CZ308598B6 - Sada pro přípravu hydrogelu na bázi hydroxyfenylového derivátu hyaluronanu, způsob přípravy hydrogelu a jeho použití - Google Patents

Sada pro přípravu hydrogelu na bázi hydroxyfenylového derivátu hyaluronanu, způsob přípravy hydrogelu a jeho použití Download PDF

Info

Publication number
CZ308598B6
CZ308598B6 CZ2019-360A CZ2019360A CZ308598B6 CZ 308598 B6 CZ308598 B6 CZ 308598B6 CZ 2019360 A CZ2019360 A CZ 2019360A CZ 308598 B6 CZ308598 B6 CZ 308598B6
Authority
CZ
Czechia
Prior art keywords
solution
mol
hydrogel
hyaluronan
concentration
Prior art date
Application number
CZ2019-360A
Other languages
English (en)
Other versions
CZ2019360A3 (cs
Inventor
Martin Pravda
Lenka Kovářová
Ivana Ščigalková
Julie Bystroňová
Evgeniy Toropitsyn
Vladimír Velebný
Original Assignee
Contipro A.S.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Contipro A.S. filed Critical Contipro A.S.
Priority to CZ2019-360A priority Critical patent/CZ2019360A3/cs
Priority to US17/618,322 priority patent/US20220378976A1/en
Priority to BR112021024988A priority patent/BR112021024988A2/pt
Priority to EP20751469.6A priority patent/EP3980029B1/en
Priority to JP2021572952A priority patent/JP2022536134A/ja
Priority to PCT/CZ2020/050043 priority patent/WO2020249143A1/en
Priority to KR1020227000656A priority patent/KR20220019775A/ko
Priority to ES20751469T priority patent/ES2963651T3/es
Publication of CZ308598B6 publication Critical patent/CZ308598B6/cs
Publication of CZ2019360A3 publication Critical patent/CZ2019360A3/cs

Links

Classifications

    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61KPREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/715Polysaccharides, i.e. having more than five saccharide radicals attached to each other by glycosidic linkages; Derivatives thereof, e.g. ethers, esters
    • A61K31/726Glycosaminoglycans, i.e. mucopolysaccharides
    • A61K31/728Hyaluronic acid
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61LMETHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L27/00Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
    • A61L27/14Macromolecular materials
    • A61L27/20Polysaccharides
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61KPREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/12Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
    • A61K35/33Fibroblasts
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61KPREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/06Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite
    • A61K47/08Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite containing oxygen, e.g. ethers, acetals, ketones, quinones, aldehydes, peroxides
    • A61K47/12Carboxylic acids; Salts or anhydrides thereof
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61KPREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/30Macromolecular organic or inorganic compounds, e.g. inorganic polyphosphates
    • A61K47/36Polysaccharides; Derivatives thereof, e.g. gums, starch, alginate, dextrin, hyaluronic acid, chitosan, inulin, agar or pectin
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61KPREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K8/00Cosmetics or similar toiletry preparations
    • A61K8/02Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by special physical form
    • A61K8/04Dispersions; Emulsions
    • A61K8/042Gels
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61KPREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K8/00Cosmetics or similar toiletry preparations
    • A61K8/18Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition
    • A61K8/72Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition containing organic macromolecular compounds
    • A61K8/73Polysaccharides
    • A61K8/735Mucopolysaccharides, e.g. hyaluronic acid; Derivatives thereof
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61KPREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/06Ointments; Bases therefor; Other semi-solid forms, e.g. creams, sticks, gels
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61LMETHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L15/00Chemical aspects of, or use of materials for, bandages, dressings or absorbent pads
    • A61L15/16Bandages, dressings or absorbent pads for physiological fluids such as urine or blood, e.g. sanitary towels, tampons
    • A61L15/22Bandages, dressings or absorbent pads for physiological fluids such as urine or blood, e.g. sanitary towels, tampons containing macromolecular materials
    • A61L15/28Polysaccharides or their derivatives
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61LMETHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L27/00Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
    • A61L27/14Macromolecular materials
    • A61L27/22Polypeptides or derivatives thereof, e.g. degradation products
    • A61L27/225Fibrin; Fibrinogen
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61LMETHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L27/00Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
    • A61L27/36Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix
    • A61L27/3604Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix characterised by the human or animal origin of the biological material, e.g. hair, fascia, fish scales, silk, shellac, pericardium, pleura, renal tissue, amniotic membrane, parenchymal tissue, fetal tissue, muscle tissue, fat tissue, enamel
    • A61L27/3616Blood, e.g. platelet-rich plasma
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61LMETHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L27/00Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
    • A61L27/40Composite materials, i.e. containing one material dispersed in a matrix of the same or different material
    • A61L27/44Composite materials, i.e. containing one material dispersed in a matrix of the same or different material having a macromolecular matrix
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61LMETHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L27/00Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
    • A61L27/50Materials characterised by their function or physical properties, e.g. injectable or lubricating compositions, shape-memory materials, surface modified materials
    • A61L27/52Hydrogels or hydrocolloids
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C07ORGANIC CHEMISTRY
    • C07KPEPTIDES
    • C07K14/00Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/745Blood coagulation or fibrinolysis factors
    • C07K14/75Fibrinogen
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C08ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08BPOLYSACCHARIDES; DERIVATIVES THEREOF
    • C08B37/00Preparation of polysaccharides not provided for in groups C08B1/00 - C08B35/00; Derivatives thereof
    • C08B37/006Heteroglycans, i.e. polysaccharides having more than one sugar residue in the main chain in either alternating or less regular sequence; Gellans; Succinoglycans; Arabinogalactans; Tragacanth or gum tragacanth or traganth from Astragalus; Gum Karaya from Sterculia urens; Gum Ghatti from Anogeissus latifolia; Derivatives thereof
    • C08B37/0063Glycosaminoglycans or mucopolysaccharides, e.g. keratan sulfate; Derivatives thereof, e.g. fucoidan
    • C08B37/0072Hyaluronic acid, i.e. HA or hyaluronan; Derivatives thereof, e.g. crosslinked hyaluronic acid (hylan) or hyaluronates
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C08ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08JWORKING-UP; GENERAL PROCESSES OF COMPOUNDING; AFTER-TREATMENT NOT COVERED BY SUBCLASSES C08B, C08C, C08F, C08G or C08H
    • C08J3/00Processes of treating or compounding macromolecular substances
    • C08J3/02Making solutions, dispersions, lattices or gels by other methods than by solution, emulsion or suspension polymerisation techniques
    • C08J3/03Making solutions, dispersions, lattices or gels by other methods than by solution, emulsion or suspension polymerisation techniques in aqueous media
    • C08J3/075Macromolecular gels
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C08ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08JWORKING-UP; GENERAL PROCESSES OF COMPOUNDING; AFTER-TREATMENT NOT COVERED BY SUBCLASSES C08B, C08C, C08F, C08G or C08H
    • C08J3/00Processes of treating or compounding macromolecular substances
    • C08J3/24Crosslinking, e.g. vulcanising, of macromolecules
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C08ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08LCOMPOSITIONS OF MACROMOLECULAR COMPOUNDS
    • C08L5/00Compositions of polysaccharides or of their derivatives not provided for in groups C08L1/00 or C08L3/00
    • C08L5/08Chitin; Chondroitin sulfate; Hyaluronic acid; Derivatives thereof
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61LMETHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L2300/00Biologically active materials used in bandages, wound dressings, absorbent pads or medical devices
    • A61L2300/40Biologically active materials used in bandages, wound dressings, absorbent pads or medical devices characterised by a specific therapeutic activity or mode of action
    • A61L2300/42Anti-thrombotic agents, anticoagulants, anti-platelet agents
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61LMETHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L2430/00Materials or treatment for tissue regeneration
    • A61L2430/02Materials or treatment for tissue regeneration for reconstruction of bones; weight-bearing implants
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61LMETHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L2430/00Materials or treatment for tissue regeneration
    • A61L2430/06Materials or treatment for tissue regeneration for cartilage reconstruction, e.g. meniscus
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C08ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08JWORKING-UP; GENERAL PROCESSES OF COMPOUNDING; AFTER-TREATMENT NOT COVERED BY SUBCLASSES C08B, C08C, C08F, C08G or C08H
    • C08J2305/00Characterised by the use of polysaccharides or of their derivatives not provided for in groups C08J2301/00 or C08J2303/00
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C08ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08JWORKING-UP; GENERAL PROCESSES OF COMPOUNDING; AFTER-TREATMENT NOT COVERED BY SUBCLASSES C08B, C08C, C08F, C08G or C08H
    • C08J2305/00Characterised by the use of polysaccharides or of their derivatives not provided for in groups C08J2301/00 or C08J2303/00
    • C08J2305/08Chitin; Chondroitin sulfate; Hyaluronic acid; Derivatives thereof

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Polymers & Plastics (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Transplantation (AREA)
  • Dispersion Chemistry (AREA)
  • Oral & Maxillofacial Surgery (AREA)
  • Materials Engineering (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Inorganic Chemistry (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Birds (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Developmental Biology & Embryology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Composite Materials (AREA)
  • Oil, Petroleum & Natural Gas (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)

Abstract

Sada pro přípravu hydrogelu, který zahrnuje dva oddělené roztoky A a B, z nichž roztok A obsahuje enzym křenovou peroxidázu a roztok B obsahuje peroxid vodíku, přičemž alespoň jeden roztok A nebo B obsahuje vápenaté ionty ve formě farmaceuticky přijatelné soli a dále roztok A a/nebo B obsahuje hydroxyfenylový derivát hyaluronanu obecného vzorce I , kde n je v rozmezí 2 až 7500 a kde R je OH nebo substituent NHR2CONHR1ArOH obecného vzorce II, kde Ar je fenylen a R1 ethylen, nebo Ar je indolyden a R1 je ethylen, nebo Ar je hydroxyfenylen a R1 je karboxyethylen, a R2 je alkylen o počtu uhlíků 3 až 7. Vynález se dále týká hydrogelu na bázi hydroxyfenylového derivátu hyaluronanu

Description

Sada pro přípravu hydrogelu na bázi hydroxyfenylového derivátu hyaluronanu, způsob přípravy hydrogelu a jeho použití
Oblast techniky
Vynález se týká sady pro přípravu hydrogelů na bázi hydroxyfenylového derivátu hyaluronanu (HATA) s obsahem krve nebo transfuzních přípravků s obsahem fibrinogenu, které mohou sloužit jako biomateriály využitelné v oblasti tkáňového inženýrství, regenerativní medicíny a dalších medicínských oborech. Vynález se dále týká hydrogelu na bázi hydroxyfenylového derivátu hyaluronanu a způsobu jeho přípravy a jeho použití.
Dosavadní stav techniky
Polymemí hydrogely jsou důležitou skupinou materiálů, které slouží pro vývoj léčebných prostředků v oblasti tkáňového inženýrství a regenerativní medicíny. Polymemí hydrogely jsou v těchto oblastech využívány například jako matrice pro řízené uvolňování biologicky aktivních látek a kultivaci buněk, mohou sloužit k augmentaci měkkých tkání, jako dočasná náhrada mezibuněčné hmoty atd.
Z fyzikálně chemického hlediska je polymemí hydrogel disperzní systém složený z disperzního prostředí - vody a disperzního podílu, který je tvořen trojrozměrnou makromolekulám! sítí. Tato síť vytváří souvislou strukturu, která prostupuje celým disperzním prostředím. Spojitéje tedy nejen disperzní prostředí, ale i disperzní podíl. Hydrogely jsou materiály s elastickými vlastnostmi, které jsou důsledkem přítomnosti této spojité trojrozměrné makromolekulámí sítě.
Podle povahy interakcí podílejících se na vzniku polymemí sítě můžeme gely rozdělit na fýzikálně síťované a chemicky síťované (kovalentní gely) [1]. Polymemí síť kovalentních hydrogelů může vznikat např. polymerací monomerů přítomných v roztoku nebo zesítěním původně lineárních řetězců prekurzorových polymerů. K tomu může dojít například vzájemnou reakcí vhodných funkčních skupin polymemích řetězců, nebo pomocí síťovacích činidel obsahujících dvě nebo více funkčních skupin schopných reagovat s výchozím polymerem. Během síťování postupně narůstá velikost polymemí sítě až do okamžiku, kdy prostoupí celý objem disperzní soustavy. Vznik této nekonečné trojrozměrně sítě se označuje jako bod gelace. Nárůst počtu uzlových bodů sítě a počtu zúčastněních polymemích řetězců se ovšem v tomto bodě nemusí zastavit. Hmotnost gelového podílu může i nadále růst na úkor hmotnosti disperzního prostředí. Další průběh síťovací reakce pak vede ke zvýšení hustoty zesítění hydrogelu, která může ovlivňovat např. stabilitu, mechanické vlastnosti a difusní parametry prostředí hydrogelu.
V řadě medicínských aplikací je výhodné, aby ke vzniku polymemí sítě a zformování hydrogelu došlo přímo v místě určeném pro aplikaci materiálu neboli in situ [2, 3], Vznik hydrogelu může být vyvolán specifickými podmínkami (teplota, pH) nebo působením externích podnětů (fyzikálních - UV záření, chemických - iniciátor reakce, přídavek síťovacího činidla apod.).
Vhodná metoda využitelná pro přípravu gelu in situ musí splňovat řadu parametrů:
• proces musí probíhat za fýziologických podmínek • kinetika vzniku gelu a jeho finální vlastnosti (hustota zesítění, mechanické vlastnosti, bobtnavost, difúze látek matricí gelu) musí být dokonale kontrolovatelné a reprodukovatelné • reaktanty ani produkty reakce nesmí působit toxicky • v případě biodegradabilních hydrogelů nesmí být degradační produkty toxické a musí být schopny podstoupit eliminaci z organismu.
Hyaluronan je polysacharid ze skupiny glykosaminoglykanů, který se skládá z disacharidických
- 1 CZ 308598 B6 jednotek složených z D-glukuronové kyseliny a JV-acetylglukosaminu. Jedná se o polysacharid, který je snadno rozpustný ve vodném prostředí, kde v závislosti na molekulové hmotnosti a koncentraci vytváří viskózní roztoky až viskoelastické hydrogely. Hyaluronan je přirozenou složkou mezibuněčné hmoty tkání. Vazbou na specifické povrchové buněčné receptory je molekula hyaluronanu schopna interagovat s buňkami ve svém okolí a regulovat jejich metabolické procesy [4], Hydrogely na bázi hyaluronanu v organismu podstupují přirozenou degradaci působením specifických enzymů (hyaluronidáz), popř. působením reaktivních forem kyslíku, díky čemuž dochází po jejich implantaci do organismu k jejich postupnému vstřebání [5], Pro dosažení mechanicky odolnějších materiálů a z důvodu zpomalení jejich biodegradace byla vyvinuta řada typů hydrogelů na bázi kovalentně zesítěného hyaluronanu. Takové hydrogely jsou často využívány jako materiály pro viskosuplementaci synoviální tekutiny, augmentaci měkkých tkání, podpůrné struktury pro kultivaci a implantaci buněk apod. [6-9],
V minulosti byly rovněž vyvinuty různé typy derivátů hyaluronanu, které jsou schopny podstupovat přechod sol-gel za fýziologických podmínek in situ [10, 11], Pro tyto účely lze využít např. fenolické deriváty hyaluronanu. Calabro et al. [12-14] popisují ve spisech EP 1587945B1 a EP 1773943B1 postup přípravy fenolických derivátů hyaluronanu reakcí karboxylů přítomných ve struktuře D-glukuronové kyseliny hyaluronanu, s aminoalkyl-deriváty fenolu, např. tyraminem. Produktem této reakce jsou amidy hyaluronanu [15],
Zesítění fenolických derivátů hyaluronanu může být iniciováno přídavkem peroxidázy (např. křenové peroxidázy) a zředěného roztoku peroxidu vodíku. Křenová peroxidáza (Horseradish peroxidase, HRP, E.C. 1.11.1.7) je v současné době široce využívána jako katalyzátor organických a biotransformačních reakcí [16-20], Hydrogely na bázi hydroxyfenylových derivátů hyaluronanu mohou být využívány jako injekčně aplikovatelné matrice pro řízené uvolňování látek nebo jako materiály vhodné pro kultivaci a implantaci buněk [21], Wolfová et al. popisují ve spisu CZ 303879 konjugát hyaluronanu a tyraminu obsahující alifatický linker vložený mezi řetězec polymeru a tyramin. Přítomnost alifatického linkeru umožňuje vyšší efektivitu síťovací reakce a dodává síti vyšší elasticitu.
Kurisawa etal. v dokumentu US 8853162 popisují způsob přípravy hydrogelu obsahující vzájemně se prostupující (interpenetrující) sítě na bázi hydroxyfenylového derivátu hyaluronanu a fibrinu. Pro zesítění hydroxyfenylového derivátu hyaluronanu metoda využívá reakci katalyzovanou křenovou peroxidázou. Fibrinová síť vzniká z fibrinogenu působením trombinu. Tento postup poskytuje hydrogely, které jsou ve srovnání s hydrogelem na bázi samotného fibrinu odolnější vůči biodegradačním pochodům. Hydrogely vzniklé kombinací fibrinové sítě a kovalentně zesítěných derivátů hyaluronanu jsou využívány jako matrice pro kultivaci buněk a v budoucnu se mohou uplatnit, např. jako součást léčivých přípravků určených pro tkáňové inženýrství [22, 23], Nevýhodou tohoto řešení je využití krevních derivátů - trombinu a fibrinogenu - získaných zpracováním homologní krve. Tento proces je jednak nákladný a rovněž zcela neeliminuje nebezpečí přenosu infekčních chorob.
Zesítění hydrogelu je zprostředkováno reakcí katalyzovanou křenovou peroxidázou, která vede k oxidaci hydroxyfenylových jader tyraminu za vzniku jejich dimerů, popř. oligomerů. Peroxid vodíku je zdrojem hydroxylových radikálů pro reakce katalyzované křenovou peroxidázou a slouží tedy jako iniciátor síťovací reakce. V prostředí krevní plazmy či krve podléhá peroxid vodíku degradaci vlivem interakce s dalšími enzymy (např. kataláza, myeoloperoxidáza) [24, 25], popř. s hematinem přítomným v hemoglobinu [26], Jedná se o reakce, které konkurují křenovou peroxidázou zprostředkované síťovací reakci, což vede ke snížení účinnosti zesítění hydrogelu. Tento jev se v případě využití krevní plazmy projeví delším časem gelace a nižším elastickým modulem vzniklého hydrogelu. V případě přípravy hydrogelu s obsahem plné krve pak tento jev může vést až k selhání procesu formování hydrogelu.
Krev a z ní připravované transfiizní přípravky jsou v oblasti regenerativní medicíny využívány jako zdroje řady biologicky aktivních látek, které se podílejí na hojení tkáňových defektů, regulaci
- 2 CZ 308598 B6 zánětlivé reakce, diferenciaci progenitorových buněk apod. [27, 28],
Možnost využití kombinace in sítu síťujícího hydrogelu a krve jako materiálu pro podporu hojení tkáňových defektů jez klinického pohledu výhodná, protože nevyžaduje přípravu transfuzního přípravku ani výrobu krevního derivátu. Možnost využití autologní krve zároveň eliminuje riziko přenosu infekčních chorob. Kombinace krve a in situ gelujícího hydrogelu pro podporu hojení tkáňových defektů popisuje např. spis EP 1294414 [29], který využívá směsi krve a chitosanglycerol fosfátu pro výplně tkáňových defektů. Roztoky chitosan-glycerolfosfátu jsou známé pro svou schopnost podstupovat přechod sol-gel při zvýšení teploty roztoku na 37 °C [30, 31], Využití tohoto systému vede k urychlení tvorby krevní sraženiny a ke zrychlení uzavření defektu. Přesto, že je tento proces rychlejší než přirozený vznik krevní sraženiny, v klinické praxi si vyžaduje dočasné přerušení zákroku, které se typicky pohybuje okolo 15 minut [32], a které je nutné k tomu, aby gel dosáhl vhodných mechanických vlastností [29].
Lee et al. [33] popisují využití hydroxyfenylového derivátu želatiny pro přípravu hydrogelů s obsahem frakce krevní plazmy bohaté na krevní destičky, který sloužil jako scaffold pro kultivaci králičích chondrocytů. Implantace tohoto scaffoldu do modelového osteochondrálního defektu vedla k urychlení hojení daného poškození chrupavky. Popsaný systém však nebyl použit k přípravě hydrogelů s obsahem krve.
Podstata vynálezu
Cílem vynálezu je vyvinout prostředek, který umožňuje účinnou přípravu hydrogelu.
Prostředek pro použití k přípravě hydrogelu, jehož podstatou je, že zahrnuje dva oddělené roztoky A a B, z nichž roztok A obsahuje enzym křenovou peroxidázu a roztok B obsahuje peroxid vodíku, přičemž alespoň jeden roztok A nebo B obsahuje vápenaté ionty ve formě farmaceuticky přijatelné soli a dále roztok A a/nebo B obsahuje hydroxyfenylový derivát hyaluronanu obecného vzorce I
(I), kde n je v rozmezí 2 až 7500 a kde Rje OH nebo substituent NHR2C0NHRiAr0H obecného vzorce II,
...A;' '’Rý' (Π) kde Ar je feny len a Ri ethylen, nebo Ar je indoly den a Ri je ethylen, nebo Ar je hydroxyfenyl a Ri je karboxy ethylen, a R2 je alky len o počtu uhlíků 3 až 7.
- 3 CZ 308598 B6
V prostředku podle jednoho provedení vynálezu roztok A obsahuje enzym křenovou peroxidázu o aktivitě 0,5 až 2,25 U/ml, s výhodou 1,8 až 2,2 U/ml, výhodněji 1,0 až 1,3 U/ml a roztok B obsahuje peroxid vodíku 2 až 10mmol/l, s výhodou 3 až 7 mmol/1, výhodněji 4 až 5 mmol/1, přičemž alespoň jeden roztok A nebo B obsahuje vápenaté ionty v koncentraci 0,05 až 0,55 mol/1, s výhodou 0,25 až 0,55 mol/1, výhodněji 0,25 až 0,45 mol/1, nejlépe 0,25 až 0,32 mol/1 a hydroxyfenylový derivát hyaluronanu obecného vzorce I o koncentraci 10 až 125 mg/ml, s výhodou 10 až 35 mg/ml, výhodněji 20 až 26 mg/ml.
Prostředek podle vynálezu zahrnuje dva vodné roztoky A a B, z nichž jeden obsahuje křenovou peroxidázu (roztok A) a druhý peroxid vodíku (roztok B), přičemž alespoň jeden z roztoků obsahuje hydroxyfenylový derivát hyaluronanu obecného vzorce I, a zároveň alespoň jeden z roztoků obsahuje vápenaté ionty ve formě farmaceuticky přijatelných a ve vodě dobře rozpustných solí. Farmaceuticky přijatelné vápenaté soli jsou vybrány ze skupiny obsahující chlorid vápenatý, mléčnan vápenatý, octan vápenatý, glukonát vápenatý, hydrogenuhličitan vápenatý nebo dihydrogenfosforečnan vápenatý, s výhodou ze skupiny obsahující chlorid vápenatý, hydrogenuhličitan vápenatý, mléčnan vápenatý, octan vápenatý, hydrogenfosforečnan vápenatý.
Hydroxyfenylový derivát hyaluronanu obecného vzorce I lze připravit podle postupů uvedených v CZ 303879, kterýje zde zahrnut tímto odkazem.
Polysacharidy, včetně hyaluronanu a z něj připravovaných derivátů, patří mezi polymery tvořené směsí různě dlouhých makromolekul a tvoří tak neuniformní (polydisperzní) systémy. Molámí hmotnost takových polymerů může být vyjádřena jako početně střední molámí hmotnost (Mn) nebo hmotnostně střední molámí hmotnost (Mw). Poměr těchto dvou typů středních molámích hmotností řetězců polymerů (Mw/Mn) vyjadřuje mim neunimorfity (polydisperzity) vzorku polymeru a je označován jako index polydisperzity (PI). Podle dalšího provedení vynálezu je Mw hydroxyfenylového derivátu hyaluronanu podle obecného vzorce I je v rozsahu 4 xlO4 až 3 x 106 g/mol, s výhodou 1 xlO5 až 1 x 106 g/mol, výhodněji 2 xlO5 až 4 x 105 g/mol. PI j e v rozsahu 1 až 3.
Podle dalšího provedení vynálezu je stupeň substituce (DS) hydroxyfenylového derivátu hyaluronanu obecného vzorce I v rozsahu 1 až 10 %, s výhodou 2 až 5 %, výhodněji 2 až 4 %.
Roztoky A, B nebo prekurzorový roztok A jsou vodné roztoky, s výhodou 0,9% vodné roztoky chloridu sodného, tedy roztoky isotonické. tj. se stejnou osmolaritou (308 mOsmol) jako má krevní plazma.
Roztok A popisovaného prostředku slouží k přípravě prekurzorového roztoku hydrogelu, kdy je roztok A prostředku smísen s krví nebo transfuzním přípravkem s obsahem fibrinogenu za vzniku pA. Smísením roztoků pA a B podle tohoto vynálezu v objemovém poměm 1 : 1 dochází ke vzniku gelotvomé směsi, která po zesítění hydroxyfenylového derivátu hyaluronanu poskytuje hydrogel obsahující krev nebo transfuzní přípravek s obsahem fibrinu. Prostředek a způsob přípravy hydrogelů popisovaný v tomto dokumentu umožňuje přípravu hydrogelů, ve kterých krev nebo transfuzní přípravek s obsahem fibrinu tvoří 1 až 30% obj. z celkového objemu finálního hydrogelu.
Podle ještě dalšího provedení vynálezu prostředek zahrnuje roztoky A a B, kde roztok A obsahuje:
• hydroxyfenylový derivát hyaluronanu dle obecného vzorce I o hmotnostně střední molámí hmotnosti v rozmezí 4 x 104 g/mol až 3 x 106 g/mol (a s indexem polydisperzity 1 až 3), ve kterém je DS v rozsahu 1 až 10 %, přičemž je v koncentraci 0 až 125 mg/ml, s výhodou 10 až 125 mg/ml • křenovou peroxidázu o aktivitě 0,5 až 2,25 U/ml • vápenaté ionty v koncentraci 0,05 až 0,55 mol/1
- 4 CZ 308598 B6 a roztok B obsahuje:
• hydroxyfenylový derivát hyaluronanu obecného vzorce I o hmotnostně střední molámí hmotnosti v rozmezí 4 x 104 g/mol až 3 x 106 g/mol (a s indexem polydisperzity 1 až 3), ve kterém je DS v rozsahu 1 až 10 %, přičemž je v koncentraci 10 až 50 mg/ml • peroxid vodíku v rozmezí koncentrace 2 až 10 mmol/1.
Podle dalšího výhodného provedení vynálezu prostředek zahrnuje roztoky A a B, kdy roztok A obsahuje:
• hydroxyfenylový derivát hyaluronanu obecného vzorce I o hmotnostně střední molámí hmotnosti v rozmezí 1 x 105 g/mol až 1 x 106 g/mol (a s indexem polydisperzity 1 až 3), ve kterém DS v rozsahu 2 až 5 %, přičemž je v koncentraci 0 až 35 mg/ml, s výhodou 10 až 35 mg/ml, • křenovou peroxidázu o aktivitě 0,5 až 2,25 U/ml • vápenaté ionty v koncentraci 0,05 až 0,55 mol/1 a roztok B obsahuje:
• hydroxyfenylový derivát hyaluronanu obecného vzorce I o hmotnostně střední molámí hmotnosti v rozmezí 1 x 105 g/mol až 1 x 106 g/mol (a s indexem polydisperzity 1 až 3), ve kterém je DS v rozsahu 2 až 5 %, přičemž je v koncentraci 26 mg/ml • peroxid vodíku v rozmezí koncentrace 3 až 7 mmol/1.
Podle dalšího výhodného provedení vynálezu prostředek zahrnuje roztoky A a B, kdy roztok A obsahuje:
• křenovou peroxidázu o aktivitě 1,8 až 2,2 U/ml • vápenaté ionty v koncentraci 0,45 až 0,55 mol/1 a roztok B obsahuje:
• hydroxyfenylový derivát hyaluronanu obecného vzorce I o hmotnostně střední molámí hmotnosti v rozmezí 2 x 105 g/mol až 4 x 105 g/mol (a s indexem polydisperzity 1 až 3), ve kterém je DS v rozsahu 2 až 4 %, přičemž je v koncentraci 26 mg/ml • peroxid vodíku v rozmezí koncentrace 4 až 5 mmol/1.
Podle dalšího výhodného provedení vynálezu prostředek zahrnuje roztoky A a B, kdy roztok A obsahuje:
• hydroxyfenylový derivát hyaluronanu obecného vzorce I o hmotnostně střední molámí hmotnosti v rozmezí 2 x 105 g/mol až 4 x 105 g/mol (a s indexem polydisperzity 1 až 3), ve kterém DS je v rozsahu výhodněji 2 až 4 %, přičemž je v koncentraci 20 mg/ml • křenovou peroxidázu o aktivitě 1,0 až 1,3 U/ml • vápenaté ionty v koncentraci 0,25 až 0,32 mol/1 a roztok B obsahuje:
• hydroxyfenylový derivát hyaluronanu dle obecného vzorce I o hmotnostně střední molámí hmotnosti v rozmezí 2 x 105 g/mol až 4 x 105 g/mol a s indexem polydisperzity 1 až 3, ve kterém DS je v rozsahu 2 až 4 %, přičemž je, v koncentraci 26 mg/ml • peroxid vodíku v rozmezí koncentrace 4 až 5 mmol/1.
Podle ještě dalšího výhodného provedení vynálezu prostředek zahrnuje roztoky A a B, kdy roztok A obsahuje:
- 5 CZ 308598 B6 • křenovou peroxidázu o aktivitě 0,8 až 2,2 U/ml, • vápenaté ionty v koncentraci 0,05 až 0,5 mol/1, • hydroxyfenylový derivát hyaluronanu obecného vzorce I o hmotnostně střední molámí hmotnosti v rozmezí 9 x 104 až 4 xlO5 g/mol, se stupněm substituce 1 až 10 % a v koncentraci v rozsahu 10 až 50 mg/ml, a roztok B obsahuje:
• peroxid vodíku v rozmezí koncentrace 4 až 5 mmol/1.
Ještě dalším provedením vynálezu je způsob přípravy hydrogelu obsahujícího kovalentně zesítěný hydroxyfenylový derivát hyaluronanu, vyznačující se tím, že se připraví oddělené roztoky A a B popsané výše, načež se roztok A smíchá s krví nebo s alespoň jedním transfůzním přípravkem s obsahem fibrinogenu za vzniku prekurzorového roztoku A, který se smíchá s roztokem B.
Do roztoku A se s výhodou přidá 10 až 60 % obj. krve nebo transfuzního přípravku s obsahem fibrinogenu, výhodněji 30 až 60 % obj. Prekurzorový roztok A s roztokem B se s výhodou smíchá v objemovém poměru 1:1.
Podle výhodného provedení způsobu podle vynálezu je nejprve roztok A prostředku smísen s krví nebo transfůzním přípravkem s obsahem fibrinogenu za vzniku prekurzorového roztoku hydrogelu pA, který obsahuje:
• hydroxyfenylový derivát hyaluronanu obecného vzorce I o hmotnostně střední molámí hmotnosti v rozmezí 4 x 104 g/mol až 3 x 106 g/mol (a s indexem polydisperzity 1 až 3), se stupněm substituce 1 až 10 %, v koncentraci 0 až 50 mg/ml, s výhodou 10 až 50 mg/ml, • křenovou peroxidázu o aktivitě 0,2 až 0,9 U/ml, • vápenaté ionty v koncentraci 0,02 až 0,22 mol/1, • 10 až 60 % obj. krve nebo transfuzního přípravku s obsahem fibrinogenu, který je dále smísen v objemovém poměru 1 : 1 s roztokem B výše popsaného prostředku, který obsahuje:
• hydroxyfenylový derivát hyaluronanu obecného vzorce I o hmotnostně střední molámí hmotnosti v rozmezí 4 x 104 g/mol až 3 x 106 g/mol (a s indexem polydisperzity 1 - 3), ve kterém je DS je v rozsahu 1 až 10 %, přičemž je v koncentraci 10 až 50 mg/ml, • peroxid vodíku v rozmezí koncentrace 2 až 10 mmol/1.
Dále je ještě popsáno výhodné provedení způsobu přípravy hydrogelu podle vynálezu, kdy je nejprve roztok A prostředku smísen s krví nebo transfůzním přípravkem s obsahem fibrinogenu za vzniku prekurzorového roztoku hydrogelu pA, který obsahuje:
• hydroxyfenylový derivát hyaluronanu obecného vzorce I o hmotnostně střední molámí hmotnosti v rozmezí 1 x 105 g/mol až 1 x 106 g/mol (a s indexem polydisperzity 1 až 3), ve kterém je DS 2 až 5 %, přičemž je v koncentraci 0 až 14 mg/ml, s výhodou 10 až 14 mg/ml, • křenovou peroxidázu o aktivitě 0,2 až 0,9 U/ml • vápenaté ionty v koncentraci 0,02 až 0,22 mol/1 • 10 až 60 % obj. krve nebo transfuzního přípravku s obsahem fibrinogenu, který je dále smísen v objemovém poměm 1 : 1 s roztokem B výše popsaného prostředku, který obsahuje:
• hydroxyfenylový derivát hyaluronanu obecného vzorce I o hmotnostně střední molámí hmotnosti v rozmezí 1 x 105 g/mol až 1 x 106 g/mol (a s indexem polydisperzity 1 až 3), ve
-6CZ 308598 B6 kterém je DS 2 až 5 %, přičemž je v koncentraci 26 mg/ml • peroxid vodíku v rozmezí koncentrace 3 až 7 mmol/1.
Dále je popsáno výhodné provedení způsobu přípravy hydrogelu podle vynálezu, kdy je nejprve roztok A prostředku smísen s transfůzním přípravkem s obsahem fibrinogenu za vzniku prekurzorového roztoku hydrogelu pA, který obsahuje:
• křenovou peroxidázu o aktivitě 0,7 až 0,9 U/ml, • vápenaté ionty v koncentraci 0,18 až 0,22 mol/1, • 60 % obj. krevní plazmy nebo frakce krevní plazmy bohaté na krevní destičky, který je dále smísen v objemovém poměru 1 : 1 s roztokem B výše popsaného prostředku, který obsahuje:
• hydroxyfenylový derivát hyaluronanu obecného vzorce I o hmotnostně střední molámí hmotnosti v rozmezí 2 x 105 g/mol až 4 x 105 g/mol (a s indexem polydisperzity 1 až 3), ve kterém je DS v rozsahu 2 až 4 %, přičemž jev koncentraci 26 mg/ml • peroxid vodíku v rozmezí koncentrace 4 až 5 mmol/1.
Dále je popsáno ještě další výhodné provedení způsobu přípravy hydrogelu podle vynálezu, kdy je nejprve roztok A prostředku smísen s krví za vzniku prekurzorového roztoku hydrogelu pA, který obsahuje:
• hydroxyfenylový derivát hyaluronanu obecného vzorce I o hmotnostně střední molámí hmotnosti v rozmezí 2 x 105 g/mol až 4 x 105 g/mol (a s indexem polydisperzity 1 až 3), ve které je DS je v rozsahu 2 až 4 %, přičemž je v koncentraci 14 mg/ml • křenovou peroxidázu o aktivitě 0,7 až 0,9 U/ml • vápenaté ionty v koncentraci 0,18 až 0,22 mol/1 • 30% obj. krve, který je dále smísen v objemovém poměm 1 : 1 s roztokem B výše popsaného prostředku, který obsahuje • hydroxyfenylový derivát hyaluronanu vzorce (I) o hmotnostně střední molámí hmotnosti v rozmezí 2 x 105 g/mol 4 x 105 g/mol (a s indexem polydisperzity 1 až 3), ve kterém je DS je v rozsahu 2 až 4 %, přičemž je v koncentraci 26 mg/ml • peroxid vodíku v rozmezí koncentrace 4 až 5 mmol/1.
Podle ještě dalšího provedení vynálezu hydrogely připravené způsobem, jak je popsaný výše, obsahují enzym křenovou peroxidázu o aktivitě 0,1 až 2,5 U/ml, s výhodou 0,25 až 0,45 U/ml, výhodněji 0,35 až 0,45 U/ml, vápenaté ionty v koncentraci 0,01 až 0,11 mol/1, s výhodou 0,09 až 0,11 mol/1, kovalentně zesítěný hydroxyfenylový derivát hyaluronanu o koncentraci 5 až 50 mg/ml, výhodněji 13 až 20 mg/ml a krev nebo transfusní přípravek s obsahem fibrinogenu v koncentraci v rozsahu 5 až 30 % obj. s výhodou 15 až 30 % obj. Elasticita hydrogelů (G) podle vynálezu se může pohybovat v rozmezí od 1 Pa až 3 kPa, s výhodou 1 Pa až 2 kPa.
Podle ještě dalšího provedení vynálezu se hydrogel popsaný výše použije pro výrobu přípravků v kosmetice, medicíně anebo regenerativní medicíně.
S výhodou je takovýto přípravek vybrán ze skupiny přípravků obsahující krytí ran, přípravek pro augmentaci měkkých tkání, přípravky pro viskosuplementaci synoviálních tekutiny, matrice pro řízené uvolňování léčiv, výplně tkáňových defektů, scaffoldy pro tkáňové inženýrství.
Jak již bylo popsáno výše, přípravek podle vynálezu umožňuje přípravu gelotvomé směsi (hydrogelu), která vznikne po smísení hydrogelu prekurzorového roztoku A a roztoku B.
- 7 CZ 308598 B6
Gelotvomá směs (hydrogelu) obsahuje hydroxyfenylový derivát hyaluronanu obecného vzorce I, krev, či transfuzní přípravek obsahující fibrinogen, křenovou peroxidázu, peroxid vodíků a vápenaté ionty ve formě ve vodě rozpustné farmaceuticky přijatelné soli. Tato gelotvomá směs umožňuje vznik hydrogelu na bázi kovalentně zesítěného tyraminovaného derivátu hyaluronanu s obsahem krve či transfuzního přípravku obsahujícího fibrin.
K zesítění hydrogelu přispívá reakce katalyzovaná křenovou peroxidázou, která vede k oxidaci hydroxyfenylových jader tyraminu za vzniku jejich dimerů, popř. oligomerů. Peroxid vodíku je zdrojem hydroxylových radikálů pro reakce katalyzované křenovou peroxidázou a slouží tedy jako iniciátor síťovací reakce.
Překvapivě však bylo zjištěno, že přídavek dostatečného množství vápenatých iontů do alespoň jednoho roztoku A nebo B, jak jsou popsány výše, vede k zefektivnění procesu gelace a navýšení elastického modulu vznikajících hydrogelů. U analogických hydrogelů bez obsahu krve či transfuzního přípravku nebyl tento jev pozorován.
Dále bylo zjištěno, že samotná přítomnost vápenatých iontů v roztoku hydroxyfenylového derivátu nebo jeho směsi s krví či transfuzním přípravkem s obsahem fibrinogenu nevede, bez iniciace enzymatické síťovací reakce hydroxyfenylového derivátu hyaluronanu, ke vzniku hydrogelů. Nejedná se tedy pouze o projev koagulace krve, která může být zvýšenou koncentrací vápníku podpořena, nebo o důsledek interakce vápenatých iontů s polyanionickým řetězcem hydroxyfenylového derivátu hyaluronanu. Není vyloučeno, že všechny zmíněné procesy v gelotvomé směsi hydrogelu probíhají současně. Ke vzniku hydrogelu pravděpodobně dojde interakcí mezi jednotlivými vznikajícími polymemími sítěmi, takže jejich společná velikost překročí kritickou mez a dojde ke vzniku hydrogelu. Na rozdíl od dosud popsaných systémů [34], tak popsané složení prostředku umožňuje přípravu hydrogelu na bázi hydroxyfenylového derivátu hyaluronanu podle obecného vzorce I i v přítomnosti krve.
V případě využití krve, výše popsané gelotvomé směsi umožňují vznik hydrogelu při koncentracích peroxidu vodíku, které nevedou k poškození biologických struktur, a zároveň umožňují využití křenové peroxidázy o aktivitě, která by samostatně nevedla k efektivnímu vzniku hydrogelu v přítomnosti krve či transfuzního přípravku s obsahem fibrinogenu. To výrazně zvyšuje možnost využití prostředku v oblasti tkáňového inženýrství, regenerativní medicíny a dalších medicínských oborech.
Podobný jev lze vypozorovat i v případě přípravy hydrogelů s obsahem plazmy. Peroxid je v plazmě stabilnější, takže přítomnost vápenatých iontů není v daném případě pro vznik hydrogelu nezbytně nutná. Nicméně i v tomto případě vede přítomnost vápenatých iontů k urychlení procesu gelace a navýšení elastického modulu připravených hydrogelů. I tento jev se dá vysvětlit paralelním vznikem fibrinové sítě a sítě na bázi hydroxyfenylového derivátu hyaluronanu.
Vyšší koncentrace vápenatých iontů vedou k inhibici proliferace kultivovaných buněk, což by limitovalo využití prostředku v jako materiálu pro medicínské účely. V prostředku podle vynálezu je množství vápenatých iontů optimalizováno tak, aby bylo dostatečné pro podporu vznikajících hydrogelů podle vynálezu, ale zároveň aby umožňovalo využití připravených hydrogelů podle vynálezu jako matric pro 2D a 3D kultivaci buněk. Možnost využití kombinace krve nebo transfuzních přípravků obsahujících fibrinogen pro přípravu hydrogelů na bázi hydroxyfenylových derivátů hyaluronanu nebyla zatím v literatuře popsána.
Termín „krev“ znamená krev odebraná dárci, člověku nebo zvířeti. Je to surovina pro přípravu transfuzních přípravků.
Termín „transfuzní přípravek s obsahem fibrinogenu“ znamená transfuzní přípravek, který se připraví z krve obvyklými postupy. Patří sem například krevní plazma, frakce krevní plazmy bohatá na krevní destičky (PRP).
-8CZ 308598 B6
Nejedná se o krevní deriváty, což jsou průmyslově vyráběné přípravky, které zahrnují zejména albumin, koagulační faktory a imunoglobuliny lidského původu.
Objasnění výkresů
Obr. 1 Vliv koncentrace vápenatých iontů na rychlost gelace vzorků obsahující transfuzní přípravek - 30 % obj. plazmy, 13 mg/ml roztok HATA, HRP 0,4 U/ml, H2O2 2,3 mM, různá koncentrace CaCh ^FLO v hydrogelu.
Obr. 2 Vliv koncentrace Ca2+ (mol/1) na proliferaci 3T3 buněk.
Obr. 3 Cytotoxicita extraktů hydrogelů obsahujících různou koncentraci vápenatých iontů
Obr. 4 Cytotoxicita extraktů hydrogelů obsahujících různý podíl krve/krevní plazmy. Koncentrace vápenatých iontů v gelu je rovna 0,1 mol/1. Uvedená % jsou % obj.
Obr. 5 Vliv koncentrace Ca2+ iontů v hydrogelech obsahujících 30 % obj. podíl krevní plazmy.
Obr. 6 Adheze buněk na povrchu hydrogelů - barvení LIVE/DEAD. Uvedená % jsou % obj.
Obr. 7: 3D kultivace buněk - barvení LIVE/DEAD (šipky - adherované buňky). Uvedená % jsou %obj.
Příklady uskutečnění vynálezu
DS = stupeň substituce = 100 % * molámí množství modifikovaných disacharadických jednotek hyaluronanu / molámí množství všech disacharadických jednotek derivátu hyaluronanu. Stupeň substituce byla stanoven pomocí Ή NMR spektroskopií.
Hmotnostně střední molámí hmotnost (Mw) a index polydisperzity (PI) byly stanoveny metodou SEC-MALLS.
Příklad 1
Syntéza tyraminovaného derivátu HA (HA-TA)
Syntéza 6-amino-/V-[2(4hydroxyfenyl)ethyl]hexanamidu
6-[(terc. butoxykarbonyl)amino]hexanová kyselina (1,00 g, 4,3 mmol) byla rozpuštěna v 50 ml tetrahydrofůranu (THF). K roztoku kyseliny byl přidán l,l'-karbodiimidazol (0,70 g, 4,3 mmol). Směs byla zahřívána na 50 °C po dobu šedesáti minut. Poté byla reakční nádoba promyta inertním plynem. K reakční směsi byl přidán tyramin (0,59 g, 4,3 mmol). Směs byla dále zahřívána další 2 hodiny. Poté byl destilací za sníženého tlaku odstraněn THF. Odparek byl rozpuštěn v 50 ml ethylacetátu. Roztok byl promyt 150 ml čištěné vody (rozděleno do tří dílů). Organická vrstva byla vysušena nad molekulovým sítem. Ethylacetát byl odstraněn destilací za sníženého tlaku. Odparek byl rozpuštěn v 50 ml MeOH a k roztoku byly přidány 2 ml trifluoroctové kyseliny (TFA). Roztok byl zahříván 6 hodin pod zpětným chladičem. Rozpouštědlo bylo odstraněno destilací za sníženého tlaku. Odparek byl rozpuštěn v 50 ml ethylacetátu. Roztok byl promyt 150 ml čištěné vody (rozděleno do tří dílů). Organická vrstva byla vysušena nad molekulovým sítem. Ethylacetát byl odstraněn destilací za sníženého tlaku.
m = 0,75 g (70 % teorie)
-9CZ 308598 B6
Ή NMR (D2O, ppm) δ: 1,17 (m, 2 H, y-CH2-hexanové kyseliny); 1,48 (m, 2 H, P-CFE-hexanové kyseliny); 1,58 (m, 2 H, d-QE-hexanové kyseliny); 2,17 (t, 2 H, -CH2-CO-); 2,73 (m, 2 H, -CH2Ph); 2,91 (m, 2 H, -CH2-NH2); 3,42 (m, 2 H, -CH2-NH-CO-); 6,83 (d, 2 H, arom); 7,13 (d, 2 H, arom).
13C NMR(D20, ppm) δ: 24 (γ-C-hexanové kyseliny); 26 (δ-C-hexanové kyseliny); 33 (β-Chexanové kyseliny); 35 (-C-CO-); 39 (-C-NH2); 40 (C-Ph); 63 (-C-NH-CO-); 115 (C3 arom); 126 (Cl arom); 130 (C2 arom.); 153 (C4 arom); 176 (-CO-).
Příprava aldehydického derivátu (HA-CHO)
Hylauronan (10,00 g, Mw. = 2 x 106 g.mol1) byl rozpuštěn v 750 ml 2,5% (w/w) roztoku Na2HPO4.12 H2O. Roztok byl vychlazen na 5 °C. K vzniklému roztoku bylo přidáno 2,60 g NaBr a 0,05 g 4-acetamido-2,2,6,6-tetramethylpiperidin-l-oxylu. Po důkladné homogenizaci roztoku byly k reakční směsi přidány 3 ml roztoku NaClO (10 až 15 % dostupného CI2). Reakce pokračovala za stálého míchání 15 min. Reakce byla ukončena přídavkem 100 ml 40% roztoku propan-2-olu. Produkt byl přečištěn ultrafiltrací a izolován precipitací propan-2-olem.
IČ (KBr): 3417, 2886, 2152, 1659, 1620, 1550, 1412, 1378, 1323, 1236, 1204, 1154, 1078, 1038, 945 ,893 cm1.
Ή NMR (D2O) δ: 2,01 (s, 3 H, CH3-), 3,37 až 3,93 (m, skelet hyaluronanu), 4,46 (s, 1H, anomer), 4,54 (s, 1H anomer., -O-CH(OH)-), 5,27 (geminální glykol -CH-(OH)2).
a) Přípravatyraminovaného derivátu HA s Ce spacerem (Mw ~ 5 x I04 g.mol1, DS ~ 6 %)
Aldehydický derivát HA (~ 6 x 104 g.mol1, DS = 9%) (5,00 g) byl rozpuštěn v 500 ml demineralizované vody. Pomocí kyseliny octové bylo pH roztoku upraveno na 3. K roztoku HACHO byl přidán 6-amino-A-[2-(4-hydroxyfenyl)ethyl]hexanamid (meziprodukt (I)) (1,25 g, 5 mmol). Směs byla míchána 2 hodiny při laboratorní teplotě. Poté byl do reakční směsi přidán komplex pikolin-boran (0,270 g, 2,5 mmol). Směs byla míchána dalších 12 hodin při laboratorní teplotě. Produkt byl přečištěn ultrafiltrací a izolován z retentátu precipitací propan- 2-olem. Precipitát byl zbaven vlhkosti a zbytkového propan-2-olu sušením v horkovzdušné sušárně (40 °C, 3 dny).
IČ (KBr): 3425, 2893, 2148, 1660, 1620, 1549, 1412, 1378, 1323, 1236, 1204, 1154, 1078, 1038, 945, 893 cm1.
Ή NMR (D2O) δ: 1,25 (t, 2 Η, γ -CH2- aminohexanové kyseliny), 1,48 (m, 2 Η, δ -CH2aminohexanové kyseliny) 1,51 (m, 2 Η, β -CH2- aminohexanové kyseliny), 2,01 (s, 3 H, CH3-), 2,65 (m, 2H, Ph-CH2-), 2,73 (m, 2H, 8-CH2- aminohexanové kyseliny), 3,37 až 3,93 (m, skelet hyaluronanu), 4,46 (s, 1H, anomer), 4,54 (s, 1H anomer., -O-CH(OH)-), 6,59 (d, 2H, arom.),
SEC MALLS: Mw = 5,4 x 104 g.mol1; PI = 1,61
DS (*HNMR): 6,2 %
b) Příprava tyraminovaného derivátu HA s Ce spacerem (Mw » 3x 105 g.mol1, DS ~ 2 %)
Aldehydický derivát HA (Mw ~ 3 x 105 g.mol1, DS ~ 9 %) (5,00 g) byl rozpuštěn v 500 ml demineralizované vody. Pomocí kyseliny octové bylo pH roztoku upraveno na 3. K roztoku HACHO byl přidán 6-amino-A-[2-(4-hydroxyfenyl)ethyl]hexanamid (meziprodukt (I)) (0,625 g, 2,5 mmol). Směs byla míchána 2 hodiny při laboratorní teplotě. Poté byl do reakční směsi přidán komplex pikolin-boran (0,270 g, 2,5 mmol). Směs byla míchána dalších 12 hodin při laboratorní teplotě. Produkt byl přečištěn ultrafiltrací a izolován z retentátu precipitací propan-2-olem.
- 10 CZ 308598 B6
Precipitát byl zbaven vlhkosti a zbytkového propan-2-olu sušením v horkovzdušné sušárně (40 °C, 3 dny).
IČ (KBr): 3425, 2893, 2148, 1660, 1620, 1549, 1412, 1378, 1323, 1236, 1204, 1154, 1078, 1038, 945, 893 cm1.
Ή NMR (D2O) δ: 1,25 (t, 2 Η, γ -CH2- aminohexanové kyseliny), 1,48 (m, 2 Η, δ -CH2aminohexanové kyseliny) 1,51 (m, 2 Η, β -CH2- aminohexanové kyseliny), 2,01 (s, 3 H, CH3-), 2,65 (m, 2H, Ph-CH2-), 2,73 (m, 2H, s-CH2- aminohexanové kyseliny), 3,37 až 3,93 (m, skelet hyaluronanu), 4,46 (s, 1H, anomer), 4,54 (s, 1H anomer., -O-CH(OH)-), 6,59 (d, 2H, arom.), 7,01 (d, 2H.arom).
SEC MALLS: Mw = 2,81 x 105 g.mol1; PI = 1,49
DS (*HNMR): 2,2 %
c) Příprava tyraminovaného derivátu HA s Ce spacerem (Mw~ 1,5 x IO6 g.mol1, DS = 1 %)
Aldehydický derivát HA (~ 1,5 x 106 g.mol1, DS = 4 %) (5,00 g) byl rozpuštěn v 500 ml demineralizované vody. Pomocí kyseliny octové bylo pH roztoku upraveno na 3. K roztoku HACHO byl přidán 6-amino-N-|2-(4-hydroxyfcnyl)cthyl |hcxanamid (meziprodukt (I)) (0,625 g, 2,5 mmol). Směs byla míchána 2 hodiny při laboratorní teplotě. Poté byl do reakční směsi přidán komplex pikolin-boran (0,270 g, 2,5 mmol). Směs byla míchána dalších 12 hodin při laboratorní teplotě. Produkt byl přečištěn ultrafiltrací a izolován z retentátu precipitací propan-2-olem. Precipitát byl zbaven vlhkosti a zbytkového propan-2-olu sušením v horkovzdušné sušárně (40 °C, 3 dny).
IČ (KBr): 3425, 2893, 2148, 1660, 1620, 1549, 1412, 1378, 1323, 1236, 1204, 1154, 1078, 1038, 945, 893 cm1.
Ή NMR (D2O) δ: 1,25 (t, 2 Η, γ -CH2- aminohexanové kyseliny), 1,48 (m, 2 Η, δ -CH2aminohexanové kyseliny) 1,51 (m, 2 Η, β -CH2- aminohexanové kyseliny), 2,01 (s, 3 H, CH3-), 2,65 (m, 2H, Ph-CH2-), 2,73 (m, 2H, s-Clf- aminohexanové kyseliny), 3,37 až 3,93 (m, skelet hyaluronanu), 4,46 (s, 1H, anomer), 4,54 (s, 1H anomer., -O-CH(OH)-), 6,59 (d, 2H, arom.), 7,01 (d, 2H.arom).
SEC MALLS: Mw = 1,45 x 106 g.mol1; PI = 1,65
DS CHNMR): 1,1 %
d) Příprava tyraminovaného derivátu HA s Ce spacerem (Mw« 1 x 105 g-mol1, DS = 8,5 %)
Aldehydický derivát HA (~l x I05 g.mol1, DS = 10%) (5,00 g) byl rozpuštěn v 500 ml demineralizované vody. Pomocí kyseliny octové bylo pH roztoku upraveno na 3. K roztoku HACHO byl přidán 6-amino-N-|2-(4-hydroxyfcnyl)cthyl |hcxanamid (meziprodukt (I)) (0,625 g, 2,5 mmol). Směs byla míchána 2 hodiny při laboratorní teplotě. Poté byl do reakční směsi přidán komplex pikolin-boran (0,270 g, 2,5 mmol). Směs byla míchána dalších 12 hodin při laboratorní teplotě. Produkt byl přečištěn ultrafiltrací a izolován z retentátu precipitací propan-2-olem. Precipitát byl zbaven vlhkosti a zbytkového propan-2-olu sušením v horkovzdušné sušárně (40 °C, 3 dny).
IČ (KBr): 3425, 2893, 2148, 1660, 1620, 1549, 1412, 1378, 1323, 1236, 1204, 1154, 1078, 1038, 945, 893 cm1.
Ή NMR (D2O) δ: 1,25 (t, 2 Η, γ -CH2- aminohexanové kyseliny), 1,48 (m, 2 Η, δ -CH2
- 11 CZ 308598 B6 aminohexanové kyseliny) 1,51 (m, 2 Η, β -CH2- aminohexanové kyseliny), 2,01 (s, 3 H, CH3-), 2,65 (m, 2H, PI1-CH2-), 2,73 (m, 2H, s-CFL- aminohexanové kyseliny), 3,37 - 3,93 (m, skelet hyaluronanu), 4,46 (s, 1H, anomer), 4,54 (s, 1H anomer., -O-CH(OH)-), 6,59 (d, 2H, arom.), 7,01 (d, 2H. arom).
SEC MALLS: Mw = 9,5 x 104 g.mol-1; PI = 1,55
DS (*HNMR): 8,6 %
e) Příprava tyraminovaného derivátu HA s Ce spacerem (Mw » 2,5 x 106 g.mol-1, DS = 1 %)
Aldehydický derivát HA (~2.5 x 106, DS = 4 %) (5,00 g) byl rozpuštěn v 500 ml demineralizované vody. Pomocí kyseliny octové bylo pH roztoku upraveno na 3. K roztoku HA-CHO byl přidán 6amino-W-[2-(4-hydroxyfenyl)ethyl]hexanamid (meziprodukt (I)) (0,625 g, 2,5 mmol). Směs byla míchána 2 hodiny při laboratorní teplotě. Poté byl do reakční směsi přidán komplex pikolin-boran (0,270 g, 2,5 mmol). Směs byla míchána dalších 12 hodin při laboratorní teplotě. Produkt byl přečištěn ultrafiltrací a izolován z retentátu precipitací propan-2-olem. Precipitát byl zbaven vlhkosti a zbytkového propan-2-olu sušením v horkovzdušné sušárně (40 °C , 3 dny).
IČ (KBr): 3425, 2893, 2148, 1660, 1620, 1549, 1412, 1378, 1323, 1236, 1204, 1154, 1078, 1038, 945, 893 cm-1.
Ή NMR (D2O) δ: 1,25 (t, 2 Η, γ -CH2- aminohexanové kyseliny), 1,48 (m, 2 Η, δ -CH2aminohexanové kyseliny) 1,51 (m, 2 Η, β -CH2- aminohexanové kyseliny), 2,01 (s, 3 H, CH3-), 2,65 (m, 2H, Ph-CH2-), 2,73 (m, 2H, 8-CH2- aminohexanové kyseliny), 3,37 - 3,93 (m, skelet hyaluronanu), 4,46 (s, 1H, anomer), 4,54 (s, 1H anomer., -O-CH(OH)-), 6,59 (d, 2H, arom.), 7,01 (d, 2H arom).
SEC MALLS: Mw = 2,5 x 106 g.mol-1; PI = 1,65
DS (*HNMR): 1 %
Příklad 2
Vliv přítomnosti vápenatých iontů na vznik hydrogelu v přítomnosti krve
Rychlost gelace byla měřena pomocí rotačního reometru AR-G2 (TA Instrument) za použití geometrie deska-deska (40 mm) a velikostí mezery 400 pm. 525 pl vzorku bylo aplikováno na spodní statickou desku. Pre-shear 2000 1/s za sekundu byl zvolen pro homogenizaci roztoků. Time sweep mód byl zvolen pro stanovení rychlosti gelace při frekvenci 1 Hz a posunu (displacement) 0,001 rad při 37 °C. Elastický a viskózní modul byl stanoven ze závislosti elastického G' a viskózního G'' modulu na čase t. K přípravě roztoků byl použit tyraminovaný derivát hyaluronanu syntetizovaný postupem dle příkladu 1 (Mw = 2,81 x 105 g.mol-1, DS 2,2 %).
V uvedené tabulce 1 je znázorněn elastický G' a viskózní G'' modul jednotlivých vzorků odečtený při 300 s.
- 12 CZ 308598 B6
Tabulka 1 Složení testovaných gelotvomých směsí
Koncentrace roztoku HATA (mg/ml) Koncentrace C aCl2.2H2O (mol/1) Aktivita HRP (U/ml) KoncentraceH 2O2 (mmol/1) Podíl krve ve vzorku (%) G' (Pa) G” (Pa)
1 20 - - - 15 0,17 1,23
2 20 0,1 - - 15 0,34 1,06
3 20 0,1 0,4 - 15 0,20 1,15
4 20 - 0,4 - 15 0,24 1,27
5 20 - - 2,3 15 0,07 0,92
6 20 0,1 0,4 2,3 15 21,80 11,50
7 20 0,4 2,3 15 0,52 1,99
Z uvedených dat je patrné, že pouze u kombinace hydroxyfenylového derivátu hyaluronanu s křenovou peroxidázou, peroxidem vodíku a vápenatých iontů s krví (vzorek 6) dochází ke gelaci elastický modul G' je vyšší než viskózní modul G”. V ostatních případech (vzorky 1 až 5 a 7) je elastický modul nižší než viskózní a nedochází ke gelaci uvedených směsí ani po 24 hodinách.
Příklad 3
Vliv vápenatých iontů na účinnost gelace v přítomnosti krve a transfúzních přípravků
Viskoelastické vlastnosti hydrogelů byly stanoveny pomocí rotačního reometru AR-G2 (TA Instruments) pomocí metody strain sweep při konstantní hodnotě frekvence 1 Hz a posunu (displacement) v rozmezí 10-3 až 2 radiány. Aby nedocházelo k vyklouznutí připravených hydrogelů během měření, byla použita geometrie s hrubším povrchem (cross-hatched). Pro stanovení byly připraveny hydrogely o průměru 17,5 mm. Hydrogely byly hodnoceny po uplynutí 60 minut od přípravy. K přípravě roztoků byl použit tyraminovaný derivát hyaluronanu syntetizovaný postupem dle příkladu 1 (Mw = 2,8 1 x 105 g.mol1, DS 2,2 %).
V tabulce 2 jsou uvedeny viskoelastické vlastnosti (elastický G' a viskózní G” modul) hydrogelů připravených bez a s transfůzním přípravkem. Dále je zde demonstrován rozdíl v elastickém modulu u hydrogelů připravených bez a s přítomností vápenatých iontů.
U hydrogelů připravených bez přítomnosti krve či transfúzních přípravků nebyl pozorován nárůst elastického modulu v závislosti na přítomnosti vápenatých iontů. Naopak, hydrogely s obsahem krevní plazmy či krevní plazma bohatá na krevní destičky (PRP) připravené v přítomnosti vápenatých iontů vykazovaly vyšší hodnoty elastického modulu než analogické gely připravené bez přítomnosti vápníku. Prekurzorové roztoky s obsahem krve, ale bez přítomného vápníku, nebyly schopné hydrogel vůbec vytvořit.
- 13 CZ 308598 B6
Tabulka 2 Složení testovaných gelotvomých směsí a vlastnosti z nich vzniklých hydrogelů
Kone. HATA (mg/ml) Konc. CaCl2.2H2 O (mol/1) Aktivit a HRP (U/ml) Konc. H2O2 (mmol/1) (obj ./obj.) G' (Pa) SD G” (Pa) SD
1 13 0,1 0,4 2,3 mM Bez krve 1028,9 48,8 2,08 0,47
0 1052,6 34,4 4,17 1,53
2 0,1 30 % plazmy 578,3 27,2 2,35 0,18
0 433,7 8,5 2,07 0,05
3 0,1 30 % PRP 548,2 65,5 2,46 0,27
0 360,8 11,7 2,94 0,15
4 20 0,1 Bez krve 1764,0 151,8 1,82 1,06
0 1664,8 91,6 1,86 1,01
5 0,1 15 % Krve 59,0 1,9 20,73 1,85
0 negeluje
6 30 0,1 30 % Krve 1,7 0,3 0,41 0,06
0 negeluje
Příklad 4
Vliv koncentrace vápenatých iontů na rychlost vzniku hydrogelu v přítomnosti krevní plazmy
Rychlost gelace byla stanovena metodikou popsanou v příkladu 2.
Na obr. 1 je znázorněn vliv koncentrace vápenatých iontů na rychlost gelace vzorků obsahujících transfuzní přípravek - 30 % obj. plazmy. S rostoucí koncentrací vápenatých iontů klesá čas gelace.
Příklad 5
Vliv koncentrace vápenatých iontů na proliferaci buněk
Na obr. 2 je uvedena viabilita buněk (fibroblasty linie 3T3) kultivovaných v přítomnosti vápenatých iontů (0,1 až 0,001 mol/1). Buňky byly nasazeny na 24-jamkový kultivační panel v hustotě 15 tis. b./jamku. Druhý den bylo buňkám vyměněno médium; nové médium obsahovalo vápenaté ionty v testovaných koncentracích. Proliferace buněk byla sledována v intervalu 24, 48 a 72 h metodou stanovení ATP pomocí CellTiter-Glo assay. Jako kontrola sloužila DEMI voda v objemu 10 % objemu média.
Norma ISO 10993-5-2009 stanovuje jako hranici cytotoxicity snížení viability ovlivněných buněk o více než 30 % ve srovnání s kontrolou. U koncentrací 0,1 mol/1 až 0,05 mol/1 Ca2+ ke snížení viability buněk pod tuto hranici došlo. Přítomnost vápenatých iontů v koncentraci < 0,01 mol/1 nemá negativní vliv na viabilitu buněk.
Příklad 6
Cytotoxicita výluhů hydrogelů obsahujících různou koncentraci vápenatých iontů
Hydrogely byly připraveny z gelotvomé směsi, která vznikla smísením prekurzorového roztoku pA a roztoku B v objemovém poměru 1:1 (složení roztoků a vznikajících hydrogelů viz tabulka 3).
- 14 CZ 308598 B6
Jako zdroj vápenatých iontů byl použit chlorid vápenatý. K přípravě roztoků byl použit tyraminovaný derivát hyaluronanu syntetizovaný postupem dle příkladu 1 (Mw = 2,81xl05 g.mol1, DS 2,2 %).
Sterilně připravené hydrogely byly přeneseny do plastové zkumavky a zality kultivačním médiem v poměru 9 : 1 (9 ml média/1 g gelu). Extrakce probíhala po dobu 72 h při 37 °C. Buňky linie 3T3 byly nasazeny na 24-jamkový kultivační panel v hustotě 15 tis. b./jamku.
Druhý den bylo buňkám odsáto médium a místo něj byl přidán testovaný extrakt. Proliferace buněk byla sledována v intervalu 24,48 a 72 h metodou stanovení ATP pomocí CellTiter-Glo assay. Jako kontrola sloužilo kultivační médium. Obr. 3 popisuje viabilitu buněk v přítomnosti extraktů hydrogelů obsahujících různou koncentraci vápenatých iontů. Pro viabilitu buněk se jako hraniční ukázala hodnota koncentrace vápenatých iontů v hydrogelu 0,1 mol/1. Při jejím překročení působily extrakty připravené z hydrogelů cytotoxicky.
Tabulka 3: Koncentrace jednotlivých složek v prekurzorového roztoku pA a roztoku Bav gelotvomé směsi vzniklé smísením roztoku pA a roztoku B
Prekurzorový roztok pA Roztok pB Gelotvomá směs (hydrogel)
HRP (U/ml) Ca2+ (mol/1) HA-TA (mg/ml) H2O2 (mmol/1) HRP (U/ml) Ca2+ (mol/1) HA-TA (mg/ml) H2O2 (mmol/1)
0,8 0,1 26 4,6 0,4 0,05 13 2,3
0,14 0,07
0,2 0,1
1 0,5
Příklad 7
Cytotoxicita výluhů hydrogelů obsahujících krev nebo krevní plazmu
Před přípravou hydrogelu byl roztok A smísen s příslušným množstvím krve nebo krevní plazmy za vzniku prekurzorového roztoku pA. Hydrogely byly připraveny z gelotvomé směsi, která vznikla smísením prekurzorového roztoku pA s příměsí krve či krevní plazmy a roztoku B v objemovém poměru 1:1 (složení roztoků a vznikajících hydrogelů viz tabulka 4). Jako zdroj vápenatých iontů byl použit chlorid vápenatý. K přípravě roztoků byl použit tyraminovaný derivát hyaluronanu syntetizovaný postupem dle příkladu 1 (Mw = 2,81 x 105 g.mol1, DS 2,2 %). Sterilně připravené hydrogely byly přeneseny do plastové zkumavky a zality kultivačním médiem v poměru 9 : 1 (9 ml média/1 g gelu). Extrakce probíhala po dobu 72 h při 37 °C. Buňky linie 3T3 byly nasazeny na 24-jamkový kultivační panel v hustotě 15 tis. b./jamku. Druhý den bylo buňkám odsáto médium a místo něj byl přidán testovaný extrakt. Proliferace buněk byla sledována v intervalu 24,48 a 72 h metodou stanovení ATP pomocí CellTiter-Glo assay. Jako kontrola sloužilo kultivační médium. Výsledky prezentované na obr. 4 dokládají, že extrakty hydrogelů s 15 až 30 % obj. podílem plazmy či krve a s obsahem 0,1 mol/1 vápenatých iontů nemají negativní vliv na viabilitu buněk.
Tabulka 4: Vliv přítomnosti krevní plazmy a krve na cytotoxicitu výluhů hydrogelů - Koncentrace jednotlivých složek v prekurzorovém roztoku pA a roztoku Bav gelotvomé směsi vzniklé smísením roztoku pA a roztoku B
- 15 CZ 308598 B6
Prekurzorový roztok pA roztok B Gelotvomá směs (hydrogel)
HRP (U/ml) Ca2+ (mol/1) HA-TA (mg/ml) o o HA-TA (mg/ml) H2O2 (mmol/1) HRP (U/ml) Ca2+ (mol/1) HA-TA (mg/ml) H2O2 (mmol/1) 0 \ 0
0,8 0,2 0 26 4,6 0,4 0,1 13 2,3
0 Plazma 60% 26 4,6 13 2,3 Plazma 30%
14 Plazma 30% 26 4,6 20 2,3 Plazma 15 %
14 Krev 30% 26 4,6 20 2,3 Krev 15 %
Příklad 8
Cytotoxicita výluhů hydrogelů obsahujících podíl krevní plazmy a různou koncentraci vápenatých iontů
Dále byl sledován vliv koncentrace vápenatých iontů přítomných v hydrogelů s obsahem krevní plazmy na viabilitu buněk. Pro zhodnocení tohoto parametru byly opět připraveny výluhy hydrogelů. Před přípravou hydrogelů byl roztok A smísen s příslušným množstvím krve nebo krevní plazmy za vzniku prekurzorového roztoku pA. Hydrogely byly připraveny z gelotvomé směsi, která vznikla smísením prekurzorového roztoku pA a roztoku B v objemovém poměru 1:1 (složení roztoků a vznikajících hydrogelů viz tabulka 5). Jako zdroj vápenatých iontů byl použit chlorid vápenatý. K přípravě roztoků byl použit tyraminovaný derivát hyaluronanu syntetizovaný postupem dle příkladu 1 (Mw = 2,81 x 105 g.mol1, DS 2,2 %). Sterilně připravené hydrogely byly přeneseny do plastové zkumavky a zality kultivačním médiem v poměru 9 : 1 (9 ml média/1 g gelu). Extrakce probíhala po dobu 72 h při 37 °C. Buňky linie 3T3 byly nasazeny na 24-jamkový kultivační panel v hustotě 15 tis. b./jamku. Druhý den bylo buňkám odsáto médium a místo něj byl přidán testovaný extrakt. Proliferace buněk byla sledována v intervalu 24, 48 a 72 h metodou stanovení ATP pomocí CellTiter-Glo assay. Jako kontrola sloužilo kultivační médium. Výsledky prezentované na obr. 5 dokládají, že extrakty připravené z hydrogelů obsahujících 30 % obj. podíl plazmy a vápenaté ionty v koncentračním rozmezí 0 až 0,1 mol/1 nepůsobí cytotoxicky.
Tabulka 5: Vliv koncentrace vápenatých iontů na cytotoxicitu extraktů hydrogelů obsahujících plazmu - Koncentrace jednotlivých složek v prekurzorovém roztoku pA a roztoku Bav gelotvomé směsi vzniklé smísením roztoku pA a roztoku B
- 16CZ 308598 B6
Prekurzorový roztok pA roztok B Gelotvomá směs (hydrogel)
HRP (U/ml) Ca2+ (mol/1) HA-TA (mg/ml) o o HA-TA (mg/ml) H2O2 (mol/1) HRP (U/ml) Ca2+ (mol/1) HA-TA (mg/ml) H2O2 (mol/1) 0 0
0,8 0 0 Plazma 60 0/ /0 26 4,6 0,4 0 13 2,3 Plazma 30 0/ /0
0,1 0 Plazma 60 0/ /0 26 4,6 0,05 13 2,3 Plazma 30 0/ /0
0,2 0 Plazma 60 0/ /0 26 4,6 0,1 13 2,3 Plazma 30 0/ /0
Příklad 9
Test adheze buněk k hydrogelovým vrstvám
Roztok A byl smísen s příslušným množstvím krve, krevní plazmy, nebo PRP za vzniku prekurzorového roztoku pA. Hydrogely byly připraveny z gelotvomé směsi, která vznikla smísením prekurzorového roztoku pA s přídavkem krve či transfuzního přípravku a roztoku B v objemovém poměru 1:1 (složení roztoků a vznikajících hydrogelů viz tabulka 6). Jako zdroj vápenatých iontů byl použit chlorid vápenatý. K přípravě roztoků byl použit tyraminovaný derivát hyaluronanu syntetizovaný postupem dle příkladu 1 (Mw = 2,81 x 105g.mol1, DS 2,2%). Testovanými hydrogely byly povrstveny 24-jamkové kultivační panely. Následně byly na povrh hydrogelové vrstvy nasazeny kmenové buňky v hustotě 13 tis. b./jamku. Růst buněk byl sledován v průběhu 4 dní pomocí barvení LIVE/DEAD.
Adheze kmenových buněk k povrchu materiálu se projevuje typickými změnami v morfologie buněk, kdy buňky zaujímají protáhlý tvar. Obr. 6 dokumentuje, že buňky nejsou schopny adheze k hydrogelu bez přídavku krve či transfuzního přípravku. V tomto případě si buňky i po 4 dnech kultivace zachovávají sférický tvar a nejeví známky interakce s povrchem gelu. Rovněž jejich proliferace je potlačena. Hydrogely s obsahem krve nebo transfuzních přípravků s obsahem fibrinogenu (krevní plazma, PRP) naopak podporují adhezi i proliferaci buněk. Buňky na jejich povrchu zaujímají typický protáhlý tvar jejich počet s dobou kultivace roste. Experiment rovněž prokázal, že přítomnost vápníku ve struktuře hydrogelu není překážkou pro kultivaci na povrchu hydrogelů.
Tabulka 6: 2D adheze kmenových buněk k povrchu hydrogelu - Koncentrace jednotlivých složek v prekurzorovém roztoku pA a roztoku Bav gelotvomé směsi vzniklé smísením roztoku pA a roztoku B
- 17 CZ 308598 B6
Prekurzorový roztok pA roztok B Gelotvomá směs (hydrogel)
HRP (U/ml) Ca2+ (mol/1) HA-TA (mg/ml) 0 \ 0 HA-TA (mg/ml) H2O2 (mmol/1) HRP (U/ml) Ca2+ (mol/1) HA-TA (mg/ml) H2O2 (mmol/1) 0 0
0,8 0,1 0 0 26 4,6 0,4 0,05 13 2,3 0
0 Plazma 60% 26 4,6 13 2,3 Plazma 30 %
14 Plazma 30% 26 4,6 20 2,3 Plazma 15 %
0 PRP 60% 26 4,6 13 2,3 PRP 30 %
14 PRP 30% 26 4,6 20 2,3 PRP 15 %
Příklad 10
3D kultivace buněk
Pro enkapsulaci byly využity buňky linie 3T3 myších fibroblastů. Před přípravou hydrogelů byl pelet buněk suspendován v roztoku A. Roztok A byl dále smísen s příslušným množstvím krve, krevní plazmy, nebo PRP za vzniku prekurzorového roztoku pA. Hydrogely byly následně připraveny smísením prekurzorového roztoku A a roztoku B v objemovém poměru 1:1 (složení roztoků a vznikajících hydrogelů viz tabulka 7). Jako zdroj vápenatých iontů byl použit chlorid vápenatý. K přípravě roztoků byl použit tyraminovaný derivát hyaluronanu syntetizovaný postupem dle příkladu 1 (Mw = 2,81xl05 g.mol1, DS 2,2 %). Sterilně připravené hydrogely byly převedeny do kultivačního panelu a zality kultivačním médiem, kde byly inkubovány po dobu 4 dnů při 37 °C, 5 % CO2. Růst buněk byl sledován pomocí barvení LIVE/DEAD. Výsledky prezentované na obr. 7 dokládají, že systém umožňuje enkapsulaci viabilních buněk do hydrogelů a jejich následnou 3D kultivaci. Buňky v hydrogelech obsahujících transfuzní přípravek jsou schopny adheze.
Tabulka 7: 3D kultivace buněk - Koncentrace jednotlivých složek v prekurzorovém roztoku A a roztoku Bav hydrogelů po smísením roztoků pA a roztoku B.
- 18CZ 308598 B6
Prekurzorový roztok pA roztok B Gelotvomá směr (hydrogel)
HRP (U/ml) Ca2+ (mol/1) HA-TA (mg/ml) z— o o HA-TA (mg/ml) H2O2 (mmol/1) HRP (U/ml) (ppui) +^3 HA-TA (mg/ml) H2O2 (mmol/1) z— o o
0,8 0,2 0 26 4,6 0,4 0,1 13 2,3
0 Plazma 60% 26 4,6 13 2,3 Plazma 30%
0 PRP 60% 26 4,6 13 2,3 PRP 30%
14 Krev 30% 26 4,6 20 2,3 Krev 15 %
Příklad 11
Příprava hydrogelů s obsahem krve 5 % obj.
K přípravě roztoků prostředku pro přípravu hydrogelů byl použit derivát HA-TA (Mw = 5,4 x 104 g.mol1, DS 6,2 %). Z roztoku A (1,8 ml) prostředku pro přípravu hydrogelů o složení:
to HRP..........................................1 U/ml
CaCl2 2H2O...................................0,223 mol/1
HA-TA.......................................55,556 mg/ml, byl přídavkem 0,2 ml krve připraven prekurzorový roztok hydrogel pA. Dále byly použity 2 ml 15 roztoku B prostředku pro přípravu hydrogelů. Složení prekurzorového roztoku pA a roztoku B popisuje tabulka 8.
Roztok pA Roztok B
HRP............... ......0,9 U/ml H2O2............ .......9,2 mmol/1
CaCl2 2H2O...... ......0,2 mol/1 HA-TA......... .......50 mg/ml
HA-TA........... ......50 mg/ml
Krev.............. ......10 % obj.
Tabulka 8: Složení prekurzorového roztoku pA a roztoku B pro přípravu hydrogelu s obsahem krve 20 5 % obj.
Hydrogel s obsahem 5 % obj. krve byl připraven smísením roztoku pA a roztoku B v objemovém poměru 1:1.
Takto připravený hydrogel obsahuje enzym křenovou peroxidázu, vápenaté ionty, kovalentně
- 19CZ 308598 B6 zesítěný hydroxyfenylový derivát hyaluronanu (crossHA-TA) a krev v těchto koncentracích:
HRP...........................................0,45 U/ml
CaCl2 2H2O..................................0,1 mol/1 crossHA-TA.................................50 mg/ml
Krev...........................................5 % obj.
Příklad 12
Příprava hydrogelů s obsahem krve (5 % obj.)
K přípravě roztoků prostředku pro přípravu hydrogelů byl použit derivát HA-TA (Mw = 2,81 x 105 g.mol1, DS 2,2 %). Z roztoku A (1,8 ml) prostředku pro přípravu hydrogelů o složení:
HRP.........
CaCl2 2H2O
HA-TA......
. .0,889 U/ml . .0,223 mol/1 15,556 mg/ml, byl přídavkem 0,2 ml krve připraven prekurzorový roztok hydrogelu pA. Byly použity 2 ml roztoku B prostředku pro přípravu hydrogelů. Složení prekurzorového roztoku pA a roztoku B popisuje tabulka 9.
Roztok pA Roztok B
HRP............... .......0,8 U/ml H2O2........... ......4,6 mmol/1
CaCl2 2H2O...... ......0,2 mol/1 HA-TA........ ......26 mg/ml
HA-TA............ ......14 mg/ml
Krev............... .......10 % obj.
Tabulka 9: Složení prekurzorového roztoku pA a roztoku B pro přípravu hydrogelu s obsahem krve 5 % obj.
Hydrogel s obsahem 5 % obj. krve byl připraven smísením roztoku pA a roztoku B v objemovém poměru 1:1.
Takto připravený hydrogel obsahuje enzym křenovou peroxidázu, vápenaté ionty, kovalentně zesítěný hydroxyfenylový derivát hyaluronanu (crossHA-TA) a krev v těchto koncentracích:
HRP...........................................0,4 U/ml
CaCl2 2H2O.................................0,1 mol/1 crossHA-TA.................................20 mg/ml
Krev..........................................5 % obj.
Příklad 13
Příprava hydrogelů s obsahem krve (5 %)
K přípravě roztoků prostředku pro přípravu hydrogelů byl použit derivát HA-TA (Mw = 1,45 x 106 g.mol1, DS 1,1 %). Z roztoku A (1,8 ml) prostředku pro přípravu hydrogelů o složení:
HRP........................................
CaCl2 2H2O...............................
0,556 U/ml
0,223 mol/1
- 20 CZ 308598 B6
HA-TA
11,112 mg/ml, byl přídavkem 0,2 ml krve připraven prekurzorový roztok hydrogel pA. Byly použity 2 ml roztoku B prostředku pro přípravu hydrogelů. Složení prekurzorového roztoku pA a roztoku B popisuje tabulka 10.
Roztok pA Roztok B
HRP............... ......0,5 U/ml H2O2.............. .........2,3 mmol/1
CaCl2 2H2O...... ......0,2 mol/1 HA-TA........... .........10 mg/ml
HA-TA........... ......10 mg/ml
Krev............... ......10 % obj.
Tabulka 10: Složení prekurzorového roztoku pA a roztoku B pro přípravu hydrogelu s obsahem krve 5 % obj.
Hydrogel s obsahem 5 % obj. krve byl připraven smísením roztoku pA a roztoku B v objemovém poměru 1:1.
Takto připravený hydrogel obsahuje enzym křenovou peroxidázu, vápenaté ionty, kovalentně zesítěný hydroxyfenylový derivát hyaluronanu (crossHA-TA) a krev v těchto koncentracích:
HRP..........................................0,25 U/ml
CaCl2-2H2O.................................0,1 mol/1 crossHA-TA.................................10 mg/ml
Krev.............................................5 % obj.
Příklad 14
Přípravahydrogelu s obsahem krve (15 % obj.)
K přípravě roztoků prostředku pro přípravu hydrogelů byl použit derivát HA-TA (Mw = 2,81 x 105 g.mol1, DS 2,2 %). Z roztoku A (1,4 ml) prostředku pro přípravu hydrogelů o složení:
HRP.........
CaCl2 2H2O
HA-TA......
.1,143 U/ml . .0,286 mol/1 20 mg/ml, byl přídavkem 0,6 ml krve připraven prekurzorový roztok hydrogel pA. Byly použity 2 ml roztoku B prostředku pro přípravu hydrogelů. Složení prekurzorového roztoku pA a roztoku B popisuje tabulka 11.
Roztok pA Roztok B
HRP................. .........0,8 U/ml H2O2................ ...........4,6 mmol/1
CaCl2 2H2O........ .........0,2 mol/1 HA-TA............. ............26 mg/ml
HA-TA............. ........14 mg/ml
Krev................. .........30% obj.
- 21 CZ 308598 B6
Tabulka 11 Složení prekurzorového roztoku pA a roztoku B pro přípravu hydrogelů s obsahem krve 15 % obj.
Hydrogel s obsahem 15 % obj. krve byl připraven smísením roztoku pA a roztoku B v objemovém poměru 1:1.
Takto připravený hydrogel obsahuje enzym křenovou peroxidázu, vápenaté ionty, kovalentně zesítěný hydroxyfenylový derivát hyaluronanu (crossHA-TA) a krev v těchto
HRP....................................0,4U/ml
CaCl2-2H2O...........................0,1mol/1 crossHA-TA...........................20mg/ml
Krev....................................15 % obj.
Příklad 15
Přípravahydrogelů s obsahem krve (30 % obj.)
K přípravě roztoků prostředku pro přípravu hydrogelů byl použit derivát HA-TA (Mw = 5,4 x 104 g.mol1, DS 6,2 %). Z roztoku A (0,8 ml) prostředku pro přípravu hydrogelů o složení:
HRP.......................................2,25 U/ml
CaCl2 2H2O...............................0,5 mol/1
HA-TA..................................125 mg/ml, byl přídavkem 1,2 ml krve připraven prekurzorový roztok hydrogel pA. Byly použity 2 ml roztoku B prostředku pro přípravu hydrogelů. Složení prekurzorového roztoku pA a roztoku B popisuje tabulka 12.
Roztok pA Roztok B
HRP................. .........0,9 U/ml H2O2............... ..........9,3 mmol/1
CaCl2 2H2O........ .........0,2 mol/1 HA-TA............ ..........50 mg/ml
HA-TA............. ........50 mg/ml
Krev................. .........60 % obj.
Tabulka 12 Složení prekurzorového roztoku pA a roztoku B pro přípravu hydrogelů s obsahem krve 15 % obj.
Hydrogel s obsahem 30 % obj. krve byl připraven smísením roztoku pA a roztoku B v objemovém poměru 1:1.
Takto připravený hydrogel obsahuje enzym křenovou peroxidázu, vápenaté ionty, kovalentně zesítěný hydroxyfenylový derivát hyaluronanu (crossHA-TA) a krev v těchto koncentracích:
HRP...........................................0,45 U/ml
CaCl2-2H2O..................................0,1 mol/1 crossHA-TA.................................50 mg/ml
Krev...........................................30% obj.
- 22 CZ 308598 B6
Příklad 16
Příprava hydrogelu s obsahem krve (30 % obj.)
K přípravě roztoků prostředku pro přípravu hydrogelů byl použit derivát HA-TA (Mw = 2,81 x 105 g.mol1, DS 2,2 %). Z roztoku A (0,8 ml) prostředku pro přípravu hydrogelů o složení:
HRP........................................2 U/ml
CaCl2 2H2O................................0,5 mol/1
HA-TA...................................35 mg/ml byl přídavkem 1,2 ml krve připraven prekurzorový roztok hydrogelu pA. Byly použity 2 ml roztoku B prostředku pro přípravu hydrogelů. Složení prekurzorového roztoku pA a roztoku B popisuje tabulka 13.
Roztok pA Roztok B
HRP................. .........0,8 U/ml H2O2............... ............4,6 mmol/1
CaCl2 2H2O......... .........0,2 mol/1 HA-TA............ ..........26 mg/ml
HA-TA.............. .........14 mg/ml
Krev................. .........60 % obj.
Tabulka 13: Složení prekurzorového roztoku pA a roztoku B pro přípravu hydrogelu s obsahem krve 30 % obj.
Hydrogel s obsahem 30 % obj. krve byl připraven smísením roztoku pA a roztoku B v objemovém poměru 1:1.
Takto připravený hydrogel obsahuje enzym křenovou peroxidázu, vápenaté ionty, kovalentně zesítěný hydroxyfenylový derivát hyaluronanu (crossHA-TA) a krev v těchto koncentracích:
HRP.......................................0,4 U/ml
CaCl2-2H2O..............................0,1 mol/1 crossHA-TA..............................20 mg/ml
Krev.......................................30 % obj.
Příklad 17
Příprava hydrogelu s obsahem krevní plazmy 5 % obj.
K přípravě roztoků prostředku pro přípravu hydrogelů byl použit derivát HA-TA (Mw = 2,81 x 105 g.mol1, DS 2,2 %). Z roztoku A (1,8 ml) prostředku pro přípravu hydrogelů o složení:
HRP.....................................................0,889 U/ml
Ca(HCO3)2.................................0,223 mol/1 byl přídavkem 0,2 ml krevní plazmy připraven prekurzorový roztok hydrogelu pA. Byly použity 2 ml roztoku B prostředku pro přípravu hydrogelů. Složení prekurzorového roztoku pA a roztoku B popisuje tabulka 14.
- 23 CZ 308598 B6
Roztok pA HRP................... .........0,8 U/ml Roztok B
H2O2............... ..........4,6 mmol/1
Ca(HCO3)2........... ........0,2 mol/1 HA-TA............ ..........26 mg/ml
Krevní plazma....... .......10 % obj.
Tabulka 14: Složení prekurzorového roztoku pA a roztoku B pro přípravu hydrogelů s obsahem krevní plazmy 5 % obj.
Hydrogel s obsahem 5 % obj. krevní plazmy byl připraven smísením roztoku pA a roztoku B v objemovém poměru 1:1.
Takto připravený hydrogel obsahuje enzym křenovou peroxidázu, vápenaté ionty, kovalentně zesítěný hydroxyfenylový derivát hyaluronanu (crossHA-TA) a krevní plazmu v těchto koncentracích:
HRP..........................................0,4 U/ml
Ca(HCO3)2...................................0,1 mol/1 crossHA-TA.................................13 mg/ml
Krevní plazma..............................5 % obj.
Příklad 18
Přípravahydrogelů s obsahem krevní plazmy (15 % obj.)
K přípravě roztoků prostředku pro přípravu hydrogelů byl použit derivát HA-TA (Mw = 2,81 x 105 g.mol1, DS 2,2 %). Z roztoku A (1,4 ml) prostředku pro přípravu hydrogelů o složení:
HRP...........................................
CaCl2 2H2O..................................
1,143 U/ml 0,286 mol/1 byl přídavkem 0,6 ml krevní plazmy připraven prekurzorový roztok hydrogel pA. Jako prekurzorový roztok pB byly použity 2 ml roztoku B prostředku pro přípravu hydrogelů. Složení prekurzorového roztoku pA a roztoku B popisuje tabulka 15.
Roztok pA HRP................... .........0,8 U/ml Roztok B
H2O2............... ..........4,6 mmol/1
CaCl2 2H2O.......... ........0,2 mol/1 HA-TA............ ..........26 mg/ml
Krevní plazma....... ........30% obj.
Tabulka 15: Složení prekurzorového roztoku pA a roztoku B pro přípravu hydrogelů s obsahem krevní plazmy 15 % obj.
Hydrogel s obsahem 15 % obj. krevní plazmy byl připraven smísením roztoků pA a roztoku B v objemovém poměru 1:1.
Takto připravený hydrogel obsahuje enzym křenovou peroxidázu, vápenaté ionty, kovalentně zesítěný hydroxyfenylový derivát hyaluronanu (crossHA-TA) a krevní plazmu v těchto koncentracích:
- 24 CZ 308598 B6
HRP...........................................0,4 U/ml
CaCl2 2H2O...................................0,1 mol/1 crossHA-TA.................................13 mg/ml
Krevní plazma...............................15 % obi.
Příklad 19
Příprava hydrogelu s obsahem krevní plazmy (30 % obj.)
K přípravě roztoků prostředku pro přípravu hydrogelů byl použit derivát HA-TA (Mw = 2,81 x 105 g.mol1, DS 2,2 %). Z roztoku A (0,8 ml) prostředku pro přípravu hydrogelů o složení:
HRP.........................................
CaCl2 2H2O................................
U/ml 0,5 mol/1 byl přídavkem 1,2 ml krve připraven prekurzorový roztok hydrogelu pA. Byly použity 2 ml roztoku B prostředku pro přípravu hydrogelů. Složení prekurzorového roztoku pA a roztoku B popisuje tabulka 16.
Roztok pA HRP................... .........0,8 U/ml Roztok B
H2O2............... ..........4,6 mmol/1
CaCl2 2H2O.......... ........0,2 mol/1 HA-TA............ ..........26 mg/ml
Krevní plazma....... ........60 % obj.
Tabulka 16 Složení prekurzorového roztoku pA a roztoku B pro přípravu hydrogelu s obsahem krevní plazmy 30 % obj.
Hydrogel s obsahem 30 % obj. krve byl připraven smísením roztoků pA a roztoku B v objemovém poměru 1:1.
Takto připravený hydrogel obsahuje enzym křenovou peroxidázu, vápenaté ionty, kovalentně zesítěný hydroxyfenylový derivát hyaluronanu (crossHA-TA) a krevní plazmu v těchto koncentracích:
HRP........................................0,4 U/ml
CaCl2 2H2O...............................0,1 mol/1 crossHA-TA..............................13 mg/ml
Krevní plazma............................30% obj.
Příklad 20
Příprava hydrogelů s obsahem frakce krevní plazmy bohaté na krevní destičky (PRP, 5 % obj.)
K přípravě roztoků prostředku pro přípravu hydrogelů byl použit derivát HA-TA (Mw = 2,81 x 105 g.mol1, DS 2,2 %). Z roztoku A (1,8 ml) prostředku pro přípravu hydrogelů o složení:
HRP...........................................
Octan vápenatý...............................
0,889 U/ml 0,223 mol/1 byl přídavkem 0,2 ml PRP připraven prekurzorový roztok hydrogelu pA. Byly použity 2 ml roztoku
- 25 CZ 308598 B6
B prostředku pro přípravu hydrogelů. Složení prekurzorového roztoku pA a roztoku B popisuje tabulka 17.
Roztok pA HRP................................0,8 U/ml Octan vápenatý..................0,2 mol/1 PRP................................10% obj. Roztok B H2O2.........................4,6 mmol/1 HA-TA......................26 mg/ml
Tabulka 17: Složení prekurzorového roztoku pA a roztoku B pro přípravu hydrogelu s obsahem PRP 5 % obj.
Hydrogel s obsahem 5 % obj. PRP byl připraven smísením roztoku pA a roztoku B v objemovém poměru 1:1.
Takto připravený hydrogel obsahuje enzym křenovou peroxidázu, vápenaté ionty, kovalentně zesítěný hydroxyfenylový derivát hyaluronanu (crossHA-TA) a PRP v těchto
HRP...........................................0,4 U/ml
Octan vápenatý...............................0,1 mol/1 crossHA-TA..................................13 mg/ml
PRP.............................................5 %obj.
Příklad 21
Příprava hydrogelů s obsahem frakce krevní plazmy bohaté na krevní destičky (PRP, 5 % obj.)
K přípravě roztoků prostředku pro přípravu hydrogelů byl použit derivát HA-TA (Mw = 2,81 x 105 g.mol1, DS 2,2 %). Z roztoku A (1,8 ml) prostředku pro přípravu hydrogelů o složení:
HRP.......................................0,889 U/ml
Mléčnan vápenatý........................0,023 mol/1 byl přídavkem 0,2 ml PRP připraven prekurzorový roztok hydrogelu pA. Byly použity 2 ml roztoku B prostředku pro přípravu hydrogelů. Složení prekurzorového roztoku pA a roztoku B popisuje tabulka 18.
Roztok pA HRP........................ ........0,8 U/ml Roztok B
H2O2................ ............4,6 mmol/1
Mléčnan vápenatý........ PRP........................ ..........0,02 mol/1 ..........10 % obj. HA-TA............. ...........26 mg/ml
Tabulka 18: Složení prekurzorového roztoku pA a roztoku B pro přípravu hydrogelu s obsahem PRP 5 % obj.
Hydrogel s obsahem 5 % obj. PRP byl připraven smísením roztoku pA a roztoku B v objemovém poměru 1:1.
Takto připravený hydrogel obsahuje enzym křenovou peroxidázu, vápenaté ionty, kovalentně zesítěný hydroxyfenylový derivát hyaluronanu (crossHA-TA) a PRP v těchto koncentracích:
-26CZ 308598 B6
HRP........................................0,4 U/ml
Mléčnan vápenatý........................0,1 mol/1 crossHA-TA..............................13 mg/ml
PRP.........................................5 %obi.
Příklad 22
Příprava hydrogelů s obsahem frakce krevní plazmy bohaté na krevní destičky (PRP, 15%)
K přípravě roztoků prostředku pro přípravu hydrogelů byl použit derivát HA-TA (Mw = 1,45 x 106 g.mol1, DS 1,1 %). Z roztoku A (1,4 ml) prostředku pro přípravu hydrogelů o složení:
HRP.........................................1,143 U/ml
CaCl2 2H2O...............................0,286 mol/1 byl přídavkem 0,6 ml PRP připraven prekurzorový roztok hydrogel pA. Byly použity 2 ml roztoku B prostředku pro přípravu hydrogelů. Složení prekurzorového roztoku pA a roztoku B popisuje tabulka 19.
Roztok pA Roztok B
HRP................................0,8 U/ml H2O2.........................4,6 mmol/1
CaCl2 2H2O......................0,2 mol/1 HA-TA......................26 mg/ml
PRP................................30% obj.
Tabulka 19: Složení prekurzorového roztoku pA a roztoku B pro přípravu hydrogelu s obsahem PRP 15 %obj.
Hydrogel s obsahem 15 % obj. PRP byl připraven smísením roztoku pA a roztoku B v objemovém poměru 1:1.
Takto připravený hydrogel obsahuje enzym křenovou peroxidázu, vápenaté ionty, kovalentně zesítěný hydroxyfenylový derivát hyaluronanu (crossHA-TA) a PRP v těchto koncentracích:
HRP........................................0,4 U/ml
CaCl2 2H2O...............................0,1 mol/1 crossHA-TA..............................13 mg/ml
PRP.........................................15 %obj.
Příklad 23
Příprava hydrogelů s obsahem frakce krevní plazmy bohaté na krevní destičky (PRP, 30%)
K přípravě roztoků prostředku pro přípravu hydrogelů byl použit derivát HA-TA (Mw = 2,81 x 105 g.mol1, DS 2,2 %). Z roztoku A (0,8 ml) prostředku pro přípravu hydrogelů o složení:
HRP
U/ml
CaCl2 2H2O..............................0,5 mol/1 byl přídavkem 1,2 ml PRP připraven prekurzorový roztok hydrogelu pA. Byly použity 2 ml roztoku B prostředku pro přípravu hydrogelů. Složení prekurzorového roztoku pA a roztoku B popisuje tabulka 20.
- TJ CZ 308598 B6
Roztok pA Roztok B
HRP................................0,8 U/ml H2O2.........................4,6 mmol/1
CaCl2 2H2O......................0,2 mol/1 HA-TA......................26 mg/ml
PRP................................60% obj.
Tabulka 20 Složení prekurzorového roztoku pA a roztoku B pro přípravu hydrogelu s obsahem PRP 30% obj.
Hydrogel s obsahem 30 % obj. PRP byl připraven smísením roztoku pA a roztoku B v objemovém poměru 1:1.
Takto připravený hydrogel obsahuje enzym křenovou peroxidázu, vápenaté ionty, kovalentně zesítěný hydroxyfenylový derivát hyaluronanu (crossHA-TA) a PRP v těchto koncentracích:
HRP....................................0,4 U/ml
CaCl2 2H2O...........................0,1 mol/1 crossHA-TA..........................13 mg/ml
PRP....................................30% obj.
Příklad 24
Příprava hydrogelů s obsahem frakce krevní plazmy bohaté na krevní destičky (PRP, 30%)
K přípravě roztoků prostředku pro přípravu hydrogelů byl použit derivát HA-TA (Mw = 1,45 x 106
g.mol1 kDa, DS 1,1 %). Z roztoku A (0,8 ml) prostředku pro přípravu hydrogelů o složení:
HRP.......................................2 U/ml
Ca(H2PO4)2................................0,05 mol/1 byl přídavkem 1,2 ml PRP připraven prekurzorový roztok hydrogelu pA. Byly použity 2 ml roztoku B prostředku pro přípravu hydrogelů. Složení prekurzorového roztoku pA a roztoku B popisuje tabulka 21.
Roztok pA HRP................... .............0,8 U/ml Roztok B
H2O2............... ..........4,6 mmol/1
Ca(H2PO4)2........... ...........0,02 mol/1 HA-TA............ ..........26 mg/ml
PRP.................... ............60 % obj.
Tabulka 21 Složení prekurzorového roztoku pA a roztoku B pro přípravu hydrogelu s obsahem PRP 30% obj.
Hydrogel s obsahem 30 % obj. PRP byl připraven smísením roztoku pA a roztoku B v objemovém poměru 1:1.
Takto připravený hydrogel obsahuje enzym křenovou peroxidázu, vápenaté ionty, kovalentně zesítěný hydroxyfenylový derivát hyaluronanu (crossHA-TA) a PRP v těchto koncentracích:
HRP.........................................0,4 U/ml
-28CZ 308598 B6
Ca(H2PO4)2.................................0,01 mol/1 crossHA-TA.................................13 mg/ml
PRP...........................................30% obj.
Příklad 25
Příprava hydrogelů s obsahem frakce krevní plazmy bohaté na krevní destičky (PRP, 30 % obj.)
K přípravě roztoků prostředku pro přípravu hydrogelů byl použit derivát HA-TA (Mw = 9,5 x 104 g.mol1, DS 8,6 %). Z roztoku A (0,8 ml) prostředku pro přípravu hydrogelů o složení:
HRP........................................2 U/ml
Ca(H2PO4)2................................0,05 mol/1
HA-TA......................................100 mg/ml byl přídavkem 1,2 ml PRP připraven prekurzorový roztok hydrogelu pA. Byly použity 2 ml roztoku B prostředku pro přípravu hydrogelů. Složení prekurzorového roztoku pA a roztoku B popisuje tabulka 22.
Roztok pA Roztok B
HRP..................... ...........0,8 U/ml H2O2............... ..........4,6 mmol/1
Ca(H2PO4)2............. .........0,02 mol/1
HA-TA.................. ...........40 mg/ml
Krevní plazma......... ...........60 % obj.
Tabulka 22 Složení prekurzorového roztoku pA a roztoku B pro přípravu hydrogelu s obsahem PRP 30% obj.
Hydrogel s obsahem 30 % obj. PRP byl připraven smísením roztoku pA a roztoku B v objemovém poměru 1:1.
Takto připravený hydrogel obsahuje enzym křenovou peroxidázu, vápenaté ionty, kovalentně zesítěný hydroxyfenylový derivát hyaluronanu (crossHA-TA) a PRP v těchto koncentracích:
HRP.....................................0,4 U/ml
Ca(H2PO4)2.............................0,01 mol/1 crossHA-TA............................20 mg/ml
Krevní plazma..........................30 % obj.
Příklad 26
Příprava hydrogelů s obsahem krve (5 % obj.)
K přípravě roztoků prostředku pro přípravu hydrogelů byl použit derivát HA-TA (Mw = 2,81 x 105 g.mol1, DS 2,2 %). Z roztoku A (1,8 ml) prostředku pro přípravu hydrogelů o složení:
HRP.......................................0,889 U/ml
CaCl2 2H2O...............................0,223 mol/1
HA-TA..................................15,556 mg/ml, byl přídavkem 0,2 ml krve připraven prekurzorový roztok hydrogel pA. Byly použity 2 ml roztoku
-29CZ 308598 B6
B prostředku pro přípravu hydrogelů. Složení prekurzorového roztoku pA a roztoku B popisuje tabulka 23.
Roztok pA Roztok B
HRP.................... .............0,8 U/ml H2O2............... ..........4,6 mmol/1
CaCl2 2H2O............ ............0,2 mol/1
HA-TA................. ............14 mg/ml
Krev.................... ...........10 % obj.
Tabulka 23: Složení prekurzorového roztoku pA a roztoku B pro přípravu hydrogelu s obsahem krve 5 % obj.
Hydrogel s obsahem 5 % obj. PRP byl připraven smísením roztoku pA a roztoku B v objemovém poměru 1:1.
Takto připravený hydrogel obsahuje enzym křenovou peroxidázu, vápenaté ionty, kovalentně zesítěný hydroxyfenylový derivát hyaluronanu (crossHA-TA) a krev v těchto koncentracích:
HRP..........................................0,4 U/ml
CaCl2-2H2O.................................0,1 mol/1 crossHA-TA....................................7 mg/ml krev.............................................5 % obj.
Odkazy:
[1] Jin R. In-Situ Forming Biomimetic Hydrogels for Tissue Regeneration. In: Uin C, editor. Biomedicine: InTech; 2012.
[2] Sun S, Cao H, Su H, Tan T. Preparation and characterization of a novel injectable in situ cross-linked hydrogel. Polym Bull. 2009;62:699-711.
[3] Sklubalova Z. [In situ gelling polymers for ophthalmic drops]. Česka Slov Farm. 2005;54:410.
[4] Xu X, Jha AK, Harrington DA, Farach-Carson MC, Jia X. Hyaluronic Acid-Based Hydrogels: from a Natural Polysaccharide to Complex Networks. Soft matter. 2012;8:3280-94.
[5] Stem R, Kogan G, Jedrzejas MJ, Soltés U. The many ways to cleave hyaluronan. Biotechnology advances. 2007;25:537-57.
[6] Salwowska NM, Bebenek A, Zadlo DA, Wcislo-Dziadecka DU. Physiochemical properties and application of hyaluronic acid: a systematic review. Journal of Cosmetic Dermatology. 2016;15:520-6.
[7] Tognana E, Borrione A, De Luca C, Pavesio A. Hyalograft C: hyaluronan-based scaffolds in tissue-engineered cartilage. Cells, tissues, organs. 2007;186:97-103.
[8] Buck li DW, Alam M, Kim JYS. Injectable fillers for facial rejuvenation: a review. Journal of Plastic, Reconstructive & Aesthetic Surgery. 2009;62:11-8.
[9] Li P, Raitcheva D, Hawes M, Moran N, Yu X, Wang F, et al. Hylan G-F 20 maintains cartilage integrity and decreases osteophyte formation in osteoarthritis through both anabolic and anti-catabolic mechanisms. Osteoarthritis and cartilage. 2012;20:1336-46.
[10] Prestwich GD. Hyaluronic acid-based clinical biomaterials derived for cell and molecule delivery in regenerative medicine. Journal of controlled release : official journal of the Controlled Release Society. 2011;155:193-9.
[11] Burdick JA, Prestwich GD. Hyaluronic Acid Hydrogels for Biomedical Applications. Advanced Materials. 2011;23:H41-H56.
[12] Calabro A, Akst L, Alam D, Chan J, Darr AB, Fukamachi K, et al. Hydroxyphenyl cross
-30CZ 308598 B6 linked macromolecular network and applications thereof. United States: The Cleveland Clinic Foundation (Cleveland, OH, US); 2008.
[13] Kurisawa M, Uee F, Chung JE. Formation of Hydrogel in the Presence of Peroxidase and Low Concentration of Hydrogen Peroxide 2009.
[14] Lee F, Chung JE, Kurisawa M. An injectable enzymatically crosslinked hyaluronic acidtyramine hydrogel system with independent tuning of mechanical strength and gelation rate. Soft Matter. 2008;4:880-7.
[15] Darr A, Calabro A. Synthesis and characterization of tyramine-based hyaluronan hydrogels. Journal of Materials Science: Materials in Medicine. 2009;20:33-44.
[16] Akkara JA, Senecal KJ, Kaplan DL. Synthesis and characterization of polymers produced by horseradish peroxidase in dioxane. Journal of Polymer Science Part A: Polymer Chemistry. 1991;29:1561-74.
[17] Shutava T, Zheng Z, John V, Lvov Y. Microcapsule modification with peroxidase-catalyzed phenol polymerization. Biomacromolecules. 2004;5:914-21.
[18] Ghan R, Shutava T, Patel A, John VT, Lvov Y. Enzyme-Catalyzed Polymerization of Phenols within Polyelectrolyte Microcapsules. Macromolecules. 2004;37:4519-24.
[19] Higashimura H, Kobayashi S. Oxidative Polymerization: John Wiley & Sons, Inc.; 2002.
[20] Veitch NC. Horseradish peroxidase: a modem view of a classic enzyme. Phytochemistry. 2004;65:249-59.
[21] Kurisawa M, Lee F, Wang L-S, Chung JE. Injectable enzymatically crosslinked hydrogel system with independent tuning of mechanical strength and gelation rate for drug delivery and tissue engineering. Journal of Materials Chemistry. 2010;20:5371-5.
[22] Snyder TN, Madhavan K, Intrator M, Dregalla RC, Park D. A fibrin/hyaluronic acid hydrogel for the delivery of mesenchymal stem cells and potential for articular cartilage repair. Journal of Biological Engineering. 2014;8.
[23] Li Z, Kaplan KM, Wertzel A, Peroglio M, Amit B, Alini M, et al. Biomimetic fibrinhyaluronan hydrogels for nucleus pulposus regeneration. Regenerative medicine. 2014;9:309-26.
[24] Chance B. An intermediate compound in the catalase-hydrogen peroxide reaction. Acta chem scand. 1947;1:236-67.
[25] Odajima T, Yamazaki I. Myeloperoxidase of the leukocyte of normal blood. I. Reaction of myeloperoxidase with hydrogen peroxide. Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Enzymology. 1970;206:71-7.
[26] Giulivi C, Davies KJA. [30] Hydrogen peroxide-mediated ferrylhemoglobin generation in Vitro and in red blood cells. Methods in Enzymology: Academic Press; 1994. p. 490-6.
[27] Gasparro R, Qorri E, Valletta A, Masucci M, Sammartino P, Amato A, et al. NonTransfiisional Hemocomponents: From Biology to the Clinic—A Literature Review. Bioengineering. 2018;5:27.
[28] Sell SA, Ericksen JJ, Bowlin GL. The incorporation and controlled release of platelet-rich plasma-derived biomolecules from polymeric tissue engineering scaffolds. Polymer International. 2012;61:1703-9.
[29] Caroline D. Hoemann MDB, Marc D. Mckee. Composition and method for the repair and regeneration of cartilage and other tissues 2001.
[30] Ahmadi R, Bruijn JDd. Biocompatibility and gelation of chitosan-glycerol phosphate hydrogels. Journal of Biomedical Materials Research Part A. 2008;86A:824-32.
[31] Zan J, Chen H, Jiang G, Lin Y, Ding F. Preparation and properties of crosslinked chitosan thermosensitive hydrogel for injectable drug delivery systems. Journal of Applied Polymer Science. 2006;101:1892-8.
[32] Shive MS, Hoemann CD, Restrepo A, Hurtig MB, Duval N, Ranger P, et al. BST-CarGel: in situ chondroinduction for cartilage repair. Operative Techniques in Orthopaedics. 2006;16:271-8.
[33] Lee H-R, Park KM, Joung YK, Park KD, Do SH. Platelet-rich plasma loaded hydrogel scaffold enhances chondrogenic differentiation and maturation with up-regulation of CB1 and CB2. Journal of Controlled Release. 2012;159:332-7.
[34] Lee F, Kurisawa M. Formation and stability of interpenetrating polymer network hydrogels consisting of fibrin and hyaluronic acid fortissue engineering. Acta Biomaterialia. 2013;9:514352.

Claims (8)

  1. PATENTOVÉ NÁROKY
    1. Sada pro přípravu polymemího hydrogelu obsahujícího kovalentně zesíťovaný hydroxyfenylový derivát hyaluronanu, přičemž hydrogel obsahuje krev nebo alespoň jeden transfuzní přípravek obsahující fibrinogen, vyznačující se tím, že zahrnuje dva oddělené roztoky A a B, z nichž roztok A obsahuje enzym křenovou peroxidázu a roztok B obsahuje peroxid vodíku, přičemž alespoň jeden roztok A nebo B obsahuje vápenaté ionty ve formě farmaceuticky přijatelné soli a dále roztok A a/nebo B obsahuje hydroxyfenylový derivát hyaluronanu obecného vzorce I,
    (I), kde n je v rozmezí 2 až 7500 a kde R je OH nebo substituent NHR2CONHRiArOH obecného vzorce II,
    0 - v (Π), kde Ar je feny len a Ri ethylen, nebo Ar je indoly den a Ri je ethylen, nebo Ar je hydroxyfenylen a Ri je karboxyethylen, a R2 je alkylen o počtu uhlíků 3 až 7.
  2. 2. Sada podle nároku 1, vyznačující se tím, že roztok A obsahuje enzym křenovou peroxidázu o aktivitě 0,5 až 2,25 U/ml, s výhodou 1,8 až 2,2 U/ml, výhodněji 1,0 až 1,3 U/ml a roztok B obsahuje peroxid vodíku 2 až 10 mmol/1, s výhodou 3 až 7 mmol/1, výhodněji 4 až 5 mmol/1, přičemž alespoň jeden roztok A nebo B obsahuje vápenaté ionty v koncentraci 0,05 až 0,55 mol/1, s výhodou 0,25 až 0,55 mol/1, výhodněji 0,25 až 0,45 mmol/1, nejlépe 0,25 až 0,32 mmol/1 a hydroxyfenylový derivát hyaluronanu obecného vzorce I o koncentraci 10 až 125 mg/ml, s výhodou 10 až 35 mg/ml, výhodněji 20 až 26 mg/ml.
  3. 3. Sada podle nároku 1 nebo nároku 2, vyznačující se tím, že hmotnostně střední molámí hmostnost hydroxyfenylového derivátu hyaluronanu obecného vzorce I je v rozsahu 4 x 104 až 3 x 106 g/mol, s výhodou 1x105 až 1x106 g/mol, výhodněji 2x105 až 4x105 g/mol, stupeň substituce hydroxyfenylového derivátu hyaluronanu obecného vzorce I je v rozsahu 1 až 10 %, s výhodou v rozsahu 2 až 5 %, výhodněji 2 až 4 %.
  4. 4. Sada podle kteréhokoliv z nároků 1 až 3, vyznačující se tím, že roztok A obsahuje:
    • hydroxyfenylový derivát hyaluronanu obecného vzorce I o hmotnostně střední molámí hmotnosti v rozmezí 4xl04až3xl06 g/mol se stupněm substituce 1 až 10 % a koncentraci 10 až 125 mg/ml, • křenovou peroxidázu o aktivitě 0,5 až 2,25 U/ml, • vápenaté ionty v koncentraci 0,05 až 0,55 mol/1, a roztok B obsahuje:
    -32CZ 308598 B6 • hydroxyfenylový derivát hyaluronanu obecného vzorce I o hmotnostně střední molámí hmotnosti v rozmezí 4 x 104 až 3 x 106 g/mol, se stupněm substituce 1 až 10 % a koncentraci 10 až 50 mg/ml • peroxid vodíku v rozmezí koncentrace 2 až 10 mmol/1.
  5. 5. Sada podle kteréhokoliv z nároků 1 až 4, vyznačující se tím, že roztok A obsahuje:
    • hydroxyfenylový derivát hyaluronanu obecného vzorce I o hmotnostně střední molámí hmotnosti v rozmezí lxl05ažlxl06 g/mol, se stupněm substituce 2 až 5 %, v koncentraci 10 až 35 mg/ml, • křenovou peroxidázu o aktivitě 0,5 až 2,25 U/ml, • vápenaté ionty v koncentraci 0,05 až 0,55 mol/1, a roztok B obsahuje:
    • hydroxyfenylový derivát hyaluronanu podle obecného vzorce (I) o hmotnostně střední molámí hmotnosti v rozmezí v rozmezí 1 x 105 až 1 x 106 g/mol se stupněm substituce 2 až 5 % a v koncentraci 26 mg/ml, • peroxid vodíku v rozmezí koncentrace 3 až 7 mmol/1.
  6. 6. Sada podle kteréhokoliv z nároků 1 až 5, vyznačující se tím, že roztok A obsahuje:
    • hydroxyfenylový derivát hyaluronanu obecného vzorce I o hmotnostně střední molámí hmotnosti v rozmezí 2xl05až4xl05 g/mol, se stupněm substituce 2 až 5 % a v koncentraci 20 mg/ml, • křenovou peroxidázu o aktivitě 1,0 až 1,3 U/ml, • vápenaté ionty v koncentraci 0,25 až 0,32 mol/1, a roztok B obsahuje:
    • hydroxyfenylový derivát hyaluronanu obecného vzorce I o hmotnostně střední molámí hmotnosti v rozmezí 2 x 105 až 4 x 105 g/mol, stupněm substituce 2 až 5 % a v koncentraci 26 mg/ml, • peroxid vodíku v rozmezí koncentrace 4 až 5 mmol/1.
  7. 7. Sada podle kteréhokoliv z nároků 1 až 3, vyznačující se tím, že roztok A obsahuje:
    • křenovou peroxidázu o aktivitě 1,8 až 2,2 U/ml, • vápenaté ionty v koncentraci 0,45 až 0,55 mol/1 a roztok B obsahuje:
    • hydroxyfenylový derivát hyaluronanu obecného vzorce I o hmotnostně střední molámí hmotnosti v rozmezí 2xl05až4xl05 g/mol, se stupněm substituce 2 až 4 % a v koncentraci 26 mg/ml, • peroxid vodíku v rozmezí koncentrace 4 až 5 mmol/1.
  8. 8. Sada podle kteréhokoliv z nároků 1 až 3, vyznačující se tím, že roztok A obsahuje:
    • křenovou peroxidázu o aktivitě 0,8 až 2,2 U/ml, • vápenaté ionty v koncentraci 0,02 až 0,5 mol/1, • hydroxyfenylový derivát hyaluronanu obecného vzorce I o hmotnostně střední molámí hmotnosti v rozmezí 9xl04až4xl05 g/mol, se stupněm substituce 1 až 10 % a v koncentraci v rozsahu 10 až 50 mg/ml,
    -33 CZ 308598 B6 a roztok B obsahuje:
    • peroxid vodíku v rozmezí koncentrace 4 až 5 mmol/1.
CZ2019-360A 2019-06-10 2019-06-10 Sada pro přípravu hydrogelu na bázi hydroxyfenylového derivátu hyaluronanu, způsob přípravy hydrogelu a jeho použití CZ2019360A3 (cs)

Priority Applications (8)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CZ2019-360A CZ2019360A3 (cs) 2019-06-10 2019-06-10 Sada pro přípravu hydrogelu na bázi hydroxyfenylového derivátu hyaluronanu, způsob přípravy hydrogelu a jeho použití
US17/618,322 US20220378976A1 (en) 2019-06-10 2020-06-09 Means for use in preparation of hydrogel based on hydroxyphenyl derivative of hyaluronan, method of hydrogel preparation and use thereof
BR112021024988A BR112021024988A2 (pt) 2019-06-10 2020-06-09 Meios para uso na preparação de hidrogel, método de preparação de um hidrogel contendo derivado hidroxifenil de hialuronano covalentemente reticulado, hidrogel e uso
EP20751469.6A EP3980029B1 (en) 2019-06-10 2020-06-09 Means for use in preparation of hydrogel based on hydroxyphenyl derivative of hyaluronan, method of hydrogel preparation and use thereof
JP2021572952A JP2022536134A (ja) 2019-06-10 2020-06-09 ヒアルロナンのヒドロキシフェニル誘導体をベースとするハイドロゲルの調製に使用するための手段,ハイドロゲルの調製方法,及びハイドロゲルの使用
PCT/CZ2020/050043 WO2020249143A1 (en) 2019-06-10 2020-06-09 Means for use in preparation of hydrogel based on hydroxyphenyl derivative of hyaluronan, method of hydrogel preparation and use thereof
KR1020227000656A KR20220019775A (ko) 2019-06-10 2020-06-09 히알루로난의 하이드록시페닐 유도체에 기반한 하이드로겔의 제조에 사용하기 위한 수단, 하이드로겔의 제조 방법 및 그 용도
ES20751469T ES2963651T3 (es) 2019-06-10 2020-06-09 Medio para su utilización en la preparación de un hidrogel a base de derivado hidroxifenílico de hialuronano, procedimiento para la preparación del hidrogel y utilización del mismo

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CZ2019-360A CZ2019360A3 (cs) 2019-06-10 2019-06-10 Sada pro přípravu hydrogelu na bázi hydroxyfenylového derivátu hyaluronanu, způsob přípravy hydrogelu a jeho použití

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CZ308598B6 true CZ308598B6 (cs) 2020-12-23
CZ2019360A3 CZ2019360A3 (cs) 2020-12-23

Family

ID=71950371

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CZ2019-360A CZ2019360A3 (cs) 2019-06-10 2019-06-10 Sada pro přípravu hydrogelu na bázi hydroxyfenylového derivátu hyaluronanu, způsob přípravy hydrogelu a jeho použití

Country Status (8)

Country Link
US (1) US20220378976A1 (cs)
EP (1) EP3980029B1 (cs)
JP (1) JP2022536134A (cs)
KR (1) KR20220019775A (cs)
BR (1) BR112021024988A2 (cs)
CZ (1) CZ2019360A3 (cs)
ES (1) ES2963651T3 (cs)
WO (1) WO2020249143A1 (cs)

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113908332B (zh) * 2021-11-15 2022-11-29 中国科学院深圳先进技术研究院 金属过氧化物复合可注射水凝胶及其制备方法和应用

Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2007095175A2 (en) * 2006-02-15 2007-08-23 Massachusetts Institute Of Technology Thermo-responsive materials
WO2007097710A1 (en) * 2006-02-27 2007-08-30 Agency For Science, Technology And Research Curable bone cement
US20120288564A1 (en) * 2011-05-11 2012-11-15 Agency For Science, Technology And Research Interpenetrating polymer network comprising fibrin
WO2013127374A1 (en) * 2012-02-28 2013-09-06 Contipro Biotech S.R.O. Derivates based on hyaluronic acid, capable of forming hydrogels, method of preparation thereof, hydrogels based on said derivatives, method of preparation thereof and use
CZ28434U1 (cs) * 2015-05-18 2015-07-07 Contipro Biotech S.R.O. Nanokompozit na bázi hydroxyfenylového derivátu kyseliny hyaluronové nebo jejísoli obsahující nanočástice fosforečnanu vápenatého
WO2018118862A1 (en) * 2016-12-23 2018-06-28 Lifecell Corporation Injectable hydrogels and applications thereof

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP5563563B2 (ja) * 2008-06-05 2014-07-30 エージェンシー フォー サイエンス, テクノロジー アンド リサーチ ペルオキシダーゼおよび低濃度の過酸化水素の存在下でのヒドロゲルの形成方法
KR101091028B1 (ko) * 2009-07-02 2011-12-09 아주대학교산학협력단 체내 주입형 하이드로젤 및 이의 생의학적 용도
WO2015054125A1 (en) * 2013-10-08 2015-04-16 Trustees Of Tufts College Tunable covalently crosslinked hydrogels and methods of making the same

Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2007095175A2 (en) * 2006-02-15 2007-08-23 Massachusetts Institute Of Technology Thermo-responsive materials
WO2007097710A1 (en) * 2006-02-27 2007-08-30 Agency For Science, Technology And Research Curable bone cement
US20120288564A1 (en) * 2011-05-11 2012-11-15 Agency For Science, Technology And Research Interpenetrating polymer network comprising fibrin
WO2013127374A1 (en) * 2012-02-28 2013-09-06 Contipro Biotech S.R.O. Derivates based on hyaluronic acid, capable of forming hydrogels, method of preparation thereof, hydrogels based on said derivatives, method of preparation thereof and use
CZ28434U1 (cs) * 2015-05-18 2015-07-07 Contipro Biotech S.R.O. Nanokompozit na bázi hydroxyfenylového derivátu kyseliny hyaluronové nebo jejísoli obsahující nanočástice fosforečnanu vápenatého
WO2018118862A1 (en) * 2016-12-23 2018-06-28 Lifecell Corporation Injectable hydrogels and applications thereof

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
K. Xu et al: "Enzyme-mediated hyaluronic acid - tyramine hydrogels for the propagation of human embryonic stem cells in 3D" Acta Biomaterica 24, 159-171 (2015) *
L. Wolfová et al: "Hydrogely na bázi kys. hyaluronové a možnosti jejího využití v tkáňovém inženýrství" Bioimplantologie, Brno 2015 *

Also Published As

Publication number Publication date
EP3980029A1 (en) 2022-04-13
EP3980029B1 (en) 2023-10-11
JP2022536134A (ja) 2022-08-12
BR112021024988A2 (pt) 2022-01-25
WO2020249143A1 (en) 2020-12-17
CZ2019360A3 (cs) 2020-12-23
ES2963651T3 (es) 2024-04-01
KR20220019775A (ko) 2022-02-17
US20220378976A1 (en) 2022-12-01

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Ying et al. In situ formed collagen-hyaluronic acid hydrogel as biomimetic dressing for promoting spontaneous wound healing
Li et al. The preparation of hyaluronic acid grafted pullulan polymers and their use in the formation of novel biocompatible wound healing film
Pandit et al. Periodate oxidized hyaluronic acid-based hydrogel scaffolds for tissue engineering applications
Meng et al. Chitosan/alginate/hyaluronic acid polyelectrolyte composite sponges crosslinked with genipin for wound dressing application
AU2003227050B2 (en) Ester derivatives of hyaluronic acid for the preparation of hydrogel materials by photocuring
Muzzarelli Chitins and chitosans for the repair of wounded skin, nerve, cartilage and bone
Agarwal et al. Hyaluronic acid containing scaffolds ameliorate stem cell function for tissue repair and regeneration
AU738788B2 (en) N-sulphated hyaluronic acid compounds, derivatives thereof and a process for their preparation
KR100674177B1 (ko) 교차 결합된 히알루론산과 그것의 의학적 용도
KR20200130685A (ko) 가교된 히알루론산 및 prp/bmc와의 조합물
Zhang et al. Photopolymerizable thiol-acrylate maleiated hyaluronic acid/thiol-terminated poly (ethylene glycol) hydrogels as potential in-situ formable scaffolds
US7345117B1 (en) Sulphated hyaluronic acid and sulphated derivatives thereof covalently bound to polyurethanes, and the process for their preparation
Gull et al. Hydrogels used for biomedical applications
Chen et al. Preparation of enzymatically cross-linked sulfated chitosan hydrogel and its potential application in thick tissue engineering
Ciarlantini et al. Design of bioactive and biomimetic scaffolds based on chitosan-alginate polyelectrolyte complexes for tissue engineering
CZ308598B6 (cs) Sada pro přípravu hydrogelu na bázi hydroxyfenylového derivátu hyaluronanu, způsob přípravy hydrogelu a jeho použití
CZ33901U1 (cs) Prostředek pro použití k přípravě hydrogelu na bázi hydroxyfenylového derivátu hyaluronanu
KR20150029988A (ko) 손상 조직에 대한 세포 전달 및 조직 재생용 생체재료와 제조방법
CZ33324U1 (cs) Hydrogel na bázi zesíťovaného hydroxyfenylového derivátu kyseliny hyaluronové
Padmanabhan Evaluation of Biodegradability and Cell Functionality of Injectable Glycol Chitosan Hydrogel
Xu Gellan gum based thiol-ene hydrogels with tunable properties for use as tissue engineering scaffolds
Rao Department of Chemical Engineering, National Taiwan University of Science and Technology, Taipei
Nilasaroya Poly (vinyl alcohol) and heparin hydrogels: Synthesis, structure and presentation of signalling molecules for growth factor activation
de Carvalho Development of Hyaluronic Acid, Dextrin and Extracellular Matrix Hydrogels for Cell Expansion
TW201519908A (zh) 一種膠原蛋白材料及其製備方法