KR20230119462A

KR20230119462A - 구리를 이용한 서방형 산화질소 방출형 in situ 가교 하이드로젤의 제조방법 및 이의 생의학적 용도

Info

Publication number: KR20230119462A
Application number: KR1020220015637A
Authority: KR
Inventors: 박기동; 디우 린 트란; 티 풍 레
Original assignee: 아주대학교산학협력단
Priority date: 2022-02-07
Filing date: 2022-02-07
Publication date: 2023-08-16
Also published as: WO2023149692A1

Abstract

본 발명은 페놀기 또는 페놀기를 포함하는 화합물이 도입된 고분자, 구리 화합물, 효소 및 과산화수소를 이용하는 구리 함유 in situ 하이드로젤의 제조방법 및 이의 용도에 관한 것으로, 본 발명에 따르면 효소의 촉매 작용 하에서, 고분자는 가교 네트워크의 형성과 Cu 나노입자의 침착을 위해 산화되어 가교된 구리 함유 하이드로젤을 형성하고, 상기 가교된 구리 함유 하이드로젤은 구리 이온을 지속 방출하므로, 거의 3주 동안 내인성 NO 공여체(RSNO)의 존재 하에 NO 생성을 촉진할 수 있다.
이에 따라, Cu 이온과 NO의 시너지 효과로 인해 항염증성 M2 표현형 분극을 조절하고 내피 세포의 이동을 자극하여 구리 함유 in situ 하이드로젤의 시험관 내 생체 활성을 확인할 수 있으며, 구리 함유 하이드로젤은 상처 치유 과정을 촉진할 수 있다.

Description

구리를 이용한 서방형 산화질소 방출형 in situ 가교 하이드로젤의 제조방법 및 이의 생의학적 용도{Preparation method of in situ crosslinkable copper-containing hydrogel as a controlled nitric oxide-releasing scaffold, and biomedical use thereof}

본 발명은 구리를 이용한 서방형 산화질소 방출형 in situ 가교 하이드로젤의 제조방법 및 이의 생의학적 용도에 관한 것이다.

하이드로젤(hydrogel)은 수상에 용해된 고분자의 물리화학적 가교를 통한 젤리 형태의 물질로서, 친수성이 우수하여 물을 쉽게 흡수할 수 있을 뿐만 아니라 강도, 모양 등을 쉽게 조절할 수 있어 조직공학용 지지체 또는 약물전달 등에 사용되고 있다. 또한 하이드로젤은 우수한 생체적합성과 생분해성, 약물방출 조절 및 체내 주입 후 상전이를 이룰 수 있는 최소침습적 특성으로 인해, 체내 약물전달 효율이 낮은 방식의 대안으로 활발히 연구되고 있다. 약물전달체로서 주된 목적은 질환 부위에서 장기간 약효 농도 이상 약물을 서방출하여 부작용을 초래할 수 있는 잦은 주입을 필요로 하지 않는 것이다.

또한, 광범위한 염증 단계와 감소된 혈관화로 인한 만성 또는 치유되지 않는 상처는 인간의 건강에 심각한 문제를 야기하고 있다. 따라서 염증 단계를 단축하고 혈관 신생 과정을 촉진하는 생체 재료의 개발은 만성 창상 치료에 유망한 치료법이다. 현재, 산화질소(NO)는 면역 반응, 세포 사멸, 염증 등을 포함한 많은 생리학적 과정에 관여하는 내인성 가스 분자이다. 그러나 NO의 임상 적용은 생체 물질로부터의 폭발적인 방출로 인해 제한된다.

이에, 가교 하이드로젤을 이용하여 초기 단계에서의 방출을 제어하여 지속적으로 산화질소를 형성할 수 있는 기술에 대한 연구가 필요한 실정이다.

대한민국 공개특허 제10-2014-0037757호 (2014.03.27 공개)

본 발명은 페놀기 또는 페놀기를 포함하는 화합물이 도입된 고분자, 구리 화합물, 효소 및 과산화수소를 이용하는 구리 함유 in situ 하이드로젤의 제조방법 및 이의 용도에 관한 것이다.

기와 같은 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 페놀기 및 카테콜기 중 적어도 하나 이상이 도입된 고분자 및 구리 화합물로 이루어지며, 상기 고분자의 측쇄에 도입된 페놀 및 카테콜 중 어느 하나 이상과 구리가 배위결합되어 하이드로젤 매트릭스 내에 구리 이온을 포함하며, 상기 고분자의 측쇄에 도입된 페놀 및 카테콜 중 어느 하나 이상이 서로 결합되어 가교된 것을 특징으로 하는 구리 함유 in situ 하이드로젤을 제공한다.

또한, 본 발명은 페놀기를 포함하는 화합물이 치환된 고분자 및 효소를 용해시킨 용해액을 제조하는 단계; 및 상기 용해액에 구리화합물 및 과산화수소를 첨가하여 가교시키는 단계;를 포함하는 구리 함유 in situ 하이드로젤의 제조방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 서술한 구리 함유 in situ 하이드로젤의 제조방법으로 제조된 구리 함유 in situ 하이드로젤을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 서술한 구리 함유 in situ 하이드로젤을 포함하는 항염증 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 서술한 구리 함유 in situ 하이드로젤을 포함하는 조직 재생용 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 서술한 구리 함유 in situ 하이드로젤을 포함하는 혈관신생용 조성물을 제공한다.

본 발명에 따르면, 효소의 촉매 작용 하에서, 고분자는 가교 네트워크의 형성과 Cu 나노입자의 침착을 위해 산화되어 가교된 구리 함유 하이드로젤을 형성하고, 상기 가교된 구리 함유 하이드로젤은 구리 이온을 지속 방출하므로, 거의 3주 동안 내인성 NO 공여체(RSNO)의 존재 하에 NO 생성을 촉진할 수 있다.

이에 따라, Cu 이온과 NO의 시너지 효과로 인해 항염증성 M2 표현형 분극을 조절하고 내피 세포의 이동을 자극하여 구리 함유 in situ 하이드로젤의 시험관 내 생체 활성을 확인할 수 있으며, 구리 함유 하이드로젤은 상처 치유 과정을 촉진할 수 있다.

도 1은 구리를 포함하는 하이드로젤에서 산화질소(NO)가 지속적으로 방출되어 혈관 신생 및 항염 과정을 자극하는 것을 나타내는 개략도이다.
도 2는 호스래디쉬 과산화효소와 티로시나제의 촉매작용을 통해 하이드로젤을 방출하는 산화질소의 형성을 나타내는 개략도이고, GH 폴리머는 카테콜과 페놀 그룹 사이의 다양한 상호작용을 통해 가교된 것을 나타낸다.
도 3은 본 발명의 하이드로젤의 특성을 실험한 결과를 나타낸 것으로, (a)는 바이알 타이틀링 방법(vial tiltling method)에 의해 정의된 겔화 시간을 나타낸 그래프이고, (b)는 레오미터에 의해 평가된 기계적 강도를 나타낸 그래프이고, (c)는 리소자임의 분해율을 나타낸 그래프이고, (d)는 단면을 주사전자현미경(SEM) 촬영 이미지이다.
도 4는 하이드로젤에서 방출된 구리 이온 및 생성된 산화질소의 누적 농도를를 나타낸 것으로, (a)는 PBS에서 배양 후 GH/Cu 하이드로젤에서 방출된 구리 이온의 누적 농도를 나타낸 그래프이고, (b)는 산화질소(NO) 공여자로서 10μM GSH의 존재 하에 GH/Cu 하이드로젤을 배양함으로써 산화질소(NO) 방출의 누적 농도를 나타낸 그래프이다.
도 5는 시험관 내(in vitro) 항염증 특성을 나타낸 것으로, (a)는 DAPI(파란색) 및 CD163(녹색)으로 부착된 대식세포의 면역형광 염색 이미지이고, (b)는 M2 대식세포 대조군과 비교한 CD163의 상대 평균 형광 강도의 정량화를 나타낸 그래프이고, (c)는 ELISA에 의해 대식세포로부터 방출된 TGF-β의 농도를 나타낸 그래프이다.
도 6은 시험관 내(in vitro) 혈관 신생 활성을 나타낸 것으로, (a)는 살아있는(녹색)/죽은(빨간색) 염색된 세포를 주사전자현미경(SEM)으로 촬영한 이미지이고, (b)는 WST-1 분석에 의해 24시간 동안 하이드로젤 샘플과 함께 배양한 후 HUVEC의 생존력을 나타낸 그래프이고, (c)는 이동률을 정량화하여 나타낸 그래프이고, (d)는 상처 스크래치 이동 분석을 사용한 HUVEC의 이동을 보여주는 광학현미경 이미지이다.
도 7은 시험관 내(in vitro) 내피관 형성 분석에 의해 평가된 혈관 신생 활성을 나타낸 것으로, (a)는 세포 네트워크의 형성을 보여주는 광학 현미경 이미지이고, (b) 노드 수, (c) 가지 수 및 (d) 총 가지 길이를 포함한 다양한 매개변수의 정량적 평가를 나타낸 그래프이다.
도 8은 난자내 닭 융모요막 혈관신생(CAM) 분석에 의해 평가된 혈관신생 활성을 나타낸 것으로, (a)는 CAM에서 새로운 혈관 형성의 광학 이미지이고, (b)는 이미지 J에 의한 혈관을 정량화한 그래프이다.
도 9는 하이드로젤의 생체내(in vivo) 피하 주사에 의해 평가된 혈관신생 활성을 나타낸 이미지로, (a)는 헤마톡실린-에오신(H&E) 염색, (b)는 VEGFA 항체(보라색: 핵, 갈색: VEGFA), (c)는 평활근 세포 염색을 위한 α-SMA (보라색: 핵, 갈색: α-SMA) 염색을 사용한 조직학적 분석을 나타낸 이미지이다.

이하, 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위하여 본 발명에 따른 바람직한 실시예를 첨부된 도면을 참조하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 본 발명은 여기서 설명되어지는 실시예에 한정되지 않고 다른 형태로 구체화될 수도 있다.

본 발명에서는 구리(Cu) 이온(NO 생성 촉매)은 내인성 S-니트로소티올의 존재 하에 NO의 제자리 생성을 위해 페놀이 풍부한 젤라틴 기반 하이드로젤(GH/Cu)에포함되었다. 이 때, 티로시나아제와 호스래디쉬(horsradish) 퍼옥시다아제의 촉매 작용 하에서, GH는 가교 네트워크의 형성과 Cu 나노입자의 침착을 위해 산화되고, GH/Cu는 Cu 이온의 지속 방출을 나타내므로 거의 3주 동안 내인성 NO 공여체의 존재 하에 NO 생성을 촉진했다. Cu 이온과 NO의 시너지 효과는 항염증성 M2 표현형 분극을 조절하고 내피 세포의 이동을 자극하여 GH/Cu의 시험관 내 생체 활성을 설명할 수 있다. GH/Cu 하이드로젤은 상처 치유 과정을 촉진하기 위한 유망한 물질로 제시되고 있다.

본 발명의 “GH/Cu 하이드로젤”은 젤라틴-하이드록시페닐 프로피온산(GH) 중합체, 구리 화합물, 호스래디쉬 과산화효소(HRP) 및 과산수소(H₂O₂)를 혼합하여 제조한 하이드로젤을 의미한다.

본 발명의 “혈관신생”은 혈관이 새로 형성되는 과정, 즉 새로운 혈관이 세포, 조직 또는 기관 내로 발생 및 분화하는 것을 의미한다. 본 발명의 혈관신생은 내피세포 활성화, 이동, 증식, 매트릭스 재형성 및 세포 안정화를 비롯한 혈관 형성 과정에 관련된 혈관재생, 혈관회복 및 혈관 분화를 포함한다.

본 발명은 페놀기 및 카테콜기 중 적어도 하나 이상이 도입된 고분자 및 구리 화합물로 이루어지며, 상기 고분자의 측쇄에 도입된 페놀 및 카테콜 중 어느 하나 이상과 구리가 배위결합되어 하이드로젤 매트릭스 내에 구리 이온을 포함하며, 상기 고분자의 측쇄에 도입된 페놀 및 카테콜 중 어느 하나 이상이 서로 결합되어 가교된 것을 특징으로 하는 구리 함유 in situ 하이드로젤을 제공한다.

도 1은 구리 함유 in situ 하이드로젤에서 산화질소(NO)가 지속적으로 방출되어 혈관 신생 및 항염 과정을 자극하는 것을 나타내는 개략도이다.

도 2는 호스래디쉬 과산화효소와 티로시나제의 촉매작용을 통해 하이드로젤을 방출하는 산화질소의 형성을 나타내는 개략도이고, GH 폴리머는 카테콜과 페놀 그룹 사이의 다양한 상호작용을 통해 가교된 것을 나타낸다.

구체적으로, H₂O₂ 존재 하에, 페놀은 효소(호스래디쉬 과산화효소, HRP)에 의해 페놀 라디칼로 산화되어 C-C 또는 C-O 커플링에 의한 방향족 고리(aromatic ring)의 가교를 가능하게 하고, 호기성 환경에서 페놀은 효소(티로시나제)에 의해 카테콜로 산화되어 페놀이 풍부한 젤라틴 중합체 사이의 가교 반응을 위한 활성화된 부분과 구리 이온의 배위결합 및 안정화를 위한 결합 부위를 제공한다. 따라서 여기서는 호스래디쉬 과산화효소(HRP)와 티로시나제에 의한 2가지 효소 촉매 반응이 발생하여 하이드로젤 매트릭스를 형성한다.

상기 구리는 금속-카테콜레이트 배위결합을 통해 하이드로겔 매트릭스에 포함되고 안정화된다. 효소(티로시나제) 촉매 작용으로 형성된 카테콜은 서로 반응하여(수소 결합, π-π 상호작용, 커플링 반응 등) 폴리머 네트워크를 가교할 수 있으며 구리 이온과 금속 배위를 통해 하이드로겔 매트릭스에서 구리를 안정화할 수 있다.

본 발명에 따른 구리 함유 in situ 하이드로젤은 하이드로젤 매트릭스 내에 구리 이온을 포함하여 구리 이온을 지속적으로 방출할 수 있고, 오랜기간(약 3주) 동안 내인성 산화질소 공급원의 존재 하에서 산화질소 생성을 촉진할 수 있다. 구리 이온과 산화질소의 시너지 효과로 인해 항염증성 M2 표현형 분극을 조절할 수 있고, 이에 따라 항염증 특성을 나타낼 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 구리 함유 in situ 하이드로젤을 포함하는 항염증 약학조성물, 조직 재생용 약학조성물 및 혈관신생용 약학조성물을 제공한다.

상기 약학조성물은 약학 조성물의 제조에 통상적으로 사용되는 담체, 부형제 또는 희석제를 추가로 포함할 수 있다.

본 발명의 조성물이 약학 조성물인 경우, 투여를 위하여, 상기 기재한 유효성분 이외에 약학적으로 허용 가능한 담체, 부형제 또는 희석제를 포함할 수 있다. 상기 담체, 부형제 및 희석제로는 락토오스, 덱스트로오스, 수크로오스, 소르비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로오스, 메틸 셀룰로오스, 미정질 셀룰로오스, 폴리비닐피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다.

본 발명의 약학조성물은 각각 통상의 방법에 따라 외용제, 좌제 또는 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용할 수 있다. 상세하게는 제형화할 경우 통상 사용하는 충진제, 중량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제는 멸균된 수용액, 비수성 용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제 및 과제를 포함한다. 비수성 용제 및 현탁제로는 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 오일, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔, 마크로솔, 트윈 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로젤라틴 등이 사용될 수 있다.

본 발명의 약학조성물은 목적하는 방법에 따라 비경구 투여(예를 들어, 정맥 내, 피하, 복강 내 또는 국소에 적용)할 수 있다. 또한 본 발명의 약학적 조성물의 투여량은 대상체의 체중, 연령, 성별, 건강상태, 식이, 투여시간, 투여방법, 배설율 및 질환의 중증도 등에 따라 그 범위가 다양하나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명은 페놀기를 포함하는 화합물이 치환된 고분자 및 효소를 용해시킨 용해액을 제조하는 단계; 및 상기 용해액에 구리화합물 및 과산화수소를 첨가하여 가교시키는 단계;를 포함하는 구리 함유 in situ 하이드로젤의 제조방법을 제공한다.

구체적으로, 상기 가교시키는 단계는 과산화수소(H₂O₂) 존재 하에, 페놀은 효소(호스래디쉬 과산화효소, HRP)에 의해 페놀 라디칼로 산화되어 C-C 또는 C-O 커플링에 의한 방향족 고리(aromatic ring)의 가교를 가능하게 하고, 호기성 환경에서 페놀은 효소(티로시나제)에 의해 카테콜로 산화되어 페놀이 풍부한 젤라틴 중합체 사이의 가교 반응을 위한 활성화된 부분과 구리 이온의 배위결합 및 안정화를 위한 결합 부위를 제공한다. 따라서 여기서는 호스래디쉬 과산화효소(HRP)와 티로시나제에 의한 2가지 효소 촉매 반응이 발생하여 하이드로젤 매트릭스를 형성한다.

또한, 상기 가교시키는 단계에서 상기 구리는 금속-카테콜레이트 배위결합을 통해 하이드로겔 매트릭스에 포함되고 안정화된다. 효소(티로시나제) 촉매 작용으로 형성된 카테콜은 서로 반응하여 수소 결합, π-π 상호작용 및 커플링 반응 중 적어도 하나 이상을 통해 폴리머 네트워크를 가교할 수 있으며, 구리 이온과 금속 배위를 통해 하이드로겔 매트릭스에서 구리를 안정화할 수 있다.

상기 고분자는 젤라틴, 키토산, 헤파린, 셀룰로스, 덱스트란, 덱스트란 설페이트, 콘드로이틴 설페이트, 케라탄 설페이트, 더마탄 설페이트, 알지네이트, 콜라겐, 알부민, 피브로넥틴, 라미닌, 엘라스틴, 비트로넥틴, 히알루론산, 피브리노겐 및 다지-고분자 로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상을 포함하고, 상기 고분자의 측쇄에 페놀기 및 카테콜기 중 어느 하나 이상이 도입될 수 있다.

상기와 같은 고분자를 포함함으로서, 상기 고분자 측쇄에 도입된 페놀기 또는 카테콜기와 구리가 배위결합하여 하이드로젤 매트릭스 내에 구리가 포함될 수 있으며, 상기 페놀기 또는 카테콜기가 서로 결합하여 가교됨으로서 가교 하이드로젤을 형성할 수 있다.

구체적으로, 상기 효소는 호스래디시 퍼록시데이즈(horseradish peroxidase), 글루타치온 퍼록시데이즈(glutathione peroxidase), 할로퍼록시데이즈(haloperoxidase), 미엘로퍼옥시데이즈(myeloperoxidase), 카탈라아제(catalase), 헤모프로틴(hemoprotein), 퍼록사이드(peroxide), 퍼록시레독신(peroxiredoxin), 동물 헴-의존적 퍼록시데이즈(animal heme-dependent peroxidases), 티로이드 퍼록시데이즈(thyroid peroxidase), 바나듐 브로모퍼록시데이즈(vanadiumbromoperoxidase), 락토퍼록시데이즈(lactoperoxidase), 티로시네이즈(tyrosinase), 및 카테콜 옥시데이즈(catechol oxidase)로 이루어진 군에서 선택된 하나 또는 둘 이상을 포함할 수 있다.

상기 페놀기를 포함하는 화합물은 하이드록시페닐프로피오닉산(hydroxyphenyl propionic acid), 4-하이드록시페닐아세트산(4-hydroxyphenyl acetic acid), 티로신(tyrosine), 티라민(tyramine), 테트로닉 티라민(tetronic tyramine) 및 PEG-티라민(PEG-tyramine) 으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상일 수 있다.

상기 카테콜기를 포함하는 화합물은 도파민(Dopamine), 갈산(Gallic acid), 케르세틴(quercetin), 탄닌산(Tannic acid) 및 에피갈로카테킨 갈레이트(Epigallocatechin Gallate, EGCG)으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상인 것을 특징으로 하는 구리 함유 in situ 하이드로젤의 제조방법.

상기 구리 화합물은 황산구리(CuSO₄) 및 염화구리(CuCl₂)로 이루어진 선택된 하나 이상을 포함할 수 있다.

상기 구리 화합물은 10 내지 75 μM, 25 내지 75 μM, 25 내지 50 μM 또는 50 내지 75 μM의 농도로 포함할 수 있다.

상기 효소의 농도는 0.001 내지 0.010 mg/ml 또는 0.001 내지 0.005 mg/ml일 수 있다.

상기 고분자의 농도는 30 내지 100 mg/ml 또는 30 내지 70 mg/ml일 수 있다.

상기 가교시키는 단계는 과산화수소를 0.01 내지 0.1 wt% 또는 0.01 내지 0.05 wt%의 농도로 첨가할 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 제조방법으로 제조된 구리 함유 in situ 하이드로젤을 제공한다.

구체적으로, 상기 구리 함유 in situ 하이드로젤은 고분자의 측쇄에 도입된 페놀 및 카테콜 중 어느 하나 이상과 구리가 배위결합되어 하이드로젤 매트릭스 내에 구리 이온을 포함할 수 있다.

또한, 상기 구리 함유 in situ 하이드로젤은 고분자의 측쇄에 도입된 페놀 및 카테콜 중 어느 하나 이상이 서로 결합되어 가교된 하이드로젤 매트릭스를 형성할 수 있다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 실시예를 들어 상세하게 설명하기로 한다. 다만 하기의 실시예는 본 발명의 내용을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 범위가 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 실시예는 당업계에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 발명을 보다 완전하게 설명하기 위해 제공되는 것이다.

실시예 1

구리 함유 in situ 형성 하이드로겔을 제조하기 위해 GH 고분자(50 mg/ml)를 37 ℃에서 DIW에 완전히 용해시킨다. 그 후, 고분자 용액을 마이크로튜브에서 호스래디쉬 과산화효소(HRP) (0.01 - 0.05 mg/ml) 및 티로시나제(Tyr) (0.25 kU/ml)을 포함하는 두 종류의 효소와 혼합하였다. 다른 마이크로튜브에서 고분자 용액을 H₂O₂ (0.02 wt%)및 CuSO₄(0, 25, 50, 75 μM)와 혼합하였다. 그 후, 두 개의 마이크로튜브에 있는 용액을 혼합하여(부피비 = 1:1) 구리 함유 in situ 하이드로겔을 제조하였다.

실험예 1-겔화 시간 측정

하이드로겔의 겔화 시간은 상기 두 용액의 균일한 혼합 후 마이크로튜브에서 하이르도젤의 상전이 후 흐름이 관찰되지 않는 시점으로 측정하였고, 그 결과를 도 3의 (a)에 나타냈다.

도 3의 (a)를 살펴보면, 겔화 시간을 나타낸 것으로 HRP의 농도가 0.01에서 0.05 mg/mL로 증가함에 따라 겔화 시간은 110초에서 20초로 감소하는 것을 확인할 수 있다.

실험예 2-하이드로젤의 유변학적 분석

하이드로젤의 기계적 강도를 평가하기 위하여 총 300μL의 기계적 강도를 레오미터 (Advanced Rheometer GEM-150-050, Bohlin Instruments, Cranbury, NJ, USA)를 사용하여 측정하였다.

하이드로젤의 분해거동을 평가하기 위하여 콜라겐 분해효소을 함유하는 PBS, 37℃에서 배양하며, 일정 시간마다 배양액을 교체하며 잔여 무게를 측정하였다.

하이드로젤의 형태학적 구조분석을 위하여 형성된 하이드로젤의 동결 건조 후, 단면을 cutting하여 FE-SEM (Field Emission Scanning Electron Microscopy)으로 내부 구조를 관찰하였고, 그 결과를 도 3의 (b) 내지 (d)에 나타냈다.

도 3의 (b) 및 (c)을 살펴보면, 시간에 따른 하이드로젤의 탄성률과 리소자임 존재 하 하이드로젤의 분해율을 나타낸 것으로 구리이온의 함량이 증가함에 따라 탄성률은 감소하고 반면, 분해속도는 빨라지는 것을 확인할 수 있다.

도 3의 (d)를 살펴보면, 하이드로젤의 단면을 촬영한 이미지로 구리이온의 함량이 증가할수록 가교도가 낮아져 기공의 크기가 증가하는 것을 확인할 수 있다.

실험예 3-산화질소의 누적 농도

하이드로겔에서 방출되는 Cu 이온을 측정하기 위해 구리 분석 키트(Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA USA)를 이용하였다. 형성된 하이드로겔을 PBS 용액에 넣어 암실에서 37℃으로 배양하였다. 특성 시간에 따라 상층액을 회수하고 새로운 PBS 용액을 추가하였다. 이후 회수한 샘플을 구리 분석 키트를 이용하여 실온에서 5분 동안 반응하였다. Cu 이온의 표준물질의 흡광도는 359 nm에서 측정되었습니다. Tyr은 구리를 함유하는 효소이기 때문에 하이드로겔 분해 과정 중 Tyr에서 Cu 이온이 방출되면 이 실험의 결과에 영향을 미칠 수 있다. 따라서 본 시험에서는 Tyr 없이 제조된 GH 하이드로겔을 대조 시료로 사용하였다.

하이드로젤의 NO 방출거동을 평가하기 위해 하이드로젤을 NO 공여체 (GSNO 및 GSH)가 포함된 PBS 용액에 넣어 암실에서 37℃으로 배양하고, 일정한 간격으로 NO 공여체 용액을 회수하며 교체하였다. 회수한 용액과 동량의 Griess 용액과 암실에서 15분 동안 반응시켜, 흡광도를 Cytation™ 3 Cell Imaging Multi-Mode Reader (BioTek™, USA)로 540 nm에서 측정하여, 하이드로젤에서 방출되는 NO의 방출거동을 평가하였다. 0 - 1 μM의 NaNO₂로 얻은 검량선을 통해 정량분석을 하였으며, 그 결과는 도 4에 나타냈다.

도 4는 하이드로젤에서 방출된 구리 이온 및 생성된 산화질소의 누적 농도를를 나타낸 것으로, (a)는 PBS에서 배양 후 GH/Cu 하이드로젤에서 방출된 구리 이온의 누적 농도를 나타낸 그래프이고, (b)는 산화질소(NO) 공여자로서 10μM GSH의 존재 하에 GH/Cu 하이드로젤을 배양함으로써 산화질소(NO) 방출의 누적 농도를 나타낸 그래프이다.

도 4를 살펴보면, 하이드로젤에서 방출된 구리 이온 및 생성된 산화질소의 누적농도를 나타낸 것으로, 도 4의 (a)는 구리 함량이 증가할수록 하이드로젤에서 방출되는 구리 이온이 증가하는 것을 확인할 수 있고, (b)는 GSNO와 GSH 존재 하에서 하이드로젤 내의 구리 함량이 증가할수록 산화질소 방출량도 증가하는 것 확인할 수 있다.

실험예 4-항염증 테스트

인간 단핵구 세포 (THP-1)를 RPMI-1640 배지를 이용하여 배양 후, 세포를 모아 12-myristate 13-acetate (PMA)를 포함하는 배지에서 2일 동안 배양한 후, 1일간 PMA 미포함 배지에 배양하여 THP-1을 M0 세포로 분화를 유도하였다. 하이드로젤을 M0 세포층 위에 처리하여 NO 공여체 유무에 따라 배양하였다. 48시간 후, 방출된 NO 함량에 따른 pro-inflammatory M1 및 anti-inflammatory M2 대식세포로의 분화능에 대한 분석을 진행하였다. 세포는 파라포름알데하이드와 Triton X-100 처리 후 marker들의 1차 항체와 배양하였다. (M2 marker: CD163, TGF-ß). IgG-형광 2차 항체와 반응 후 DAPI 염색하여 confocal laser scanning microscope (Zeiss LSM 780, Carl Zeiss, Jena, Germany)을 통해 분화된 anti-inflammatory M2 marker들의 형광 정성 분석을 진행하였다. 분화 유도된 M2 세포를 lysis하여 ELISA로 TGF-ß 및 CD163의 정량 분석을 통해 M2 분극화 정도를 평가하였으며, 그 결과를 도 5에 나타냈다.

(a)는 DAPI(파란색) 및 CD163(녹색)으로 부착된 대식세포의 면역형광 염색 이미지이고, (b)는 M2 대식세포 대조군과 비교한 CD163의 상대 평균 형광 강도의 정량화를 나타낸 그래프이고, (c)는 ELISA에 의해 대식세포로부터 방출된 TGF-β의 농도를 나타낸 그래프이다.

도 5는 시험관 내(in vitro) 항염증 특성을 나타낸 것으로, (a)는 DAPI(파란색) 및 CD163(녹색)으로 부착된 대식세포의 면역형광 염색 이미지이고, (b)는 M2 대식세포 대조군과 비교한 CD163의 상대 평균 형광 강도의 정량화를 나타낸 그래프이고, (c)는 ELISA에 의해 대식세포로부터 방출된 TGF-β의 농도를 나타낸 그래프이다.

도 5의 (a) 및 (b)를 살펴보면, 면역형광 염색 이미지와 CD163의 상대 평균 형광 강도를 정량한 것으로 먼저 대조군에서 볼 때, CD163의 발현이 많은 M2 대식세포에서 M0 대식세포 대비 녹색의 형광이 높음을 알 수 있으며 이를 바탕으로 NO 공여체 존재 하 GH/Cu 하이드로젤을 처리한 실험군에서 처리하지 않은 실험군 대비 확연히 녹색의 발현이 큰 것을 확인할 수 있다. 이는 항염증성의 M2로의 분극화가 이루어졌음을 말해준다.

또한 도 5의 (c)를 살펴보면, 대식세포로부터 방출된 TGF-β의 농도를 나타낸 것으로 GH/Cu를 처리한 실험군에서 M0 대조군 혹은 GH만 처리한 실험군 대비 유의미한 TGF-β의 농도 증가를 보인 것을 확인할 수 있다.

실험예 5-시험관 내 혈관 신생 활성

인간제대혈내피세포인 HUVEC을 EGM-2 배지에서 하이드로젤과 배양 후 세포층의 스크래치 회복, 세포의 tube formation을 통한 방출된 NO 함량에 따른 혈관신생능력을 평가하였다.

방출된 NO 함량에 따른 HUVEC의 성장평가를 WST-1와 live/dead 형광분석을 통해 평가하였다. 추가로, HUVEC을 배양하여 세포층을 형성 후 피펫을 이용해 스크래치를 형성하였다. 하이드로젤을 세포층 위에 두고 새 배지를 첨가하며 NO 공여체를 4시간마다 공급함. 일정 시점에서의 스크래치의 회복 면적의 변화를 측정하여 NO 함량에 따른 혈관내피세포 스크래치의 회복능을 평가하였다.

HUVEC의 혈관신생 모세관 구조 형성 평가를 위해 Corning Matrigel Matrix 용액으로 TCP에 얇은 젤 층을 형성 후 그 위에 HUVEC을 1일간 배양하였다. 이후 하이드로젤을 세포층 위에 두고 매 4시간마다 NO 공여체의 유무에 따라 배양하였다. 12시간 후 HUVEC의 혈관신생 모세관 유사 구조의 형성을 광학 현미경으로 측정하고, 튜브의 길이는 Image J 프로그램으로 계산하여 평가하였으며, 그 결과는 도 6 및 도 7에 나타냈다.

도 6은 시험관 내(in vitro) 혈관 신생 활성을 나타낸 것으로, (a)는 살아있는(녹색)/죽은(빨간색) 염색된 세포를 주사전자현미경(SEM)으로 촬영한 이미지이고, (b)는 WST-1 분석에 의해 24시간 동안 하이드로젤 샘플과 함께 배양한 후 HUVEC의 생존력을 나타낸 그래프이고, (c)는 이동률을 정량화하여 나타낸 그래프이고, (d)는 상처 스크래치 이동 분석을 사용한 HUVEC의 이동을 보여주는 광학현미경 이미지이다.

도 7은 시험관 내(in vitro) 내피관 형성 분석에 의해 평가된 혈관 신생 활성을 나타낸 것으로, (a)는 세포 네트워크의 형성을 보여주는 광학 현미경 이미지이고, (b) 노드 수, (c) 가지 수 및 (d) 총 가지 길이를 포함한 다양한 매개변수의 정량적 평가를 나타낸 그래프이다.

도 6을 살펴보면, GH/Cu를 처리한 실험군에서 NO 공여체 존재 하 HUVEC세포의 증식이 확연히 증가된 것을 확인할 수 있으며 구리 이온의 함량이 증가함에 따라 NO의 생성이 증가하여 결과적으로 HUVEC의 이동이 빨라진 것을 확인할 수 있다.

도 7을 살펴보면, NO 공여체가 없을 때는 VEGF를 처리한 실험군을 제외하고 튜브형태의 세포 정렬이 이루어지지 않은 반면, NO 공여체 존재 하에서는 구리의 함량이 증가함에 따라 확연히 튜브 형태의 세포 정렬이 발생함과 동시에 노드 수, 가지 수 및 총 가지 길이의 유의미한 증가가 발생한 것을 확인할 수 있다.

실험예 6-닭 융모요막에서의 혈관 신생 활성

하이드로젤의 혈관신생 특성은 in ovo 닭 융모요막(Chicken Chorioallantoic Membrane, CAM) assay를 통해 조사되었다. 먼저, 수정란(국내산, 한국)을 37-38°C, 40-60% 습도 및 O2 존재하에 7일(0-7일) 동안 부화시켰다. 그 후, 부화 7일째에 알을 꺼내어 70% 알코올로 소독했다. 그런 다음 달걀 껍질에 약 1 cm x 1 cm의 창을 만들어, 미리 형성된 100 μL의 하이드로겔 샘플을 배아의 CAM에 조심스럽게 배치했다. 창은 추가 배양 동안의 감염을 방지하기 위해 멸균된 파라필름으로 밀봉되었다. 10일째에 초기 조직 반응을 평가하기 위해 CAM-하이드로겔 복합체의 이미지를 디지털 카메라로 촬영했습니다. 하이드로겔 주변의 혈관의 정량분석은 Image J 프로그램을 이용하여 계산되었다. 이 실험에서는 10 ng/mL의 VEGF를 포함하는 GH 하이드로겔을 양성 대조군으로 사용하였으며, 그 결과는 도 8에 나타냈다.

도 8은 난자내 닭 융모요막 혈관신생(CAM) 분석에 의해 평가된 혈관신생 활성을 나타낸 것으로, (a)는 CAM에서 새로운 혈관 형성의 광학 이미지이고, (b)는 이미지 J에 의한 혈관을 정량화한 그래프이다.

도 8을 살펴보면, CAM분석을 통해 VEGF를 처리한 실험군에서 다수의 혈관이신생된 것을 확인할 수 있으며 이와 비교하여 하이드로젤 내의 구리 이온의 함량이 증가할수록 혈관의 신생을 효과적으로 자극하는 것을 확인할 수 있다.

실험예 7-생체 내 혈관 신생 활성

동물모델을 이용한 생체 내 혈관 신생 능력에 대해 평가하기 위해 mouse 모델을 이용하였다. 윤리적으로 승인된 protocol을 따라 mouse 마취 후 하이드로젤의 피하 주입 및 3주 후 하이드로젤을 포함한 피하조직을 회수하여 체내 조직재생에 대한 신생혈관 특성 분석을 하였다. 회수한 조직을 즉시 4% 파라포름알데히드에 하루 동안 고정 후, 파라핀에 넣어 단면화 하였다. 조직 절편은 hematoxylin and eosin (H&E)을 이용한 조직학적 분석과 혈관신생 관련 인자인 anti-αSMA와 VEGFA antibody를 이용한 면역 조직 화학 분석을 시행하였으며, 그 결과는 도 9에 나타냈다.

도 9는 하이드로젤의 생체내(in vivo) 피하 주사에 의해 평가된 혈관신생 활성을 나타낸 이미지로, (a)는 헤마톡실린-에오신(H&E) 염색, (b)는 VEGFA 항체(보라색: 핵, 갈색: VEGFA), (c)는 평활근 세포 염색을 위한 α-SMA (보라색: 핵, 갈색: α-SMA) 염색을 사용한 조직학적 분석을 나타낸 이미지이다.

도 9를 살펴보면, GH하이드로젤을 처리한 실험군에서는 하이드로젤 내부로 세포의 침습이 발생하지 않은 반면, GH/Cu25 하이드로젤을 처리한 실험군에서는 다수의 세포가 하이드로젤 내부로 침습하여 혈관을 형성하는 초기 단계에 있는 것을 확인할 수 있다. 또한 GH/Cu50 및 GH/Cu75 하이드로젤을 처리한 실험군에서는 VEGF를 처리한 심험군과 마찬가지로 다수의 혈관이 세포 가장자리 및 내부에 형성된 것을 것을 확인할 수 있다.

이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 즉, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다.

Claims

페놀기 및 카테콜기 중 적어도 하나 이상이 도입된 고분자 및 구리 화합물로 이루어지며, 상기 고분자의 측쇄에 도입된 페놀 및 카테콜 중 어느 하나 이상과 구리가 배위결합되어 하이드로젤 매트릭스 내에 구리 이온을 포함하며, 상기 고분자의 측쇄에 도입된 페놀 및 카테콜 중 어느 하나 이상이 서로 결합되어 가교된 것을 특징으로 하는 구리 함유 in situ 하이드로젤.
제 1 항에 있어서,
상기 고분자 측쇄에 도입된 페놀을 효소에 의해 페놀 라디칼로 산화되어 C-C 및 C-O 결합 중 어느 하나 이상에 의한 방향족 고리를 연결하여 고분자 네트워크를 가교시킨 것을 특징으로 하는 구리 함유 in situ 하이드로젤.
제 1 항에 있어서,
상기 고분자 측쇄에 도입된 카테콜은 호기성 환경에서 효소에 의해 고분자에 도입된 페놀이 산화된 것이고,
상기 카테콜은 구리 이온과 배위결합을 통해 하이드로젤 매트릭스에서 구리를 안정화하는 것을 특징으로 하는 구리 함유 in situ 하이드로젤.
제 1 항에 따른 구리 함유 in situ 하이드로젤을 포함하는 항염증 약학조성물.
제 1 항에 따른 구리 함유 in situ 하이드로젤을 포함하는 조직 재생용 약학조성물.
제 1 항에 따른 구리 함유 in situ 하이드로젤을 포함하는 혈관 신생용 약학조성물.
페놀기를 포함하는 화합물이 치환된 고분자 및 효소를 용해시킨 용해액을 제조하는 단계; 및
상기 용해액에 구리화합물 및 과산화수소를 첨가하여 가교시키는 단계;를 포함하는 구리 함유 in situ 하이드로젤의 제조방법.
제 7 항에 있어서,
상기 가교시키는 단계는 구리가 금속-카테콜레이트 배위결합을 통해 하이드로겔 매트릭스에 포함되고 안정화되는 것을 특징으로 하는 구리 함유 in situ 하이드로젤의 제조방법.
제 7 항에 있어서,
상기 가교시키는 단계는 효소의 촉매 작용으로 형성된 카테콜은 서로 반응하여 고분자 네트워크를 가교시키는 것을 특징으로 하는 구리 함유 in situ 하이드로젤의 제조방법.
제 7 항에 있어서,
상기 가교시키는 단계는 효소의 촉매 작용으로 페놀이 페놀 라디칼로 산화되어 C-C 및 C-O 결합 중 어느 하나 이상에 의한 방향족 고리를 가교시켜 고분자 네트워크를 가교시키는 것을 특징으로 하는 구리 함유 in situ 하이드로젤의 제조방법.
제 7 항에 있어서,
상기 고분자는 젤라틴, 키토산, 헤파린, 셀룰로스, 덱스트란, 덱스트란 설페이트, 콘드로이틴 설페이트, 케라탄 설페이트, 더마탄 설페이트, 알지네이트, 콜라겐, 알부민, 피브로넥틴, 라미닌, 엘라스틴, 비트로넥틴, 히알루론산, 피브리노겐 및 다지-고분자 로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상을 포함하는 구리 함유 in situ 하이드로젤의 제조방법.
제 7 항에 있어서,
상기 효소는 호스래디시 퍼록시데이즈(horseradish peroxidase), 글루타치온 퍼록시데이즈(glutathione peroxidase), 할로퍼록시데이즈(haloperoxidase), 미엘로퍼옥시데이즈(myeloperoxidase), 카탈라아제(catalase), 헤모프로틴(hemoprotein), 퍼록사이드(peroxide), 퍼록시레독신(peroxiredoxin), 동물 헴-의존적 퍼록시데이즈(animal heme-dependent peroxidases), 티로이드 퍼록시데이즈(thyroid peroxidase), 바나듐 브로모퍼록시데이즈(vanadiumbromoperoxidase), 락토퍼록시데이즈(lactoperoxidase), 티로시네이즈(tyrosinase), 및 카테콜 옥시데이즈(catechol oxidase)로 이루어진 군에서 선택된 하나 또는 둘 이상을 포함하는 구리 함유 in situ 하이드로젤의 제조방법.
제 7 항에 있어서,
상기 구리 화합물은 황산구리(CuSO₄) 및 염화구리(CuCl₂)로 이루어진 선택된 하나 이상을 포함하는 구리 함유 in situ 하이드로젤의 제조방법.
제 7 항에 있어서,
상기 구리 화합물은 10 내지 75 μM의 농도로 포함하는 것을 특징으로 하는 구리 함유 in situ 하이드로젤의 제조방법.
제 7 항에 있어서,
상기 고분자의 농도는 30 내지 100 mg/ml인 것을 특징으로 하는 구리 함유 in situ 하이드로젤의 제조방법.
제 7 항에 있어서,
상기 페놀기를 포함하는 화합물은 하이드록시페닐프로피오닉산(hydroxyphenyl propionic acid), 4-하이드록시페닐아세트산(4-hydroxyphenyl acetic acid), 티로신(tyrosine), 티라민(tyramine), 테트로닉 티라민(tetronic tyramine) 및 PEG-티라민(PEG-tyramine) 으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상인 것을 특징으로 하는 구리 함유 in situ 하이드로젤의 제조방법.
제 7 항에 있어서,
상기 가교시키는 단계는 과산화수소를 0.01 내지 0.05 wt%의 농도로 첨가하는 것을 특징으로 하는 구리 함유 in situ 하이드로젤의 제조방법.