AT18104U1 - Hydrogel auf Basis eines vernetzten Hydroxyphenylderivats der Hyaluronsäure - Google Patents
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Abstract
Hydrogel auf Basis eines vernetzten Hydroxyphenylderivats der Hyaluronsäure, das Moleküle eines Hydroxyphenylderivats der Hyaluronsäure (HA-TA) oder seines pharmazeutisch verträglichen Salzes der allgemeinen Formel I enthält, wobei n im Bereich von 2 bis 7500 liegt und wobei R1 H+ oder ein Ion eines Alkalisalzes oder Erdalkalimetall-Salzes ist und R2 OH oder ein Tyraminsubstituent der allgemeinen Formel II ist: wobei in einem Molekül des Hydroxyphenylderivats der Hyaluronsäure oder seines pharmazeutisch verträglichen Salzes der allgemeinen Formel I, mindestens ein R2 ein Tyraminsubstituent der allgemeinen Formel II ist und wobei mindestens zwei Tyraminsubstituenten der allgemeinen Formel II mit einer kovalenten Bindung in einer beliebigen ortho-Position von Phenylgruppen verbunden sind, und ferner Chondroitinsulfat oder sein pharmazeutisch verträgliches Salz, ausgewählt aus der Gruppe, die Alkalisalze oder Erdalkalimetall-Salze aufweist, enthalten sind.
Description
HYDROGEL AUF BASIS EINES VERNETZTEN HYDROXYPHENYLDERIVATS DER HYALURONSAURE
GEBIET DER ERFINDUNG
[0001] Die Erfindung betrifft ein Hydrogel auf Basis eines vernetzten Hydroxyphenylderivats der Hyaluronsäure im Gemisch mit Chondroitinsulfat mit verbessertem Abbaugrad.
ALLGEMEINER STAND DER TECHNIK
[0002] Hyaluronsäure (auch Hyaluronan, HA) ist ein Polysaccharid aus der Gruppe der Glykosaminoglykane, das aus Disaccharideinheiten besteht, die sich aus D-Glucuronsäure und N-AcetylD-Glucosamin zusammensetzen. Dabei handelt es sich um ein Polysaccharid, das leicht in einer wässrigen Umgebung löslich ist, wo es in Abhängigkeit von Molekülmasse und Konzentration zähflüssige Lösungen bis hin zu viskoelastischen Hydrogelen bildet. HA ist ein natürlicher Bestandteil der interzellulären Gewebematrix. Das Hyaluronan-Molekül ist in der Lage, mit den umgebenden Zellen zu interagieren und deren Stoffwechselprozesse zu regulieren (Xu, Jha et al. 2012), und zwar durch Bindung an spezifische Zelloberflächenrezeptoren. Die Materialien, die Hyaluronan oder gegebenenfalls seine Derivate enthalten, werden daher oftmals zur Herstellung von Zubereitungen verwendet, die in biomedizinischen Anwendungen zum Einsatz kommen. Hydrogele auf der Basis von Hyaluronan durchlaufen im Organismus einen natürlichen Abbau durch die Wirkung spezifischer Enzyme (Hyaluronidasen), eventuell durch das Wirken reaktiver Sauerstoffspezies (ROS, engl. reactive oxygen species), wodurch sie nach ihrer Implantation allmählich im Organismus absorbiert werden (Stern, Kogan et al. 2007).
[0003] Um mechanisch widerstandsfähigere Materialien zu gewinnen und ihren biologischen Abbau zu verlangsamen, wurde eine Reihe von Hydrogeltypen entwickelt, die kovalent vernetztes Hyaluronan enthalten. Solche Hydrogele werden als Materialien zur Viskositätssteigerung von Synovialflüssigkeit, zur Vergrößerung von Weichteilgeweben verwendet, dienen als Gerüststrukturen für die Kultivierung und Implantation von Zellen usw. (Tognana, Borrione et al. 2007, Buck Il, Alam et al. 2009, Li, Raitcheva et al. 2012, Salwowska, Bebenek et al. 2016).
[0004] In der Vergangenheit wurden verschiedene Arten von Hyaluronanderivaten entwickelt, die unter physiologischen Bedingungen in situ einen Sol-Gel-Ubergang vollziehen können (Burdick und Prestwich 2011, Prestwich 2011). Dazu können zum Beispiel phenolische Derivate von Hyaluronan verwendet werden. Calabro et al. (Calabro, Akst et al. 2008, Lee, Chung et al. 2008, Kurisawa, Lee et al. 2009) beschreiben in den Dokumenten EP1587945B1 und EP1773943B1 ein Protokoll zur Herstellung von phenolischen Derivaten von Hyaluronan durch Umsetzung von Carboxylen, die in der Struktur der D-Glucuronsäure von Hyaluronan vorhanden sind, mit Aminoalkyl-Derivaten von Phenol, z. B. Tyramin. Hyaluronanamide (Darr und Calabro 2009) sind Produkte dieser Reaktion.
[0005] Die Vernetzung der phenolischen Derivate von Hyaluronan kann durch Zugabe von Peroxidase (z. B. Meerrettichperoxidase) und verdünnter Wasserstoffperoxidlösung eingeleitet werden. Meerrettichperoxidase (Horseradish peroxidase, HRP, E.C.1.11.1.7.) wird gegenwärtig als Katalysator für organische und Biotransformations-Reaktionen verwendet (Akkara, Senecal et al. 1991, Higashimura und Kobayashi 2002, Ghan, Shutava et al. 2004, Shutava, Zheng et al. 2004, Veitch 2004). Hydrogele auf der Basis von Hydroxyphenylderivaten von Hyaluronan können als injektionsfähige Matrix zur kontrollierten Freisetzung biologisch aktiver Verbindungen oder als zur Kultivierung und Implantation von Zellen geeignete Materialien verwendet werden (Kurisawa, Lee et al. 2010). Wolf et al. beschreiben im Dokument CZ303879 ein Konjugat aus Hyaluronan und Tyramin, das einen aliphatischen Linker enthält, der zwischen den Ketten des Polymers und dem Tyramin eingefügt ist. Die Anwesenheit des aliphatischen Linkers ermöglicht eine höhere Effizienz der Vernetzungsreaktion und stellt dem Netz eine höhere Elastizität bereit.
[0006] Chondroitinsulfat (ChS) ist ein weiteres Mitglied der Glykosaminoglykane, das häufig zur Herstellung von Materialien verwendet wird, die bei der Behandlung von degenerativen Krankheiten, z. B. Arthrose (OA, engl. osteoarthritis), zum Einsatz kommen. Die ChS-Kette besteht aus Disaccharideinheiten, die aus N-Acetylgalactosamin (GalNAc) und Iduronsäure (IdoA) zusammengesetzt sind. Die Disaccharideinheiten von ChS können in Position 4 und 6 von GalNAc und gegebenenfalls in Position 2I1doA sulfatiert sein. Chondroitinsulfat ist ein gerackettiges, sulfatiertes und negativ geladenes Glykosaminoglykan, das aus sich wiederholenden Monomereinheiten von N-Acetyl-D-Galaktosamin und D-Glucuronsäure besteht, die durch B(1=3) und B(1—4) Oglykosidische Bindungen miteinander verbunden sind (zur Strukturformel von Chondroitinsulfat siehe unten).
be ; 2 OR“ R'o0C R 8 Q Q HO Oo n 2 en OR NHAc wobei
R' H oder Na ist, R? H, O-SO>-OH oder O-SO,2-ONa ist
[0007] Tierisches Bindegewebe ist eine Quelle für Chondroitinsulfat, wo es Proteine bindet und so einen Teil der Proteoglykane bildet. Die Sulfatierung von Chondroitin erfolgt durch Sulfotransferasen in verschiedenen Positionen und in unterschiedlicher Darstellung. Die besondere Formel der Sulfatierung der einzelnen Positionen in der Polymerkette codiert die spezifische biologische Aktivität von Chondroitinsulfat. Es ist ein wichtiger Baustein des Knorpelgewebes in den Gelenken, der Druckbeständigkeit bereitstellt und das Gleichgewicht in der Zusammensetzung der Synovialflüssigkeit wiederherstellt (Baeurle, S. A., Kiselev M. G., Makarova E. S., Nogovitsin E. A. 2009. Polymer 50: 1805). Chondroitinsulfat wird zusammen mit Glucosamin als Nahrungsergänzungsmittel zur Behandlung oder Vorbeugung der Entwicklung von Arthrose beim Menschen (z. B. Flextor®, Advance Nutraceutics, Ltd.) oder bei Tieren (z. B. Geloren“®%®, Contipro Pharma, Ltd.) verwendet. Aus pharmazeutischer Sicht gilt Chondroitinsulfat als Arzneimittel mit verzögertem Wirkungsbeginn zur Schmerzlinderung bei degenerativen Gelenkstörungen (Aubry-Rozier B. 2012. Revue Medicale Suisse 14:571).
[0008] In-vitro- und In-vivo-Studien haben gezeigt, dass ChS die Wirkung von Hyaluronidasen hemmt. Die hemmende Wirkung von ChS auf die Enzyme wird durch die Bildung von elektrostatischen (ionischen) Wechselwirkungen bewirkt. Es wurde auch nachgewiesen, dass ChS in der Lage ist, ROS abzufangen und so die Bestandteile der extrazellulären Matrix vor dem Abbau zu schützen (Bali, Cousse et al. 2001, Xiong und Jin 2007).
[0009] Die Verwendung einer Kombination aus Hyaluronan und Chondroitinsulfat zur Herstellung von Mitteln zum Schutz von menschlichen oder tierischen Zellen und Geweben vor einem Trauma wird in Dokument EP0136782 (1983) beschrieben. Gleichermaßen beschreibt das Dokument US6051560 (1992) die Verwendung eines Gemisches aus Hyaluronan und Chondroitinsulfat als Material zur Viskositätssteigerung bei ophthalmologischen Eingriffen. Das Patent WO030417024 beschreibt eine zähflüssige Zusammensetzung, die eine therapeutisch wirksame Menge eines Gemischs aus ChS und HA enthält, zur Herstellung von Arzneimitteln für die Behandlung von Gelenken bei Menschen mit geschädigtem Knorpelgewebe aufgrund Chondromalazie oder OA Grad | und Il, die die intraartikuläre Verabreichung des Gemischs verwenden. In der Patentliteratur finden sich auch Dokumente, die ein Mittel zur parenteralen Verabreichung beschreiben, das zur Vorbeugung und Behandlung von Gelenkknorpelschäden bei Menschen oder Tieren geeignet ist und aus einer therapeutisch wirksamen Menge von Chondroitinsulfat, Hyaluronan und Glucosamin besteht (WO2004034980, 2002). Das Dokument EP2219595 beschreibt eine Formulierung auf der Basis von Polysacchariden, insbesondere Glykosaminoglykanen und deren Gemischen mit Flavonoiden, die Hydrogele mit einer verlängerten Dauer des biologischen Abbaus
bilden. In dem genannten Dokument wird auch ein Hydrogel beschrieben, das Hyaluronan, ein mit Butandiol-1,4-diglycidylether vernetztes Hyaluronanderivat und ChS enthält, das eine erhöhte Widerstandsfähigkeit gegen den durch das Enzym Hyaluronidase verursachten Abbau aufzeigt.
KURZDARSTELLUNG DER ERFINDUNG
[0010] Die Erfindung betrifft ein Hydrogel auf Basis eines vernetzten Hydroxyphenylderivats der Hyaluronsäure, welches Moleküle des Hydroxyphenylderivats der Hyaluronsäure (HA-TA) oder seines pharmazeutisch verträglichen Salzes der allgemeinen Formel | enthält
{1},
wobei n im Bereich von 2 bis 7500 liegt und wobei R' H* oder ein lon eines Alkalisalzes oder Erdalkalimetall-Salzes ist und R? OH oder ein Tyraminsubstituent der allgemeinen Formel Il ist:
SE SL an ae OO 53
9 zn NH U LS
EN un a nt Fe Ka SE ne
wobei in einem Molekül des Hydroxyphenylderivats der Hyaluronsäure oder seines pharmazeutisch verträglichen Salzes gemäß der allgemeinen Formel I, mindestens ein R? ein Tyraminsubstituent der allgemeinen Formel Il ist und wobei mindestens zwei Tyraminsubstituenten der allgemeinen Formel Il mit einer kovalenten Bindung in einer beliebigen ortho-Position von Phenylgruppen verbunden sind,
und ferner Chondroitinsulfat oder sein pharmazeutisch verträgliches Salz, ausgewählt aus der Gruppe, die Alkalisalze oder Erdalkalimetall-Salze enthält, enthalten sind.
[0011] Die Alkalisalze oder Salze des Alkalimetalls des Hydroxyphenylderivats der Hyaluronsäure der allgemeinen Formel | oder des Chondroitinsulfats sind vorzugsweise aus der Gruppe ausgewählt, die Na*, K*, Ca**, Mg** aufweist.
[0012] Die Konzentration von Chondroitinsulfat oder seines pharmazeutisch verträglichen Salzes liegt gemäß der Erfindung im Bereich von 0,5 bis 50 mg/ml Hydrogel, vorzugsweise in einer Konzentration von 1 bis 20 mg/ml, bevorzugter 5 mg/ml.
[0013] Der Gehalt des vernetzten Hydroxyphenylderivats von Hyaluronan liegt gemäß der Erfindung im Bereich von 5 bis 30 mg/ml, vorzugsweise 10 mg/ml Hydrogel.
[0014] Gemäß einer anderen bevorzugten Ausführungsform der Erfindung enthält das Hydrogel ferner Hyaluronsäure oder ihr pharmazeutisch verträgliches Salz in einer Konzentration von 1 bis 20 mg/ml, vorzugsweise 5 bis 10 mg/ml, besonders bevorzugt 5 mg/ml Hydrogel gemäß der Erfindung.
[0015] Die kovalente Bindung kann in einem Molekül des Derivats der Hyaluronsäure der allgemeinen Formel | in einer beliebigen ortho-Position der Phenylgruppen von mindestens zwei Tyraminsubstituenten der allgemeinen Formel Il, die sich in diesem Molekül befinden, vorkommen. Dies wird als intramolekulare Quervernetzung bezeichnet. Die kovalente Bindung kann auch in einer beliebigen ortho-Position von Phenylgruppen von mindestens zwei Tyraminsubstituenten
der allgemeinen Formel Il vorkommen, die sich in verschiedenen Molekülen des Derivats der Hyaluronsäure der allgemeinen Formel | befinden. Dies stellt eine wechselseitige Vernetzung zwischen den Molekülen des HA-Derivats dar.
[0016] Ein Beispiel für ein vernetztes Hydroxyphenylderivat von Hyaluronan (crossHA-TA) ist unten schematisch dargestellt, siehe Formel Ill:
> _ HC CR. 3% GBR A Ra HOT u m HA A 5 x n Ka N ee Na ja Rn a Te a OH % } n a X We U Ru x Sn X “ a Dt DM HE rm a Es N x Rs A Y 6 u A SG” 8 EN NS N I A A I CR OR
{111}
[0017] Derartige Hydrogele gemäß der Erfindung zeigen eine erhöhte Widerstandsfähigkeit gegenüber Prozessen des biologischen Abbaus durch hydrolytische Enzyme und reaktive Sauerstoffspezies auf.
[0018] Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform liegt das Gewichtsmittel der Molmasse (Mw) des Hydroxyphenylderivats von Hyaluronan der allgemeinen Formel | im Bereich von 5 x 10* bis 1,5 x 10° g.mol”, bevorzugt 2,5 x 10° bis 1 x 10° g.mol, besonders bevorzugt bei 8 x 10° g.mol”. PI liegt im Bereich von 1 bis 3.
[0019] Gemäß einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung liegt der Substitutionsgrad (DS) des Hydroxyphenylderivats von Hyaluronan der allgemeinen Formel | im Bereich von 0,5 bis 10 %, vorzugsweise 1 bis 4 %, vorzugsweise bei 1 %.
[0020] Gemäß einer weiteren bevorzugten Ausführungsform liegt das Mw von Chondroitinsulfat im Bereich von 5 x 10° bis 95 x 10° g.mol“, ferner vorzugsweise 10 x 10° bis 40 x 10° g.mol”.
[0021] Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform enthält das Hydrogel Hyaluronan (HA) oder sein pharmazeutisch verträgliches Salz mit einem Mw im Bereich von 5 x 10* bis 2,5 x 10° g.mol“, vorzugsweise 1,5 x 10° bis 2,5 x 10° g.mol', besonders bevorzugt 2,0 x 10° g.mol”.
[0022] Derartige Hydrogele gemäß der Erfindung können in der Kosmetik, der Medizin und der regenerativen Medizin verwendet werden, insbesondere zur Herstellung von Materialien für die Geweberegeneration, die Gewebevergrößerung, als Trägerstruktur für die Bereitstellung von Tissue Engineering, als Matrix für die kontrollierte Freisetzung von biologisch aktiven Wirkstoffen und Arzneimitteln und zur Viskositätssteigerung der Synovialflüssigkeit.
KURZBESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN.
[0023] Fig. 1: Vergleich der Abbaugeschwindigkeit von HA-Lösungen mit Zusatz von ChS mit ROS
[0024] Fig. 2: Vergleich der Abbaugeschwindigkeit von Materialien mit ROS [0025] Fig. 3: Kumulativer Abbau von Hydrogel [%] BTH 30 E/mg
BEISPIELE FÜR AUSFÜHRUNGSFORMEN DER ERFINDUNG
[0026] DS = Substitutionsgrad = 100 % * molare Menge der modifizierten Disaccharideinheiten des Hyaluronans / molare Menge aller Disaccharideinheiten des Hyaluronanderivats. Der Substitutionsgrad wurde mit 'H HMR-Spektroskopie bestimmt.
[0027] Das Gewichtsmittel der Molmasse (Mw) und der Polydispersitätsindex (Pl) wurden mit SEC-MALLS bestimmt.
[0028] Die Infrarotspektren der hergestellten Derivate wurden mit FT-IR gewonnen.
[0029] Chondroitinsulfat in Arzneimittelqualität von Bioiberica, ES wurde zur Verabreichung als Injektion verwendet.
BEISPIEL 1 Synthese des Tyraminderivats von HA (HA-TA) Synthese von 6-Amino-N-[2(4hydroxyphenyl)ethyl]hexanamid
[0030] 6-[(terc.-Butoxycarbonyl)amino]hexansäure (1,00 g, 4,3 mmol) wurde in 50 ml Tetrahydrofuran (THF) gelöst. 1.1'Carbodiimidazol (0,70 g, 4,3 mmol) wurde zur Säurelösung hinzugefügt. Das Gemisch wurde für sechzig Minuten auf 50 °C erwärmt. Der Reaktionsbehälter wurde dann mit Inertgas gespült. Tyramin (0,59 g, 4,3 mmol) wurde zu dem Reaktionsgemisch hinzugefügt. Das Gemisch wurde ferner für weitere 2 Stunden erwärmt. THF wurde dann unter reduziertem Druck destillativ entfernt. Der Rückstand wurde in 50 ml Ethylacetat gelöst. Die Lösung wurde mit 150 ml gereinigtem Wasser (aufgeteilt in drei Teile) gewaschen. Die organische Schicht wurde über Molekularsieb getrocknet. Ethylacetat wurde unter reduziertem Druck destillativ entfernt. Der Rückstand wurde in 50 ml MeOH gelöst und 2 ml Trifluoressigsäure (TFA) wurden der Lösung zugefügt. Die Lösung wurde für 6 Stunden unter Rückfluss erwärmt. Das Lösungsmittel wurde unter reduziertem Druck destillativ entfernt. Der Rückstand wurde in 50 ml Ethylacetat gelöst. Die Lösung wurde mit 150 ml gereinigtem Wasser (aufgeteilt in drei Teile) gewaschen. Die organische Schicht wurde über Molekularsieb getrocknet. Ethylacetat wurde unter reduziertem Druck destillativ entfernt.
m = 0,75 g (70 % des berechneten Anteils)
[0031] ')H NMR (D‚O, ppm) 5: 1,17 (m, 2 H, y-CH>-Hexansäure); 1,48 (m, 2 H, B-CH>-Hexansäure); 1,58 (m, 2 H, S-CH2-Hexansäure); 2,17 (t, 2 H, -CH2-CO-); 2,73 (m, 2 H, -CH2-Ph); 2,91 (m, 2 H, -CH2-NH2); 3,42 (m, 2 H, -CH2-NH-CO-); 6,83 (d, 2 H, arom); 7,13 (d, 2 H, arom).
[0032] °C NMR (D2O, ppm) 5: 24 (v-C-Hexansäure); 26 (5-C-Hexansäure); 33 (B-C-Hexansäure); 35 (-C-CO-); 39 (-C-NH>2); 40 (C-Ph); 63 (-C-NH-CO-); 115 (C3 arom); 126 (C1 arom); 130 (C2 arom.); 153 (C4 arom); 176 (-CO-).
HERSTELLUNG DES ALDEHYDISCHEN DERIVATS (HA-CHO)
[0033] Hyaluronan (10,00 g, Mw = 2 x 10° g.mol*) wurde in 750 mi 2,5%iger (w/w) Lösung von Naz2zHPO4.12H,0 gelöst. Die Lösung wurde auf 5 °C gekühlt. 2,60 g NaBr und 0,05 g 4-Acetamido2,2,6,6-tetramethylpiperidin-1-oxyl wurden zu der Lösung hinzugefügt. Nach einer gründlichen Homogenisierung der Lösung wurden 3 ml NaCIO-Lösung (10-15 % verfügbares Cl») zum Reaktionsgemisch hinzugefügt. Die Reaktion erfolgte unter Rühren für 15 min. Die Reaktion wurde durch Zugabe von 100 ml 40%iger Propan-2-ol-Lösung gequencht. Das Produkt wurde durch Ultrafiltration gereinigt und durch Ausfällung mit Propan-2-ol isoliert.
[0034] IR (KBr): 3417, 2886, 2152, 1659, 1620, 1550, 1412, 1378, 1323, 1236, 1204, 1154, 1078, 1038, 945, 893 cm”.
[0035] ')H NMR (D‚O) 5: 2,01 (s, 3 H, CHs-), 3,37 - 3,93 (m, Hyaluronangerüst), 4,46 (s, 1H, Anomer), 4,54 (s, 1H anomer., -O-CH(OH)-), 5,27 (geminales Glykol -CH-(OH)»2).
a) Herstellung des Tyraminderivats von HA mit Ce-Spacer (Mw = 3 x 10° g.mol”, DS = 2%)
[0036] Das HA-Aldehydderivat (= 3 x 10° g.mol”, DS = 9 %) (5,00 g) wurde in 500 ml demineralisiertem Wasser gelöst. Der pH-Wert der Lösung wurde unter Verwendung von Essigsäure auf 3 angepasst. 6-Amino-N-[2-(4-hydroxyphenyl)ethyl]hexanamid (Zwischenprodukt (1)) (1,25 g, 5 mmol) wurde zu der HA-CHO-Lösung hinzugefügt. Das Gemisch wurde für 2 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Der Komplex Picolin-Borat (0,270 g, 2,5 mmol) wurde dann dem Reaktionsgemisch hinzugefügt. Das Gemisch wurde für weitere 12 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Das Produkt wurde durch Ultrafiltration gereinigt und durch Fällung mit Propan-2-ol aus dem Retentat isoliert. Der Niederschlag wurde entfeuchtet und das restliche Propan-2-ol wurde durch Trocknen im Heißlufttrockner (40 °C, 3 Tage) entfernt.
[0037] IR (KBr): 3425, 2893, 2148, 1660, 1620, 1549, 1412, 1378, 1323, 1236, 1204, 1154, 1078, 1038, 945, 893 cm”.
[0038] 'H NMR (DO) 5: 1,25 (t, 2 H, v-CH2-Aminohexansäure), 1,48 (m, 2 H, 5-CH2-Aminohexansäure) 1,51 (m, 2 H, B-CH2-Aminohexansäure), 2,01 (s, 3 H, CHs-), 2,65 (m, 2H, Ph-CH2-), 2,73 (m, 2H, e-CH2-Aminohexansäure), 3,37 - 3,93 (m, Hyaluronangerüst), 4,46 (s, 1H, Anomer), 4,54 (s, 1H anomer., -O-CH(OH)-), 6,59 (d, 2H, arom.), 7,01 (d, 2H. arom).
[0039] SEC MALLS: Mw = 2,78 x 10° g.mol” [0040] DS ()H NMR): 2,1 % b) Herstellung des Tyraminderivats von HA mit Ce-Spacer (Mw = 8 x 10° g.mol”, DS = 1%)
[0041] Das Aldehydderivat von HA (Mw = 8 x 10° g.mol”, DS = 5 %) (5,00 g) wurde in 500 ml demineralisiertem Wasser gelöst. Der pH-Wert wurde unter Verwendung von Essigsäure auf 3 angepasst. 6-Amino-N-[2-(4-hydroxyphenyl)ethyl]hexanamid (Zwischenprodukt (1)) (0,625 g, 2,5 mmol) wurde zu der HA-CHO-Lösung hinzugefügt. Das Gemisch wurde für 2 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Anschließend wurde der Picolin-Borat-Komplex (0,270 g, 2,5 mmol) zu dem Gemisch hinzugefügt. Das Gemisch wurde für weitere 12 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Das Produkt wurde durch Ultrafiltration gereinigt und durch Fällung mit Propan-2-ol aus dem Retentat isoliert. Der Niederschlag wurde entfeuchtet und das restliche Propan-2-ol wurde durch Trocknen im Heißlufttrockner (40 °C, 3 Tage) entfernt.
[0042] IR (KBr): 3425, 2893, 2148, 1660, 1620, 1549, 1412, 1378, 1323, 1236, 1204, 1154, 1078, 1038, 945, 893 cm”.
[0043] ’H NMR (DO) 5: 1,25 (t, 2 H, v-CH2-Aminohexansäure), 1,48 (m, 2 H, 5-CH2-Aminohexansäure) 1,51 (m, 2 H, B-CH2-Aminohexansäure), 2,01 (s, 3 H, CHs-), 2,65 (m, 2H, Ph-CH2-), 2,73 (m, 2H, e-CH2-Aminohexansäure), 3,37 - 3,93 (m, Hyaluronangerüst), 4,46 (s, 1H, Anomer), 4,54 (s, 1H anomer., -O-CH(OH)-), 6,59 (d, 2H, arom.), 7,01 (d, 2H. arom).
[0044] SEC MALLS: Mw = 8,09 x 105 g.mol”' [0045] DS ('H NMR): 1,1 %
c) Herstellung des Tyraminderivats von HA mit Ce-Spacer (Mw = 1,5 x 10° g.mol”, DS = 0,5 %)
[0046] Das Aldehydderivat von HA (Mw = 1,5 x 10° g.mol', DS = 0,5 %) (5,00 g) wurde in 500 mL demineralisiertem Wasser gelöst. Der pH-Wert wurde unter Verwendung von Essigsäure auf 3 angepasst. 6-Amino-N-[2-(4-hydroxyphenyl)ethyl]hexanamid (Zwischenprodukt I)) (0,625 g, 2,5 mmol) wurde zur HA-CHO-Lösung hinzugefügt. Das Gemisch wurde für 2 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Anschließend wurde der Picolin-Borat-Komplex (0,270 g, 2,5 mmol) dem Reaktionsgemisch hinzugefügt. Das Gemisch wurde für weitere 12 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Das Produkt wurde durch Ultrafiltration gereinigt und durch Fällung mit Propan-2-ol aus dem Retentat isoliert. Der Niederschlag wurde entfeuchtet und das restliche Propan-2-ol wurde durch Trocknen im Heißlufttrockner (40 °C, 3 Tage) entfernt.
[0047] IR (KBr): 3425, 2893, 2148, 1660, 1620, 1549, 1412, 1378, 1323, 1236, 1204, 1154, 1078,
1038, 945, 893 cm”.
[0048] ’H NMR (D‚2O) 5: 1,25 (t, 2 H, v-CH2-Aminohexansäure), 1,48 (m, 2 H, 5-CH2-Aminohexansäure) 1,51 (m, 2 H, B-CH2-Aminohexansäure), 2,01 (s, 3 H, CHs-), 2,65 (m, 2H, Ph-CH2-), 2,73 (m, 2H, e-CH2-Aminohexansäure), 3,37 - 3,93 (m, Hyaluronangerüst), 4,46 (s, 1H, Anomer), 4,54 (s, 1H anomer., -O-CH(OH)-), 6,59 (d, 2H, arom.), 7,01 (d, 2H. arom).
[0049] SEC MALLS: Mw = 1,5 x 10° g.mol” [0050] DS ('H NMR): 0,5 % d) Herstellung des Tyraminderivats von HA mit Ce-Spacer (Mw = 5 x 10* g.mol”, DS = 10 %)
[0051] Das Aldehydderivat von HA Mw = 5 x 10* g.mol”, DS = 10 %) (5,00 g) wurde in 500 ml demineralisiertem Wasser gelöst. Der pH-Wert wurde unter Verwendung von Essigsäure auf 3 angepasst. 6-Amino-N-[2-(4-hydroxyphenyl)ethyl]hexanamid (Zwischenprodukt 1)) (0,625 g, 2,5 mmol) wurde zur HA-CHO-Lösung hinzugefügt. Das Gemisch wurde für 2 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Anschließend wurde der Picolin-Borat-Komplex (0,270 g, 2,5 mmol) dem Reaktionsgemisch hinzugefügt. Das Gemisch wurde für weitere 12 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Das Produkt wurde durch Ultrafiltration gereinigt und durch Fällung mit Propan-2-ol aus dem Retentat isoliert. Der Niederschlag wurde entfeuchtet und das restliche Propan-2-ol wurde durch Trocknen im Heißlufttrockner (40 °C, 3 Tage) entfernt.
[0052] IR (KBr): 3425, 2893, 2148, 1660, 1620, 1549, 1412, 1378, 1323, 1236, 1204, 1154, 1078, 1038, 945, 893 cm”.
[0053] 'H NMR (D‚2O) 5: 1,25 (t, 2 H, v-CH2-Aminohexansäure), 1,48 (m, 2 H, 5-CH2-Aminohexansäure) 1,51 (m, 2 H, B-CH2-Aminohexansäure), 2,01 (s, 3 H, CHs-), 2,65 (m, 2H, Ph-CH2-), 2,73 (m, 2H, e-CH2-Aminohexansäure), 3,37 - 3,93 (m, Hyaluronangerüst), 4,46 (s, 1H, Anomer), 4,54 (s, 1H anomer., -O-CH(OH)-), 6,59 (d, 2H, arom.), 7,01 (d, 2H. arom).
[0054] SEC MALLS: Mw = 5 x 10* g.mol” [0055] DS ’H NMR): 10 %
BEISPIEL 2
Herstellung von Hydrogelen auf der Basis eines Hydroxyphenylderivats von HA-TA in einer Konzentration von 20 mg/ml
[0056] Die Hydrogele wurden durch Mischen zweier Vorläuferlösungen A und B hergestellt, für deren Herstellung eine wässrige NaCl-Lösung (9 g/l) verwendet wurde. Zur Herstellung der Vorläuferlösungen wurde ein Hydroxyphenylderivat von HA-TA mit Mw = 2,78 x 10° g.mol” und DS 2,1 % verwendet. Die Zusammensetzung der Lösungen ist in der folgenden Tabelle dargestellt (Tabelle 1).
Lösung A Lösung B
HP arserrre 0,48 E/MI |H2O2..ererr 2,0 mmol/l HA -TArsserrrrrrrrrrr 20 mg/ml |HA-T Arsen 20 mg/ml Na Clare 9 g/l Na ler 9 g/l
Tabelle 1: Zusammensetzung der Vorläuferlösungen zur Herstellung von Hydrogelen auf der Basis eines Hydroxyphenylderivats von HA-TA in einer Konzentration von 20 mg/mL.
[0057] Durch Mischen von Lösung A und Lösung B im Verhältnis 1:1 wurden Hydrogele mit der in der folgenden Tabelle (Tabelle 2) dargestellten endgültigen Zusammensetzung hergestellt, wobei crossHA-TA ein kovalent vernetztes Hydroxyphenylderivat von Hyaluronan ist.
Zusammensetzung der Hydrogele
HP arserrre 0,24 E/ml CFOSSHA-T Arssirrrrrrr 20 mg/ml Na Clare 9 g/l
Tabelle 2: Endgültige Zusammensetzung von Hydrogelen auf Basis eines Hydroxyphenylderivats von HA-TA in einer Konzentration von 20 mg/ml
BEISPIEL 3 Herstellung von Hydrogelen, die ChS in einer Konzentration von 0,5 mg/ml enthalten
[0058] Die Hydrogele wurden durch Mischen zweier Vorläuferlösungen A und B hergestellt, für deren Herstellung eine wässrige NaCl-Lösung (9 g/l) verwendet wurde. Zur Herstellung der Vorläuferlösungen wurde ein Hydroxyphenylderivat von HA-TA mit Mw = 2,78 x 10° g.mol” und DS 2,1 % und ChS mit Mw = 10 x 10% - 40 x 10° g.mol” verwendet. Die Zusammensetzung der Lösungen ist in der folgenden Tabelle dargestellt (Tabelle 3).
Lösung A Lösung B
HP arserrre 0,48 E/MI |H2O 2.000 2,0 mmol/l HA -TArsserrrrrrrrrrr 20 mg/ml |HA-T Arsen 20 mg/ml CS erreeeeerrrr 0,5 mg/ml |CHS are 0,5 mg/ml Na Clare 9 g/l Na ler 9 g/l
Tabelle 3: Zusammensetzung der Vorläuferlösungen zur Herstellung von Hydrogelen, die ChS in einer Konzentration von 0,5 mg/ml enthalten.
[0059] Durch Mischen von Lösung A und Lösung B im Verhältnis 1:1 wurden Hydrogele mit der in der folgenden Tabelle (Tabelle 4) dargestellten endgültigen Zusammensetzung hergestellt, wobei crossHA-TA ein kovalent vernetztes Hydroxyphenylderivat von Hyaluronan ist.
Hydrogelzusammensetzung
HP arserrre 0,24 E/ml CFOSSHA-T Arssirrrrrrr 20 mg/ml CS erreeeeerrrr 0,5 mg/ml Na Clare 9 g/l
Tabelle 4: Endgültige Zusammensetzung der Hydrogele, die ChS in einer Konzentration von 0,5 mg/ml enthalten
BEISPIEL 4
Herstellung von Hydrogelen, die ChS in einer Konzentration von 3,3 mg/ml enthalten
[0060] Die Hydrogele wurden durch Mischen zweier Vorläuferlösungen A und B hergestellt, für deren Herstellung eine wässrige NaCl-Lösung (9 g/l) verwendet wurde. Zur Herstellung der Vorläuferlösungen wurde das Hydroxyphenylderivat HA-TA mit Mw = 2,78 x 10° g.mol und DS 2,1 % und ChS mit Mw = 10 x 10° - 40 x 10° g.mol” verwendet. Die Zusammensetzung der Lösungen ist in der folgenden Tabelle dargestellt (Tabelle 5).
Lösung A Lösung B
HP arserrre 0,48 E/MI |H2O 2.000 2,0 mmol/l HA -TArsserrrrrrrrrrr 20 mg/ml |HA-T Arsen 20 mg/ml CS erreeeeerrrr 3,3 Mg/mMl | CS are 3,3 mg/ml Na Clare 9 g/l Na ler 9 g/l
Tabelle 5: Zusammensetzung der Vorläuferlösungen zur Herstellung von Hydrogelen, die ChS in einer Konzentration von 3,3 mg/ml enthalten
[0061] Durch Mischen der Lösung A und Lösung B im Verhältnis 1:1 wurden Hydrogele mit der in der folgenden Tabelle (Tabelle 6) dargestellten endgültigen Zusammensetzung hergestellt, wobei crossHA-TA ein kovalent vernetztes Hydroxyphenylderivat von Hyaluronan ist.
Zusammensetzung der Hydrogele
HP arserrre 0,24 E/ml CFOSSHA-T Arssirrrrrrr 20 mg/ml CS erreeeeerrrr 3,3 mg/ml Na Clare 9 g/l
Tabelle 6: Endgültige Zusammensetzung der Hydrogele, die ChS in einer Konzentration von 3,3 mg/ml enthalten.
BEISPIEL 5 Herstellung von Hydrogelen, die ChS in einer Konzentration von 10 mg/ml enthalten
[0062] Die Hydrogele wurden durch Mischen zweier Vorläuferlösungen A und B hergestellt, für deren Herstellung eine wässrige NaCl-Lösung (9 g/l) verwendet wurde. Zur Herstellung der Vorläuferlösungen wurde das Hydroxyphenylderivat HA-TA mit Mw = 2,78 x 10° g.mol und DS 2,1 % und ChS mit Mw = 10 x 10° - 40 x 10% g.mol” verwendet. Die Zusammensetzung der Lösungen ist in der folgenden Tabelle dargestellt (Tabelle 7).
Lösung A Lösung B
HP arserrre 0,48 E/ml Ha 2 errreerr rer 2,0 mmol/l HA -TArsserrrrrrrrrrr 20 mg/ml HA -T Arkserrrrrrrrrr 20 mg/ml CS ereeeeeerrrrr 10 mg/ml CS rreererrerer 10 mg/ml Na Clare 9 g/l NE 9 g/l
Tabelle 7: Zusammensetzung der Vorläuferlösungen zur Herstellung von Hydrogelen, die ChS in einer Konzentration von 10 mg/ml enthalten
[0063] Durch Mischen der Lösung A und Lösung B im Verhältnis 1:1 wurden Hydrogele mit der in der folgenden Tabelle (Tabelle 8) dargestellten endgültigen Zusammensetzung hergestellt, wobei crossHA-TA ein kovalent vernetztes Hydroxyphenylderivat von Hyaluronan ist.
Zusammensetzung der Hydrogele
HP arserrre 0,24 E/ml CFOSSHA-T Arssirrrrrrr 20 mg/ml CS ereeeeeerrrrr 10 mg/ml Na Clare 9 g/l
Tabelle 8: Endgültige Zusammensetzung der Hydrogele, die ChS in einer Konzentration von 10 mg/ml enthalten.
BEISPIEL 6 Herstellung von Hydrogelen, die ChS in einer Konzentration von 50 mg/ml enthalten
[0064] Die Hydrogele wurden durch Mischen zweier Vorläuferlösungen A und B hergestellt, für deren Herstellung eine wässrige NaCl-Lösung (9 g/l) verwendet wurde. Zur Herstellung der Vorläuferlösungen wurde das Hydroxyphenylderivat HA-TA mit Mw = 2,78 x 10° g.mol und DS 2,1 % und ChS mit Mw = 10 x 10° - 40 x 10° g.mol” verwendet. Die Zusammensetzung der Lösungen ist in der folgenden Tabelle dargestellt (Tabelle 9).
Lösung A Lösung B
HP arserrre 0,48 E/ml Ha 2 errreerr rer 2,0 mmol/l HA -TArsserrrrrrrrrrr 20 mg/ml HA -T Arkserrrrrrrrrr 20 mg/ml CS ereeeeeerrrrr 50 mg/ml CS rreererrerer 50 mg/ml Na Clare 9 g/l NE 9 g/l
Tabelle 9: Zusammensetzung der Vorläuferlösungen zur Herstellung von Hydrogelen, die ChS in einer Konzentration von 50 mg/ml enthalten
[0065] Durch Mischen der Lösung A und Lösung B im Verhältnis 1:1 wurden Hydrogele mit der in der folgenden Tabelle (Tabelle 10) dargestellten endgültigen Zusammensetzung hergestellt, wobei crossHA-TA ein kovalent vernetztes Hydroxyphenylderivat von Hyaluronan ist.
Zusammensetzung der Hydrogele
HP arserrre 0,24 E/ml CFOSSHA-T Arssirrrrrrr 20 mg/ml CS ereeeeeerrrrr 50 mg/ml Na Clare 9 g/l
Tabelle 10: Endgültige Zusammensetzung der Hydrogele, die ChS in einer Konzentration von 50 mg/ml enthalten.
BEISPIEL 7 Herstellung von Hydrogelen, die HA in einer Konzentration von 5 mg/ml enthalten
[0066] Die Herstellung von Hydrogelen, die nicht vernetzte Hyaluronsäure enthalten, wies 3 grundlegende Schritte auf:
1) Herstellung eines Hydrogels, das das vernetzte Derivat crossHA-TA enthält Das Hydrogel, das das vernetzte Derivat crossHA-TA enthält, wurde durch Mischen zweier Vorläuferlösungen A und B hergestellt, die durch Lösen der einzelnen Bestandteile in phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) hergestellt worden waren. Zur Herstellung der Vorläuferlösungen wurde ein Hydroxyphenylderivat von HA-TA mit Mw = 8,09 x 105 g.mol und DS 1,1 % verwendet. Die Zusammensetzung der Lösungen ist in der folgenden Tabelle dargestellt (Tabelle 11).
Lösung A Lösung B
HP rrserrrre 12,8 mE/ml Ha 2er 0,6 mmol/l HA -TArsserrrrrrrrrrr 20 mg/ml HA -T Arster 20 mg/ml Na Clare 8 g/l Na Cl errrrrre 8 g/l
Kl errrrerere 0,2 g/l BC leerer 0,2 g/l NazHPO4.12H20..........00000 2,85 g/l NazHPO4.12H20 a... 2,85 g/l KHRP Od errrrrreer er 0,2 g/l KHRP Od errrreer ee 0,2 g/l
Tabelle 11: Zusammensetzung der Vorläuferlösungen zur Herstellung des vernetzten Derivats crossHA-TA
[0067] Durch Mischen von Lösung A und Lösung B im Verhältnis 1:1 wurde ein Hydrogel mit der in der folgenden Tabelle (Tabelle 12) dargestellten Zusammensetzung hergestellt.
Zusammensetzung des vernetzten Derivats -
crossHA-TA
HP arserrre 0,24 E/ml CFOSSHA-T Arssirrrrrrr 20 mg/ml Na Clare 8 g/l
Kl errrrerere 0,2 g/l NazHPO4.12H20..........00000 2,85 g/l KHP Oder 0,2 g/l
Tabelle 12: Zusammensetzung des vernetzten Derivats von HA-TA 2) Herstellung der Hyaluronanlösung
[0068] Die HA-Lösung in einer Konzentration von 5 mg/ml wurde durch Lösen von nativem Hyaluronan mit einem Mw von 1,91 x 10° g.mol in PBS hergestellt.
3) Homogenisierung von Hydrogel und Hyaluronanlösung
[0069] Das endgültige Hydrogel wurde hergestellt, indem das vernetzte Derivat crossHA-TA und die HA-Lösung im Verhältnis 1:1 gemischt und das Gemisch anschließend homogenisiert wurde. Die endgültige Zusammensetzung des Materials ist in der folgenden Tabelle dargestellt (Tabelle 13).
Endgültige Zusammensetzung
HP arserrre 0,12 E/ml CFOSSHA-T Arssirrrrrrr 10 mg/ml HA rrrrrrrrrrrrrr rn rn 5 mg/ml Na Clare 8 g/l
Kl errrrerere 0,2 g/l NazHPO4.12H20..........00000 2,85 g/l KHP Oder 0,2 g/l
Tabelle 13: Endgültige Zusammensetzung des Hydrogels, das HA in einer Konzentration von 5 mg/ml enthält
BEISPIEL 8 Herstellung von Hydrogelen, die HA in einer Konzentration von 20 mg/ml enthalten
[0070] Die Herstellung von Hydrogelen, die nicht vernetzte Hyaluronsäure enthalten, wies 3 grundlegende Schritte auf:
1) Herstellung eines Hydrogels, das das vernetzte Derivat crossHA-TA enthält Das Hydrogel, das das vernetzte Derivat crossHA-TA enthält, wurde durch Mischen zweier Vorläuferlösungen A und B hergestellt, die durch Lösen der einzelnen Bestandteile in phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) hergestellt worden waren. Zur Herstellung der Vorläuferlösungen wurde ein Hydroxyphenylderivat von HA-TA mit Mw = 8,09 x 105 g.mol” und DS 1,1 % verwendet. Die Zusammensetzung der Lösungen ist in der folgenden Tabelle dargestellt (Tabelle 14).
Lösung A Lösung B
HP rrserrrre 12,8 mE/ml Ha 2er rrrrrrr 0,6 mmol/l HA -TArsserrrrrrrrrrr 20 mg/ml HA -T Akkserrrrrrrrrr 20 mg/ml Na Clare 8 g/l Na ler 8 g/l
Kl errrrerere 0,2 g/l KO ererrrrerer 0,2 g/l NazHPO4.12H20..........00000 2,85 g/l NazHPO4.12H20 ......uuu 2,85 g/l KHRP Od errrrrreer er 0,2 g/l KHoP Oder 0,2 g/l
Tabelle 14: Zusammensetzung der Vorläuferlösungen zur Herstellung des vernetzten Derivats crossHA-TA
[0071] Durch Mischen von Lösung A und Lösung B im Verhältnis 1:1 wurde ein Hydrogel in der in der folgenden Tabelle (Tabelle 15) dargestellten Zusammensetzung hergestellt.
Zusammensetzung des vernetzten Derivats crossHA-TA
HP arserrre 0,24 E/ml CFOSSHA-T Arssirrrrrrr 20 mg/ml Na Clare 8 g/l
Kl errrrerere 0,2 g/l NazHPO4.12H20..........00000 2,85 g/l KHP Oder 0,2 g/l
Tabelle 15: Zusammensetzung des vernetzten Derivats crossHA-TA 2) Herstellung der Hyaluronanlösung
[0072] Die HA-Lösung in einer Konzentration von 40 mg/ml wurde durch Lösen von nativem Hyaluronan mit einem Mw von 1,91 x 10° g.mol in Phosphatpuffer (PBS) hergestellt.
3) Homogenisierung von Hydrogel und Hyaluronanlösung
[0073] Das endgültige Hydrogel wurde hergestellt, indem das vernetzte Derivat crossHA-TA und die HA-Lösung im Verhältnis 1:1 gemischt und das Gemisch dann homogenisiert wurde. Die endgültige Zusammensetzung des Materials ist in der folgenden Tabelle dargestellt (Tabelle 16).
Endgültige Zusammensetzung
HP arserrre 0,12 E/ml CFOSSHA-T Arssirrrrrrr 10 mg/ml HA rrrrrrrrrrrrrrr rn 20 mg/ml Na Clare 8 g/l
Kl errrrerere 0,2 g/l NazHPO4.12H20..........00000 2,85 g/l KHP Oder 0,2 g/l
Tabelle 16: Endgültige Zusammensetzung von Hydrogel, das HA in einer Konzentration von 20 mg/ml enthält
BEISPIEL 9
Herstellung von Hydrogelen, die HA in einer Konzentration von 5 mg/ml und ChS in einer Konzentration von 5 mg/ml enthalten
[0074] Die Herstellung von Hydrogelen, die nicht vernetzte Hyaluronsäure und Chondroitinsulfat enthalten, wies 3 grundlegende Schritte auf:
1) Herstellung von Hydrogel, das das vernetzte Derivat crossHA-TA enthält Das Hydrogel, das das vernetzte Derivat crossHA-TA enthält, wurde durch Mischen zweier Vorläuferlösungen A und B hergestellt, die durch Lösen der einzelnen Bestandteile in phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) hergestellt worden waren. Zur Herstellung der Vorläuferlösungen wurde ein Hydroxyphenylderivat von HA-TA mit Mw = 8,09 x 105 g.mol und DS 1,1 % verwendet. Die Zusammensetzung der Lösungen ist in der folgenden Tabelle dargestellt (Tabelle 17).
Lösung A Lösung B
HP rrserrrre 12,8 mE/ml Ha 2er rrrrrrr 0,6 mmol/l HA -TArsserrrrrrrrrrr 20 mg/ml HA -T Akkserrrrrrrrrr 20 mg/ml Na Clare 8 g/l Na ler 8 g/l
Kl errrrerere 0,2 g/l KO ererrrrerer 0,2 g/l NazHPO4.12H20..........00000 2,85 g/l NazHPO4.12H20 ......uuu 2,85 g/l KHRP Od errrrrreer er 0,2 g/l KHoP Oder 0,2 g/l
Tabelle 17: Zusammensetzung der Vorläuferlösungen zur Herstellung des vernetzten Derivats crossHA-TA
[0075] Durch Mischen der Lösung A und Lösung B im Verhältnis 1:1 wurde ein Hydrogel mit der in der folgenden Tabelle (Tabelle 18) dargestellten Zusammensetzung hergestellt.
Zusammensetzung des vernetzten Derivats
crossHA-TA
HP arserrre 0,24 E/ml CFOSSHA-T Arssirrrrrrr 20 mg/ml Na Clare 8 g/l
Kl errrrerere 0,2 g/l NazHPO4.12H20..........00000 2,85 g/l KHP Oder 0,2 g/l
Tabelle 18: Zusammensetzung des vernetzten Derivats crossHA-TA 2) Herstellen einer Lösung mit einem Gehalt an Hyaluronan und Chondroitinsulfat
[0076] Die Lösung von HA in einer Konzentration von 10 mg/ml und ChS in einer Konzentration von 10 mg/ml wurde durch Lösen von nativem Hyaluronan mit einem Mw von 1,91 x 10° g.mol“ und Chondroitinsulfat mit einem Mw von 10 x 10% - 40 x 10° g.mol” in Phosphatpuffer (PBS) hergestellt.
3) Homogenisierung von Hydrogel und Lösung mit einem Gehalt an Hyaluronan und Chondroitinsulfat
[0077] Das endgültige Hydrogel wurde hergestellt, indem das vernetzte Derivat crossHA-TA und die Lösung von HA und ChS im Verhältnis 1:1 gemischt und das Gemisch dann homogenisiert wurde. Die endgültige Zusammensetzung des Materials ist in der folgenden Tabelle dargestellt (Tabelle 19).
Endgültige Zusammensetzung
HP arserrre 0,12 E/ml CFOSSHA-T Arssirrrrrrr 10 mg/ml HA rrrrrrrrrrrrrr rn rn 5 mg/ml CS erreeeeerrrr 5 mg/ml Na Clare 8 g/l
Kl errrrerere 0,2 g/l NazHPO4.12H20..........00000 2,85 g/l KHP Oder 0,2 g/l
Tabelle 19: Endgültige Zusammensetzung des Hydrogels, das HA in einer Konzentration von 5 mg/ml und ChS in einer Konzentration von 5 mg/ml enthält
BEISPIEL 10
Herstellung von Hydrogelen, die HA in einer Konzentration von 5 mg/ml und ChS in einer Konzentration von 10 mg/ml enthalten
[0078] Die Herstellung von Hydrogelen, die nicht vernetzte Hyaluronsäure und Chondroitinsulfat enthalten, wies 3 grundlegende Schritte auf:
1) Herstellung eines Hydrogels, das das vernetzte Derivat crossHA-TA enthält Das Hydrogel, das das vernetzte Derivat crossHA-TA enthält, wurde durch Mischen zweier Vorläuferlösungen A und B hergestellt, die durch Lösen der einzelnen Bestandteile in phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) hergestellt worden waren. Zur Herstellung der Vorläuferlösungen wurde ein Hydroxyphenylderivat von HA-TA mit Mw = 8,09 x 105 g.mol” und DS 1,1 % verwendet. Die Zusammensetzung der Lösungen ist in der folgenden Tabelle dargestellt (Tabelle 20)
Lösung A Lösung B
HP rrserrrre 12,8 mE/ml Ha 2er rrrrrrr 0,6 mmol/l HA -TArsserrrrrrrrrrr 20 mg/ml HA -T Akkserrrrrrrrrr 20 mg/ml Na Clare 8 g/l Na ler 8 g/l
Kl errrrerere 0,2 g/l KO ererrrrerer 0,2 g/l NazHPO4.12H20..........00000 2,85 g/l NazHPO4.12H20 ......uuu 2,85 g/l KHRP Od errrrrreer er 0,2 g/l KHoP Oder 0,2 g/l
Tabelle 20: Zusammensetzung der Vorläuferlösungen zur Herstellung des vernetzten Derivats crossHA-TA
[0079] Durch Mischen der Lösung A und Lösung B im Verhältnis 1:1 wurde ein Hydrogel mit der in der folgenden Tabelle (Tabelle 21) dargestellten Zusammensetzung hergestellt.
Zusammensetzung des vernetzten Derivats
crossHA-TA
HP arserrre 0,24 E/ml CFOSSHA-T Arssirrrrrrr 20 mg/ml Na Clare 8 g/l
Kl errrrerere 0,2 g/l NazHPO4.12H20..........00000 2,85 g/l KHP Oder 0,2 g/l
Tabelle 21: Zusammensetzung des vernetzten Derivats crossHA-TA 2) Herstellen einer Lösung mit einem Gehalt an Hyaluronan und Chondroitinsulfat
[0080] Die Lösung von HA in einer Konzentration von 10 mg/ml und ChS in einer Konzentration von 20 mg/ml wurde durch Lösen von nativem Hyaluronan mit einem Mw von 1,91 x 10° g.mol“ und Chondroitinsulfat mit einem Mw von 10 x 10% - 40 x 10° g.mol” in Phosphatpuffer (PBS) hergestellt.
3) Homogenisierung von Hydrogel und Lösung mit einem Gehalt an Hyaluronan und Chondroitinsulfat
[0081] Das endgültige Hydrogel wurde hergestellt, indem das vernetzte Derivat crossHA-TA und die Lösung von HA und ChS im Verhältnis 1:1 gemischt und das Gemisch dann homogenisiert wurde. Die endgültige Zusammensetzung des Materials ist in der folgenden Tabelle dargestellt (Tabelle 22).
Endgültige Zusammensetzung
HP arserrre 0,12 E/ml CFOSSHA-T Arssirrrrrrr 10 mg/ml HA rrrrrrrrrrrrrr rn rn 5 mg/ml CS ereeeeeerrrrr 10 mg/ml Na Clare 8 g/l
Kl errrrerere 0,2 g/l NazHPO4.12H20..........00000 2,85 g/l KHP Oder 0,2 g/l
Tabelle 22: Endgültige Zusammensetzung des Hydrogels, das HA in einer Konzentration von 5 mg/ml und ChS in einer Konzentration von 10 mg/ml enthält
BEISPIEL 11
Herstellung von Hydrogelen auf der Basis eines Hydroxyphenylderivats von HA-TA mit einer Konzentration von 5 mg/ml
[0082] Die Hydrogele wurden durch Mischen zweier Vorläuferlösungen A und B hergestellt, für deren Herstellung eine wässrige NaCl- Lösung (9 g/l) verwendet wurde. Zur Herstellung der Vorläuferlösungen wurde ein HA-TA-Hydroxyphenylderivat mit Mw = 1,5 x 10° g.mol und DS 0,5 % verwendet. Die Zusammensetzung der Lösungen ist in der folgenden Tabelle dargestellt (Tabelle 23).
Lösung A Lösung B
HP arserrre 0,12 E/ml Ha O2 errrrrrrrr 0,5 mmol/l HA TA rseerrrrrrr rer 5 mg/ml HA TA rreeeeereeee 5 mg/ml Na Clare 9 g/l NaCl errrr 9 g/l
Tabelle 23: Zusammensetzung der Vorläuferlösungen zur Herstellung von Hydrogelen auf der Basis eines HA-TA-Hydroxyphenylderivats in einer Konzentration von 5 mg/ml
[0083] Durch Mischen der Lösung A und Lösung B im Verhältnis 1:1 wurden Hydrogele mit der in der folgenden Tabelle (Tabelle 24) dargestellten endgültigen Zusammensetzung hergestellt, wobei crossHA-TA ein kovalent vernetztes Hydroxyphenylderivat von Hyaluronan ist.
Zusammensetzung der Hydrogele
HP are 0,06 E/ml CFrOSSHA-TArssire 5 mg/ml Na Cl errrrr 9 g/l
Tabelle 24: Endgültige Zusammensetzung der Hydrogele auf Basis eines HA-TA-Hydroxyphenylderivats in einer Konzentration von 5 mg/ml
BEISPIEL 12
Herstellung von Hydrogelen auf der Basis eines HA-TA-Hydroxyphenylderivats mit einer Konzentration von 30 mg/ml
[0084] Die Hydrogele wurden durch Mischen zweier Vorläuferlösungen A und B hergestellt, für deren Herstellung eine wässrige NaCl-Lösung (9 g/l) verwendet wurde. Zur Herstellung der Vorläuferlösungen wurde ein HA-TA-Hydroxyphenylderivat mit Mw = 5 x 10* g.mol” und DS 10% verwendet. Die Zusammensetzung der Lösungen ist in der folgenden Tabelle dargestellt (Tabelle 25).
Lösung A Lösung B
HP arserrre 1,2 E/ml Ha O2 errrrrrrrr 5 mmol/l HA -TArsserrrrrrrrrrr 30 mg/ml HA TA rrsrrrrrr 30 mg/ml Na Clare 9 g/l NaCl errrr 9 g/l
Tabelle 25: Zusammensetzung der Vorläuferlösungen zur Herstellung von Hydrogelen auf der Basis eines HA-TA-Hydroxyphenylderivats in einer Konzentration von 30 mg/ml
[0085] Durch Mischen der Lösung A und Lösung B im Verhältnis 1:1 wurden Hydrogele mit der in der folgenden Tabelle (Tabelle 26) dargestellten endgültigen Zusammensetzung hergestellt, wobei crossHA-TA ein kovalent vernetztes Hydroxyphenylderivat von Hyaluronan ist.
Zusammensetzung der Hydrogele
HP arserrre 0,6 E/ml CFOSSHA-T Arssirrrrrrr 30 mg/ml Na Clare 9 g/l
Tabelle 26: Endgültige Zusammensetzung der Hydrogele auf Basis eines HA-TA-Hydroxyphenylderivats in einer Konzentration von 30 mg/ml.
BEISPIEL 13 Abbau von HA-Lösungen mit Zusatz von ChS unter Verwendung von ROS
[0086] Zum Vergleich der Abbaugeschwindigkeit der HA-Lösungen mit ChS durch die Wirkung von ROS wurden Lösungen von Hyaluronan in Phosphatpuffer (PBS) mit verschiedenen ChSKonzentrationen hergestellt. Zur Herstellung der Lösungen wurden Hyaluronsäure mit einem Mw von 1,91 x 10° g.mol” und ChS mit Mw = 10 x 10° - 40 x 10° g.mol” verwendet. Lösung A enthielt 20 mg/ml HA, Lösung B 20 mg/ml HA und 0,5 mg/mi ChS, Lösung C 20 mg/ml HA und 1 mg/ml ChS, Lösung D 20 mg/ml HA und 3 mg/mIi ChS, Lösung E 20 mg/ml HA und 5 mg/ml ChS, Lösung F 20 mg/ml HA und 20 mg/ml ChS.
Durchführung des Abbauversuches
[0087] Die Abbaugeschwindigkeit wurde als prozentuale Abnahme der Viskosität der Lösungen bei einer Scherrate von 0,1 s* gegenüber dem Ausgangswert ausgedrückt. Die Messung der Viskositätsabnahme wurde mit dem Rheometer Kinexus Malvern in der Konfiguration KegelPlatte durchgeführt. Es wurde ein Kegel mit einem Durchmesser von 40 mm und einem Scheitel-
winkel von 1° verwendet. Der Abbau des Materials erfolgte in 10-ml-Spritzen, in der zu 9 ml Material 0,5 ml CuSO4-Lösung mit einer Konzentration von 0,25 mmol/l hinzugefügt wurde, gefolgt von 0,5 ml H2O2-Lösung mit einer Konzentration von 2,5 mmol/l. Während des Hydrogelabbaus wurden in vorgegebenen Zeitabständen Proben des Materials entnommen, in denen die Viskosität bei 25 °C und einer Scherrate von 0,1 s gemessen wurde. Der Abbau dauerte insgesamt 3 h.
[0088] Fig. 1 zeigt den Abbau der Hyaluronan-Ketten, ausgedrückt in der prozentualen Abnahme der Viskosität der Lösung im Laufe der Zeit. Aus Fig. 1 ist der Einfluss der ChS-Konzentration auf die Hyaluronan-Abbaugeschwindigkeit ersichtlich. Die durch ROS verursachte HA-Abbaugeschwindigkeit nimmt mit steigender ChS-Konzentration ab. Die Viskosität der Lösung A, die kein ChS enthielt, verringerte sich in 3 Stunden um 97 % gegenüber dem Ausgangswert vor dem Abbau, der Lösung B (mit dem Zusatz von 0,5 mg/ml ChS) um 89 %, der Lösung C, der 1 mg/ml ChS hinzugefügt wurde, um 84 %, der Lösung D (20 mg/ml HA + 3 mg/ml ChS) um 46 %, der Lösung E (20 mg/ml HA + 5 mg/mIl ChS) um 25 % und der Lösung F (20 mg/ml + 20 mg/ml ChS) lediglich um 8 %.
BEISPIEL 14
Abbau von Hydrogelen auf Basis des vernetzten Derivats crossHA-TA durch die Wirkung von ROS
[0089] Zum Vergleich der Abbaugeschwindigkeit von Hydrogelen durch die Wirkung von ROS wurden 3 Materialtypen hergestellt.
[0090] Material A ist eine Lösung von HA mit einer Konzentration von 20 mg/ml, die durch Lösen von HA mit einem Mw von 1,91 x 10° g.mol* in PBS hergestellt wurde.
[0091] Material B ist ein Gemisch aus dem vernetzten Derivat crossHA-TA und nicht vernetztem HA, das gemäß Beispiel 7 hergestellt wurde.
[0092] Die Materialien C und D bestanden aus nicht vernetztem HA, CHS und crossHA-TA und wurden gemäß den Beispielen 9 und 10 hergestellt.
[0093] Die Abbaugeschwindigkeit wurde als prozentuale Abnahme der Viskosität der Materialien bei einer Scherrate von 0,1 s" gegenüber dem Ausgangswert ausgedrückt. Die Messung der Abnahme der Viskosität wurde mit dem Rheometer Kinexus Malvern in der Konfiguration KegelPlatte durchgeführt. Es wurde ein Kegel mit einem Durchmesser von 40 mm und einem Scheitelwinkel von 1° verwendet. Der Abbau des Materials erfolgte in 10-ml-Spritzen, in der zu 9 ml Material 0,5 ml CuSO4-Lösung mit einer Konzentration von 0,25 mmol/l hinzugefügt wurde, gefolgt von 0,5 ml H2O2-Lösung mit einer Konzentration von 2,5 mmol/l. Während des Hydrogelabbaus wurden in vorgegebenen Zeitabständen Proben des Materials entnommen, in denen die Viskosität bei 25 °C und einer Scherrate von 0,1 s gemessen wurde. Der Abbau dauerte insgesamt 3 h. Aus Fig. 2 ist ersichtlich, dass die Anwesenheit von ChS in den hergestellten Hydrogelen (C 5 mg/ml ChS; D - 10 mg/ml ChS) deren Widerstandsfähigkeit gegenüber der Wirkung von ROS erhöht.
BEISPIEL 15
Enzymatischer Abbau von Hydrogelen auf der Basis des vernetzten Derivats crossHA-TA
[0094] Es wurden 3 Hydrogeltypen hergestellt, um den Einfluss der Anwesenheit von ChS auf die Abbaugeschwindigkeit von Hydrogelen auf der Basis von crossHA-TA durch die Wirkung von Hyaluronidase aus Rinderhoden zu bestimmen:
[0095] A - Hydrogele ohne Zusatz von Chondroitinsulfat, die gemäß dem Protokoll von Beispiel 2 hergestellt wurden
[0096] B - Hydrogele mit Zusatz von ChS in einer Konzentration von 3,3 mg/ml, die gemäß dem Protokoll von Beispiel 4 hergestellt wurden
[0097] C - Hydrogele mit Zusatz von ChS in einer Konzentration von 10 mg/ml, die gemäß dem Protokoll von Beispiel 5 hergestellt wurden.
[0098] Die Abbaugeschwindigkeit wurde als Anstieg der Konzentration der durch BTH verursachten Produkte, ausgedrückt in Prozent, ausgedrückt.
[0099] Die Hydrogele wurden in das Abbaumedium eingetaucht (Lösung von Hyaluronidase BTH mit einer Aktivität von 30 E/mg in einer Lösung von Rinderserumalbumin (BSA) in einer Konzentration von 0,1 mg/ml in 0,01 mol/l Acetatpuffer (OP) pH 5,3). Der Abbau der Hydrogele erfolgte im Inkubator bei 37 °C unter Rühren. Nach bestimmten Zeitintervallen wurden Proben des Abbaumediums mit den Produkten des Hydrogelabbaus entnommen. Die Konzentration der HA-Disaccharideinheiten im Abbaumedium wurde spektrophotometrisch als Konzentration von N-Acetylglucosamin bestimmt. Fig. 3 stellt den Anstieg der Konzentration von Hydrogel-Abbauprodukten im Medium im Laufe der Zeit dar. Aus der Figur geht hervor, dass die Anwesenheit von ChS in Hydrogelen auf der Basis von crossHA-TA zu einer Verringerung der Abbaugeschwindigkeit der Materialien durch die Wirkung von Hyaluronidase führt.
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Claims (5)
1. Hydrogel auf Basis eines vernetzten Hydroxyphenylderivats der Hyaluronsäure, dadurch gekennzeichnet, dass es Moleküle des Hydroxyphenylderivats der Hyaluronsäure (HA-TA) oder seines pharmazeutisch verträglichen Salzes der allgemeinen Formel | enthält
>
X
wobei n im Bereich von 2 bis 7500 liegt und wobei R' H* oder ein lon eines Alkalisalzes oder Erdalkalimetall-Salzes ist und R? OH oder ein Tyraminsubstituent der allgemeinen Formel II
ist: > CH O A NE em UL Le ] EN Le a Se
{IL}
wobei in einem Molekül des Hydroxyphenylderivats der Hyaluronsäure oder seines pharmazeutisch verträglichen Salzes der allgemeinen Formel I, mindestens ein R* ein Tyraminsubstituent der allgemeinen Formel Il ist und wobei mindestens zwei Tyraminsubstituenten der allgemeinen Formel Il mit einer kovalenten Bindung in einer beliebigen ortho-Position von Phenylgruppen verbunden sind,
und ferner Chondroitinsulfat oder sein pharmazeutisch verträgliches Salz, ausgewählt aus der Gruppe, die Alkalisalze oder Erdalkalimetall-Salze aufweist, enthalten sind.
2. Hydrogel nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Alkalisalze oder Erdalkalimetall-Salze aus der Gruppe ausgewählt sind, die Na*, K*, Ca**, Mg** aufweist.
3. Hydrogel nach Anspruch 1 oder Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass die Konzentration von Chondroitinsulfat oder seines pharmazeutisch verträglichen Salzes im Bereich von 0,5 bis 50 mg/ml Hydrogel liegt, vorzugsweise bei einer Konzentration von 1 bis 20 mg/ml, bevorzugter 5 mg/ml.
4. Hydrogel nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass der Gehalt des vernetzten Hydroxyphenylderivats von Hyaluronan im Bereich von 5 bis 30 mg/ml, vorzugsweise 10 mg/ml Hydrogel liegt.
5. Hydrogel nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass es ferner Hyaluronsäure oder ihr pharmazeutisch verträgliches Salz in einer Konzentration von 1 bis 20 mg/ml Hydrogel, vorzugsweise 5 bis 10 mg/ml Hydrogel, besonders bevorzugt 5 mg/ml Hydrogel enthält.
Hierzu 2 Blatt Zeichnungen
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