，４‐グルカン誘導体（平均分子量：３０ｋＤａ）０.０１ｇ、および参考例６で得られたスルホン酸基を有するα‐１，４‐グルカン誘導体（平均分子量：５００ｋＤａ）０.０１ｇを、それぞれ１ｍＬの生理食塩水溶液中に溶解した。
上記とは別途、血漿（ドライへマト血液凝固コントロール血漿レベル１、和光純薬製）を０.５ｍＬの超純水に溶解して血漿溶液を調製した。
また、Ｂｏｃ−ＶＰＲ−ＭＣＡ（１０ｍＭのＤＭＳＯ溶液）１０μＬをトリスバッファー９０μＬで希釈した、１０倍希釈Ｂｏｃ−ＶＰＲ−ＭＣＡ溶液を調製した。
また、ＡＭＣ（１０ｍＭのＤＭＳＯ溶液）５ｍＬをトリスバッファー４５μＬで希釈した、トリスバッファー溶液を調製した。
さらに、０.１ｇの塩化カルシウムを１０ｍＬの超純水で溶解し、１重量％の塩化カルシウム溶液を調製した。
上記で作製した各溶液を、以下に示す割合で混合した。
＊低分子量ヘパリン：シグマ社製造、ブタ腸管粘膜由来、分子量約６０００Ｄａ
９６穴プレート（Ｎｕｎｃ社製）の各穴に１００μＬずつ各溶液を分注し、アミノメチルクマリン（ＡＭＣ）の３６０ｎｍの励起光に対する４６５ｎｍの蛍光発光を、Ｔｅｃａｎ社製プレートリーダー（品番ＳＰＥＣＴＲＡ Ｆｌｕｏｒ Ｐｌｕｓ）を用いて、１０分間隔で１時間測定した（図１）。トロンビンが活性化されると、トロンビンの基質であるＢｏｃ−ＶＰＲ−ＭＣＡは分解され、ＡＭＣが遊離する。このＡＭＣの蛍光強度を測定することによりトロンビンの活性を測定した。図１の結果から、本発明のスルホン酸基を有するα‐１，４‐グルカン誘導体は、トロンビン活性を抑制することが明らかである。トロンビン活性を抑制すれば、血漿中のフィブリノーゲンからフィブリン塊の形成を抑制することができる。この実施例によって、本発明のスルホン酸基を有するα‐１，４‐グルカン誘導体は抗血液凝固機能を有することが確認された。
実施例４ 本発明のα‐１，４‐グルカン誘導体の抗血液凝固活性試験の方法と結果
下記表４に示した各試料１ｍｇを１ｍＬのトリスバッファーで溶解した。血漿（ドライへマト血液凝固コントロール血漿レベル１、和光純薬製）を０.５ｍＬの超純水に溶解したのち、２ｍＬのトリスバッファーを加えて希釈した。それ以外は参考例９と同様な方法で抗血液凝固活性試験を行った。試験開始から８時間後における、蛍光基質Ｂｏｃ−ＶＰＲ−ＭＣＡの分解率を図２に示す。
図２に示されるとおり、いずれの分子量のα‐１，４‐グルカンにおいても、スルホン酸基およびカルボン酸基の両方を有する試料すなわち５ｋ−２、９０ｋ−２、１０００ｋ−２の分解率が低く、より高い抗血液凝固活性を持つことが確認された。
下記表４に示した各試料１ｍｇを１ｍＬのトリスバッファーで溶解した。血漿（ドライへマト血液凝固コントロール血漿レベル１、和光純薬製）を０.５ｍＬの超純水に溶解したのち、２ｍＬのトリスバッファーを加えて希釈した。それ以外は参考例９と同様な方法で抗血液凝固活性試験を行った。試験開始から８時間後における、蛍光基質Ｂｏｃ−ＶＰＲ−ＭＣＡの分解率を図２に示す。
図２に示されるとおり、いずれの分子量のα‐１，４‐グルカンにおいても、スルホン酸基およびカルボン酸基の両方を有する試料すなわち５ｋ−２、９０ｋ−２、１０００ｋ−２の分解率が低く、より高い抗血液凝固活性を持つことが確認された。
参考例１０ ヘパリン結合性成長因子用徐放基材の調製
１４−１ エチレンジアミン２Ｎ‐ヒドロキシコハク酸イミド塩（ＥＤＡ・２ＨＯＳｕ)の調製
２.３ｇのＮ‐ヒドロキシコハク酸イミド（ＨＯＳｕ）を酢酸エチル１５０ｍＬに溶解し、１０ｍＬの酢酸エチルに溶解した０.６ｇのエチレンジアミン（ＥＤＡ）を室温で撹拌しながら滴下した。滴下終了後さらに１時間撹拌した。析出した結晶を熱メタノールから再結晶して２.０ｇのエチレンジアミン２Ｎ‐ヒドロキシコハク酸イミド塩（ＥＤＡ・２ＨＯＳｕ）を得た。
１４−１ エチレンジアミン２Ｎ‐ヒドロキシコハク酸イミド塩（ＥＤＡ・２ＨＯＳｕ)の調製
２.３ｇのＮ‐ヒドロキシコハク酸イミド（ＨＯＳｕ）を酢酸エチル１５０ｍＬに溶解し、１０ｍＬの酢酸エチルに溶解した０.６ｇのエチレンジアミン（ＥＤＡ）を室温で撹拌しながら滴下した。滴下終了後さらに１時間撹拌した。析出した結晶を熱メタノールから再結晶して２.０ｇのエチレンジアミン２Ｎ‐ヒドロキシコハク酸イミド塩（ＥＤＡ・２ＨＯＳｕ）を得た。
１４−２ ヘパリン結合性成長因子用徐放基材の調製
参考例７より得られた、カルボン酸基を有するα‐１，４‐グルカン誘導体２ｇを、１３８ｍＬのＤＭＳＯに溶解した。タウリン０．５ｇを添加し撹拌した。溶解後、Ｎ‐ヒドロキシコハク酸イミド（ＨＯＳｕ）０．７５ｇ、Ｎ,Ｎ‐ジイソプロピルエチレンアミン（ＤＩＰＥＡ）１．１ｍＬを添加しさらに撹拌した。１‐エチル‐３‐（３‐ジメチルアミノプロピル）‐カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ・ＨＣｌ）２．６ｇを添加し、２０℃で一晩撹拌した。反応終了後、５５２ｍＬの超純水で希釈し、透析を行った。３日間の透析後、凍結乾燥を行った。得られた試料の赤外吸収スペクトルよりスルホン酸化されたことを確認した。得られたスルホン酸基を有する酵素合成α‐１，４‐グルカン１ｇに超純水４０ｍＬを加え溶解した。
参考例７より得られた、カルボン酸基を有するα‐１，４‐グルカン誘導体２ｇを、１３８ｍＬのＤＭＳＯに溶解した。タウリン０．５ｇを添加し撹拌した。溶解後、Ｎ‐ヒドロキシコハク酸イミド（ＨＯＳｕ）０．７５ｇ、Ｎ,Ｎ‐ジイソプロピルエチレンアミン（ＤＩＰＥＡ）１．１ｍＬを添加しさらに撹拌した。１‐エチル‐３‐（３‐ジメチルアミノプロピル）‐カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ・ＨＣｌ）２．６ｇを添加し、２０℃で一晩撹拌した。反応終了後、５５２ｍＬの超純水で希釈し、透析を行った。３日間の透析後、凍結乾燥を行った。得られた試料の赤外吸収スペクトルよりスルホン酸化されたことを確認した。得られたスルホン酸基を有する酵素合成α‐１，４‐グルカン１ｇに超純水４０ｍＬを加え溶解した。
上記より得られたエチレンジアミン２Ｎ‐ヒドロキシコハク酸イミド塩（ＥＤＡ・２ＨＯＳｕ）０.４４ｇを溶解し、溶解後、１‐エチル‐３‐(３‐ジメチルアミノプロピル)‐カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ・ＨＣｌ)３．２ｇを添加し室温下で撹拌した。１３ｃｍ×１７ｃｍのテフロン被覆したステンレストレイに流延し、約２５℃で４８時間静置し架橋体を得た。得られた架橋体を２.５ｍＭの塩化カルシウムと１４３ｍＭの塩化ナトリウムを含む水溶液で十分に洗浄した。その後、超純水で数回洗浄し、凍結乾燥してキセロゲル状の徐放基材を得た。
本発明の酵素合成α‐１，４‐グルカン誘導体からなる新規なヘパリン代替材料は、抗血液凝固作用およびヘパリン結合性成長因子用貯蔵および徐放材としての機能を有し、とりわけ医療用製剤または医療用物品および化粧料に利用することができる。
Claims (12)
- 酵素合成α‐１，４‐グルカン誘導体がスルホン酸基およびカルボン酸基を有するヘパリン代替材料であって、
該酵素合成α‐１，４‐グルカン誘導体が有するカルボン酸基は、酵素合成α‐１，４‐グルカン誘導体と二塩基酸とを反応させることによって導入されたカルボン酸基である、
ヘパリン代替材料。 - 前記二塩基酸はコハク酸である、請求項１記載のヘパリン代替材料。
- 抗血液凝固機能を有する請求項１または２記載のヘパリン代替材料。
- 請求項１または２記載の酵素合成α‐１，４‐グルカン誘導体を含有する抗血液凝固製剤。
- 請求項１または２記載の酵素合成α‐１，４‐グルカン誘導体を含有する皮膚外用剤または化粧料。
- 請求項１または２記載の酵素合成α‐１，４‐グルカン誘導体を表面にコーティングした、医療用具。
- 採血用注射器、人工臓器、ゲル、糸、フィルム、スポンジ、不織布、ガーゼ、バイパス、膜から成る群から選択される何れかである、請求項６に記載の医療用具。
- ヘパリン結合性成長因子徐放機能を有する請求項１または２記載のヘパリン代替材料。
- 請求項１または２記載の酵素合成α‐１，４‐グルカン誘導体およびヘパリン結合性成長因子を含有する、ヘパリン結合性成長因子徐放用組成物。
- 請求項１または２記載の酵素合成α‐１，４‐グルカン誘導体およびヘパリン結合性成長因子を含有する、ヘパリン結合性成長因子徐放用成型物。
- 請求項１または２記載の酵素合成α‐１，４‐グルカン誘導体を化学的に架橋された酵素合成α‐１，４‐グルカン誘導体；およびヘパリン結合性成長因子；を含有する、ヘパリン結合性成長因子徐放用ゲル。
- 酵素合成α‐１，４‐グルカンと、二塩基酸とを反応させて、酵素合成α‐１，４‐グルカンにカルボン酸基を導入する、カルボン酸基導入工程、
カルボン酸基導入工程により得られたカルボン酸基を有する酵素合成α‐１，４‐グルカン誘導体と、アミノ基およびスルホン酸基含有化合物とを反応させて、カルボン酸基の一部にスルホン酸基を導入する、スルホン酸基導入工程
を包含する工程によって得られる、請求項１記載のヘパリン代替材料。
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