FR3104945A3 - Hydrogel à base d’un dérivé hydroxyphényle réticulé d’acide hyaluronique - Google Patents
Hydrogel à base d’un dérivé hydroxyphényle réticulé d’acide hyaluronique Download PDFInfo
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Abstract
Hydrogel à base d’un dérivé hydroxyphényle réticulé d’acide hyaluronique La présente invention concerne un hydrogel à base d’un dérivé hydroxyphényle réticulé de l’acide hyaluronique, caractérisé en ce qu’il contient des molécules d’un dérivé hydroxyphényle de l’acide hyaluronique (HA-TA), ou du sel pharmaceutiquement acceptable de celui-ci, et du sulfate de chondroïtine, ou du sel de celui-ci pharmaceutiquement acceptable, sélectionné dans un groupe comprenant des sels alcalins ou des sels alcalino-terreux.
Description
La solution technique concerne un hydrogel à base d’un dérivé hydroxyphényle réticulé d’acide hyaluronique en mélange avec du sulfate de chondroïtine avec un niveau de dégradation améliorée.
État technique antérieur
L’acide hyaluronique (aussi appelé hyaluronane, HA) est un polysaccharide du groupe de glycosaminoglycanes, qui est formé d’unités disaccharidiques, consistant en acide D-glucuronique et en N-acetyle-D-glucosamine. Il s’agit d’un polysaccharide facilement soluble dans l’eau, où il forme des solutions viscoses jusqu’à des hydrogels viscoélastiques en fonction de poids moléculaire et de concentration. HA est un composant naturel de la matrice extracellulaire des tissus. La molécule d’hyaluronane est capable d’interagir avec les cellules au voisinage par liaison de récepteurs de surface cellulaire spécifiques (Xu, Jha et al. 2012). Pour ces raisons, les matériaux contenant de l’hyaluronane, éventuellement dérivés de celui-ci, sont souvent utilisés pour la production de préparations, utilisées dans des applications biomédicales. Les hydrogels à base d’hyaluronane subissent dans l’organisme une dégradation naturelle par les enzymes spécifiques (hyaluronidases), éventuellement par les formes réactives d’oxygène (ROS), ce qui permet leur absorption graduelle après leur implantation dans l’organisme (Stern, Kogan et al. 2007).
Pour obtenir des matériaux mécaniquement plus durables et pour ralentir leur biodégradation, un nombre de types d’hydrogels, contenant de l’hyaluronane réticulé de manière covalente, a été développé. Des tels hydrogels sont utilisés comme matériaux pour la viscosupplementation du liquide synovial, pour l’augmentation des tissus mous, ils servent comme des structures de soutien pour cultiver et implanter des cellules etc. (Tognana, Borrione et al. 2007, Buck Ii, Alam et al. 2009, Li, Raitcheva et al. 2012, Salwowska, Bebenek et al. 2016).
Dans le passé, de divers types de dérivés d’hyaluronane ont été développés, qui sont capables de subir la transition sol-gel sous les conditionsin-situphysiologiques (Burdick and Prestwich 2011, Prestwich 2011). Pour ce faire, on peut utiliser par exemple des dérivés phénols d’hyaluronane. Calabro et al. (Calabro, Akst et al. 2008, Lee, Chung et al. 2008, Kurisawa, Lee et al. 2009) décrivent dans les documents EP1587945B1 et EP1773943B1 un procédé de préparation de dérivés phénols d’hyaluronane par réaction de carboxyles, présents dans la structure de l’acide D-glucuronique de l’hyaluronane avec des dérivés aminoalkyles du phénol, par exemple avec de la tyramine. Les produits de cette réaction sont des amides d’hyaluronane (Darr and Calabro 2009).
La réticulation des dérivés phénols d’hyaluronane peut être initiée par l’ajout de peroxydase (par exemple peroxydase de raifort) et d’une solution diluée de peroxyde d’hydrogène. La peroxydase de raifort (Horseradish peroxidase, HRP, E.C.1.11.1.7) est actuellement utilisée comme catalyseur des réactions organiques et biotransformatives (Akkara, Senecal et al. 1991, Higashimura and Kobayashi 2002, Ghan, Shutava et al. 2004, Shutava, Zheng et al. 2004, Veitch 2004). Les hydrogels à base de dérivés hydroxyphényles d’hyaluronane peuvent être utilisés comme matrices injectables pour la libération contrôlée des substances biologiquement actives ou comme matériaux appropriés pour la cultivation et l’implantation de cellules (Kurisawa, Lee et al. 2010). Wolfová et al. décrivent dans le document CZ303879 un conjugué d’hyaluronane et de tyramine, contenant un lieur aliphatique, inséré entre la chaine de polymère et la tyramine. La présence du lieur aliphatique permet une effectivité augmentée de la réaction de réticulation et donne au réseau une élasticité augmentée.
Le sulfate de chondroïtine (ChS) est un autre représentant de glycosaminoglycanes, qui est souvent utilisé pour la préparation des matériaux, destinés pour utilisation dans le traitement des maladies dégénératives, par exemple de l’ostéoarthrite (OA). La chaine de ChS est constituée d’unités disaccharidiques, composées de N-acétylegalctosamine (GalNAc) et d’acide iduronique (IdoA). Les unités disaccharidiques de ChS peuvent être sulfatées dans la position 4 et 6 GalNAc ou bien aussi dans la position 2 IdoA. Le sulfate de chondroïtine est un glycosaminoglycane linéaire chargé négativement, composé d’unités monomériques répétitives de N-acétyle-D-galactosamine et d’acide D-glucuronique, mutuellement liées par les liaisons O-glycosidiques β(1→3) a β(1→4) (la formule structurale du sulfate de chondroïtine ci-dessous).
où
R1est H ou Na,
R2est H, O-SO2-OH ou O-SO2-ONa.
Les sources du sulfate de chondroïtine sont des tissus animaux conjonctifs, où ledit sulfate de chondroïtine se lie aux protéines et ainsi constitue une partie de protéoglycannes. La sulfatation est effectuée à l’aide de sulfotransférases dans des positions et des quantités diverses. La formule unique de sulfatation des positions individuelles dans la chaine polymérique code une activité biologique spécifique du sulfate de chondroïtine. Le sulfate de chondroïtine est un élément de construction important du cartilage dans les articulations, auxquelles il rend la résistance à la compression et rétablit l’équilibre dans la composition du lubrifiant articulaire (Baeurle S.A., Kiselev M.G., Makarova E.S., Nogovitsin E.A. 2009. Polymer 50: 1805). Le sulfate de chondroïtine est ensemble avec le glucosaimne utilisé comme complément alimentaire pour le traitement ou aussi la prévention du développement de l’ostéoarthrite chez l’homme (par exemple Flextor®, Advance Nutraceutics Ltd.) ou chez animaux (par exemple Gelorendog®, Contipro Pharma Ltd.). Du point de vue pharmaceutique, le sulfate de chondroïtine est considéré comme un médicament avec l’apparition retardée de l’effet de soulagement de la douleur dans les maladies dégénératives des articulations (Aubry-Rozier B. 2012. Revue Médicale Suisse 14: 571).
Les étudesin vitroetin vivoont montré que le ChS inhibe l’effet des hyaluronidases. L’effet inhibitif du ChS sur les enzymes est causé par l’apparition des interactions électrostatiques (ioniques). Il a aussi été prouvé que le ChS est capable d’intercepter le ROS et ainsi protéger les composants de la matrice extracellulaire de la dégradation.
L’utilisation de la combinaison de l’hyaluronane et du sulfate de chondroïtine pour la préparation d’un moyen pour la protection des cellules et tissus humains et animaux du traumatisme est décrite dans le document EP0136782 (1983). De manière similaire, le document US6051560 (1992) décrit l’utilisation d’un mélange d’hyaluronane et de sulfate de chondroïtine comme matériaux viscosupplementaires au cours des opérations ophtalmologiques. Le brevet WO030417024 décrit une composition viscose, contenant une quantité thérapeutiquement effective du mélange de ChS et de HA pour la production des médicaments, destinés pour le traitement des articulations chez les humains avec un cartilage endommagé par la chondromalacie ou par OA niveau I et II, qui utilise l’administration intra-articulaire du mélange. Dans les documents de brevets, on peut également trouver des documents qui décrivent un moyen pour l’administration parentérale, approprié pour la prévention et le traitement de l’endommagement du cartilage articulaire chez l’homme ou chez les animaux, qui consiste en quantité de sulfate de chondroïtine thérapeutiquement active, d’hyaluronane et de glucosamine (WO2004034980, 2002). Le document EP2219595 décrit une formulation à base de polysaccharides, principalement glycosaminoglycanes, et leurs mélanges avec des flavonoïdes, qui constitue des hydrogels avec le temps de biodégradation prolongé. Le document mentionné décrit également un hydrogel, contenant de l’hyaluronane, du dérivé d’hyaluronane, réticulé par butandiole 1,4-diglycidyl éther et du ChS, qui montre une résistance plus élevée contre la dégradation par l’enzyme de l’hyaluronidase.
La substance de la solution technique
La solution technique concerne un hydrogel à base de dérivé hydroxyphényle de l’acide hyaluronique, dont la substance est qu’il contient des molécules d’un dérivé hydroxyphényle de l’acide hyaluronique (HA-TA) ou du sel pharmaceutiquement acceptable de celui-ci, selon la formule générale I:
oùnest dans la plage de 2 à 7500 et où R1est H+ ou un ion d’un sel alcalin ou d’un sel alcalino-terreux
et R2est OH ou un substituant tyramine selon la formule générale II:
où dans le cadre d’une molécule du dérivé hydroxyphényle de l’acide hyaluronique ou dans le cadre du sel pharmaceutiquement acceptable de celui-ci selon la formule générale I, au moins un R2est un substituant tyramine selon la formule générale II et où au moins deux substituants tyramines selon la formule générale II sont liés par la liaison covalente dans quelconque des positions ortho des groupes phényle,
et en outre il contient du sulfate de chondroïtine ou du sel pharmaceutiquement acceptable de celui-ci, sélectionné dans le groupe contenant des sels alcalins ou des sels alcalino-terreux.
et en outre il contient du sulfate de chondroïtine ou du sel pharmaceutiquement acceptable de celui-ci, sélectionné dans le groupe contenant des sels alcalins ou des sels alcalino-terreux.
Les sels alcalins ou les sels alcalino-terreux du dérivé hydroxyphényle de l’acide hyaluronique selon la formule générale I ou du sulfate de chondroïtine sont sélectionnés de préférence dans le groupe contenant Na+, K+, Ca2+, Mg2+.
La concentration du sulfate de chondroïtine ou du sel pharmaceutiquement acceptable de celui-ci est dans la plage de 0,5 à 50 mg/ml d’hydrogel selon la solution technique, de préférence dans la plage de 1 à 20 mg/ml, mieux encore 5 mg/ml.
La teneur du dérivé hydroxyphényle réticulé de l’hyaluronane selon la solution technique est dans la plage de 5 à 30 mg/ml, de préférence 5 à 10 mg/ml, mieux encore 5 mg/ml.
Selon un autre mode de réalisation préféré de la solution technique l’hydrogel contient également de l’acide hyaluronique ou du sel pharmaceutiquement acceptable de celui-ci dans la concentration de 1 à 20 mg/ml, de préférence de 5 à 10 mg/ml, mieux encore 5 mg/ml d’hydrogel selon la solution technique.
Dans le cadre d’une molécule du dérivé de l’acide hyaluronique selon la formule générale I, la liaison covalente peut être dans quelconque des positions ortho des groupes phényle d’au moins deux substituants selon la formule générale II, qui se trouvent dans cette molécule. Il s’agit de soi-disant réticulation intramoléculaire. La liaison covalente peut également être dans quelconque des positions ortho des groupes phényle d’au moins deux substituants tyramines selon la formule générale II, qui se trouvent dans des molécules différentes du dérivé de l’acide hyaluronique selon la formule générale I. Cela représente un réseau mutuellement interconnecté entre les molécules du dérivé HA.
Un exemple du dérivé hydroxyphényle de l’hyaluronane (crossHA-TA) est indiqué schématiquement ci-dessous (voir formule III):
De tels hydrogels selon la solution technique présentent une résistance plus élevée contre la biodégradation, résultant de l’effet des enzymes hydrolytiques et des formes réactives de l’oxygène.
Selon un mode de réalisation préféré, la masse molaire moyenne en poids (Mw) du dérivé hydroxyphényle de l’hyaluronane selon la formule générale I est dans la plage de 5 x 104à 1,5 x 106g.mol-1, de préférence 2,5 x 105à 1 x 106g.mol-1, mieux encore 8 x 105g.mol-1. PI est dans la plage de 1 à 3.
Selon un autre mode de réalisation de l’invention, le degré de substitution (DS) du dérivé hydroxyphényle de l’hyaluronane selon la formule générale I est dans la plage de 0,5 à 10 %, de préférence de 1 à 4 %, mieux encore 1 %.
Selon un autre mode de réalisation préféré, la Mwdu sulfate de chondroïtine est dans la plage de 5 x 103à 95 x 103g.mol-1, de préférence de 10 x 103à 40 x 103g. mol-1.
Selon un mode de réalisation préféré, l’hydrogel contient de l’hyaluronane (HA) ou du sel pharmaceutiquement acceptable de celui-ci avec la Mwdans la plage de 5 x 104à 2,5 x 106g.mol-1, de préférence de 1,5 x 106à 2,5 x 106g.mol-1, mieux encore 2,0 x 106g-mol-1.
De tels hydrogels selon la solution technique peuvent être utilisés dans les produits cosmétiques, la médecine et la médecine régénérative, surtout pour la préparation des matériaux pour la régénération du tissu, l’augmentation du tissu, la préparation des supports dans l’ingénierie tissulaire, comme matrice pour la libération contrôlée des substances biologiquement actives et pour la viscosupplementation du liquide synovial.
Description brève des figures
Exemples des modes de réalisation de la solution technique
DS = degré de substitution = 100 % * quantité molaire d’unités disaccharidiques modifiées d’hyaluronane / quantité molaire de toutes les unités disaccharidiques du dérivé de l’hyaluronane. Le degré de substitution a été déterminé à l’aide de la spectroscopie RMN.
La masse molaire moyenne en poids (Mw) et l’indice de polydispersité (PI) ont été déterminés par la méthode SEC-MALLS.
Les spectres infrarouges des dérivés préparés ont été obtenus par la méthode FT-IR.
Le sulfate de chondroïtine de qualité pharmaceutique pour l’injection (de Bioiberica, ES) a été utilisé.
Exemple 1
Synthèse du dérivé tyramine HA (HA-TA)
Synthèse de 6-amino-N-[2(4-hydroxyphényle)éthyle]hexanamide
De l’acide 6-[(tert-butoxycarbonyle)amino]hexanoïque (1,00 g, 4,3 mmol) a été dissous dans 50 ml de tétrahydrofurane (THF). 1,1’carbodiimidazole (0,70 g, 4,3 mmol) a été ajouté à la solution d’acide. Le mélange a été chauffé jusqu’à 50 °C pendant 60 minutes. Le conteneur de réaction a ensuite été lavé par du gaz inerte. De la tyramine a été ajoutée au mélange de réaction (0,59 g, 4,3 mmol). Le mélange a encore été chauffé pendant 2 heures de plus. Ensuite, le THF a été retiré par distillation à basse pression. Le résidu a été dissous dans 50 ml d’acétate d’éthyle. La solution a été lavée par 150 ml d’eau épurée (divisé en trois parts). La couche organique a été séchée sur un tamis moléculaire. L’acétate d’éthyl a été retiré par distillation à basse pression. Le résidu a été dissous dans 50 ml de MeOH et 2 ml d’acide trifluoroacétique (TFA) ont été ajoutés à la solution. La solution a été chauffée pendant 6 heures sous un condenseur à reflux. Le solvant a été retiré par distillation à basse pression. Le résidu a été dissous dans 50 ml d’acétate d’éthyle. La solution a été lavée par 150 ml d’eau épurée (divisé en trois parts). La couche organique a été séchée sur un tamis moléculaire. L’acétate d’éthyle a été retiré par distillation à basse pression.
m = 0,75 g (70 % théoriquement)
1 H NMR (D 2 O, ppm) δ: 1,17 (m, 2 H, acides γ-CH2-hexanoïques); 1,48 (m, 2 H, acides ß-CH2-hexanoïques); 1,58 (m, 2 H, acides δ-CH2-hexanoïques); 2,17 (t, 2 H, -CH2-CO-); 2,73 (m, 2 H, -CH2-Ph); 2,91 (m, 2 H, -CH2-NH2); 3,42 (m, 2 H, -CH2-NH-CO-); 6,83 (d, 2 H, arom); 7,13 (d, 2 H, arom).
13 C NMR (D 2 O, ppm) δ: 24 (acides γ-CH2-hexanoïques); 26 (acides δ-C-hexanoïques); 33 (acides ß-C-hexanoïques); 35 (-C-CO-); 39 (-C-NH2); 40 (C-Ph); 63 (-C-NH-CO-); 115 (C3 arom); 126 (C1 arom); 130 (C2 arom); 153 (C4 arom); 176 (-CO-).
Préparation d’un dérivé aldéhydique (HA-CHO)
De l’hyaluronane (10,00 g, Mw= 2 x 106g.mol-1) a été dissous dans 750 ml de 2,5 % (w/w) solution de Na2HPO4• 12H2O. La solution a été refroidie à 5 °C. 2,60 g de NaBr et 0,05 g de 4-acetamido-2,2,6,6-tertramethylpiperidine-1-oxyle a été ajouté à la solution résultante. Après l’homogénéisation profonde, 3 ml de la solution NaClO (10-15 % de Cl2disponible) a été ajoutée au mélange de réaction. En remuant constamment, la réaction continuait pendant 15 minutes. La réaction a été terminée par l’ajout de 100 ml de 40% solution de propane-2-ol. Le produit a été purifié par ultrafiltration et isolé par précipitation par propane-2-ol.
IR (KBr): 3417, 2886, 2152, 1659, 1620, 1550, 1412, 1378, 1323, 1236, 1204, 1154, 1078, 1038, 945, 893 cm-1.
1 H NMR (D 2 O) δ: 2,01 (s, 3 H, CH3-), 3,37 – 3,93 (m, squelette de l’hyaluronane), 4,46 (s, 1H, anomère), 4,54 (s, 1H anomère, -O-CH(OH)-), 5,27 (glycol geminale -CH-(OH)2).
a) Préparation d’un dérivé tyramine HA avec un espaceur C6(Mw≈ 3 x 105g.mol-1, DS ≈ 2 %)
Le dérivé aldéhydique HA (≈ 3 x 105g.mol-1, DS = 9 %) (5,00 g) a été dissous dans 500 ml d’eau déminéralisée. Le pH de la solution a été ajusté à 3 à l’aide de l’acide acétique. Du 6-amino-N-[2-(hydroxyphényl)éthyle]hexanamide (produit intermédiaire de (I)) (1,25 g, 5 mmol) a été ajouté à la solution HA-CHO. Le mélange a été remué pendant 2 heures à la température ambiante. Ensuite, du complexe de picoline-borane (0,270 g, 2,5 mmol) a été ajouté au mélange de réaction. Le mélange a été remué pendant 12 heures de plus à la température ambiante. Le produit a été purifié par ultrafiltration et isolé du rétentat par précipitation par propane-2-ol. Le précipité a été débarrassé de l’humidité et du propane-2-ol résiduel par séchage en sécheur à air chaud (40 °C, 3 jours).
IR (KBr): 3425, 2893, 2148, 1660, 1620, 1549, 1412, 1378, 1323, 1236, 1204, 1154, 1078, 1038, 945, 893 cm-1.
1 H NMR(D2O) δ: 1,25 (t, 2H, acides γ-CH2-aminohexanoïques), 1,48 (m, 2 H, acides δ-CH2-aminohexanoïques), 1,51 (m, 2 H, acides ß-CH2-aminohexanoïques), 2,01 (s, 3 H, CH3-), 2,65 (m, 2 H, Ph-CH2-), 2,73 (m, 2 H, acides ε-CH2-aminohexanoïques), 3,37 – 3,93 (m, squelette d’hyaluronane), 4,46 (s, 1H, anomère), 4,54 (s, 1H anomère., -O-CH(OH)-), 6,59 (d, 2 H, arom.), 7,01 (d, 2 H, arom.).
SEC MALLS: Mw= 2,78 x 105g.mol-1
DS (1h NMR): 2,1 %
b) Préparation d’un dérivé tyramine HA avec un espaceur C6(Mw≈ 8 x 105g.mol-1, DS ≈ 1 %)
Du dérivé aldéhydique HA (Mw≈ 8 x 105g.mol-1, DS ≈ 5 %) (5,00 g) a été dissous dans 500 ml d’eau déminéralisée. Le pH de la solution a été ajusté à 3 à l’aide de l’acide acétique. Du 6-amino-N-[2-(hydroxyphényl)éthyle]hexanamide (produit intermédiaire de (I)) (0,625 g, 2,5 mmol) a été ajouté à la solution HA-CHO. Le mélange a été remué pendant 2 heures à la température ambiante. Ensuite, du complexe de picoline-borane (0,270 g, 2,5 mmol) a été ajouté au mélange de réaction. Le mélange a été remué pendant 12 heures de plus à la température ambiante. Le produit a été purifié par ultrafiltration et isolé du rétentat par précipitation par propane-2-ol. Le précipité a été débarrassé de l’humidité et du propane-2-ol résiduel par séchage en sécheur à air chaud (40 °C, 3 jours).
IR (KBr): 3425, 2893, 2148, 1660, 1620, 1549, 1412, 1378, 1323, 1236, 1204, 1154, 1078, 1038, 945, 893 cm-1:
1 H NMR(D2O) δ: 1,25 (t, 2 H, acides γ-CH2-aminohexanoïques), 1,48 (m, 2 H, acides δ-CH2-aminohexanoïques), 1,51 (m, 2 H, acides ß-CH2-aminohexanoïques), 2,01 (s, 3 H, CH3), 2,65 (m, 2 H, Ph-CH2-), 2,73 (m, 2 H, ε-CH2-aminohexanoïque, 3,37 – 3,93 (m, squelette d’hyaluronane), 4,46 (s, 1 H, anomère), 4,54 (s, 1 H anomère., -O-CH(OH)-), 6,59 (d, 2 H, arom.), 7,01 (d, 2H, arom.).
SEC MALLS: Mw= 8,09 x 105g.mol-1
DS (1H NMR): 1,1 %
c) Préparation d’un dérivé tyramine HA avec un espaceur C6 (Mw≈ 1,5 x 106g.mol-1, DS ≈ 0,5 %)
Du dérivé aldéhydique HA (Mw≈ 1,5 x 106g.mol-1, DS ≈ 0,5 %) (5,00 g) a été dissous dans 500 ml d’eau déminéralisée. Le pH de la solution a été ajusté à 3 à l’aide de l’acide acétique. Du 6-amino-N-[2-(hydroxyphényl)éthyle]hexanamide (produit intermédiaire de (I)) (0,625 g, 2,5 mmol) a été ajouté à la solution HA-CHO. Le mélange a été remué pendant 2 heures à la température ambiante. Ensuite, du complexe de picoline-borane (0,270 g, 2,5 mmol) a été ajouté au mélange de réaction. Le mélange a été remué pendant 12 heures de plus à la température ambiante. Le produit a été purifié par ultrafiltration et isolé du rétentat par précipitation par propane-2-ol. Le précipité a été débarrassé de l’humidité et du propane-2-ol résiduel par séchage en sécheur à air chaud (40 °C, 3 jours).
IR (KBr): 3425, 2893, 2148, 1660, 1620, 1549, 1412, 1378, 1323, 1236, 1204, 1154, 1078, 1038, 945, 893 cm-1.
1 H NMR(D2O) δ: 1,25 (t, 2 H, acides γ-CH2-aminohexanoïques), 1,48 (m, 2 H, acides δ-CH2-aminohexanoïques), 1,51 (m, 2 H, acides ß-CH2-aminohexanoïques), 2,01 (s, 3 H, CH3), 2,65 (m, 2 H, Ph-CH2-), 2,73 (m, 2 H, ε-CH2-aminohexanoïque, 3,37 – 3,93 (m, squelette d’hyaluronane), 4,46 (s, 1 H, anomère), 4,54 (s, 1 H anomère., -O-CH(OH)-), 6,59 (d, 2 H, arom.), 7,01 (d, 2H, arom.).
SEC MALLS: Mw= 5 x 104g.mol-1
DS (1H NMR): 10 %
Exemple 2
Préparation d’hydrogels à base du dérivé hydroxyphényle HA-TA à une concentration de 20 mg/ml
Les hydrogels ont été préparés par mélange de deux précurseurs en solution A et B, pour la préparation desquelles une solution aqueuse de NaCl (9g/l) a été utilisée. Un dérivé hydroxyphényle HA-TA (Mw= 2,78 x 105g.mol-1, DS 2,1 %) a été utilisé pour la préparation des précurseurs en solution. La composition des solutions est présentée dans la table suivante (Table 1).
| Solution A HRP…………………………0,48 U/ml HA-TA………………….…...20 mg/ml NaCl…………………………9 g/l |
Solution B H2O2………………………2,0 mmol/l HA-TA………………….…20 mg/ml NaCl……………………….9 g/l |
Table 1: Composition des précurseurs en solution pour la préparation d’hydrogels à base d’un dérivé hydroxyphényle HA-TA à une concentration de 20 mg/ml
Les hydrogels à une composition finale, présentée dans la table suivante (Table 2), ont été préparés par mélange des solutions A et B en proportion 1:1, où crossHA-TA est un dérivé hydroxyphényle d’hyaluronane réticulé de manière covalente.
| Composition des hydrogels HRP…………………………0,24 U/ml crossHA-TA……………..…20 mg/ml NaCl…………………………9 g/l |
Exemple 3
Préparation d’hydrogels, contenant du ChS à une concentration de 0,5 mg/ml
Les hydrogels ont été préparés par mélange de deux précurseurs en solution A et B, pour la préparation desquelles une solution aqueuse de NaCl (9g/l) a été utilisée. Un dérivé hydroxyphényle HA-TA (Mw= 2,78 x 105g.mol-1, DS 2,1 %) et ChS (Mw= 10 x 103– 40 x 103g.mol-1) a été utilisé pour la préparation des précurseurs en solution. La composition des solutions est présentée dans la table suivante (Table 3).
| Solution A HRP…………………………0,48 U/ml HA-TA……………………....20 mg/ml ChS………………………….0,5 mg/ml NaCl…………………………9 g/l |
Solution B H2O2………………………2,0 mmol/l HA-TA…………….………20 mg/ml ChS………………………..0,5 mg/ml NaCl……………………….9 g/l |
Table 3: Composition des précurseurs en solution pour la préparation d’hydrogels contenant du ChS à une concentration de 0,5 mg/ml
Les hydrogels à une composition finale, présentée dans la table suivante (Table 4), ont été préparés par mélange des solutions A et B en proportion 1:1, où crossHA-TA est un dérivé hydroxyphényle d’hyaluronane réticulé de manière covalente.
| Composition des hydrogels HRP…………………………0,24 U/ml crossHA-TA……………..…20 mg/ml ChS………………………….0,5 mg/ml NaCl…………………………9 g/l |
Table 4: Composition finale des hydrogels, contenant du ChS à une concentration de 0,5 mg/ml
Exemple 4
Préparation d’hydrogels, contenant du ChS à une concentration de 3,3 mg/ml
Les hydrogels ont été préparés par mélange de deux précurseurs en solution A et B, pour la préparation desquelles une solution aqueuse de NaCl (9g/l) a été utilisée. Un dérivé hydroxyphényle HA-TA (Mw= 2,78 x 105g.mol-1, DS 2,1 %) et ChS (Mw= 10 x 103– 40 x 103g.mol-1) a été utilisé pour la préparation des précurseurs en solution. La composition des solutions est présentée dans la table suivante (Table 5).
| Solution A HRP…………………………0,48 U/ml HA-TA……………………...20 mg/ml ChS………………………….3,3 mg/ml NaCl…………………………9 g/l |
Solution B H2O2………………………2,0 mmol/l HA-TA……………………20 mg/ml ChS……………………....3,3 mg/ml NaCl……………………….9 g/l |
Table 5: Composition des précurseurs en solution pour la préparation d’hydrogels contenant du ChS à une concentration de 3,3 mg/ml
Les hydrogels à une composition finale, présentée dans la table suivante (Table 6), ont été préparés par mélange des solutions A et B en proportion 1:1, où crossHA-TA est un dérivé hydroxyphényle d’hyaluronane réticulé de manière covalente.
| Composition des hydrogels HRP…………………………0,24 U/ml crossHA-TA………..………20 mg/ml ChS………………………….3,3 mg/ml NaCl…………………………9 g/l |
Table 6: Composition finale des hydrogels, contenant du ChS à une concentration de 3,3 mg/ml
Exemple 5
Préparation d’hydrogels, contenant du ChS à une concentration de 10 mg/ml
Les hydrogels ont été préparés par mélange de deux précurseurs en solution A et B, pour la préparation desquelles une solution aqueuse de NaCl (9g/l) a été utilisée. Un dérivé hydroxyphényle HA-TA (Mw= 2,78 x 105g.mol-1, DS 2,1 %) et ChS (Mw= 10 x 103– 40 x 103g.mol-1) a été utilisé pour la préparation des précurseurs en solution. La composition des solutions est présentée dans la table suivante (Table 7).
| Solution A HRP…………………………0,48 U/ml HA-TA……………….……...20 mg/ml ChS………………………….10 mg/ml NaCl…………………………9 g/l |
Solution B H2O2………………………2,0 mmol/l HA-TA…………….………20 mg/ml ChS………………………..10 mg/ml NaCl……………………….9 g/l |
Table 7: Composition des précurseurs en solution pour la préparation d’hydrogels contenant du ChS à une concentration de 10 mg/ml
Les hydrogels à une composition finale, présentée dans la table suivante (Table 8), ont été préparés par mélange des solutions A et B en proportion 1:1, où crossHA-TA est un dérivé hydroxyphényle d’hyaluronane réticulé de manière covalente.
| Composition des hydrogels HRP…………………………0,24 U/ml crossHA-TA……..…………20 mg/ml ChS………………………….10 mg/ml NaCl…………………………9 g/l |
Table 8: Composition finale des hydrogels, contenant du ChS à une concentration de 10 mg/ml
Exemple 6
Préparation des hydrogels, contenant du ChS à une concentration de 50 mg/ml
Les hydrogels ont été préparés par mélange de deux précurseurs en solution A et B, pour la préparation desquelles il a été utilisé une solution aqueuse de NaCl (9g/l). Un dérivé hydroxyphényle HA-TA (Mw= 2,78 x 105g.mol-1, DS 2,1 %) et ChS (Mw= 10 x 103– 40 x 103g.mol-1) a été utilisé pour la préparation des précurseurs en solution. La composition des solutions est présentée dans la table suivante (Table 9).
| Solution A HRP…………………………0,48 U/ml HA-TA……………….……...20 mg/ml ChS………………………….50 mg/ml NaCl…………………………9 g/l |
Solution B H2O2……………….………2,0 mmol/l HA-TA……………..………20 mg/ml ChS………………………..50 mg/ml NaCl……………………….9 g/l |
Table 9: Composition des précurseurs en solution pour la préparation d’hydrogels contenant du ChS à une concentration de 50 mg/ml
Les hydrogels à une composition finale, présentée dans la table suivante (Table 10), ont été préparés par mélange des solutions A et B en proportion 1:1, où crossHA-TA est un dérivé hydroxyphényle d’hyaluronane réticulé de manière covalente.
| Composition des hydrogels HRP…………………………0,24 U/ml crossHA-TA…………..……20 mg/ml ChS………………………….50 mg/ml NaCl…………………………9 g/l |
Table 10: Composition finale des hydrogels, contenant du ChS à une concentration de 50 mg/ml
Exemple 7
Préparations des hydrogels, contenant de l’HA à une concentration de 5 mg/ml
La préparation d’hydrogels, contenant de l’acide hyaluronique non reticulé, comprenait 3 étapes de base.
1) Préparation d’un hydrogel, contenant du dérivé réticulé crossHA-TA
L’hydrogel, contenant du dérivé réticulé crossHA-TA, a été préparé par mélange de deux précurseurs en solution A et B, qui avaient été préparés par dissolution des composants individuels dans du tampon phosphate salin (PBS). Un dérivé hydroxyphényle HA-TA (Mw= 8,09 x 105g.mol-1et DS 1,1 %). La composition des solutions est présentée dans la table suivante (Table 11).
| Solution A HRP…………………………12,8 mU/ml HA-TA…………………….....20 mg/ml NaCl……………………….…8 g/l KCl……………………….…..0,2 g/l Na2HPO4.12H2O…….........2,85 g/l KH2PO4……………………...0,2 g/l |
Solution B H2O2…………………....…0,6 mmol/l HA-TA………………….…20 mg/ml NaCl………………….……8 g/l KCl…………………….......0,2 g/l Na2HPO4.12H2O…..…….2,85 g/l KH2PO4…………….….....0,2 g/l |
Table 11 : Composition des précurseurs en solution pour la préparation du dérivé réticulé crossHA-TA
L’hydrogel à la composition présentée dans la table suivante (Table 12), a été préparé par mélange des solutions A a B en proportion 1:1.
| Composition du dérivé reticulé crossHA-TA HRP…………………………0,24 U/ml crossHA-TA……………..…20 mg/ml NaCl…………………………8 g/l KCl…………………………..0,2 g/l Na2HPO4.12H2O………......2,85 g/l KH2PO4…………………......0,2 g/l |
Table 12: Composition du dérivé réticulé crossHA-TA
2) Préparation d’une solution d’hyaluronane
La solution HA à une concentration de 5 mg/ml a été préparée par dissolution d’hyaluronane natif (Mw= 1,91 x 106g.mol-1dans du PBS)
3) Préparation d’un dérivé d’hyaluronane
L’hydrogel final a été préparé par mélange d’un dérivé réticulé crossHA-TA et d’une solution en proportion 1:1 avec une homogénéisation suivante du mélange. La composition finale du matériau est présentée dans la table suivante (Table 13).
| Composition finale HRP…………………………0,12 U/ml crossHA-TA…...…………...10 mg/ml HA…………..…………….…5 mg/ml NaCl…………………………8 g/l KCl…………………….……..0,2 g/l Na2HPO4.12H2O…………...2,85 g/l KH2PO4……………………...0,2 g/l |
Table 13: Composition finale de l’hydrogel contenant de l’HA à une concentration de 5 mg/ml
Exemple 8
Préparations d’hydrogels contenant de l’HA à une concentration de 20 mg/ml
La préparation d’hydrogels contenant de l’acide hyaluronique non réticulé comprenait 3 étapes de base:
1) Préparation d’un hydrogel contenant du dérivé crossHA-TA réticulé
L’hydrogel contenant du dérivé réticulé crossHA-TA a été préparé par mélange de deux précurseurs en solution A et B, qui avaient été préparés par dissolution des composants individuels dans du tampon phosphate salin (PBS). Un dérivé hydroxyphényle HA-TA (Mw= 8,09 x 105g.mol-1et DS 1,1 %) a été utilisé pour la préparation des précurseurs en solution. La composition des solutions est présentée dans la table suivante (Table 14).
| Solution A HRP…………………………12,8 mU/ml HA-TA……………………....20 mg/ml NaCl…………………………8 g/l KCl…………………………..0,2 g/l Na2HPO4.12H2O…………..2,85 g/l KH2PO4………………….....0,2 g/l |
Solution B H2O2………………………0,6 mmol/l HA-TA……………………20 mg/ml NaCl………………………8 g/l KCl………………………..0,2 g/l Na2HPO4.12H2O…….….2,85 g/l KH2PO4…………………...0,2 g/l |
Table 14 : Composition des précurseurs en solution pour la préparation du dérivé réticulé crossHA-TA
L’hydrogel à la composition présentée dans la table suivante (Table 15), a été préparé par mélange des solutions A a B en proportion 1:1.
| Composition du dérivé réticulé crossHA-TA HRP…………………………0,24 U/ml crossHA-TA……………..…20 mg/ml NaCl…………………………8 g/l KCl…………………………..0,2 g/l Na2HPO4.12H2O………......2,85 g/l KH2PO4…………………......0,2 g/l |
Table 15: Composition du dérivé réticulé crossHA-TA
2) Préparation d’une solution d’hyaluronane
La solution HA à une concentration de 40 mg/ml a été préparée par dissolution d’hyaluronane natif, Mw= 1,91 x 106g.mol-1, dans du tampon phosphate salin (PBS).
3) Homogénéisation de l’hydrogel et de la solution d’hyaluronane
L’hydrogel final a été préparé par mélange du dérivé réticulé crossHA-TA avec de la solution HA en proportion 1:1 avec une homogénéisation suivante du mélange. La composition finale du matériau est présentée dans la table suivante (Table 16).
| La composition finale HRP…………………………0,12 U/ml crossHA-TA…...……………10 mg/ml HA…………..………………20 mg/ml NaCl…………………………8 g/l KCl…………………………..0,2 g/l Na2HPO4.12H2O………….....2,85 g/l KH2PO4……………………...0,2 g/l |
Table 16 : Composition finale d‘hydrogel contenant de l’HA à une concentration de 20 mg/ml
Exemple 9
Préparation d’hydrogels contenant de l’HA à une concentration de 5 mg/ml et du ChS à une concentration de 5 mg/ml
La préparation d’hydrogels contenant de l’acide hyaluronique non réticulé et du sulfate de chondroïtine comprenait 3 étapes de base:
1) Préparation d’un hydrogel contenant un dérivé réticulé crossHA-TA
L’hydrogel contenant du dérivé réticulé crossHA-TA a été préparé par mélange de deux précurseurs en solution A et B, qui avaient été préparés par dissolution des composants individuels dans du tampon phosphate salin (PBS). Un dérivé hydroxyphényle HA-TA (Mw= 8,09 x 105g.mol-1et DS 1,1 %) a été utilisé pour la préparation des précurseurs en solution. La composition des solutions est présentée dans la table suivante (Table 17).
| Solution A HRP…………………………12,8 mU/ml HA-TA……………………....20 mg/ml NaCl…………………………8 g/l KCl…………………………..0,2 g/l Na2HPO4.12H2O………......2,85 g/l KH2PO4……………………...0,2 g/l |
Solution B H2O2………………...……0,6 mmol/l HA-TA……………………20 mg/ml NaCl………………………8 g/l KCl………………………..0,2 g/l Na2HPO4.12H2O…….….2,85 g/l KH2PO4…………………...0,2 g/l |
Table 17 : Composition des précurseurs en solution pour la préparation du dérivé réticulé crossHA-TA
L’hydrogel à la composition présentée dans la table suivante (Table 18), a été préparé par mélange des solutions A a B en proportion 1:1.
| Composition du dérivé reticulé crossHA-TA HRP…………………………0,24 U/ml crossHA-TA……………..…20 mg/ml NaCl…………………………8 g/l KCl…………………………..0,2 g/l Na2HPO4.12H2O………......2,85 g/l KH2PO4………………….....0,2 g/l |
Table 18: Composition du dérivé réticulé crossHA-TA
2) Préparation d’une solution comprenant de l’hyaluronane et du sulfate de chondroïtine
La solution HA à une concentration de 5 mg/ml et le ChS à une concentration de 10 mg/ml a été préparée par dissolution d’hyaluronane natif (Mw= 1,91 x 106g.mol-1dans du PBS) et de sulfate de chondroïtine (Mw= 10 x 103– 40 x 103g.mol-1dans du tampon salin de phosphate (PBS))
3) Homogénéisation de l’hydrogel et de la solution contenant de l’hyaluronane et du sulfate de chondroïtine
L’hydrogel final a été préparé par mélange du dérivé réticulé crossHA-TA avec de la solution HA et ChS en proportion 1:1 avec une homogénéisation suivante du mélange. La composition finale du matériau est présentée dans la table suivante (Table 19).
| Composition finale HRP…………………….……0,12 U/ml crossHA-TA…...……………10 mg/ml HA…………..……………..…5 mg/ml ChS…………..………….…...5 mg/ml NaCl…………………….……8 g/l KCl……………………….…..0,2 g/l Na2HPO4.12H2O……….......2,85 g/l KH2PO4……………………...0,2 g/l |
Table 19: Composition finale de l’hydrogel, HA à une concentration de 5 mg/ml et ChS à une concentration de 5 mg/ml
Exemple 10
Préparation d’hydrogels contenant de l’HA à une concentration de 5 mg/ml et du ChS à une concentration de 10 mg/ml
La préparation d’hydrogels contenant de l’acide hyaluronique non réticulé et du sulfate de chondroïtine comprenait 3 étapes de base:
1) Préparation d’un hydrogel contenant un dérivé réticulé crossHA-TA
L’hydrogel contenant du dérivé réticulé crossHA-TA a été préparé par mélange de deux précurseurs en solution A et B, qui avaient été préparés par dissolution des composants individuels dans du tampon phosphate salin (PBS). Un dérivé hydroxyphényle HA-TA (Mw= 8,09 x 105g.mol-1et DS 1,1 %) a été utilisé pour la préparation des précurseurs en solution. La composition des solutions est présentée dans la table suivante (Table 20).
| Solution A HRP…………………………12,8 mU/ml HA-TA……………………....20 mg/ml NaCl…………………………8 g/l KCl…………………………..0,2 g/l Na2HPO4.12H2O ……….....2,85 g/l KH2PO4……………………...0,2 g/l | Solution B H2O2………………………0,6 mmol/l HA-TA……………………20 mg/ml NaCl………………………8 g/l KCl………………………..0,2 g/l Na2HPO4.12H2O ……….2,85 g/l KH2PO4…………………...0,2 g/l |
Table 20 : Composition des précurseurs en solution pour la préparation du dérivé réticulé crossHA-TA
L’hydrogel à la composition présentée dans la table suivante (Table 21), a été préparé par mélange des solutions A a B en proportion 1:1.
| Composition du dérivé réticulé crossHA-TA HRP…………………………0,24 U/ml crossHA-TA……………..…20 mg/ml NaCl…………………………8 g/l KCl…………………………..0,2 g/l Na2HPO4.12H2O………......2,85 g/l KH2PO4……………………...0,2 g/l |
Table 21: Composition du dérivé réticulé crossHA-TA
2) Préparation d’une solution comprenant de l’hyaluronane et du sulfate de chondroïtine
La solution HA à une concentration de 10 mg/ml et ChS à une concentration de 20 mg/ml a été préparée par dissolution d’hyaluronane natif (Mw= 1,91 x 106g.mol-1dans du PBS) et de sulfate de chondroïtine (Mw= 10 x 103– 40 x 103g.mol-1dans du tampon salin de phosphate (PBS)).
3) Homogénéisation de l’hydrogel et de la solution contenant de l’hyaluronane et du sulfate de chondroïtine
L’hydrogel final a été préparé par mélange du dérivé réticulé crossHA-TA avec de la solution HA et ChS en proportion 1:1 avec une homogénéisation suivante du mélange. La composition finale du matériau est présentée dans la table suivante (Table 22).
| Composition finale HRP……………………….…0,12 U/ml crossHA-TA…...……………10 mg/ml HA…………..……………..…5 mg/ml ChS…………..……………...10 mg/ml NaCl…………………………8 g/l KCl…………………………..0,2 g/l Na2HPO4.12H2O………......2,85 g/l KH2PO4……………………...0,2 g/l |
Table 22 : Composition finale de l’hydrogel, HA à une concentration de 5 mg/ml et ChS à une concentration de 5 mg/ml
Exemple 11
Préparation d’hydrogels à base d’un dérivé hydroxyphényle HA-TA à une concentration de 5 mg/ml
Les hydrogels ont été préparés par mélange de deux précurseurs en solution A et B, pour la préparation desquels une solution aqueuse de NaCl (9 g/l) a été utilisée. Un dérivé hydroxyphényle HA-TA (Mw= 1,5 x 106g.mol-1, DS = 0,5%) a été utilisé pour la préparation des précurseurs en solution. La composition des solutions est présentée dans la table suivante (Table 23).
| Solution A HRP…………………………0,12 U/ml HA-TA……………………...5 mg/ml NaCl…………………………9 g/l |
Solution B H2O2………………………0,5 mmol/l HA-TA……………………5 mg/ml NaCl……………………….9 g/l |
Table 23: Composition des précurseurs en solution pour la préparation des hydrogels à base d’un dérivé hydroxyphényle HA-TA à une concentration de 5 mg/ml
Les hydrogels à la composition finale, présentée dans la table suivante (Table 24), ont été préparés par mélange des solutions A et B en proportion 1:1, où crossHA-TA est un dérivé hydroxyphényle d’hyaluronane réticulé de manière covalente.
| Composition des hydrogels HRP…………………………0,06 U/ml crossHA-TA………………...5 mg/ml NaCl…………………………9 g/l |
Table 24: Composition finales des hydrogels à base d’un dérivé hydroxyphényle HA-TA à une concentration de 5 mg/ml
Exemple 12
Préparation des hydrogels à base d’un dérivé hydroxyphényle HA-TA à une concentration de 30 mg/ml
Les hydrogels ont été préparés par mélange de deux précurseurs en solution A et B, pour la préparation desquels une solution aqueuse de NaCl (9 g/l) a été utilisée. Un dérivé hydroxyphényle HA-TA (Mw= 5 x 104g.mol-1, DS = 10%) a été utilisé pour la préparation des précurseurs en solution. La composition des solutions est présentée dans la table suivante (Table 25).
| Solution A HRP…………………………1,2 U/ml HA-TA……………………...30 mg/ml NaCl…………………………9 g/l |
Solution B H2O2………………………5 mmol/l HA-TA……………………30 mg/ml NaCl……………………….9 g/l |
Table 25: Composition des précurseurs en solution pour la préparation des hydrogels à base d’un dérivé hydroxyphényle HA-TA à une concentration de 30 mg/ml
Les hydrogels à la composition finale, présentée dans la table suivante (Table 26), ont été préparés par mélange des solutions A et B en proportion 1:1, où crossHA-TA est un dérivé hydroxyphényle d’hyaluronane réticulé de manière covalente.
| Composition des hydrogels HRP…………………………0,6 U/ml crossHA-TA………………...30 mg/ml NaCl…………………………9 g/l |
Table 26: Composition finale des hydrogels à base d’un dérivé hydroxyphényle HA-TA à une concentration de 30 mg/ml
Exemple 13
Dégradation des solutions HA avec l’ajout du ChS à l’aide de ROS
Pour comparer le taux de dégradation des solutions HA avec du ChS par ROS, des solutions d’hyaluronane dans du tampon salin de phosphate (PBS) ont été préparées avec des concentrations diverses du ChS. De l’acide hyaluronique à une Mw= 1,91 x 106g.mol-1et du ChS à une Mw = 10 x 103– 40 x 103g.mol-1. La solution A contenait 20 mg/ml d’HA, la solution B contenait 20 mg/ml d’HA et 0,5 mg/ml de ChS, la solution C contenait 20 mg/ml d’HA et 1 mg/ml de ChS, la solution D contenait 20 mg/ml d’HA et 3 mg/ml de ChS, la solution E contenait 20 mg/ml d’HA et 5 mg/ml de ChS, la solution F contenait 20 mg/ml d’HA et 20 mg/ml de ChS.
Réalisation de l’expérience de dégradation
Le taux de dégradation était exprimé en pourcentage de diminution de la viscosité des solutions à un taux de cisaillement de 0,1 s- 1par rapport à la valeur initiale. La mesure de diminution de viscosité a été effectuée en utilisant le rhéomètre Kinexus Malvern dans la configuration cone-plate. Un cône d’un diamètre de 40 mm et d’un angle au sommet de 1° a été utilisé. La dégradation du matériau a été effectuée dans des seringues d’un volume de 10 ml, où 0,5 ml d’une solution de CuSO4à une concentration de 0,25 mmol/l et ensuite 0,5 ml d’une solution de H2O2à une concentration de 2,5 mmol/l a été ajouté dans 9 ml du matériau. Durant la dégradation suivante des hydrogels, des échantillons du matériau, dont la viscosité a été mesurée à une température de 25 °C et à un taux de cisaillement de 0,1 s- 1, ont été prélevés dans des intervalles de temps prédéterminés. Le temps total de dégradation était 3 heures.
La illustre une dégradation des chaines de l’hyaluronane, qui est exprimé par la diminution en pourcentage de la viscosité des solutions au cours du temps. La démontre l’influence de la concentration du ChS au taux de dégradation de l’hyaluronane. Le taux de dégradation de l’HA par ROS diminue avec l’augmentation de la concentration du ChS. La viscosité de la solution A, qui ne contenait pas de ChS, a diminué de 97 % en comparaison avec la valeur initiale avant la dégradation, la viscosité de la solution B (avec l’ajout de 0,5 mg/ml de ChS) a diminué de 97 %, la viscosité de la solution C avec l’ajout de 1 mg/ml de ChS a diminué de 84 %, la viscosité de la solution D (20 mg/ml d’HA + 3 mg/ml de ChS) a diminué de 46 %, la viscosité de la solution E (20 mg/ml d’HA + 5 mg/ml de ChS) a diminué de 25 % et la viscosité de la solution E (20 mg/ml d’HA + 20 mg´ml de ChS) a diminué juste de 8 %.
Exemple 14
Dégradation des hydrogels à base d’un dérivé crossHA-TA réticulé par ROS
Pour comparer le taux de dégradation des hydrogels par ROS, 3 types de matériaux ont été préparés.
Le matériau A est une solution d’HA à une concentration de 20 mg/ml, qui a été préparé par dissolution d’HA à une Mwde 1,91 x 106g.mol- 1dans du PBS.
Le matériau B est un mélange de dérivé crossHA-TA réticulé et d’HA non réticulé, qui a été préparé selon l’exemple 7.
Les matériaux C et D se composaient d’HA, de ChS et de crossHA-TA et ils ont été préparés selon les exemples 9 et 10.
Le taux de dégradation a été exprimé comme la diminution en pourcentage de la viscosité des matériaux à un taux de cisaillement de 0,1 s- 1en comparaison avec la valeur initiale.
La mesure de la diminution de la viscosité a été effectuée à l’aide d’un rhéomètre Kinexus Malvern dans la configuration cone-plate. Un cône d’un diamètre de 40 mm et d’un angle au sommet de 1° a été utilisé. La dégradation du matériau a été effectuée dans des seringues d’un volume de 10 ml, où 0,5 ml d’une solution de CuSO4à une concentration de 0,25 mmol/l et ensuite 0,5 ml d’une solution de H2O2à une concentration de 2,5 mmol/l a été ajouté dans 9 ml du matériau. Après de certains temps de dégradation, des échantillons du matériau, dont la viscosité a été mesurée à une température de 25 °C et à un taux de cisaillement de 0,1 s-1, étaient prélevés. Le temps de dégradation total était 3 heures. La le fait clairement ressortir que la présence de ChS dans les hydrogels préparés (C – 5 mg/ml de ChS, D – 10 mg/ml de ChS) augmente leur résistance à l’effet de ROS.
Exemple 15
Dégradation enzymatique des hydrogels à base d’un dérivé crossHA-TA réticulé
Trois types des hydrogels ont été préparés pour la détermination de l’influence du ChS sur le taux de dégradation des hydrogels à base de crossHA-TA par l’effet de l’hyaluronidase bovine testiculaire:
A – hydrogels sans ajout de sulfate de chondroïtine, qui ont été préparés selon le procédé de l’exemple 2
B – hydrogels avec l’ajout de ChS à une concentration de 3,3 mg/ml, qui ont été préparés selon le procédé de l’exemple 4.
C – hydrogels avec l’ajout de ChS à une concentration de 10 mg/ml, qui ont été préparés selon le procédé de l’exemple 5.
Le taux de dégradation a été exprimé en augmentation de la concentration des produits de la dégradation par l’effet de BTH exprimé en pourcentage.
Les hydrogels ont été immergés dans un milieu de dégradation (une solution d’hyaluronidase BTH à une activité de 30 U/mg dans une solution d’albumine du sérum de bovin (BSA) à une concentration de 0,1 mg/ml dans 0,01 mol/l de tampon d’acétate (OP), pH 5,3). La dégradation des hydrogels a été effectuée, en agitant, dans un incubateur à une température de 37 °C. Des échantillons du milieu de dégradation avec les produits de la dégradation des hydrogels étaient prélevés après certains intervalles de temps. La concentration des unités disaccharidiques d’HA dans le milieu de dégradation a été déterminée par spectrophotométrie comme concentration de N-acétylglucosamine. La illustre l’augmentation de la concentration des produits de dégradation des hydrogels dans le milieu au cours du temps. Il ressort de la figure, que la présence de ChS dans les hydrogels à base de crossHA-TA amène à la diminution du taux de dégradation des matériaux par l’effet d’hyaluronidase.
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Claims (5)
- Hydrogel à base d’un dérivé hydroxyphényl réticulé de l’acide hyaluronique, caractérisé en ce qu’il contient des molécules d’un dérivé hydroxyphényl de l’acide hyaluronique (HA-TA) ou du sel pharmaceutiquement acceptable de celui-ci selon la formule générale I
n est dans la plage de 2 à 7500 et où R1est H+ou un ion d’un sel alcalin ou d’un sel alcalino-terreux
et R2est OH ou un substitué tyramine selon la formule générale II:
où dans le cadre d’une molécule du dérivé hydroxyphényl de l’acide hyaluronique ou d’un sel pharmaceutiquement acceptable de celui-ci selon la formule générale I, et où au moins un R2est un substitué tyramine selon la formule générale II et au moins deux substitués tyramine selon la formule générale II sont liés par la liaison covalente dans une quelconque position ortho des groupes phényle,
et de plus contient du sulfate de chondroïtine ou du sel de celui-ci pharmaceutiquement acceptable, sélectionné dans un groupe comprenant des sels alcalins ou des sels alcalino-terreux. - Hydrogel selon la revendication I, caractérisé en ce que les sels alcalins ou les sels alcalino-terreux sont sélectionnés dans un groupe contenant Na+, K+, Ca2+, Mg2+.
- Hydrogel selon la revendication 1 ou 2, caractérisé en ce que la concentration du sulfate de chondroïtine ou du sel pharmaceutiquement acceptable de celui-ci est dans la plage de 0,5 à 50 mg/ml d’hydrogel, de préférence à une concentration de 1 à 20 mg/ml, mieux encore 5 mg/ml.
- Hydrogel selon l’une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que la teneur du dérivé hydroxyphényle réticulé d’hyaluronane est dans la plage de 5 à 30 mg/ml, de préférence 10 mg/ml d’hydrogel.
- Hydrogel selon l’une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisé en ce qu’il contient également de l’acide hyaluronique ou du sel pharmaceutiquement acceptable de celui-ci dans une concentration de 1 à 20 mg/ml d’hydrogel, de préférence de 5 à 10mg/ml, mieux encore 5 mg/ml d’hydrogel.
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