CZ308598B6

CZ308598B6 - Sada pro přípravu hydrogelu na bázi hydroxyfenylového derivátu hyaluronanu, způsob přípravy hydrogelu a jeho použití

Info

Publication number: CZ308598B6
Application number: CZ2019-360A
Authority: CZ
Inventors: Martin Pravda; Lenka Kovářová; Ivana Ščigalková; Julie Bystroňová; Evgeniy Toropitsyn; Vladimír Velebný
Original assignee: Contipro A.S.
Priority date: 2019-06-10
Filing date: 2019-06-10
Publication date: 2020-12-23
Also published as: EP3980029A1; EP3980029B1; JP2022536134A; BR112021024988A2; WO2020249143A1; CZ2019360A3; ES2963651T3; KR20220019775A; US20220378976A1

Abstract

Sada pro přípravu hydrogelu, který zahrnuje dva oddělené roztoky A a B, z nichž roztok A obsahuje enzym křenovou peroxidázu a roztok B obsahuje peroxid vodíku, přičemž alespoň jeden roztok A nebo B obsahuje vápenaté ionty ve formě farmaceuticky přijatelné soli a dále roztok A a/nebo B obsahuje hydroxyfenylový derivát hyaluronanu obecného vzorce I , kde n je v rozmezí 2 až 7500 a kde R je OH nebo substituent NHR2CONHR1ArOH obecného vzorce II, kde Ar je fenylen a R1 ethylen, nebo Ar je indolyden a R1 je ethylen, nebo Ar je hydroxyfenylen a R1 je karboxyethylen, a R2 je alkylen o počtu uhlíků 3 až 7. Vynález se dále týká hydrogelu na bázi hydroxyfenylového derivátu hyaluronanu

Description

Sada pro přípravu hydrogelu na bázi hydroxyfenylového derivátu hyaluronanu, způsob přípravy hydrogelu a jeho použití

Oblast techniky

Vynález se týká sady pro přípravu hydrogelů na bázi hydroxyfenylového derivátu hyaluronanu (HATA) s obsahem krve nebo transfuzních přípravků s obsahem fibrinogenu, které mohou sloužit jako biomateriály využitelné v oblasti tkáňového inženýrství, regenerativní medicíny a dalších medicínských oborech. Vynález se dále týká hydrogelu na bázi hydroxyfenylového derivátu hyaluronanu a způsobu jeho přípravy a jeho použití.

Dosavadní stav techniky

Polymemí hydrogely jsou důležitou skupinou materiálů, které slouží pro vývoj léčebných prostředků v oblasti tkáňového inženýrství a regenerativní medicíny. Polymemí hydrogely jsou v těchto oblastech využívány například jako matrice pro řízené uvolňování biologicky aktivních látek a kultivaci buněk, mohou sloužit k augmentaci měkkých tkání, jako dočasná náhrada mezibuněčné hmoty atd.

Z fyzikálně chemického hlediska je polymemí hydrogel disperzní systém složený z disperzního prostředí - vody a disperzního podílu, který je tvořen trojrozměrnou makromolekulám! sítí. Tato síť vytváří souvislou strukturu, která prostupuje celým disperzním prostředím. Spojitéje tedy nejen disperzní prostředí, ale i disperzní podíl. Hydrogely jsou materiály s elastickými vlastnostmi, které jsou důsledkem přítomnosti této spojité trojrozměrné makromolekulámí sítě.

Podle povahy interakcí podílejících se na vzniku polymemí sítě můžeme gely rozdělit na fýzikálně síťované a chemicky síťované (kovalentní gely) [1]. Polymemí síť kovalentních hydrogelů může vznikat např. polymerací monomerů přítomných v roztoku nebo zesítěním původně lineárních řetězců prekurzorových polymerů. K tomu může dojít například vzájemnou reakcí vhodných funkčních skupin polymemích řetězců, nebo pomocí síťovacích činidel obsahujících dvě nebo více funkčních skupin schopných reagovat s výchozím polymerem. Během síťování postupně narůstá velikost polymemí sítě až do okamžiku, kdy prostoupí celý objem disperzní soustavy. Vznik této nekonečné trojrozměrně sítě se označuje jako bod gelace. Nárůst počtu uzlových bodů sítě a počtu zúčastněních polymemích řetězců se ovšem v tomto bodě nemusí zastavit. Hmotnost gelového podílu může i nadále růst na úkor hmotnosti disperzního prostředí. Další průběh síťovací reakce pak vede ke zvýšení hustoty zesítění hydrogelu, která může ovlivňovat např. stabilitu, mechanické vlastnosti a difusní parametry prostředí hydrogelu.

V řadě medicínských aplikací je výhodné, aby ke vzniku polymemí sítě a zformování hydrogelu došlo přímo v místě určeném pro aplikaci materiálu neboli in situ [2, 3], Vznik hydrogelu může být vyvolán specifickými podmínkami (teplota, pH) nebo působením externích podnětů (fyzikálních - UV záření, chemických - iniciátor reakce, přídavek síťovacího činidla apod.).

Vhodná metoda využitelná pro přípravu gelu in situ musí splňovat řadu parametrů:

• proces musí probíhat za fýziologických podmínek • kinetika vzniku gelu a jeho finální vlastnosti (hustota zesítění, mechanické vlastnosti, bobtnavost, difúze látek matricí gelu) musí být dokonale kontrolovatelné a reprodukovatelné • reaktanty ani produkty reakce nesmí působit toxicky • v případě biodegradabilních hydrogelů nesmí být degradační produkty toxické a musí být schopny podstoupit eliminaci z organismu.

Hyaluronan je polysacharid ze skupiny glykosaminoglykanů, který se skládá z disacharidických

- 1 CZ 308598 B6 jednotek složených z D-glukuronové kyseliny a JV-acetylglukosaminu. Jedná se o polysacharid, který je snadno rozpustný ve vodném prostředí, kde v závislosti na molekulové hmotnosti a koncentraci vytváří viskózní roztoky až viskoelastické hydrogely. Hyaluronan je přirozenou složkou mezibuněčné hmoty tkání. Vazbou na specifické povrchové buněčné receptory je molekula hyaluronanu schopna interagovat s buňkami ve svém okolí a regulovat jejich metabolické procesy [4], Hydrogely na bázi hyaluronanu v organismu podstupují přirozenou degradaci působením specifických enzymů (hyaluronidáz), popř. působením reaktivních forem kyslíku, díky čemuž dochází po jejich implantaci do organismu k jejich postupnému vstřebání [5], Pro dosažení mechanicky odolnějších materiálů a z důvodu zpomalení jejich biodegradace byla vyvinuta řada typů hydrogelů na bázi kovalentně zesítěného hyaluronanu. Takové hydrogely jsou často využívány jako materiály pro viskosuplementaci synoviální tekutiny, augmentaci měkkých tkání, podpůrné struktury pro kultivaci a implantaci buněk apod. [6-9],

V minulosti byly rovněž vyvinuty různé typy derivátů hyaluronanu, které jsou schopny podstupovat přechod sol-gel za fýziologických podmínek in situ [10, 11], Pro tyto účely lze využít např. fenolické deriváty hyaluronanu. Calabro et al. [12-14] popisují ve spisech EP 1587945B1 a EP 1773943B1 postup přípravy fenolických derivátů hyaluronanu reakcí karboxylů přítomných ve struktuře D-glukuronové kyseliny hyaluronanu, s aminoalkyl-deriváty fenolu, např. tyraminem. Produktem této reakce jsou amidy hyaluronanu [15],

Zesítění fenolických derivátů hyaluronanu může být iniciováno přídavkem peroxidázy (např. křenové peroxidázy) a zředěného roztoku peroxidu vodíku. Křenová peroxidáza (Horseradish peroxidase, HRP, E.C. 1.11.1.7) je v současné době široce využívána jako katalyzátor organických a biotransformačních reakcí [16-20], Hydrogely na bázi hydroxyfenylových derivátů hyaluronanu mohou být využívány jako injekčně aplikovatelné matrice pro řízené uvolňování látek nebo jako materiály vhodné pro kultivaci a implantaci buněk [21], Wolfová et al. popisují ve spisu CZ 303879 konjugát hyaluronanu a tyraminu obsahující alifatický linker vložený mezi řetězec polymeru a tyramin. Přítomnost alifatického linkeru umožňuje vyšší efektivitu síťovací reakce a dodává síti vyšší elasticitu.

Kurisawa etal. v dokumentu US 8853162 popisují způsob přípravy hydrogelu obsahující vzájemně se prostupující (interpenetrující) sítě na bázi hydroxyfenylového derivátu hyaluronanu a fibrinu. Pro zesítění hydroxyfenylového derivátu hyaluronanu metoda využívá reakci katalyzovanou křenovou peroxidázou. Fibrinová síť vzniká z fibrinogenu působením trombinu. Tento postup poskytuje hydrogely, které jsou ve srovnání s hydrogelem na bázi samotného fibrinu odolnější vůči biodegradačním pochodům. Hydrogely vzniklé kombinací fibrinové sítě a kovalentně zesítěných derivátů hyaluronanu jsou využívány jako matrice pro kultivaci buněk a v budoucnu se mohou uplatnit, např. jako součást léčivých přípravků určených pro tkáňové inženýrství [22, 23], Nevýhodou tohoto řešení je využití krevních derivátů - trombinu a fibrinogenu - získaných zpracováním homologní krve. Tento proces je jednak nákladný a rovněž zcela neeliminuje nebezpečí přenosu infekčních chorob.

Zesítění hydrogelu je zprostředkováno reakcí katalyzovanou křenovou peroxidázou, která vede k oxidaci hydroxyfenylových jader tyraminu za vzniku jejich dimerů, popř. oligomerů. Peroxid vodíku je zdrojem hydroxylových radikálů pro reakce katalyzované křenovou peroxidázou a slouží tedy jako iniciátor síťovací reakce. V prostředí krevní plazmy či krve podléhá peroxid vodíku degradaci vlivem interakce s dalšími enzymy (např. kataláza, myeoloperoxidáza) [24, 25], popř. s hematinem přítomným v hemoglobinu [26], Jedná se o reakce, které konkurují křenovou peroxidázou zprostředkované síťovací reakci, což vede ke snížení účinnosti zesítění hydrogelu. Tento jev se v případě využití krevní plazmy projeví delším časem gelace a nižším elastickým modulem vzniklého hydrogelu. V případě přípravy hydrogelu s obsahem plné krve pak tento jev může vést až k selhání procesu formování hydrogelu.

Krev a z ní připravované transfiizní přípravky jsou v oblasti regenerativní medicíny využívány jako zdroje řady biologicky aktivních látek, které se podílejí na hojení tkáňových defektů, regulaci

- 2 CZ 308598 B6 zánětlivé reakce, diferenciaci progenitorových buněk apod. [27, 28],

Možnost využití kombinace in sítu síťujícího hydrogelu a krve jako materiálu pro podporu hojení tkáňových defektů jez klinického pohledu výhodná, protože nevyžaduje přípravu transfuzního přípravku ani výrobu krevního derivátu. Možnost využití autologní krve zároveň eliminuje riziko přenosu infekčních chorob. Kombinace krve a in situ gelujícího hydrogelu pro podporu hojení tkáňových defektů popisuje např. spis EP 1294414 [29], který využívá směsi krve a chitosanglycerol fosfátu pro výplně tkáňových defektů. Roztoky chitosan-glycerolfosfátu jsou známé pro svou schopnost podstupovat přechod sol-gel při zvýšení teploty roztoku na 37 °C [30, 31], Využití tohoto systému vede k urychlení tvorby krevní sraženiny a ke zrychlení uzavření defektu. Přesto, že je tento proces rychlejší než přirozený vznik krevní sraženiny, v klinické praxi si vyžaduje dočasné přerušení zákroku, které se typicky pohybuje okolo 15 minut [32], a které je nutné k tomu, aby gel dosáhl vhodných mechanických vlastností [29].

Lee et al. [33] popisují využití hydroxyfenylového derivátu želatiny pro přípravu hydrogelů s obsahem frakce krevní plazmy bohaté na krevní destičky, který sloužil jako scaffold pro kultivaci králičích chondrocytů. Implantace tohoto scaffoldu do modelového osteochondrálního defektu vedla k urychlení hojení daného poškození chrupavky. Popsaný systém však nebyl použit k přípravě hydrogelů s obsahem krve.

Podstata vynálezu

Cílem vynálezu je vyvinout prostředek, který umožňuje účinnou přípravu hydrogelu.

Prostředek pro použití k přípravě hydrogelu, jehož podstatou je, že zahrnuje dva oddělené roztoky A a B, z nichž roztok A obsahuje enzym křenovou peroxidázu a roztok B obsahuje peroxid vodíku, přičemž alespoň jeden roztok A nebo B obsahuje vápenaté ionty ve formě farmaceuticky přijatelné soli a dále roztok A a/nebo B obsahuje hydroxyfenylový derivát hyaluronanu obecného vzorce I

(I), kde n je v rozmezí 2 až 7500 a kde Rje OH nebo substituent NHR2C0NHRiAr0H obecného vzorce II,

...A;' '’Rý' (Π) kde Ar je feny len a Ri ethylen, nebo Ar je indoly den a Ri je ethylen, nebo Ar je hydroxyfenyl a Ri je karboxy ethylen, a R2 je alky len o počtu uhlíků 3 až 7.

- 3 CZ 308598 B6

V prostředku podle jednoho provedení vynálezu roztok A obsahuje enzym křenovou peroxidázu o aktivitě 0,5 až 2,25 U/ml, s výhodou 1,8 až 2,2 U/ml, výhodněji 1,0 až 1,3 U/ml a roztok B obsahuje peroxid vodíku 2 až 10mmol/l, s výhodou 3 až 7 mmol/1, výhodněji 4 až 5 mmol/1, přičemž alespoň jeden roztok A nebo B obsahuje vápenaté ionty v koncentraci 0,05 až 0,55 mol/1, s výhodou 0,25 až 0,55 mol/1, výhodněji 0,25 až 0,45 mol/1, nejlépe 0,25 až 0,32 mol/1 a hydroxyfenylový derivát hyaluronanu obecného vzorce I o koncentraci 10 až 125 mg/ml, s výhodou 10 až 35 mg/ml, výhodněji 20 až 26 mg/ml.

Prostředek podle vynálezu zahrnuje dva vodné roztoky A a B, z nichž jeden obsahuje křenovou peroxidázu (roztok A) a druhý peroxid vodíku (roztok B), přičemž alespoň jeden z roztoků obsahuje hydroxyfenylový derivát hyaluronanu obecného vzorce I, a zároveň alespoň jeden z roztoků obsahuje vápenaté ionty ve formě farmaceuticky přijatelných a ve vodě dobře rozpustných solí. Farmaceuticky přijatelné vápenaté soli jsou vybrány ze skupiny obsahující chlorid vápenatý, mléčnan vápenatý, octan vápenatý, glukonát vápenatý, hydrogenuhličitan vápenatý nebo dihydrogenfosforečnan vápenatý, s výhodou ze skupiny obsahující chlorid vápenatý, hydrogenuhličitan vápenatý, mléčnan vápenatý, octan vápenatý, hydrogenfosforečnan vápenatý.

Hydroxyfenylový derivát hyaluronanu obecného vzorce I lze připravit podle postupů uvedených v CZ 303879, kterýje zde zahrnut tímto odkazem.

Polysacharidy, včetně hyaluronanu a z něj připravovaných derivátů, patří mezi polymery tvořené směsí různě dlouhých makromolekul a tvoří tak neuniformní (polydisperzní) systémy. Molámí hmotnost takových polymerů může být vyjádřena jako početně střední molámí hmotnost (Mn) nebo hmotnostně střední molámí hmotnost (Mw). Poměr těchto dvou typů středních molámích hmotností řetězců polymerů (Mw/Mn) vyjadřuje mim neunimorfity (polydisperzity) vzorku polymeru a je označován jako index polydisperzity (PI). Podle dalšího provedení vynálezu je Mw hydroxyfenylového derivátu hyaluronanu podle obecného vzorce I je v rozsahu 4 xlO⁴ až 3 x 10⁶ g/mol, s výhodou 1 xlO⁵ až 1 x 10⁶ g/mol, výhodněji 2 xlO⁵ až 4 x 10⁵ g/mol. PI j e v rozsahu 1 až 3.

Podle dalšího provedení vynálezu je stupeň substituce (DS) hydroxyfenylového derivátu hyaluronanu obecného vzorce I v rozsahu 1 až 10 %, s výhodou 2 až 5 %, výhodněji 2 až 4 %.

Roztoky A, B nebo prekurzorový roztok A jsou vodné roztoky, s výhodou 0,9% vodné roztoky chloridu sodného, tedy roztoky isotonické. tj. se stejnou osmolaritou (308 mOsmol) jako má krevní plazma.

Roztok A popisovaného prostředku slouží k přípravě prekurzorového roztoku hydrogelu, kdy je roztok A prostředku smísen s krví nebo transfuzním přípravkem s obsahem fibrinogenu za vzniku pA. Smísením roztoků pA a B podle tohoto vynálezu v objemovém poměm 1 : 1 dochází ke vzniku gelotvomé směsi, která po zesítění hydroxyfenylového derivátu hyaluronanu poskytuje hydrogel obsahující krev nebo transfuzní přípravek s obsahem fibrinu. Prostředek a způsob přípravy hydrogelů popisovaný v tomto dokumentu umožňuje přípravu hydrogelů, ve kterých krev nebo transfuzní přípravek s obsahem fibrinu tvoří 1 až 30% obj. z celkového objemu finálního hydrogelu.

Podle ještě dalšího provedení vynálezu prostředek zahrnuje roztoky A a B, kde roztok A obsahuje:

• hydroxyfenylový derivát hyaluronanu dle obecného vzorce I o hmotnostně střední molámí hmotnosti v rozmezí 4 x 104 g/mol až 3 x 106 g/mol (a s indexem polydisperzity 1 až 3), ve kterém je DS v rozsahu 1 až 10 %, přičemž je v koncentraci 0 až 125 mg/ml, s výhodou 10 až 125 mg/ml • křenovou peroxidázu o aktivitě 0,5 až 2,25 U/ml • vápenaté ionty v koncentraci 0,05 až 0,55 mol/1

- 4 CZ 308598 B6 a roztok B obsahuje:

• hydroxyfenylový derivát hyaluronanu obecného vzorce I o hmotnostně střední molámí hmotnosti v rozmezí 4 x 10⁴ g/mol až 3 x 10⁶ g/mol (a s indexem polydisperzity 1 až 3), ve kterém je DS v rozsahu 1 až 10 %, přičemž je v koncentraci 10 až 50 mg/ml • peroxid vodíku v rozmezí koncentrace 2 až 10 mmol/1.

Podle dalšího výhodného provedení vynálezu prostředek zahrnuje roztoky A a B, kdy roztok A obsahuje:

• hydroxyfenylový derivát hyaluronanu obecného vzorce I o hmotnostně střední molámí hmotnosti v rozmezí 1 x 10⁵ g/mol až 1 x 10⁶ g/mol (a s indexem polydisperzity 1 až 3), ve kterém DS v rozsahu 2 až 5 %, přičemž je v koncentraci 0 až 35 mg/ml, s výhodou 10 až 35 mg/ml, • křenovou peroxidázu o aktivitě 0,5 až 2,25 U/ml • vápenaté ionty v koncentraci 0,05 až 0,55 mol/1 a roztok B obsahuje:

• hydroxyfenylový derivát hyaluronanu obecného vzorce I o hmotnostně střední molámí hmotnosti v rozmezí 1 x 10⁵ g/mol až 1 x 10⁶ g/mol (a s indexem polydisperzity 1 až 3), ve kterém je DS v rozsahu 2 až 5 %, přičemž je v koncentraci 26 mg/ml • peroxid vodíku v rozmezí koncentrace 3 až 7 mmol/1.

• křenovou peroxidázu o aktivitě 1,8 až 2,2 U/ml • vápenaté ionty v koncentraci 0,45 až 0,55 mol/1 a roztok B obsahuje:

• hydroxyfenylový derivát hyaluronanu obecného vzorce I o hmotnostně střední molámí hmotnosti v rozmezí 2 x 10⁵ g/mol až 4 x 10⁵ g/mol (a s indexem polydisperzity 1 až 3), ve kterém je DS v rozsahu 2 až 4 %, přičemž je v koncentraci 26 mg/ml • peroxid vodíku v rozmezí koncentrace 4 až 5 mmol/1.

• hydroxyfenylový derivát hyaluronanu obecného vzorce I o hmotnostně střední molámí hmotnosti v rozmezí 2 x 10⁵ g/mol až 4 x 10⁵ g/mol (a s indexem polydisperzity 1 až 3), ve kterém DS je v rozsahu výhodněji 2 až 4 %, přičemž je v koncentraci 20 mg/ml • křenovou peroxidázu o aktivitě 1,0 až 1,3 U/ml • vápenaté ionty v koncentraci 0,25 až 0,32 mol/1 a roztok B obsahuje:

• hydroxyfenylový derivát hyaluronanu dle obecného vzorce I o hmotnostně střední molámí hmotnosti v rozmezí 2 x 10⁵ g/mol až 4 x 10⁵ g/mol a s indexem polydisperzity 1 až 3, ve kterém DS je v rozsahu 2 až 4 %, přičemž je, v koncentraci 26 mg/ml • peroxid vodíku v rozmezí koncentrace 4 až 5 mmol/1.

Podle ještě dalšího výhodného provedení vynálezu prostředek zahrnuje roztoky A a B, kdy roztok A obsahuje:

- 5 CZ 308598 B6 • křenovou peroxidázu o aktivitě 0,8 až 2,2 U/ml, • vápenaté ionty v koncentraci 0,05 až 0,5 mol/1, • hydroxyfenylový derivát hyaluronanu obecného vzorce I o hmotnostně střední molámí hmotnosti v rozmezí 9 x 10⁴ až 4 xlO⁵ g/mol, se stupněm substituce 1 až 10 % a v koncentraci v rozsahu 10 až 50 mg/ml, a roztok B obsahuje:

• peroxid vodíku v rozmezí koncentrace 4 až 5 mmol/1.

Ještě dalším provedením vynálezu je způsob přípravy hydrogelu obsahujícího kovalentně zesítěný hydroxyfenylový derivát hyaluronanu, vyznačující se tím, že se připraví oddělené roztoky A a B popsané výše, načež se roztok A smíchá s krví nebo s alespoň jedním transfůzním přípravkem s obsahem fibrinogenu za vzniku prekurzorového roztoku A, který se smíchá s roztokem B.

Do roztoku A se s výhodou přidá 10 až 60 % obj. krve nebo transfuzního přípravku s obsahem fibrinogenu, výhodněji 30 až 60 % obj. Prekurzorový roztok A s roztokem B se s výhodou smíchá v objemovém poměru 1:1.

Podle výhodného provedení způsobu podle vynálezu je nejprve roztok A prostředku smísen s krví nebo transfůzním přípravkem s obsahem fibrinogenu za vzniku prekurzorového roztoku hydrogelu pA, který obsahuje:

• hydroxyfenylový derivát hyaluronanu obecného vzorce I o hmotnostně střední molámí hmotnosti v rozmezí 4 x 10⁴ g/mol až 3 x 10⁶ g/mol (a s indexem polydisperzity 1 až 3), se stupněm substituce 1 až 10 %, v koncentraci 0 až 50 mg/ml, s výhodou 10 až 50 mg/ml, • křenovou peroxidázu o aktivitě 0,2 až 0,9 U/ml, • vápenaté ionty v koncentraci 0,02 až 0,22 mol/1, • 10 až 60 % obj. krve nebo transfuzního přípravku s obsahem fibrinogenu, který je dále smísen v objemovém poměru 1 : 1 s roztokem B výše popsaného prostředku, který obsahuje:

• hydroxyfenylový derivát hyaluronanu obecného vzorce I o hmotnostně střední molámí hmotnosti v rozmezí 4 x 10⁴ g/mol až 3 x 10⁶ g/mol (a s indexem polydisperzity 1 - 3), ve kterém je DS je v rozsahu 1 až 10 %, přičemž je v koncentraci 10 až 50 mg/ml, • peroxid vodíku v rozmezí koncentrace 2 až 10 mmol/1.

Dále je ještě popsáno výhodné provedení způsobu přípravy hydrogelu podle vynálezu, kdy je nejprve roztok A prostředku smísen s krví nebo transfůzním přípravkem s obsahem fibrinogenu za vzniku prekurzorového roztoku hydrogelu pA, který obsahuje:

• hydroxyfenylový derivát hyaluronanu obecného vzorce I o hmotnostně střední molámí hmotnosti v rozmezí 1 x 10⁵ g/mol až 1 x 10⁶ g/mol (a s indexem polydisperzity 1 až 3), ve kterém je DS 2 až 5 %, přičemž je v koncentraci 0 až 14 mg/ml, s výhodou 10 až 14 mg/ml, • křenovou peroxidázu o aktivitě 0,2 až 0,9 U/ml • vápenaté ionty v koncentraci 0,02 až 0,22 mol/1 • 10 až 60 % obj. krve nebo transfuzního přípravku s obsahem fibrinogenu, který je dále smísen v objemovém poměm 1 : 1 s roztokem B výše popsaného prostředku, který obsahuje:

• hydroxyfenylový derivát hyaluronanu obecného vzorce I o hmotnostně střední molámí hmotnosti v rozmezí 1 x 10⁵ g/mol až 1 x 10⁶ g/mol (a s indexem polydisperzity 1 až 3), ve

-6CZ 308598 B6 kterém je DS 2 až 5 %, přičemž je v koncentraci 26 mg/ml • peroxid vodíku v rozmezí koncentrace 3 až 7 mmol/1.

Dále je popsáno výhodné provedení způsobu přípravy hydrogelu podle vynálezu, kdy je nejprve roztok A prostředku smísen s transfůzním přípravkem s obsahem fibrinogenu za vzniku prekurzorového roztoku hydrogelu pA, který obsahuje:

• křenovou peroxidázu o aktivitě 0,7 až 0,9 U/ml, • vápenaté ionty v koncentraci 0,18 až 0,22 mol/1, • 60 % obj. krevní plazmy nebo frakce krevní plazmy bohaté na krevní destičky, který je dále smísen v objemovém poměru 1 : 1 s roztokem B výše popsaného prostředku, který obsahuje:

• hydroxyfenylový derivát hyaluronanu obecného vzorce I o hmotnostně střední molámí hmotnosti v rozmezí 2 x 10⁵ g/mol až 4 x 10⁵ g/mol (a s indexem polydisperzity 1 až 3), ve kterém je DS v rozsahu 2 až 4 %, přičemž jev koncentraci 26 mg/ml • peroxid vodíku v rozmezí koncentrace 4 až 5 mmol/1.

Dále je popsáno ještě další výhodné provedení způsobu přípravy hydrogelu podle vynálezu, kdy je nejprve roztok A prostředku smísen s krví za vzniku prekurzorového roztoku hydrogelu pA, který obsahuje:

• hydroxyfenylový derivát hyaluronanu obecného vzorce I o hmotnostně střední molámí hmotnosti v rozmezí 2 x 10⁵ g/mol až 4 x 10⁵ g/mol (a s indexem polydisperzity 1 až 3), ve které je DS je v rozsahu 2 až 4 %, přičemž je v koncentraci 14 mg/ml • křenovou peroxidázu o aktivitě 0,7 až 0,9 U/ml • vápenaté ionty v koncentraci 0,18 až 0,22 mol/1 • 30% obj. krve, který je dále smísen v objemovém poměm 1 : 1 s roztokem B výše popsaného prostředku, který obsahuje • hydroxyfenylový derivát hyaluronanu vzorce (I) o hmotnostně střední molámí hmotnosti v rozmezí 2 x 10⁵ g/mol 4 x 10⁵ g/mol (a s indexem polydisperzity 1 až 3), ve kterém je DS je v rozsahu 2 až 4 %, přičemž je v koncentraci 26 mg/ml • peroxid vodíku v rozmezí koncentrace 4 až 5 mmol/1.

Podle ještě dalšího provedení vynálezu hydrogely připravené způsobem, jak je popsaný výše, obsahují enzym křenovou peroxidázu o aktivitě 0,1 až 2,5 U/ml, s výhodou 0,25 až 0,45 U/ml, výhodněji 0,35 až 0,45 U/ml, vápenaté ionty v koncentraci 0,01 až 0,11 mol/1, s výhodou 0,09 až 0,11 mol/1, kovalentně zesítěný hydroxyfenylový derivát hyaluronanu o koncentraci 5 až 50 mg/ml, výhodněji 13 až 20 mg/ml a krev nebo transfusní přípravek s obsahem fibrinogenu v koncentraci v rozsahu 5 až 30 % obj. s výhodou 15 až 30 % obj. Elasticita hydrogelů (G) podle vynálezu se může pohybovat v rozmezí od 1 Pa až 3 kPa, s výhodou 1 Pa až 2 kPa.

Podle ještě dalšího provedení vynálezu se hydrogel popsaný výše použije pro výrobu přípravků v kosmetice, medicíně anebo regenerativní medicíně.

S výhodou je takovýto přípravek vybrán ze skupiny přípravků obsahující krytí ran, přípravek pro augmentaci měkkých tkání, přípravky pro viskosuplementaci synoviálních tekutiny, matrice pro řízené uvolňování léčiv, výplně tkáňových defektů, scaffoldy pro tkáňové inženýrství.

Jak již bylo popsáno výše, přípravek podle vynálezu umožňuje přípravu gelotvomé směsi (hydrogelu), která vznikne po smísení hydrogelu prekurzorového roztoku A a roztoku B.

- 7 CZ 308598 B6

Gelotvomá směs (hydrogelu) obsahuje hydroxyfenylový derivát hyaluronanu obecného vzorce I, krev, či transfuzní přípravek obsahující fibrinogen, křenovou peroxidázu, peroxid vodíků a vápenaté ionty ve formě ve vodě rozpustné farmaceuticky přijatelné soli. Tato gelotvomá směs umožňuje vznik hydrogelu na bázi kovalentně zesítěného tyraminovaného derivátu hyaluronanu s obsahem krve či transfuzního přípravku obsahujícího fibrin.

K zesítění hydrogelu přispívá reakce katalyzovaná křenovou peroxidázou, která vede k oxidaci hydroxyfenylových jader tyraminu za vzniku jejich dimerů, popř. oligomerů. Peroxid vodíku je zdrojem hydroxylových radikálů pro reakce katalyzované křenovou peroxidázou a slouží tedy jako iniciátor síťovací reakce.

Překvapivě však bylo zjištěno, že přídavek dostatečného množství vápenatých iontů do alespoň jednoho roztoku A nebo B, jak jsou popsány výše, vede k zefektivnění procesu gelace a navýšení elastického modulu vznikajících hydrogelů. U analogických hydrogelů bez obsahu krve či transfuzního přípravku nebyl tento jev pozorován.

Dále bylo zjištěno, že samotná přítomnost vápenatých iontů v roztoku hydroxyfenylového derivátu nebo jeho směsi s krví či transfuzním přípravkem s obsahem fibrinogenu nevede, bez iniciace enzymatické síťovací reakce hydroxyfenylového derivátu hyaluronanu, ke vzniku hydrogelů. Nejedná se tedy pouze o projev koagulace krve, která může být zvýšenou koncentrací vápníku podpořena, nebo o důsledek interakce vápenatých iontů s polyanionickým řetězcem hydroxyfenylového derivátu hyaluronanu. Není vyloučeno, že všechny zmíněné procesy v gelotvomé směsi hydrogelu probíhají současně. Ke vzniku hydrogelu pravděpodobně dojde interakcí mezi jednotlivými vznikajícími polymemími sítěmi, takže jejich společná velikost překročí kritickou mez a dojde ke vzniku hydrogelu. Na rozdíl od dosud popsaných systémů [34], tak popsané složení prostředku umožňuje přípravu hydrogelu na bázi hydroxyfenylového derivátu hyaluronanu podle obecného vzorce I i v přítomnosti krve.

V případě využití krve, výše popsané gelotvomé směsi umožňují vznik hydrogelu při koncentracích peroxidu vodíku, které nevedou k poškození biologických struktur, a zároveň umožňují využití křenové peroxidázy o aktivitě, která by samostatně nevedla k efektivnímu vzniku hydrogelu v přítomnosti krve či transfuzního přípravku s obsahem fibrinogenu. To výrazně zvyšuje možnost využití prostředku v oblasti tkáňového inženýrství, regenerativní medicíny a dalších medicínských oborech.

Podobný jev lze vypozorovat i v případě přípravy hydrogelů s obsahem plazmy. Peroxid je v plazmě stabilnější, takže přítomnost vápenatých iontů není v daném případě pro vznik hydrogelu nezbytně nutná. Nicméně i v tomto případě vede přítomnost vápenatých iontů k urychlení procesu gelace a navýšení elastického modulu připravených hydrogelů. I tento jev se dá vysvětlit paralelním vznikem fibrinové sítě a sítě na bázi hydroxyfenylového derivátu hyaluronanu.

Vyšší koncentrace vápenatých iontů vedou k inhibici proliferace kultivovaných buněk, což by limitovalo využití prostředku v jako materiálu pro medicínské účely. V prostředku podle vynálezu je množství vápenatých iontů optimalizováno tak, aby bylo dostatečné pro podporu vznikajících hydrogelů podle vynálezu, ale zároveň aby umožňovalo využití připravených hydrogelů podle vynálezu jako matric pro 2D a 3D kultivaci buněk. Možnost využití kombinace krve nebo transfuzních přípravků obsahujících fibrinogen pro přípravu hydrogelů na bázi hydroxyfenylových derivátů hyaluronanu nebyla zatím v literatuře popsána.

Termín „krev“ znamená krev odebraná dárci, člověku nebo zvířeti. Je to surovina pro přípravu transfuzních přípravků.

Termín „transfuzní přípravek s obsahem fibrinogenu“ znamená transfuzní přípravek, který se připraví z krve obvyklými postupy. Patří sem například krevní plazma, frakce krevní plazmy bohatá na krevní destičky (PRP).

-8CZ 308598 B6

Nejedná se o krevní deriváty, což jsou průmyslově vyráběné přípravky, které zahrnují zejména albumin, koagulační faktory a imunoglobuliny lidského původu.

Objasnění výkresů

Obr. 1 Vliv koncentrace vápenatých iontů na rychlost gelace vzorků obsahující transfuzní přípravek - 30 % obj. plazmy, 13 mg/ml roztok HATA, HRP 0,4 U/ml, H2O2 2,3 mM, různá koncentrace CaCh ^FLO v hydrogelu.

Obr. 2 Vliv koncentrace Ca²⁺ (mol/1) na proliferaci 3T3 buněk.

Obr. 3 Cytotoxicita extraktů hydrogelů obsahujících různou koncentraci vápenatých iontů

Obr. 4 Cytotoxicita extraktů hydrogelů obsahujících různý podíl krve/krevní plazmy. Koncentrace vápenatých iontů v gelu je rovna 0,1 mol/1. Uvedená % jsou % obj.

Obr. 5 Vliv koncentrace Ca²⁺ iontů v hydrogelech obsahujících 30 % obj. podíl krevní plazmy.

Obr. 6 Adheze buněk na povrchu hydrogelů - barvení LIVE/DEAD. Uvedená % jsou % obj.

Obr. 7: 3D kultivace buněk - barvení LIVE/DEAD (šipky - adherované buňky). Uvedená % jsou %obj.

Příklady uskutečnění vynálezu

DS = stupeň substituce = 100 % * molámí množství modifikovaných disacharadických jednotek hyaluronanu / molámí množství všech disacharadických jednotek derivátu hyaluronanu. Stupeň substituce byla stanoven pomocí Ή NMR spektroskopií.

Hmotnostně střední molámí hmotnost (Mw) a index polydisperzity (PI) byly stanoveny metodou SEC-MALLS.

Příklad 1

Syntéza tyraminovaného derivátu HA (HA-TA)

Syntéza 6-amino-/V-[2(4hydroxyfenyl)ethyl]hexanamidu

6-[(terc. butoxykarbonyl)amino]hexanová kyselina (1,00 g, 4,3 mmol) byla rozpuštěna v 50 ml tetrahydrofůranu (THF). K roztoku kyseliny byl přidán l,l'-karbodiimidazol (0,70 g, 4,3 mmol). Směs byla zahřívána na 50 °C po dobu šedesáti minut. Poté byla reakční nádoba promyta inertním plynem. K reakční směsi byl přidán tyramin (0,59 g, 4,3 mmol). Směs byla dále zahřívána další 2 hodiny. Poté byl destilací za sníženého tlaku odstraněn THF. Odparek byl rozpuštěn v 50 ml ethylacetátu. Roztok byl promyt 150 ml čištěné vody (rozděleno do tří dílů). Organická vrstva byla vysušena nad molekulovým sítem. Ethylacetát byl odstraněn destilací za sníženého tlaku. Odparek byl rozpuštěn v 50 ml MeOH a k roztoku byly přidány 2 ml trifluoroctové kyseliny (TFA). Roztok byl zahříván 6 hodin pod zpětným chladičem. Rozpouštědlo bylo odstraněno destilací za sníženého tlaku. Odparek byl rozpuštěn v 50 ml ethylacetátu. Roztok byl promyt 150 ml čištěné vody (rozděleno do tří dílů). Organická vrstva byla vysušena nad molekulovým sítem. Ethylacetát byl odstraněn destilací za sníženého tlaku.

m = 0,75 g (70 % teorie)

-9CZ 308598 B6

Ή NMR (D2O, ppm) δ: 1,17 (m, 2 H, y-CH2-hexanové kyseliny); 1,48 (m, 2 H, P-CFE-hexanové kyseliny); 1,58 (m, 2 H, d-QE-hexanové kyseliny); 2,17 (t, 2 H, -CH2-CO-); 2,73 (m, 2 H, -CH2Ph); 2,91 (m, 2 H, -CH₂-NH₂); 3,42 (m, 2 H, -CH2-NH-CO-); 6,83 (d, 2 H, arom); 7,13 (d, 2 H, arom).

¹³C NMR(D20, ppm) δ: 24 (γ-C-hexanové kyseliny); 26 (δ-C-hexanové kyseliny); 33 (β-Chexanové kyseliny); 35 (-C-CO-); 39 (-C-NH2); 40 (C-Ph); 63 (-C-NH-CO-); 115 (C3 arom); 126 (Cl arom); 130 (C2 arom.); 153 (C4 arom); 176 (-CO-).

Příprava aldehydického derivátu (HA-CHO)

Hylauronan (10,00 g, M_w. = 2 x 10⁶ g.mol¹) byl rozpuštěn v 750 ml 2,5% (w/w) roztoku Na2HPO4.12 H2O. Roztok byl vychlazen na 5 °C. K vzniklému roztoku bylo přidáno 2,60 g NaBr a 0,05 g 4-acetamido-2,2,6,6-tetramethylpiperidin-l-oxylu. Po důkladné homogenizaci roztoku byly k reakční směsi přidány 3 ml roztoku NaClO (10 až 15 % dostupného CI2). Reakce pokračovala za stálého míchání 15 min. Reakce byla ukončena přídavkem 100 ml 40% roztoku propan-2-olu. Produkt byl přečištěn ultrafiltrací a izolován precipitací propan-2-olem.

IČ (KBr): 3417, 2886, 2152, 1659, 1620, 1550, 1412, 1378, 1323, 1236, 1204, 1154, 1078, 1038, 945 ,893 cm¹.

Ή NMR (D2O) δ: 2,01 (s, 3 H, CH3-), 3,37 až 3,93 (m, skelet hyaluronanu), 4,46 (s, 1H, anomer), 4,54 (s, 1H anomer., -O-CH(OH)-), 5,27 (geminální glykol -CH-(OH)2).

a) Přípravatyraminovaného derivátu HA s Ce spacerem (Mw ~ 5 x I0⁴ g.mol¹, DS ~ 6 %)

Aldehydický derivát HA (~ 6 x 10⁴ g.mol¹, DS = 9%) (5,00 g) byl rozpuštěn v 500 ml demineralizované vody. Pomocí kyseliny octové bylo pH roztoku upraveno na 3. K roztoku HACHO byl přidán 6-amino-A-[2-(4-hydroxyfenyl)ethyl]hexanamid (meziprodukt (I)) (1,25 g, 5 mmol). Směs byla míchána 2 hodiny při laboratorní teplotě. Poté byl do reakční směsi přidán komplex pikolin-boran (0,270 g, 2,5 mmol). Směs byla míchána dalších 12 hodin při laboratorní teplotě. Produkt byl přečištěn ultrafiltrací a izolován z retentátu precipitací propan- 2-olem. Precipitát byl zbaven vlhkosti a zbytkového propan-2-olu sušením v horkovzdušné sušárně (40 °C, 3 dny).

IČ (KBr): 3425, 2893, 2148, 1660, 1620, 1549, 1412, 1378, 1323, 1236, 1204, 1154, 1078, 1038, 945, 893 cm¹.

Ή NMR (D2O) δ: 1,25 (t, 2 Η, γ -CH2- aminohexanové kyseliny), 1,48 (m, 2 Η, δ -CH2aminohexanové kyseliny) 1,51 (m, 2 Η, β -CH2- aminohexanové kyseliny), 2,01 (s, 3 H, CH3-), 2,65 (m, 2H, Ph-CH2-), 2,73 (m, 2H, 8-CH2- aminohexanové kyseliny), 3,37 až 3,93 (m, skelet hyaluronanu), 4,46 (s, 1H, anomer), 4,54 (s, 1H anomer., -O-CH(OH)-), 6,59 (d, 2H, arom.),

SEC MALLS: Mw = 5,4 x 10⁴ g.mol¹; PI = 1,61

DS (*HNMR): 6,2 %

b) Příprava tyraminovaného derivátu HA s Ce spacerem (Mw » 3x 10⁵ g.mol¹, DS ~ 2 %)

Aldehydický derivát HA (Mw ~ 3 x 10⁵ g.mol¹, DS ~ 9 %) (5,00 g) byl rozpuštěn v 500 ml demineralizované vody. Pomocí kyseliny octové bylo pH roztoku upraveno na 3. K roztoku HACHO byl přidán 6-amino-A-[2-(4-hydroxyfenyl)ethyl]hexanamid (meziprodukt (I)) (0,625 g, 2,5 mmol). Směs byla míchána 2 hodiny při laboratorní teplotě. Poté byl do reakční směsi přidán komplex pikolin-boran (0,270 g, 2,5 mmol). Směs byla míchána dalších 12 hodin při laboratorní teplotě. Produkt byl přečištěn ultrafiltrací a izolován z retentátu precipitací propan-2-olem.

- 10 CZ 308598 B6

Precipitát byl zbaven vlhkosti a zbytkového propan-2-olu sušením v horkovzdušné sušárně (40 °C, 3 dny).

Ή NMR (D2O) δ: 1,25 (t, 2 Η, γ -CH2- aminohexanové kyseliny), 1,48 (m, 2 Η, δ -CH2aminohexanové kyseliny) 1,51 (m, 2 Η, β -CH2- aminohexanové kyseliny), 2,01 (s, 3 H, CH3-), 2,65 (m, 2H, Ph-CH2-), 2,73 (m, 2H, s-CH2- aminohexanové kyseliny), 3,37 až 3,93 (m, skelet hyaluronanu), 4,46 (s, 1H, anomer), 4,54 (s, 1H anomer., -O-CH(OH)-), 6,59 (d, 2H, arom.), 7,01 (d, 2H.arom).

SEC MALLS: Mw = 2,81 x 10⁵ g.mol¹; PI = 1,49

DS (*HNMR): 2,2 %

c) Příprava tyraminovaného derivátu HA s Ce spacerem (Mw~ 1,5 x IO⁶ g.mol¹, DS = 1 %)

Aldehydický derivát HA (~ 1,5 x 10⁶ g.mol¹, DS = 4 %) (5,00 g) byl rozpuštěn v 500 ml demineralizované vody. Pomocí kyseliny octové bylo pH roztoku upraveno na 3. K roztoku HACHO byl přidán 6-amino-N-|2-(4-hydroxyfcnyl)cthyl |hcxanamid (meziprodukt (I)) (0,625 g, 2,5 mmol). Směs byla míchána 2 hodiny při laboratorní teplotě. Poté byl do reakční směsi přidán komplex pikolin-boran (0,270 g, 2,5 mmol). Směs byla míchána dalších 12 hodin při laboratorní teplotě. Produkt byl přečištěn ultrafiltrací a izolován z retentátu precipitací propan-2-olem. Precipitát byl zbaven vlhkosti a zbytkového propan-2-olu sušením v horkovzdušné sušárně (40 °C, 3 dny).

Ή NMR (D2O) δ: 1,25 (t, 2 Η, γ -CH2- aminohexanové kyseliny), 1,48 (m, 2 Η, δ -CH2aminohexanové kyseliny) 1,51 (m, 2 Η, β -CH2- aminohexanové kyseliny), 2,01 (s, 3 H, CH3-), 2,65 (m, 2H, Ph-CH2-), 2,73 (m, 2H, s-Clf- aminohexanové kyseliny), 3,37 až 3,93 (m, skelet hyaluronanu), 4,46 (s, 1H, anomer), 4,54 (s, 1H anomer., -O-CH(OH)-), 6,59 (d, 2H, arom.), 7,01 (d, 2H.arom).

SEC MALLS: Mw = 1,45 x 10⁶ g.mol¹; PI = 1,65

DS CHNMR): 1,1 %

d) Příprava tyraminovaného derivátu HA s Ce spacerem (Mw« 1 x 10⁵ g-mol¹, DS = 8,5 %)

Aldehydický derivát HA (~l x I0⁵ g.mol¹, DS = 10%) (5,00 g) byl rozpuštěn v 500 ml demineralizované vody. Pomocí kyseliny octové bylo pH roztoku upraveno na 3. K roztoku HACHO byl přidán 6-amino-N-|2-(4-hydroxyfcnyl)cthyl |hcxanamid (meziprodukt (I)) (0,625 g, 2,5 mmol). Směs byla míchána 2 hodiny při laboratorní teplotě. Poté byl do reakční směsi přidán komplex pikolin-boran (0,270 g, 2,5 mmol). Směs byla míchána dalších 12 hodin při laboratorní teplotě. Produkt byl přečištěn ultrafiltrací a izolován z retentátu precipitací propan-2-olem. Precipitát byl zbaven vlhkosti a zbytkového propan-2-olu sušením v horkovzdušné sušárně (40 °C, 3 dny).

Ή NMR (D2O) δ: 1,25 (t, 2 Η, γ -CH2- aminohexanové kyseliny), 1,48 (m, 2 Η, δ -CH2

- 11 CZ 308598 B6 aminohexanové kyseliny) 1,51 (m, 2 Η, β -CH2- aminohexanové kyseliny), 2,01 (s, 3 H, CH3-), 2,65 (m, 2H, PI1-CH2-), 2,73 (m, 2H, s-CFL- aminohexanové kyseliny), 3,37 - 3,93 (m, skelet hyaluronanu), 4,46 (s, 1H, anomer), 4,54 (s, 1H anomer., -O-CH(OH)-), 6,59 (d, 2H, arom.), 7,01 (d, 2H. arom).

SEC MALLS: Mw = 9,5 x 10⁴ g.mol^-1; PI = 1,55

DS (*HNMR): 8,6 %

e) Příprava tyraminovaného derivátu HA s Ce spacerem (Mw » 2,5 x 10⁶ g.mol^-1, DS = 1 %)

Aldehydický derivát HA (~2.5 x 10⁶, DS = 4 %) (5,00 g) byl rozpuštěn v 500 ml demineralizované vody. Pomocí kyseliny octové bylo pH roztoku upraveno na 3. K roztoku HA-CHO byl přidán 6amino-W-[2-(4-hydroxyfenyl)ethyl]hexanamid (meziprodukt (I)) (0,625 g, 2,5 mmol). Směs byla míchána 2 hodiny při laboratorní teplotě. Poté byl do reakční směsi přidán komplex pikolin-boran (0,270 g, 2,5 mmol). Směs byla míchána dalších 12 hodin při laboratorní teplotě. Produkt byl přečištěn ultrafiltrací a izolován z retentátu precipitací propan-2-olem. Precipitát byl zbaven vlhkosti a zbytkového propan-2-olu sušením v horkovzdušné sušárně (40 °C , 3 dny).

IČ (KBr): 3425, 2893, 2148, 1660, 1620, 1549, 1412, 1378, 1323, 1236, 1204, 1154, 1078, 1038, 945, 893 cm^-1.

Ή NMR (D2O) δ: 1,25 (t, 2 Η, γ -CH2- aminohexanové kyseliny), 1,48 (m, 2 Η, δ -CH2aminohexanové kyseliny) 1,51 (m, 2 Η, β -CH2- aminohexanové kyseliny), 2,01 (s, 3 H, CH3-), 2,65 (m, 2H, Ph-CH2-), 2,73 (m, 2H, 8-CH2- aminohexanové kyseliny), 3,37 - 3,93 (m, skelet hyaluronanu), 4,46 (s, 1H, anomer), 4,54 (s, 1H anomer., -O-CH(OH)-), 6,59 (d, 2H, arom.), 7,01 (d, 2H arom).

SEC MALLS: Mw = 2,5 x 10⁶ g.mol^-1; PI = 1,65

DS (*HNMR): 1 %

Příklad 2

Vliv přítomnosti vápenatých iontů na vznik hydrogelu v přítomnosti krve

Rychlost gelace byla měřena pomocí rotačního reometru AR-G2 (TA Instrument) za použití geometrie deska-deska (40 mm) a velikostí mezery 400 pm. 525 pl vzorku bylo aplikováno na spodní statickou desku. Pre-shear 2000 1/s za sekundu byl zvolen pro homogenizaci roztoků. Time sweep mód byl zvolen pro stanovení rychlosti gelace při frekvenci 1 Hz a posunu (displacement) 0,001 rad při 37 °C. Elastický a viskózní modul byl stanoven ze závislosti elastického G' a viskózního G'' modulu na čase t. K přípravě roztoků byl použit tyraminovaný derivát hyaluronanu syntetizovaný postupem dle příkladu 1 (Mw = 2,81 x 10⁵ g.mol^-1, DS 2,2 %).

V uvedené tabulce 1 je znázorněn elastický G' a viskózní G'' modul jednotlivých vzorků odečtený při 300 s.

- 12 CZ 308598 B6

Tabulka 1 Složení testovaných gelotvomých směsí

	Koncentrace roztoku HATA (mg/ml)	Koncentrace C aCl₂.2H₂O (mol/1)	Aktivita HRP (U/ml)	KoncentraceH ₂O₂(mmol/1)	Podíl krve ve vzorku (%)	G' (Pa)	G” (Pa)
1	20	-	-	-	15	0,17	1,23
2	20	0,1	-	-	15	0,34	1,06
3	20	0,1	0,4	-	15	0,20	1,15
4	20	-	0,4	-	15	0,24	1,27
5	20	-	-	2,3	15	0,07	0,92
6	20	0,1	0,4	2,3	15	21,80	11,50
7	20		0,4	2,3	15	0,52	1,99

Z uvedených dat je patrné, že pouze u kombinace hydroxyfenylového derivátu hyaluronanu s křenovou peroxidázou, peroxidem vodíku a vápenatých iontů s krví (vzorek 6) dochází ke gelaci elastický modul G' je vyšší než viskózní modul G”. V ostatních případech (vzorky 1 až 5 a 7) je elastický modul nižší než viskózní a nedochází ke gelaci uvedených směsí ani po 24 hodinách.

Příklad 3

Vliv vápenatých iontů na účinnost gelace v přítomnosti krve a transfúzních přípravků

Viskoelastické vlastnosti hydrogelů byly stanoveny pomocí rotačního reometru AR-G2 (TA Instruments) pomocí metody strain sweep při konstantní hodnotě frekvence 1 Hz a posunu (displacement) v rozmezí 10^-3 až 2 radiány. Aby nedocházelo k vyklouznutí připravených hydrogelů během měření, byla použita geometrie s hrubším povrchem (cross-hatched). Pro stanovení byly připraveny hydrogely o průměru 17,5 mm. Hydrogely byly hodnoceny po uplynutí 60 minut od přípravy. K přípravě roztoků byl použit tyraminovaný derivát hyaluronanu syntetizovaný postupem dle příkladu 1 (Mw = 2,8 1 x 10⁵ g.mol¹, DS 2,2 %).

V tabulce 2 jsou uvedeny viskoelastické vlastnosti (elastický G' a viskózní G” modul) hydrogelů připravených bez a s transfůzním přípravkem. Dále je zde demonstrován rozdíl v elastickém modulu u hydrogelů připravených bez a s přítomností vápenatých iontů.

U hydrogelů připravených bez přítomnosti krve či transfúzních přípravků nebyl pozorován nárůst elastického modulu v závislosti na přítomnosti vápenatých iontů. Naopak, hydrogely s obsahem krevní plazmy či krevní plazma bohatá na krevní destičky (PRP) připravené v přítomnosti vápenatých iontů vykazovaly vyšší hodnoty elastického modulu než analogické gely připravené bez přítomnosti vápníku. Prekurzorové roztoky s obsahem krve, ale bez přítomného vápníku, nebyly schopné hydrogel vůbec vytvořit.

- 13 CZ 308598 B6

Tabulka 2 Složení testovaných gelotvomých směsí a vlastnosti z nich vzniklých hydrogelů

	Kone. HATA (mg/ml)	Konc. CaCl₂.2H₂ O (mol/1)	Aktivit a HRP (U/ml)	Konc. H₂O₂(mmol/1)	(obj ./obj.)	G' (Pa)	SD	G” (Pa)	SD
1	13	0,1	0,4	2,3 mM	Bez krve	1028,9	48,8	2,08	0,47
0	1052,6	34,4	4,17	1,53
2	0,1	30 % plazmy	578,3	27,2	2,35	0,18
0	433,7	8,5	2,07	0,05
3	0,1	30 % PRP	548,2	65,5	2,46	0,27
0	360,8	11,7	2,94	0,15
4	20	0,1	Bez krve	1764,0	151,8	1,82	1,06
0	1664,8	91,6	1,86	1,01
5	0,1	15 % Krve	59,0	1,9	20,73	1,85
0	negeluje
6	30	0,1	30 % Krve	1,7	0,3	0,41	0,06
0	negeluje

Příklad 4

Vliv koncentrace vápenatých iontů na rychlost vzniku hydrogelu v přítomnosti krevní plazmy

Rychlost gelace byla stanovena metodikou popsanou v příkladu 2.

Na obr. 1 je znázorněn vliv koncentrace vápenatých iontů na rychlost gelace vzorků obsahujících transfuzní přípravek - 30 % obj. plazmy. S rostoucí koncentrací vápenatých iontů klesá čas gelace.

Příklad 5

Vliv koncentrace vápenatých iontů na proliferaci buněk

Na obr. 2 je uvedena viabilita buněk (fibroblasty linie 3T3) kultivovaných v přítomnosti vápenatých iontů (0,1 až 0,001 mol/1). Buňky byly nasazeny na 24-jamkový kultivační panel v hustotě 15 tis. b./jamku. Druhý den bylo buňkám vyměněno médium; nové médium obsahovalo vápenaté ionty v testovaných koncentracích. Proliferace buněk byla sledována v intervalu 24, 48 a 72 h metodou stanovení ATP pomocí CellTiter-Glo assay. Jako kontrola sloužila DEMI voda v objemu 10 % objemu média.

Norma ISO 10993-5-2009 stanovuje jako hranici cytotoxicity snížení viability ovlivněných buněk o více než 30 % ve srovnání s kontrolou. U koncentrací 0,1 mol/1 až 0,05 mol/1 Ca²⁺ ke snížení viability buněk pod tuto hranici došlo. Přítomnost vápenatých iontů v koncentraci < 0,01 mol/1 nemá negativní vliv na viabilitu buněk.

Příklad 6

Cytotoxicita výluhů hydrogelů obsahujících různou koncentraci vápenatých iontů

Hydrogely byly připraveny z gelotvomé směsi, která vznikla smísením prekurzorového roztoku pA a roztoku B v objemovém poměru 1:1 (složení roztoků a vznikajících hydrogelů viz tabulka 3).

- 14 CZ 308598 B6

Jako zdroj vápenatých iontů byl použit chlorid vápenatý. K přípravě roztoků byl použit tyraminovaný derivát hyaluronanu syntetizovaný postupem dle příkladu 1 (Mw = 2,81xl0⁵ g.mol¹, DS 2,2 %).

Sterilně připravené hydrogely byly přeneseny do plastové zkumavky a zality kultivačním médiem v poměru 9 : 1 (9 ml média/1 g gelu). Extrakce probíhala po dobu 72 h při 37 °C. Buňky linie 3T3 byly nasazeny na 24-jamkový kultivační panel v hustotě 15 tis. b./jamku.

Druhý den bylo buňkám odsáto médium a místo něj byl přidán testovaný extrakt. Proliferace buněk byla sledována v intervalu 24,48 a 72 h metodou stanovení ATP pomocí CellTiter-Glo assay. Jako kontrola sloužilo kultivační médium. Obr. 3 popisuje viabilitu buněk v přítomnosti extraktů hydrogelů obsahujících různou koncentraci vápenatých iontů. Pro viabilitu buněk se jako hraniční ukázala hodnota koncentrace vápenatých iontů v hydrogelu 0,1 mol/1. Při jejím překročení působily extrakty připravené z hydrogelů cytotoxicky.

Tabulka 3: Koncentrace jednotlivých složek v prekurzorového roztoku pA a roztoku Bav gelotvomé směsi vzniklé smísením roztoku pA a roztoku B

Prekurzorový roztok pA	Roztok pB	Gelotvomá směs (hydrogel)
HRP (U/ml)	Ca²⁺(mol/1)	HA-TA (mg/ml)	H₂O₂(mmol/1)	HRP (U/ml)	Ca²⁺(mol/1)	HA-TA (mg/ml)	H2O2 (mmol/1)
0,8	0,1	26	4,6	0,4	0,05	13	2,3
0,14	0,07
0,2	0,1
1	0,5

Příklad 7

Cytotoxicita výluhů hydrogelů obsahujících krev nebo krevní plazmu

Před přípravou hydrogelu byl roztok A smísen s příslušným množstvím krve nebo krevní plazmy za vzniku prekurzorového roztoku pA. Hydrogely byly připraveny z gelotvomé směsi, která vznikla smísením prekurzorového roztoku pA s příměsí krve či krevní plazmy a roztoku B v objemovém poměru 1:1 (složení roztoků a vznikajících hydrogelů viz tabulka 4). Jako zdroj vápenatých iontů byl použit chlorid vápenatý. K přípravě roztoků byl použit tyraminovaný derivát hyaluronanu syntetizovaný postupem dle příkladu 1 (Mw = 2,81 x 10⁵ g.mol¹, DS 2,2 %). Sterilně připravené hydrogely byly přeneseny do plastové zkumavky a zality kultivačním médiem v poměru 9 : 1 (9 ml média/1 g gelu). Extrakce probíhala po dobu 72 h při 37 °C. Buňky linie 3T3 byly nasazeny na 24-jamkový kultivační panel v hustotě 15 tis. b./jamku. Druhý den bylo buňkám odsáto médium a místo něj byl přidán testovaný extrakt. Proliferace buněk byla sledována v intervalu 24,48 a 72 h metodou stanovení ATP pomocí CellTiter-Glo assay. Jako kontrola sloužilo kultivační médium. Výsledky prezentované na obr. 4 dokládají, že extrakty hydrogelů s 15 až 30 % obj. podílem plazmy či krve a s obsahem 0,1 mol/1 vápenatých iontů nemají negativní vliv na viabilitu buněk.

Tabulka 4: Vliv přítomnosti krevní plazmy a krve na cytotoxicitu výluhů hydrogelů - Koncentrace jednotlivých složek v prekurzorovém roztoku pA a roztoku Bav gelotvomé směsi vzniklé smísením roztoku pA a roztoku B

- 15 CZ 308598 B6

Prekurzorový roztok pA	roztok B	Gelotvomá směs (hydrogel)
HRP (U/ml)	Ca²⁺(mol/1)	HA-TA (mg/ml)	o o	HA-TA (mg/ml)	H₂O₂(mmol/1)	HRP (U/ml)	Ca²⁺(mol/1)	HA-TA (mg/ml)	H2O2 (mmol/1)	0 \ 0
0,8	0,2	0	—	26	4,6	0,4	0,1	13	2,3
0	Plazma 60%	26	4,6	13	2,3	Plazma 30%
14	Plazma 30%	26	4,6	20	2,3	Plazma 15 %
14	Krev 30%	26	4,6	20	2,3	Krev 15 %

Příklad 8

Cytotoxicita výluhů hydrogelů obsahujících podíl krevní plazmy a různou koncentraci vápenatých iontů

Dále byl sledován vliv koncentrace vápenatých iontů přítomných v hydrogelů s obsahem krevní plazmy na viabilitu buněk. Pro zhodnocení tohoto parametru byly opět připraveny výluhy hydrogelů. Před přípravou hydrogelů byl roztok A smísen s příslušným množstvím krve nebo krevní plazmy za vzniku prekurzorového roztoku pA. Hydrogely byly připraveny z gelotvomé směsi, která vznikla smísením prekurzorového roztoku pA a roztoku B v objemovém poměru 1:1 (složení roztoků a vznikajících hydrogelů viz tabulka 5). Jako zdroj vápenatých iontů byl použit chlorid vápenatý. K přípravě roztoků byl použit tyraminovaný derivát hyaluronanu syntetizovaný postupem dle příkladu 1 (Mw = 2,81 x 10⁵ g.mol¹, DS 2,2 %). Sterilně připravené hydrogely byly přeneseny do plastové zkumavky a zality kultivačním médiem v poměru 9 : 1 (9 ml média/1 g gelu). Extrakce probíhala po dobu 72 h při 37 °C. Buňky linie 3T3 byly nasazeny na 24-jamkový kultivační panel v hustotě 15 tis. b./jamku. Druhý den bylo buňkám odsáto médium a místo něj byl přidán testovaný extrakt. Proliferace buněk byla sledována v intervalu 24, 48 a 72 h metodou stanovení ATP pomocí CellTiter-Glo assay. Jako kontrola sloužilo kultivační médium. Výsledky prezentované na obr. 5 dokládají, že extrakty připravené z hydrogelů obsahujících 30 % obj. podíl plazmy a vápenaté ionty v koncentračním rozmezí 0 až 0,1 mol/1 nepůsobí cytotoxicky.

Tabulka 5: Vliv koncentrace vápenatých iontů na cytotoxicitu extraktů hydrogelů obsahujících plazmu - Koncentrace jednotlivých složek v prekurzorovém roztoku pA a roztoku Bav gelotvomé směsi vzniklé smísením roztoku pA a roztoku B

- 16CZ 308598 B6

Prekurzorový roztok pA	roztok B	Gelotvomá směs (hydrogel)
HRP (U/ml)	Ca²⁺(mol/1)	HA-TA (mg/ml)	o o	HA-TA (mg/ml)	H₂O₂(mol/1)	HRP (U/ml)	Ca²⁺(mol/1)	HA-TA (mg/ml)	H2O2 (mol/1)	0 0
0,8	0	0	Plazma 60 0/ /0	26	4,6	0,4	0	13	2,3	Plazma 30 0/ /0
0,1	0	Plazma 60 0/ /0	26	4,6	0,05	13	2,3	Plazma 30 0/ /0
0,2	0	Plazma 60 0/ /0	26	4,6	0,1	13	2,3	Plazma 30 0/ /0

Příklad 9

Test adheze buněk k hydrogelovým vrstvám

Roztok A byl smísen s příslušným množstvím krve, krevní plazmy, nebo PRP za vzniku prekurzorového roztoku pA. Hydrogely byly připraveny z gelotvomé směsi, která vznikla smísením prekurzorového roztoku pA s přídavkem krve či transfuzního přípravku a roztoku B v objemovém poměru 1:1 (složení roztoků a vznikajících hydrogelů viz tabulka 6). Jako zdroj vápenatých iontů byl použit chlorid vápenatý. K přípravě roztoků byl použit tyraminovaný derivát hyaluronanu syntetizovaný postupem dle příkladu 1 (Mw = 2,81 x 10⁵g.mol¹, DS 2,2%). Testovanými hydrogely byly povrstveny 24-jamkové kultivační panely. Následně byly na povrh hydrogelové vrstvy nasazeny kmenové buňky v hustotě 13 tis. b./jamku. Růst buněk byl sledován v průběhu 4 dní pomocí barvení LIVE/DEAD.

Adheze kmenových buněk k povrchu materiálu se projevuje typickými změnami v morfologie buněk, kdy buňky zaujímají protáhlý tvar. Obr. 6 dokumentuje, že buňky nejsou schopny adheze k hydrogelu bez přídavku krve či transfuzního přípravku. V tomto případě si buňky i po 4 dnech kultivace zachovávají sférický tvar a nejeví známky interakce s povrchem gelu. Rovněž jejich proliferace je potlačena. Hydrogely s obsahem krve nebo transfuzních přípravků s obsahem fibrinogenu (krevní plazma, PRP) naopak podporují adhezi i proliferaci buněk. Buňky na jejich povrchu zaujímají typický protáhlý tvar jejich počet s dobou kultivace roste. Experiment rovněž prokázal, že přítomnost vápníku ve struktuře hydrogelu není překážkou pro kultivaci na povrchu hydrogelů.

Tabulka 6: 2D adheze kmenových buněk k povrchu hydrogelu - Koncentrace jednotlivých složek v prekurzorovém roztoku pA a roztoku Bav gelotvomé směsi vzniklé smísením roztoku pA a roztoku B

- 17 CZ 308598 B6

Prekurzorový roztok pA	roztok B	Gelotvomá směs (hydrogel)
HRP (U/ml)	Ca²⁺(mol/1)	HA-TA (mg/ml)	0 \ 0	HA-TA (mg/ml)	H2O2 (mmol/1)	HRP (U/ml)	Ca²⁺(mol/1)	HA-TA (mg/ml)	H2O2 (mmol/1)	0 0
0,8	0,1	0	0	26	4,6	0,4	0,05	13	2,3	0
0	Plazma 60%	26	4,6	13	2,3	Plazma 30 %
14	Plazma 30%	26	4,6	20	2,3	Plazma 15 %
0	PRP 60%	26	4,6	13	2,3	PRP 30 %
14	PRP 30%	26	4,6	20	2,3	PRP 15 %

Příklad 10

3D kultivace buněk

Pro enkapsulaci byly využity buňky linie 3T3 myších fibroblastů. Před přípravou hydrogelů byl pelet buněk suspendován v roztoku A. Roztok A byl dále smísen s příslušným množstvím krve, krevní plazmy, nebo PRP za vzniku prekurzorového roztoku pA. Hydrogely byly následně připraveny smísením prekurzorového roztoku A a roztoku B v objemovém poměru 1:1 (složení roztoků a vznikajících hydrogelů viz tabulka 7). Jako zdroj vápenatých iontů byl použit chlorid vápenatý. K přípravě roztoků byl použit tyraminovaný derivát hyaluronanu syntetizovaný postupem dle příkladu 1 (Mw = 2,81xl0⁵ g.mol¹, DS 2,2 %). Sterilně připravené hydrogely byly převedeny do kultivačního panelu a zality kultivačním médiem, kde byly inkubovány po dobu 4 dnů při 37 °C, 5 % CO2. Růst buněk byl sledován pomocí barvení LIVE/DEAD. Výsledky prezentované na obr. 7 dokládají, že systém umožňuje enkapsulaci viabilních buněk do hydrogelů a jejich následnou 3D kultivaci. Buňky v hydrogelech obsahujících transfuzní přípravek jsou schopny adheze.

Tabulka 7: 3D kultivace buněk - Koncentrace jednotlivých složek v prekurzorovém roztoku A a roztoku Bav hydrogelů po smísením roztoků pA a roztoku B.

- 18CZ 308598 B6

Prekurzorový roztok pA	roztok B	Gelotvomá směr (hydrogel)
HRP (U/ml)	Ca²⁺(mol/1)	HA-TA (mg/ml)	z— o o	HA-TA (mg/ml)	H₂O₂(mmol/1)	HRP (U/ml)	(ppui) ₊^3	HA-TA (mg/ml)	H₂O₂(mmol/1)	z— o o
0,8	0,2	0	—	26	4,6	0,4	0,1	13	2,3
0	Plazma 60%	26	4,6	13	2,3	Plazma 30%
0	PRP 60%	26	4,6	13	2,3	PRP 30%
14	Krev 30%	26	4,6	20	2,3	Krev 15 %

Příklad 11

Příprava hydrogelů s obsahem krve 5 % obj.

K přípravě roztoků prostředku pro přípravu hydrogelů byl použit derivát HA-TA (Mw = 5,4 x 10⁴g.mol¹, DS 6,2 %). Z roztoku A (1,8 ml) prostředku pro přípravu hydrogelů o složení:

to HRP..........................................1 U/ml

CaCl₂ 2H₂O...................................0,223 mol/1

HA-TA.......................................55,556 mg/ml, byl přídavkem 0,2 ml krve připraven prekurzorový roztok hydrogel pA. Dále byly použity 2 ml 15 roztoku B prostředku pro přípravu hydrogelů. Složení prekurzorového roztoku pA a roztoku B popisuje tabulka 8.

Roztok pA	Roztok B
HRP...............	......0,9 U/ml	H₂O₂............	.......9,2 mmol/1
CaCl₂ 2H₂O......	......0,2 mol/1	HA-TA.........	.......50 mg/ml
HA-TA...........	......50 mg/ml
Krev..............	......10 % obj.

Tabulka 8: Složení prekurzorového roztoku pA a roztoku B pro přípravu hydrogelu s obsahem krve 20 5 % obj.

Hydrogel s obsahem 5 % obj. krve byl připraven smísením roztoku pA a roztoku B v objemovém poměru 1:1.

Takto připravený hydrogel obsahuje enzym křenovou peroxidázu, vápenaté ionty, kovalentně

- 19CZ 308598 B6 zesítěný hydroxyfenylový derivát hyaluronanu (crossHA-TA) a krev v těchto koncentracích:

HRP...........................................0,45 U/ml

CaCl₂ 2H₂O..................................0,1 mol/1 crossHA-TA.................................50 mg/ml

Krev...........................................5 % obj.

Příklad 12

Příprava hydrogelů s obsahem krve (5 % obj.)

K přípravě roztoků prostředku pro přípravu hydrogelů byl použit derivát HA-TA (Mw = 2,81 x 10⁵g.mol¹, DS 2,2 %). Z roztoku A (1,8 ml) prostředku pro přípravu hydrogelů o složení:

HRP.........

CaCl₂ 2H₂O

HA-TA......

. .0,889 U/ml . .0,223 mol/1 15,556 mg/ml, byl přídavkem 0,2 ml krve připraven prekurzorový roztok hydrogelu pA. Byly použity 2 ml roztoku B prostředku pro přípravu hydrogelů. Složení prekurzorového roztoku pA a roztoku B popisuje tabulka 9.

Roztok pA	Roztok B
HRP...............	.......0,8 U/ml	H₂O₂...........	......4,6 mmol/1
CaCl₂ 2H₂O......	......0,2 mol/1	HA-TA........	......26 mg/ml
HA-TA............	......14 mg/ml
Krev...............	.......10 % obj.

Tabulka 9: Složení prekurzorového roztoku pA a roztoku B pro přípravu hydrogelu s obsahem krve 5 % obj.

Takto připravený hydrogel obsahuje enzym křenovou peroxidázu, vápenaté ionty, kovalentně zesítěný hydroxyfenylový derivát hyaluronanu (crossHA-TA) a krev v těchto koncentracích:

HRP...........................................0,4 U/ml

CaCl₂ 2H₂O.................................0,1 mol/1 crossHA-TA.................................20 mg/ml

Krev..........................................5 % obj.

Příklad 13

Příprava hydrogelů s obsahem krve (5 %)

K přípravě roztoků prostředku pro přípravu hydrogelů byl použit derivát HA-TA (Mw = 1,45 x 10⁶g.mol¹, DS 1,1 %). Z roztoku A (1,8 ml) prostředku pro přípravu hydrogelů o složení:

HRP........................................

CaCl₂ 2H₂O...............................

0,556 U/ml

0,223 mol/1

- 20 CZ 308598 B6

HA-TA

11,112 mg/ml, byl přídavkem 0,2 ml krve připraven prekurzorový roztok hydrogel pA. Byly použity 2 ml roztoku B prostředku pro přípravu hydrogelů. Složení prekurzorového roztoku pA a roztoku B popisuje tabulka 10.

Roztok pA	Roztok B
HRP...............	......0,5 U/ml	H₂O₂..............	.........2,3 mmol/1
CaCl₂ 2H₂O......	......0,2 mol/1	HA-TA...........	.........10 mg/ml
HA-TA...........	......10 mg/ml
Krev...............	......10 % obj.

Tabulka 10: Složení prekurzorového roztoku pA a roztoku B pro přípravu hydrogelu s obsahem krve 5 % obj.

HRP..........................................0,25 U/ml

CaCl₂-2H₂O.................................0,1 mol/1 crossHA-TA.................................10 mg/ml

Krev.............................................5 % obj.

Příklad 14

Přípravahydrogelu s obsahem krve (15 % obj.)

K přípravě roztoků prostředku pro přípravu hydrogelů byl použit derivát HA-TA (Mw = 2,81 x 10⁵g.mol¹, DS 2,2 %). Z roztoku A (1,4 ml) prostředku pro přípravu hydrogelů o složení:

HRP.........

CaCl₂ 2H₂O

HA-TA......

.1,143 U/ml . .0,286 mol/1 20 mg/ml, byl přídavkem 0,6 ml krve připraven prekurzorový roztok hydrogel pA. Byly použity 2 ml roztoku B prostředku pro přípravu hydrogelů. Složení prekurzorového roztoku pA a roztoku B popisuje tabulka 11.

Roztok pA	Roztok B
HRP.................	.........0,8 U/ml	H₂O₂................	...........4,6 mmol/1
CaCl₂ 2H₂O........	.........0,2 mol/1	HA-TA.............	............26 mg/ml
HA-TA.............	........14 mg/ml
Krev.................	.........30% obj.

- 21 CZ 308598 B6

Tabulka 11 Složení prekurzorového roztoku pA a roztoku B pro přípravu hydrogelů s obsahem krve 15 % obj.

Hydrogel s obsahem 15 % obj. krve byl připraven smísením roztoku pA a roztoku B v objemovém poměru 1:1.

Takto připravený hydrogel obsahuje enzym křenovou peroxidázu, vápenaté ionty, kovalentně zesítěný hydroxyfenylový derivát hyaluronanu (crossHA-TA) a krev v těchto

HRP....................................0,4U/ml

CaCl₂-2H₂O...........................0,1mol/1 crossHA-TA...........................20mg/ml

Krev....................................15 % obj.

Příklad 15

Přípravahydrogelů s obsahem krve (30 % obj.)

K přípravě roztoků prostředku pro přípravu hydrogelů byl použit derivát HA-TA (Mw = 5,4 x 10⁴g.mol¹, DS 6,2 %). Z roztoku A (0,8 ml) prostředku pro přípravu hydrogelů o složení:

HRP.......................................2,25 U/ml

CaCl₂ 2H₂O...............................0,5 mol/1

HA-TA..................................125 mg/ml, byl přídavkem 1,2 ml krve připraven prekurzorový roztok hydrogel pA. Byly použity 2 ml roztoku B prostředku pro přípravu hydrogelů. Složení prekurzorového roztoku pA a roztoku B popisuje tabulka 12.

Roztok pA	Roztok B
HRP.................	.........0,9 U/ml	H₂O₂...............	..........9,3 mmol/1
CaCl₂ 2H₂O........	.........0,2 mol/1	HA-TA............	..........50 mg/ml
HA-TA.............	........50 mg/ml
Krev.................	.........60 % obj.

Tabulka 12 Složení prekurzorového roztoku pA a roztoku B pro přípravu hydrogelů s obsahem krve 15 % obj.

Hydrogel s obsahem 30 % obj. krve byl připraven smísením roztoku pA a roztoku B v objemovém poměru 1:1.

HRP...........................................0,45 U/ml

CaCl₂-2H₂O..................................0,1 mol/1 crossHA-TA.................................50 mg/ml

Krev...........................................30% obj.

- 22 CZ 308598 B6

Příklad 16

Příprava hydrogelu s obsahem krve (30 % obj.)

K přípravě roztoků prostředku pro přípravu hydrogelů byl použit derivát HA-TA (Mw = 2,81 x 10⁵g.mol¹, DS 2,2 %). Z roztoku A (0,8 ml) prostředku pro přípravu hydrogelů o složení:

HRP........................................2 U/ml

CaCl₂ 2H₂O................................0,5 mol/1

HA-TA...................................35 mg/ml byl přídavkem 1,2 ml krve připraven prekurzorový roztok hydrogelu pA. Byly použity 2 ml roztoku B prostředku pro přípravu hydrogelů. Složení prekurzorového roztoku pA a roztoku B popisuje tabulka 13.

Roztok pA	Roztok B
HRP.................	.........0,8 U/ml	H₂O₂...............	............4,6 mmol/1
CaCl₂ 2H₂O.........	.........0,2 mol/1	HA-TA............	..........26 mg/ml
HA-TA..............	.........14 mg/ml
Krev.................	.........60 % obj.

Tabulka 13: Složení prekurzorového roztoku pA a roztoku B pro přípravu hydrogelu s obsahem krve 30 % obj.

HRP.......................................0,4 U/ml

CaCl₂-2H₂O..............................0,1 mol/1 crossHA-TA..............................20 mg/ml

Krev.......................................30 % obj.

Příklad 17

Příprava hydrogelu s obsahem krevní plazmy 5 % obj.

HRP.....................................................0,889 U/ml

Ca(HCO₃)₂.................................0,223 mol/1 byl přídavkem 0,2 ml krevní plazmy připraven prekurzorový roztok hydrogelu pA. Byly použity 2 ml roztoku B prostředku pro přípravu hydrogelů. Složení prekurzorového roztoku pA a roztoku B popisuje tabulka 14.

- 23 CZ 308598 B6

Roztok pA HRP...................	.........0,8 U/ml	Roztok B
H₂O₂...............	..........4,6 mmol/1
Ca(HCO₃)₂...........	........0,2 mol/1	HA-TA............	..........26 mg/ml
Krevní plazma.......	.......10 % obj.

Tabulka 14: Složení prekurzorového roztoku pA a roztoku B pro přípravu hydrogelů s obsahem krevní plazmy 5 % obj.

Hydrogel s obsahem 5 % obj. krevní plazmy byl připraven smísením roztoku pA a roztoku B v objemovém poměru 1:1.

Takto připravený hydrogel obsahuje enzym křenovou peroxidázu, vápenaté ionty, kovalentně zesítěný hydroxyfenylový derivát hyaluronanu (crossHA-TA) a krevní plazmu v těchto koncentracích:

HRP..........................................0,4 U/ml

Ca(HCO₃)₂...................................0,1 mol/1 crossHA-TA.................................13 mg/ml

Krevní plazma..............................5 % obj.

Příklad 18

Přípravahydrogelů s obsahem krevní plazmy (15 % obj.)

HRP...........................................

CaCl₂ 2H₂O..................................

1,143 U/ml 0,286 mol/1 byl přídavkem 0,6 ml krevní plazmy připraven prekurzorový roztok hydrogel pA. Jako prekurzorový roztok pB byly použity 2 ml roztoku B prostředku pro přípravu hydrogelů. Složení prekurzorového roztoku pA a roztoku B popisuje tabulka 15.

Roztok pA HRP...................	.........0,8 U/ml	Roztok B
H₂O₂...............	..........4,6 mmol/1
CaCl₂ 2H₂O..........	........0,2 mol/1	HA-TA............	..........26 mg/ml
Krevní plazma.......	........30% obj.

Tabulka 15: Složení prekurzorového roztoku pA a roztoku B pro přípravu hydrogelů s obsahem krevní plazmy 15 % obj.

Hydrogel s obsahem 15 % obj. krevní plazmy byl připraven smísením roztoků pA a roztoku B v objemovém poměru 1:1.

- 24 CZ 308598 B6

HRP...........................................0,4 U/ml

CaCl₂ 2H₂O...................................0,1 mol/1 crossHA-TA.................................13 mg/ml

Krevní plazma...............................15 % obi.

Příklad 19

Příprava hydrogelu s obsahem krevní plazmy (30 % obj.)

HRP.........................................

CaCl₂ 2H₂O................................

U/ml 0,5 mol/1 byl přídavkem 1,2 ml krve připraven prekurzorový roztok hydrogelu pA. Byly použity 2 ml roztoku B prostředku pro přípravu hydrogelů. Složení prekurzorového roztoku pA a roztoku B popisuje tabulka 16.

Roztok pA HRP...................	.........0,8 U/ml	Roztok B
H₂O₂...............	..........4,6 mmol/1
CaCl₂ 2H₂O..........	........0,2 mol/1	HA-TA............	..........26 mg/ml
Krevní plazma.......	........60 % obj.

Tabulka 16 Složení prekurzorového roztoku pA a roztoku B pro přípravu hydrogelu s obsahem krevní plazmy 30 % obj.

Hydrogel s obsahem 30 % obj. krve byl připraven smísením roztoků pA a roztoku B v objemovém poměru 1:1.

HRP........................................0,4 U/ml

CaCl₂ 2H₂O...............................0,1 mol/1 crossHA-TA..............................13 mg/ml

Krevní plazma............................30% obj.

Příklad 20

Příprava hydrogelů s obsahem frakce krevní plazmy bohaté na krevní destičky (PRP, 5 % obj.)

HRP...........................................

Octan vápenatý...............................

0,889 U/ml 0,223 mol/1 byl přídavkem 0,2 ml PRP připraven prekurzorový roztok hydrogelu pA. Byly použity 2 ml roztoku

- 25 CZ 308598 B6

B prostředku pro přípravu hydrogelů. Složení prekurzorového roztoku pA a roztoku B popisuje tabulka 17.

Roztok pA HRP................................0,8 U/ml Octan vápenatý..................0,2 mol/1 PRP................................10% obj.

Roztok B H2O2.........................4,6 mmol/1 HA-TA......................26 mg/ml

Tabulka 17: Složení prekurzorového roztoku pA a roztoku B pro přípravu hydrogelu s obsahem PRP 5 % obj.

Hydrogel s obsahem 5 % obj. PRP byl připraven smísením roztoku pA a roztoku B v objemovém poměru 1:1.

Takto připravený hydrogel obsahuje enzym křenovou peroxidázu, vápenaté ionty, kovalentně zesítěný hydroxyfenylový derivát hyaluronanu (crossHA-TA) a PRP v těchto

HRP...........................................0,4 U/ml

Octan vápenatý...............................0,1 mol/1 crossHA-TA..................................13 mg/ml

PRP.............................................5 %obj.

Příklad 21

K přípravě roztoků prostředku pro přípravu hydrogelů byl použit derivát HA-TA (Mw = 2,81 x 10⁵ g.mol¹, DS 2,2 %). Z roztoku A (1,8 ml) prostředku pro přípravu hydrogelů o složení:

HRP.......................................0,889 U/ml

Mléčnan vápenatý........................0,023 mol/1 byl přídavkem 0,2 ml PRP připraven prekurzorový roztok hydrogelu pA. Byly použity 2 ml roztoku B prostředku pro přípravu hydrogelů. Složení prekurzorového roztoku pA a roztoku B popisuje tabulka 18.

Roztok pA HRP........................	........0,8 U/ml	Roztok B
H2O2................	............4,6 mmol/1
Mléčnan vápenatý........ PRP........................	..........0,02 mol/1 ..........10 % obj.	HA-TA.............	...........26 mg/ml

Tabulka 18: Složení prekurzorového roztoku pA a roztoku B pro přípravu hydrogelu s obsahem PRP 5 % obj.

Takto připravený hydrogel obsahuje enzym křenovou peroxidázu, vápenaté ionty, kovalentně zesítěný hydroxyfenylový derivát hyaluronanu (crossHA-TA) a PRP v těchto koncentracích:

-26CZ 308598 B6

HRP........................................0,4 U/ml

Mléčnan vápenatý........................0,1 mol/1 crossHA-TA..............................13 mg/ml

PRP.........................................5 %obi.

Příklad 22

Příprava hydrogelů s obsahem frakce krevní plazmy bohaté na krevní destičky (PRP, 15%)

K přípravě roztoků prostředku pro přípravu hydrogelů byl použit derivát HA-TA (Mw = 1,45 x 10⁶g.mol¹, DS 1,1 %). Z roztoku A (1,4 ml) prostředku pro přípravu hydrogelů o složení:

HRP.........................................1,143 U/ml

CaCl₂ 2H₂O...............................0,286 mol/1 byl přídavkem 0,6 ml PRP připraven prekurzorový roztok hydrogel pA. Byly použity 2 ml roztoku B prostředku pro přípravu hydrogelů. Složení prekurzorového roztoku pA a roztoku B popisuje tabulka 19.

Roztok pA	Roztok B
HRP................................0,8 U/ml	H₂O₂.........................4,6 mmol/1
CaCl₂ 2H₂O......................0,2 mol/1	HA-TA......................26 mg/ml
PRP................................30% obj.

Tabulka 19: Složení prekurzorového roztoku pA a roztoku B pro přípravu hydrogelu s obsahem PRP 15 %obj.

Hydrogel s obsahem 15 % obj. PRP byl připraven smísením roztoku pA a roztoku B v objemovém poměru 1:1.

HRP........................................0,4 U/ml

PRP.........................................15 %obj.

Příklad 23

Příprava hydrogelů s obsahem frakce krevní plazmy bohaté na krevní destičky (PRP, 30%)

HRP

U/ml

CaCl₂ 2H₂O..............................0,5 mol/1 byl přídavkem 1,2 ml PRP připraven prekurzorový roztok hydrogelu pA. Byly použity 2 ml roztoku B prostředku pro přípravu hydrogelů. Složení prekurzorového roztoku pA a roztoku B popisuje tabulka 20.

- TJ CZ 308598 B6

Roztok pA	Roztok B
HRP................................0,8 U/ml	H₂O₂.........................4,6 mmol/1
CaCl₂ 2H₂O......................0,2 mol/1	HA-TA......................26 mg/ml
PRP................................60% obj.

Tabulka 20 Složení prekurzorového roztoku pA a roztoku B pro přípravu hydrogelu s obsahem PRP 30% obj.

Hydrogel s obsahem 30 % obj. PRP byl připraven smísením roztoku pA a roztoku B v objemovém poměru 1:1.

HRP....................................0,4 U/ml

CaCl₂ 2H₂O...........................0,1 mol/1 crossHA-TA..........................13 mg/ml

PRP....................................30% obj.

Příklad 24

K přípravě roztoků prostředku pro přípravu hydrogelů byl použit derivát HA-TA (Mw = 1,45 x 10⁶

g.mol¹ kDa, DS 1,1 %). Z roztoku A (0,8 ml) prostředku pro přípravu hydrogelů o složení:

HRP.......................................2 U/ml

Ca(H₂PO₄)₂................................0,05 mol/1 byl přídavkem 1,2 ml PRP připraven prekurzorový roztok hydrogelu pA. Byly použity 2 ml roztoku B prostředku pro přípravu hydrogelů. Složení prekurzorového roztoku pA a roztoku B popisuje tabulka 21.

Roztok pA HRP...................	.............0,8 U/ml	Roztok B
H₂O₂...............	..........4,6 mmol/1
Ca(H₂PO₄)₂...........	...........0,02 mol/1	HA-TA............	..........26 mg/ml
PRP....................	............60 % obj.

Tabulka 21 Složení prekurzorového roztoku pA a roztoku B pro přípravu hydrogelu s obsahem PRP 30% obj.

HRP.........................................0,4 U/ml

-28CZ 308598 B6

Ca(H₂PO₄)₂.................................0,01 mol/1 crossHA-TA.................................13 mg/ml

PRP...........................................30% obj.

Příklad 25

Příprava hydrogelů s obsahem frakce krevní plazmy bohaté na krevní destičky (PRP, 30 % obj.)

K přípravě roztoků prostředku pro přípravu hydrogelů byl použit derivát HA-TA (Mw = 9,5 x 10⁴g.mol¹, DS 8,6 %). Z roztoku A (0,8 ml) prostředku pro přípravu hydrogelů o složení:

HRP........................................2 U/ml

Ca(H₂PO₄)₂................................0,05 mol/1

HA-TA......................................100 mg/ml byl přídavkem 1,2 ml PRP připraven prekurzorový roztok hydrogelu pA. Byly použity 2 ml roztoku B prostředku pro přípravu hydrogelů. Složení prekurzorového roztoku pA a roztoku B popisuje tabulka 22.

Roztok pA		Roztok B
HRP.....................	...........0,8 U/ml	H₂O₂...............	..........4,6 mmol/1
Ca(H₂PO₄)₂.............	.........0,02 mol/1
HA-TA..................	...........40 mg/ml
Krevní plazma.........	...........60 % obj.

Tabulka 22 Složení prekurzorového roztoku pA a roztoku B pro přípravu hydrogelu s obsahem PRP 30% obj.

HRP.....................................0,4 U/ml

Ca(H₂PO₄)₂.............................0,01 mol/1 crossHA-TA............................20 mg/ml

Krevní plazma..........................30 % obj.

Příklad 26

Příprava hydrogelů s obsahem krve (5 % obj.)

HRP.......................................0,889 U/ml

CaCl₂ 2H₂O...............................0,223 mol/1

HA-TA..................................15,556 mg/ml, byl přídavkem 0,2 ml krve připraven prekurzorový roztok hydrogel pA. Byly použity 2 ml roztoku

-29CZ 308598 B6

B prostředku pro přípravu hydrogelů. Složení prekurzorového roztoku pA a roztoku B popisuje tabulka 23.

Roztok pA	Roztok B
HRP....................	.............0,8 U/ml	H₂O₂...............	..........4,6 mmol/1
CaCl₂ 2H₂O............	............0,2 mol/1
HA-TA.................	............14 mg/ml
Krev....................	...........10 % obj.

Tabulka 23: Složení prekurzorového roztoku pA a roztoku B pro přípravu hydrogelu s obsahem krve 5 % obj.

HRP..........................................0,4 U/ml

CaCl₂-2H₂O.................................0,1 mol/1 crossHA-TA....................................7 mg/ml krev.............................................5 % obj.

Odkazy:

[1] Jin R. In-Situ Forming Biomimetic Hydrogels for Tissue Regeneration. In: Uin C, editor. Biomedicine: InTech; 2012.

[2] Sun S, Cao H, Su H, Tan T. Preparation and characterization of a novel injectable in situ cross-linked hydrogel. Polym Bull. 2009;62:699-711.

[3] Sklubalova Z. [In situ gelling polymers for ophthalmic drops]. Česka Slov Farm. 2005;54:410.

[4] Xu X, Jha AK, Harrington DA, Farach-Carson MC, Jia X. Hyaluronic Acid-Based Hydrogels: from a Natural Polysaccharide to Complex Networks. Soft matter. 2012;8:3280-94.

[5] Stem R, Kogan G, Jedrzejas MJ, Soltés U. The many ways to cleave hyaluronan. Biotechnology advances. 2007;25:537-57.

[6] Salwowska NM, Bebenek A, Zadlo DA, Wcislo-Dziadecka DU. Physiochemical properties and application of hyaluronic acid: a systematic review. Journal of Cosmetic Dermatology. 2016;15:520-6.

[7] Tognana E, Borrione A, De Luca C, Pavesio A. Hyalograft C: hyaluronan-based scaffolds in tissue-engineered cartilage. Cells, tissues, organs. 2007;186:97-103.

[8] Buck li DW, Alam M, Kim JYS. Injectable fillers for facial rejuvenation: a review. Journal of Plastic, Reconstructive & Aesthetic Surgery. 2009;62:11-8.

[9] Li P, Raitcheva D, Hawes M, Moran N, Yu X, Wang F, et al. Hylan G-F 20 maintains cartilage integrity and decreases osteophyte formation in osteoarthritis through both anabolic and anti-catabolic mechanisms. Osteoarthritis and cartilage. 2012;20:1336-46.

[10] Prestwich GD. Hyaluronic acid-based clinical biomaterials derived for cell and molecule delivery in regenerative medicine. Journal of controlled release : official journal of the Controlled Release Society. 2011;155:193-9.

[11] Burdick JA, Prestwich GD. Hyaluronic Acid Hydrogels for Biomedical Applications. Advanced Materials. 2011;23:H41-H56.

[12] Calabro A, Akst L, Alam D, Chan J, Darr AB, Fukamachi K, et al. Hydroxyphenyl cross

-30CZ 308598 B6 linked macromolecular network and applications thereof. United States: The Cleveland Clinic Foundation (Cleveland, OH, US); 2008.

[13] Kurisawa M, Uee F, Chung JE. Formation of Hydrogel in the Presence of Peroxidase and Low Concentration of Hydrogen Peroxide 2009.

[14] Lee F, Chung JE, Kurisawa M. An injectable enzymatically crosslinked hyaluronic acidtyramine hydrogel system with independent tuning of mechanical strength and gelation rate. Soft Matter. 2008;4:880-7.

[15] Darr A, Calabro A. Synthesis and characterization of tyramine-based hyaluronan hydrogels. Journal of Materials Science: Materials in Medicine. 2009;20:33-44.

[16] Akkara JA, Senecal KJ, Kaplan DL. Synthesis and characterization of polymers produced by horseradish peroxidase in dioxane. Journal of Polymer Science Part A: Polymer Chemistry. 1991;29:1561-74.

[17] Shutava T, Zheng Z, John V, Lvov Y. Microcapsule modification with peroxidase-catalyzed phenol polymerization. Biomacromolecules. 2004;5:914-21.

[18] Ghan R, Shutava T, Patel A, John VT, Lvov Y. Enzyme-Catalyzed Polymerization of Phenols within Polyelectrolyte Microcapsules. Macromolecules. 2004;37:4519-24.

[19] Higashimura H, Kobayashi S. Oxidative Polymerization: John Wiley & Sons, Inc.; 2002.

[20] Veitch NC. Horseradish peroxidase: a modem view of a classic enzyme. Phytochemistry. 2004;65:249-59.

[21] Kurisawa M, Lee F, Wang L-S, Chung JE. Injectable enzymatically crosslinked hydrogel system with independent tuning of mechanical strength and gelation rate for drug delivery and tissue engineering. Journal of Materials Chemistry. 2010;20:5371-5.

[22] Snyder TN, Madhavan K, Intrator M, Dregalla RC, Park D. A fibrin/hyaluronic acid hydrogel for the delivery of mesenchymal stem cells and potential for articular cartilage repair. Journal of Biological Engineering. 2014;8.

[23] Li Z, Kaplan KM, Wertzel A, Peroglio M, Amit B, Alini M, et al. Biomimetic fibrinhyaluronan hydrogels for nucleus pulposus regeneration. Regenerative medicine. 2014;9:309-26.

[24] Chance B. An intermediate compound in the catalase-hydrogen peroxide reaction. Acta chem scand. 1947;1:236-67.

[25] Odajima T, Yamazaki I. Myeloperoxidase of the leukocyte of normal blood. I. Reaction of myeloperoxidase with hydrogen peroxide. Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Enzymology. 1970;206:71-7.

[26] Giulivi C, Davies KJA. [30] Hydrogen peroxide-mediated ferrylhemoglobin generation in Vitro and in red blood cells. Methods in Enzymology: Academic Press; 1994. p. 490-6.

[27] Gasparro R, Qorri E, Valletta A, Masucci M, Sammartino P, Amato A, et al. NonTransfiisional Hemocomponents: From Biology to the Clinic—A Literature Review. Bioengineering. 2018;5:27.

[28] Sell SA, Ericksen JJ, Bowlin GL. The incorporation and controlled release of platelet-rich plasma-derived biomolecules from polymeric tissue engineering scaffolds. Polymer International. 2012;61:1703-9.

[29] Caroline D. Hoemann MDB, Marc D. Mckee. Composition and method for the repair and regeneration of cartilage and other tissues 2001.

[30] Ahmadi R, Bruijn JDd. Biocompatibility and gelation of chitosan-glycerol phosphate hydrogels. Journal of Biomedical Materials Research Part A. 2008;86A:824-32.

[31] Zan J, Chen H, Jiang G, Lin Y, Ding F. Preparation and properties of crosslinked chitosan thermosensitive hydrogel for injectable drug delivery systems. Journal of Applied Polymer Science. 2006;101:1892-8.

[32] Shive MS, Hoemann CD, Restrepo A, Hurtig MB, Duval N, Ranger P, et al. BST-CarGel: in situ chondroinduction for cartilage repair. Operative Techniques in Orthopaedics. 2006;16:271-8.

[33] Lee H-R, Park KM, Joung YK, Park KD, Do SH. Platelet-rich plasma loaded hydrogel scaffold enhances chondrogenic differentiation and maturation with up-regulation of CB1 and CB2. Journal of Controlled Release. 2012;159:332-7.

[34] Lee F, Kurisawa M. Formation and stability of interpenetrating polymer network hydrogels consisting of fibrin and hyaluronic acid fortissue engineering. Acta Biomaterialia. 2013;9:514352.

Claims

PATENTOVÉ NÁROKY

1. Sada pro přípravu polymemího hydrogelu obsahujícího kovalentně zesíťovaný hydroxyfenylový derivát hyaluronanu, přičemž hydrogel obsahuje krev nebo alespoň jeden transfuzní přípravek obsahující fibrinogen, vyznačující se tím, že zahrnuje dva oddělené roztoky A a B, z nichž roztok A obsahuje enzym křenovou peroxidázu a roztok B obsahuje peroxid vodíku, přičemž alespoň jeden roztok A nebo B obsahuje vápenaté ionty ve formě farmaceuticky přijatelné soli a dále roztok A a/nebo B obsahuje hydroxyfenylový derivát hyaluronanu obecného vzorce I,

(I), kde n je v rozmezí 2 až 7500 a kde R je OH nebo substituent NHR2CONHRiArOH obecného vzorce II,

0 - v (Π), kde Ar je feny len a Ri ethylen, nebo Ar je indoly den a Ri je ethylen, nebo Ar je hydroxyfenylen a Ri je karboxyethylen, a R2 je alkylen o počtu uhlíků 3 až 7.
2. Sada podle nároku 1, vyznačující se tím, že roztok A obsahuje enzym křenovou peroxidázu o aktivitě 0,5 až 2,25 U/ml, s výhodou 1,8 až 2,2 U/ml, výhodněji 1,0 až 1,3 U/ml a roztok B obsahuje peroxid vodíku 2 až 10 mmol/1, s výhodou 3 až 7 mmol/1, výhodněji 4 až 5 mmol/1, přičemž alespoň jeden roztok A nebo B obsahuje vápenaté ionty v koncentraci 0,05 až 0,55 mol/1, s výhodou 0,25 až 0,55 mol/1, výhodněji 0,25 až 0,45 mmol/1, nejlépe 0,25 až 0,32 mmol/1 a hydroxyfenylový derivát hyaluronanu obecného vzorce I o koncentraci 10 až 125 mg/ml, s výhodou 10 až 35 mg/ml, výhodněji 20 až 26 mg/ml.
3. Sada podle nároku 1 nebo nároku 2, vyznačující se tím, že hmotnostně střední molámí hmostnost hydroxyfenylového derivátu hyaluronanu obecného vzorce I je v rozsahu 4 x 10⁴ až 3 x 10⁶ g/mol, s výhodou 1x10⁵ až 1x10⁶ g/mol, výhodněji 2x10⁵ až 4x10⁵ g/mol, stupeň substituce hydroxyfenylového derivátu hyaluronanu obecného vzorce I je v rozsahu 1 až 10 %, s výhodou v rozsahu 2 až 5 %, výhodněji 2 až 4 %.
4. Sada podle kteréhokoliv z nároků 1 až 3, vyznačující se tím, že roztok A obsahuje:

• hydroxyfenylový derivát hyaluronanu obecného vzorce I o hmotnostně střední molámí hmotnosti v rozmezí 4xl0⁴až3xl0⁶ g/mol se stupněm substituce 1 až 10 % a koncentraci 10 až 125 mg/ml, • křenovou peroxidázu o aktivitě 0,5 až 2,25 U/ml, • vápenaté ionty v koncentraci 0,05 až 0,55 mol/1, a roztok B obsahuje:

-32CZ 308598 B6 • hydroxyfenylový derivát hyaluronanu obecného vzorce I o hmotnostně střední molámí hmotnosti v rozmezí 4 x 10⁴ až 3 x 10⁶ g/mol, se stupněm substituce 1 až 10 % a koncentraci 10 až 50 mg/ml • peroxid vodíku v rozmezí koncentrace 2 až 10 mmol/1.
5. Sada podle kteréhokoliv z nároků 1 až 4, vyznačující se tím, že roztok A obsahuje:

• hydroxyfenylový derivát hyaluronanu obecného vzorce I o hmotnostně střední molámí hmotnosti v rozmezí lxl0⁵ažlxl0⁶ g/mol, se stupněm substituce 2 až 5 %, v koncentraci 10 až 35 mg/ml, • křenovou peroxidázu o aktivitě 0,5 až 2,25 U/ml, • vápenaté ionty v koncentraci 0,05 až 0,55 mol/1, a roztok B obsahuje:

• hydroxyfenylový derivát hyaluronanu podle obecného vzorce (I) o hmotnostně střední molámí hmotnosti v rozmezí v rozmezí 1 x 10⁵ až 1 x 10⁶ g/mol se stupněm substituce 2 až 5 % a v koncentraci 26 mg/ml, • peroxid vodíku v rozmezí koncentrace 3 až 7 mmol/1.
6. Sada podle kteréhokoliv z nároků 1 až 5, vyznačující se tím, že roztok A obsahuje:

• hydroxyfenylový derivát hyaluronanu obecného vzorce I o hmotnostně střední molámí hmotnosti v rozmezí 2xl0⁵až4xl0⁵ g/mol, se stupněm substituce 2 až 5 % a v koncentraci 20 mg/ml, • křenovou peroxidázu o aktivitě 1,0 až 1,3 U/ml, • vápenaté ionty v koncentraci 0,25 až 0,32 mol/1, a roztok B obsahuje:

• hydroxyfenylový derivát hyaluronanu obecného vzorce I o hmotnostně střední molámí hmotnosti v rozmezí 2 x 10⁵ až 4 x 10⁵ g/mol, stupněm substituce 2 až 5 % a v koncentraci 26 mg/ml, • peroxid vodíku v rozmezí koncentrace 4 až 5 mmol/1.
7. Sada podle kteréhokoliv z nároků 1 až 3, vyznačující se tím, že roztok A obsahuje:

• křenovou peroxidázu o aktivitě 1,8 až 2,2 U/ml, • vápenaté ionty v koncentraci 0,45 až 0,55 mol/1 a roztok B obsahuje:

• hydroxyfenylový derivát hyaluronanu obecného vzorce I o hmotnostně střední molámí hmotnosti v rozmezí 2xl0⁵až4xl0⁵ g/mol, se stupněm substituce 2 až 4 % a v koncentraci 26 mg/ml, • peroxid vodíku v rozmezí koncentrace 4 až 5 mmol/1.
8. Sada podle kteréhokoliv z nároků 1 až 3, vyznačující se tím, že roztok A obsahuje:

• křenovou peroxidázu o aktivitě 0,8 až 2,2 U/ml, • vápenaté ionty v koncentraci 0,02 až 0,5 mol/1, • hydroxyfenylový derivát hyaluronanu obecného vzorce I o hmotnostně střední molámí hmotnosti v rozmezí 9xl0⁴až4xl0⁵ g/mol, se stupněm substituce 1 až 10 % a v koncentraci v rozsahu 10 až 50 mg/ml,

-33 CZ 308598 B6 a roztok B obsahuje:

• peroxid vodíku v rozmezí koncentrace 4 až 5 mmol/1.