CZ28434U1

CZ28434U1 - Nanokompozit na bázi hydroxyfenylového derivátu kyseliny hyaluronové nebo jejísoli obsahující nanočástice fosforečnanu vápenatého

Info

Publication number: CZ28434U1
Application number: CZ2015-31093U
Authority: CZ
Inventors: Lucie Wolfová; Julie Bystroňová; Martin Pravda; Vladimír Velebný
Original assignee: Contipro Biotech S.R.O.
Priority date: 2015-05-18
Filing date: 2015-05-18
Publication date: 2015-07-07

Description

Úřad průmyslového vlastnictví v zápisném řízení nezjišťuje, zda předmět užitného vzoru splňuje podmínky způsobilosti k ochraně podle § 1 zák. č. 478/1992 Sb.

Nanokompozit na bázi hydroxyfenylového derivátu kyseliny hyaluronové nebo její soli obsahující nanočástice fosforečnanu vápenatého

Oblast techniky

Užitný vzor se týká nanokompozitu hydroxyfenylového derivátu kyseliny hyaluronové nebo její soli, obsahující nanočástice fosforečnanu vápenatého.

Dosavadní stav techniky

Hydrogely jsou tvořeny ve vodě nerozpustnou sítí alespoň částečně hydrofilních polymerů (Slaughter, B. V. a kol., Advanced Materials 2009, 21, 3307). Hydrogely na bázi biopolymerů kompatibilních s lidskými tkáněmi se stále častěji uplatňují v tkáňovém inženýrství a regenerativní medicíně, kde mohou sloužit např. jako matrice pro kultivaci buněk nebo jako náhrada extracelulámí matrix poškozených tkání (Hoffman, A. S. Annals of the New York Academy of Sciences 2001, 944, 62). Pro tyto účely je jako polymemí složka hydrogelů s výhodou často využívána kyselina hyaluronová a její deriváty. Hyaluronová kyselina je vysokomolekulámí glykosaminoglykan, který je nezbytnou součástí extracelulámí matrix tkání živočišných organismů a vyznačuje se širokou paletou biologických účinků. Jedná se o polysacharid, který se skládá z disacharidických jednotek složených z D-glukuronové kyseliny a D-N-acetylglukosaminu vázaných alternujícími β-1,4 a β-1,3 glykosidickými vazbami. Hmotnostní průměr molekulové hmotnosti in vivo bývá v rozsahu 3xl0³ g.mol'¹ až 15xl0⁶ g.mol'¹ (Xu, X. a kol. Soft Matter 2012, 8, 3280). Jeho značnou nevýhodou je to, že je plně rozpustný ve vodě a ve své nativní podobě je v organismu poměrně rychle rozkládán. Z tohoto důvodu jsou často využívány chemicky modifikované deriváty hyaluronové kyseliny, které mají rozpustnost sníženou, nebo se po jejich zesíťovaní stanou nerozpustné.

Příprava rozpustných derivátů hyaluronové kyseliny a jejich následné zesíťovaní bylo popsáno řadou autorů. Rovněž bylo v minulosti popsáno využití fenolického derivátu hyaluronové kyseliny pro síťovací reakce a přípravu hydrogelů. Calabro et, al, popisují přípravu fenolických derivátů hyaluronové kyseliny reakcí karboxylů, přítomných ve struktuře D-.glukuronové kyseliny, s aminoalkyl-deriváty fenolu. Produktem této reakce jsou amidy hyaluronové kyseliny. Zesítění fenolických derivátů hyaluronové kyseliny, vedoucí ke vzniku hydrogelu, je katalýzo váno enzymaticky (např. pomocí křenové peroxidázy - HRP). Síťovací reakce je nejčastěji iniciována přídavkem zředěného roztoku peroxidu vodíku. Reakce probíhá za fyziologických podmínek a tento postup přípravy je často využíván k tzv. in šitu hydrogelaci, při které finální hydrogel vzniká přímo v místě aplikace - např. v místě defektu tkáně (EP 1773 943).

Wolfová et, al. (CZ 303 879, WO 2013/127374) popisují derivát hyaluronové kyseliny modifikovaný navázáním ligandu obsahujícího aminoalkylfenol či aminoalkylheteroarylfenol (např. tyramin, 5-hydroxytryptofan, serotonin), který je navázán na polysacharid prostřednictvím vhodného spaceru. Bylo prokázáno, že přítomnost tohoto spaceru vede díky jeho flexibilitě, k navýšení možností konformačních uspořádání zúčastněných segmentů polymeru a tím i navýšení elasticity polymemí sítě po zesítění. To vede k dosažení lepších mechanických vlastností těchto hydrogelů oproti hydrogelům připravených z derivátu bez přítomnosti daného spaceru. Přítomnost spaceru se projeví dosažením vyššího zatížení v mezi pevnosti a zlepšení disipace deformační energie. Zavedení spáčem zvětšuje vzdálenost reaktivního aromatického centra (fenolu, hetoroaryl fenolu) od základního řetězce polymeru, a tím také zlepšuje jeho přístupnost pro interakci s enzymem a kromě mechanických vlastností zásadním způsobem také ovlivňuje průběh a kinetiku síťovací reakce. To umožňuje snížit koncentraci síťovacích činidel potřebných ke vzniku gelu. Vzniklé hydrogely však nevykazují žádoucí mechanickou odolnost.

Ying et, al popisují v dokumentu WO 2007/097710 přípravu kostního cementu, obsahujícího polymemí pojivo na bázi hydroxyfenylového derivátu hyaluronové kyseliny a částic anorganického plniva. Zesítění polymemí složky je zprostředkováno reakcí iniciovanou přídavkem peroxidu a HRP, nicméně nevýhodné je, že materiál tuhne relativně dlouho (10 s až 30 min.).

-1 CZ 28434 Ul

Podstata technického řešeni

Technické řešení se týká nanokompozitu na bázi hydroxyfenylového derivátu hyaluronové kyseliny nebo její soli, jehož podstatou je, že obsahuje hydroxyfenylový derivát hyaluronové kyseliny nebo její farmaceuticky přijatelnou sůl obecného vzorce I

^CH3 kde n je celé číslo v rozmezí 100 až 2500,

R¹ je OH nebo NH(CH₂)₅C(O)NH(CH₂)₂Ph, s podmínkou, že alespoň jeden Ri v derivátu je NH(CH₂)₅C(O)NH(CH₂)₂Ph, R² je H⁺ nebo farmaceuticky přijatelná sůl, s výhodou vybraná ze skupiny obsahující ionty alkalických solí nebo ionty alkalických zemin, výhodněji Na⁺, K⁺, Ca²⁺, ío Mg²⁺, Zn²⁺ nebo Fe³⁺, a nanočástice fosforečnanu vápenatého, s výhodou je jejich velikost v rozmezí 1 až 200 nm.

Podle výhodného provedení technického řešení je molekulová hmotnost hydroxyfenylového derivátu hyaluronové kyseliny nebo její farmaceuticky přijatelné soli v rozsahu 6 χ 10⁴ g/mol až 1 χ 10⁶ g/mol, s výhodou v rozsahu 3 χ 10⁵ g/mol až 6 χ 10⁵ g/mol.

Podle dalšího výhodného provedení technického řešení je stupeň substituce derivátu v rozmezí 0,5 až 5 %.

Podle dalšího výhodného provedení technického řešení je obsah nanočástic fosforečnanu vápenatého v rozsahu 1 až 200 mg na ml nanokompozitu.

Nezesíťovaný nanokompozit podle technického řešení je ve formě roztoku neboli koloidní su20 spenze.

Podle dalšího výhodného provedení technického řešení má derivát alespoň jednu disacharidickou jednotku derivátu obecného vzorce I zesíťovanou podle obecného vzorce II

přičemž je s výhodou ve formě hydrogelu.

-2CZ 28434 Ul

K zesíťovaní nanokompozitu podle technického řešení je s výhodou využívaná křenovou peroxidázou katalyzovaná oligomerizace fenolických jader derivátu podle obecného vzorce 1 výše, za vzniku zesíťovaného nanokompozitního materiálu v podobě hydrogelové matrice. Takovéto zesíťovaní polymemí složky nanokompozitu lze provést za fyziologických podmínek přímo v místě defektu bez poškození okolní tkáně. To umožňuje dokonalé vyplnění nepravidelných či laločnatých defektů bez nutnosti úpravy tvaru defektu a odstranění okolní zdravé tkáně. Využití derivátu HA podle obecného vzorce 1 výše umožňuje rychlý vznik polymemí matrice v místě defektu s výhodou do 5 až 10 s. Rychlý vznik tvarově stále matrice brání úniku materiálu z defektu. Složení prekurzorového roztoku zajišťuje, že při konstantní koncentraci síťovacích činidel (křenové peroxidázy (HRP) a peroxidu vodíku) a při koncentraci anorganických nanočástic o velikosti 1 až 200 nm, která zajišťuje výrazný nárůst houževnatosti materiálu, nedochází, ve srovnání s hydrogelem bezi obsahu anorganického plniva, ani k prodloužení času gelace materiálu ani k nárůstu jeho bobtnavosti. Množství anorganické složky v materiálu podle užitného vzoru umožňuje snadnou aplikaci endoskopickými technikami a zajišťuje vznik mechanicky odolnějšího materiálu, než by tomu bylo při využití samotné polymemí složky popsané v CZ 303 879.

Příklady technického řešeni

Definice pojmů

Termín „nanočástice fosforečnanu vápenatého“ znamená částice fosforečnanu vápenatého v nanorozměrech, tedy v rozsahu 1 nm až 999 nm.

Termín „Ph“ znamená fenyl.

Termín „HA“ znamená kyselinu hyaluronovou nebo její sůl.

Termín „molekulová hmotnost“ znamená hmotnostní průměr molekulové hmotnosti. Stupeň substituce (DS) je určen jako molámí poměr modifikovaných a nemodifikovaných disacharidických jednotek hyaluronové kyseliny ve vzorku. Stanoven byl pomocí NMR a vyjadřován je v procentech.

Koncentrace polymemí složky nanokompozitu je vyjadřována v g/1. Obsah použitých nanočástic fosforečnanu vápenatého jev materiálu uváděn v mg/ml.

Mechanické vlastnosti v kompresi, jsou určovány z grafu závislosti napětí na deformaci. Youngův modul slouží k charakterizaci materiálu z hlediska jeho tuhosti a je odečítán z počáteční, lineární, oblasti křivky. Zatížením v mezi pevnosti rozumíme napětí, které způsobí lom materiálu - jeho destrukci. Posledním pro nás důležitým faktorem je houževnatost, ta odpovídá ploše pod křivkou, je to energie spotřebovaná do vzniku trvalé nevratné deformace materiálu vztažená na objem vzorku. Dalším hodnotícím parametrem materiálu je rychlost gelace. Jedná se o čas vzniku příčných vazeb a z hlediska použitého Teologického stanovení se jedná o bod, ve kterém je ztrátový modul (G“) materiálu protnut narůstajícím elastickým modulem (G').

Příklad 1

Příprava nezesíťovaného nanokompozitního materiálu

A. Nejdříve byl připraven roztok nezesíťovaného nanokompozitního materiálu tvořeného roztokem hydroxyfenylového derivátu HA obecného vzorce I (M_w na 350 000 g/mol, stupeň substituce 1,5 %) o koncentraci 20 g/1, do kterého byla homogenně dispergována různá množství (0 200 g/1) nanočástic fosforečnanu vápenatého. Velikost nanočástic byla v rozmezí 1 až 200 nm.

B. Stejným postupem se připravil nanokompozitní materiál tvořený roztokem hydroxyfenylového derivátu HA obecného vzorce I (o M_w 5,5xl0⁵ g/mol a stupni substituce 1,5 % nebo o M_w na 3,5xlO⁵ g/mol a stupni substituce 2,8 %) o koncentraci 20 g/1 a nanočásticemi a fosforečnanu vápenatého o velikosti v rozsahu 1 až 200 nm.

-3CZ 28434 Ul

Příklad 2

Příprava a vlastnosti zesíťovaných nanokompozitních materiálů

Zesíťované nanokompozitní materiály byly připraveny působením HRP (0,6 U/ml) a peroxidu vodíku (0,33 mM) na roztoky připravené dle Příkladu 1.

Mechanické vlastnosti zesíťovaných nakompozitních materiálů v kompresi byly stanoveny na zařízení Instron 3343 (100 N snímač; rychlost posunu příčníku 2 mm/min; Youngův modul vypočten z prvních 10 % křivky), data byla vyhodnocena programem Bluehill.

Sledovány byly tyto parametry Youngův modul pružnosti, zatížení v mezi pevnosti a houževnatost zesíťovaného nanokompozitního materiálu připraveného z roztoku dle Příkladu 1, A. Výí o sledky j sou uvedeny v Tabulce 1.

Tabulka 1: Přehled vlivu koncentrace nanočástic fosforečnanu vápenatého na mechanické vlastnosti a stupeň botnání připravených kompozitních materiálů.

obsah částic [mg/ml]	Koncentrace derivátu HA [mg/ml]	Čas gelace [sl	Youngův modul pružnosti [kPa]	zatížení v mezi pevnosti [kPa]	houževnatost [J/m3]	stupeň nabotnání [%] po 28 dnech
0	20	<10	6,80 ± 0,607	155 + 9,29	11166 + 283	49 ± 3,20
20	20	<10	7,93 ± 1,67	159 + 38,0	12356 + 1309
60	20	<10	7,24 ± 0,929	151 + 9,82	14082 ± 10,1
100	20	<10	7,99 ± 0,857	317 + 58,8	26492 ± 1063	55 ± 2,65
160	20	<10	8,01 ± 0,753	325 ± 55,3	29444 ± 2334
200	20	<10	9,97 ± 0,424	401 ± 1,67	35279 ± 2246	53 ±4,12

Z dosažených výsledků vyplývá, že přítomnost nanočástic fosforečnanu vápenatého výrazně zvy15 suje, v závislosti na použitém množství, pevnost a houževnatost hydrogelové matrice a celého kompozitního materiálu. V závislosti na koncentraci nanočástic fosforečnanu vápenatého dochází k navýšení hodnoty mezi pevnosti materiálu v kompresi a také houževnatosti.

Vliv DS na vlastnosti zesíťovaného nanokompozitního materiálu

Podle příkladu 1 byly připraveny nezesíťované nanokompozitní materiály. Zesíťovaní bylo pro20 vedeno působením HRP (0,6 U/ml) a peroxidu vodíku (0,33 mM). Hydroxyfenylové deriváty měly shodnou molekulovou hmotnost 3,5x10⁵ g/mol a lišily se stupněm substituce.

Sledovány byly tyto parametry Youngův modul pružnosti, zatížení v mezi pevnosti a houževnatost. Výsledky jsou uvedeny v Tabulce 2 níže.

Mw [g/mol]	DS [%]	obsah částic [mg/ml]	Youngův modul pružnosti [kPa]	zatížení v mezi pevnosti [kPa]	houževnatost [J/m3]
350 000	1,5	100	6,80 + 0,607	155 + 9,29	11166 ± 283
350 000	2,8	100	7,50 + 0,436	264 ± 16,20	22395 + 1384

Tabulka 2: Přehled vlivu koncentrace DS hydroxyfenylového derivátu HA na mechanické vlastnosti připravených kompozitních materiálů.

Z dosažených výsledků vyplývá, že v závislosti na rostoucím DS dochází k navýšení hodnoty mezi pevnosti materiálu v kompresi a také houževnatosti.

-4CZ 28434 Ul

Vliv Mw na vlastnosti nanokompozitního materiálu

Hydroxyfenylové deriváty měly shodný stupeň substituce 1,5 %. Sledovány byly tyto parametry Youngův modul pružnosti, zatížení v mezi pevnosti a houževnatost. Výsledky jsou uvedeny v Tabulce 3 níže.

Tabulka 3: Přehled vlivu koncentrace DS hydroxyfenylového derivátu HA na mechanické vlastnosti připravených nanokompozitních materiálů.

Mw [g/mol]	DS [%]	obsah částic [mg/ml]	Youngův modul pružnosti [kPa]	zatížení v mezi pevnosti [kPa]	houževnatost [J/m3]
350 000	1,5	100	6,80 ± 0,607	155 ± 9,29	11166 ± 283
550 000	1,5	100	10,5 ± 1,09	218 ± 2,37	22553 ± 387

Z dosažených výsledků vyplývá, že v závislosti na rostoucí Mw dochází k navýšení hodnoty mezi pevnosti materiálu v kompresi a také houževnatosti.

ío NÁROKY NA OCHRANU

Claims

ío NÁROKY NA OCHRANU

1. Nanokompozit na bázi hydroxyfenylového derivátu hyaluronové kyseliny nebo její soli, vyznačující se tím, že obsahuje hydroxyfenylový derivát hyaluronové kyseliny nebo její farmaceuticky přijatelnou sůl obecného vzorce 1

15 kde n je celé číslo v rozmezí 100 až 2500,

R¹ je OH nebo NH(CH₂)5C(O)NH(CH₂)₂Ph, s podmínkou, že alespoň jeden Ri v derivátu je NH(CH₂)₅C(O)NH(CH₂)₂Ph,

R² je H⁺ nebo farmaceuticky přijatelná sůl, a nanočástice fosforečnanu vápenatého.

20
2. Nanokompozit podle nároku 1, vyznačující se tím, že farmaceuticky přijatelná sůl je vybraná ze skupiny obsahující ionty alkalických solí nebo ionty alkalických zemin, s výhodou Na⁺, K⁺, Ca²⁺, Mg²⁺ , Zn²⁺ nebo Fe³⁺.
3. Nanokompozit podle nároku 1 nebo nároku 2, vyznačující se tím, že molekulová hmotnost hydroxyfenylového derivátu hyaluronové kyseliny nebo její farmaceuticky prija25 telné soli je v rozsahu 6 x 10⁴ g/mol až 1 x 10⁶ g/mol, s výhodou v rozsahu 3 x 10⁵ g/mol až 6 x 10⁵ g/mol.
4. Nanokompozit podle kteréhokoliv z nároků laž3, vyznačující se tím, že stupeň substituce derivátu je v rozmezí 0,5 až 5 %.
5. Nanokompozit podle kteréhokoliv z nároků laž4, vyznačující se tím, že veli30 kost nanočástice fosforečnanu vápenatého je v rozmezí 1 až 200 nm.

-5CZ 28434 Ul
6. Nanokompozit podle kteréhokoliv z nároků laž5, vyznačující se tím, že obsah nanočástic fosforečnanu vápenatého je v rozsahu 1 až 200 mg na ml kompozitu.
7. Nanokompozit podle kteréhokoliv z nároků 1 až 6, vyznačující se tím, že derivát má alespoň jednu disacharidickou jednotku derivátu obecného vzorce 1 zesíťovanou podle

5 obecného vzorce II (Π),
8. Nanokompozit podle nároku 7, vyznačující se tím, že je ve formě hydrogelu.

Konec dokumentu