SK500272022U1

SK500272022U1 - Hydrogél na báze zosieťovaného hydroxyfenylového derivátu kyseliny hyalurónovej

Info

Publication number: SK500272022U1
Application number: SK500272022U
Authority: SK
Inventors: Ing. Toropitsyn Evgeniy; PharmDr. Pravda Martin, PhD.; Ing. Kovářová Lenka; Ing. Bystroňová Julie; doc. RNDr. CSc. ebný Vladimír
Original assignee: Contipro A.S.
Priority date: 2019-09-06
Filing date: 2020-09-03
Publication date: 2022-07-27
Also published as: SK9649Y1; AT18104U1; FR3104945A3; WO2021043349A1; CZ33324U1; DE212020000715U1; FR3104945B3

Abstract

Hydrogél na báze zosieťovaného hydroxyfenylového derivátu kyseliny hyalurónovej, ktorý obsahuje molekuly hydroxyfenylového derivátu hyalurónovej kyseliny, HA-TA, alebo jeho farmaceuticky prijateľnú soľ podľa všeobecného vzorca (I), kde n je v rozmedzí 2 až 7 500 a kde R1 je H+ alebo ión alkalickej soli, alebo soli alkalických zemín a R2 je OH alebo tyramínový substituent podľa všeobecného vzorca (II), pričom v rámci jednej molekuly hydroxyfenylového derivátu hyalurónovej kyseliny alebo jeho farmaceuticky prijateľnej soli podľa všeobecného vzorca (I) je aspoň jeden R2 tyramínový substituent podľa všeobecného vzorca (II), a pričom aspoň dva tyramínové substituenty podľa všeobecného vzorca (II) sú spojené prostredníctvom kovalentnej väzby v ktorejkoľvek orto polohe fenylových skupín, a ďalej obsahuje chondroitín sulfát alebo jeho farmaceuticky prijateľnú soľ vybranú zo skupiny obsahujúcej alkalické soli alebo soli alkalických zemín.

Description

Oblasť techniky

Technické riešenie sa týka hydrogélu na báze zosieťovaného hydroxyfenylového derivátu kyseliny hyalurónovej v zmesi s chondroitín sulfátom so zlepšenou mierou degradácie.

Doterajší stav techniky

Kyselina hyalurónová (tiež hyaluronan, HA) je polysacharid zo skupiny glykoz- aminoglykánov, ktorý sa skladá z disacharidických jednotiek zložených z kyseliny D-glukurónovej a /V-acetyl-D-glukozamínu. Jedná sa o polysacharid, ktorý je ľahko rozpustný vo vodnom prostredí, kde v závislosti na molekulovej hmotnosti a koncentrácii vytvára viskózne roztoky až viskoelastické hydrogély. HA je prirodzenou zložkou medzibunkovej hmoty tkanív. Väzbou na špecifické povrchové bunkové receptory je molekula hyaluronanu schopná interagovať s bunkami vo svojom okolí a regulovať ich metabolické procesy (Xu, Jha a kol. 2012). Z týchto dôvodov sú materiály obsahujúce hyaluronan prípadne jeho deriváty často využívané na výrobu prípravkov používaných v biomedicínskych aplikáciách. Hydrogély na báze hyaluronanu v organizme podstupujú prirodzenú degradáciu pôsobením špecifických enzýmov (hyaluronidáz), prípadne pôsobením reaktívnych foriem kyslíka (ROS), vďaka čomu dochádza po ich implantácii do organizmu k ich postupnému vstrebaniu (Stern, Kogan a kol. 2007).

Na dosiahnutie mechanicky odolnejších materiálov a z dôvodu spomalenia ich biodegradácie bol vyvinutý rad typov hydrogélov obsahujúcich kovalentne zosietený hyaluronan. Takéto hydrogély sú využívané ako materiály na viskosuplementáciu synoviálnej tekutiny, augmentáciu mäkkých tkanív, slúžia ako podporné štruktúry na kultiváciu a implantáciu buniek a pod. (Tognana, Borrione a kol. 2007, Buck li, Alam a kol. 2009, Li, Raitcheva a kol. 2012, Salwowska, Bebenek a kol. 2016).

V minulosti boli taktiež vyvinuté rôzne typy derivátov hyaluronanu, ktoré sú schopné podstupovať prechod sol-gel za fyziologických podmienok in situ (Burdick and Prestwich 2011, Prestwich 2011). Na tieto účely je možné využiť napr. fenolické deriváty hyaluronanu. Calabro a kol. (Calabro, Akst a kol. 2008, Lee, Chung a kol. 2008, Kurisawa, Lee a kol. 2009) opisujú v spisoch EP1587945B1 a EP1773943B1 postup prípravy fenolických derivátov hyaluronanu reakciou karboxylov prítomných v štruktúre D-glukurónovej kyseliny hyaluronanu, s aminoalkyl-derivátmi fenolu napr. tyramínom. Produktom tejto reakcie sú amidy hyaluronanu (Darr a Calabro 2009).

Zosietenie fenolických derivátov hyaluronanu môže byť iniciované prídavkom peroxidázy (napr. chrenovej peroxidázy) a zriedeného roztoku peroxidu vodíka. Chrenová peroxidáza (Horseradish peroxidase, HRP, E.C.1.11.1.7) je v súčasnej dobe využívaná ako katalyzátor organických a biotransformačných reakcií (Akkara, Senecal a kol. 1991, Higashimura a Kobayashi 2002, Ghán, Shutava a kol. 2004, Shutava, Zheng a kol. 2004, Veitch 2004). Hydrogély na báze hydroxyfenylových derivátov hyaluronanu môžu byť využívané ako injekčné aplikovateľné matrice na riadené uvoľňovanie biologicky aktívnych látok alebo ako materiály vhodné na kultiváciu a implantáciu buniek (Kurisawa, Lee a kol. 2010). Wolfová a kol. opisujú v spise CZ303879 konjugát hyaluronanu a tyramínu obsahujúci alifatický linker vložený medzi reťazec polyméru a tyramín. Prítomnosť alifatického linkera umožňuje vyššiu efektivitu sieťovacej reakcie a dodáva sieti vyššiu elasticitu.

Chondroitín sulfát (ChS) je ďalším zástupcom glykozaminoglykánov, ktorý je často využívaný na prípravu materiálov určených na využitie v liečbe degeneratívnych chorôb, napr. osteoartrózy (OA). Reťazec ChS je tvorený disacharidickými jednotkami zloženými z /V-acetylgalaktozamínu (GalNAc) a kyseliny idurónovej (IdoA). Disacharidické jednotky ChS môžu byť sulfatované v polohe 4 a 6 GalNAc a prípadne aj v polohe 2 IdoA. Chondroitín sulfát je lineárny, sulfatovaný a negatívne-nabitý glykozaminoglykán zložený z opakujúcich sa monomérnych jednotiek /V-acetyl-D-galaktozamínu a kyseliny D-glukurónovej navzájom prepojených β(1—>3) a β(1—>4) O-glykozidickými väzbami (štruktúrny vzorec chondroitín sulfátu pozri nižšie).

kde

SK 50027-2022 U1

R¹ je H alebo Na,

R² je H, O-SO2-OH alebo O-SO₂-ONa

Zdrojom chondroitín sulfátu sú živočíšne spojivové tkanivá, kde sa viaže na proteíny a tvorí tak súčasť proteoglykánov. Sulfatácia chondroitínu sa uskutočňuje pomocou sulfotransferáz v rôznych polohách a rôznom zastúpení. Jedinečný vzorec sulfatácie jednotlivých polôh v polymérnom reťazci kóduje špecifickú biologickú aktivitu chondroitín sulfátu. Ten je dôležitým stavebným blokom chrupavky v kĺboch, ktorým dodáva odolnosť v tlaku a obnovuje rovnováhu v zložení kĺbového maziva (Baeurle S. A., Kiselev M. G., Makarova E. S., Nogovitsin E. A. 2009. Polymér 50: 1805). Chondroitín sulfát sa spoločne s glukozamínom používa ako výživový doplnok na liečenie, alebo tiež na prevenciu vzniku osteoartritídy u ľudí (napr. Flextor®, Advance Nutraceutics, Ltd.) alebo u zvierat (napr. Geloren^dog®, Contipro Pharma, Ltd.). Z farmaceutického hľadiska sa chondroitín sulfát považuje za liečivo s oneskoreným nástupom účinku tlmenia bolesti pri degeneratívnom ochorení kĺbov (Aubry-Rozier B. 2012. Revue Médicale Suisse 14: 571).

In vitro a in vivo štúdie ukázali, že ChS inhibuje účinok hyaluronidáz. Inhibičný účinok ChS na enzýmy je spôsobený tvorbou elektrostatických (iónových) interakcií. Tiež bolo preukázané, že ChS je schopný zachycovať ROS, a tým chrániť pred degradáciou zložky extracelulárnej matrice (Báli, Cousse a kol. 2001, Xiong and Jin 2007).

Využitie kombinácie hyaluronanu a chondroitín sulfátu na prípravu prostriedku na ochranu ľudských alebo živočíšnych buniek a tkanív pred traumatizáciou opisuje dokument EP0136782 (1983). Podobne dokument US6051560 (1992) opisuje využitie zmesi hyaluronanu a chondroitín sulfátu ako viskosuplementačných materiálov počas oftalmologických zákrokov. Patent WO030417024 opisuje viskóznu kompozíciu obsahujúcu terapeuticky účinné množstvo zmesi ChS a HA na výrobu liekov určených na liečbu kĺbov ľudí s poškodením chrupavky spôsobeným chondromaláciou alebo OA stupňa I a II, ktorá využíva intraartikulárne podanie zmesi. V patentovej literatúre taktiež nájdeme dokumenty, ktoré opisujú prostriedok na parenterálne podanie vhodný na prevenciu a liečbu poškodenia kĺbovej chrupavky u ľudí alebo zvierat, ktorý sa skladá z terapeuticky účinného množstva chondroitín sulfátu, hyaluronanu a glukozamínu (WO2004034980, 2002). Dokument EP2219595 opisuje formuláciu na báze polysacharidov, najmä glykozaminoglykánov, a ich zmesi s flavonoidmi, ktorá tvorí hydrogély s predĺženou dobou biodegradácie. Uvedený dokument opisuje aj hydrogél obsahujúci hyaluronan, derivát hyaluronanu zosietený butándiol 1,4-diglycidyléterom a ChS, ktorý vykazuje zvýšenú odolnosť voči degradácii pôsobením enzýmu hyaluronidázy.

Podstata technického riešenia

Technické riešenie sa týka hydrogélu na báze zosieťovaného hydroxyfenylového derivátu kyseliny hyalurónovej, ktorého podstatou je, že obsahuje molekuly hydroxyfenylového derivátu hyalurónovej kyseliny (HA-TA) alebo jeho farmaceutický prijateľnú soľ podľa všeobecného vzorca (I) (I), kde n je v rozmedzí 2 až 7500 a kde R¹ je H⁺ alebo ión alkalickej soli alebo soli alkalických zemín a R² je OH alebo tyramínový substituent podľa všeobecného vzorca (II):

OH

NH

NH (Π) pričom v rámci jednej molekuly hydroxyfenylového derivátu hyalurónovej kyseliny alebo jeho farmaceutický prijateľnej soli podľa všeobecného vzorca (I) aspoň jeden R² je tyramínový substituent podľa všeobecného

SK 50027-2022 U1 vzorca (II) a pričom aspoň dva tyramínové substituenty podľa všeobecného vzorca (II) sú spojené prostredníctvom kovalentnej väzby v ktorejkoľvek orto polohe fenylových skupín, a ďalej obsahuje chondroitín sulfát alebo jeho farmaceutický prijateľnú soľ vybranú zo skupiny obsahujúcej alkalické soli alebo soli alkalických zemín.

Alkalické soli alebo soli alkalických zemín hydroxyfenylového derivátu hyalurónovej kyseliny podľa všeobecného vzorca (I) alebo chondroitín sulfátu sú výhodne vybrané zo skupiny obsahujúcej Na⁺, K⁺, Ca²⁺, Mg²⁺.

Koncentrácia chondroitín sulfátu alebo jeho farmaceutický prijateľnej soli je v rozsahu 0,5 až 50 mg/ml hydrogélu podľa technického riešenia, výhodne v koncentrácii 1 až 20 mg/ml, výhodnejšie 5 mg/ml.

Obsah zosieťovaného hydroxyfenylového derivátu hyaluronanu je v rozsahu 5 až 30 mg/ml, výhodne 10 mg/ml hydrogélu podľa technického riešenia.

Podľa ďalšieho výhodného uskutočnenia technického riešenia hydrogél ďalej obsahuje kyselinu hyalurónovú alebo jej farmaceutický prijateľnú soľ v koncentrácii 1 až 20 mg/ml, výhodne 5 až 10 mg/ml, výhodnejšie 5 mg/ml hydrogélu podľa technického riešenia.

Kovalentná väzba môže byť v rámci jednej molekuly derivátu kyseliny hyalurónovej podľa všeobecného vzorca (I) v ktorejkoľvek orto polohe fenylových skupín aspoň dvoch tyramínových substituentov všeobecného vzorca (II), ktoré sa v tejto molekule nachádzajú. Jedná sa o takzvané intramolekulárne zosieťovanie. Tiež môže byť kovalentná väzba v ktorejkoľvek orto polohe fenylových skupín aspoň dvoch tyramínových substituentov všeobecného vzorca (II), ktoré sa nachádzajú v rôznych molekulách derivátu kyseliny hyalurónovej podľa všeobecného vzorca (I). To predstavuje navzájom prepojenú sieť medzi molekulami derivátu HA.

Príklad kovalentne zosieteného hydroxyfenylového derivátu hyaluronanu. (crossHA- TA) je schematický ukázaný nižšie, pozri vzorec (III):

Takéto hydrogély podľa technického riešenia vykazujú zvýšenú odolnosť voči biodegradačným pochodom vznikajúcim pôsobením hydrolytických enzýmov a reaktívnych foriem kyslíka.

Podľa výhodného uskutočnenia je hmotnostne stredná molárna hmotnosť (Mw) hydroxyfenylového derivátu hyaluronanu podľa všeobecného vzorca (I) v rozsahu 5 x 10⁴ až 1,5 x 10⁶ g.moľ¹, výhodne 2,5 x 10⁵až 1 x 10⁶ g.moľ¹, výhodnejšie 8 x 10⁵ g.moľ¹. PI je v rozsahu 1 až 3.

Podľa ďalšieho uskutočnenia technického riešenia je stupeň substitúcie (DS) hydroxyfenylového derivátu hyaluronanu všeobecného vzorca (I) v rozsahu 0,5 až 10 %, výhodne 1 až 4 %, výhodnejšie 1 %.

Podľa ďalšieho výhodného uskutočnenia je Mw chondroitín sulfátu v rozsahu 5 x 10³ až 95 x 10³ g.moľ¹, ďalej výhodne 10 x 10³ až 40 x 10³ g.moľ¹.

Podľa výhodného uskutočnenia hydrogél obsahuje hyaluronan (HA) alebo jeho farmaceutický prijateľnú soľ s Mw v rozsahu 5 x 10⁴ až 2,5 x 10⁶ g.moľ¹, výhodne 1,5 x 10⁶ až 2,5 x 10⁶ g.moľ¹, výhodnejšie 2,0 x 10⁶g. moľ¹.

Takéto hydrogély podľa technického riešenia môžu byť použité v kozmetike, medicíne a regeneratívnej medicíne, najmä na prípravu materiálov na regeneráciu tkaniva, augmentáciu tkaniva, prípravu scaffoldov pre tkanivové inžinierstvo, ako matrica na riadené uvoľňovanie biologicky aktívnych látok a liečiv a viskosuplementáciu synoviálnej tekutiny.

SK 50027-2022 U1

Prehľad obrázkov na výkresoch

Obr. 1: Porovnanie rýchlosti degradácie roztokov HA s prídavkom ChS pomocou ROS

Obr. 2: Porovnanie rýchlosti degradácie materiálov pomocou ROS

Obr. 3: Kumulatívna degradácia hydrogélu [%] BTH 30 U/mg

Príklady uskutočnenia

DS = stupeň substitúcie = 100 % * molárne množstvo modifikovaných disacharidických jednotiek hyaluronanu/molárne množstvo všetkých disacharadických jednotiek derivátu hyaluronanu. Stupeň substitúcie bol stanovený pomocou ³H NMR spektroskopiou.

Hmotnostne stredná molárna hmotnosť (Mw) a index polydisperzity (PI) boli stanovené metódou SECMALLS.

Infračervené spektrá pripravených derivátov boli získané metódou FT-IR.

Bol použitý chondroitín sulfát vo farmaceutickej kvalite na injekčné podanie od Bioiberica, ES.

Príklad 1

Syntéza tyramínovaného derivátu HA (HA-TA)

Syntéza 6-amino-/V-[2(4hydroxyfenyl)ethyl]hexánamidu

6-[(terc-Butoxykarbonyl)amino]hexanová kyselina (1,00 g, 4,3 mmol) bola rozpustená v 50 ml tetrahydrofuránu (THF). K roztoku kyseliny bol pridaný 1,1'- karbodiimidazol (0,70 g, 4,3 mmol). Zmes bola zahrievaná na 50 °C po dobu šesťdesiatich minút. Potom bola reakčná nádoba premytá inertným plynom. K reakčnej zmesi bol pridaný tyramín (0,59 g, 4,3 mmol). Zmes bola ďalej zahrievaná ďalšie 2 hodiny. Potom bol destiláciou za zníženého tlaku odstránený THF. Odparok bol rozpustený v 50 ml etylacetátu. Roztok bol premytý 150 ml čistenej vody (rozdelené do troch dielov). Organická vrstva bola vysušená nad molekulovým sitom. Etylacetát bol odstránený destiláciou za zníženého tlaku. Odparok bol rozpustený v 50 ml MeOH a k roztoku boli pridané 2 ml trifluóroctovej kyseliny (TFA). Roztok bol zahrievaný 6 hodín pod spätným chladičom. Rozpúšťadlo bolo odstránené destiláciou za zníženého tlaku. Odparok bol rozpustený v 50 ml etylacetátu. Roztok bol premytý 150 ml čistenej vody (rozdelené do troch dielov). Organická vrstva bola vysušená nad molekulovým sitom. Etylacetát bol odstránený destiláciou za zníženého tlaku.

m = 0,75 g (70 % teórie) ³H NMR (P₂O, ppm) δ: 1,17 (m, 2 H, y-CH₂- hexánovej kyseliny); l,48(m, 2 H, β- CH₂- hexánovej kyseliny); 1,58 (m, 2 H, 5-CH₂- hexánovej kyseliny); 2,17 (t, 2 H, - CH₂-CO-); 2,73 (m, 2 H, -CH₂-Ph); 2,91 (m, 2 H, -CH₂NH₂); 3,42 (m, 2 H, -CH₂- NH-CO-); 6,83 (d, 2 H, aróm); 7,13 (d, 2 H, aróm).

¹³C NMR(D₂O, ppm) δ: 24 (y-C- hexánovej kyseliny); 26 (δ-C- hexánovej kyseliny); 33 (β-C- hexánovej kyseliny); 35 (-C-CO-); 39 (-C-NH₂); 40 (C-Ph); 63 (-C-NH-CO- ); 115 (C3 aróm); 126 (C1 aróm); 130 (C2 aróm.); 153 (C4arom); 176 (-CO-).

Príprava aldehydického derivátu (HA-CHO)

Hylauronan (10,00 g, M_w. = 2 x 10⁶ g.mol -¹) bol rozpustený v 750 ml 2,5 % (w/w) roztoku Na₂HPO₄. 12 H₂O. Roztok bol vychladený na 5 °C. K vzniknutému roztoku bolo pridaných 2,60 g NaBr a 0,05 g 4-acetamido-2,2,6,6-tetrametylpiperidín-l- oxylu. Po dôkladnej homogenizácii roztoku boli k reakčnej zmesi pridané 3 ml roztoku NaCIO (10 -15 % dostupného Cl₂). Reakcia pokračovala za stáleho miešania 15 min. Reakcia bola ukončená prídavkom 100 ml 40 % roztoku propán-2-olu. Produkt bol prečistený ultrafiltráciou a izolovaný precipitáciou propán-2-olom.

IČ(KBr): 3417, 2886, 2152,1659,1620,1550,1412,1378,1323,1236,1204,1154,1078,1038, 945, 893 cm¹. ³H NMR (P₂O) δ: 2,01 (s, 3 H, CH3-), 3,37 - 3,93 (m, skelet hyaluronanu), 4,46 (s, 1H, anomér), 4,54 (s, 1H anomér, -O-CH(OH)-), 5,27 (geminálny glykol -CH- (OH)₂).

a) Príprava tyramínovaného derivátu HA s C₆ spacerom (Mw = 3 x 10⁵ g.moľ¹, DS = 2 %)

Aldehydický derivát HA (= 3 x 10⁵ g.moľ¹, DS = 9 %) (5,00 g) bol rozpustený v 500 ml demineralizovanej vody. Pomocou kyseliny octové bolo pH roztoku upravené na 3. K roztoku HA-CHO bol pridaný 6-amino-/V-[2-(4- hydroxyfenyl)etyl]hexánamid (medzi-produkt (I)) (1,25 g, 5 mmol). Zmes bola miešaná 2 hodiny pri laboratórnej teplote. Potom bol do reakčnej zmesi pridaný komplex pikolín-boran (0,270 g, 2,5 mmol). Zmes bola miešaná ďalších 12 hodín pri laboratórnej teplote. Produkt bol prečistený ultrafiltráciou a izolovaný z retentátu precipitáciou propán-2-olom. Precipitát bol zbavený vlhkosti a zvyškového propán-2-olu sušením v teplovzdušnej sušiarni (40 °C, 3 dni).

SK 50027-2022 U1

IČ(KBr): 3425, 2893, 2148,1660,1620,1549,1412,1378,1323,1236,1204,1154,1078,1038, 945, 893 cm T ¹H NMR (D₂O) δ: 1,25 (t, 2 H, y-CH₂- aminohexánovej kyseliny), 1,48 (m, 2 H, δ- CH2- aminohexánovej kyseliny)l,51 (m, 2 H, P-CH2- aminohexánovej kyseliny), 2,01 (s, 3 H, CH₃-), 2,65 (m, 2H, Ph-CH₂-), 2,73 (m, 2H, e-CH₂- aminohexánovej kyseliny), 3,37 - 3,93 (m, skelet hyaluronanu), 4,46 (s, 1H, anomér), 4,54 (s, 1H anomér., -O-CH(OH)-), 6,59 (d, 2H, aróm.), 7,01 (d, 2H. aróm).

SEC MALLS: Mw = 2,78 x 10⁵ g.moľ¹

PS PH NMR): 2,1 %

b) Príprava tyramínovaného derivátu HA s C₆ spacerom (Mw = 8 x 10⁵ g.moľ¹, DS = 1 %)

Aldehydický derivát HA (Mw = 8 x 10⁵ g.moľ¹, DS = 5 %) (5,00 g) bol rozpustený v 500 ml demineralizovanej vody. Pomocou kyseliny octovej bolo pH roztoku upravené na 3. K roztoku HA-CHO bol pridaný 6-amino/V-[2-(4- hydroxyfenyl)ethyl]hexánamid (medziprodukt (I)) (0,625 g, 2,5 mmol). Zmes bola miešaná 2 hodiny pri laboratórnej teplote. Potom bol do reakčnej zmesi pridaný komplex pikolín-boran (0,270 g, 2,5 mmol). Zmes bola miešaná ďalších 12 hodín pri laboratórnej teplote. Produkt bol prečistený ultrafiltráciou a izolovaný z retentátu precipitáciou propán-2-olom. Precipitát bol zbavený vlhkosti a zvyškového propán-2-olu sušením v teplovzdušnej sušiarni (40 °C, 3 dni).

IČ (KBr): 3425, 2893, 2148, 1660, 1620, 1549, 1412, 1378, 1323, 1236, 1204, 1154, 1078, 1038, 945, 893 cm' i ^XH NMR (D₂O) δ: 1,25 (t, 2 H, y-CH₂- aminohexánovej kyseliny), 1,48 (m, 2 H, δ- CH₂- aminohexánovej kyseliny), 1,51 (m, 2 H, β-ΟΗ₂- aminohexánovej kyseliny), 2,01 (s, 3 H, CH₃-), 2,65 (m, 2H, Ph-CH₂-), 2,73 (m, 2H, e-CH₂- aminohexánovej kyseliny), 3,37 - 3,93 (m, skelet hyaluronanu), 4,46 (s, 1H, anomér), 4,54 (s, 1H anomér., -O-CH(OH)-), 6,59 (d, 2H, aróm.), 7,01 (d, 2H. aróm).

SEC MALLS: Mw = 8,09 x 10⁵ g.moľ¹

DS PH NMR): 1,1 %

c) Príprava tyramínovaného derivátu HA s C₆ spacerom (Mw = 1,5 x 10⁶ g.moľ¹, DS = 0,5 %)

Aldehydický derivát HA (Mw = 1,5 x 10⁶ g.moľ¹, DS = 0,5 %) (5,00 g) bol rozpustený v 500 ml demineralizovanej vody. Pomocou kyseliny octovej bolo pH roztoku upravené na 3. K roztoku HA-CHO bol pridaný 6-amino-/V-[2-(4- hydroxyfenyl)etyl]hexán-amid (medziprodukt (I)) (0,625 g, 2,5 mmol). Zmes bola miešaná 2 hodiny pri laboratórnej teplote. Potom bol do reakčnej zmesi pridaný komplex pikolín-boran (0,270 g, 2,5 mmol). Zmes bola miešaná ďalších 12 hodín pri laboratórnej teplote. Produkt bol prečistený ultrafiltráciu a izolovaný z retentátu precipitáciou propán-2-olom. Precipitát bol zbavený vlhkosti a zvyškového propán- 2-olu sušením v teplovzdušnej sušiarni (40 °C, 3 dni).

IČ (KBr): 3425, 2893, 2148,1660,1620,1549,1412,1378,1323,1236,1204,1154,1078,1038, 945, 893 cm¹. ^XH NMR (D₂O) δ: 1,25 (t, 2 H, y-CH₂- aminohexánovej kyseliny), 1,48 (m, 2 H, δ- CH₂- aminohexánovej kyseliny)l,51 (m, 2 H, β -CH₂- aminohexánovej kyseliny), 2,01 (s, 3 H, CH₃-), 2,65 (m, 2H, Ph-CH₂-), 2,73 (m, 2H, e-CH₂- aminohexánovej kyseliny), 3,37 - 3,93 (m, skelet hyaluronanu), 4,46 (s, 1H, anomér), 4,54 (s, 1H anomér., -O-CH(OH)-), 6,59 (d, 2H, aróm.), 7,01 (d, 2H. aróm).

SEC MALLS: Mw = 1,5 x 10⁶ g.moľ¹

DS PH NMR): 0,5 %

d) Príprava tyramínovaného derivátu HA s C₆ spacerem (Mw = 5x 10⁴ g.moľ¹, DS -10 %)

Aldehydický derivát HA (Mw = 5 x 10⁴ g.moľ¹, DS = 10 %) (5,00 g) bol rozpustený v 500 ml demineralizovanej vody. Pomocou kyseliny octové bolo pH roztoku upravené na 3. K roztoku HA-CHO bol pridaný 6-amino-/V-[2-(4-hydroxy- fenyl)ethyl]hexanamid (medzi-produkt (I)) (0,625 g, 2,5 mmol). Zmes bola miešaná 2 hodiny pri laboratórnej teplote. Potom bol do reakčnej zmesi pridaný komplex pikolín-boran (0,270 g, 2,5 mmol). Zmes bola miešaná ďalších 12 hodín pri laboratórnej teplote. Produkt bol prečistený ultrafiltráciou a izolovaný z retentátu precipitáciou propán-2-olom. Precipitát bol zbavený vlhkosti a zvyškového propán- 2-olu sušením v teplovzdušnej sušiarni (40 °C, 3 dni).

IČ (KBr): 3425, 2893, 2148, 1660, 1620, 1549, 1412, 1378, 1323, 1236, 1204, 1154, 1078, 1038, 945, 893 cm' i ^XH NMR (D₂O) δ: 1,25 (t, 2 H, y-CH₂- aminohexánovej kyseliny), 1,48 (m, 2 H, δ- CH₂- aminohexánovej kyseliny), 1,51 (m, 2 H, β-ΟΗ₂- aminohexánovej kyseliny), 2,01 (s, 3 H, CH₃-), 2,65 (m, 2H, Ph-CH₂-), 2,73 (m, 2H, e-CH₂- aminohexánovej kyseliny), 3,37 - 3,93 (m, skelet hyaluronanu), 4,46 (s, 1H, anomér), 4,54 (s, 1H anomér., -O-CH(OH)-), 6,59 (d, 2H, aróm.), 7,01 (d, 2H, aróm).

SEC MALLS: Mw = 5 x 10⁴ g.moľ¹

DS PH NMR): 10 %

Príklad 2

Príprava hydrogélov na báze hydroxyfenylového derivátu HA-TA s koncentráciou 20 mg/ml

SK 50027-2022 U1

Hydrogély boli pripravené zmiešaním dvoch prekurzorových roztokov A a B, na ich prípravu bol použitý vodný roztok NaCI (9 g/l). Na prípravu prekurzorových roztokov bol použitý hydroxyfenylový derivát HA-TA s Mw = 2,78 x 10⁵ g.mol¹ a DS 2,1 %. Zloženie roztokov je uvedené v nasledujúcej tabuľke (Tabuľka 1).

Tabuľka 1: Zloženie prekurzorových roztokov na prípravu hydrogélov na báze hydroxyfenylového derivátu HA-TA s koncentráciou 20 mg/ml

Roztok A	Roztok B
HRP...........	...0,48 U/ml	h₂o₂.......	2,0 mmol/l
HA-TA........	... 20 mg/ml	HA-TA....	20 mg/ml
NaCI...........	.... 9 g/l	NaCI.......	9 g/l

Zmiešaním roztoku A a roztoku B v pomere 1 : 1 boli pripravené hydrogély s finálnym zložením, uvedeným v nasledujúcej tabuľke (Tabuľka 2), kde crossHA- TA je kovalentne zosieteným hydroxyfenylovým derivátom hyaluronanu.

Tabuľka 2: Finálne zloženie hydrogélov na báze hydroxyfenylového derivátu HA-TA s koncentráciou 20 mg/ml ______________________________

Zloženie hydrogélov
HRP..................	......0,24 U/ml
crossHA-TA......	........20 mg/ml
NaCI..................	......9 g/l

Príklad 3

Príprava hydrogélov, obsahujúcich ChS s koncentráciou 0,5 mg/ml

Hydrogély boli pripravené zmiešaním dvoch prekurzorových roztokov A a B, na prípravu ktorých bol použitý vodný roztok NaCI (9 g/l). Na prípravu prekurzorových roztokov bol použitý hydroxyfenylový derivát HA-TA s Mw = 2,78 x 10⁵ g.mol¹ a DS 2,1 % a ChS s Mw = 10 x 10³ - 40 x 10³ g.moľ¹. Zloženie roztokov je uvedené v nasledujúcej tabuľke (Tabuľka 3).

Tabuľka 3: Zloženie prekurzorových roztokov na prípravu hydrogélov obsahujúce ChS s koncentráciou 0,5 mg/ml

Roztok A	RoztokB
HRP........0,48 U/ml	H₂O₂.........	.....2,0 mmol/l
HA-TA....20 mg/ml	HA-TA......	....20 mg/ml
ChS........0,5 mg/ml	ChS..........	....0,5 mg/ml
NaCI.......9 g/l	NaCI.........	...9 g/l

Zmiešaním roztoku A a roztoku B v pomere 1 : 1 boli pripravené hydrogély s finálnym zložením, uvedeným v nasledujúcej tabuľke (Tabuľka 4), kde crossHA- TA je kovalentne zosieteným hydroxyfenylovým derivátom hyaluronanu.

Tabuľka 4: Finálne zloženie hydrogélov obsahujúce ChS s koncentráciou 0,5 mg/ml

Zloženie hydrogélov
HRP................	.....0,24 U/ml
crossHA-TA....	.....20 mg/ml
ChS................	....0,5 mg/ml
NaCI...............	....9 g/l

Príklad 4

Príprava hydrogélov, obsahujúcich ChS s koncentráciou 3,3 mg/ml

Hydrogély boli pripravené zmiešaním dvoch prekurzorových roztokov A a B, na prípravu ktorých bol použitý vodný roztok NaCI (9 g/l). Na prípravu prekurzorových roztokov bol použitý hydroxyfenylový derivát

SK 50027-2022 U1

HA-TA s Mw = 2,78 x 10⁵ g.mol·¹ a DS 2,1 % a ChS s Mw = 10 x 10³ - 40 x 10³ g.moľ¹. Zloženie roztokov je uvedené v nasledujúcej tabuľke (Tabuľka 5).

Tabuľka 5: Zloženie prekurzorových roztokov na prípravu hydrogélov obsahujúce ChS s koncentráciou 3,3 mg/ml

Roztok A	Roztok B
HRP..............................0,48 U/ml HA-TA..........................20 mg/ml ChS..............................3,3 mg/ml NaCI............................9 g/l	Η₂Ο₂.............................2,0 mmol/l HA-TA..........................20 mg/ml ChS..............................3,3 mg/ml NaCI.............................9 g/l

Zmiešaním roztoku A a roztoku B v pomere 1 : 1 boli pripravené hydrogély s finálnym zložením, uvedeným v nasledujúcej tabuľke (Tabuľka 6), kde crossHA- TA je kovalentne zosieteným hydroxyfenylovým derivátom hyaluronanu.

Tabuľka 6: Finálne zloženie hydrogélov obsahujúce ChS s koncentráciou 3,3 mg/ml

Zloženie hydrogélov
HRP...................	.......0,24 U/ml
crossHA-TA......	........20 mg/ml
ChS....................	......3,3 mg/ml
NaCI..................	......9 g/l

Príklad 5

Príprava hydrogélov, obsahujúcich ChS s koncentráciou 10 mg/ml

Hydrogély boli pripravené zmiešaním dvoch prekurzorových roztokov A a B, na prípravu ktorých bol použitý vodný roztok NaCI (9 g/l). Na prípravu prekurzorových roztokov bol použitý hydroxyfenylový derivát HA-TA s Mw = 2,78 x 10⁵ g.mol·¹ a DS 2,1 % a ChS s Mw = 10 x 10³ - 40 x 10³ g.mol·¹. Zloženie roztokov je uvedené v nasledujúcej tabuľke (Tabuľka 7).

Tabuľka 7: Zloženie prekurzorových roztokov na prípravu hydrogélov obsahujúce ChS s koncentráciou 10 mg/ml

Roztok A	Roztok B
HRP..................	...........0,48 U/ml	H2O2...................	.............2,0 mmol/l
HA-TA..............	...........20 mg/ml	HA-TA................	............20 mg/ml
ChS..................	...........10 mg/ml	ChS....................	............10 mg/ml
NaCI.................	..........9 g/l	NaCI...................	.............9 g/l

Zmiešaním roztoku A a roztoku B v pomere 1 : 1 boli pripravené hydrogély s finálnym zložením, uvedeným v nasledujúcej tabuľke (Tabuľka 8), kde crossHA- TA je kovalentne zosieteným hydroxyfenylovým derivátom hyaluronanu.

Tabuľka 8: Finálne zloženie hydrogélov obsahujúce ChS s koncentráciou 10 mg/ml

Zloženie hydrogélov HRP.................................0,24 U/ml crossHA-TA.......................20 mg/ml

ChS..................................10 mg/ml

NaCI................................9 g/l

SK 50027-2022 U1

Príklad 6

Príprava hydrogélov, obsahujúcich ChS s koncentráciou 50 mg/ml

Hydrogély boli pripravené zmiešaním dvoch prekurzorových roztokov A a B, na prípravu ktorých bol použitý vodný roztok NaCI (9 g/l). Na prípravu prekurzorových roztokov bol použitý hydroxyfenylový derivát HA-TA s Mw = 2,78 x 10⁵ g.mol¹ a DS 2,1 % a ChS s Mw = 10 x 10³ - 40 x 10³ g.moľ¹. Zloženie roztokov je uvedené v nasledujúcej tabuľke (Tabuľka 9).

Tabuľka 9: Zloženie prekurzorových roztokov na prípravu hydrogélov obsahujúce ChS s koncentráciou 50 mg/ml

Roztok A	Roztok B
HRP..................	...........0,48 U/ml	h₂o₂..................	............2,0 mmol/l
HA-TA..............	..........20 mg/ml	HA-TA...............	...........20 mg/ml
ChS..................	..........50 mg/ml	ChS...................	............50 mg/ml
NaCI.................	............9 g/l	NaCI..................	............9 g/l

Zmiešaním roztoku A a roztoku B v pomere 1: 1 boli pripravené hydrogély s finálnym zložením, uvedeným v nasledujúcej tabuľke (Tabuľka 10), kde crossHA- TA je kovalentne zosieteným hydroxyfenylovým derivátom hyaluronanu.

Tabuľka 10: Finálne zloženie hydrogélov obsahujúce ChS s koncentráciou 50 mg/ml

Zloženie hydrogélov
HRP.................	....0,24 U/ml
crossHA-TA....	..........20 mg/ml
ChS..................	.....50 mg/ml
NaCI................	....9 g/l

Príklad 7

Príprava hydrogélov, obsahujúcich HA s koncentráciou 5 mg/ml

Príprava hydrogélov, obsahujúcich nezosietenú kyselinu hyalurónovú zahŕňala 3 základné kroky:

1) Príprava hydrogélu obsahujúceho zosietený derivát crossHA-TA

Hydrogél obsahujúci zosietený derivát crossHA-TA bol pripravený zmiešaním dvoch prekurzorových roztokov A a B, ktoré boli pripravené rozpustením jednotlivých zložiek vo fosfátom pufrovanom fyziologickom roztoku (PBS). Na prípravu prekurzorových roztokov bol použitý hydroxyfenylový derivát HATA s Mw = 8,09 x 105 g.mol-1 a DS 1,1 %. Zloženie roztokov je uvedené v nasledujúcej tabuľke (Tabuľka 11).

Tabuľka 11: Zloženie prekurzorových roztokov na prípravu zosieteného derivátu crossHA-TA

Roztok A	Roztok B H₂O₂.........................	.......0,6 mmol/l
HRP...........................	........12,8 mU/ml
HA-TA.......................	........20 mg/ml	HA-TA.......................	........20 mg/ml
NaCI..........................	.........8 g/l	NaCI.........................	........8 g/l
KCI............................	........0,2 g/l	KCI............................	........0,2 g/l
Na₂HPO₄.12H₂O........	........2,85 g/l	Na₂HPO₄.12H₂O.......	........2,85 g/l
KH₂PO₄.....................	........0,2 g/l	KH₂PO₄.....................	........0,2 g/l

Zmiešaním roztoku A a roztoku B v pomere 1 : 1 bol pripravený hydrogél so zložením uvedenom v nasledujúcej tabuľke (Tabuľka 12).

SK 50027-2022 U1

Tabuľka 12: Zloženie zosieteného derivátu crossHA-TA

Zloženie zosieteného derivátu crossHA-TA
HRP...........................	........0,24 U/ml
crossHA-TA...............	..........20 mg/ml
NaCI..........................	..........8 g/l
KCI............................	.........0,2 g/l
Na₂HPO₄.12H₂O........	.............2,85 g/l
KH₂PO₄.....................	.........0,2 g/l

2) Príprava roztoku hyaluronanu

Roztok HA s koncentráciou 5 mg/ml bol pripravený rozpustením natívneho hyaluronanu s Mw 1,91 x 10⁶g.mol¹ v PBS.

3) Homogenizácia hydrogélu a roztoku hyaluronanu

Finálny hydrogél bol pripravený zmiešaním zosieteného derivátu crossHA-TA a roztoku HA v pomere 1 : 1 s následnou homogenizáciou zmesi. Finálne zloženie materiálu je uvedené v nasledujúcej tabuľke (Tabuľka 13).

Tabuľka 13: Finálne zloženie hydrogélu, obsahujúce HA s koncentráciou 5 mg/ml

Finálne zloženie
HRP....................	.0,12 U/ml
crossHA-TA........	......10 mg/ml
HA......................	..5 mg/ml
NaCI....................	-8 g/l
KCI......................	-0,2 g/l
Na₂HPO₄.12H₂O.	......2,85 g/l
KH₂PO₄...............	-0,2 g/l

Príklad 8

Príprava hydrogélov, obsahujúcich HA s koncentráciou 20 mg/ml

1) Príprava hydrogélu obsahujúceho zosietený derivát crossHA-TA

Hydrogél obsahujúci zosietený derivát crossHA-TA bol pripravený zmiešaním dvoch prekurzorových roztokov A a B, ktoré boli pripravené rozpustením jednotlivých zložiek vo fosfátom pufrovanom fyziologickom roztoku (PBS). Na prípravu prekurzorových roztokov bol použitý hydroxyfenylový derivát HATA s Mw = 8,09 x 10⁵ g.moľ¹ a DS 1,1 %. Zloženie roztokov je uvedené v nasledujúcej tabuľke (Tabuľka 14).

Tabuľka 14: Zloženie prekurzorových roztokov na prípravu zosieteného derivátu crossHA-TA

Roztok A	Roztok B
HRP...........................	..........12,8 mU/ml	H₂O₂.........................	........0,6 mmol/l
HA-TA.......................	...........20 mg/ml	HA-TA.......................	.........20 mg/ml
NaCI..........................	.........8 g/l	NaCI.........................	.........8 g/l
KCI............................	........0,2 g/l	KCI............................	.......0,2 g/l
Na₂HPO₄.12H₂O........	...........2,85 g/l	Na₂HPO₄.12H₂O.......	...........2,85 g/l
KH₂PO₄......................	........ 0,2 g/l	KH₂PO₄.....................	........ 0,2 g/l

Zmiešaním roztoku A a roztoku B v pomere 1 : 1 bol pripravený hydrogél so zložením uvedenom v nasledujúcej tabuľke (Tabuľka 15).

SK 50027-2022 U1

Tabuľka 15: Zloženie zosieteného derivátu crossHA-TA

Zloženie zosieteného derivátu crossHA-TA
HRP......................	.....0,24 U/ml
crossHA-TA...........	.......20 mg/ml
NaCI......................	.....8 g/l
KCI........................	0,2 g/l
Na₂HPO₄.12H₂O...	........2,85 g/l
KH₂PO₄.................	.....0,2 g/l

2) Príprava roztoku hyaluronanu

Roztok HA s koncentráciou 40 mg/ml bol pripravený rozpustením natívneho hyaluronanu s Mw 1,91 x 5 10⁶ g.moľ¹ vo fosfátovom pufri (PBS).

3) Homogenizácia hydrogélu a roztoku hyaluronanu

Finálny hydrogél bol pripravený zmiešaním zosieteného derivátu crossHA-TA a roztoku HA v pomere 1 : 1 s následnou homogenizáciou zmesi. Finálne zloženie materiálu je uvedené v nasledujúcej tabuľke (Tabuľka 16).

.0

Tabuľka 16: Finálne zloženie hydrogélu, obsahujúce HA s koncentráciou 20 mg/ml

Finálne zloženie
HRP........................	.....0,12 U/ml
crossHA-TA...........	.........10 mg/ml
HA..........................	.....20 mg/ml
NaCI.......................	....8 g/l
KCI.........................	.....0,2 g/l
Na₂HPO₄.12H₂O....	.......2,85 g/l
KH₂PO₄..................	.....0,2 g/l

Príklad 9

Príprava hydrogélov, obsahujúcich HA s koncentráciou 5 mg/ml a ChS s koncentráciou 5 mg/ml

Príprava hydrogélov, obsahujúcich nezosietenú kyselinu hyalurónovú a chondroitín sulfát zahŕňala 3 základné kroky:

1) Príprava hydrogélu obsahujúceho zosietený derivát crossHA-TA

Hydrogél obsahujúci zosietený derivát crossHA-TA bol pripravený zmiešaním dvoch prekurzorových 20 roztokov A a B, ktoré boli pripravené rozpustením jednotlivých zložiek vo fosfátom pufrovanom fyziologickom roztoku (PBS). Na prípravu prekurzorových roztokov bol použitý hydroxyfenylový derivát HATA s Mw = 8,09 x 10⁵ g.moľ¹ a DS 1,1 %. Zloženie roztokov je uvedené v nasledujúcej tabuľke (Tabuľka 17).

Tabuľka 17: Zloženie prekurzorových roztokov na prípravu zosieteného derivátu crossHA-TA

Roztok A	Roztok B
HRP...........................	............12,8 mU/ml	H₂O₂........................	..........0,6 mmol/l
HA-TA.......................	.............20 mg/ml	HA-TA.....................	.........20 mg/ml
NaCI..........................	...........8 g/l	NaCI........................	.........8 g/l
KCI............................	........0,2 g/l	KCI..........................	......0,2 g/l
Na₂HPO₄.12H₂O........	..............2,85 g/l	Na₂HPO₄.12H₂O......	............2,85 g/l
KH₂PO₄......................	...........0,2 g/l	KH₂PO₄....................	.......0,2 g/l

Zmiešaním roztoku A a roztoku B v pomere 1 : 1 bol pripravený hydrogél so zložením uvedenom v nasledujúcej tabuľke (Tabuľka 18).

SK 50027-2022 U1

Tabuľka 18: Zloženie zosieteného derivátu crossHA-TA

Zloženie zosieteného derivátu crossHA- TA
HRP............................	..........0,24 U/ml
crossHA-TA................	.............20 mg/ml
NaCI...........................	...........8 g/l
KCI..............................	..........0,2 g/l
Na₂HPO₄.12H₂O.........	..............2,85 g/l
KH₂PO₄.......................	.........0,2 g/l

2) Príprava roztoku s obsahom hyaluronanu a chondroitín sulfátu

Roztok HA s koncentráciou 10 mg/ml a ChS s koncentráciou 10 mg/ml bol pripravený rozpustením natívneho hyaluronanu s Mw 1,91 x 10⁶ g.mol¹ a chondroitín sulfátu ChS s Mw = 10 x 10³ - 40 x 10³ g.mol¹vo fosfátovom pufri (PBS).

3) Homogenizácia hydrogélu a roztoku s obsahom hyaluronanu a chondroitín sulfátu

Finálny hydrogél bol pripravený zmiešaním zosieteného derivátu crossHA-TA a roztoku HA a ChS v pomere 1 : 1 s následnou homogenizáciou zmesi. Finálne zloženie materiálu je uvedené v nasledujúcej tabuľke (Tabuľka 19).

Tabuľka 19: Finálne zloženie hydrogélu, HA s koncentráciou 5 mg/ml a ChS s koncentráciou 5 mg/ml

Finálne zloženie
HRP.......................	.....0,12 U/ml
crossHA-TA..........	.........10 mg/ml
HA.........................	.....5 mg/ml
ChS........................	.......5 mg/ml
NaCI......................	.....8 g/l
KCI........................	...0,2 g/l
Na₂HPO₄.12H₂O...	.........2,85 g/l
KH₂PO₄.................	......0,2 g/l

Príklad 10

Príprava hydrogélov, obsahujúcich HA s koncentráciou 5 mg/ml a ChS s koncentráciou 10 mg/ml

1) Príprava hydrogélu obsahujúceho zosietený derivát crossHA-TA

Hydrogél obsahujúci zosietený derivát crossHA-TA bol pripravený zmiešaním dvoch prekurzorových roztokov A a B, ktoré boli pripravené rozpustením jednotlivých zložiek vo fosfátom pufrovanom fyziologickom roztoku (PBS). Na prípravu prekurzorových roztokov bol použitý hydroxyfenylový derivát HATA s Mw = 8,09 x 10⁵ g.moľ¹ a DS 1,1 %. Zloženie roztokov je uvedené v nasledujúcej tabuľke (Tabuľka 20).

Tabuľka 20: Zloženie prekurzorových roztokov na prípravu zosieteného derivátu crossHA-TA

Roztok A	Roztok B
HRP..........................	.........12,8 mU/ml	H₂O₂........................	........0,6 mmol/l
HA-TA......................	........20 mg/ml	HA-TA......................	........20 mg/ml
NaCI.........................	........8 g/l	NaCI.........................	........8 g/l
KCI...........................	.......0,2 g/l	KCI...........................	......0,2 g/l
Na₂HPO₄.12H₂O.......	............2,85 g/l	Na₂HPO₄.12H₂O......	............2,85 g/l
KH₂PO₄.....................	........0,2 g/l	KH₂PO₄....................	.......0,2 g/l

SK 50027-2022 U1

Zmiešaním roztoku A a roztoku B v pomere 1 : 1 bol pripravený hydrogél so zložením uvedenom v nasledujúcej tabuľke (Tabuľka 21).

Tabuľka 21: Zloženie zosieteného derivátu crossHA-TA

Zloženie zosieteného derivátu crossHA-TA
HRP.............................	...........0,24 U/ml
crossHA-TA.................	..............20 mg/ml
NaCI............................	............8 g/l
KCI...............................	...........0,2 g/l
Na₂HPO₄.12H₂O..........	..............2,85 g/l
KH₂PO₄........................	..........0,2 g/l

2) Príprava roztoku s obsahom hyaluronanu a chondroitín sulfátu Roztok HA s koncentráciou 10 mg/ml a ChS s koncentráciou 20 mg/ml bol pripravený rozpustením natívneho hyaluronanu s Mw 1,91 x 10⁶ g.moľ¹a chondroitín sulfátu s Mw = 10 x 10³ - 40 x 10³ g.moľ¹ vo fosfátovom pufri (PBS).

Finálny hydrogél bol pripravený zmiešaním zosieteného derivátu crossHA-TA a roztoku HA a ChS v pomere 1 : 1 s následnou homogenizáciou zmesi. Finálne zloženie materiálu je uvedené v nasledujúcej tabuľke (Tabuľka 22).

Tabuľka 22: Finálne zloženie hydrogélu, HA s koncentráciou 5 mg/ml a ChS s koncentráciou 10 mg/ml

Finálne zloženie
HRP............................	...........0,12 U/ml
crossHA-TA................	..............10 mg/ml
HA..............................	............5 mg/ml
ChS.............................	..............10 mg/ml
NaCI...........................	...........8 g/l
KCI.............................	.........0,2 g/l
Na₂HPO₄.12H₂O.........	............2,85 g/l
KH₂PO₄.......................	..........0,2 g/l

Príklad 11

Príprava hydrogélov na báze hydroxyfenylového derivátu HA-TA s koncentráciou 5 mg/ml

Hydrogély boli pripravené zmiešaním dvoch prekurzorových roztokov A a B, na prípravu ktorých bol použitý vodný roztok NaCI (9 g/l). Na prípravu prekurzorových roztokov bol použitý hydroxyfenylový derivát HA-TA s Mw = 1,5 x 10⁶ g.moľ¹ a DS 0,5 %. Zloženie roztokov je uvedené v nasledujúcej tabuľke (Tabuľka 23).

Tabuľka 23: Zloženie prekurzorových roztokov na prípravu hydrogélov na báze hydroxyfenylového derivátu HA-TA s koncentráciou 5 mg/ml

Roztok A	Roztok B
HRP..................	...........0,12 U/ml	H₂O₂...................	.............0,5 mmol/l
HA-TA..............	..........5 mg/ml	HA-TA.................	..............5 mg/ml
NaCI.................	..........9 g/l	NaCI....................	..............9 g/l

Zmiešaním roztoku A a roztoku B v pomere 1 : 1 boli pripravené hydrogély s finálnym zložením, uvedeným v nasledujúcej tabuľke (Tabuľka 24), kde crossHA- TA je kovalentne zosieteným hydroxyfenylovým derivátom hyaluronanu.

SK 50027-2022 U1

Tabuľka 24: Finálne zloženie hydrogélov na báze hydroxyfenylového derivátu HA-TA s koncentráciou 5 mg/ml

Zloženie hydrogélov
HRP...............................	.....0,06 U/ml
crossHA-TA...................	.....5 mg/ml
NaCI..............................	.....9 g/l

Príklad 12

Príprava hydrogélov na báze hydroxyfenylového derivátu HA-TA s koncentráciou 30 mg/ml

Hydrogély boli pripravené zmiešaním dvoch prekurzorových roztokov A a B, na prípravu ktorých bol použitý vodný roztok NaCI (9 g/l). Na prípravu prekurzorových roztokov bol použitý hydroxyfenylový derivát HA-TA s Mw = 5 x 10⁴ g.moľ¹ a DS 10 %. Zloženie roztokov je uvedené v nasledujúcej tabuľke (Tabuľka 25).

Tabuľka 25: Zloženie prekurzorových roztokov na prípravu hydrogélov na báze hydroxyfenylového derivátu HA-TA s koncentráciou 30 mg/ml

Roztok A	Roztok B
HRP...................................1,2 U/ml HA-TA................................30 mg/ml NaCI....................................9 g/l	H₂O₂.................................5 mmol/l HA-TA...............................30 mg/ml NaCI...................................9 g/l

Zmiešaním roztoku A a roztoku B v pomere 1 : 1 boli pripravené hydrogély s finálnym zložením, uvedeným v nasledujúcej tabuľke (Tabuľka 26), kde crossHA- TA je kovalentne zosieteným hydroxyfenylovým derivátom hyaluronanu.

Tabuľka 26: Finálne zloženie hydrogélov na báze hydroxyfenylového derivátu HA-TA s koncentráciou 30 mg/ml

Zloženie hydrogélov
HRP..............................	....0,6 U/ml
crossHA-TA..................	....30 mg/ml
NaCI.............................	.....9 g/l

Príklad 13

Degradácia roztokov HA s prídavkom ChS pomocou ROS

Na porovnanie rýchlosti degradácie roztokov HA s ChS pôsobením ROS boli pripravené roztoky hyaluronanu vo fosfátovom pufri (PBS) s rôznou koncentráciou ChS. Na prípravu roztokov bola použitá kyselina hyalurónová s Mw 1,91 x 10⁶g.moľ¹ a ChS s Mw = 10 x 10³ - 40 x 10³ g.moľ¹. Roztok A obsahoval 20 mg/ml HA, roztok B 20 mg/ml HA a 0,5 mg/ml ChS, roztok C 20 mg/ml HA a 1 mg/ml ChS, roztok D 20 mg/ml HA a 3 mg/ml ChS, roztok E 20 mg/ml HA a 5 mg/ml ChS, roztok F 20 mg/ml HA a 20 mg/ml ChS.

Uskutočnenie experimentu degradácie

Rýchlosť degradácie bola vyjadrená ako percentuálny pokles viskozity roztokov pri šmykovej rýchlosti 0,1 s¹ oproti počiatočnej hodnote. Meranie poklesu viskozity sa uskutočňovalo na reometri Kinexus Malvern v konfigurácii cone-plate. Bol použitý kužeľ s priemerom 40 mm s vrcholovým uhlom 1°. Degradácia materiálu prebiehala v 10 ml striekačkách, kde do 9 ml materiálu bolo pridaných 0,5 ml roztoku CuSO₄ s koncentráciou 0,25 mmol/l a následne 0,5 ml roztoku H₂O₂ s koncentráciou 2,5 mmol/l. Počas prebiehajúcej degradácie hydrogélov boli vo vopred daných časových intervaloch odoberané vzorky materiálu, u ktorých bola nameraná viskozita pri teplote 25 °C a šmykovej rýchlosti 0,1 s¹. Celková doba degradácie bola 3 h.

Obr. 1 znázorňuje degradáciu reťazcov hyaluronanu, ktorá je vyjadrená percentuálnym poklesom viskozity roztokov v čase. Z obr. 1 je vidieť vplyv koncentrácie ChS na rýchlosť degradácie hyaluronanu. So zvyšujúcou sa koncentráciou ChS klesá rýchlosť degradácie HA pôsobením ROS. Viskozita roztoku A, ktorý neobsahoval ChS sa po 3 hodinách poklesla o 97 % oproti počiatočnej hodnote pred degradáciou, roztoku B (s prídavkom 0,5 mg/ml ChS) už o 89 %, roztoku C, do ktorého bolo pridaných 1 mg/ml ChS o 84 %, roztoku

SK 50027-2022 U1

D (20 mg/ml HA + 3 mg/ml ChS) o 46 %, roztoku E (20 mg/ml HA + 5 mg/ml ChS) o 25 % a roztoku F (20 mg/ml HA + 20 mg/ml ChS) len o 8 %.

Príklad 14

Degradácia hydrogélov na báze zosieteného derivátu crossHA-TA pôsobením ROS

Na porovnanie rýchlosti degradácie hydrogélov pôsobením ROS boli pripravené 3 typy materiálov. Materiál A je roztok HA s koncentráciou 20 mg/ml, ktorý bol pripravený rozpustením HA s Mw 1,91 x 10⁶g.mol¹ v PBS.

Materiál B je zmes zosieteného derivátu crossHA-TA a nezosietenej HA, ktorý bol pripravený podľa príkladu 7.

Materiály C a D sa skladali z nezosietenej HA, CHS a crossHA-TA a boli pripravené podľa príkladov 9 a 10.

Rýchlosť degradácie bola vyjadrená ako percentuálny pokles viskozity materiálov pri šmykovej rýchlosti 0,1 s¹ oproti počiatočnej hodnote. Meranie poklesu viskozity sa uskutočňovalo na reometri Kinexus Malvern v konfigurácii cone-plate. Bol použitý kužeľ s priemerom 40 mm s vrcholovým uhlom 1°. Degradácia materiálu prebiehala v 10 ml striekačkách, kde do 9 ml materiálu bolo pridaných 0,5 ml roztoku CuSO₄ s koncentráciou 0,25 mmol/l a následne 0,5 ml roztoku H₂O₂ s koncentráciou 2,5 mmol/l. Po určitých časoch degradácie sa odoberali vzorky, u ktorých bola nameraná viskozita pri teplote 25 °C a šmykovej rýchlosti 0,1 s’¹. Celková doba degradácie bola 3 h. Z obr. 2 je zrejmé, že prítomnosť ChS v pripravených hydrogéloch (C - 5 mg/ml ChS; D -10 mg/ml ChS) zvyšuje ich odolnosť voči pôsobeniu ROS.

Príklad 15

Enzymatická degradácia hydrogélov na báze zosieteného derivátu crossHA-TA

Na zistenie vplyvu prítomnosti ChS na rýchlosť degradácie hydrogélov na báze crossHA-TA pôsobením bovinnej testikulárnej hyaluronidázy boli pripravené 3 typy hydrogélov:

A - hydrogély bez prídavku chondroitín sulfátu, ktoré boli pripravené podľa postupu v príklade 2

B - hydrogély s prídavkom ChS s koncentráciou 3,3 mg/ml, ktoré boli pripravené podľa postupu v príklade 4

C - hydrogély s prídavkom ChS s koncentráciou 10 mg/ml, ktoré boli pripravené podľa postupu v príklade 5.

Rýchlosť degradácie bola vyjadrená ako nárast koncentrácie produktov degradácie, spôsobenej BTH, vyjadrený v percentách.

Hydrogély boli ponorené do degradačného média (roztok hyaluronidázy BTH s aktivitou 30 U/mg v roztoku hovädzieho sérového albumínu (BSA) s koncentráciou 0,1 mg/ml v 0,01 mol/l octanovom pufri (OP) pH 5,3). Degradácia hydrogélov prebiehala v inkubátore pri 37 °C za súčasného miešania. Po určitých časových intervaloch sa odoberali vzorky degradačného média s produktmi degradácie hydrogélov. Koncentrácia disacharidických jednotiek HA v degradačnom médiu bola stanovená spektrofotometricky ako koncentrácia /V-acetylglukozamínu. Obr. 3 znázorňuje nárast koncentrácie degradačných produktov hydrogélov v médiu v čase. Z obr. je zrejmé, že prítomnosť ChS v hydrogéloch na báze crossHA-TA vedie k zníženiu rýchlosti degradácie materiálov pôsobením hyaluronidázy.

SK 50027-2022 U1

Odkazy:

Aubry-Rozier B. 2012. Revue Médicale Suisse 14: 571

Akkara, J. A., K. J. Senecal a D. L. Kaplan (1991). Synthesis and characterization of polymers produced by horseradish peroxidase in dioxane. Journal of Polymér Science Part A: Polymér Chemistry 29(11): 15611574.

Balí, J.-P., H. Cousse a E. Neužil (2001). Biochemical basis of the pharmacologic action of chondroitín sulfates on the osteoarticular systém. Seminars in Arthritis and Rheumatism 31(1): 58-68.

Baeurle S. A., Kiselev M. G., Makarova E. S., Nogovitsin E. A. 2009. Polymér 50: 1805

Buck II, D. W., M. Alam a J. Y. S. Kim (2009). Injectable fillers for facial rejuvenation: a review. Journal of Plastic, Reconstructive & Aesthetic Surgery 62(1): 11-18.

Burdick, J. A. a G. D. Prestwich (2011). Hyaluronic Acid Hydrogéls for Biomedical Applications. Advanced Materials 23(12): H41-H56.

Calabro, A., L. Akst, D. Alam, J. Chán, A. B. Darr, K. Fukamachi, R. A. Gross, D. Haynes, K. Kamohara, D. P. Knott, H. Lewis, A. Melamud, A. Miniaci a M. Strome (2008). Hydroxyphenyl cross-linked macromolecular network and applications thereof. United States, The Cleveland Clinic Foundation (Cleveland, OH, US).

Darr, A. a A. Calabro (2009). Synthesis and characterization of tyramine-based hyaluronan hydrogéls. Journal of Materials Science: Materials in Medicíne 20(1): 33-44.

Ghán, R., T. Shutava, A. Patel, V. T. John a Y. Lvov (2004). Enzyme-Catalyzed Polymerization of Phenols within Polyelectrolyte Microcapsules. Macromolecules 37(12): 4519-4524.

Higashimura, H. a S. Kobayashi (2002). Oxidative Polymerization, John Wiley &Sons, Inc.

Kurisawa, M., F. Lee a J. E. Chung (2009). Formation of Hydrogél in the Presence of Peroxidase and Low Concentration of Hydrogen Peroxide

Kurisawa, M., F. Lee, L.-S. Wang a J. E. Chung (2010). Injectable enzymatically crosslinked hydrogél systém with independent tuning of mechanical strength and gelation rate for drug delivery and tissue engineering. Journal of Materials Chemistry 20(26): 5371-5375.

Lee, F., J. E. Chung a M. Kurisawa (2008). An injectable enzymatically crosslinked hyaluronic acid-tyramine hydrogél systém with independent tuning of mechanical strength and gelation rate. Soft Matter 4: 880887.

Li, P., D. Raitcheva, M. Hawes, N. Moran, X. Yu, F. Wang a G. L. Matthews (2012). Hylan G-F 20 maintains cartilage integrity and decreases osteophyte formation in osteoarthritis through both anabolic and anticatabolic mechanisms. Osteoarthritis and Cartilage 20(11): 1336-1346.

Prestwich, G. D. (2011). Hyaluronic acid-based clinical biomaterials derived for celí and molecule delivery in regenerative medicíne. J Control Release 155(2): 193-199.

Salwowska, N. M., A. Bebenek, D. A. Žgdfo a D. L. Wcisfo-Dziadecka (2016). Physiochemical properties and application of hyaluronic acid: a systematic review. Journal of Cosmetic Dermatology 15(4): 520-526.

Shutava, T., Z. Zheng, V. John a Y. Lvov (2004). Microcapsule modification with peroxidase-catalyzed phenol polymerization. Biomacromolecules 5(3): 914-921.

Stern, R., G. Kogan, M. J. Jedrzejas a L. Šoltés (2007). The many ways to cleave hyaluronan. Biotechnology advances 25(6): 537-557.

Tognana, E., A. Borrione, C. De Luca a A. Pavesio (2007). Hyalograft C: hyaluronan-based scaffolds in tissueengineered cartilage. CellsTissues Organs 186(2): 97-103.

Veitch, N. C. (2004). Horseradish peroxidase: a modern view of a classic enzýme. Phytochemistry 65(3): 249-259.

Volpi, N. (2019). Chondroitín Sulfate Safety and Quality. Molecules (Basel, Switzerland) 24(8): 1447.

Xiong, S.-L. a Z.-Y. Jin (2007). THE FREE RADICAL-SCAVENGING PROPERTY OF CHONDROITÍN SULFATE FROM PIG LARYNGEAL CARTILAGE IN VITRO. Journal of Food Biochemistry 31(1): 28-44.

Xu, X., A. K. Jha, D. A. Harrington, M. C. Farach-Carson a X. Jia (2012). Hyaluronic Acid-Based Hydrogéls: from a Natural Polysaccharide to Complex Networks. Soft matter 8(12): 3280-3294.

Claims

1. Hydrogél na báze zosieťovaného hydroxyfenylového derivátu kyseliny hyalurónovej, vyznačujúci sa tým, že obsahuje molekuly hydroxyfenylového derivátu hyalurónovej kyseliny (HA-TA) alebo jeho farmaceutický prijateľnú soľ podľa všeobecného vzorca (I)

(I), kde n je v rozmedzí 2 až 7500 a kde R¹ je H⁺ alebo ión alkalickej soli alebo soli alkalických zemín a R² je OH alebo tyramínový substituent podľa všeobecného vzorca (II):

pričom v rámci jednej molekuly hydroxyfenylového derivátu hyalurónovej kyseliny alebo jeho farmaceutický prijateľnej soli podľa všeobecného vzorca (I) je aspoň jeden R² tyramínový substituent podľa všeobecného vzorca (II) a pričom aspoň dva tyramínové substituenty podľa všeobecného vzorca (II) sú spojené prostredníctvom kovalentnej väzby v ktorejkoľvek orto polohe fenylových skupín, a ďalej obsahuje chondroitín sulfát alebo jeho farmaceutický prijateľnú soľ vybranú zo skupiny obsahujúcej alkalické soli alebo soli alkalických zemín.

2. Hydrogél podľa nároku 1, vyznačujúci sa tým, že alkalické soli alebo soli alkalických zemín sú vybrané zo skupiny obsahujúcej Na⁺, K⁺, Ca²⁺, Mg²⁺.

3. Hydrogél podľa nároku 1 alebo nároku 2, vyznačujúci sa tým, že koncentrácia chondroitín sulfátu alebo jeho farmaceutický prijateľnej soli je v rozsahu 0,5 až 50 mg/ml hydrogélu, výhodne v koncentrácii 1 až 20 mg/ml, výhodnejšie 5 mg/ml.

4. Hydrogél podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 3, vyznačujúci sa tým, že obsah zosieťovaného hydroxyfenylového derivátu hyaluronanu je v rozsahu 5 až 30 mg/ml, výhodne 10 mg/ml hydrogélu.

5. Hydrogél podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 4, vyznačujúci sa tým, že ďalej obsahuje kyselinu hyalurónovú alebo jej farmaceutický prijateľnú soľ v koncentrácii 1 až 20 mg/ml hydrogélu, výhodne 5 až 10 mg/ml, výhodnejšie 5 mg/ml hydrogélu.