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Gebiet der Erfindung
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Die Erfindung bezieht sich auf Hydrogel auf der Basis eines vernetzten Hydroxyphenylderivats der Hyaluronsäure in einem Gemisch mit Chondroitinsulfat mit verbessertem Abbaugrad.
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Hintergrund der Erfindung
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Die Hyaluronsäure (auch Hyaluronan, HA) ist ein Polysaccharid aus der Gruppe der Glykosaminoglykane, welches aus Disaccharideinheiten aus D-Glucuronsäure und N-Acetyl-D-Glucosamin besteht. Es handelt sich um ein Polysaccharid, welches in wässriger Umgebung gut löslich ist, wo es je nach Molekülmasse und Konzentration viskose Lösungen bis hin zu viskoelastischen Hydrogelen bildet. HA ist ein natürlicher Bestandteil der interzellulären Gewebematrix. Hyaluronanmoleküle sind in der Lage, mit umgebenden Zellen zu interagieren und deren Stoffwechselprozesse zu regulieren (Xu, Jha et al. 2012), indem sie an bestimmte Zelloberflächenrezeptoren binden. Materialien, die Hyaluronan oder gegebenenfalls seine Derivate enthalten, werden daher häufig zur Herstellung von bei biomedizinischen Anwendungen eingesetzten Präparaten verwendet. Hydrogele auf Hyaluronanbasis unterliegen im Organismus einem natürlichen Abbau durch die Wirkung bestimmter Enzyme (Hyaluronidasen), schließlich durch die Wirkung reaktiver Sauerstoffspezies (ROS), wodurch ihre allmähliche Absorption im Organismus nach ihrer Implantation erfolgt (Stern, Kogan et al. 2007).
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Um mechanisch widerstandsfähigere Materialien zu erhalten und um ihren biologischen Abbau zu verlangsamen, wurde eine Reihe von Hydrogelarten entwickelt, welche kovalent vernetztes Hyaluronan enthalten. Derartige Hydrogele werden als Materialien für die Viskosupplementierung von Synovialflüssigkeit, die Augmentation von Weichteilgeweben verwendet, dienen als Gerüststrukturen für Zellkulturen und -implantationen etc. (Tognana, Borrione et al. 2007, Buck Ii, Alam et al. 2009, Li, Raitcheva et al. 2012, Salwowska, Bebenek et al. 2016).
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In der Vergangenheit wurden verschiedene Arten von Hyaluronanderivaten entwickelt, welche unter physiologischen Bedingungen in situ einen Sol-Gel-Übergang durchlaufen können (Burdick und Prestwich 2011, Prestwich 2011). Beispielsweise können hierfür Phenolderivate von Hyaluronan verwendet werden. Calabro et al. (Calabro, Akst et al. 2008, Lee, Chung et al. 2008, Kurisawa, Lee et al. 2009) beschreiben in den Druckschriften
EP1587945B1 und
EP1773943B1 ein Protokoll zur Herstellung von Phenolderivaten von Hyaluronan durch Reaktion von Carboxylen, welche in der Struktur der D-Glucuronsäure von Hyaluronan vorhanden sind, mit Aminoalkyl-Derivaten von Phenol, z.B. sind Tyramin, Hyaluronan-Amide (Darr und Calabro 2009) ein Produkt dieser Reaktion.
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Die Vernetzung von Phenolderivaten von Hyaluronan kann durch Zusetzen von Peroxidase (z.B. Meerrettichperoxidase) und verdünnter Wasserstoffperoxidlösung eingeleitet werden. Die Meerrettichperoxidase (Meerrettichperoxidase, HRP, E.C.1.11.1.7.) wird gegenwärtig als Katalysator für organische und Biotransformationsreaktionen verwendet (Akkara, Senecal et al. 1991, Higashimura und Kobayashi 2002, Ghan, Shutava et al. 2004, Shutava, Zheng et al. 2004, Veitch 2004). Hydrogele auf der Basis von Hydroxyphenylderivaten von Hyaluronan können als injizierbare Matrix für die kontrollierte Freisetzung biologisch aktiver Verbindungen oder als geeignete Materialien für Zellkulturen und -implantation verwendet werden (Kurisawa, Lee et al. 2010). Wolf et al. beschreiben in der Druckschrift CZ303879 ein Konjugat aus Hyaluronan und Tyramin, welches einen zwischen den Ketten aus Polymer und Tyramin eingesetzten aliphatischen Linker enthält. Das Vorhandensein eines aliphatischen Linkers ermöglicht eine höhere Effizienz der Vernetzungsreaktion und verleiht dem Netz eine höhere Elastizität.
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Chondroitinsulfat (ChS) gehört ebenfalls zu den Glykosaminoglykanen und wird häufig bei der Herstellung von Materialien zur Verwendung bei der Behandlung von degenerativen Krankheiten, z.B. Osteoarthrose (OA), verwendet. Die ChS-Kette besteht aus Disaccharideinheiten, die sich aus N-Acetylgalactosamin (GalNAc) und Iduronsäure (IdoA) zusammensetzen. Die ChS-Disaccharideinheiten können in Position 4 und 6 von GaINAc und gegebenenfalls in Position 2 von IdoA sulfatiert sein. Chondroitinsulfat ist ein lineares, sulfatiertes und negativ geladenes Glykosaminoglykan, welches aus sich wiederholenden Monomereinheiten von N-Acetyl-D-Galaktosamin und D-Glucuronsäure besteht, welche über β(1→3) und β(1→4) O-glykosidische Bindungen miteinander verbunden sind (zur Strukturformel von Chondroitinsulfat siehe unten).
wobei
R
1 H oder Na ist,
R
2 H, O-SO
2-OH oder O-SO
2-ONa ist.
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Tierische Bindegewebe sind Quellen für Chondroitinsulfat; dort bindet es Proteine und stellt somit einen Bestandteil der Proteoglykane dar. Die Sulfatierung von Chondroitin erfolgt durch Sulfotransferasen in verschiedenen Positionen und in unterschiedlicher Darstellung. Die einzigartige Formel der Sulfatierung der einzelnen Position in der Polymerkette kodiert die spezifische biologische Aktivität von Chondroitinsulfat. Dieses ist ein wichtiger Baustein des Gelenkknorpels, welcher für Druckfestigkeit sorgt und das Gleichgewicht in der Zusammensetzung der Synovialflüssigkeit wiederherstellt (Baeurle, S. A., Kiselev M. G., Makarova E. S., Nogovitsin E. A. 2009. Polymer 50: 1805). Chondroitinsulfat wird zusammen mit Glucosamin als Nahrungsergänzungsmittel zur Behandlung oder Vorbeugung gegen die Entwicklung von Osteoarthritis beim Menschen (z.B. Flextor®, Advance Nutraceutics, Ltd.) oder bei Tieren (z.B. Gelorendog®, Contipro Pharma, Ltd.) verwendet. Aus pharmazeutischer Sicht gilt Chondroitinsulfat als Medikament mit verzögertem Wirkungseintritt zur Schmerzlinderung bei degenerativen Gelenkerkrankungen (Aubry-Rozier B. 2012. Revue Medicale Suisse 14:571).
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In vitro- und in vivo-Studien haben gezeigt, dass ChS die Wirkung von Hyaluronidasen hemmt. Die hemmende Wirkung von ChS auf Enzyme wird durch die Entstehung von elektrostatischen (ionischen) Wechselwirkungen verursacht. Es wurde auch nachgewiesen, dass ChS in der Lage ist, ROS aufzufangen und so die Bestandteile der extrazellulären Matrix vor dem Abbau zu schützen (Bali, Cousse et al. 2001, Xiong und Jin 2007).
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Die Verwendung der Kombination von Hyaluronan und Chondoitinsulfat bei der Herstellung von Mitteln zum Schutz menschlicher oder tierischer Zellen und Gewebe vor Traumata wird in der Druckschrift
EP0136782 (1983) beschrieben. In ähnlicher Weise beschreibt die Druckschrift
US6051560 (1992) die Verwendung eines Gemisches aus Hyaluronan und Chondroitinsulfat als Viskosupplementierungsmaterial bei ophthalmologischen Eingriffen. Das Patent
WO030417024 beschreibt eine viskose Zusammensetzung, welche eine therapeutisch wirksame Menge eines Gemisches aus ChS und HA enthält, zur Herstellung von Medikamenten für die Behandlung von Gelenken bei Menschen mit geschädigtem Knorpel aufgrund von Chondromalazie oder OA Grad 1 und 2, wobei die Mischung intraartikulär verabreicht wird. In der Patentliteratur finden sich auch Druckschriften, welche Mittel zur parenteralen Verabreichung beschreiben, die zur Vorbeugung und Behandlung von Gelenkknorpelschäden bei Menschen oder Tieren geeignet sind und aus einer therapeutisch wirksamen Menge von Chondroitinsulfat, Hyaluronan und Glucosamin bestehen (
WO2004034980, 2002 ). Die Druckschrift
EP2219595 beschreibt eine Rezeptur auf der Grundlage von Polysacchariden, insbesondere Glykosaminoglykanen und deren Mischungen mit Flavonoiden, die Hydrogele mit verlängerter biologischer Abbaudauer bilden. In der genannten Druckschrift wird auch ein Hydrogel beschrieben, welches Hyaluronan, ein mit Butandiol-1,4-diglycidylether vernetztes Hyaluronanderivat und ChS enthält und eine erhöhte Resistenz gegen den durch das Enzym Hyaluronidase verursachen Abbau aufweist.
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Zusammenfassung der Erfindung
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Die Erfindung betrifft Hydrogel auf der Basis eines vernetzten Hydroxyphenylderivats der Hyaluronsäure, und der Gegenstand der Erfindung besteht darin, dass das Hydrogel Moleküle eines Hydroxyphenylderivats der Hyaluronsäure (HA-TA) oder seines pharmazeutisch akzeptablen Salzes der allgemeinen Formel I enthält:
wobei n im Bereich von 2 bis 7500 liegt und wobei R
1 H
+ ist oder ein Ion eines Alkalisalzes oder Erdalkalisalzes und R
2 OH oder ein Tyramin-Substituent der allgemeinen Formel II ist:
wobei in einem Molekül des Hydroxyphenylderivats der Hyaluronsäure oder seines pharmazeutisch akzeptablen Salzes gemäß der allgemeinen Formel I mindestens ein R
2 ein Tyramin-Substituent der allgemeinen Formel II ist und wobei mindestens zwei Tyramin-Substituenten der allgemeinen Formel II mit einer kovalenten Bindung in einer beliebigen ortho-Position der Phenylgruppen verbunden sind, und dass es ferner Chondroitinsulfat oder sein pharmazeutisch akzeptables Salz, ausgewählt aus der Alkalisalze oder Erdalkalisalze enthaltenden Gruppe, enthält.
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Die Alkalisalze oder Erdalkalisalze des Hydroxyphenylderivats der Hyaluronsäure der allgemeinen Formel I oder Chondroitinsulfat werden bevorzugt aus der Gruppe bestehend aus Na+, K+, Ca2+, Mg2+ ausgewählt.
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Die Konzentration des Chondroitinsulfats oder seines pharmazeutisch akzeptablen Salzes liegt im Bereich von 0,5 bis 50 mg/ml Hydrogel gemäß der Erfindung, bevorzugt im Bereich von 1 bis 20 mg/ml, noch mehr bevorzugt beträgt sie 5 mg/ml.
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Der Gehalt an vernetztem Hydroxyphenylderivat von Hyaluronan liegt im Bereich von 5 bis 30 mg/ml Hydrogel gemäß der Erfindung und beträgt vorzugsweise 10 mg/ml des Hydrogels.
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Gemäß einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der Erfindung enthält das Hydrogel ferner Hyaluronsäure oder ihr pharmazeutisch akzeptables Salz in einer Konzentration von 1 bis 20 mg/ml, bevorzugt 5 bis 10 mg/ml, noch mehr bevorzugt 5 mg/ml Hydrogel gemäß der Erfindung.
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Eine kovalente Bindung kann in einem Molekül des Hyaluronsäurederivats der allgemeinen Formel I in einer beliebigen ortho-Position der Phenylgruppen von mindestens zwei in diesem Molekül enthaltenen Tyramin-Substituenten der allgemeinen Formel II vorliegen. Dies wird als intramolekulare Vernetzung bezeichnet. Eine kovalente Bindung kann auch in einer beliebigen ortho-Position der Phenylgruppen von mindestens zwei in verschiedenen Molekülen des Hyaluronsäurederivats der allgemeinen Formel I enthaltenen Tyramin-Substituenten der allgemeinen Formel II vorliegen. Sie stellt eine interkonnektive Vernetzung zwischen den Molekülen des HA-Derivats dar.
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Ein Beispiel für ein vernetztes Hydroxyphenylderivat von Hyaluronan (crossHA-TA) ist unten schematisch dargestellt, siehe Formel III:
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Derartige erfindungsgemäße Hydrogele zeigen eine erhöhte Resistenz gegen biologische Abbauprozesse aufgrund von hydrolytischen Enzymen und reaktiven Sauerstoffspezies.
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Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform liegt die gewichtsmittlere molare Masse (Mw) des Hydroxyphenylderivats von Hyaluronan der allgemeinen Formel I im Bereich von 5 × 104 bis 1,5 × 106 g · mol-1, bevorzugt 2,5 × 105 bis 1 × 106 g ·mol-1, noch mehr bevorzugt beträgt sie 8 × 105 g · mol-1. Der PI liegt im Bereich von 1 bis 3.
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Gemäß einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung liegt der Substitutionsgrad (DS) des Hydroxyphenylderivats von Hyaluronan der allgemeinen Formel I im Bereich von 0,5 bis 10%, bevorzugt 1 bis 4% und beträgt noch mehr bevorzugt 1%.
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Gemäß einer weiteren bevorzugten Ausführungsform liegt die Mw des Chondroitinsulfats im Bereich von 5 × 103 bis 95 × 103 g · mol-1, noch mehr bevorzugt 10 x 103 bis 40 x 103 g·mol-1.
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Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform enthält das Hydrogel Hyaluronan (HA) oder sein pharmazeutisch akzeptables Salz mit einer Mw im Bereich von 5 x 104 bis 2,5 x 106 g-mol-1, bevorzugt 1,5 x 106 bis 2,5 x 106 g-mol-1, noch mehr bevorzugt von 2,0 x 106 g·mol-1.
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Derartige erfindungsgemäße Hydrogele können in der Kosmetik, der Medizin und der regenerativen Medizin verwendet werden, insbesondere für die Herstellung von Materialien für die Geweberegeneration, die Gewebeaugmentation, als Gerüst für Tissue-Engineering-Präparate, als Matrix für die kontrollierte Freisetzung biologisch aktiver Wirkstoffe und Medikamente und zur Viskosupplementierung von Synovialflüssigkeit.
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Figurenliste
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- 1: Vergleich der Abbaugeschwindigkeit von HA-Lösungen mit Zusatz von ChS mit ROS
- 2: Vergleich der Abbaugeschwindigkeit von Materialien mit ROS
- 3: Kumulativer Abbau des Hydrogels [%] BTH 30 U/mg
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Ausführungsbeispiele der Erfindung
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DS = Substitutionsgrad = 100 % * molare Menge der modifizierten Disaccharideinheiten des Hyaluronans / molare Menge aller Disaccharideinheiten des Hyaluronanderivats. Der Substitutionsgrad wurde mit 1H-HMR-Spektroskopie bestimmt.
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Die gewichtsmittlere molare Masse (Mw) und der Polydispersitätsindex (PI) wurden mit SEC-MALLS bestimmt.
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Die Infrarotspektren der hergestellten Derivate wurden mit FT-IR erhalten.
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Für die Injektionsverabreichung wurde Chondroitinsulfat in pharmazeutischer Qualität von Bioiberica, ES, verwendet.
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Beispiel 1
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Synthese eines Tyraminderivats von HA (HA-TA)
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Synthese von 6-Amino-N-[2(4hydroxyphenyl)ethyl]hexanamid
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6-[(terc. Butoxycarbonyl)amino]hexansäure (1,00 g, 4,3 mmol) wurde in 50 ml Tetrahydrofuran (THF) gelöst. 1.1'Carbodiimidazol (0,70 g, 4,3 mmol) wurde der Säurelösung zugesetzt. Das Gemisch wurde sechzig Minuten lang auf 50 °C erhitzt. Anschließend wurde der Reaktionsbehälter mit Inertgas gewaschen. Tyramin (0,59 g, 4,3 mmol) wurde dem Reaktionsgemisch zugesetzt. Das Gemisch wurde für weitere 2 Stunden erhitzt. Das THF wurde dann durch Destillation unter vermindertem Druck entfernt. Der Rückstand wurde in 50 ml Ethylacetat aufgelöst. Die Lösung wurde mit 150 ml gereinigtem Wasser (aufgeteilt in drei Teile) gewaschen. Die organische Schicht wurde über Molekularsieb getrocknet. Das Ethylacetat wurde durch Destillation unter vermindertem Druck entfernt. Der Rückstand wurde in 50 ml MeOH gelöst, und 2 ml Trifluoressigsäure (TFA) wurden der Lösung zugesetzt. Die Lösung wurde 6 Stunden lang unter Rückfluss erhitzt. Das Lösungsmittel wurde durch Destillation unter vermindertem Druck entfernt. Der Rückstand wurde in 50 ml Ethylacetat aufgelöst. Die Lösung wurde mit 150 ml gereinigtem Wasser (aufgeteilt in drei Teile) gewaschen. Die organische Schicht wurde über Molekularsieb getrocknet. Das Ethylacetat wurde durch Destillation unter vermindertem Druck entfernt.
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1H NMR (D2O, ppm) δ: 1,17 (m, 2 H, γ-CH2-Hexansäure); 1,48 (m, 2 H, β-CH2-Hexansäure)-, 1,58 (m, 2 H, δ-CH2-Hexansäure); 2,17 (t, 2 H, -CH2-CO- ); 2,73 (m, 2 H, -CH2-Ph); 2,91 (m, 2 H, -CH2-NH2); 3,42 (m, 2 H, -CH2-NH-CO- ); 6,83 (d, 2 H, arom); 7,13 (d, 2 H, arom).
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13C NMR(D2O, ppm) δ: 24 (γ-C-Hexansäure); 26 (δ-C-Hexansäure); 33 (β-C-Hexansäure); 35 (-C-CO-); 39 (-C-NH2); 40 (C-Ph); 63 (-C-NH-CO-); 115 (C3 arom); 126 (C1 arom); 130 (C2 arom); 153 (C4 arom); 176 (-CO-).
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Herstellung eines Aldehydderivats (HA-CHO)
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Hyaluronan (10,00 g, Mw = 2 x 106 g·mol-1) wurde in 750 ml 2,5%iger (w/w) Na2HPO4·12H2O-Lösung aufgelöst. Die Lösung wurde auf 5 °C abgekühlt. 2,60 g NaBr und 0,05 g 4-Acetamido-2,2,6,6-tetramethylpiperidin-1-oxyl wurden der Lösung zugesetzt. Nach einer gründlichen Homogenisierung der Lösung wurden 3 ml NaClO-Lösung (10-15% verfügbares Cl2) dem Reaktionsgemisch zugesetzt. Die Reaktion erfolgte 15 Minuten lang unter Rühren. Die Reaktion wurde durch Zugabe von 100 ml 40%iger Propan-2-ol-Lösung gequencht. Das Produkt wurde durch Ultrafiltration gereinigt und durch Ausfällung mit Propan-2-ol isoliert.
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IR (KBr): 3417, 2886, 2152, 1659, 1620, 1550, 1412, 1378, 1323, 1236, 1204, 1154, 1078, 1038, 945, 893 cm-1.
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1H NMR (D2O) δ: 2,01 (s, 3 H, CH3-), 3,37 - 3,93 (m, Skelett von Hyaluronan), 4,46 (s, 1H, Anomer), 4,54 (s, 1H Anomer, -O-CH(OH)-), 5,27 (geminales Glykol -CH-(OH)2).
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a) Herstellung eines Tyraminderivats von HA mit C6-Spacer (Mw ≈ 3 x 105 g ·mol-1, DS ≈ 2%)
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Ein Aldehydderivat von HA (≈ 3 x 105 g-mol-1, DS = 9%) (5,00 g) wurde in 500 ml entmineralisiertem Wasser gelöst. Der pH-Wert der Lösung wurde mit Essigsäure auf 3 eingestellt. 6-Amino-N-[2-(4-hydroxyphenyl)ethyl]hexanamid (Zwischenprodukt (I)) (1,25 g, 5 mmol) wurde der HA-CHO-Lösung zugesetzt. Das Gemisch wurde 2 Stunden lang bei Raumtemperatur gerührt. Komplexes Picolinborat (0,270 g, 2,5 mmol) wurde dann dem Reaktionsgemisch zugesetzt. Das Gemisch wurde für weitere 12 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Das Produkt wurde durch Ultrafiltration gereinigt und von dem Retentat durch Ausfällung mit Propan-2-ol isoliert. Das Präzipitat wurde entfeuchtet, und das restliche Propan-2-ol wurde durch Trocknen im Heißlufttrockner (40 °C, 3 Tage) entfernt.
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IR (KBr): 3425, 2893, 2148, 1660, 1620, 1549, 1412, 1378, 1323, 1236, 1204, 1154, 1078, 1038, 945, 893 cm-1.
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1H NMR (D
2O) δ: 1,25 (t, 2 H, γ -CH
2- Aminohexansäure), 1,48 (m, 2 H, δ -CH
2- Aminohexansäure), 1,51 (m, 2 H, β -CH
2- Aminohexansäure), 2,01 (s, 3 H, CH
3-), 2,65 (m, 2H, Ph-CH
2-), 2,73 (m, 2 H, ε-CH
2- Aminohexansäure), 3,37 - 3,93 (m, Skelett von Hyaluronan), 4,46 (s, 1 H, Anomer), 4,54 (s, 1 H Anomer, -O-CH(OH)-), 6,59 (d, 2 H, arom.), 7,01 (d, 2 H, arom).
SEC MALLS:
DS (
1H NMR): 2,1 %
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b) Herstellung eines Tyraminderivats von HA mit C6-Spacer (Mw ≈ 8 x 105 g-mol-1, DS ≈ 1%)
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Ein Aldehydderivat von HA (Mw ≈ 8 x 105 g-mol-1, DS ≈ 5 %) (5,00 g) wurde in 500 ml entmineralisiertem Wasser gelöst. Der pH-Wert wurde mit Essigsäure auf 3 eingestellt. 6-Amino-N-[2-(4-hydroxyphenyl)ethyl]hexanamid (Zwischenprodukt (I)) (0,625 g, 2,5 mmol) wurde der HA-CHO-Lösung zugesetzt. Das Gemisch wurde 2 Stunden lang bei Raumtemperatur gerührt. Picolinborat-Komplex (0,270 g, 2,5 mmol) wurde dann dem Gemisch zugesetzt. Das Gemisch wurde für weitere 12 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Das Produkt wurde durch Ultrafiltration gereinigt und von dem Retentat durch Ausfällung mit Propan-2-ol isoliert. Das Präzipitat wurde entfeuchtet, und das restliche Propan-2-ol wurde durch Trocknen im Heißlufttrockner (40 °C, 3 Tage) entfernt.
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IR (KBr): 3425, 2893, 2148, 1660, 1620, 1549, 1412, 1378, 1323, 1236, 1204, 1154, 1078, 1038, 945, 893 cm-1.
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1H NMR (D
2O) δ: 1,25 (t, 2 H, γ -CH
2- Aminohexansäure), 1,48 (m, 2 H, δ -CH
2- Aminohexansäure), 1,51 (m, 2 H, β -CH
2- Aminohexansäure), 2,01 (s, 3 H, CH
3-), 2,65 (m, 2 H, Ph-CH
2-), 2,73 (m, 2 H, ε-CH
2- Aminohexansäure), 3,37 - 3,93 (m, Skelett von Hyaluronan), 4,46 (s, 1 H, Anomer), 4,54 (s, 1 H Anomer, -O-CH(OH)-), 6,59 (d, 2 H, arom.), 7,01 (d, 2 H, arom).
SEC MALLS:
DS (
1H NMR): 1,1%
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c) Herstellung eines Tyraminderivats von HA mit C6-Spacer (Mw ≈ 1,5 x 106 g·mol-1, DS ≈ 0,5%)
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Ein Aldehydderivat von HA (Mw ≈ 1,5 x 106 g.mol-1, DS ≈ 0,5%) (5,00 g) wurde in 500 ml entmineralisiertem Wasser gelöst. Der pH-Wert wurde mit Essigsäure auf 3 eingestellt. 6-Amino-N-[2-(4-hydroxyphenyl)ethyl]hexanamid (Zwischenprodukt (I)) (0,625 g, 2,5 mmol) wurde der HA-CHO-Lösung zugesetzt. Das Gemisch wurde 2 Stunden lang bei Raumtemperatur gerührt. Picolin-Borat-Komplex (0,270 g, 2,5 mmol) wurde dann dem Reaktionsgemisch zugesetzt. Das Gemisch wurde für weitere 12 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Das Produkt wurde durch Ultrafiltration gereinigt und von dem Retentat durch Ausfällung mit Propan-2-ol isoliert. Das Präzipitat wurde entfeuchtet, und das restliche Propan-2-ol wurde durch Trocknen im Heißlufttrockner (40 °C, 3 Tage) entfernt.
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IR (KBr): 3425, 2893, 2148, 1660, 1620, 1549, 1412, 1378, 1323, 1236, 1204, 1154, 1078, 1038, 945, 893 cm-1.
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1H NMR (D
2O) δ: 1,25 (t, 2 H, γ -CH
2- Aminohexansäure), 1,48 (m, 2 H, δ -CH
2- Aminohexansäure), 1,51 (m, 2 H, β -CH
2- Aminohexansäure), 2,01 (s, 3 H, CH
3-), 2,65 (m, 2 H, Ph-CH
2-), 2,73 (m, 2 H, ε-CH
2- Aminohexansäure), 3,37 - 3,93 (m, Skelett von Hyaluronan), 4,46 (s, 1 H, Anomer), 4,54 (s, 1 H Anomer, -O-CH(OH)-), 6,59 (d, 2 H, arom.), 7,01 (d, 2 H, arom).
SEC MALLS:
DS (
1H NMR): 0,5%
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d) Herstellung eines Tyraminderivats von HA mit C6-Spacer (Mw ≈ 5 × 104 g-mol-1, DS ≈ 10%)
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Ein Aldehydderivat von HA (Mw ≈ 5 x 104 g-mol-1, DS ≈ 10%) (5,00 g) wurde in 500 ml entmineralisiertem Wasser gelöst. Der pH-Wert wurde mit Essigsäure auf 3 eingestellt. 6-Amino-N-[2-(4-hydroxyphenyl)ethyl]hexanamid (Zwischenprodukt (I)) (0,625 g, 2,5 mmol) wurde der HA-CHO-Lösung zugesetzt. Das Gemisch wurde 2 Stunden lang bei Raumtemperatur gerührt. Picolin-Borat-Komplex (0,270 g, 2,5 mmol) wurde dann dem Reaktionsgemisch zugesetzt. Das Gemisch wurde für weitere 12 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Das Produkt wurde durch Ultrafiltration gereinigt und von dem Retentat durch Ausfällung mit Propan-2-ol isoliert. Das Präzipitat wurde entfeuchtet, und das restliche Propan-2-ol wurde durch Trocknen im Heißlufttrockner (40 °C, 3 Tage) entfernt.
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IR (KBr): 3425, 2893, 2148, 1660, 1620, 1549, 1412, 1378, 1323, 1236, 1204, 1154, 1078, 1038, 945, 893 cm-1.
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1H NMR (D
2O) δ: 1,25 (t, 2 H, γ -CH
2- Aminohexansäure), 1,48 (m, 2 H, δ -CH
2- Aminohexansäure), 1,51 (m, 2 H, β -CH
2- Aminohexansäure), 2,01 (s, 3 H, CH
3-), 2,65 (m, 2 H, Ph-CH
2-), 2,73 (m, 2 H, ε-CH
2- Aminohexansäure), 3,37 - 3,93 (m, Skelett von Hyaluronan), 4,46 (s, 1 H, Anomer), 4,54 (s, 1 H Anomer, -O-CH(OH)-), 6,59 (d, 2 H, arom.), 7,01 (d, 2 H, arom).
SEC MALLS:
DS (
1H NMR): 10%
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Beispiel 2
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Herstellung von Hydrogelen auf der Basis von Hydroxyphenylderivat HA-TA mit einer Konzentration von 20 mg/ml
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Hydrogele wurden durch Mischen zweier Vorläuferlösungen A und B hergestellt, für deren Herstellung eine wässrige NaCI-Lösung (9 g/l) verwendet worden war. Für die Herstellung der Vorläuferlösungen wurde ein Hydroxyphenylderivat HA-TA mit Mw = 2,78 x 10
5 g · mol
-1 und DS 2,1 % verwendet. Die Zusammensetzung der Lösungen ist in der folgenden Tabelle dargestellt (Tabelle 1). Tabelle 1: Zusammensetzung der Vorläuferlösungen für die Herstellung von Hydrogelen auf der Basis von Hydroxyphenylderivat HA-TA mit einer Konzentration von 20 mg/ml.
Lösung A | | Lösung B | |
HRP | 0,48 U/ml | H2O2 | 2,0 mmol/l |
HA-TA | 20 mg/ml | HA-TA | 20 mg/ml |
NaCI | 9 g/L | NaCI | 9 g/l |
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Durch Mischen von Lösung A und Lösung B im Verhältnis 1:1 wurden Hydrogele mit der in der folgenden Tabelle (Tabelle 2) dargestellten End-Zusammensetzung hergestellt, wobei crossHA-TA ein kovalent vernetztes Hydroxyphenylderivat von Hyaluronan ist. Tabelle 2: End-Zusammensetzung der Hydrogele auf der Basis von Hydroxyphenylderivat HA-TA mit einer Konzentration von 20 mg/ml
Zusammensetzung der Hydrogele | |
HRP | 0,24 U/ml |
crossHA-TA | 20 mg/ml |
NaCI | 9 g/l |
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Beispiel 3
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Herstellung von ChS in einer Konzentration von 0,5 mg/ml enthaltenden Hydrogelen
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Hydrogele wurden durch Mischen zweier Vorläuferlösungen A und B hergestellt, für deren Herstellung eine wässrige NaCI-Lösung (9 g/l) verwendet worden war. Für die Herstellung der Vorläuferlösungen wurde ein Hydroxyphenylderivat HA-TA mit Mw = 2,78 x 10
5 g · mol
-1 und DS 2,1 % und ChS mit Mw = 10 x 10
3 - 40 x 10
3 g · mol
-1 verwendet. Die Zusammensetzung der Lösungen ist in der folgenden Tabelle (Tabelle 3) dargestellt. Tabelle 3: Zusammensetzung der Vorläuferlösungen für die Herstellung von ChS in einer Konzentration von 0,5 mg/ml enthaltenden Hydrogelen.
Lösung A | | Lösung B | |
HRP | 0,48 U/ml | H2O2 | 2,0 mmol/l |
HA-TA | 20 mg/ml | HA-TA | 20 mg/ml |
ChS | 0,5 mg/ml | ChS | 0,5 mg/ml |
NaCI | 9 g/l | NaCI | 9 g/l |
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Durch Mischen von Lösung A und Lösung B im Verhältnis 1:1 wurden Hydrogele mit der in der folgenden Tabelle (Tabelle 4) dargestellten End-Zusammensetzung hergestellt, wobei crossHA-TA ein kovalent vernetztes Hydroxyphenylderivat von Hyaluronan ist. Tabelle 4: End-Zusammensetzung der ChS in einer Konzentration von 0,5 mg/ml enthaltenden Hydrogele
Hydrogel-Zusammensetzung | |
HRP | 0,24 U/ml |
crossHA-TA | 20 mg/ml |
ChS | 0,5 mg/ml |
NaCl | 9 g/l |
-
Beispiel 4
-
Herstellung von ChS in einer Konzentration von 3,3 mg/ml enthaltenden Hydrogelen
-
Hydrogele wurden durch Mischen zweier Vorläuferlösungen A und B hergestellt, für deren Herstellung eine wässrige NaCI-Lösung (9 g/l) verwendet worden war. Für die Herstellung der Vorläuferlösungen wurde ein Hydroxyphenylderivat HA-TA mit Mw = 2,78 x 10
5 g · mol
-1 und DS 2,1 % und ChS mit Mw = 10 x 10
3 - 40 x 10
3 g · mol
-1 verwendet. Die Zusammensetzung der Lösungen ist in der folgenden Tabelle (Tabelle 5) dargestellt. Tabelle 5: Zusammensetzung der Vorläuferlösungen für die Herstellung von ChS in einer Konzentration von 3,3 mg/ml enthaltenden Hydrogelen
Lösung A | | Lösung B | |
HRP | 0,48 U/ml | H2O2 | 2,0 mmol/I |
HA-TA | 20 mg/ml | HA-TA | 20 mg/ml |
ChS | 3,3 mg/ml | ChS | 3,3 mg/ml |
NaCl | 9 g/l | NaCl | 9 g/l |
-
Durch Mischen von Lösung A und Lösung B im Verhältnis 1:1 wurden Hydrogele mit der in der folgenden Tabelle (Tabelle 6) dargestellten End-Zusammensetzung hergestellt, wobei crossHA-TA ein kovalent vernetztes Hydroxyphenylderivat von Hyaluronan ist. Tabelle 6: End-Zusammensetzung der ChS in einer Konzentration von 3,3 mg/ml enthaltenden Hydrogele.
Zusammensetzung der Hydrogele | |
HRP | 0,24 U/ml |
crossHA-TA | 20 mg/ml |
ChS | 3,3 mg/ml |
NaCl | 9 g/l |
-
Beispiel 5
-
Herstellung von ChS in einer Konzentration von 10 mg/ml enthaltenden Hydrogelen
-
Hydrogele wurden durch Mischen zweier Vorläuferlösungen A und B hergestellt, für deren Herstellung eine wässrige NaCI-Lösung (9 g/l) verwendet worden war. Für die Herstellung der Vorläuferlösungen wurde ein Hydroxyphenylderivat HA-TA mit Mw = 2,78 x 10
5 g·mol
-1 und DS 2,1% und ChS mit Mw = 10 x 10
3 - 40 x 10
3 g · mol
-1 verwendet. Die Zusammensetzung der Lösungen ist in der folgenden Tabelle (Tabelle 7) dargestellt. Tabelle 7: Zusammensetzung der Vorläuferlösungen für die Herstellung von ChS in einer Konzentration von 10 mg/ml enthaltenden Hydrogelen
Lösung A | | Lösung B | |
HRP | 0,48 U/ml | H2O2 | 2,0 mmol/l |
HA-TA | 20 mg/ml | HA-TA | 20 mg/ml |
ChS | 10 mg/ml | ChS | 10 mg/ml |
NaCl | 9 g/l | NaCl | 9 g/l |
-
Durch Mischen von Lösung A und Lösung B im Verhältnis 1:1 wurden Hydrogele mit der in der folgenden Tabelle (Tabelle 8) dargestellten End-Zusammensetzung hergestellt, wobei crossHA-TA ein kovalent vernetztes Hydroxyphenylderivat von Hyaluronan ist. Tabelle 8: End-Zusammensetzung der ChS in einer Konzentration von 10 mg/ml enthaltenden Hydrogele.
Zusammensetzung der Hydrogele | |
HRP | 0,24 U/ml |
crossHA-TA | 20 mg/ml |
ChS | 10 mg/ml |
NaCl | 9 g/l |
-
Beispiel 6
-
Herstellung von ChS in einer Konzentration von 50 mg/ml enthaltenden Hydrogelen
-
Hydrogele wurden durch Mischen zweier Vorläuferlösungen A und B hergestellt, für deren Herstellung eine wässrige NaCI-Lösung (9 g/l) verwendet worden war. Für die Herstellung der Vorläuferlösungen wurde ein Hydroxyphenylderivat HA-TA mit Mw = 2,78 x 10
5 g · mol
-1 und DS 2,1 % und ChS mit Mw = 10 x 10
3 - 40 x 10
3 g · mol
-1 verwendet. Die Zusammensetzung der Lösungen ist in der folgenden Tabelle (Tabelle 9) dargestellt. Tabelle 9: Zusammensetzung der Vorläuferlösungen für die Herstellung von ChS in einer Konzentration von 50 mg/ml enthaltenden Hydrogelen
Lösung A | | Lösung B | |
HRP | 0,48 U/ml | H2O2 | 2,0 mmol/l |
HA-TA | 20 mg/ml | HA-TA | 20 mg/ml |
ChS | 50 mg/ml | ChS | 50 mg/ml |
NaCl | 9 g/l | NaCl | 9 g/l |
-
Durch Mischen von Lösung A und Lösung B im Verhältnis 1:1 wurden Hydrogele mit der in der folgenden Tabelle (Tabelle 10) dargestellten End-Zusammensetzung hergestellt, wobei crossHA-TA ein kovalent vernetztes Hydroxyphenylderivat von Hyaluronan ist. Tabelle 10: End-Zusammensetzung der ChS in einer Konzentration von 50 mg/ml enthaltenden Hydrogele.
Zusammensetzung der Hydrogele | |
HRP | 0,24 U/ml |
crossHA-TA | 20 mg/ml |
ChS | 50 mg/ml |
NaCl | 9 g/l |
-
Beispiel 7
-
Herstellung von HA in einer Konzentration von 5 mg/ml enthaltenden Hydrogelen
-
Die Herstellung nicht vernetzte Hyaluronsäure enthaltender Hydrogele umfasste 3 grundlegende Schritte:
-
1) Herstellung eines ein vernetztes Derivat crossHA-TA enthaltenden Hydrogels
-
Ein ein vernetztes Derivat crossHA-TA enthaltendes Hydrogel wurde hergestellt durch Mischen zweier Vorläuferlösungen A und B, welche durch Lösen einzelner Bestandteile in Phosphat-gepufferter Salzlösung (PBS) hergestellt worden waren. Für die Herstellung der Vorläuferlösungen wurde ein Hydroxyphenylderivat HA-TA mit Mw = 8,09 x 10
5 g ·mol
-1 und DS 1,1% verwendet. Die Zusammensetzung der Lösungen ist in der folgenden Tabelle (Tabelle 11) dargestellt. Tabelle 11: Zusammensetzung der Vorläuferlösungen für die Herstellung des vernetzten Derivats crossHA-TA
Lösung A | | Lösung B | |
HRP | 12,8 mU/ml | H2O2 | 0,6 mmol/l |
HA-TA | 20 mg/ml | HA-TA | 20 mg/ml |
NaCl | 8 g/l | NaCl | 8 g/l |
KCl | 0,2 g/l | KCl | 0,2 g/l |
Na2HPO4·12H2O | 2,85 g/l | Na2HPO4·12H2O | 2,85 g/l |
KH2PO4 | 0,2 g/l | KH2PO4 | 0,2 g/l |
-
Durch Mischen von Lösung A und Lösung B im Verhältnis 1:1 wurde ein Hydrogel mit der in der folgenden Tabelle (Tabelle 12) dargestellten Zusammensetzung hergestellt. Tabelle 12: Zusammensetzung des vernetzten Derivats HA-TA
Zusammensetzung des vernetzten Derivats - crossHA-TA |
HRP | 0,24 U/ml |
crossHA-TA | 20 mg/ml |
NaCl | 8 g/l |
KCl | 0,2 g/l |
Na2HPO4 · 12H2O | 2,85 g/l |
KH2PO4 | 0,2 g/l |
-
2) Herstellung der Hyaluronan-Lösung
-
Eine HA-Lösung mit einer Konzentration von 5 mg/ml wurde durch Lösen von nativem Hyaluronan mit Mw 1,91 x 106 g·mol-1 in PBS hergestellt.
-
3) Homogenisierung von Hydrogel und Hyaluronan-Lösung
-
Das Hydrogel-Endprodukt wurde durch Mischen des vernetzten Derivats crossHA-TA und der HA-Lösung im Verhältnis 1:1 und anschließendes Homogenisieren des Gemischs hergestellt. Die End-Zusammensetzung des Materials ist in der folgenden Tabelle (Tabelle 13) dargestellt. Tabelle 13: End-Zusammensetzung des HA in einer Konzentration von 5 mg/ml enthaltenden Hydrogels
End-Zusammensetzung | |
HRP | 0,12 U/ml |
crossHA-TA | 10 mg/ml |
HA | 5 mg/ml |
NaCl | 8 g/l |
KCl | 0,2 g/l |
Na2HPO4·12H2O | 2,85 g/l |
KH2PO4 | 0,2 g/l |
-
Beispiel 8
-
Herstellung von HA in einer Konzentration von 20 mg/ml enthaltenden Hydrogelen
-
Die Herstellung nicht vernetzte Hyaluronsäure enthaltender Hydrogele umfasste 3 grundlegende Schritte:
-
1) Herstellung eines ein vernetztes Derivat crossHA-TA enthaltenden Hydrogels
-
Ein ein vernetztes Derivat crossHA-TA enthaltendes Hydrogel wurde hergestellt durch Mischen zweier Vorläuferlösungen A und B, welche durch Lösen einzelner Bestandteile in Phosphatgepufferter Salzlösung (PBS) hergestellt worden waren. Für die Herstellung der Vorläuferlösungen wurde ein Hydroxyphenylderivat HA-TA mit Mw = 8,09 x 10
5 g·mol
-1 und DS 1,1% verwendet. Die Zusammensetzung der Lösungen ist in der folgenden Tabelle (Tabelle 14) dargestellt. Tabelle 14: Zusammensetzung der Vorläuferlösungen für die Herstellung des vernetzten Derivats crossHA-TA
Lösung A | | Lösung B | |
HRP | 12,8 mU/ml | H2O2 | 0,6 mmol/l |
HA-TA | 20 mg/ml | HA-TA | 20 mg/ml |
NaCl | 8 g/l | NaCl | 8 g/l |
KCl | 0,2 g/l | KCl | 0,2 g/l |
Na2HPO4·12H2O | 2,85 g/l | Na2HPO4·12H2O | 2,85 g/l |
KH2PO4 | 0,2 g/l | KH2PO4 | 0,2 g/l |
-
Durch Mischen von Lösung A und Lösung B im Verhältnis 1:1 wurde ein Hydrogel mit der in der folgenden Tabelle (Tabelle 15) dargestellten Zusammensetzung hergestellt. Tabelle 15: Zusammensetzung des vernetzten Derivats crossHA-TA
Zusammensetzung des vernetzten Derivats crossHA-TA | |
HRP | 0,24 U/ml |
crossHA-TA | 20 mg/ml |
NaCl | 8 g/l |
KCl | 0,2 g/l |
Na2HPO4·12H2O | 2,85 g/l |
KH2PO4 | 0,2 g/l |
-
2) Herstellung der Hyaluronan-Lösung
-
Eine HA-Lösung mit einer Konzentration von 40 mg/ml wurde durch Lösen von nativem Hyaluronan mit Mw 1,91 x 106 g · mol-1 in Phosphat-Puffer (PBS) hergestellt.
-
3) Homogenisierung von Hydrogel und Hyaluronan-Lösung
-
Das Hydrogel-Endprodukt wurde durch Mischen des vernetzten Derivats crossHA-TA und der HA-Lösung im Verhältnis 1:1 und anschließendes Homogenisieren des Gemischs hergestellt. Die End-Zusammensetzung des Materials ist in der folgenden Tabelle (Tabelle 16) dargestellt. Tabelle 16: End-Zusammensetzung des HA in einer Konzentration von 20 mg/ml enthaltenden Hydrogels
End-Zusammensetzung | |
HRP | 0,12 U/ml |
crossHA-TA | 10 mg/ml |
HA | 20 mg/ml |
NaCl | 8 g/l |
KCl | 0,2 g/l |
Na2HPO4·12H2O | 2,85 g/l |
KH2PO4 | 0,2 g/l |
-
Beispiel 9
-
Herstellung von HA in einer Konzentration von 5 mg/ml und ChS in einer Konzentration von 5 mg/ml enthaltenden Hydrogelen
-
Die Herstellung nicht vernetzte Hyaluronsäure und Chondroitinsulfat enthaltender Hydrogele umfasste 3 grundlegende Schritte:
-
1) Herstellung eines ein vernetztes Derivat crossHA-TA enthaltenden Hydrogels
-
Ein ein vernetztes Derivat crossHA-TA enthaltendes Hydrogel wurde hergestellt durch Mischen zweier Vorläuferlösungen A und B, welche durch Lösen einzelner Bestandteile in Phosphatgepufferter Salzlösung (PBS) hergestellt worden waren. Für die Herstellung der Vorläuferlösungen wurde ein Hydroxyphenylderivat HA-TA mit Mw = 8,09 x 10
5 g·mol
-1 und DS 1,1% verwendet. Die Zusammensetzung der Lösungen ist in der folgenden Tabelle (Tabelle 17) dargestellt. Tabelle 17: Zusammensetzung der Vorläuferlösungen für die Herstellung des vernetzten Derivats crossHA-TA
Lösung A | | Lösung B | |
HRP | 12,8 mU/ml | H2O2 | 0,6 mmol/l |
HA-TA | 20 mg/ml | HA-TA | 20 mg/ml |
NaCl | 8 g/l | NaCl | 8 g/l |
KCl | 0,2 g/l | KCl | 0,2 g/l |
Na2HPO4·12H2O | 2,85 g/l | Na2HPO4·12H2O | 2,85 g/l |
KH2PO4 | 0,2 g/l | KH2PO4 | 0,2 g/l |
-
Durch Mischen von Lösung A und Lösung B im Verhältnis 1:1 wurde ein Hydrogel mit der in der folgenden Tabelle (Tabelle 18) dargestellten Zusammensetzung hergestellt. Tabelle 18: Zusammensetzung des vernetzten Derivats crossHA-TA
Zusammensetzung des vernetzten Derivats crossHA-TA |
HRP | 0,24 U/ml |
crossHA-TA | 20 mg/ml |
NaCl | 8 g/l |
KCl | 0,2 g/l |
Na2HPO4·12H2O | 2,85 g/l |
KH2PO4 | 0,2 g/l |
-
2) Herstellung einer Hyaluronan und Chondroitinsulfat enthaltenden Lösung
-
Eine Lösung von HA in einer Konzentration von 10 mg/ml und Chondroitinsulfat in einer Konzentration von 10 mg/ml wurde durch Lösen von nativem Hyaluronan mit Mw 1,91 x 106 g·mol-1 und Chondroitinsulfat mit Mw 10 x 103 - 40 x 103 g. mol-1 in Phosphat-Puffer (PBS) hergestellt.
-
3) Homogenisierung von Hydrogel und Hyaluronan und Chondroitinsulfat enthaltender Lösung
-
Das Hydrogel-Endprodukt wurde durch Mischen des vernetzten Derivats crossHA-TA und der HA- und ChS-Lösung im Verhältnis 1:1 und anschließendes Homogenisieren des Gemischs hergestellt. Die End-Zusammensetzung des Materials ist in der folgenden Tabelle (Tabelle 19) dargestellt. Tabelle 19: End-Zusammensetzung des HA in einer Konzentration von 5 mg/ml und ChS in einer Konzentration von 5 mg/ml enthaltenden Hydrogels
End-Zusammensetzung | |
HRP | 0,12 U/ml |
crossHA-TA | 10 mg/ml |
HA | 5 mg/ml |
ChS | 5 mg/ml |
NaCl | 8 g/l |
KCl | 0,2 g/l |
Na2HPO4·12H2O | 2,85 g/l |
KH2PO4 | 0,2 g/l |
-
Beispiel 10
-
Herstellung von HA in einer Konzentration von 5 mg/ml und ChS in einer Konzentration von 10 mg/ml enthaltenden Hydrogelen
-
Die Herstellung nicht vernetzte Hyaluronsäure und Chondroitinsulfat enthaltender Hydrogele umfasste 3 grundlegende Schritte:
-
1) Herstellung eines ein vernetztes Derivat crossHA-TA enthaltenden Hydrogels
-
Ein ein vernetztes Derivat crossHA-TA enthaltendes Hydrogel wurde hergestellt durch Mischen zweier Vorläuferlösungen A und B, welche durch Lösen einzelner Bestandteile in Phosphatgepufferter Salzlösung (PBS) hergestellt worden waren. Für die Herstellung der Vorläuferlösungen wurde ein Hydroxyphenylderivat HA-TA mit Mw = 8,09 x 10
5 g·mol
-1 und DS 1,1% verwendet. Die Zusammensetzung der Lösungen ist in der folgenden Tabelle (Tabelle 20) dargestellt. Tabelle 20: Zusammensetzung der Vorläuferlösungen für die Herstellung des vernetzten Derivats crossHA-TA
Lösung A | | Lösung B | |
HRP | 12,8 mU/ml | H2O2 | 0,6 mmol/l |
HA-TA | 20 mg/ml | HA-TA | 20 mg/ml |
NaCl | 8 g/l | NaCl | 8 g/l |
KCl | 0,2 g/l | KCl | 0,2 g/l |
Na2HPO4·12H2O | 2,85 g/l | Na2HPO4·12H2O | 2,85 g/l |
KH2PO4 | 0,2 g/l | KH2PO4 | 0,2 g/l |
-
Durch Mischen von Lösung A und Lösung B im Verhältnis 1:1 wurde ein Hydrogel mit der in der folgenden Tabelle (Tabelle 21) dargestellten Zusammensetzung hergestellt. Tabelle 21: Zusammensetzung des vernetzten Derivats crossHA-TA
Zusammensetzung des vernetzten Derivats crossHA-TA |
HRP | 0,24 U/ml |
crossHA-TA | 20 mg/ml |
NaCl | 8 g/l |
KCl | 0,2 g/l |
Na2HPO4 · 12H2O | 2,85 g/l |
KH2PO4 | 0,2 g/l |
-
2) Herstellung einer Hyaluronan und Chondroitinsulfat enthaltenden Lösung
-
Eine Lösung von HA in einer Konzentration von 10 mg/ml und Chondroitinsulfat in einer Konzentration von 20 mg/ml wurde durch Lösen von nativem Hyaluronan mit Mw 1,91 x 106 g·mol-1 und Chondroitinsulfat mit Mw 10 x 103-40 x 103 g · mol-1 in Phosphat-Puffer (PBS) hergestellt.
-
3) Homogenisierung von Hydrogel und Hyaluronan und Chondroitinsulfat enthaltender Lösung
-
Das Hydrogel-Endprodukt wurde durch Mischen des vernetzten Derivats crossHA-TA und der HA- und ChS-Lösung im Verhältnis 1:1 und anschließendes Homogenisieren des Gemischs hergestellt. Die End-Zusammensetzung des Materials ist in der folgenden Tabelle (Tabelle 22) dargestellt. Tabelle 22: End-Zusammensetzung des HA in einer Konzentration von 5 mg/ml und ChS in einer Konzentration von 10 mg/ml enthaltenden Hydrogels
End-Zusammensetzung | |
HRP | 0,12 U/ml |
crossHA-TA | 10 mg/ml |
HA | 5 mg/ml |
ChS | 10 mg/ml |
NaCl | 8 g/l |
KCl | 0,2 g/l |
Na2HPO4·12H2O | 2,85 g/l |
KH2PO4 | 0,2 g/l |
-
Beispiel 11
-
Herstellung von Hydrogelen auf der Basis von Hydroxyphenylderivat HA-TA in einer Konzentration von 5 mg/ml
-
Hydrogele wurden durch Mischen zweier Vorläuferlösungen A und B hergestellt, für deren Herstellung eine wässrige NaCI-Lösung (9 g/l) verwendet worden war. Für die Herstellung der Vorläuferlösungen wurde Hydroxyphenylderivat HA-TA mit Mw = 1,5 x 10
5 g·mol
-1 und DS 0,5% verwendet. Die Zusammensetzung der Lösungen ist in der folgenden Tabelle (Tabelle 23) dargestellt. Tabelle 23: Zusammensetzung der Vorläuferlösungen für die Herstellung von Hydrogelen auf der Basis von Hydroxyphenylderivat HA-TA in einer Konzentration von 5 mg/ml
Lösung A | | Lösung B | |
HRP | 0,12 U/ml | H2O2 | 0,5 mmol/l |
HA-TA | 5 mg/ml | HA-TA | 5 mg/ml |
NaCl | 9 g/L | NaCl | 9 g/l |
-
Durch Mischen von Lösung A und Lösung B im Verhältnis 1:1 wurden Hydrogele mit der in der folgenden Tabelle (Tabelle 24) dargestellten End-Zusammensetzung hergestellt, wobei crossHA-TA ein kovalent vernetztes Hydroxyphenylderivat von Hyaluronan ist. Tabelle 24: End-Zusammensetzung der Hydrogele auf der Basis von Hydroxyphenylderivat HA-TA in einer Konzentration von 5 mg/ml
Zusammensetzung der Hydrogele | |
HRP | 0,06 U/ml |
crossHA-TA | 5 mg/ml |
NaCI | 9 g/l |
-
Beispiel 12
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Herstellung von Hydrogelen auf der Basis von Hydroxyphenylderivat HA-TA in einer Konzentration von 30 mg/ml
-
Hydrogele wurden durch Mischen zweier Vorläuferlösungen A und B hergestellt, für deren Herstellung eine wässrige NaCI-Lösung (9 g/l) verwendet worden war. Für die Herstellung der Vorläuferlösungen wurde Hydroxyphenylderivat HA-TA mit Mw = 5 x 10
4 g ·mol
-1 und DS 10% verwendet. Die Zusammensetzung der Lösungen ist in der folgenden Tabelle (Tabelle 25) dargestellt. Tabelle 25: Zusammensetzung der Vorläuferlösungen für die Herstellung von Hydrogelen auf der Basis von Hydroxyphenylderivat HA-TA in einer Konzentration von 30 mg/ml
Lösung A | | Lösung B | |
HRP | 1,2 U/ml | H2O2 | 5 mmol/l |
HA-TA | 30 mg/ml | HA-TA | 30 mg/ml |
NaCI | 9 g/L | NaCI | 9 g/l |
-
Durch Mischen von Lösung A und Lösung B im Verhältnis 1:1 wurden Hydrogele mit der in der folgenden Tabelle (Tabelle 26) dargestellten End-Zusammensetzung hergestellt, wobei crossHA-TA ein kovalent vernetztes Hydroxyphenylderivat von Hyaluronan ist. Tabelle 26: End-Zusammensetzung der Hydrogele auf der Basis von Hydroxyphenylderivat HA-TA in einer Konzentration von 30 mg/ml.
Zusammensetzung der Hydrogele | |
HRP | 0,6 U/ml |
crossHA-TA | 30 mg/ml |
NaCl | 9 g/l |
-
Beispiel 13
-
Abbau von HA-Lösungen mit Zusatz von ChS unter Verwendung von ROS
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Zum Vergleich der Abbaugeschwindigkeit der HA-Lösungen mit ChS durch die Wirkung von ROS wurden Lösungen von Hyaluronan in Phosphat-Puffer (PBS) mit verschiedenen ChS-Konzentrationen hergestellt. Für die Herstellung der Lösungen wurden Hyaluronsäure mit Mw von 1,91 x 106 g·mol-1 und ChS mit Mw = 10 x 103 - 40 x 103 g · mol-1 verwendet. Lösung A enthielt 20 mg/ml HA, Lösung B 20 mg/ml HA und 0,5 mg/ml ChS, Lösung C 20 mg/ml HA und 1 mg/ml ChS, Lösung D 20 mg/ml HA und 3 mg/ml ChS, Lösung E 20 mg/ml HA und 5 mg/ml ChS, Lösung F 20 mg/ml HA und 20 mg/ml ChS.
-
Durchführung des Abbauversuchs
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Die Abbaugeschwindigkeit wurde als prozentuale Abnahme der Viskosität der Lösungen bei einer Scherrate von 0,1 s-1 gegenüber dem Ausgangswert ausgedrückt. Die Messung der Viskositätsabnahme wurde mit dem Rheometer Kinexus Malvern in der Konfiguration Kegel-Platte durchgeführt. Es wurde ein Kegel mit einem Durchmesser von 40 mm und einem Scheitelwinkel von 1° verwendet. Der Materialabbau erfolgte in 10-ml-Spritzen, wobei in 9 ml Material 0,5 ml CuSO4-Lösung mit einer Konzentration von 0,25 mmol/l und anschließend 0,5 ml H2O2-Lösung mit einer Konzentration von 2,5 mmol/l zugesetzt wurden. Während des laufenden Hydrogelabbaus wurden in vorgegebenen Zeitintervallen Proben des Materials entnommen, bei denen die Viskosität bei 25 °C und einer Scherrate von 0,1 s-1 gemessen wurde. Die Gesamtdauer des Abbaus betrug 3 h.
-
1 zeigt den Abbau von Hyluronanketten, welcher als prozentuale Abnahme der Viskosität der Lösung in der Zeit dargestellt ist. Aus der 1 ist der Einfluss der ChS-Konzentration auf die Hyaluronan-Abbaugeschwindigkeit ersichtlich. Die durch ROS verursachte HA-Abbaugeschwindigkeit nimmt mit steigender ChS-Konzentration ab. Die Viskosität der Lösung A, welche kein ChS enthielt, nahm in 3 Stunden um 97% gegenüber dem Ausgangswert vor dem Abbau ab, die der Lösung B (mit Zusatz von 0,5 mg/ml ChS) um 89%, die der Lösung C, welcher 1 mg/ml ChS zugesetzt wurde, um 84%, die der Lösung D (20 mg/ml HA + 3 mg/ml ChS) um 46%, die der Lösung E (20 mg/ml HA + 5 mg/ml ChS) um 25% und die der Lösung F (20 mg/ml HA + 20 mg/ml ChS) nur um 8%.
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Beispiel 14
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Abbau von Hydrogelen auf der Basis von vernetztem Derivat crossHA-TA durch die Wirkung von ROS
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3 Arten von Material wurden für den Vergleich der Abbaugeschwindigkeit von Hydrogelen durch die Wirkung von ROS hergestellt.
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Material A ist eine HA-Lösung mit einer Konzentration von 20 mg/ml, welche durch Lösen von HA mit Mw 1,91 x 106 g·mol-1 in PBS hergestellt wurde.
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Material B ist ein Gemisch aus vernetztem Derivat crossHA-TA und nicht vernetztem HA, welches gemäß Beispiel 7 hergestellt wurde.
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Die Materialien C und D waren zusammengesetzt aus nicht vernetztem HA, CHS und crossHA-TA und wurden gemäß den Beispielen 9 und 10 hergestellt.
-
Die Abbaugeschwindigkeit wurde als prozentuale Abnahme der Viskosität der Materialien bei einer Scherrate von 0,1 s-1 gegenüber dem Ausgangswert dargestellt. Die Messung der Viskositätsabnahme wurde mit dem Rheometer Kinexus Malvern in der Konfiguration Kegel-Platte durchgeführt. Es wurde ein Kegel mit einem Durchmesser von 40 mm und einem Scheitelwinkel von 1° verwendet. Der Materialabbau erfolgte in 10-ml-Spritzen, wobei in 9 ml Material 0,5 ml CuSO4-Lösung mit einer Konzentration von 0,25 mmol/I und anschließend 0,5 ml H2O2-Lösung mit einer Konzentration von 2,5 mmol/l zugesetzt wurden. Während des laufenden Hydrogelabbaus wurden in vorgegebenen Zeitintervallen Proben des Materials entnommen, bei denen die Viskosität bei 25 °C und einer Scherrate von 0,1 s-1 gemessen wurde. Die Gesamtdauer des Abbaus betrug 3 h. Aus 2 ist ersichtlich, dass das Vorhandensein von ChS in den hergestellten Hydrogelen (C - 5 mg/ml ChS; D - 10 mg/ml ChS) ihre Resistenz gegen die Wirkung von ROS erhöht.
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Beispiel 15
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Enzymatischer Abbau von Hydrogelen auf der Basis von vernetztem Derivat crossHA-TA
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3 Arten von Hydrogelen wurden hergestellt, um den Einfluss des Vorhandenseins von ChS auf die Abbaugeschwindigkeit von Hydrogelen auf der Basis von crossHA-TA durch die Wirkung von Rinderhoden-Hyaluronidase zu ermitteln:
- A - Hydrogele ohne Zusatz von Chondroitinsulfat, welche gemäß dem Protokoll aus Beispiel 2 hergestellt wurden
- B - Hydrogele mit Zusatz von ChS in einer Konzentration von 3,3 mg/ml, welche gemäß dem Protokoll aus Beispiel 4 hergestellt wurden
- C - Hydrogele mit Zusatz von ChS in einer Konzentration von 10 mg/ml, welche gemäß dem Protokoll aus Beispiel 5 hergestellt wurden.
-
Die Abbaugeschwindigkeit wurde als Erhöhung der Konzentration der durch BTH verursachten Abbauprodukte in Prozent dargestellt.
-
Die Hydrogele wurden in ein Abbau-Medium getaucht (Lösung von Hyaluronidase BTH mit einer Aktivität von 30 U/mg in einer Lösung von Rinderserumalbumin (BSA) mit einer Konzentration von 0,1 mg/ml in 0,01 mol/l Acetat-Puffer (OP) mit pH 5,3). Der Abbau der Hydrogele erfolgte im Inkubator bei 37 °C unter Rühren. Nach vorgegebenen Zeitintervallen wurden Proben des Abbau-Mediums mit den Hydrogel-Abbauprodukten entnommen. Die Konzentration der HA-Disaccharideinheiten im Abbau-Medium wurde spektrophotometrisch als Konzentration von N-Acetylglucosamin bestimmt. 3 zeigt die Erhöhung der Konzentration der Hydrogel-Abbauprodukte im Medium in der Zeit. Aus der Fig. ist ersichtlich, dass das Vorhandensein von ChS in Hydrogelen auf der Basis von crossHA-TA zu einer Abnahme der Abbaugeschwindigkeit der Materialien durch die Wirkung von Hyaluronidase führt.
-
Literaturverzeichnis:
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- Bali, J.-P., H. Cousse und E. Neuzil (2001). „Biochemical basis of the pharmacologic action of chondroitin sulfates on the osteoarticular system.“ Seminars in Arthritis and Rheumatism 31(1): 58-68.
- Baeurle S.A., Kiselev M.G., Makarova E.S., Nogovitsin E.A. 2009. Polymer 50: 1805
- Buck Ii, D.W., M. Alam und J.Y.S. Kim (2009). „Injectable fillers for facial rejuvenation: a review.“ Journal of Plastic, Reconstructive & Aesthetic Surgerv 62(1): 11-18.
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ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
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Zitierte Patentliteratur
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- EP 1587945 B1 [0004]
- EP 1773943 B1 [0004]
- EP 0136782 [0009]
- US 6051560 [0009]
- WO 030417024 [0009]
- WO 20040349802002 [0009]
- EP 2219595 [0009]