KR102381175B1 - 과산화칼슘을 이용한 효소 매개 가교형 in situ 형성 하이드로젤의 제조방법 및 이의 생의학적 응용 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 페놀기 또는 페놀기를 포함하는 화합물이 도입된 고분자, 효소 및 과산화칼슘을 이용하는 in situ 가교 하이드로젤 제조방법 및 이의 용도에 대한 것이다.
본 발명의 제조방법으로 제조된 GH/C 하이드로젤은 CaO2 농도를 최적화시킴으로써 H2O2, O2 및 Ca2+에 대한 조절 가능한 방출 프로파일뿐만 아니라 조정 가능한 물리 화학적 특성을 나타냈다. 하이드로젤로부터의 H2O2, O2 및 Ca 이온의 지속 방출은 hMSC의 이동 속도 및 골 형성 분화를 상승적으로 촉진할 수 있었다. 또한, GH/C 하이드로젤은 E. coli 와 S. aureus 의 성장을 억제함으로써 항균 활성을 나타냈다. 따라서, 본 발명의 HRP/CaO2-매개 반응에 의해 유도된 in situ 하이드로젤 형성은 감염 치료, 골 재생 및 조직 재생 의약품과 같은 광범위한 생의학 응용에 대한 잠재력을 가진다.

Description

과산화칼슘을 이용한 효소 매개 가교형 in situ 형성 하이드로젤의 제조방법 및 이의 생의학적 응용 {Method of preparing Calcium Peroxide-Mediated Enzymatic Crosslinking Reaction of Horseradish Peroxidase for In Situ Forming Hydrogels and Biomedical Applications thereof}
본 발명은 페놀기 또는 페놀기를 포함하는 화합물이 도입된 고분자, 효소 및 과산화칼슘을 이용하는 in situ 가교 하이드로젤 제조방법 및 이의 용도에 대한 것이다.
천연 세포 외 매트릭스를 모방할 수 있는 물리적 또는 화학적으로 가교 결합된 중합체 네트워크인 하이드로젤은 광범위한 생의학 및 생약학적 응용을 위한 혁신적인 재료로 여겨져 왔다. 특히, in situ 가교 결합 하이드로젤은 치료제를 쉽게 캡슐화하고 최소 침습적 주입으로 인해 많은 관심을 끌었다. 지금까지 수소 결합, 이온 상호 작용, 호스트-게스트 상호 작용, 클릭 화학, 입체 복합 또는 광중합과 같은 in situ 가교 결합 하이드로젤을 달성하기 위해 많은 접근법이 사용되었다. 다양한 가교 전략 중에서, 효소 가교는 온화한 반응 조건 및 조정 가능한 하이드로젤 특성을 갖는 하이드로젤화를 위한 현명한 방법이다.
홀스래디쉬 과산화효소(HRP, Horseradish peroxidase)-매개 가교 결합 반응은 in situ 에서 하이드로젤을 유도하기 위해 집중적으로 연구되었다. 트랜스글루타미나제, 티로시나제, 포스파타제, 라이실옥시다제와 같은 기존의 효소 하이드로젤화 시스템과 비교하여, HRP는 빠른 젤화, 가교 결합 밀도 및 하이드로젤화 비율 조절의 용이성이라는 장점을 갖는다. 종래의 HRP 촉매 사이클에서, 과산화수소(H2O2)의 첨가는 HRP를 활성화시키는 강력한 산화제로서 작용하기 때문에 필수적이다. 일반적으로, 외부 환경으로부터의 H2O2 용액은 반응 시스템에 직접 첨가되어 하이드로젤을 형성한다. 그러나, H2O2의 직접 첨가는 첨가 즉시 높은 국부적 H2O2 농도로 인한 잠재적인 문제를 야기하며, 이는 HRP의 불활성화, 이종 겔 구조 및 생물학적 개체(세포, 단백질 또는 성장 인자 등)에 부정적인 영향을 초래할 수 있다. 이러한 단점을 해결하기 위해, HRP-촉매 하이드로젤화를 위해 H2O2를 간접적으로 공급하는 방법에 대한 연구가 이루어지고 있다. 가장 보편적인 방법은 포도당 산화 효소(GOx)를 이용하여 포도당으로부터 H2O2를 생성하고 HRP-매개 가교 반응을 위해 H2O2를 공급하는 것이다. 이 시스템의 생체 내 적용에 대한 가장 큰 우려는 GOx가 남아 있고 계속되는 경우 신체 내 포도당을 계속적으로 산화시킴으로써 바람직하지 않은 H2O2 가 생성되는 것이다. 다른 시스템에서, 하이드로젤은 중합체 사슬 상에 공액된 티올기 또는 폴리페놀(에피갈로카테킨-3-갈레이트)의 HRP 효소 반응 및 자동 산화를 통해 제조될 수 있다. 그러나, 이들 하이드로겔화로부터 방출되는 소량의 H2O2 시스템은 이들의 응용을 제한했다.
대한민국 공개특허 제10-2018-0016670호는 티올기를 함유하는 고분자 및 과산화칼슘을 이용한 서방형 산소 방출형 in situ 가교 하이드로젤의 제조방법 및 이의 생의학적 용도에 대한 것이다. 그러나 in situ 가교 하이드로젤 제조에 다양한 장점을 제공하는 홀스래디쉬 과산화효소와 과산화칼슘을 모두 포함하는 in situ 가교 하이드로젤 제조방법에 대한 연구 내지 기재는 개시된 바 없다.
본 발명자들은 in situ 하이드로젤 제작에 필수적으로 발생하고 요구되는 H2O2를 제어하여 H2O2로 인해 발생하는 문제점들을 해결하고자 예의 노력한 결과, 과산화 칼슘(CaO2) 농도 변화에 의해 겔화 시간, 기계적 강도, 미세 구조 및 분해 속도를 포함한 하이드로젤의 물리 화학적 특성을 조절할 수 있고, 하이드로젤로부터의 H2O2, Ca 이온 및 O2의 지속 가능한 방출은 항균 활성 및 골 형성 분화 능력을 유도할 수 있음을 확인하고 본 발명을 완성하였다.
본 발명은 i) 페놀기 또는 페놀기를 포함하는 화합물이 도입된 고분자 및 효소를 용해시킨 용해액을 제조하는 단계;
ii) 과산화칼슘을 용해시킨 용해액을 제조하는 단계; 및
iii) 상기 i)의 용해액 및 ii)의 용해액을 혼합하여 혼합액을 제조하는 단계;
를 포함하는 in situ 가교 하이드로젤 제조방법을 제공한다.
본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 단계 i)의 고분자는 젤라틴, 키토산, 헤파린, 셀룰로스, 덱스트란, 덱스트란 설페이트, 콘드로이틴 설페이트, 케라탄 설페이트, 더마탄 설페이트, 알지네이트, 콜라겐, 알부민, 피브로넥틴, 라미닌, 엘라스틴, 비트로넥틴, 히알루론산, 피브리노겐 및 다지-고분자 로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상인 것이다.
본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 단계 i)의 효소는 홀스래디쉬 과산화효소(horseradish peroxidase), 글루타치온 과산화효소(glutathione peroxidase), 할로과산화효소(haloperoxidase), 미엘로퍼옥시데이즈(myeloperoxidase), 카탈라아제(catalase), 헤모프로틴(hemoprotein), 페록시레독신(peroxiredoxin), 동물 헴-의존적 과산화효소(animal heme-dependent peroxidases), 티로이드 과산화효소(thyroid peroxidase), 바나듐 브로모과산화효소(vanadium bromoperoxidase), 락토과산화효소(lactoperoxidase), 티로시네이즈(tyrosinase) 및 카테콜 옥시데이즈(catechol oxidase)로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상인 것이다.
본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 단계 i)의 고분자의 농도는 1 내지 10 wt % 인 것이다.
본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 단계 i)의 효소의 농도는 0.01 내지 1 mg/㎖ 인 것이다.
본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 단계 i)의 용해액에 페놀기를 포함하는 화합물을 추가적으로 포함하는 것이다.
본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 페놀기를 포함하는 화합물은 하이드록시페닐프로피오닉산(hydroxyphenyl propionic acid), 4-하이드록시페닐아세트산(4-hydroxyphenyl acetic acid), 티로신(tyrosine), 티라민(tyramine), 테트로닉 티라민(tetronic tyramine) 및 PEG-티라민(PEG-tyramine) 으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상인 것이다.
본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 단계 ii)의 과산화칼슘의 농도는 0.01 내지 0.5 wt % 인 것이다.
본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 단계 iii)의 혼합액에 사이클로덱스트린(cyclodextrin)에 포접된 항암제를 추가적으로 포함하는 것이다.
또한, 본 발명은 상기 제조방법으로 제조된 in situ 가교 하이드로젤을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 in situ 가교 하이드로젤을 포함하는 항균용 조성물, 조직 재생용 조성물, 골세포 또는 골아세포로의 분화용 조성물 내지 혈관신생용 조성물을 제공한다.
본 발명의 GH/C 하이드로젤은 CaO2 농도를 최적화시킴으로써 H2O2, O2 및 Ca2+에 대한 조절 가능한 지속적인 방출 프로파일은 hMSC의 이동 속도 및 골 형성 분화를 상승적으로 촉진할 수 있었을 뿐만 아니라 조정 가능한 물리 화학적 특성을 제공할 수 있었으며, E. coli 와 S. aureus 의 성장을 억제함으로써 항균 활성을 나타냈다. 따라서, 본 발명의 HRP/CaO2-매개 반응에 의해 유도된 in situ 하이드로젤(GH/C 하이드로젤) 형성은 감염 치료, 골 재생 및 조직 재생 의약품과 같은 광범위한 생의학 응용에 대한 잠재력을 가진다.
도 1은 HRP 및 CaO2-매개 가교 반응을 통한 페놀-공액 중합체의 in situ 하이드로겔 형성에 대한 개략도를 나타낸다. 수성 매질에서, CaO2는 Ca(OH)2, H2O2 및 O2로 분해된다. 생성된 H2O2는 페놀기 사이에 HRP-매개 가교 반응을 유도하여 하이드로젤을 형성하고, 하이드로젤 형성 후 점차적으로 방출될 수 있다. H2O2는 또한 물과 O2로 부분적으로 분리되어 다양한 생의학 응용을 위해 H2O2, O2 및 Ca2+ 이온을 동시에 방출하는 잠재적인 하이드로젤 매트릭스를 생성했다.
도 2는 GH/C 하이드로젤의 겔화 역학적 분석 결과로서, CaO2 용액 (A) 및 GH/C 하이드로젤 (B)의 H2O2 누적 방출 프로파일과, 바이알 틸팅 방법을 사용하여 겔화 시간에 대한 HRP 농도 (C) 및 CaO2 농도 (D)의 영향을 나타낸다.
도 3은 다양한 CaO2 농도로 제작된 하이드로젤의 탄성계수 측정을 통한 탄성률(Elastic modulus), 압축강도(Compressive strength) 및 인장력(Tensile strength) 등의 기계적 강도를 측정한 결과를 나타낸다. 첨가된 CaO2 농도에 의존적으로 하이드로젤의 기계적 강도가 강해지는 것을 확인할 수 있었다.
도 4는 다양한 CaO2 농도로 제작된 하이드로젤의 분해속도를 측정한 결과를 나타낸다. GH/H0.01은 0.01 중량 %의 H2O2를 직접 첨가하여 HRP/H2O2-매개 가교 반응에 의해 형성된 하이드로젤을 나타내었고, 이는 GH/C0.1과 유사한 탄성률을 나타냈다.
도 5는 다양한 CaO2 농도로 제작된 하이드로젤의 기공 크기를 측정한 결과를 나타낸다. 첨가된 CaO2 농도에 의존적으로 기공의 크기가 감소하였으나, 0.5 wt% 이상의 농도에서는 기공의 크기가 증가한 것을 확인할 수 있었다(스케일 바=100 ㎛).
도 6은 GH/C 하이드로젤 매트릭스의 Ca2+ 이온 및 산소 방출 역학을 나타낸다. Ca 이온 방출 역학은 일당 방출 속도 (A) 및 21 일 동안 누적 방출 (B)을 특징으로 한다. 산소 발생 역학은 시간 (C)의 함수로서 하이드로젤의 바닥에서 용존 산소 (DO)를 측정함으로써 특성화되었다. GH/H는 H2O2를 직접 첨가하여 형성된 하이드로젤을 나타낸다.
도 7은 다양한 CaO2 농도로 제작된 하이드로젤의 약물방출 거동을 측정한 결과를 나타낸다. 첨가된 CaO2 농도가 증가할수록 기공의 크기가 작아져 약물 방출 수준이 감소하였으며, 담지되는 약물의 분자량이 작을수록 방출 수준이 높은 것을 확인할 수 있었다. 다만, 첨가된 CaO2 농도가 0.5 wt% 이상인 경우 기공의 크기가 증가하기 때문에 약물 방출 수준이 증가하였다.
도 8은 다양한 CaO2 농도로 제작된 하이드로젤의 조직 접착 특성을 측정한 결과를 나타낸다. 첨가된 CaO2의 농도 및 고분자(GH)의 농도에 비례하여 접착력(Adhesive strength)가 증가하는 것을 확인할 수 있었다.
도 9는 3일 또는 7일 후 GH/H 또는 GH/C 하이드로젤에서 배양된 hMSC의 생/사 염색 이미지 및 3일 또는 7일 후 GH/H 또는 GH/C 하이드로젤에서 배양된 hMSC의 WST-1 분석을 사용한 세포 생존율의 정량 분석 결과를 나타낸다.
도 10은 CaO2 농도의 함수로서 GH/C 하이드로젤의 세포 적합성을 나타낸다. (A) 3 일 후 하이드로젤상에서 배양된 hMSC의 생/사 염색 이미지(스케일 바=200㎛, 살아있는 세포는 녹색, 죽은 세포는 적색으로 나타냄)와, (B) 3 일 후 하이드로젤상에서 배양된 hMSC의 WST-1 분석을 사용한 세포 생존율의 정량 분석 결과를 나타낸다.
도 11은 배양 배지(대조군) 또는 다른 하이드로젤(GH/H 또는 GH/C 하이드로젤)과 함께 12 시간 및 24 시간 배양 후 hMSC의 이동을 나타낸다.
도 12는 H & E 염색 및 알리자린 레드 염색에 의해 평가된, 14 일의 골 형성 배양 후 GH/H 또는 GH/C 하이드로젤에서 배양된 hMSC의 in vitro 골 형성 분화를 나타낸다(스케일 바=100 ㎛). OC-골 세포; OB 골아 세포; TB-소주골(trabecular bone); NB-새로운 골 형성(골 형성 계통의 세포에 의한 석회 침착의 존재).
도 13은 E. coli (A)와 S. aureus (B)에 대한 CaO2 농도에 따른 GH/C 하이드로젤의 시험 관내 항균 활성을 나타낸다.
도 14는 다양한 CaO2 농도로 제작된 하이드로젤의 신생혈관 형성 효과를 나타낸다. 첨가된 CaO2 의 농도가 증가할수록 튜브 구조 형성이 증가하는 것을 확인할 수 있었다. 다만, 첨가된 CaO2 의 농도가 0.5 wt% 이상인 경우 과량 발생한 H2O2의 독성으로 인해 튜브 구조가 감소한 것으로 나타났다.
도 15는 VEGF를 담지한 젤라틴 및 헤파린(GH/HT) 혼합형 하이드로젤을 나타낸다.
도 16은 젤라틴 및 헤파린(GH/HT) 혼합형 하이드로젤의 VEGF 방출거동을 나타낸다. 젤라틴만을 포함한 하이드로젤(GH)에 비하여 GH/HT 혼합형 하이드로젤의 VEGF 방출 속도가 늦어지는 것을 확인할 수 있었다.
도 17은 테트로닉-티라민(TetTA)/사이클로덱스트린(CD) 하이드로젤을 나타낸다.
도 18은 테트로닉-티라민(TetTA)/사이클로덱스트린(CD) 하이드로젤의 항암약물(Doxorubicin, Dox) 방출 거동을 나타낸다. CD 내부 소수성 부분의 크기(α, β 또는 γ CD)가 클수록, pH가 높을수록 Dox의 방출 속도가 느려지는 것을 확인할 수 있었다.
도 19는 젤라틴/PEG 혼합형 하이드로젤을 나타낸다.
도 20은 젤라틴/PEG 혼합형 하이드로젤의 기계적 강도 및 조직 접착력을 나타낸다. 첨가되는 PEG-티라민(PT)의 농도가 증가함에 따라 하이드로젤의 기계적 강도 및 조직 접착력이 증가하는 것을 확인할 수 있었으며, 젤라틴 및 PT의 비율이 25:75인 경우(25/75) 가장 우수한 조직 접착력을 나타냈다.
도 21은 CaO2를 이용하여 이중가교된 알지네이트 하이드로젤을 나타낸다.
도 22는 CaO2를 이용하여 이중가교된 알지네이트 하이드로젤의 기계적 강도 및 조직 접착력을 나타낸다. 첨가되는 CaO2의 농도가 증가함에 따라 하이드로젤의 기계적 강도 및 조직 접착력이 증가하는 것을 확인할 수 있었다.
이하, 본 발명을 보다 상세히 설명한다.
본 발명의 “GH/H 하이드로젤”은 젤라틴-하이드록시페닐 프로피온산(GH) 중합체에 과산화수소(H2O2)를 직접 첨가하여 제조한 하이드로젤을 의미한다.
본 발명의 “GH/C 하이드로젤”은 젤라틴-하이드록시페닐 프로피온산(GH) 중합체, 홀스래디쉬 과산화효소(HRP) 및 과산화칼슘(CaO2)를 혼합하여 제조한 하이드로젤을 의미한다.
본 발명의 “혈관신생”은 혈관이 새로 형성되는 과정, 즉 새로운 혈관이 세포, 조직 또는 기관 내로 발생 및 분화하는 것을 의미한다. 본 발명의 혈관신생은 내피세포 활성화, 이동, 증식, 매트릭스 재형성 및 세포 안정화를 비롯한 혈관 형성 과정에 관련된 혈관재생, 혈관회복 및 혈관 분화를 포함한다.
주입형 하이드로젤은 다양한 질병 치료 및 조직 재건/재생을 위한 약물 전달체와 임플란트의 역할을 수행할 수 있다. 이중에서도, 상기 기재한 바와 같이 홀스래디쉬 산화효소(HRP)와 과산화수소(H2O2)의 촉매반응을 이용한 하이드로젤화 시스템은 손쉽게 제조 가능함과 동시에 간단하게 하이드로젤의 특성을 조절할 수 있어 많은 관심을 받아왔다. 본 발명의 in situ 가교 하이드로젤 제조방법은, 과산화수소를 직접적으로 첨가하지 않고 과산화칼슘(CaO2)과 HRP의 반응을 통해 간접적으로 과산화수소를 제공하여 초기 과량의 과산화수소에 의해 발생하는 세포독성을 발생시키지 않으면서도 단단한 물성의 하이드로젤을 제조 가능하게 한다. 추가적으로, 과산화수소, 산소, 칼슘 이온의 조절된 서방 방출은 인간 성체줄기세포의 부착, 이동 및 분화를 촉진하였으며, 방출되는 과산화수소화 칼슘 이온의 양에 따라 그람 양성(E. coli) 또는 음성(S. aureus) 박테리아에 대해 사멸 효과를 보였다. 이러한 긍정적인 결과들은 HPR/과산화칼슘에 의해 제조된 하이드로젤이 골 재생이나 감염병 치료과 같은 다양한 범위의 생체의료 분야에 잠재적인 모체로서 사용될 수 있음을 보여준다.
따라서, 본 발명은 i) 페놀기 또는 페놀기를 포함하는 화합물이 도입된 고분자 및 효소를 용해시킨 용해액을 제조하는 단계;
ii) 과산화칼슘을 용해시킨 용해액을 제조하는 단계; 및
iii) 상기 i)의 용해액 및 ii)의 용해액을 혼합하여 혼합액을 제조하는 단계;
를 포함하는 in situ 가교 하이드로젤 제조방법을 제공할 수 있다.
상기 페놀기는 다른 작용기들과는 달리 다양한 형태로서 하이드로겔 제조에 사용되는 다양한 고분자 전구체에 제한없이 도입될 수 있다.
본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 단계 i)의 상기 페놀기를 포함하는 화합물은 하이드록시페닐프로피오닉산(hydroxyphenyl propionic acid), 4-하이드록시페닐아세트산(4-hydroxyphenyl acetic acid), 티로신(tyrosine), 티라민(tyramine), 테트로닉 티라민(tetronic tyramine) 및 PEG-티라민(PEG-tyramine) 으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상인 것일 수 있다.
본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 단계 i)의 고분자는 천연고분자 또는 합성고분자일 수 있으며, 바람직하게는 젤라틴, 키토산, 헤파린, 셀룰로스, 덱스트란, 덱스트란 설페이트, 콘드로이틴 설페이트, 케라탄 설페이트, 더마탄 설페이트, 알지네이트, 콜라겐, 알부민, 피브로넥틴, 라미닌, 엘라스틴, 비트로넥틴, 히알루론산, 피브리노겐 및 다지-고분자 로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상인 것일 수 있다. 상기 다지-고분자는 3지(3-arm)-폴리에틸렌글리콜(3armPEG), 4지(4-arm)-폴리에틸렌글리콜(4armPEG), 6지(6-arm)-폴리에틸렌글리콜(6armPEG), 8지(8-arm)-폴리에틸렌글리콜(8armPEG), 또는 4지(4-arm)-폴리프로필렌옥사이드-폴리에틸렌옥사이드(4arm-PPO-PEO)에서 선택된 어느 하나 또는 둘 이상의 고분자인 것일 수 있다.
본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 단계 i)의 효소는 홀스래디쉬 과산화효소(horseradish peroxidase), 글루타치온 과산화효소(glutathione peroxidase), 할로과산화효소(haloperoxidase), 미엘로퍼옥시데이즈(myeloperoxidase), 카탈라아제(catalase), 헤모프로틴(hemoprotein), 페록시레독신(peroxiredoxin), 동물 헴-의존적 과산화효소(animal heme-dependent peroxidases), 티로이드 과산화효소(thyroid peroxidase), 바나듐 브로모과산화효소(vanadium bromoperoxidase), 락토과산화효소(lactoperoxidase), 티로시네이즈(tyrosinase) 및 카테콜 옥시데이즈(catechol oxidase)로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상인 것일 수 있다.
본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 단계 i)의 고분자의 농도는 1 내지 10 wt % 인 것일 수 있으며, 바람직하게는 4 내지 7 wt % 인 것일 수 있다.
본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 단계 i)의 효소의 농도는 0.01 내지 1 mg/㎖ 인 것일 수 있다.
상기 단계 i)의 용해액에는, 페놀기 또는 페놀기를 포함하는 화합물이 도입된 고분자 1 종류가 포함될 수 있으며, 서로 상이하게 페놀기 또는 페놀기를 포함하는 화합물이 도입된 2종류 이상의 고분자가 포함될 수 있다(실시예 <11-1>).
본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 단계 i)의 용해액에 페놀기를 포함하는 화합물을 추가적으로 포함할 수 있는데, 상기 페놀기를 포함하는 화합물은 하이드록시페닐프로피오닉산(hydroxyphenyl propionic acid), 4-하이드록시페닐아세트산(4-hydroxyphenyl acetic acid), 티로신(tyrosine), 티라민(tyramine), 테트로닉 티라민(tetronic tyramine) 및 PEG-티라민(PEG-tyramine) 으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상인 것일 수 있다. 페놀기를 포함하는 화합물을 고분자에 도입하는 것 이외에, 고분자 및 효소를 용해시킨 용해액에 추가적으로 포함하여 하이드로젤을 제조함으로써 VEGF 내지 항암제 등의 약물의 서방방출을 조절할 수 있고, 하이드로젤의 접착력 등을 개선시킬 수 있다.
본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 단계 ii)의 과산화칼슘의 농도는 0.01 내지 0.5 wt % 인 것일 수 있으며, 바람직하게는 0.05 내지 0.2 wt % 인 것일 수 있다. 과산화칼슘의 농도가 0.5 wt% 이상인 경우에는 세포 독성을 나타낼 수 있어 세포 배양에 적합하지 않을 수 있다.
본 발명에서 CaO2는 HRP-매개 가교 반응을 통한 H2O2/O2-생성 하이드로젤(GH/C 하이드로젤)의 제조를 위한 유망한 재료로 사용되었다. CaO2는 폴리머 전구체(GH)와 함께 용해시킬 때, 먼저 물과 반응하여 Ca(OH)2 및 H2O2를 생성하였다. 이어서, 형성된 Ca(OH)2를 하이드로젤 매트릭스에 캡슐화하였다. Ca2+ 이온은 세포 이주 촉진 이외에도, 줄기 세포의 골 형성 분화를 촉진하고 뼈 공학의 잠재적 치료제 역할을 하는 것으로 이전에 보고된 바 있다. 이전에 8mM(320ppm) Ca 이온의 첨가가 인간 지방 유래 줄기 세포의 생존력을 유지했을 뿐만 아니라 그 증식을 증가시켰다고 보고된 바 있다.
반응성 산소종(ROS), 특히 H2O2는 세포의 이동 및 접착에 중요한 역할을 하는 것으로 보고되었다. 일부 in vitro 증거는 H2O2가 세포 이동을 촉진함으로써 상처 봉합을 촉진하기 위해 세포 사이의 화학 유인 물질로서 작용할 수 있다고 제안했다. 의료 분야에서 H2O2는 멸균, 항경련 및 소독에 효과적인 살균제로 사용되어 왔으며 미국 식품의약국(FDA)에서 최대 3 % (980mM)의 농도로 승인했다. 현재까지 상처 치료 및 조직 재생 응용을 위해 다양한 H2O2 방출 바이오 물질이 개발되었다. 반면에, 높은 외인성 H2O2 수준은 산화 스트레스를 유발하여 시간 및 용량 의존적 방식으로 세포 사멸을 유발할 수 있는 것으로 보고되었다.
상기 단계 iii)의 혼합액에서, 페놀기 또는 페놀기를 포함하는 화합물이 도입된 고분자 : 효소 : 과산화칼슘 의 부피비는 8 : 1 : 1 인 것일 수 있다.
본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 단계 iii)의 혼합액에 사이클로덱스트린(cyclodextrin)에 포접된 항암제를 추가적으로 포함하는 것일 수 있다. 상기 사이클로덱스트린은 알파-사이클로덱스트린, 베타-사이클로덱스트린, 감마-사이클로덱스트린, 또는 하이드록시프로필 베타-사이클로덱스트린 일 수 있다. 상기 항암제는 게스트 물질(guest molecule)로서 소수성 항암제라면 제한없이 포접될 수 있으나, 바람직하게는 독소루비신일 수 있다.
상기 사이클로덱스트린에 호스트-게스트 친화력(host-guest affinity)으로 포접된 항암제를 포함하는 하이드로젤은 pH 반응성을 가질 수 있다. 상기 pH 반응성을 갖는 하이드로젤은 산성조건에서 항암제를 방출하는 것일 수 있다. 구체적으로, pH 5 내지 7, 바람직하게는 pH 5 내지 6 의 약산성 조건에서 항암제를 방출하는 것일 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 제조방법으로 제조된 in situ 가교 하이드로젤을 제공할 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 in situ 가교 하이드로젤을 포함하는 항균용 조성물을 제공할 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 in situ 가교 하이드로젤을 포함하는 조직 재생용 조성물을 제공할 수 있다.
상기 조직 재생은 연골 재생(cartilage regeneration), 골 재생(bone regeneration), 치주골 재생, 피부 재생(skin regeneration), 심근 재생(cardiac tissue regeneration), 인공 수정체(artificial intraocularlens), 척수 신경 재생(spinal cord regeneration), 뇌신경 재생(cranial regeneration) 또는 성대 재생(vocal regeneration) 일 수 있으나 이에 한정되지 않는다.
또한, 본 발명은 상기 in situ 가교 하이드로젤을 포함하는 골세포 또는 골아세포로의 분화용 조성물 조성물을 제공할 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 in situ 가교 하이드로젤을 포함하는 혈관신생용 조성물을 제공할 수 있다.
상기 혈관신생용 조성물은 혈관 재생, 회복 및 분화가 필요한 다양한 질환에 대한 예방 또는 치료 효과를 가질 수 있다. 상기 질환은 재관류 손상, 허혈성 궤양, 허혈성 심장 질환, 허혈성 심근 경색, 하지 허혈 질환, 협심증, 뇌졸중 또는 뇌경색 등을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의하여 제한되는 것으로 해석하지 않는 것은 해당 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명한 것이다.
재료
젤라틴(돼지 피부에서 타입 A; > 300 블룸), 3-(4-히드록시-페닐)프로피온산(HPA, 3-(4-hydroxy-phenyl) propionic acid), 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)-카르보디이미드(EDC, 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)-carbodiimide), N-히드록시석신이미드(NHS, N-hydroxysuccinimide), 홀스래디쉬 산화효소(HRP, VI 형, 250-330 U/mg 고체), 클로스트리디움 히스토리티텀(Clostridium histolyticum)의 콜라게나제(타입 II, 0.5-5.0 FALGPA U/mg 고체), 과산화수소(H2O2, H2O에서 30 중량 %) 및 과산화칼슘(CaO2, 75 %, -200 메쉬)는 Sigma Aldrich로부터 구입하였다. 디메틸포름아미드(DMF, Dimethylformamide)는 준세이(Tokyo, Japan)에서 구입하였다. 페니실린-스트렙토마이신(P/S, Penicillin-streptomycin) 및 트립신/에틸렌디아민테트라아세트산(trypsin/ethylenediaminetetraacetic acid)은 Gibco BRL(Grand Island, NY, USA)에서 구입하였다. 소 태아 혈청(FBS) 및 둘 베코의 인산염 완충 식염수(PBS)는 Wisent(Saint-Bruno, Quebec, Canada)에서 구입했다. 줄기 세포 배양을 위한 알파-최소 필수 배지(α-MEM) 및 생/사 세포 생존성 키트(Live/dead cell viability kit)는 Invitrogen(Carlsbad, CA, USA)으로부터 구입하였다. EZ-Cytox 강화 세포 생존력 분석 키트(WST-1 분석 시약)는 ITSBIO(Seoul, South Korea)에서 구입하였다. 다른 화학 물질 및 용매들은 추가 정제없이 사용하였다.
겔화의 역학적 분석
<2-1> 과산화수소 측정
CaO2 용액 또는 하이드로젤 매트릭스로부터 방출된 H2O2의 양을 Pierce 정량적 과산화물 분석 키트(Thermo Scientific Pierce, Rockford, USA, USA)로 측정하고자 하였다.
구체적으로, 0.08, 0.1 또는 0.2 wt % 농도의 CaO2 용액(각각 C 0.08, C 0.1 또는 C 0.2) 200 ㎕ 을 37 ℃에서 72 시간 동안 1㎖의 DPBS와 함께 인큐베이션하였다. 상기 인큐베이션 시작 후 1, 3, 6, 24, 48 또는 72시간 지난 때의 용액 10 ㎕을 각각 96-웰 플레이트에서 공급자의 프로토콜에 따라 사전에 혼합된 작업 시약(WR) 용액 100 ㎕ 와 혼합하고 15 분 동안 실온에서 인큐베이션하였다. 그 후, 마이크로 플레이트 리더(VersaMax Tunable Microplate reader, Molecular Devices, USA)를 사용하여 혼합물의 흡광도를 595 nm에서 측정하였다. H2O2 농도(0-100 μM)의 흡광도를 측정하여 표준 곡선을 형성하고 방출된 H2O2 양을 보정했다.
추가적으로, 0.1, 0.2, 0.5 또는 1 wt % 농도의 CaO2을 각각 포함하여 하기 실시예 <2-2>의 방법으로 제조된 200 ㎕ 하이드로젤(각각 GH/C0.1, GH/C0.2, GH/C0.5 또는 GH/C1)을 사용하여 상기와 동일한 방법으로 방출된 H2O2의 양을 측정하였다. 측정에 사용된 하이드로젤은 각각 인큐베이션 시작 후 1, 2, 4, 6, 24, 48, 72, 96, 120 및 144 시간 지난 때의 하이드로젤이었다.
그 결과, [도 2]에서 나타나는 바와 같이 CaO2 농도가 증가함에 따라 생성된 H2O2의 양이 증가하였으며, 특히 인큐베이션 후 24 시간까지 점차적으로 증가되는 것을 확인할 수 있었다(도 2의 A). 또한, 동일한 CaO2 농도(0.1 wt %)에서 하이드로젤에서 방출된 H2O2의 양은 CaO2 용액에서 방출된 것보다 현저히 낮았으며, 이는 HRP-매개 가교 반응에 H2O2가 소비되었음을 의미하였다(도 2의 B). 하이드로젤에서 생성된 H2O2가 3D 중합체 네트워크 내에 포획되어 하이드로젤로부터의 H2O2 방출 속도가 감소됨을 주목하였다. 이는 혼입된 CaO2의 농도를 조절함으로써 하이드로젤 매트릭스의 H2O2 방출을 조절할 수 있음을 의미하였다.
<2-2> 하이드로젤의 제조 및 겔화 시간
젤라틴-하이드록시페닐 프로피온산(GH, gelatin-hydroxyphenyl propionic acid) 중합체를 합성한 방법은 다음과 같다. 물 15 ㎖의 조용매 (co-solvent)에 용해된 EDC 3.83 g (20 mmol) : DMF (3:2)를 조용매 125 ㎖ 중 3.32 g HPA(20 mmol)가 포함된 용액에 투입하였다. 1시간 활성화 후에, 상기 용액에 물 15 ㎖에 용해된 3.45 g NHS (30 mmol) : DMF (3:2) 조용매를 1시간 동안 교반 하에 투입하였다. 상기 활성화된 HPA 용액을 젤라틴 용액(5 g in 150 ㎖ DI water, 40℃)으로 투입하였다. 상기 활성화된 HPA 용액과 젤라틴 용액의 반응을 24시간 동안 수행하였으며, 젤라틴이 HPA 용액에 균질하게 용해되도록 40℃의 온도를 유지하였다. 상기 반응된 혼합물을 40℃에서 3,500 kDa의 MWCO를 갖는 투석막(dialysis tube)으로부터 한외여과 하였고, 상기 배지를 3일 동안 하루에 3번씩 교체하였다. 상기 GH 고분자를 냉동 건조 후에 78.8%의 수율로 얻을 수 있었다. GH(초기농도 6.25 wt%) 및 홀스래디쉬 산화효소(HRP; 0.05, 0.1, 0.2 및 0.4 mg/㎖)를 DPBS에 용해시키고, CaO2(0.5-5 wt %)를 0.1 M Tris-HCl(pH 8)에 용해시켰다. 하이드로젤(GH/C)은 중합체 용액을 상이한 농도의 HRP 및 CaO2 용액(GH : HRP : CaO2 = 8 : 1 : 1의 부피비)과 혼합함으로써 제조되었다(GH 최종농도: 5 wt%). 하이드로젤을 2㎖ 바이알(vial)에서 형성하고, 겔화 시간을 바이알 틸팅 방법(vial-tilting method)에 의해 결정하였다.
그 결과, [도 2]의 C 에서 나타나는 바와 같이 고정된 HRP 농도(0.01 mg/㎖)에서 하이드로젤의 겔화 시간은 CaO2 농도가 증가함에 따라 감소했지만, 0.2 wt % 이상의 농도에서는 급격히 증가하였다. 이는 더 높은 CaO2 농도가 더 높은 H2O2 방출량을 유도하여 가교 반응을 가속화한다는 사실에 의해 설명될 수 있었다. 그러나, 방출된 H2O2 양의 추가 증가는 HRP를 불활성화시키고 겔화 시간을 증가시켰다. 또한 HRP 농도가 증가함에 따라 하이드로겔의 겔화 시간이 15 초에서 5 초로 단축되었다(도 2의 D). 종합적으로, 페놀 결합 젤라틴 폴리머가 제어 가능한 겔화 시간을 갖는 HRP/CaO2-매개 산화성 가교 반응을 일으킬 수 있음을 확인하였다.
하이드로젤의 유변학적 분석
<3-1> 하이드로젤의 기계적 강도 측정
하이드로젤의 탄성 계수(G')는 진동 모드에서 레오 미터(GEM-150-050, Bohlin Instruments, USA)로 측정하였다. 플레이트 지오메트리(직경 = 25 mm, 갭 = 0.5 mm)에서 상이한 농도의 CaO2로부터 300 ㎕ 하이드로젤을 제조하였다. 하이드로젤의 유변학적 분석을 동적 시간 스위프에서 수행하였고, 측정 10 분 후에 G' 값을 기록하였다. 탄성률(Elastic modulus) 이외에도 압축강도(Compressive strength) 및 인장강도(Tensile strength)을 측정하였다.
압축강도는 universal testing machine(UTM) (H50K-T UTM, GEN-M-128, 노르웨이 Tinius Olsen)에 의해 측정되었다. 먼저, 하이드로겔 (600 ㎕, n = 3)을 정사각형 큐브 (10 × 10 × 10 mm)로 형성 한 다음 5 ㎖의 0.01M PBS에서 1 시간 동안 배양 하였다. 이어서, 제조된 하이드로겔 큐브를 UTM 플레이트 상에 놓고 10mm/분의 일정한 속도로 압력을 가하였다 (1000N). 하이드로겔 큐브가 파단된 힘(N)이 압축강도로 기록되었다.
인장강도는 universal testing machine(UTM) (H50K-T UTM, GEN-M-128, 노르웨이 Tinius Olsen)에 의해 측정되었다. 먼저, 하이드로겔 (600 ㎕, n = 3)을 직사각형 막대 (10 × 30 × 1 mm)로 형성 한 다음 5 ㎖의 0.01M PBS에서 1 시간 동안 배양 하였다. 이어서, 제조된 하이드로겔 바를 UTM 플레이트 상에 놓고 10mm/분의 일정한 속도로 인장력을 가하였다(1000N). 하이드로겔 바가 파단된 힘(N)이 인장강도로 기록되었다.
그 결과, [도 3]에서 나타나는 바와 같이 GH/C 하이드로젤의 탄성률, 압축강도 및 인장력은 CaO2 농도가 증가함에 따라 증가했는데, 이는 생성된 H2O2 양이 높기 때문인 것으로 판단하였다. 또한, 하이드로젤의 G '값은 점차 증가하여 10분 후에도 편평기(plateau)에 도달하지 않았는데, 이는 24 시간 동안 CaO2 분해로부터 생성된 H2O2 때문인 것으로 판단하였다.
<3-2> 하이드로젤의 체외분해
300 ㎕ 하이드로젤을 1.5 ㎖ 마이크로 튜브에서 제조하고, 37 ℃에서 0.001 mg/㎖ 콜라게나제(Clostridium histolyticum 유래)를 함유하는 1 ㎖ PBS 용액에서 인큐베이션 하였다. 미리 결정된 시점에서, 분해된 하이드로젤의 무게를 측정한 후 배지를 제거하고 새로운 배지로 교체하였다. 남아있는 하이드로젤의 백분율은 하기 [수학식 1]로 계산하였다(Wd: 분해된 하이드로젤 중량, Wi: 초기 하이드로젤 중량).
[수학식 1]
잔류 하이드로젤의 중량 (%) = Wd / Wi × 100
그 결과, [도 4]에서 나타나는 바와 같이 콜라게나제와 함께 배양된 모든 하이드로젤은 13 일 이내에 완전히 분해되었다. 고정된 농도의 중합체(5 wt %) 및 HRP(0.01 mg/㎖)에서, CaO2 농도의 증가는 분해 속도를 감소시켰다. 더 느린 분해는 하이드로젤의 기계적 강도 증가에 기인한다. GH/C0.1(~ 1700 Pa)의 강도과 유사한 강도를 갖는 GH/H0.01 하이드로젤과 비교하여, GH/C0.1 하이드로젤의 분해 시간이 연장되었다. 방출된 Ca2+ 이온은 콜라게나제의 효소 활성에 영향을 줄 수 있는 것으로 판단하였다.
<3-3> 하이드로젤의 다공성 구조
하이드로젤의 다공성 구조는 전계 방출 주사 전자 현미경(FE-SEM, JSM 7001F, JEOL, Tokyo, Japan)을 사용하여 주사 전자 현미경(SEM) 분석에 의해 특성화되었다. 간단히, 몰드(직경 = 5 mm)에 600 ㎕ 하이드로젤을 준비한 다음 동결 건조기에서 동결 건조했다. 그 후, 동결 건조된 하이드로젤을 절단하고 금으로 스퍼터 코팅하여 단면의 형태를 관찰하였다.
그 결과, [도 5]에서 나타나는 바와 같이 GH/C 하이드로젤은 100-300 ㎛ 범위의 기공 크기를 가진 상호 연결된 다공성 구조를 나타냈다. CaO2 농도의 증가는 겔 가교밀도의 증가에 기인한 하이드로젤 매트릭스의 기공 크기를 감소시키는 것으로 관찰되었다. 그러나, 0.5 wt % 이상의 CaO2 농도에서는 더 높은 산소 기포 발생률로 인해 하이드로젤의 기공 크기를 증가시켰다.
하이드로젤의 체외 방출
<4-1> 하이드로젤의 칼슘 이온 방출거동
상이한 GH/C 하이드로젤로부터의 칼슘 이온 방출 프로파일을 유도 결합 플라즈마 질량 분광법(ICP-MS)을 사용하여 연구하였다. 하이드로젤을 37 ℃에서 1㎖의 DIW와 함께 배양하였다. 미리 결정된 시간에 배지를 제거하고 -20 ℃에 보관한 다음 새로운 배지로 교체했다. Ca 이온의 농도를 결정하기 위해, 500 ㎕의 샘플 용액을 DIW로 10 회 희석하고 ICP-MS 기계로 측정하였다. 직접 H2O2 첨가에 의해 형성된 하이드로젤을 대조군(GH/H)으로 사용하였다.
그 결과, [도 6]에서 나타나는 바와 같이, Ca 이온이 한번에 방출되지 않고 20 일에 걸쳐 하이드로젤로부터 점진적으로 방출되는 것을 확인할 수 있었다. 방출 패턴은 CaO2 농도의 증가가 매일 Ca 이온 방출량을 증가 시켰지만(도 6의 A), 더 높은 겔 강도으로 인해 누적 방출 속도를 감소시켰다(도 6의 B). 줄기 세포에 대한 세포 독성 농도보다 훨씬 낮은 GH/C0.5 하이드로젤에 대해 최고 Ca 이온 수준은 82.3 ± 13.4 ppm 이었다.
<4-2> 하이드로젤의 약물 방출거동
하이드로젤 제작시 첨가된 CaO2 농도 또는 하이드로젤 내에 담지한 약물의 분자량에 따른 하이드로젤의 약물방출거동을 확인하고자 하였다.
구체적으로, GH 용액 (6.25 wt %)을 PBS에 용해시키고 큰 분자량의 약물(성장 인자 bFGF; 10 ㎍/㎖) 또는 작은 분자량의 약물(Doxycycline(Dox); 10 mg/㎖)와 혼합한 혼합물을 2개의 분취량으로 나누었다. 하나의 분취액에 HRP(0.05 mg/㎖)를 첨가하고 다른 분취액에 CaO2 (1 wt%)를 첨가하였다 (GH : bFGF / Dox : HRP / CaO2 = 8 : 1 : 1의 부피비). 약물 담지된 하이드로겔은 2개의 분취량을 혼합함으로써 형성되었다. GH, HRP, CaO2 및 약물의 최종 실험 조건은 각각 5 wt%, 0.005 mg/㎖, 0.1 wt%, 1 ㎍/㎖ (bFGF) 및 1 mg/㎖ (Dox)이었다. 이어서, 1 ㎖ PBS 완충액을 하이드로겔에 첨가하고 37 ℃에서 배양하였다. 미리 정해둔 시간 간격으로, 하이드로겔과 배양된 PBS 상층액을 수집하여 영하 20 ℃에 보관하고 새로운 PBS 완충액을 추가하였다. 수집된 완충액 중 bFGF의 농도는 제조사의 프로토콜에 따라 bFGF ELISA 키트 (R&D Systems)를 사용하여 측정하였으며, 추출된 용액의 흡광도를 347 nm에서 측정하여 Dox 방출을 분석하였다. bFGF 및 Dox의 누적 방출 백분율은 하기 [수학식 2]로 계산되었다(C: 수입된 완충액 내의 bFGF 및 Dox 방출 농도, Co: 초기 bFGF 및 Dox의 농도).
[수학식 2]
bFGF / Dox 방출 (%) = C / Co × 100
그 결과, [도 7]에 나타나는 바와 같이, CaO2의 농도가 증가할수록 가교 밀도가 증가하여 약물 방출 수준이 감소하는 것을 확인할 수 있었다. 그러나, CaO2 농도가 0.5 wt% 이상인 경우에는 산소 기포 발생이 증가하여 하이드로젤의 기공 크기가 증가함으로써 약물 방출 수준이 증가하였다. 또한, 독시사이클린(Doxycycline)과 같은 작은 분자량의 약물은 하이드로젤에서 쉽게 방출되어 bFGF와 같은 거대분자 약물보다 빠른 방출 속도를 나타냈다.
산소 장력의 체외 측정
하이드로젤 내에서 산소 발생을 측정하기 위해 상용화된 센서(Presens, Regensburg, Germany)를 사용했다. CaO2 농도(GH/C0.05 및 GH/C0.25) 하이드로젤 매트릭스(80 ㎕)는 96-웰 플레이트의 바닥에 부착된 패치 센서에서 제조되었다. 하이드로젤을 10분 동안 안정화한 후, DIW 200 ㎕를 첨가하고 하이드로젤 전체의 용존 산소(DO) 수준을 1분 간격으로 24 시간 동안 모니터링하였다. 모든 측정은 실온에서 수행되었다.
그 결과, [도 6]의 C에서 나타나는 바와 같이, 모든 하이드로젤은 최대 24 시간 동안 지속적으로 산소를 방출했는데, GH/H 하이드로젤은 또한 H2O2 분해에 기인하는 O2 발생을 유도한다는 것을 주목하였다. 최대 산소 수준은 CaO2 농도가 증가함에 따라 증가했다(GH/H: 25.5 % O2; GH/C0.05: 29.4 % O2; GH/C0.25: 36.5 % O2). 이는 H2O2 및 Ca 이온의 방출 역학과 일치하여, 하이드로젤의 물리 화학적 특성 및 방출 역학을 제어하는데 있어서 CaO2 농도의 역할을 시사한다.
하이드로젤의 세포 적합성
<6-1> H 2 O 2 직접 첨가 여부에 따른 세포 적합성 확인
하이드로젤 제작시 H2O2(최종농도 0.005 wt%)를 직접 첨가한 하이드로젤(GH/H)와, H2O2 직접 첨가 대신 CaO2(최종농도 0.05 wt%)를 첨가한 하이드로젤(GH/C)의 세포 적합성을 유사한 물성(500 Pa)에서 확인하고자 하였다.
구체적으로, WST-1 분석 키트 및 생/사 분석(live/dead assay)을 사용하여 세포 생존력 및 하이드로젤 상으로의 확산을 조사하였다. 인간 중간엽 줄기 세포(hMSC)를 표준 배양 조건(37 ℃ 및 5 % CO2) 하에서 10 % FBS 및 1 % P/S가 보충된 α-MEM으로 배양하였다. 세포 부착 및 확산 시험을 위해, hMSC(3 × 104 cells)를 24-웰 플레이트에서 GH/C 하이드로젤(200 ㎕)에 시드하고 세포 배양 인큐베이터에서 37 ℃ 로 배양하였다. 3일 또는 7일 동안 배양한 후, 하이드로젤에 부착된 세포 형태를 2 mM 칼세인의 아세토메톡실 유도체(calcein AM) 및 4 mM 에티디움 호모다이머-1(EthD-1)을 함유하는 500 ㎕ PBS 용액으로 37 ℃에서 30 분 동안 처리한 후 형광 현미경(TE2 TE2000, Nikon, Tokyo, Japan)으로 검사하였다. 세포 증식은 WST-1 분석에 의해 결정되었다. 세포를 37 ℃에서 5 % CO2 하에 2 시간 동안 1㎖ 의 새로운 배지 및 100㎕의 WST-1 시약과 함께 인큐베이션 하였다. 그 후, 100 ㎕의 반응 용액을 96-웰 플레이트로 옮기고 마이크로 플레이트 리더(VersaMax Tunable Microplate reader, Molecular Devices, USA)를 사용하여 450 nm에서 광학 밀도를 측정하였다.
그 결과, [도 8]에서 나타나는 바와 같이 GH/H 하이드로젤에 비하여 GH/C 하이드로젤에서 세포의 접착이 증가한 것을 확인할 수 있었다. 또한, [도 9]에서 나타나는 바와 같이 배양 3 일째에 GH/H와 GH/C 하이드로겔 간에는 세포 증식에 차이가 없었으나, GH/C는 GH/H보다 7 일 배양 후 향상된 세포 성장을 나타냈다. 이는 GH/C 하이드로겔로부터 O2의 지속적인 방출과 수송에 기인한 것으로, 3D 세포 배양 시스템에서 세포 활동을 촉진시켰음을 의미하였다. 따라서, GH/C 하이드로젤은 세포 전달 치료의 잠재적인 후보군이 될 수 있다.
<6-2> CaO 2 농도에 따른 세포 적합성 확인
상기 실시예 <6-1> 과 동일한 방법으로 본 발명의 하이드로젤 제작시 첨가된 CaO2 농도(0.05, 0.1, 0.2 또는 0.5 wt%) 에 따른 세포 적합성을 확인하고자 하였다. 세포배양은 3일 동안 수행하였다.
그 결과, [도 10]에서 나타나는 바와 같이 최대 0.2 wt %의 CaO2에 대해 세포가 하이드로젤 상에 증식하는 것을 확인할 수 있었다. GH/C0.2는 GH/C0.05 및 GH/C0.1에 비해 세포 증식률이 가장 높았는데, 이는 상이한 겔 강도 및 H2O2, O2 및 Ca 이온의 방출량이 원인인 것으로 판단하였다. GH/C0.5 의 감소된 세포 생존율은 높은 H2O2 방출량의 잠재적 독성이 원인인 것으로 판단하였다. 상기 결과에 기초하여, 추가의 시험 관내 세포 연구를 위해 GH/C0.05 및 GH/C0.1을 선택하였다.
In vitro 세포 이동 분석
인간 중간엽 줄기 세포(hMSC)를 웰당 2×105 의 세포 밀도로 48-웰 플레이트에 시딩하고 37 ℃에서 배양하여 융합 단일층을 수득하였다. 그 후, 100 ㎕ 피펫 팁을 사용하여 수직 스크래치 상처를 만들었고, 분리된 세포를 제거하기 위해 세포를 PBS로 3 번 헹구었다. 이어서, 상처를 입은 단층을 새로운 배양 배지(음성 대조군), GH/H 하이드로젤을 함유하는 배양 배지(HRP/H2O2-매개 반응에 의해 형성된 하이드로젤, 양성 대조군) 및 GH/C 하이드로젤을 함유하는 배양 배지와 함께 배양 하였다. 인큐베이션 12 시간 및 24 시간 후, 위상차 현미경(Olympus, Japan)에 의해 세포 이동을 관찰하였다.
그 결과, [도 11]에서 나타나는 바와 같이 GH/C 하이드로젤이 대조군과 비교하여 24 시간 인큐베이션 후 hMSC의 이동을 유의하게 촉진시켰음을 확인할 수 있었다. 세포가 이동하여 스크래치를 거의 완전히 채운 GH/C0.1 하이드로젤에서 가장 높은 이동 속도가 관찰되었다. 상기 결과는 하이드로젤에서 방출된 H2O2의 영향으로 설명할 수 있다. 종합적으로, GH/C 하이드로겔의 Ca 이온 및 H2O2 생성을 통한 hMSC 이주 자극을 조직 재생 의약에 응용할 수 있음을 의미한다.
hMSC의 골 형성 분화에 대한 GH/C 하이드로젤의 효과
GH 및 HRP를 멸균 DPBS에 용해시키고 시린지 필터(기공 크기 0.2㎛)를 사용하여 여과하였다. hMSC(5 × 104 세포)를 200 ㎕의 GH 중합체 용액에 재현탁시키고, HRP 및 CaO2를 첨가하여 48-웰 플레이트에 세포 매립 겔 구조물을 제조하였다. 10 분의 평형 후, 하이드로젤을 50 ㎍/㎖ L-아스코르브 산, 10 mM β-글리세로포스페이트, 100 nM 덱사메타손 및 100 ㎍/㎖ 스트렙토마이신이 보충된 성장 배지와 함께 배양하고 매 2 일마다 배지를 교환하였다. 대조군 샘플로서 H2O2 를 직접 첨가하여 형성된 GH 하이드로젤(GH/H)을 사용하였다. 배양 14 일 후, 샘플을 PBS로 세척하고 4 % 파라포름알데히드 용액으로 실온에서 1 시간 동안 고정시켰다. 헤마톡실린-에오신(H & E) 및 알리자린 레드 S(Alizarin Red S) 염색을 사용한 조직학적 분석을 위해, 샘플을 일련의 알코올 용액(80-100 %)에서 탈수시키고, 파라핀에 매립하고 4 ㎛ 두께로 슬라이스하였다.
그 결과, [도 12]에서 나타나는 바와 같이 배양 14 일 후, 모든 그룹에서 캡슐화된 hMSC의 대부분은 생존했으며 죽은 세포는 검출되지 않았는데, 이는 하이드로젤의 우수한 생체 적합성을 의미했다. 또한, 대조군 GH/H 하이드로젤과 비교하여, GH/C0.05 및 GH/C0.1 하이드로젤은 hMSC의 골 형성 분화를 유의적으로 상향 조절하였는데, 14 일 배양 후 H & E 염색을 통해 골 세포 및 골아 세포의 수가 증가하였다. 특히, hMSCs-포함 GH/H 및 GH/C 하이드로젤의 구조는 상이하였는데, 골 뼈 유사 구조는 GH/C 하이드로젤에 대해서만 관찰되었다. 또한, 알리자린 레드 S 염색은 CaO2 농도가 증가함에 따라 더 많은 양의 석회 침착을 보였으며, 이는 골 형성 계통의 밀도가 높음을 나타냈다. 종합적으로, GH/C 하이드로젤 시스템에서, CaO2는 in situ 하이드로젤 형성을 촉매할뿐만 아니라 H2O2, O2 및 Ca2+ 이온으로의 분해에 의해 줄기 세포 거동(부착, 증식, 이동 및 분화)을 자극하는 생물 활성 분자를 제공하였다.
항균성 테스트
하이드로젤의 항균 활성은 박테리아 현탁액 분석으로 결정하였다. 간단하게, 48-웰 플레이트에서 200 ㎕의 하이드로젤을 제조하였다. 이어서, 1 ㎖의 박테리아 용액(E. coli 또는 S. aureus, 104 세포)을 각 웰에 첨가하고 37 ℃에서 48 시간 동안 부드럽게 흔들었다. 박테리아 용액만을 함유하는 웰을 대조군으로 사용하였다. 박테리아 성장률을 결정하기 위해, 100 ㎕의 박테리아 용액을 96-웰 플레이트로 옮기고 광학 밀도를 600 nm에서 측정 하였다.
그 결과, [도 13]에서 나타나는 바와 같이 GH/C 하이드로젤이 E. coli 또는 S. aureus의 성장 속도를 억제하는 것을 확인할 수 있었다. 하이드로젤의 항균 활성은 GH/C0.1이 GH/C0.05보다 더 높은 효과를 나타내는 H2O2 방출의 방출량에 의존적이었다. 하이드로젤이 박테리아를 사멸시킬 수는 없지만, GH/C 그룹의 존재 하에서 박테리아 성장이 효과적으로 감소되었다. 상기 분석과 함께, GH/C 하이드로젤은 다양한 생체 의학 응용을 위한 다기능 주입용 하이드로젤 스캐폴드로서 큰 잠재력을 보여 주었다.
신생혈관 형성 효과 확인
본 발명의 CH/C 하이드로겔의 신생 혈관 형성을 촉진하기 위한 생물 활성 매트릭스로서 잠재력을 조사하기 위해, 인간 탯줄 정맥 내피 세포(HUVEC, Human Umbilical Vein Endothelial Cells)를 사용하여 튜브 형성 분석을 수행하였다.
구체적으로, 200 ㎕의 GH/H(H2O2 0.005 wt%) 및 GH/C(CaO2 0.05-0.5 wt%)를 24-웰 플레이트에서 제조하였다. 표준 배양 조건(37 ℃ 및 5 % CO2)하에 유리 혈청 EGM(Lonza, Walkersville, MD, USA)을 사용하여 HUVEC(passage 3, 2 × 10⁴세포/웰)를 제조된 하이드로겔에 배양되었다. 12 시간 후, 위상차 현미경 (40× 배율)을 사용하여 튜브 형성을 관찰하고 ImageJ 소프트웨어를 사용하여 미세 혈관 브릿지의 수를 정량화 하였다. 50 ng/㎖의 혈관 내피 성장 인자(VEGF)를 첨가하여 배양된 HUVEC를 대조군으로 사용 하였다.
그 결과, [도 14]에서 나타나는 바와 같이 CaO2 농도 의존적으로 H2O2 방출량이 증가하여 튜브 구조 형성 개수가 증가하였으며, 이는 VEFG를 처리한 경우와 비슷한 수준인 것을 확인할 수 있었다. 그러나 CaO2 농도가 0.5 wt% 이상인 경우 높은 H2O2 방출량으로 독성이 나타나 튜브 구조가 감소하는 것으로 나타났다.
하이드로젤의 생의학적 응용을 위한 추가구성
<11-1> VEGF 서방방출을 위한 젤라틴/헤파린 혼합형 하이드로젤
하이드록시페닐 프로피오닉산을 도입한 젤라틴 고분자(GH)와, 티라민을 도입한 헤파린 고분자(HT)를 모두 포함하여 VEGF를 담지하도록 제조된 젤라틴 및 헤파린(GH/HT) 혼합형 하이드로젤의 VEGF 방출 거동을 확인하고자 하였다.
구체적으로, GH 및 HT 중합체를 각각 12.5 wt % 및 5 wt %에서 0.01 M PBS에 개별적으로 용해시켰다. 이어서, GH 및 HT 용액을 1 : 1 부피비로 혼합하여 균질 혼합물을 수득하였다. 이후에, 혼합물을 2 개의 분취량으로 나누었다. 하나의 분취 량에 HRP (0.05 mg/㎖) 및 VEGF (10 ㎍/㎖)를 첨가하고, 다른 하나는 CaO2 (1 wt%) 및 VEGF (10 ㎍/㎖)가 첨가되었다(중합체 : VEGF : HRP/CaO2의 부피비 = 8 : 1 : 1). VEGF 담지된 하이드로겔은 2 개의 분취량을 혼합함으로써 형성되었다(도 15). GH, HT, VEGF, HRP 및 CaO2의 최종 농도는 각각 5 wt%, 2 wt%, 1 mg/㎖, 0.005 mg/㎖ 및 0.1 wt%였다.
그 결과, [도 16] 에서 나타나는 바와 같이, GH/HT 혼합형 하이드로젤에서 VEGF의 방출속도는 헤파린 분자와 VEGF의 특이적 친화력으로 인해 GH 하이드로젤에 비해 지연되는 것을 확인할 수 있었다.
<11-2> 항암제의 조절가능한 서방방출을 위한 TetTA/CDs 하이드로젤
Tetronic의 양친매성 성질을 응용하여 독소루비신(Dox)과 같은 소수성 약물을 담지하기 위해 페놀기가 결합되어 Tetronic (TetTA)으로 형성된 하이드로젤을 제조하였다.
구체적으로, TetTA를 0.01 M PBS에 22.2 wt%로 용해시켰다. CD (γ, β 또는 α-CD)를 5.5 M%의 0.01 M PBS에 개별적으로 용해시킨 다음, 5.5 ㎍/㎖의 CD 용액에 Dox를 용해시켰다. 이어서, TetTA 및 CD/Dox 용액을 1 : 1 부피비로 혼합하여 균질 혼합물을 수득하였다. 이후에, 혼합물을 2 개의 분취량으로 나누었다. 한 분취량에 HRP (0.05 mg/㎖)를 첨가하고 다른 분취량에 CaO2 (2 wt%)를 첨가하였다(TetTA/CD/Dox : HRP/CaO2의 부피비 = 9 : 1). Dox 담지된 하이드로겔은 2 개의 분취 량을 혼합함으로써 형성되었다(도 17). TetTA, CD, Dox, HRP, CaO2의 최종 농도는 각각 20 wt%, 2.5 wt%, 2.5 ㎍/㎖, 0.005 mg/㎖ 및 0.2 wt%였다.
그 결과, [도 18] 에서 나타나는 바와 같이 사이클로덱스트린의 높은 게스트 물질(guest molecule, Dox)과의 친화력(Host-Guest affinity)으로 인해 사이클로덱스트린의 첨가는 자체 내부 소수성 부분의 크기(α, β 또는 γ CD)에 비례하여 Dox의 방출속도를 감소시켰다. pH 반응성을 갖는 TetTA 하이드로젤에서의 Dox 방출은 종양 근처 산성 환경을 모방하여 산성도에 비례한 방출거동을 나타냈으며, 종양 근처의 산성 환경에서 활성화될 수 있음을 의미하였다.
<11-3> 조직접착력 강화를 위한 젤라틴/PEG 혼합형 하이드로젤
페놀기가 도입된 고분자를 이용하여 하이드로젤 제조시 PEG-티라민 중합체(PT)를 추가적으로 포함하여 젤라틴/PEG 혼합형 하이드로젤을 제조하여 이의 기계적 강도 및 조직접착력을 확인하였다.
구체적으로, GH 및 PT를 5 wt%에서 0.01 M PBS에 개별적으로 용해시켰다. 이어서, GH 및 PT 용액을 다양한 중합체 조성물 (100/0, 75/25, 50/50, 25/75 및 0/100 (GH/PT, w/w)과 혼합하고 볼텍싱하여 균질 혼합물을 수득하였다. 혼합물을 2 개의 분취액으로 나누고, 하나의 분취량에 HRP (0.05 mg/㎖)를 첨가하고 다른 분취물에 CaO2 (2 wt%)를 첨가하였다(중합체 : HRP/CaO2 = 9 : 1의 부피비). 하이드로겔은 2 개의 분취량을 혼합함으로써 형성되었다(도 19).
그 결과, [도 20] 에서 나타나는 바와 같이, 젤라틴 하이드로젤(GH)의 기계적 강도 및 접착력은 HRP/CaO2 촉매반응 하에 PEG-티라민 중합체(PT)와 가교시킴으로서 상당히 개선되는 것을 확인할 수 있었다. 혼합형 하이드로젤의 접착력은 고분자 농도를 조절함으로서 조절가능하며, 25/75 GH/PT 비율에서 100 ± 7 kPa 의 가장 높은 값을 나타냈다.
<11-4> 물성 강화를 위해 이중가교된 알지네이트 하이드로젤
[도 21]에서 나타나는 바와 같이, CaO2를 이중가교 매개체로 사용하여 ① 금속이온과 킬레이션 반응(알지네이트의 G 유닛과 Ca 이온)을 통한 물리적 가교; 및 ② HRP/H2O2를 이용한 페놀기 사이의 화학적 가교; 로 이중가교된 하이드로젤을 제조하였다.
구체적으로, 페놀 작용기가 중합된 알지네이트(AlgTA) 및 HRP를 각각 3.75 wt% 및 0.1 mg/㎖에서 0.01 M PBS에 용해시켰다. CaO2 (2, 4, 6, 8 및 10 wt%)를 0.1 M Tris-HCl (pH 8)에 용해시켰다. 하이드로겔은 중합체 용액을 HRP 및 CaO2 용액 (AlgTA : HRP : CaO2 = 8 : 1 : 1의 부피비)과 혼합하여 형성되었다(도 21). AlgTA, HRP 및 CaO2의 최종 농도는 각각 3 wt%, 0.01 및 0.2 - 1 wt% 였다.
그 결과, [도 22] 에서 나타는 바와 같이, HRP/CaO2 가교된 알지네이트 하이드로젤의 기계적 특성은 CaCl2를 이용하여 물리적으로 가교된 알지네이트 하이드로젤에 비하여 월등히 높았다. 하이드로젤의 물성은 CaO2의 농도를 조절함으로써 조절 가능하였다.
[통계 분석]
연구의 실험 데이터는 스튜던트 t-테스트를 사용하여 분석되었다. 통계적 유의성은 * P < 0.05 를 갖는 것으로 간주되었다. 모든 실험은 3 회 수행되었고 데이터는 평균 ± SD로 제시되었다.

Claims (14)

  1. i) 페놀기 또는 페놀기를 포함하는 화합물이 도입된 고분자 4 내지 7 wt % 및 홀스래디쉬 과산화효소(horseradish peroxidase) 0.01 내지 1 mg/㎖ 를 용해시킨 용해액을 제조하는 단계;
    ii) 과산화칼슘 0.05 내지 0.2 wt % 을 용해시킨 용해액을 제조하는 단계; 및
    iii) 상기 i)의 용해액 및 ii)의 용해액을 혼합하여 혼합액을 제조하는 단계;
    를 포함하는 과산화수소를 간접적으로 공급하는 in situ 가교 하이드로젤 제조방법으로서,
    상기 고분자는 젤라틴, 키토산, 알지네이트, 히알루론산 및 덱스트란 으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는 제조방법.
  2. 삭제
  3. 삭제
  4. 삭제
  5. 삭제
  6. 제1항에 있어서, 상기 단계 i)의 용해액에 페놀기를 포함하는 화합물을 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 제조방법.
  7. 제1항 또는 제6항에 있어서, 상기 페놀기를 포함하는 화합물은 하이드록시페닐프로피오닉산(hydroxyphenyl propionic acid), 4-하이드록시페닐아세트산(4-hydroxyphenyl acetic acid), 티로신(tyrosine), 티라민(tyramine), 테트로닉 티라민(tetronic tyramine) 및 PEG-티라민(PEG-tyramine) 으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는 제조방법.
  8. 삭제
  9. 제1항에 있어서, 상기 단계 iii)의 혼합액에 사이클로덱스트린(cyclodextrin)에 포접된 항암제를 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 제조방법.
  10. 제1항의 제조방법으로 제조된 in situ 가교 하이드로젤.
  11. 제10항의 in situ 가교 하이드로젤을 포함하는 항균용 조성물.
  12. 제10항의 in situ 가교 하이드로젤을 포함하는 조직 재생용 조성물.
  13. 제10항의 in situ 가교 하이드로젤을 포함하는 골세포 또는 골아세포로의 분화용 조성물.
  14. 제10항의 in situ 가교 하이드로젤을 포함하는 혈관신생용 조성물.
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