RU2613887C2 - Устойчивый к расщеплению сшитый низкомолекулярный гиалуронат - Google Patents
Устойчивый к расщеплению сшитый низкомолекулярный гиалуронат Download PDFInfo
- Publication number
- RU2613887C2 RU2613887C2 RU2014108821A RU2014108821A RU2613887C2 RU 2613887 C2 RU2613887 C2 RU 2613887C2 RU 2014108821 A RU2014108821 A RU 2014108821A RU 2014108821 A RU2014108821 A RU 2014108821A RU 2613887 C2 RU2613887 C2 RU 2613887C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- sodium hyaluronate
- molecular weight
- crosslinked
- average molecular
- substrate
- Prior art date
Links
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
- C08B—POLYSACCHARIDES; DERIVATIVES THEREOF
- C08B37/00—Preparation of polysaccharides not provided for in groups C08B1/00 - C08B35/00; Derivatives thereof
- C08B37/006—Heteroglycans, i.e. polysaccharides having more than one sugar residue in the main chain in either alternating or less regular sequence; Gellans; Succinoglycans; Arabinogalactans; Tragacanth or gum tragacanth or traganth from Astragalus; Gum Karaya from Sterculia urens; Gum Ghatti from Anogeissus latifolia; Derivatives thereof
- C08B37/0063—Glycosaminoglycans or mucopolysaccharides, e.g. keratan sulfate; Derivatives thereof, e.g. fucoidan
- C08B37/0072—Hyaluronic acid, i.e. HA or hyaluronan; Derivatives thereof, e.g. crosslinked hyaluronic acid (hylan) or hyaluronates
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
- A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
- A61K31/715—Polysaccharides, i.e. having more than five saccharide radicals attached to each other by glycosidic linkages; Derivatives thereof, e.g. ethers, esters
- A61K31/726—Glycosaminoglycans, i.e. mucopolysaccharides
- A61K31/728—Hyaluronic acid
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
- A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
- A61K31/715—Polysaccharides, i.e. having more than five saccharide radicals attached to each other by glycosidic linkages; Derivatives thereof, e.g. ethers, esters
- A61K31/738—Cross-linked polysaccharides
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
- A61K47/30—Macromolecular organic or inorganic compounds, e.g. inorganic polyphosphates
- A61K47/36—Polysaccharides; Derivatives thereof, e.g. gums, starch, alginate, dextrin, hyaluronic acid, chitosan, inulin, agar or pectin
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K8/00—Cosmetics or similar toiletry preparations
- A61K8/02—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by special physical form
- A61K8/04—Dispersions; Emulsions
- A61K8/042—Gels
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K8/00—Cosmetics or similar toiletry preparations
- A61K8/18—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition
- A61K8/72—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition containing organic macromolecular compounds
- A61K8/73—Polysaccharides
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K8/00—Cosmetics or similar toiletry preparations
- A61K8/18—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition
- A61K8/72—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition containing organic macromolecular compounds
- A61K8/73—Polysaccharides
- A61K8/735—Mucopolysaccharides, e.g. hyaluronic acid; Derivatives thereof
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
- A61K9/06—Ointments; Bases therefor; Other semi-solid forms, e.g. creams, sticks, gels
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
- A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
- A61L27/14—Macromolecular materials
- A61L27/20—Polysaccharides
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
- A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
- A61L27/50—Materials characterised by their function or physical properties, e.g. injectable or lubricating compositions, shape-memory materials, surface modified materials
- A61L27/52—Hydrogels or hydrocolloids
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61Q—SPECIFIC USE OF COSMETICS OR SIMILAR TOILETRY PREPARATIONS
- A61Q19/00—Preparations for care of the skin
- A61Q19/08—Anti-ageing preparations
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
- C08J—WORKING-UP; GENERAL PROCESSES OF COMPOUNDING; AFTER-TREATMENT NOT COVERED BY SUBCLASSES C08B, C08C, C08F, C08G or C08H
- C08J3/00—Processes of treating or compounding macromolecular substances
- C08J3/02—Making solutions, dispersions, lattices or gels by other methods than by solution, emulsion or suspension polymerisation techniques
- C08J3/03—Making solutions, dispersions, lattices or gels by other methods than by solution, emulsion or suspension polymerisation techniques in aqueous media
- C08J3/075—Macromolecular gels
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
- C08L—COMPOSITIONS OF MACROMOLECULAR COMPOUNDS
- C08L5/00—Compositions of polysaccharides or of their derivatives not provided for in groups C08L1/00 or C08L3/00
- C08L5/08—Chitin; Chondroitin sulfate; Hyaluronic acid; Derivatives thereof
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
- C08J—WORKING-UP; GENERAL PROCESSES OF COMPOUNDING; AFTER-TREATMENT NOT COVERED BY SUBCLASSES C08B, C08C, C08F, C08G or C08H
- C08J2305/00—Characterised by the use of polysaccharides or of their derivatives not provided for in groups C08J2301/00 or C08J2303/00
- C08J2305/08—Chitin; Chondroitin sulfate; Hyaluronic acid; Derivatives thereof
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Public Health (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Dermatology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Dispersion Chemistry (AREA)
- Polymers & Plastics (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Transplantation (AREA)
- Birds (AREA)
- Oral & Maxillofacial Surgery (AREA)
- Materials Engineering (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Gerontology & Geriatric Medicine (AREA)
- Inorganic Chemistry (AREA)
- Polysaccharides And Polysaccharide Derivatives (AREA)
- Medicinal Preparation (AREA)
- Cosmetics (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
Abstract
Изобретение относится к биоразлагаемому, но устойчивому к расщеплению продукту, а именно к твердому прозрачному гидрогелю сшитой гиалуроновой кислоты, используемому в качестве вязкого вспомогательного наполнителя для применения в биомедицине, фармацевтике и космических средствах, к способу его получения. Гидрогель образован субстратом гиалуроната натрия со средней молекулярной массой от 50000 до 100000 Да, сшитым диглицидиловым эфиром 1,4-бутандиола, который получают способом, включающим взаимодействие 8-40%-ного раствора гиалуроната натрия со средней молекулярной массой от 50000 до 100000 Да в 0,75-1,5%-ном водном растворе гидроксида натрия с количеством диглицидилового эфира 1,4-бутандиола от 180 до 500 молей на моль гиалуроната натрия. Продукт имеет высокую устойчивость к ферментативному расщеплению. 3 н. и 11 з.п. ф-лы, 15 ил., 5 табл., 14 пр.
Description
Область техники, к которой относится изобретение
Настоящее изобретение относится к биоразлагаемому, но устойчивому к расщеплению продукту, полученному модификацией низкомолекулярной гиалуроновой кислоты, для применения в биомедицине, фармацевтике и косметических средствах. Конкретнее, изобретение относится к новому гидрогелю сшитой низкомолекулярной гиалуроновой кислоты с молекулярной массой от 50000 до 100000, более устойчивому к ферментативному расщеплению, чем коммерческие сшитые гиалуронаты, с заявляемой кинетикой длительного биорасщепления и морфологическими характеристиками, которые существенно улучшены по сравнению со сшитыми гиалуронатами, описанными до сих пор.
Указанная низкомолекулярная гиалуроновая кислота, сшитая с помощью сшивающего агента диглицидилового эфира 1,4-бутандиола (BDDE), представляет собой твердый (полутвердый), но вязкоупругий прозрачный гидрогель, который можно легко использовать в качестве вспомогательного вязкого (viscosupplementation) наполнителя в случае лечения болезней суставов или наполнителя в косметических средствах для релаксационной обработки ткани (морщин).
Предпосылки создания изобретения
Гиалуроновая кислота (НА) представляет собой гликозаминогликан, который присутствует в гиалиновом хряще, синовиальной суставной жидкости и в кожных тканях. Конкретнее, НА представляет собой линейный гликозаминогликан, образованный смесью цепей различной длины, состоящих из повторов регулярного дисахарида, образованного звеном гиалуроновой кислоты и звеном N-ацетилглюкозамина, соединенных бета 1-4. Дисахариды соединяются бета 1-3 со средней молекулярной массой до 6 МДа (6×106 Да). Следовательно, каждая цепь в указанной смеси показывает одинаковую повторяющуюся последовательность формулы (А)
причем соответствующий катион обычно представляет собой водород (гиалуроновая кислота) или натрий (гиалуронат натрия).
В тканях функцией гиалуроновой кислоты является, главным образом, поддержание структурной плотности, что допускает одновременные биохимические действия природных продуктов в определенных местах организма. В жидкостях, подобных синовии, действием НА должно быть сохранение должной вязкости путем действия как смазки. Для того чтобы производить такие действия, НА должна быть полностью биосовместимой, включая должное метаболическое равновесие. Природная НА непрерывно разрушается и синтезируется ферментами организма. Такой гомеостаз отклоняется от нормы, когда происходят патологические ситуации, поэтому возрастания катаболизма НА могут привести к широкому ряду эффектов от тяжелой патологии до простых модификаций тканей. Применение НА в виде гиалуроната натрия в качестве наполнителя в косметических средствах или при вязкоупругом замещении при синовите требует, чтобы используемый полимер НА имел усиленные вязкоупругие свойства. Такая реология должна быть сбалансирована с эффективной возможностью получать инъецируемый продукт.
Промышленную гиалуроновую кислоту получают экстрагированием из животных тканей или ферментацией микроорганизмами, и она обычно доступна в виде гиалуроната натрия. Что касается молекулярной массы, то вообще известно, что низкомолекулярная НА представляет собой смесь цепей со средней молекулярной массой ниже 250 кДа (2,5×105 Да). НА используют, обычно в виде гиалуроната натрия, при многих применениях в косметических средствах, офтальмологии, ревматологии и конструировании тканей. В частности, НА со средней молекулярной массой выше 1 МДа используют в качестве вязкого вспомогательного средства при артрозе суставов или при устранении морщин. Высокая молекулярная масса требуется для дополнения суставной жидкости или для заполнения соединительных мертвых пространств кожи благодаря вязкости полученного раствора.
В настоящее время на рынке доступны многие лекарственные средства, основанные на вышеописанной технологии. Они имеют высокую биосовместимость, но подвергаются довольно быстрому расщеплению ферментами организма, в частности, гиалуронидазой, и как следствие, имеют короткое время полужизни.
Уровень техники
Согласно литературе, время полужизни НА повышают путем модификации НА посредством химических взаимодействий, в частности, путем сшивания цепей НА друг с другом с помощью двухвалентных реагентов. Такими двухвалентными реагентами, хорошо известными специалистам в данной области техники, являются обычно би- или полифункциональные эпоксиды, например, низшие алифатические эпоксиды, или соответствующие галогенгидрины или эпигалогенгидрины или галогениды, образующие простые эфирные мостики с молекулами гиалуроновой кислоты. В качестве подходящих примеров можно назвать эпихлоргидрин, дивинилсульфон, диглицидиловый эфир 1,4-бутандиола (BDDE), диглицидиловый эфир 1,2-этилендиола, 1-(2,3-эпоксипропил)-2,3-эпоксициклогексан, КД-диглицидиланилин и эпоксизамещенный пентаэритрит. Другими сшивающими агентами, которые можно использовать, являются реакционноспособные полимеры, такие как, например, декстрин или крахмал, которые вводят во взаимодействие как содержащие, например, простые глицидилэфирные группы, как описано в ЕР 272300 (WO 87/78989), где также раскрывается сшивание с помощью BDDE.
В патенте США №4582865 и в WO 2006/056204 описывается получение сшитой НА, одной или в комбинации с гидрофильными полимерами дивинилсульфона (DVS), образующими 1,2-этиленовые мостики.
Полифункциональные эпоксисоединения описаны в ЕР 0161887. В качестве сшивающих агентов описаны формальдегид (US 4713448), генерирующий метиленовые мостики, и карбодиимиды (US 5017229 и US 6013679), генерирующие карбонильные мостики.
Одностадийный способ сшивания НА двухвалентным эпоксиреагентом и продукт, полученный с использованием высокой концентрации НА, описан в US 2005/0281880. Во всех перечисленных документах описывается применение в качестве исходного материала НА со средней молекулярной массой выше 500 кДа.
Модификация НА химическими взаимодействиями и, в частности, процесс образования сшивок, снижает свойство связывания НА с природными расщепляющими ферментами, в частности, гиалуронидазой. Когда НА сшивается, образуется трехмерная сетка, и свободная энергия полисахаридных цепей уменьшается. Чем меньше молярное отношение НА/применяемый сшивающий реагент, тем выше устойчивость к расщеплению природным ферментом гиалуронидазой. Например, согласно вышеуказанному US 2005/0281880, степень ферментативного расщепления снижается с 60-90% до 10% за счет осуществления способа получения при работе с водными растворами НА концентрации до 20% и молярным отношением НА/сшивающий реагент от 1:1 до 1:2,4.
В US 4716154 раскрывается заменитель жидкой части стекловидного тела, используемый в офтальмологии, состоящий из геля сшитой гиалуроновой кислоты, и также утверждается, что молекулярная масса гиалуроновой кислоты не является критическим фактором для практического осуществления описанного изобретения. Согласно указанному документу, предпочтительны субстраты НА со средней молекулярной массой от 500000 до 3000000 Да, но при этом сообщается, что субстрат сшитой НА имеет среднюю молекулярную массу 20000.
В US 2005/0281880 (Wang) раскрываются способы получения инъецируемых гидрогелей гиалуронана из субстрата гиалуронана со средней молекулярной массой 2,3 МД, причем указанный способ включает стадии сшивания одного или нескольких полимеров и промывки образовавшегося впоследствии геля с последующей очисткой и гомогенизацией для получения инъецируемого гидрогеля. Данный документ конкретно указывает параметры, используемые для получения гидрогеля из гиалуроновой кислоты.
Доступные в настоящее время наполнители для вязкого вспомогательного средства на основе природной, биотехнологической или сшитой гиалуроновой кислоты не имеют вполне удовлетворительную терапевтическую эффективность. Это имеет место не только из-за описанного действия гиалуронидазы, но также из-за полного катаболизма НА, в который вовлечены многие природные факторы. Как следствие, частота введения НА повышается при осуществлении конкретного применения.
Таким образом, существует потребность в продукте для применения в качестве вязкого вспомогательного наполнителя с усиленными способностями сохранять свойства высокой вязкости и меньшей аффинностью к гиалуронидазе, способном, таким образом, к пролонгированию времени полужизни НА, в особенности, в случае ее дермального, интрадермального или интраартикулярного применения, но важно, чтобы продукт сохранял характеристику деполимеризации эндогенными ферментами для того, чтобы избежать токсичности.
Раскрытие изобретения
Принимая во внимание результаты цитированных выше опубликованных ранее исследований, в частности, тот факт, что исходный материал НА для получения сшитых продуктов для применения в качестве вязких вспомогательных наполнителей представляет собой полимеры со средней молекулярной массой выше 500 кДа, т.е. линейные полимерные цепи, насчитывающие минимум 1250 дисахаридов, авторы вычислили, что, принимая во внимание эффективность реакции с использованием сшивающих реагентов 5-10%, статистически каждая цепь должна нести 12 замещений, причем таким образом остается примерно 100-200 непрореагировавших дисахаридов. Таким образом, авторы полагают, что сшитый продукт, исходящий из субстратов НА с уменьшенной длиной цепи, может быть менее склонным к ферментативному расщеплению, в частности, гиалуронидазами. Авторы вычислили, что для сшитого продукта, полученного с использованием НА в 100 кДа, статистическая длина немодифицированной цепи может быть уменьшена до 10-20 дисахаридов, причем в результате появляется потенциальная возможность снижения кинетики расщепления. Можно синтезировать сшитые продукты, которые можно получить из НА со средней массой ниже 50000, но для получения подходящего геля агента BDDE должно быть больше. Принимая во внимание вышеупомянутое вычисление достижимой цепи в 100-200 дисахаридов в случае образца НА в 1000 кДа и 10-20 в случае образца НА в 100 кДа, сшитый продукт с использованием образца НА менее 50 кДа будет приводить к достижимой цепи в 5-10 сахаридов. Это может представлять собой неподходящее соединение для сохранения минимального биорасщепления in vivo.
Однако цель получения сшитой НА с молекулярной массой от 50000 до 100000 сталкивается с проблемой объективного затруднения при получении продукта с морфологическими характеристиками, подходящими для применения людьми в смысле безопасности и сложности процесса.
Действительно, несмотря на ряд публикаций о сшитых низкомолекулярных гиалуронатах, в литературе не раскрываются твердые, но вязкоупругие и прозрачные гидрогели сшитых низкомолекулярных НА из гиалуроната в 50000-100000 Да для использования людьми в качестве вязких вспомогательных наполнителей, используемых также в инъецируемых формах.
Например, в WO 2005/066215 раскрываются растворы гелей на основе полимеров с ультранизкой MW различных НА с ультранизкой MW (<500 кДа), включая раствор НА в 60 кДа, но не описывается какой-либо твердый и прозрачный гель сшитой НА в 60000 Да.
Junji Kim et al. (J. Materials Science: Materials in Medicine, 2008, 19/11, 3311-3318) раскрывают сшитую гиалуроновую кислоту в 50000 Да, полученную из акрилированной НА с использованием полипептида в качестве сшивающего агента, как гидрогель для научных экспериментов, но в работе не описывается какой-либо вязкоупругий, твердый и прозрачный гидрогель недериватизированной сшитой НА в 50000 Да, подходящий в качестве вспомогательного наполнителя.
В GB 2401043 раскрывается получение разлагаемого геля путем сшивания гиалуроновой кислоты вместе с лекарственным средством, включая сшивание НА в 90 кДа, с использованием диглицидилового эфира этиленгликоля в качестве сшивающего агента в присутствии деназола, но не описывается какой-либо вязкоупругий, твердый и прозрачный гидрогель сшитой НА в 90000 Да, подходящий в качестве вспомогательного наполнителя. Напротив, в данном документе подчеркивается разрушение системы именно с точки зрения использования в качестве носителя лекарственного средства.
В WO 2010/029344 раскрывается получение криогеля из гиалуроновой кислоты различной молекулярной массы, включая субстрат в 50000 Да, сшитый 3-глицидоксипропилтриметоксисиланом, и субстрат в 100000 Да, сшитый глицидилметакрилатом, N,N-метиленбисакриламидом и N,N,N',N'-тетраметилендиамином, с использованием классического способа, используемого для получения полиакриламидного геля для электрофореза, но в указанном документе не раскрывается какой-либо вязкоупругий, твердый и прозрачный гидрогель сшитой НА в 50000 Да или 100000 Да. Напротив, полученный продукт представляет собой пористый криогель.
В WO 90/09401 раскрывается способ сшивания гиалуроновой кислоты путем обработки раствора гиалуроновой кислоты с использованием фосфорсодержащего реагента и получения гиалуроната натрия в 100000 Да, сшитого POCl3, т.е. потенциально взрывоопасным агентом, но в документе не описывается какой-либо вязкоупругий, твердый и прозрачный гидрогель сшитой НА в 100000 Да, подходящий в качестве вспомогательного наполнителя, поскольку полученный продукт представляет собой опалесцирующий хрупкий гель. Согласно данному документу, гели, полученные по вышеуказанному ЕР 272300, раскрывающему сшивание с помощью BDDE, нельзя получить в инъецируемой форме.
Применяя способ по вышеуказанному US 2005/0218880, т.е. взаимодействие гиалуроната натрия (Na-HA) с BDDE в условиях, описанных в данном документе, гидрогель не получают, поскольку сшитый продукт не образуется, или образовавшийся продукт возможно остается в растворе.
Фактически в литературе не раскрываются вязкоупругие полутвердые и прозрачные гидрогели сшитой низкомолекулярной (50000-100000 кДа) гиалуроновой кислоты.
Теперь обнаружено, что путем применения реакции сшивания к низкомолекулярному гиалуронату натрия, но не очень низкомолекулярному гиалуронату натрия, с тем, чтобы пролонгировать время полужизни соединения, избегая токсичности, в частности, путем использования субстрата гиалуроната натрия со средней молекулярной массой от 50000 Да до 100000 Да, с использованием диглицидилового эфира 1,4-бутандиола (BDDE) в качестве сшивающего агента в определенных условиях, получают вязкоупругий полутвердый и прозрачный гидрогель сшитого гиалуроната натрия, который весьма устойчив к расщеплению бактериальной гиалуронидазой.
Действительно, обнаружено, что выполняя реакцию сшивания в определенных условиях, т.е. с использованием субстрата гиалуроната натрия со средней молекулярной массой 100000 Да в 1% растворе гидроксида натрия при концентрации от 18 до 22% и сшивающего агента при молярном отношении HA-Na/сшивающий агент от 1:55 до 1:60, можно получить гидрогель для использования для вязкого вспомогательного средства, имеющего устойчивость к расщеплению гиалуронидазой значительно большую, чем устойчивость высокомолекулярного сшитого гиалуроната натрия, причем таким образом подтверждается гипотеза, которую авторы изобретения излагают в разделе «Предпосылки создания изобретения». Кроме того, обнаружено, что можно получить вязкоупругие полутвердые и прозрачные гидрогели низкомолекулярных сшитых гиалуронатов взаимодействием 8-40% раствора гиалуроната натрия со средней молекулярной массой от 50000 до 100000 Да в 0,75-1,5% водном растворе гидроксида натрия с количеством диглицидилового эфира 1,4-бутандиола, соответствующим от 180 до 500 молей на моль гиалуроната натрия.
Неожиданно обнаружено, что полученные таким образом сшитые BDDE НА от 50000 до 100000 Да не являются ноздреватыми или какими-либо пористыми, как описанные в литературе, в частности, как соответствующие сшитому BDDE нативному гиалуронану, описанному G.D. Prestwich в обзоре «Biomaterials from Chemically-Modified Hyaluronan», Glycoforum.gr.jp/science/hyaluronan/HA18/HA18E.html, а являются вязкоупругими полутвердыми и прозрачными продуктами, которые, в частности, адаптируются как вязкие вспомогательные наполнители.
Краткое описание чертежей
Фиг. 1 иллюстрирует кинетику ферментативного расщепления сшитого гиалуроната натрия в 1000 кДа из примера получения 1 в сравнении с кинетикой расщепления нативного гиалуроната натрия.
Фиг. 2 иллюстрирует кинетику ферментативного расщепления сшитого гиалуроната натрия в 100 кДа из примера 1 в сравнении с кинетикой расщепления нативного гиалуроната натрия в 1000 кДа и нативного гиалуроната натрия в 100 кДа.
Фиг. 3 иллюстрирует кинетику ферментативного расщепления сшитого гиалуроната натрия в 100 кДа из примера 1 в сравнении с кинетикой расщепления коммерческого сшитого гиалуроната натрия.
Фиг. 4 иллюстрирует кинетику ферментативного расщепления нативного гиалуроната натрия в 100 кДа и сшитого гиалуроната натрия в 100 кДа из примеров 1-3.
Фиг. 5 иллюстрирует кинетику ферментативного расщепления нативного гиалуроната натрия в 50 кДа и сшитого гиалуроната натрия в 50 кДа из примеров 5-6 и сшитого гиалуроната натрия в 100 кДа из примера 1.
Фиг. 6 иллюстрирует профиль GPC-ВЭЖХ гиалуроновой кислоты с молекулярной массой 1000 кДа, деполимеризованной гиалуронидазой млекопитающего после реакции в течение 7 часов. На хроматограмме указаны сигналы до дека - (14,09 мин), гекса - (15,22 мин) и тетрасахаридов (15,68).
Фиг. 7 иллюстрирует профиль GPC-ВЭЖХ коммерческого сшитого продукта (Durolane), деполимеризованного гиалуронидазой млекопитающего после реакции в течение 7 часов. На хроматограмме указаны сигналы высокомолекулярных олигомеров свыше и ниже 25000 Да (10,46 мин и 11,24 мин, соответственно) и сигналы додека - (14,09 мин), окта - (14,84 мин), гекса - (15,22 мин) и тетрасахаридов (15,69).
Фиг. 8 иллюстрирует профиль GPC-ВЭЖХ сшитой гиалуроновой кислоты с молекулярной массой 1000 кДа, деполимеризованной гиалуронидазой млекопитающего после реакции в течение 7 часов. На хроматограмме указаны сигналы дека - (14,17 мин), окта - (14,80 мин), гекса - (15,22 мин) и тетрасахаридов (15,88 мин).
Фиг. 9 иллюстрирует профиль GPC-ВЭЖХ сшитой гиалуроновой кислоты с молекулярной массой 100 кДа, деполимеризованной гиалуронидазой млекопитающего после реакции в течение 7 часов. На хроматограмме указаны сигналы тетрасахаридов (15,88 мин).
Фиг. 10 иллюстрирует профиль GPC-ВЭЖХ гиалуроновой кислоты с молекулярной массой 1000 кДа, деполимеризованной гиалуронидазой млекопитающего после реакции в течение 48 часов. На хроматограмме указаны сигналы окта - (14,90 мин), гекса - (15,22 мин) и тетрасахаридов (15,66 мин).
Фиг. 11 иллюстрирует профиль GPC-ВЭЖХ коммерческого сшитого продукта (Durolane), деполимеризованного гиалуронидазой млекопитающего после реакции в течение 48 часов. На хроматограмме указаны сигналы окта - (14,91 мин), гекса - (15,21 мин) и тетрасахаридов (15,66).
Фиг. 12 иллюстрирует профиль GPC-ВЭЖХ сшитой гиалуроновой кислоты с молекулярной массой 1000 кДа, деполимеризованной гиалуронидазой млекопитающего после реакции в течение 48 часов. На хроматограмме указаны сигналы дека - (14,42 мин), окта - (14,81 мин), гекса - (15,18 мин) и тетрасахаридов (15,65 мин).
Фиг. 13 иллюстрирует профиль GPC-ВЭЖХ сшитой гиалуроновой кислоты с молекулярной массой 100 кДа, обработанной гиалуронидазой млекопитающего, после реакции в течение 48 часов. На хроматограмме указаны сигналы окта - (14,93 мин), гекса -(15,18 мин) и тетрасахаридов (15,65 мин).
Фиг. 14 показывает прозрачный твердый гидрогель примера 1.
Фиг. 15 показывает прозрачный твердый гидрогель примера 4.
Осуществление изобретения
Таким образом, настоящее изобретение относится к новому вязкоупругому твердому и прозрачному сшитому гиалуронату натрия, образованному субстратом гиалуроната натрия со средней молекулярной массой от 50000 до 100000 Да, сшитым BDDE.
Сшитый BDDE низкомолекулярный гиалуронат натрия получают взаимодействием субстрата гиалуроната натрия со средней молекулярной массой от 50000 Да до 100000 Да и диглицидилового эфира 1,4-бутандиола в молярном отношении от 1/180 до 1/500 в водном растворе гидроксида натрия. Реакцию сшивания выполняют взаимодействием 8-40% раствора гиалуроната натрия со средней молекулярной массой от 50000 до 100000 в 0,75-1,5% водном растворе гидроксида натрия с количеством сшивающего агента от 180 до 500 молей на моль гиалуроната натрия.
Таким образом, целью настоящего изобретения является вязкоупругий твердый и прозрачный низкомолекулярный гиалуронат, получаемый способом, который включает взаимодействие 8-40% раствора гиалуроната натрия со средней молекулярной массой от 50000 до 100000 Да в 0,75-1,5% водном растворе гидроксида натрия с количеством диглицидилового эфира 1,4-бутандиола от 180 до 500 молей на моль гиалуроната натрия.
Согласно частному воплощению способ, дающий сшитые гиалуронаты по настоящему изобретению, осуществляют в вышеуказанных условиях, исходя из гиалуроната натрия со средней молекулярной массой от 50000 до 100000 Да, при температуре от 45 до 60°C в течение периода времени от 3 до 8 часов.
Также целью настоящего изобретения является способ получения вязкоупругого твердого и прозрачного сшитого низкомолекулярного гиалуроната натрия, который включает взаимодействие 8-40% раствора гиалуроната натрия со средней молекулярной массой от 50000 до 100000 Да в 0,75-1,5% водном растворе гидроксида натрия с количеством диглицидилового эфира 1,4-бутандиола, соответствующим 180 - 500 молям на моль субстрата гиалуроната натрия, при температуре от 45 до 60°C в течение периода времени от 3 до 8 часов.
Однако вязкоупругий твердый и прозрачный гидрогель сшитой НА (гиалуроната) также можно получить из субстрата гиалуроната натрия со средней молекулярной массой 100000 Да при работе в более широком интервале условий, в частности, используя более широкий интервал отношения сшивающий агент/НА. Действительно, такой гидрогель также можно получить взаимодействием 8-40% раствора гиалуроната натрия со средней молекулярной массой 100000 Да в 0,75%-1,5% водном растворе гидроксида натрия с количеством диглицидилового эфира 1,4-бутандиола, соответствующим 55 - 500 молям на моль субстрата гиалуроната натрия, при температуре от 42 до 60°C в течение периода времени от 3 до 8 часов.
Согласно предпочтительному воплощению гиалуронат натрия со средней молекулярной массой 100000 Да растворяют в концентрациях от 18 до 22% в 0,75-1,25% водном растворе гидроксида натрия, к полученному раствору добавляют в качестве сшивающего агента диглицидиловый эфир 1,4-бутандиола в молярном количестве от 55 до 60 молей сшивающего агента на моль гиалуроната натрия, и раствор греют при 45-55°C в течение 4-6 часов.
По окончании взаимодействия гидрогель сшитого BDDE гиалуроната натрия, полученный таким образом, очищают от непрореагировавших реагентов и от солей известными процедурами промывки, в частности, с использованием фосфатного буфера и воды, и извлекают в виде полутвердого вязкоупругого прозрачного гидрогеля.
Согласно другому воплощению гиалуронат натрия со средней молекулярной массой 100000 Да растворяют в концентрациях от 18 до 22% в 0,75-1,25% водном растворе гидроксида натрия, к полученному раствору добавляют в качестве сшивающего агента диглицидиловый эфир 1,4-бутандиола в молярном количестве от 55 до 60 молей сшивающего агента на моль гиалуроната натрия, и раствор греют при 42-55°C в течение 4-6 часов.
Таким образом, настоящее изобретение также относится к способу получения вязкоупругого полутвердого и прозрачного сшитого гиалуроната, который включает взаимодействие 18-22% раствора гиалуроната натрия со средней молекулярной массой 100000 Да в 0,75-1,25% водном растворе гидроксида натрия с диглицидиловым эфиром 1,4-бутандиола в молярном количестве от 55 до 65 молей на моль гиалуроната натрия при температуре 42-55°C в течение периода времени от 4 до 6 часов.
Сшитые НА по настоящему изобретению можно использовать в качестве вязких вспомогательных наполнителей в случае лечения болезней суставов или в качестве наполнителя для релаксационной обработки тканей (морщины). Для такого применения очищенный таким образом гидрогель сшитого низкомолекулярного гиалуроната натрия может быть тонко измельчен, стерилизован и представлен в стандартной форме, такой как шприц.
Таким образом, настоящее изобретение также относится к вязкому вспомогательному наполнителю, включающему гидрогель сшитого гиалуроната натрия, который можно получить взаимодействием гиалуроната натрия со средней молекулярной массой 100000 Да, растворенного в концентрации от 18 до 22% в 0,75-1,25% водном растворе гидроксида натрия, с диглицидиловым эфиром 1,4-бутандиола (BDDE) в молярном количестве от 55 до 65 молей на моль гиалуроната натрия при 42-55°C, предпочтительно, при 45-55°C, в течение 4-6 часов, очищенный и необязательно измельченный и стерилизованный.
Использование сшитых НА по изобретению для применения в биомедицине, фармацевтике и косметических средствах составляет еще один аспект изобретения. Применение сшитого НА по изобретению в качестве вязкого вспомогательного наполнителя составляет еще один аспект изобретения.
Согласно одному из своих аспектов изобретение относится к фармацевтической композиции, содержащей сшитые НА, раскрытые и заявленные в данном случае.
Согласно другому своему аспекту изобретение относится к косметической композиции, содержащей сшитые НА, раскрытые и заявленные в данном случае.
Изобретение иллюстрируют приведенные далее примеры.
Пример получения 1 (пример для сравнения)
Порошок гиалуроната натрия со средней молекулярной массой 1000 кДа (Shiseido) в количестве 1 г растворяют в 4,5 мл 1% раствора NaOH (11 мас.% раствор в 0,25 М растворе NaOH). Раствор выдерживают при комнатной температуре в течение 4 часов при перемешивании и затем сшивают при 50°C в течение 5 часов в присутствии 60 мкл диглицидилового эфира бутандиола (BDDE). Сшитый гиалуронат натрия оставляют в 0,067 М фосфатном буфере, pH 7,4, и затем промывают три раза тем же буфером и три раза водой. Таким образом, получают полутвердый прозрачный гидрогель, состоящий из сшитого гиалуроната натрия в 1000 кДа.
Получение эталона А
Раствор нативного НА в 1000 кДа
Гиалуронат натрия со средней молекулярной массой 1000 кДа, используемый в качестве субстрата в препаративном примере 1, в количестве 10 мг растворяют в 10 мл 0,2 М ацетатного буфера, pH 5,6, содержащего 140 мМ NaCl, и оставляют для гидратации на ночь при комнатной температуре.
Получение эталона В
Раствор нативного НА в 100 кДа
Гиалуронат натрия со средней молекулярной массой 100 кДа (Shiseido) в количестве 10 мг растворяют в 10 мл 0,2 М ацетатного буфера, рН 5,6, содержащего 140 мМ NaCl, и оставляют для гидратации на ночь при комнатной температуре.
Получение эталона С
Раствор нативного НА в 50 кДа
Гиалуронат натрия со средней молекулярной массой 50 кДа (Shiseido) в количестве 10 мг растворяют в 10 мл 0,2 М ацетатного буфера, рН 5,6, содержащего 140 мМ NaCl, и оставляют для гидратации на ночь при комнатной температуре.
Получение образца D
Раствор сшитой НА в 1000 кДа
Образец, полученный так, как описано в препаративном примере 1, в количестве 10 мг растворяют в 10 мл 0,2 М ацетатного буфера, рН 5,6, содержащего 140 мМ NaCl.
Получение образца Е
Раствор сшитой НА в 100 кДа
Образец, полученный так, как описано ниже в примере 1, в количестве 10 мг растворяют в 10 мл 0,2 М ацетатного буфера, рН 5,6, содержащего 140 мМ NaCl.
Получение образца F
Раствор сшитой НА в 100 кДа
Образец, полученный так, как описано ниже в примере 2, в количестве 10 мг растворяют в 10 мл 0,2 М ацетатного буфера, рН 5,6, содержащего 140 мМ NaCl.
Получение образца G
Раствор сшитой НА в 100 кДа
Образец, полученный так, как описано ниже в примере 3, в количестве 10 мг растворяют в 10 мл 0,2 М ацетатного буфера, рН 5,6, содержащего 140 мМ NaCl.
Получение образца Н
Раствор сшитой НА в 50 кДа
Образец, полученный так, как описано ниже в примере 5, в количестве 10 мг растворяют в 10 мл 0,2 М ацетатного буфера, pH 5,6, содержащего 140 мМ NaCl.
Получение образца J
Раствор сшитой НА в 50 кДа
Образец, полученный так, как описано ниже в примере 6, в количестве 10 мг растворяют в 10 мл 0,2 М ацетатного буфера, pH 5,6, содержащего 140 мМ NaCl.
Пример получения K
Раствор коммерческой сшитой НА
Коммерческую сшитую НА в количестве 14 мг растворяют в 14 мл 0,2 М ацетатного буфера, pH 5,6, содержащего 140 мМ NaCl.
Пример 1
Получение сшитого NaHA из субстрата NaHA в 100 кДа
Порошок гиалуроната натрия со средней молекулярной массой 100 кД (Shiseido) в количестве 500 мг растворяют в 2,5 мл 1% раствора NaOH (20 мас.% раствор в 0,25 М растворе NaOH). Раствор выдерживают при комнатной температуре в течение 4 часов при перемешивании и затем сшивают при 50°C в течение 5 часов в присутствии 60 мкл диглицидилового эфира бутандиола (BDDE), соответствующих 58 молям BDDE на моль HA-Na. Сшитую гиалуроновую кислоту оставляют в 0,067 М фосфатном буфере, pH 7,4, затем промывают три раза тем же буфером и три раза водой, и получают твердый прозрачный гидрогель, состоящий из сшитого гиалуроната натрия в 100 кДа.
Пример 2
Получение сшитого NaHA из субстрата NaHA в 100 кДа
Порошок гиалуроната натрия со средней молекулярной массой 100 кДа, такой же, как используемый в примере 1, в количестве 1,1 г растворяют в 10 мл 1% раствора NaOH (11 мас.% раствор в 0,25 М растворе NaOH). Раствор выдерживают при комнатной температуре в течение 4 часов при перемешивании и затем сшивают при 50°C в течение 5 часов в присутствии 1 мл диглицидилового эфира бутандиола (BDDE), соответствующего 445 молям BDDE на моль HA-Na. Сшитую гиалуроновую кислоту оставляют в 0,067 М фосфатном буфере, pH 7,4, затем промывают три раза тем же буфером и три раза водой, и получают твердый прозрачный гидрогель, состоящий из сшитого гиалуроната натрия в 100 кДа.
Пример 3
Получение сшитого NaHA из субстрата NaHA в 100 кДа
Порошок гиалуроната натрия со средней молекулярной массой 100 кДа, такой же, как используемый в примере 1, в количестве 400 мг растворяют в 1 мл 1,3% раствора NaOH (40 мас.% раствор). Раствор выдерживают при комнатной температуре в течение 4 часов при перемешивании и затем сшивают при 50°C в течение 5 часов в присутствии 300 мкл диглицидилового эфира бутандиола (BDDE), соответствующих 209 молям BDDE на моль HA-Na. Сшитую гиалуроновую кислоту оставляют в 0,067 М фосфатном буфере, pH 7,4, затем промывают три раза тем же буфером и три раза водой, и получают твердый прозрачный гидрогель, состоящий из сшитого гиалуроната натрия в 100 кДа.
Пример 4
Порошок гиалуроната натрия со средней молекулярной массой 100 кДа (Shiseido) в количестве 500 мг растворяют в 2,5 мл 1% раствора NaOH (20 мас.% раствор в 0,25 М растворе NaOH). Раствор выдерживают при комнатной температуре в течение 4 часов при перемешивании и затем сшивают при 42°C в течение 5 часов в присутствии 60 мкл диглицидилового эфира 1,4-бутандиола (BDDE), соответствующих 58 молям BDDE на моль НА. Сшитую гиалуроновую кислоту оставляют в 0,067 М фосфатном буфере, pH 7,4, затем промывают три раза тем же буфером и три раза водой, и получают гидрогель, состоящий из сшитого гиалуроната натрия в 100 кДа. Получают твердый прозрачный гидрогель.
Пример 5
Получение сшитого NaHA из субстрата NaHA в 50 кДа
Порошок гиалуроната натрия со средней молекулярной массой 50 кДа в количестве 1,1 г растворяют в 10 мл 1% раствора NaOH (11 мас.% раствор). Раствор выдерживают при комнатной температуре в течение 4 часов при перемешивании и затем сшивают при 50°C в течение 4 часов в присутствии 1 мл диглицидилового эфира бутандиола (BDDE), соответствующего 222 молям BDDE на моль HA-Na. Сшитую гиалуроновую кислоту оставляют в 0,067 М фосфатном буфере, pH 7,4, затем промывают три раза тем же буфером и три раза водой, и получают твердый прозрачный гидрогель, состоящий из сшитого гиалуроната натрия в 50 кДа.
Пример 6
Получение сшитого NaHA из субстрата NaHA в 50 кДа
Порошок гиалуроната натрия со средней молекулярной массой 50 кДа в количестве 400 мг растворяют в 1 мл 1,3% раствора NaOH (40 мас.% раствор). Раствор выдерживают при комнатной температуре в течение 4 часов при перемешивании и затем сшивают при 50°C в течение 4 часов в присутствии 300 мкл диглицидилового эфира бутандиола (BDDE), соответствующих 185 молям BDDE на моль HA-Na. Сшитую гиалуроновую кислоту оставляют в 0,067 М фосфатном буфере, рН 7,4, затем промывают три раза тем же буфером и три раза водой, и получают твердый прозрачный гидрогель, состоящий из сшитого гиалуроната натрия в 50 кДа.
Пример 7
Способ определения кинетики ферментативного расщепления
В сосуды в темноте помещают по 1 мл каждого из материалов, полученных в A-K (субстрат). Раствор приводят к 37°C на водяной бане при слабом перемешивании. Отдельно получают раствор гиалуронидазы (раствор фермента), растворяя содержимое сосуда гиалуронидазу из Streptomyces hyalurolyticus (SIGMA, кат. № H1136) в 1 мл 0,2 М ацетатного буфера, рН 5,6, содержащего 1 мг/мл бычьего сывороточного альбумина (BSA) в качестве стабилизатора. Объем в 200 мкл полученного таким образом раствора фермента добавляют в реакционный сосуд с субстратом, равномерно отбирают 100-мкл аликвоты и останавливают реакцию, добавляя 1 мл 50 мМ раствора KCl, рН 1,8. После центрифугирования при 3000 об/мин в течение 20 минут при 4°C определяют поглощение раствора при 235 нм.
Пример 8
Сравнение кинетик ферментативного расщепления
Поглощение гиалуроновой кислоты из примера получения эталона А и полученного сшитого образца D, определенное согласно способу примера 7 в различные моменты времени, приводится в таблице 1.
Кинетика расщепления гиалуронидазой двух продуктов из таблицы 1 приводится на фигуре 1. Такое сравнение показывает, что на 23-м часу расщепление сшитой НА в 1000 кДа примерно в три раза меньше, чем эталонной НА в 1000 кДа.
Пример 9
Сравнение кинетик ферментативного расщепления
Поглощение гиалуроновой кислоты из примера получения эталона А, примера получения эталона В и полученного сшитого образца Е по настоящему изобретению, определенное согласно способу примера 7 в различные моменты времени, приводится в таблице 2.
Кинетика расщепления гиалуронидазой трех продуктов из таблицы 2 приводится на фигуре 2. Такое сравнение показывает, что на 25-м часу расщепление сшитой НА в 100 кДа из примера 1 настоящего изобретения примерно в четырнадцать раз меньше, чем эталонной НА в 1000 кДа и примерно в девять раз меньше, чем эталонной НА в 100 кДа.
Пример 10
Сравнение кинетик ферментативного расщепления
Поглощение коммерческой сшитой гиалуроновой кислоты из примера получения К и полученного сшитого образца Е по настоящему изобретению, определенное согласно способу примера 7 в различные моменты времени, приводится в таблице 3.
Кинетика расщепления гиалуронидазой двух продуктов из таблицы 3 приводится на фигуре 3. Такое сравнение показывает, что на 28-м часу расщепление сшитой НА в 100 кДа из примера 1 настоящего изобретения примерно в три раза меньше, чем коммерческой НА в 1000 кДа.
Пример 11
Сравнение кинетик ферментативного расщепления
Поглощение нативной НА в 100 кДа из примера получения В и полученных сшитых образцов Е, F, G по настоящему изобретению, определенное согласно способу примера 7 в различные моменты времени, приводится в таблице 4.
Кинетика расщепления гиалуронидазой четырех продуктов из таблицы 4 приводится на фигуре 4. Такое сравнение показывает, что на 28-м часу расщепление сшитой НА в 100 кДа из примеров 1, 2 и 3 настоящего изобретения в 6-8 раз меньше, чем нативного материала в 100 кДа из примера получения В.
Пример 12
Сравнение кинетик ферментативного расщепления
Поглощение нативной НА в 50 кДа из примера получения С и полученных сшитых образцов Н и J по настоящему изобретению, определенное согласно способу примера 7 в различные моменты времени, приводится в таблице 5.
Кинетика расщепления гиалуронидазой четырех продуктов из таблицы 5 приводится на фигуре 5. Такое сравнение показывает, что на 30-м часу расщепление сшитой НА в 50 кДа из примеров 5 и 6 настоящего изобретения в 4-8 раз меньше, чем исходного материала в 50 кДа из примера получения С.Также у них та же устойчивость или время полужизни более прочные в отношении ферментативной деполимеризации, чем сшитого образца в 100 кДа из примера 1.
Пример 13
Деполимеризация гиалуронидазой млекопитающего
Для того, чтобы исследовать in vitro устойчивость гидрогеля к ферментам в патологической ситуации больных артрозом, при котором имеет место сверхпродуцирование гиалуронидазы, полутвердый гидрогель примера 1 деполимеризуют в присутствии избытка гиалуронидазы млекопитающего в сравнении с коммерческой гиалуроновой кислотой, гиалуроновой кислотой в 1000000 Да и сшитой гиалуроновой кислотой в 1000000 Да, синтезированной таким же взаимодействием, как продукт примера 1, и продукты реакции анализируют GPC-ВЭЖХ.
Образец в количестве 6 мг растворяют в 2 мл 0,3 М фосфатного буфера, pH 5,5, и оставляют на ночь при комнатной температуре. Затем раствор разбавляют 1:10 тем же буфером, и к 2 мл образца для деполимеризации добавляют 0,5 мл 20 мМ фосфатного буфера, содержащего 77 мМ NaCl, pH 7,0. Раствор оставляют при 37°C.
Гиалуронидазу типа IV из яичка быка (SIGMA-ALDRICH) в количестве 10 мг растворяют в 14,92 мл 20 мМ фосфатного буфера, содержащего 77 мМ NaCl, pH 7,0, и разбавляют 1:25 тем же буфером, и получают 40 Е/мл. Раствор фермента выдерживают при 37°C в течение 10 минут. Затем 1,5 мл раствора фермента добавляют к раствору образца при 37°C и оставляют для взаимодействия на 7 часов. Отбирают 1 мл реакционной смеси, и реакцию останавливают кипячением при 100°C. Перед анализом ВЭЖХ образец фильтруют через мембрану 0,2 мкм. После реакции в течение 8 часов к каждому образцу добавляют 750 мкл фермента, и взаимодействие продолжают еще в течение 40 часов. По окончании реакцию останавливают кипячением при 100°C, смесь фильтруют через мембрану 0,2 мкм и анализируют ВЭЖХ.
Анализ выполняют на установке ВЭЖХ с автоинжектором, насосом и УФ-детектором, с колонкой GPC (Cosmosil Diol 120 II, 5 мкм, 7,5×300 мм, с предколонкой от Nacalai, США) и 0,15 М натрийсульфатным буфером в качестве изократной подвижной фазы со скоростью потока 0,6 мл/мин. Образцы фильтруют через фильтр 0,45 мкм, и в систему ВЭЖХ впрыскивают 100 мкл раствора. Сигналы детектируют при 205 нм по всему времени пробега (25 минут). Времена удерживания (RT) сигналов сравнивают с RT калибровочных стандартов олигосахаридов со следующими интервалами RT:
додекасахарид - 13,80-14,05 мин;
декасахарид - 14,05-14,45 мин;
октасахарид - 14,70-15,00 мин;
гексасахарид - 15,05-15,25 мин;
тетрасахарид - 15,50-15,90 мин.
Пример 14
(Биологическая активность)
Два образца сшитой гиалуроновой кислоты - коммерческий образец (Durolane®, сшитый высокомолекулярный Na-HA) и гидрогель примера 1 (GL 2570) - испытывают на хондроцитах. Хондроциты берут у 3 больных остеоартритом, следовательно, со сверхпродуцированием ферментов, расщепляющих НА (гиалуронидаз). К клеточным культурам с различными концентрациями клеток (12000 и 22500 клеток) добавляют образцы в возрастающих количествах (200, 500 и 1000 мкг/мл) и испытывают в различные моменты времени (24, 48 и 72 часа). В первом анализе морфологию клеток после добавления образцов анализируют с помощью микроскопа. Форма клеток оказывается неизменной при всех концентрациях. Затем проверяют выжившие и погибшие клетки с помощью набора LIVE/DEAD Viability/Cytotoxicity KIT, кат. № L3224 (Invitrogen), где живые клетки имеют зеленый цвет, в то время как погибшие клетки окрашиваются в красный цвет. В обоих случаях (Durolane и GL 2570) красные клетки не обнаруживаются при всех концентрациях во все моменты времени. Соединение примера 1 (GL 2570) не вызывает гибели клеток.
Для того чтобы проверить клеточный метаболизм, коррелирующий с пролиферацией клеток, применяют тест МТТ (МТТ, кат. № М-5655, SIGMA). Не обнаруживают различий после добавления образца к хондроцитам при всех концентрациях во все моменты времени.
Для того чтобы оценить клеточную токсичность продуктов, измеряют образование LDH с помощью набора для детекции цитотоксичности (Cytotoxicity Detection KIT (LDH), кат. №11644793001 (ROCHE)). LDH представляет собой показатель целостности клеточной мембраны и превышается в присутствии токсичного агента. Во всех отобранных образцах хондроцитов токсичность не детектируется для обоих образцов.
Пролиферацию проверяют, измеряя внедрение тритированного тимидина. Тимидин включается клетками для синтеза новой ДНК для нового поколения клеток. При таком испытании два образца оказываются различными. По меньшей мере, у одного пациента внедрение тритированного тимидина в клетки, обработанные Durolane, возрастает за 24 часа, в то время как в клетки, обработанные GL 2570, тритированный тимидин не внедряется до 48 часов и затем постепенно нарастает на момент 72 часа, но не достигает значения для Durolane. Такое различие коррелирует с устойчивостью к действию гиалуронидазы. В частности, в течение первых 24 часов GL 2570 не деполимеризуется гиалуронидазой, и слой сшитого соединения блокирует внедрение различных биологических и химических агентов, включая тритированный тимидин. Durolane, напротив, сразу же расщепляется и не может ингибировать проникание веществ в клетки.
Claims (14)
1. Твердый прозрачный гидрогель сшитой гиалуроновой кислоты в качестве вязкого вспомогательного наполнителя для применения в биомедицине, фармацевтике и косметических средствах, образованный субстратом гиалуроната натрия со средней молекулярной массой от 50000 до 100000 Да, сшитым диглицидиловым эфиром 1,4-бутандиола, который получают способом, который включает взаимодействие 8-40%-ного раствора гиалуроната натрия со средней молекулярной массой от 50000 до 100000 Да в 0,75-1,5%-ном водном растворе гидроксида натрия с количеством диглицидилового эфира 1,4-бутандиола от 180 до 500 молей на моль гиалуроната натрия.
2. Гидрогель по п. 1, получаемый способом, который включает взаимодействие 8-40%-ного водного раствора гиалуроната натрия со средней молекулярной массой 100000 Да в 0,75-1,5%-ном водном растворе гидроксида натрия с количеством диглицидилового эфира 1,4-бутандиола, соответствующим 55 - 500 молям на моль субстрата гиалуроната натрия, при температуре от 45 до 60°C в течение периода времени от 3 до 8 часов.
3. Гидрогель по п. 2, при этом в указанном способе к гиалуронату натрия со средней молекулярной массой 100000 Да, растворенному в концентрации от 18 до 22% в 0,75-1,25%-ном растворе гидроксида натрия, добавляют сшивающий агент в молярном количестве сшивающего агента от 55 до 60 молей и раствор греют при 42-55°C в течение 4-6 часов.
4. Гидрогель по п. 3, при этом в указанном способе раствор греют при 45-55°C.
5. Гидрогель по п. 1, образованный субстратом со средней молекулярной массой 50000 Да.
6. Гидрогель по п. 5, получаемый способом, который включает взаимодействие 11%-ного водного раствора гиалуроната натрия со средней молекулярной массой 50000 Да в 1%-ном водном растворе гидроксида натрия с количеством диглицидилового эфира 1,4-бутандиола, соответствующим 222 молям на моль субстрата гиалуроната натрия, при 50°C в течение 4 часов.
7. Гидрогель по п. 5, получаемый способом, который включает взаимодействие 40%-ного водного раствора гиалуроната натрия со средней молекулярной массой 50000 Да в 1,3%-ном водном растворе гидроксида натрия с количеством диглицидилового эфира 1,4-бутандиола, соответствующим 185 молям на моль субстрата гиалуроната натрия, при 50°C в течение 4 часов.
8. Способ получения вязкоупругого твердого и прозрачного гидрогеля сшитого низкомолекулярного гиалуроната натрия, включающий взаимодействие 8-40%-ного раствора субстрата гиалуроната натрия со средней молекулярной массой от 50000 до 100000 Да в 0,75-1,5%-ном водном растворе гидроксида натрия с количеством диглицидилового эфира 1,4-бутандиола, соответствующим 180 - 500 молям на моль субстрата гиалуроната натрия, при температуре от 45 до 60°C в течение периода времени от 3 до 8 часов.
9. Способ по п. 8, при этом исходный субстрат представляет собой гиалуронат натрия со средней молекулярной массой 100000 Да и количество диглицидилового эфира 1,4-бутандиола соответствует 55 - 500 молям на моль указанного субстрата.
10. Способ по п. 8, при этом исходный субстрат представляет собой гиалуронат натрия со средней молекулярной массой 100000 Да, количество диглицидилового эфира 1,4-бутандиола соответствует 55 - 500 молям на моль указанного субстрата и температура реакции составляет от 42 до 60°C.
11. Способ по п. 10, при этом исходный субстрат представляет собой гиалуронат натрия со средней молекулярной массой 100000 Да, количество диглицидилового эфира 1,4-бутандиола соответствует 55 - 500 молям на моль указанного субстрата и реакцию осуществляют при 45-55°C в течение 4-6 часов.
12. Вязкий вспомогательный наполнитель, состоящий из гидрогеля сшитой гиалуроновой кислоты по любому из пп. 1-7.
13. Гидрогель сшитой гиалуроновой кислоты по любому из пп. 1-7 для использования в применениях в биомедицине, фармацевтике и косметических средствах.
14. Гидрогель сшитой гиалуроновой кислоты по любому из пп. 1-7 для применения в качестве вязкого вспомогательного наполнителя.
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
EP11006559 | 2011-08-10 | ||
EP11006559.6 | 2011-08-10 | ||
PCT/IB2012/001472 WO2013021249A1 (en) | 2011-08-10 | 2012-07-31 | Degradation-resistant cross-linked, low-molecular-weight hyaluronate |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
RU2014108821A RU2014108821A (ru) | 2015-09-20 |
RU2613887C2 true RU2613887C2 (ru) | 2017-03-21 |
Family
ID=46799277
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
RU2014108821A RU2613887C2 (ru) | 2011-08-10 | 2012-07-31 | Устойчивый к расщеплению сшитый низкомолекулярный гиалуронат |
Country Status (13)
Country | Link |
---|---|
EP (1) | EP2742070B1 (ru) |
CY (1) | CY1124718T1 (ru) |
DK (1) | DK2742070T3 (ru) |
ES (1) | ES2899992T3 (ru) |
HR (1) | HRP20211659T1 (ru) |
HU (1) | HUE056131T2 (ru) |
LT (1) | LT2742070T (ru) |
PL (1) | PL2742070T3 (ru) |
PT (1) | PT2742070T (ru) |
RS (1) | RS62488B1 (ru) |
RU (1) | RU2613887C2 (ru) |
SI (1) | SI2742070T1 (ru) |
WO (1) | WO2013021249A1 (ru) |
Families Citing this family (9)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
EP2892564A4 (en) * | 2012-09-06 | 2016-04-27 | Univ Nanyang Tech | HYALURONIC ACID MEDICINE DELIVERY SYSTEMS |
EP3194452B1 (en) | 2014-08-29 | 2018-06-13 | Galderma S.A. | Enantiopure or enantioenriched bdde and its use as crosslinking agent in the manufacture of cross-linked products |
WO2016057607A1 (en) * | 2014-10-08 | 2016-04-14 | Therakine | Micronized hydrophilic cross-linked biopolymer systems and method of making same |
RU2582702C1 (ru) * | 2015-08-19 | 2016-04-27 | федеральное государственное бюджетное учреждение "Федеральный научно-исследовательский центр эпидемиологии и микробиологии имени почетного академика Н.Ф. Гамалеи" Министерства здравоохранения Российской Федерации (ФГБУ "ФНИЦЭМ им. Н.Ф. Гамалеи" Минздрава России) | Способ получения композиции на основе модифицированного гиалуроната натрия, композиция на основе модифицированного гиалуроната натрия и ее применение |
WO2017082538A1 (ko) * | 2015-11-13 | 2017-05-18 | 서강대학교산학협력단 | 유착 방지용 하이드로젤 및 이의 제조 방법 |
US10456347B2 (en) | 2015-11-24 | 2019-10-29 | Bmi Korea Co., Ltd | Composition for injection of hyaluronic acid, containing hyaluronic acid derivative and DNA fraction, and use thereof |
PL241064B1 (pl) * | 2018-10-01 | 2022-08-01 | Dolniak Blazej | Sposób wytwarzania lepko-sprężystego żelu uzupełniającego maź stawową i lepko-sprężysty żel uzupełniający maź stawową |
IT202000008299A1 (it) * | 2020-04-17 | 2021-10-17 | Glycores 2000 Srl | Composizione liquida oftalmica comprendente acido ialuronico lineare a basso peso molecolare |
CN113413484B (zh) * | 2021-06-21 | 2023-02-10 | 浙江苏嘉医疗器械股份有限公司 | 可用于人体软组织填充的植入材料 |
Citations (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
KR20080073419A (ko) * | 2007-02-06 | 2008-08-11 | 주식회사 핸슨바이오텍 | 의료용 히알루론산 유도체 마이크로비드 및 이의 제조 방법 |
WO2008126803A1 (ja) * | 2007-04-06 | 2008-10-23 | Shiseido Company, Ltd. | 可溶性架橋ヒアルロン酸含有眼用組成物 |
WO2010015900A1 (en) * | 2008-08-04 | 2010-02-11 | Allergan Industrie Sas | Hyaluronic acid-based gels including anesthetic agents |
WO2011023355A2 (en) * | 2009-08-27 | 2011-03-03 | Fidia Farmaceutici S.P.A. | Viscoelastic gels as novel fillers |
Family Cites Families (17)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US4716224A (en) | 1984-05-04 | 1987-12-29 | Seikagaku Kogyo Co. Ltd. | Crosslinked hyaluronic acid and its use |
SE442820B (sv) | 1984-06-08 | 1986-02-03 | Pharmacia Ab | Gel av tverbunden hyaluronsyra for anvendning som glaskroppssubstitut |
US4582865A (en) | 1984-12-06 | 1986-04-15 | Biomatrix, Inc. | Cross-linked gels of hyaluronic acid and products containing such gels |
US4713448A (en) | 1985-03-12 | 1987-12-15 | Biomatrix, Inc. | Chemically modified hyaluronic acid preparation and method of recovery thereof from animal tissues |
SE452469B (sv) | 1986-06-18 | 1987-11-30 | Pharmacia Ab | Material bestaende av en tverbunden karboxylgrupphaltig polysackarid och forfarande vid framstellning av detsamma |
US5017229A (en) | 1990-06-25 | 1991-05-21 | Genzyme Corporation | Water insoluble derivatives of hyaluronic acid |
SE8900422D0 (sv) | 1989-02-08 | 1989-02-08 | Pharmacia Ab | Tvaerbundna hyaluronatgeler samt foerfarande foer framstaellning av dessa |
US5356883A (en) | 1989-08-01 | 1994-10-18 | Research Foundation Of State University Of N.Y. | Water-insoluble derivatives of hyaluronic acid and their methods of preparation and use |
TWI251596B (en) * | 2002-12-31 | 2006-03-21 | Ind Tech Res Inst | Method for producing a double-crosslinked hyaluronate material |
JP2004323454A (ja) | 2003-04-25 | 2004-11-18 | Chisso Corp | 薬剤 |
AU2004312532B2 (en) | 2003-12-30 | 2010-05-20 | Genzyme Corporation | Cohesive gels form cross-linked hyaluronan and/or hylan, their preparation and use |
US20050281880A1 (en) | 2004-05-20 | 2005-12-22 | Wei Wang | Methods for making injectable polymer hydrogels |
PT1817347T (pt) | 2004-11-24 | 2017-07-21 | Albumedix As | Resumo |
JP2009541372A (ja) * | 2006-06-28 | 2009-11-26 | ノボザイムス バイオファーマ デーコー アクティーゼルスカブ | 複数のヒアルロン酸画分を含む化粧用と医療用の組成物 |
KR20080062092A (ko) * | 2006-12-29 | 2008-07-03 | 주식회사 핸슨바이오텍 | 세포전달체로서의 히알루론산 유도체 및 이의 제조 방법 |
GB0816496D0 (en) | 2008-09-10 | 2008-10-15 | Zhao Xiaobin | Hyaluronic acid cryogel |
CN101721349B (zh) * | 2008-10-16 | 2011-07-20 | 常州百瑞吉生物医药有限公司 | 可注射原位交联水凝胶及其制备方法和用途 |
-
2012
- 2012-07-31 PL PL12755897T patent/PL2742070T3/pl unknown
- 2012-07-31 WO PCT/IB2012/001472 patent/WO2013021249A1/en active Application Filing
- 2012-07-31 RS RS20211234A patent/RS62488B1/sr unknown
- 2012-07-31 LT LTEPPCT/IB2012/001472T patent/LT2742070T/lt unknown
- 2012-07-31 DK DK12755897.1T patent/DK2742070T3/da active
- 2012-07-31 HR HRP20211659TT patent/HRP20211659T1/hr unknown
- 2012-07-31 HU HUE12755897A patent/HUE056131T2/hu unknown
- 2012-07-31 ES ES12755897T patent/ES2899992T3/es active Active
- 2012-07-31 EP EP12755897.1A patent/EP2742070B1/en active Active
- 2012-07-31 PT PT127558971T patent/PT2742070T/pt unknown
- 2012-07-31 SI SI201231951T patent/SI2742070T1/sl unknown
- 2012-07-31 RU RU2014108821A patent/RU2613887C2/ru active
-
2021
- 2021-11-09 CY CY20211100969T patent/CY1124718T1/el unknown
Patent Citations (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
KR20080073419A (ko) * | 2007-02-06 | 2008-08-11 | 주식회사 핸슨바이오텍 | 의료용 히알루론산 유도체 마이크로비드 및 이의 제조 방법 |
WO2008126803A1 (ja) * | 2007-04-06 | 2008-10-23 | Shiseido Company, Ltd. | 可溶性架橋ヒアルロン酸含有眼用組成物 |
WO2010015900A1 (en) * | 2008-08-04 | 2010-02-11 | Allergan Industrie Sas | Hyaluronic acid-based gels including anesthetic agents |
WO2011023355A2 (en) * | 2009-08-27 | 2011-03-03 | Fidia Farmaceutici S.P.A. | Viscoelastic gels as novel fillers |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
HRP20211659T1 (hr) | 2022-02-04 |
PL2742070T3 (pl) | 2022-01-31 |
WO2013021249A1 (en) | 2013-02-14 |
DK2742070T3 (da) | 2021-11-08 |
CY1124718T1 (el) | 2022-07-22 |
ES2899992T3 (es) | 2022-03-15 |
RU2014108821A (ru) | 2015-09-20 |
SI2742070T1 (sl) | 2021-11-30 |
HUE056131T2 (hu) | 2022-01-28 |
EP2742070B1 (en) | 2021-09-15 |
RS62488B1 (sr) | 2021-11-30 |
PT2742070T (pt) | 2021-11-22 |
EP2742070A1 (en) | 2014-06-18 |
LT2742070T (lt) | 2021-10-25 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
RU2613887C2 (ru) | Устойчивый к расщеплению сшитый низкомолекулярный гиалуронат | |
EP1701981B1 (en) | Cohesive gels from cross-linked hyaluronan and/or hylan,their preparation and use | |
Shi et al. | Chondroitin sulfate: Extraction, purification, microbial and chemical synthesis | |
US20050281880A1 (en) | Methods for making injectable polymer hydrogels | |
CN101502677B (zh) | 一种注射用交联透明质酸钠凝胶及其制备方法 | |
JP2004323453A (ja) | 分解性ゲル及びその製造法 | |
Arlov et al. | The impact of chain length and flexibility in the interaction between sulfated alginates and HGF and FGF-2 | |
EP3736296B1 (en) | Method of crosslinking glycosaminoglycans | |
Tavakol et al. | Synthesis and characterization of an enzyme mediated in situ forming hydrogel based on gum tragacanth for biomedical applications | |
La Gatta et al. | Hyaluronan dermal fillers via crosslinking with 1, 4‐butandiol diglycidyl ether: E xploitation of heterogeneous reaction conditions | |
EP4038105B1 (en) | A hyperbranched polyglycerol polyglycidyl ether and its use as crosslinker for polysaccharides | |
EP4063433A1 (en) | Hydrogel of mercapto-modified macromolecular compound, and preparation method therefor and use thereof | |
US9908948B2 (en) | Enantiopure or enantioenriched BDDE and its use as crosslinking agent in the manufacture of cross-linked products | |
RU2582702C1 (ru) | Способ получения композиции на основе модифицированного гиалуроната натрия, композиция на основе модифицированного гиалуроната натрия и ее применение | |
Schuurmans et al. | Hydrolytic (in) stability of methacrylate esters in covalently cross-linked hydrogels based on chondroitin sulfate and hyaluronic acid methacrylate | |
RU2477138C1 (ru) | Способ получения заполняющего материала для пластической хирургии и инструментальной косметологии, заполняющий материал и способ введения заполняющего материала в проблемную зону | |
EP3494145B1 (en) | Method of crosslinking glycosaminoglycans | |
KR102425496B1 (ko) | 고탄성, 고점도 및 고유효 가교율을 갖는 히알루론산 가교체, 및 이의 제조방법 | |
EP2844310B1 (en) | Shape-memory cross-linked polysaccharides | |
CN102727424A (zh) | 用于骨关节腔的透明质酸钠凝胶针剂及其制备方法 | |
EP3040118A1 (en) | Ether cross-linked chondroitin hydrogels and their use for soft tissue applications | |
WO2021043349A1 (en) | Hydrogel based on crosslinked hydroxyphenyl derivative of hyaluronic acid | |
RU2750000C1 (ru) | Способ получения модифицированного гиалуронана и его применение в медицине, в том числе при эндопротезировании | |
AU2017307331A1 (en) | Method of crosslinking glycosaminoglycans | |
Øvrebø et al. | Characterisation and biocompatibility of crosslinked hyaluronic acid with BDDE and PEGDE for clinical applications |