KR102308721B1 - 세로토닌 수식 히알루론산을 포함하는 하이드로젤 및 이의 용도 - Google Patents

세로토닌 수식 히알루론산을 포함하는 하이드로젤 및 이의 용도 Download PDF

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Abstract

본 발명은 세로토닌으로 수식된 히알루론산을 포함하는 하이드로젤, 이의 용도 및 이의 제조방법에 관한 것이다.

Description

세로토닌 수식 히알루론산을 포함하는 하이드로젤 및 이의 용도{HYDROGEL COMPRISING HYALURONIC ACID MODIFIED BY SEROTONIN AND USES THEREOF}
본 발명은 세로토닌으로 수식된 히알루론산을 포함하는 하이드로젤, 이의 용도 및 이의 제조방법에 관한 것이다.
외과적 수술 및 치료에 있어 기능성 의료용 제제의 필요성이 갈수록 증가하고 있으며, 이미 다양한 종류의 제품들이 개발되어 임상적으로 사용되고 있다.
그 중에서, 현재 시판되는 지혈제 대부분은 피브린 계열의 유도체로 구성되어 있고, 피브리노겐 단백질 용액과 트롬빈 단백질 용액을 혼합하여 반응시킴으로써 피브린 덩어리를 형성하여 출혈 부위를 물리적으로 막는 단순 응고 방식으로 작용한다. 이 경우 충분한 지혈 효과를 얻기 위해서는 많은 양의 지혈제가 요구되고, 그로 인해 형성된 피브린 덩어리는 상처 재생을 더디게 하거나 이후 주변 조직과 유착을 유발하는 부작용이 발생할 가능성이 존재한다.
또한, 지혈제의 사용이 요구되는 상황에서 종래 피브린 계열의 지혈제를 사용하는 경우, 조직 유착이 일어나기 쉽기 때문에 지혈제 외에 유착방지제를 추가적으로 처리해줘야 하며, 이러한 추가적 처리가 요구되기 때문에 임상적으로 편의성이 떨어지고 경제적인 부담이 동반된다는 문제점이 존재한다.
이러한 물리적으로 지혈을 유도하는 종래의 지혈제가 갖는 문제점을 극복하기 위해 지혈제의 지혈 성능을 개선하고, 과도한 피브린 덩어리에 의해 발생되는 부작용을 해결할 수 있는 새로운 기술의 필요성이 증대되고 있으며, 나아가 단일 제품으로 상기한 복합적인 기능을 수행할 수 있는 기능성 의료용 제제의 필요성이 증가하고 있다.
한국공개특허 제10-2014-0127286호 한국등록특허 제10-1040561호
본 발명의 목적은 세로토닌으로 수식된 히알루론산을 포함하는 하이드로젤을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 하이드로젤을 포함하는 지혈제 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 하이드로젤을 포함하는 조직 접착제 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 하이드로젤을 포함하는 세포 분화 촉진용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 하이드로젤을 포함하는 세포 배양용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 하이드로젤을 포함하는 약물 전달용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 하이드로젤을 제조하는 방법을 제공하는 것이다.
상기와 같은 본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명의 일 측면은 세로토닌으로 수식된 히알루론산을 포함하는 하이드로젤에 관한 것이다.
본 발명에서, “세로토닌(serotonin, 5-hydroxytryptamine)”은 아미노산인 트립토판에서 유도된 화학물질로서, 뇌, 내장조직, 혈소판, 비만세포에 들어 있으며, 5-하이드록시트립타민이라고도 한다. 인간과 동물의 위장관과 혈소판, 중추신경계에 주로 존재하며 행복의 감정을 느끼게 해주는 분자로, 호르몬이 아님에도 해피니스 호르몬(happiness hormone)이라 불리기도 한다. 또한, 정신 질환(우울증, 공격성, 공황발작, 강박 장애, 정신병, 정신분열증, 자살 충동증), 신경퇴행 질환(알츠하이머 타입 치매, 파킨슨증, 헌팅톤 무도병), 거식증, 대식증, 알코올중독 관련 질환, 뇌혈관 사고 및 편두통과 같은 다양한 타입의 병리학적 질환에서 중요한 인자임이 보고된 바 있다(Meltzer, Neuropsychopharmacology, 21:106S-115S (1999); Barnes & Sharp, Neuropharmacology, 38:1083-1152 (1999); Glennon, Neurosci. Biobehavioral Rev., 14:35 (1990)).
본 발명에서, “히알루론산(hyaluronic acid)”은 아미노산과 우론산으로 이루어지는 복잡한 다당류의 하나로, N-아세틸글루코사민과 글루쿠론산으로 이루어진 고분자 화합물이다. 생체유래 고분자로서 생체 적용시 부작용이 거의 발생하지 않으며, 당을 포함하는 구조로 인해 친수성이다. 또한, 수분을 많이 함유하여 관절에서 물리적 완충효과 및 윤활효과를 가지며, 피부의 유연성에 관여하는 것으로 알려져 있고, 생체 내 존재하는 대표적인 세포외기질 성분 중 하나로서, 체내에서 분해되기 때문에 장기간 면역반응을 유도하거나 조직 재생을 방해하는 우려가 적다. 나아가, 히알루론산 효소(hyaluronidase)에 의해 생분해되기 때문에 다양한 약물을 히알루론산과 결합시킴으로써 약물 전달 시스템의 중요한 소재로 활용될 수 있다.
본 발명에서, “하이드로젤(hydrogel)”은 분산매가 물이거나 물이 기본 성분으로 들어 있는 젤로서, 본 발명에서의 하이드로젤은 세로토닌으로 수식된 히알루론산을 포함하는 것을 특징으로 한다.
또한, 하이드로젤의 탄성, 점착성 등의 물성은 더 높은 하중에 노출되는 소정의 조직, 예컨대, 관절 연골 또는 뼈의 결함의 치료를 위한 지지체로 사용되는 하이드로젤에 매우 중요한 요소이며, 본 발명의 하이드로젤은 산화 조건의 조절을 통해 물성을 조절할 수 있는 바, 조건에 맞추어 제작하여 사용할 수 있다.
구체적으로, 상기 세로토닌으로 수식된 히알루론산 유도체는 하기 화학식 1의 구조를 갖는 것일 수 있다.
[화학식 1]
Figure 112019026278166-pat00001
(R1은
Figure 112019026278166-pat00002
이다.)
더욱 구체적으로, 상기 하이드로젤은 상기 화학식 1의 반복단위구조를 포함하는 것일 수 있다. 반복단위는 특별히 제한되지 않으며, 필요에 따라 적절히 반복수를 변경하면서 적용할 수 있다. 예를 들어, 넓은 범위에서의 하이드로젤의 적용이 필요한 경우, 다수의 반복단위가 필요할 수 있으며, 국소 부위에서의 적용의 경우 반복단위는 상대적으로 적은 수로 포함될 수 있다.
또한 구체적으로, 상기 하이드로젤은 혈액 응고 촉진, 지혈, 조직 유착 방지, 세포 분화 촉진, 세포 배양 및 약물 전달로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 용도를 나타내는 것일 수 있다. 또한 구체적으로, 상기 하이드로젤은 접착성인 것일 수 있다.
본 발명 일 실시예에서는 본 발명의 하이드로젤을 처리한 경우 혈액응고 인자들의 분비량이 증가하는 것을 확인하였으며, 다른 모든 군 대비 가장 많은 양의 혈액 응고가 일어남을 확인하였다(도 14). 또한, 간 출혈 동물의 출혈 부위에 본 발명의 세로토닌 수식 히알루론산 하이드로젤을 접착시킨 경우 기존의 상용화 된 지혈제에 비해 현저히 우수한 지혈 효과를 나타냄을 확인하였다(도 15 및 도 16). 상기와 같은 결과로부터 본 발명의 하이드로젤이 혈액 응고 촉진 및/또는 지혈 용도로 활용될 수 있음을 확인하였다.
또한, 본 발명 일 실시예에서는 지혈시 나타나는 조직 유착과 관련하여, 종래의 지혈제가 조직 유착을 나타내는 반면 본 발명의 하이드로젤을 처리한 경우 조직간 접착이 일어나지 않음을 확인하였는 바(도 17), 조직 유착 방지 용도로 활용될 수 있음을 확인하였다.
또한, 본 발명 일 실시예에서는 인간 신경줄기세포(human neural stem cell; hNSC)를 본 발명의 하이드로젤 내에 봉입하여 삼차원 배양을 한 결과, 분화가 촉진되어 신경세포 특이적 마커(TUJ1)가 높게 발현이 되고 신경 돌기가 잘 뻗는 것을 확인하였는 바(도 21), 세포 분화 촉진 용도로 활용될 수 있음을 확인하였다.
또한, 본 발명 일 실시예에서는 인간 지방유래 줄기세포(hADSCs) 및 인간 혈관내피세포(HUVEC 세포)를 본 발명의 하이드로젤 내에 봉입하여 삼차원 배양을 한 결과, 각각의 세포가 고유의 특이적인 형태를 유지하면서 증식한 것을 확인하였는 바(도 22), 세포 배양 용도로 활용될 수 있음을 확인하였다.
또한, 본 발명 일 실시예에서는 체내 환경과 같이 히알루론산이 분해될 수 있는 환경에서 하이드로젤 내에 담지된 인자가 하이드로젤이 생분해됨에 따라 서서히 방출됨을 확인하였는 바(도 23), 약물 전달 용도로 활용될 수 있음을 확인하였다.
또한 구체적으로, 상기 하이드로젤은 생분해성인 것일 수 있다.
본 발명 일 실시예에서는 본 발명의 하이드로젤이 체내 환경과 같이 히알루론산이 분해될 수 있는 환경에서 시간이 흐름에 따라 서서히 분해됨을 확인하였다(도 19). 또한, 본 발명의 하이드로젤은 세포 독성이 없는 바(도 20), 생체 적합성이 우수하다.
본 발명의 다른 측면은, 상기 하이드로젤을 포함하는 지혈제 조성물에 관한 것이다. 구체적으로, 상기 지혈제는 조직 간의 유착방지 효과를 나타내는 것일 수 있다. 본 발명의 지혈 효과 및 조직 간의 유착 방지 효과에 대해서는 상기 설명한 바와 같다.
또한 구체적으로, 상기 지혈제는 접착성 패치 또는 필름 형태인 것일 수 있다.
본 발명 일 실시예에서는 접착이 가능한 형태로 동물 모델에 적용되어 우수한 지혈 효과를 나타냄과 동시에 지혈제 특유의 조직 간 유착이 나타나지 않음을 확인하였는 바(도 12 및 도 13), 표면에 부착될 수 있는 형태로 적용 가능하다. 상기 표면은 신체 모든 조직의 표면일 수 있으며, 특정 부위에 한정되지 않는다.
본 발명의 또 다른 측면은, 상기 하이드로젤을 포함하는 조직 접착제 조성물에 관한 것이다. 구체적으로, 상기 조직 접착제는 조직 간의 유착방지 효과를 나타내는 것일 수 있다. 본 발명의 조직 간의 유착 방지 효과에 대해서는 상기 설명한 바와 같다.
본 발명의 또 다른 측면은, 상기 하이드로젤을 포함하는 세포 분화 촉진용 조성물에 관한 것이다. 구체적으로, 상기 세포는 줄기세포, 태아줄기세포, 유도만능줄기세포, 배아줄기세포 또는 성체줄기세포인 것일 수 있다. 본 발명의 세포 분화 촉진 효과에 대해서는 상기 설명한 바와 같다.
본 발명의 또 다른 측면은, 상기 하이드로젤을 포함하는 세포 배양용 조성물에 관한 것이다. 구체적으로, 상기 배양은 삼차원 배양인 것일 수 있다.
또한 구체적으로, 상기 배양 대상이 되는 세포는 줄기세포, 조혈모세포, 간세포, 섬유세포, 상피세포, 중피세포, 내피세포, 근육세포, 신경세포, 면역세포, 지방세포, 연골세포, 골세포, 혈액세포 또는 피부세포일 수 있으나, 상기에 제한되는 것은 아니며 세포 종류에 관계없이 본 발명의 하이드로젤에서 성장이 가능한 모든 세포에 적용 가능하다. 더욱 구체적으로, 상기 배양은 2종 이상 세포의 동시 배양일 수 있다.
본 발명 일 실시예에서는 인간 지방유래 줄기세포(hADSCs) 및 인간 혈관내피세포(HUVEC 세포)를 동시에 하이드로젤 내에 봉입하여 삼차원 공배양을 실시하였으며, 각각의 세포가 고유의 특이적인 형태를 유지하면서 증식하는 것을 확인하였는 바(도 22), 본 발명의 하이드로젤은 세포 배양 용도로 활용될 수 있으며, 2종 이상의 복합 배양에까지 활용 가능하다.
본 발명의 또 다른 측면은, 상기 하이드로젤을 포함하는 약물 전달용 조성물에 관한 것이다.
구체적으로, 상기 약물은 하이드로젤 내에 봉입될 수 있으며, 면역세포 활성화제, 항암제, 치료용 항체, 항생제, 항박테리아제, 항바이러스제, 항염증제, 조영제, 단백질 의약품, 성장인자, 사이토카인, 펩티드 약물, 발모제 및 이들의 조합들로 이루어진 군으로부터 선택된 것일 수 있으나, 상기에 제한되는 것은 아니며 하이드로젤에 봉입되거나 담지될 수 있는 약물이면 제한없이 적용될 수 있다.
본 발명 일 실시예에서는 약물 예시로 성장인자 중 하나인 혈관내피성장인자를 하이드로젤 내에 담지한 후 방출 양상을 확인하였으며, 체내 환경과 유사한 환경에서 하이드로젤이 생분해됨에 따라 성장인자가 서서히 방출됨을 확인하였는 바(도 23), 약물 전달용으로 활용될 수 있음을 확인하였다. 나아가 상기 약물 방출은 지연 방출, 서방성 방출 형태로도 적용될 수 있음을 확인하였다.
또한, 상기 약물은 본 발명의 하이드로젤 내에 담지, 탑재되거나 봉입될 수 있으며 이는 필요에 따라 적절한 형태로 사용할 수 있다.
본 발명에 따른 약학적 조성물은 포유동물에 투여된 후 활성 성분의 신속, 지속 또는 지연된 방출을 제공할 수 있도록 당업계에 잘 알려진 방법을 사용하여 약학적 제형으로 제조될 수 있다. 제형의 제조에 있어서, 본 발명에 따른 약학적 조성물은 활성 성분의 기능을 저해하지 않는 범위 내에서 추가적으로 약학적으로 허용가능한 담체를 포함할 수 있다.
상기 약학적으로 허용가능한 담체는 통상적으로 사용되는 것들, 예컨대 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유 등을 포함하나 이에 국한되지 않는다. 또한, 본 발명의 약학적 조성물은 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제, 기타 약학적으로 허용 가능한 첨가제를 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 약학적 조성물의 투여는 약학적으로 유효한 양을 투여할 수 있다. "약학적으로 유효한 양"은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 예방 또는 치료하기에 충분한 양을 의미한다. 유효 용량 수준은 제제화 방법, 환자의 상태 및 체중, 환자의 성별, 연령, 질환의 정도, 약물형태, 투여경로 및 기간, 배설 속도, 반응 감응성 등과 같은 요인들에 따라 당업자에 의해 다양하게 선택될 수 있다. 유효량은 당업자에게 인식되어 있듯이 처리의 경로, 부형제의 사용 및 다른 약제와 함께 사용할 수 있는 가능성에 따라 변할 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 마우스, 가축, 인간 등의 포유동물에 다양한 경로를 통해 투여될 수 있다. 구체적으로, 본 발명의 약학적 조성물은 경구 또는 비경구 투여(예를 들어, 도포 또는 정맥 내, 피하, 복강 내 주사)할 수 있으나 경구 투여가 바람직하다. 질염의 예방 및 치료를 위해서는 질 내로 투여할 수 있다. 경구 투여를 위한 고형제제에는 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 연질캡슐제, 환제 등이 포함될 수 있다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제, 에어로졸 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제로는 각각 통상의 방법에 따라 멸균된 수용액, 액제, 비수성용제, 현탁제, 에멀젼, 점안제, 안연고제, 시럽, 좌제, 에어로졸 등의 외용제 및 멸균 주사제제의 형태로 제형화하여 사용될 수 있으며, 구체적으로는 크림, 젤, 패취, 분무제, 연고제, 경고제, 로션제, 리니멘트제, 안연고제, 점안제, 파스타제 또는 카타플 라스마제의 약학적 조성물을 제조하여 사용할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 국소 투여를 위한 제제는 임상적 처방에 따라 무수형 또는 수성형일 수 있다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.
구체적으로, 본 발명의 상기 약학적 조성물은 접착성 패치 또는 필름 형태일 수 있다. 본 발명 일 실시예에서는 표면에 우수한 접착성을 나타내면서도(도 12), 조직에 부착되어 서로 다른 조직간의 유착이 없도록 함을 확인하였는 바(도 13), 표면에 부착될 수 있는 형태로 적용 가능하다. 상기 표면은 신체 모든 부위의 피부, 조직 내외의 표면 등이 있으며, 특정 부위에 한정되지 않는다.
본 발명의 또 다른 측면은, a) 히알루론산에서 수산기(-OH)를 세로토닌으로 치환하는 단계; 및 b) 치환된 세로토닌으로 수식된 히알루론산을 가교(cross-linking) 결합하여 하이드로젤을 형성하는 단계를 포함하는, 세로토닌으로 수식된 히알루론산을 포함하는 하이드로젤 제조방법에 관한 것이다.
구체적으로, 상기 수산기를 세로토닌으로 치환하는 단계는 히알루론산에서 하기 화학식 1에서 R1 위치의 수산기를
Figure 112019026278166-pat00003
으로 치환하는 것일 수 있다.
[화학식 1]
Figure 112019026278166-pat00004
본 발명 일 실시예에서는 히알루론산에 세로토닌을 도입한 후, 상기 히알루론산의 가교 결합을 통해 세로토닌이 수식된 히알루론산을 포함하는 하이드로젤을 제조하였으며(도 1), 상기 하이드로젤의 가교 반응에 있어 산화 조건을 조절함으로써 하이드로젤의 탄성, 팽윤 양상 등의 물성을 필요에 따라 적절히 조절하여 사용할 수 있다.
본 발명의 세로토닌으로 수식된 히알루론산을 포함하는 하이드로젤은 산화 조건 조절을 통해 가교 정도, 가교 속도 및 하이드로젤의 물성을 조절하여 사용할 수 있다.
또한, 본 발명의 하이드로젤은 지혈, 혈액 응고 촉진, 조직 유착 방지, 약물 전달, 세포 분화 촉진 등 다양한 효과를 나타내어 단일 또는 복합 용도로서 활용할 수 있다. 나아가, 본 발명은 세포 독성이 거의 없으면서도 체내 분해가 가능하여 생체 적합성이 매우 우수하여 활용 가능성이 매우 높다.
본 발명의 효과는 상기한 효과로 한정되는 것은 아니며, 본 발명의 상세한 설명 또는 청구범위에 기재된 발명의 구성으로부터 추론 가능한 모든 효과를 포함하는 것으로 이해되어야 한다.
도 1은 세로토닌 수식된 히알루론산 유도체의 합성과정을 나타낸 모식도이다.
도 2는 세로토닌 수식된 히알루론산이 올바르게 합성되었는지 여부를 확인하기 위하여, 1H-NMR 분석을 실시한 결과를 나타낸 것이다((1): 히알루론산 골격 내 메틸기(methyl group)의 수소 양성자, (2): 세로토닌의 방향족 고리의 수소 양성자).
도 3은 세로토닌 수식 히알루론산 유도체가 하이드로젤을 형성하기 위해 가교(cross-linking)하는 과정의 화학적 구조를 나타낸 것이다.
도 4는 광전자 분석법(XPS 분석)을 이용하여 산화 이전과 산화 이후의 스펙트럼을 비교하여 세로토닌 수식 히알루론산 하이드로젤의 가교를 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 5는 푸리에 변환 적외선 분광법(FTIR)을 이용하여 산화 이전과 산화 이후의 스펙트럼을 비교하여 세로토닌 수식 히알루론산 하이드로젤의 가교를 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 6은 UV-vis(Ultraviolet-visible spectroscopy)을 이용하여 세로토닌 수식 히알루론산 하이드로젤의 가교를 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 7은 산화를 통한 가교 방법에 의해 제조된 세로토닌 수식된 히알루론산 하이드로젤을 나타낸 것이다.
도 8은 세로토닌 수식 히알루론산 하이드로젤 제조 과정의 산화 조건에 따른 가교 속도를 비교한 결과를 나타낸 것이다.
도 9는 세로토닌 수식 히알루론산 하이드로젤 제조 과정의 산화 조건에 따른 탄성을 비교한 결과를 나타낸 것이다.
도 10은 세로토닌 수식 히알루론산 하이드로젤 제조 과정의 산화 조건에 따른 팽윤 양상을 나타낸 것이다.
도 11은 과산화수소 및 HRP의 농도에 따른 하이드로젤의 접착력 변화를 측정한 결과를 나타낸 것이다.
도 12는 세로토닌 수식 히알루론산 하이드로젤의 조직에 대한 생체 접착성을 확인한 결과를 나타낸 것이다(A: 조직 접착성 확인, B: H&E 조직 염색 확인).
도 13은 세로토닌 수식 히알루론산 하이드로젤의 조직 간 유착 방지 효과를 확인한 결과를 나타낸 것이다(A: 조직 간 유착여부 확인 사진, B: 물리적 유착정도 측정 그래프).
도 14는 in vitro에서의 세로토닌 수식 히알루론산 하이드로젤의 혈액 응고 촉진 효과 확인한 결과를 나타낸 것이다(A: 혈소판 인자 4 측정 그래프, B: Factor V 측정 그래프, C: 조직에서의 혈액 응고량 측정 그래프).
도 15는 간 출혈 마우스 모델에서의 세로토닌 수식 히알루론산 하이드로젤의 지혈효과를 확인한 결과를 나타낸 것이다(A: 실험 모식도, B: 출혈량 측정 그래프, C: 혈액 응고시간 측정).
도 16은 혈우병 하의 간 출혈 마우스 모델에서의 세로토닌 수식 히알루론산 하이드로젤의 지혈효과를 확인한 결과를 나타낸 것이다(A: 지혈 효과 확인 조직사진, B: 출혈량 측정 그래프, C: 혈액 응고시간 측정, D: H&E 조직 염색 결과).
도 17은 in vivo에서의 조직 간 유착방지 효과를 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 18은 면역대식세포 염색(Toluidine blue staining)을 통해 지혈 부위에서의 대식세포 침투 정도를 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 19는 세로토닌 수식 히알루론산 하이드로젤의 시간에 따른 분해 정도를 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 20은 세로토닌 수식 히알루론산 하이드로젤의 세포 독성이 없음을 확인한 결과를 나타낸 것이다(A: HepG2 세포, B: hADSC, C: hiPSC-derived hepatocyte, D: hNSC).
도 21은 세로토닌 수식 히알루론산 하이드로젤의 세포 분화 유도 효과를 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 22는 세로토닌 수식 히알루론산 하이드로젤의 세포 배양 효과를 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 23은 세로토닌 수식 히알루론산 하이드로젤의 약물 전달 효과 및 서방성 방출 효과를 확인한 결과를 나타낸 것이다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명이 하기 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. 세로토닌 수식 히알루론산 유도체(HA-ST)의 합성
세로토닌 수식된 히알루론산 유도체(HA-ST)의 합성을 위해, 분자량 200kDa의 히알루론산(Lifecore Biomedical, IL, USA)을 3차 증류수(TDW)에 1 mg/ml의 농도가 되도록 용해시켰다.
상기 용액에 1-(3-디메틸아미노프로필)-3-에틸카르보디이미드 하이드로클로라이드(EDC, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA)와 N-히드록시숙신이미드(NHS, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA)를 히알루론산과 동일한 몰 비율로 첨가하고, pH 5.5-6.0 조건에서 30분간 교반 하였다.
상기 용액에 세로토닌 염산염을 히알루론산과 1:1의 몰비로 첨가하고, 실온pH 5.5-6.0 조건에서 밤새 교반 하여 세로토닌 수식 히알루론산을 수득하였다(도 1).
반응 부산물 및 반응하지 않은 화학 물질은 pH 5.0의 PBS 완충용액에서 Cellu Sep T2 투석막을 이용하여 제거하였다. 상기 과정에서 합성된 생성물은 동결 건조하여 4 ℃에서 보관하였다.
상기 과정을 통해 세로토닌 치환된 히알루론산이 올바르게 합성되었는지 여부를 확인하기 위하여, 1H-NMR (300 MHz, Bruker, Billerica, MA, USA) 분석을 실시하였다. 상기 합성 과정의 모식도는 도 1에 나타난 바와 같으며, 합성 결과 도 2에 나타난 바와 같이 히알루론산에 세로토닌이 결합되어 각각의 피크값을 가지는 것을 확인하였다.
실시예 2. 세로토닌 수식 히알루론산의 하이드로젤 제조
상기 실시예 1의 세로토닌 수식 히알루론산 유도체를 가교(cross-linking)시켜 히알루론산 하이드로젤을 제조하였다. 구체적으로, 이를 위해 과산화수소(H2O2)와 퍼옥시다아제(Horseradish peroxidase, HRP)를 이용한 산화 반응을 통한 가교를 유도하여 하이드로젤을 제조하였다.
도 3에 나타난 바와 같이, 상기 히알루론산 유도체의 가교는 세로토닌의 5-하이드록시인돌 부분 간의 화학적 결합에 의해 이루어지며, 수득한 하이드로젤은 약한 황색을 띠는 것을 확인하였다.
상기 히알루론산 하이드로젤의 가교를 구체적으로 확인하기 위하여 광전자 분석법(XPS 분석), 푸리에 변환 적외선 분광법(FTIR) 및 UV-vis(Ultraviolet-visible spectroscopy)를 통해 산화 이전과 산화 이후의 스펙트럼(spectrum)을 비교하였다.
그 결과, XPS 분석 및 FTIR 분석을 통해 가교반응에 의해 생성되는 결합인 C-C 결합, C-O-C 결합에 해당하는 피크가 증가한 것을 확인하였고(도 4 및 도 5), UV-vis 분석을 통해 퀴논(quinone)에 해당하는 피크(~400 nm)의 증가를 확인하여(도 6), 세로토닌의 5-하이드록시인돌 부분 간의 화학적 결합이 생성된 것을 확인하였다.
또한, 상기와 같은 산화를 통한 가교 방법에 의해 세로토닌 수식된 히알루론산 하이드로젤이 제조된 것을 확인하였다(도 7).
실시예 3. 산화 조건에 따른 가교 속도 변화 확인
상기 실시예 2에 따른 하이드로젤 제조 단계에서, 세로토닌 수식 히알루론산 용액의 농도를 2 중량%로 고정하고, 과산화수소(H2O2)와 HRP의 몰 농도비를 다르게 하여 세로토닌 수식 히알루론산 유도체의 겔-졸 전이시간 및 젤화 완료 시간을 측정하였다.
그 결과, 세로토닌 수식 히알루론산 하이드로젤의 형성 속도는 과산화수소의 농도에는 크게 영향을 받지 않지만, HRP의 농도에 크게 의존하는 것을 확인하였다.
구체적으로, 도 8에 나타난 바와 같이, HRP의 농도를 12, 18 및 24 U/ml로 한 경우 겔화 시간은 30초 미만이었지만, 6 U/ml의 경우 겔화 완료까지 50초가 걸리는 것을 확인할 수 있는 반면, 과산화수소의 농도 변화에 따른 속도 변화폭은 크지 않은 것을 확인하였다.
실시예 4. 산화 조건에 따른 하이드로젤의 탄성 변화 확인
세로토닌 수식 히알루론산 하이드로젤의 점탄성 계수는 유동계(MCR 102 레오미터, Anton Paar, Ashland, VA, USA)를 이용하여, 각각 0.1 내지 1Hz의 주파수 범위에서 주파수 스윕 모드(frequency sweep mode)내의 저장 탄성율(G') 및 손실 탄성율(G'')을 측정하여 분석하였다. 하이드로젤의 탄성은 1Hz (n=3)에서의 평균 저장 탄성률을 계산하여 나타내었다.
도 9에 나타난 바와 같이, 산화 조건에서 과산화수소의 농도가 증가함에 따라 하이드로젤의 강도를 나타내는 탄성계수(Elastic modulus)가 증가하는 것을 확인하여 과산화수소 및 HRP의 농도를 조절하여 하이드로젤의 강도 및 탄성력을 조절할 수 있는 것을 확인하였다.
실시예 5. 산화 조건에 따른 하이드로젤의 팽윤 양상 확인
산화 조건에 따라 상반된 팽윤 양상을 보이는 것을 확인하였다. 팽윤 특성은 특정 시점(0, 1, 3, 5 및 7일째)에 잔존하는 하이드로젤의 무게를 측정하여 평가하였다. 구체적으로, 1 mM의 과산화수소와 12 U/ml의 HRP 조건 하에서 세로토닌 수식 히알루론산 용액의 농도만 1 중량% 또는 2 중량%로 달리하여 형성한 하이드로젤의 팽윤 양상을 확인하였다.
그 결과, 도 10에 나타난 바와 같이, 2 중량%의 세로토닌 수식 히알루론산 용액을 사용한 경우는 하이드로젤이 팽창하는 양상을 보이는 반면, 1 중량%의 세로토닌 수식 히알루론산 용액을 사용한 경우 하이드로젤이 수축하여, 세로토닌 수식 히알루론산 용액의 농도 조건에 따라 하이드로젤의 팽윤 양상을 조절 가능한 것을 확인하였다.
실시예 6. 하이드로젤의 접착성 분석
본 발명에서 제조된 하이드로젤의 접착성을 평가하기 위하여, 유동계(MCR 102 레오미터, Anton Paar, Ashland, VA, USA)의 프로브와 플레이트 사이에서 하이드로젤을 가교시키고, 10 μm/s(n=3)으로 상기 플레이트의 간격을 증가시키면서 거기에 가해지는 힘을 측정하였다.
산화조건에 따른 접착성의 차이를 확인하기 위하여 과산화수소의 농도를 1 mM로 고정시키고 HRP의 농도만을 12, 18 및 24 U/ml로 달리하여 형성된 하이드로젤의 접착력을 측정하였다. 그 결과, 도 11A에 나타난 바와 같이, 1mM의 과산화수소 농도 하에서는 12 U/ml의 HRP 의 조건에서 하이드로젤의 접착력이 가장 높게 나타남을 확인하였다.
또한, HRP의 농도를 12 U/ml로 고정시키고 과산화수소의 농도를 각각 1, 2, 3 및 4 mM로 달리하여 형성한 하이드로젤의 접착력을 측정하였으며, 그 결과 도 11B에 나타난 바와 같이, 12 U/ml의 HRP 하에서 1 mM의 과산화수소 농도일 때 가장 높은 접착력을 나타냄을 확인하였다.
상기와 같은 결과는 과산화수소 및 HRP의 농도를 조절하여 하이드로젤의 접착력을 조절할 수 있으며, 이를 이용하여 원하는 정도의 접착력을 변형하면서 수득할 수 있음을 나타내는 것이다.
실시예 7. 하이드로젤의 생체 조직 접착성 확인
본 발명 세로토닌 수식 히알루론산 하이드로젤의 접착력이 체내 조직에서도 충분한 접착력을 가지는지 여부를 확인하였다.
구체적으로, 상기 하이드로젤을 복막 조직에 도포한 이후 부착된 하이드로젤을 잡아당겨 조직에 잘 붙어 있는지 여부를 측정하였으며, 그 결과 도 12A에 나타난 바와 같이, 조직에 높은 접착성을 나타내며 잘 붙어있음을 확인하였다.
또한, 하이드로젤이 부착된 복막 조직에 대한 조직학 염색(H&E staining)을 통해 조직에의 부착 여부를 확인하였으며, 그 결과 도 12B에 나타난 바와 같이, 세로토닌 수식 히알루론산 하이드로젤이 조직과 단단히 잘 부착되어 있음을 확인하였다.
이는 세로토닌 분자가 산화될 때 일어나는 화학 반응에 의해 세로토닌 수식 히알루론산 하이드로젤이 조직 표면의 단백질에 결합하게 되기 때문에 조직 접착성을 가지게 되는 것으로, 조직 표면에 하이드로젤 막을 형성할 수 있어 체내 조직에 부착되어 잘 유지될 수 있을 정도로 충분한 접착력을 가질 수 있음을 확인하였다.
실시예 8. 하이드로젤의 조직 간의 유착방지 효과 확인
본 발명의 세로토닌 수식 히알루론산 하이드로젤이 조직 간의 비정상적인 유착을 방지할 수 있는지 확인하였다. 마우스 복막 손상 모델을 이용하여 실험을 실시하였으며, 구체적으로, 마우스 복막 손상 모델의 손상된 조직 표면과 다른 조직 간의 유착을 유도하고 본 발명의 하이드로젤 처리 유무에 따른 차이를 확인하였다.
그 결과, 도 13A에 나타난 바와 같이, 마우스 복막 손상 모델을 통해 손상된 조직 표면과 다른 조직 간의 유착을 유도하였을 때, 아무 처리가 없는 경우(NT)에 거의 모든 동물에서 비정상적인 조직 유착이 발생하였지만, 본 발명의 세로토닌 수식 히알루론산 하이드로젤을 처리한 경우(HA-ST)에는 모든 동물에서 조직 유착이 발생하지 않았다.
또한, 상기와 같은 유착 정도는 정량적으로도 확인하였으며, 도 13B에 나타난 바와 같이 본 발명의 세로토닌 수식 히알루론산 하이드로젤을 처리한 경우에 유착이 전혀 나타나지 않음을 수치적으로도 확인하였다.
이러한 결과는 히알루론산에 의한 생물 유착 방지 기작에 따라 조직 표면에 형성된 히알루론산 기반 하이드로젤 박막이 유착 방지 효과를 가지는 것을 나타내는 것이다.
실시예 9. in vitro 에서의 혈액 응고 촉진 효과 확인
세로토닌 수식 히알루론산 하이드로젤의 지혈 효과를 확인하기 위하여, 혈액으로부터 분리한 혈소판이 풍부한 혈장(Platelet-rich plasma, PRP)과 대조군(PBS), 세로토닌 용액(Serotonin), 히알루론산 용액(HA) 및 세로토닌 수식 히알루론산 용액(HA-ST)을 혼합하고 반응시킨 샘플의 상층액을 분리하여 단백질 정량을 위한 ELISA 분석을 실시하고, 혈소판으로부터 분비되는 주요 혈액응고 인자들인 혈소판 인자 4(Platelet factor 4) 및 Factor V의 양을 측정하였다.
그 결과, 도 14A에 나타난 바와 같이 세로토닌 수식 히알루론산 하이드로젤을 처리한 경우, 다른 모든 군에 비하여 현저히 높은 수치의 혈소판 인자 4가 분비됨을 확인하였다. 또한, 도 14B에 나타난 바와 같이 세로토닌 수식 히알루론산 하이드로젤을 처리한 경우, Factor V의 분비량이 단순 하이드로젤만 처리한 경우에 비해 약 2배 이상 나타나는 것을 확인하였다.
또한, 혈액과 각 샘플(대조군 (PBS), 세로토닌 용액(Serotonin), 히알루론산 용액 (HA), 세로토닌 수식 히알루론산 용액(HA-ST))을 기판 위에서 혼합하고 반응시킨 후에 응고되지 않은 혈액을 씻어내고 응고되어 남은 잔존물의 무게를 측정하였다. 그 결과, 도 14C에 나타난 바와 같이 세로토닌 수식 히알루론산 하이드로젤을 처리한 경우 가장 많은 양의 혈액 응고가 일어남을 확인하였다.
상기와 같은 결과는 본 발명의 세로토닌 수식 히알루론산이 세로토닌이 매개하는 혈소판 활성을 촉진함으로써 혈액응고 작용을 촉진시키는 것을 나타내는 것이다.
실시예 10. in vivo 에서의 지혈 효과 확인
in vivo에서의 세로토닌 수식 히알루론산 하이드로젤의 지혈 효과 확인을 위하여, 4주령 암컷 ICR 마우스(오리엔트 바이오, 성남시)를 이용하여 간 출혈 모델을 제작하였다. 구체적으로, 상기 마우스를 마취하고 복부를 절개한 후, 멸균된 여과지를 간 아래에 두고 18G 바늘을 이용하여 출혈을 유도하였고, 손상된 부위는 즉시 세로토닌 수식 히알루론산 하이드로젤 또는 섬유소 접착제(TISSEEL, Baxter, Vienna, Austria)로 덮었다. 이후, 관찰이 끝날 때까지 여과지를 30 초마다 교환하였고, 수집된 여과지의 무게를 측정하여 출혈량을 측정하였다. 이 출혈의 평가를 완료한 후, 복막과 절개 부위를 6-0프롤린 봉합사로 봉합하였다. 치료받지 않은 마우스는 대조군으로 사용되었다. 치료 7 일 후, 마우스를 희생시키고 생리학적 상태를 검사하였다.
도 15A에 나타난 바와 같이 상기 마우스 간 출혈 모델에 대조군(NT), 상용화된 지혈제(Fibrin glue) 및 세로토닌 수식 히알루론산 하이드로젤(HA-ST) 처리 군을 제작하였으며, 이후 출혈량을 측정하였다.
그 결과, 도 15B에 나타난 바와 같이 세로토닌 수식 히알루론산 하이드로젤을 처리한 경우 기존의 상용화 된 지혈제에 비해 현저히 우수한 지혈 효과를 나타냄을 정량적으로 확인하였다.
또한, 출혈량 확인을 위해 사용된 혈액 흡수용 거름 종이의 사진을 시간 순으로 확인하였으며, 그 결과 도 15C에 나타난 바와 같이 세로토닌 수식 히알루론산 하이드로젤을 처리한 경우 빠른 시간 내에 출혈이 멈추는 것을 확인하였다.
나아가, 6주령의 혈우병 마우스(B6;129S-F8tm1Kaz/J, Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME, USA)를 대상으로 상기 방법과 동일하게 간 출혈 모델을 제작하여 혈우병 하의 간 출혈 모델에서의 지혈 효과를 확인하였다.
그 결과, 도 16A에 나타난 바와 같이 혈액 응고 인자가 결여되어 지혈이 잘 되지 않는 혈우병 마우스 모델에서도 대조군에 비해 우수한 지혈 효과를 나타냄을 확인하였으며, 도 16B에 나타난 바와 같이 출혈양 역시 현저히 감소됨을 확인하였다.
또한, 도 16C에 나타난 바와 같이 본 발명의 세로토닌 수식 히알루론산 하이드로젤을 처리한 경우 대조군에 비해 현저히 빠른 시간 내에 출혈이 멈추는 것을 확인하였으며, 나아가, 도 16D에 나타난 바와 같이 세로토닌 수식 히알루론산 지혈제가 출혈 부위에 혈전 형성을 유도하여 효과적으로 지혈 작용을 가능하게 함을 H&E 조직 염색을 통해 확인하였다.
실시예 11. in vivo 에서의 조직 간의 유착방지 효과 확인
종래의 지혈제는 지혈과정에서 형성된 피브린 덩어리에 의해 주변 조직과 유착을 유발하는 부작용이 존재하였다. 이에 따라, 본 발명의 세로토닌 수식 히알루론산 지혈제가 지혈작용 외에 유착방지 효과를 갖는지 확인하기 위하여 상기 간 출혈 모델 마우스에서 지혈제 처리 후 1, 3, 7일차에 전체 9 마리 중 임의로 각 3마리에 대해서 조직 유착 정도를 확인하였다.
그 결과, 도 17에 나타난 바와 같이 지혈제를 처리하지 않은 대조군(NT) 및 기존의 상업적으로 판매되는 피브린 지혈제(Fibrin glue)와 비교하여 세로토닌 수식 히알루론산 하이드로젤 지혈제의 유착 방지 효과가 뛰어남을 확인하였다.
실시예 12. 하이드로젤의 생체 적합성 확인
상기 지혈 효과 실험에서, 지혈제 처리 후 3 일째에 수거한 간 조직 샘플에 대한 면역대식세포 염색(Toluidine blue staining)을 통해 대식세포를 염색하여 지혈 부위에서의 대식세포 침투 정도를 확인하였다.
그 결과, 도 18에 나타난 바와 같이 세로토닌 수식 히알루론산 하이드로젤을 처리한 조직 부위는 흰색 화살표로 표시된 대식세포의 침투 정도가 정상 조직과 비교하여 특별한 차이를 보이지 않았으며, 이는 본 발명의 세로토닌 수식 히알루론산 하이드로젤에 대해 민감한 면역 반응이 일어나지 않음을 나타내는 바, 우수한 생체 적합성을 보유하는 것을 확인하였다.
또한, 2 중량%의 세로토닌 수식 히알루론산 용액, 1 mM의 과산화수소, 및 12 U/ml의 HRP를 8:1:1의 부피비로 혼합하여 만든 세로토닌 수식 히알루론산 하이드로젤의 효소 분해 양상을 확인하였다. 그 결과, 도 19에 나타난 바와 같이 본 발명의 세로토닌 수식 히알루론산 하이드로젤은 히알루론산 분해 효소에 의해 수시간에 걸쳐 분해되는 것을 확인하여, 체내 분해가 가능함을 확인하였다. 상기와 같은 결과는 본 발명의 하이드로젤에 대한 민감한 면역 반응이 일어나지 않으면서도 시간의 흐름에 따라 체내 분해가 일어나는 바, 생체 적합성이 우수함을 나타내는 것이다.
실시예 13. 세포 독성 확인
본 발명 세로토닌 수식 히알루론산 하이드로젤의 세포 독성 및 생체 적합성을 평가하기 위하여, 12 U/ml HRP 및 1 mM 과산화수소 조건에서 가교된 세로토닌 수식 히알루론산 하이드로젤 내에 HepG2 세포와 인간 지방유래 줄기세포(human adipose-derived stem cell, hADSC) (1.0×106 cells/하이드로젤 100μl)를 봉입하여 삼차원 배양하면서 Live/Dead 염색을 실시하였다. 구체적으로, Live/Dead viability/cytotoxicity kit (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)를 이용해 제조사의 지시에 따라 0 일 및 7 일째의 세포 생존을 측정하였다. 염색된 세포를 모델 IX73 형광 현미경(Olympus, Tokyo, Japan)을 사용하여 관찰하였고, 녹색으로 표시된 생존세포 대 적색으로 표시된 죽은 세포의 비율을 상기 현미경으로 얻은 이미지(n=3)로부터 수동 계산에 의해 정량화 하였다. HepG2 세포는 10% 태아 소 혈청(Invitrogen) 및 1% 페니실린/스트렙토마이신(Invitrogen)이 보충된 고포도당 Dulbecco's Modified Eagle's 배지로 배양하였고, hADSCs는 MesenPRO-RSTM 배지로 배양하였다.
독성 확인 결과, 도 20A 및 도 20B에 나타난 바와 같이, HepG2 세포 및 hADSCs 모두 7일 경과 후에도 약 100%의 생존율을 나타내어 본 발명의 세로토닌 수식 히알루론산 하이드로젤이 세포 독성이 거의 없음을 확인하였다.
또한, 본 발명의 세로토닌 수식 히알루론산 하이드로젤 내에 인간 유도만능줄기세포에서 분화 유도된 간세포(hiPSC-derived hepatocyte)를 봉입하여 삼차원 배양하면서 상기와 마찬가지로 Live/Dead 염색을 실시한 결과, 도 20C에 나타난 바와 같이 죽은 세포들이 거의 나타나지 않았는 바, 세포 독성이 없음을 확인하였다.
또한, 본 발명의 세로토닌 수식 히알루론산 하이드로젤 내에 인간 신경줄기세포(human neural stem cell; hNSC)를 봉입하여 삼차원 배양하면서 상기와 마찬가지로 Live/Dead 염색을 실시한 결과, 생존 유지가 쉽지 않은 인간 신경줄기세포에서도 7일 경과 후에도 약 80%의 생존율을 나타내었는 바, 상기와 마찬가지로 본 발명의 세로토닌 수식 히알루론산 하이드로젤이 세포 독성이 없음을 확인하였다.
실시예 14. 세포 분화 유도 효과 확인
세로토닌 수식 히알루론산 하이드로젤 내에 인간 신경줄기세포(human neural stem cell; hNSC)를 봉입하여 삼차원 배양하면서 면역염색 (ICC)을 실시하였다. 그 결과, 도 21에 나타난 바와 같이, 신경세포 특이적 마커(TUJ1)가 높게 발현이 되고 신경 돌기가 잘 뻗는 것을 확인하였다. 이는 본 발명의 세로토닌 수식 히알루론산 하이드로젤이 줄기세포의 유지 및 분화에 효과적이며 줄기세포의 삼차원 배양 및 이식을 위한 지지체로 활용될 수 있음을 나타내는 것이다.
실시예 15. 세포 배양 효과 확인
세로토닌 수식 히알루론산 하이드로젤 내에 인간 지방유래 줄기세포(hADSCs) 및 인간 혈관내피세포(HUVEC 세포)를 동시에 봉입하여 삼차원 공배양을 실시한 후 면역염색을 실시하였다.
그 결과, 도 22에 나타난 바와 같이, 각각의 세포가 고유의 특이적인 형태를 유지하면서 서로간 상호작용을 통해 혈관 네트워크 형성을 유도하는 것을 확인하였으며, 동시에 해당 세포 마커들이 정상적으로 발현되는 것이 확인하였다.
상기와 같은 결과로부터 본 발명의 세로토닌 수식 히알루론산 하이드로젤을 이용하여 다양한 세포의 삼차원 공배양이 가능함을 확인하였다.
실시예 16. 약물 전달 효과 확인
세로토닌 수식 히알루론산 하이드로젤의 약물 전달 효과를 확인하기 위하여, 약물 예시로 성장인자 중 하나인 혈관내피성장인자(Vascular endothelial growth factor, VEGF)를 세로토닌 수식 히알루론산 하이드로젤 내에 담지한 뒤에 37°C 조건의 히알루로니다아제(Hyaluronidase)(0.5 U/ml) 용액과 PBS 용액 내에서의 방출 양상을 확인하였다.
그 결과, 도 23에 나타난 바와 같이 단백질에 대한 우수한 결합 능력으로 인해 하이드로젤이 분해되지 않는 조건(PBS)에서는 성장인자가 거의 방출되지 않았지만, 체내 환경과 같이 히알루론산이 분해될 수 있는 환경인 히알루로니다아제 존재 하에서는 하이드로젤이 생분해됨에 따라 담지된 성장인자가 서서히 방출되는 것을 확인하였다.
상기 결과는 본 발명의 세로토닌 수식 히알루론산 하이드로젤이 효과적으로 약물을 담지할 수 있을 뿐만 아니라 체내에서는 서서히 약물을 제어 방출할 수 있기 때문에 약물전달 시스템으로서의 응용 가능성이 높은 것을 의미한다.
전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다. 예를 들어, 단일형으로 설명되어 있는 각 구성 요소는 분산되어 실시될 수도 있으며, 마찬가지로 분산된 것으로 설명되어 있는 구성 요소들도 결합된 형태로 실시될 수 있다.
본 발명의 범위는 후술하는 청구범위에 의하여 나타내어지며, 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 균등 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

Claims (21)

  1. 세로토닌으로 수식된 히알루론산을 포함하는 하이드로젤을 함유하는, 혈액 응고 촉진을 통한 지혈제 조성물로서,
    상기 하이드로젤은 하기 화학식 1의 반복단위구조를 포함하는 것인, 지혈제 조성물:
    [화학식 1]
    Figure 112021075233771-pat00032
    .
  2. 삭제
  3. 제1항에 있어서,
    상기 하이드로젤은 상기 세로토닌의 5-하이드록시인돌 부분 간의 화학적 결합에 의해 상기 수식된 히알루론산이 서로 가교된(cross-linked) 것인, 지혈제 조성물.
  4. 삭제
  5. 제1항에 있어서,
    상기 하이드로젤은 접착성인 것인, 지혈제 조성물.
  6. 제1항에 있어서,
    상기 하이드로젤은 생분해성인 것인, 지혈제 조성물.
  7. 삭제
  8. 제1항에 있어서,
    상기 지혈제는 조직 간의 유착방지 효과를 나타내는 것인, 지혈제 조성물.
  9. 제1항에 있어서,
    상기 지혈제는 접착성 패치 또는 필름 형태인 것인, 지혈제 조성물.
  10. 삭제
  11. 삭제
  12. 삭제
  13. 삭제
  14. 삭제
  15. 삭제
  16. 삭제
  17. 삭제
  18. 삭제
  19. 삭제
  20. (a) 히알루론산에서 수산기(-OH)를 세로토닌으로 치환시켜 세로토닌으로 수식된 히알루론산을 포함하는 용액을 제조하는 단계; 및
    (b) 상기 용액 내 상기 수식된 히알루론산을 서로 가교(cross-linking) 결합하여 하이드로젤을 형성하는 단계를 포함하는, 혈액 응고 촉진을 통한 지혈제 조성물의 제조방법으로서,
    상기 (a) 단계는 하기 화학식 2의 반복단위구조를 포함하는 히알루론산에서 R1에 위치하는 수산기(-OH)를
    Figure 112021075233771-pat00033
    으로 치환하는 것인, 지혈제 조성물의 제조방법:
    [화학식 2]
    Figure 112021075233771-pat00034
    .
  21. 삭제
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