ES2899992T3

ES2899992T3 - Acido hialurónico reticulado de bajo peso molecular resistente a la degradación

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Publication number: ES2899992T3
Application number: ES12755897T
Authority: ES
Inventors: Pasqua Oreste
Original assignee: Glycores 2000 Srl
Current assignee: Glycores 2000 Srl
Priority date: 2011-08-10
Filing date: 2012-07-31
Publication date: 2022-03-15
Anticipated expiration: 2032-07-31
Also published as: RS62488B1; RU2613887C2; RU2014108821A; HRP20211659T1; HUE056131T2; DK2742070T3; EP2742070A1; CY1124718T1; LT2742070T; PL2742070T3; SI2742070T1; WO2013021249A1; EP2742070B1; PT2742070T

Abstract

Un procedimiento para la preparación de un hidrogel de hialuronato de sodio reticulado viscoelástico, sólido y transparente de bajo peso molecular, que comprende hacer reaccionar una solución al 8-40% de un sustrato de hialuronato de sodio que tiene un peso molecular medio de desde 50.000 Da hasta 100.000 Da en una solución acuosa al 0,75%-1,5% de hidróxido de sodio con una cantidad de éter diglicidílico de 1,4-butanodiol correspondiente a desde 180 moles hasta 500 moles por mol del sustrato de hialuronato de sodio a una temperatura de desde 45 hasta 60 °C durante un periodo de tiempo desde 3 hasta 8 horas.

Description

DESCRIPCIÓN

Ácido hialurónico reticulado de bajo peso molecular resistente a la degradación

Objeto de la invención

La presente invención versa acerca de un producto biodegradable pero resistente a la degradación obtenido mediante la modificación de ácido hialurónico de bajo peso molecular para su uso en aplicaciones biomédicas, farmacéuticas y cosméticas. Más en particular, la invención proporciona un procedimiento para la preparación de un hidrogel de ácido hialurónico reticulado de bajo peso molecular que tiene un peso molecular de desde 50.000 hasta 100.000, una mayor resistencia a la degradación enzimática que los hialuronatos reticulados comerciales con una cinética de biodegradación reivindicada a largo plazo y características morfológicas que son muy mejoradas con respecto a los hialuronatos reticulados descritos hasta la fecha. La invención también proporciona el hidrogel de ácido hialurónico reticulado de bajo peso molecular obtenido mediante el procedimiento de la invención.

Dicho ácido hialurónico de bajo peso molecular reticulado mediante el agente reticulante éter diglicidílico de 1,4-butanodiol (BDDE, por sus siglas en inglés), es un sólido (semisólido) pero viscoelástico, hidrogel transparente que puede ser empleado con facilidad como material de carga de viscosuplementación para tratar enfermedades articulares o como material de carga para el tratamiento de relajación tisular (arrugas) en productos cosméticos.

Antecedentes de la invención

El ácido hialurónico (HA, por sus siglas en inglés) es un glucosaminoglucano que está presente en el cartílago hialino, en el líquido de articulación sinovial y en tejidos cutáneos. Más en particular, e1HA es un glucosaminoglucano lineal formado por una mezcla de cadenas de distinta longitud constituidas por la repetición de un disacárido regular formado por una unidad de ácido glucurónico y una unidad de N-acetil-glucosamina ligada por enlaces glucosídicos beta 1-4. Los disacáridos están ligados por enlaces glucosídicos beta 1-3 con un peso molecular medio de hasta 6 Md (6 x 106 Da). Por lo tanto, cada cadena en dicha mezcla de cadenas muestra la misma secuencia repetitiva de la fórmula (A)

siendo el catión correspondiente, en general, hidrógeno (ácido hialurónico) o sodio (hialuronato de sodio).

En los tejidos, la función del ácido hialurónico es principalmente mantener la densidad estructural que permite al mismo tiempo las acciones bioquímicas de los productos naturales en las zonas corporales específicas. En líquidos como la sinovia, la acción del HA es mantener la viscosidad correcta mediante una acción lubricante. Para ejercer estas acciones, el HA necesita ser completamente biocompatible incluyendo un equilibrio metabólico correcto. E1HA natural es degradado continuamente y sintetizado por las enzimas corporales. Se produce una desviación en esta homeostasia cuando se producen situaciones patológicas; por lo tanto, los aumentos en el catabolismo de HA tienen como resultado una amplia gama de efectos desde una patología grave hasta simples modificaciones cutáneas. La aplicación de HA, como hialuronato de sodio, como material de carga en productos cosméticos o en una sustitución viscoelástica en la sinovitis, requiere que el polímero de HA empleado tenga propiedades viscoelásticas mejoradas. Esta reología tiene que ser equilibrada con una capacidad eficaz para la fabricación del producto inyectable.

El ácido hialurónico industrial se obtiene mediante la extracción de tejidos animales o mediante la fermentación por microorganismos y está disponible habitualmente como hialuronato de sodio. Con respecto al peso molecular, en general se reconoce que el Ha de bajo peso molecular es una mezcla de cadenas que tiene un peso molecular medio inferior a 250 Kd (2,5 x 105 Da). Se utiliza HA, en general como hialuronato de sodio, en muchas aplicaciones en productos cosméticos, en oftalmología, en reumatología y en ingeniería de tejidos. En particular, se utiliza HA con un peso molecular medio superior a 1 Md como una viscosuplementación en artrosis articular o en el tratamiento de arrugas. Se requiere el peso molecular elevado para suplementar el líquido sinovial o para rellenar los espacios muertos conectivos cutáneos gracias a la viscosidad de la solución resultante.

En la actualidad, existen en el mercado muchos medicamentos basados en la anterior tecnología. Tienen una biocompatibilidad elevada, pero son sometidos a una degradación bastante rápida por las enzimas corporales, en particular por la hialuronidasa, con la consecuencia de una vida media corta.

Descripción de la técnica anterior

Según la bibliografía, se ha aumentado la vida media del HA modificando e1HA mediante reacciones químicas, en particular reticulando las cadenas de HA entre sí por medio de reactivos divalentes. Tales agentes divalentes, bien conocidos por las personas que trabajan en esta técnica, son, en general, epóxidos bi o polifuncionales, por ejemplo epóxidos alifáticos inferiores, o sus halohidrinas o epihalohidrinas o haluros correspondientes, que forman puentes de éter con las moléculas de ácido hialurónico. Como ejemplos adecuados, pueden mencionarse epiclorohidrina, divinilsulfona, éter diglicidílico de 1,4-butanodiol (BDDE), éter diglicidílico de 1,2-etilenodiol, ciclohexano de 1-(2,3-epoxipropil)-2,3-epoxi, anilina N,N-diglicidílica y pentaeritritol sustituido con epoxi. Otros agentes reticulantes que pueden emplearse son polímeros reactivos tales como, por ejemplo, dextrano o almidón que se ha hecho que reaccionen para que contengan, por ejemplo grupos de éter glicidilíco, como se describe en el documento EP 272300 (WO87/78989) que también divulga la reticulación mediante BDDE.

La patente U.S. n° 4.582.865 y WO 2006/056204 describen la preparación de HA reticulado, solo o en combinación con polímeros hidrófilos a partir de divinilsulfona (DVS), generando una reticulación de 1,2-etileno.

Se han descrito compuestos de epoxi polifuncional en el documento EP 0161887. Se han descrito como agentes reticulantes formaldehído (documento US 4.713.448), que genera una reticulación de metileno y carbodiimidas (documentos US 5.017.229 y US 6.013.679), que generan una reticulación de carbonilo.

En el documento US 2005/0281880 se ha documentado un procedimiento de una etapa para reticular HA con un reactivo divalente de epoxi y el producto obtenido utilizando una concentración elevada de HA. Todos estos documentos describen el uso de HA con un peso molecular medio superior a 500 Kd como material de partida.

La modificación de HA mediante reacciones químicas y, en particular, en el procedimiento de reticulación reduce la propiedad de enlace del HA a las enzimas degradadoras naturales, en particular a la hialuronidasa. Cuando se reticula ^elHa , ^{se forma una red tridimensional y se reduce la energía libre de las cadenas de polisacáridos. Cuanto menor}sea la relación molar de HA/reactivo reticulante aplicado, mayor será la resistencia a la degradación por la enzima natural hialuronidasa. Por ejemplo, según el documento US 2005/0281880 mencionado anteriormente, se reduce la tasa de degradación enzimática desde un 60-90% hasta un 10% actuando sobre el procedimiento de producción trabajando con concentraciones de solución acuosa de HA de hasta un 20% y una relación de HA/reactivo reticulante desde 1:1 hasta 1:2,4.

El documento US 4.716.154 da a conocer un sustituto de humor vítreo para ser utilizado en oftalmología, que consiste en un gel de ácido hialurónico reticulado y también afirma que el peso molecular del ácido hialurónico no es un factor crítico para la puesta en práctica de la invención reivindicada en el mismo. Según este documento, son preferidos los sustratos de HA que tienen un peso molecular medio de desde 500.000 hasta 3.000.000 Da, pero se describe un HA reticulado en el que el sustrato tiene un peso molecular medio de 20.000.

El documento US 2005/0281880 (Wang) da a conocer un procedimiento para la preparación de hidrogeles inyectables de hialuronano a partir de un sustrato de hialuronano que tiene un peso molecular medio de 2,3 MDa, incluyendo dicho procedimiento las etapas de reticular uno o más polímeros y lavar el gel formado subsiguientemente, seguidas por la purificación y la homogeneización para producir un hidrogel inyectable. Este documento indica específicamente los parámetros que han de ser utilizados para obtener un hidrogel a partir de ácido hialurónico.

Los materiales de carga disponibles en la actualidad para una viscosuplementación, a base de ácido hialurónico nativo biotecnológico o reticulado, no tienen una eficacia terapéutica completamente satisfactoria. Esto es debido no solo a la menor acción de la hialuronidasa, sino también a todo el catabolismo de HA en el que hay implicados muchos factores naturales. Por consiguiente, se aumenta la frecuencia de administración de HA en función de la aplicación específica.

Por lo tanto, existe la necesidad de un producto, para su uso como un material de carga de viscosuplementación con mejores capacidades para retener las propiedades viscosas elevadas y menos afinidad por la hialuronidasa, siendo capaz, por lo tanto, de prolongar la vida media del HA, especialmente en el caso de su uso dérmico, intradérmico o intraarticular, pero es importante que el producto retenga la característica de ser despolimerizado por las enzimas endógenas para evitar la toxicidad.

Sumario de la invención

Considerando los resultados de los estudios publicados previamente citados con anterioridad, en particular el hecho de que el material de partida de HA para la producción de productos reticulados para su uso como materiales de carga de viscosuplementación son polímeros con un peso molecular medio superior a 500 Kd, es decir cadenas poliméricas lineales que tienen un mínimo de 1250 disacáridos, los inventores han calculado que, teniendo en cuenta una eficacia de reacción de 5-10% utilizando un reactivo reticulante, estadísticamente cada cadena debería tener 12 sustituciones, dejando, por lo tanto, aproximadamente 100-200 disacáridos sin reaccionar. Por lo tanto, los inventores partieron de la premisa de que un producto reticulado procedente de un sustrato de HA con una longitud reducida de las cadenas estaría menos inclinado a una degradación enzimática, especialmente por hialuronidasas. Los inventores han calculado que en el producto reticulado que utiliza un HA de partida de 100 Kd, se reduciría la longitud estadística de cadena no modificada a 10-20 disacáridos, con una capacidad potencial resultante de reducir la cinética de degradación. Los productos reticulados que pueden obtenerse con HA con un PM medio inferior a 50.000 podrían ser sintetizados, pero para obtener un gel adecuado se debe aumentar el agente BDDE. Considerando el cálculo mencionado anteriormente de cadena accesible de 100-200 disacáridos en el caso de una muestra de HA de 1.000 KDa y de 10-20 en el caso de la muestra de HA de 100 KD, el producto reticulante que utiliza una muestra de HA inferior a 50 KDa tendrá como resultado una cadena accesible inferior a 5-10 disacáridos. Esto sería un compuesto no adecuado para mantener una biodegradación mínima in vivo.

Sin embargo, el fin de obtener un HA reticulado con un peso molecular de desde 50.000 hasta 100.000 afrontaba el problema de la dificultad objetiva de obtener un producto que tenga las características morfológicas adecuadas para un uso en seres humanos, por medio de un procedimiento seguro y sencillo.

De hecho, a pesar de varias referencias de hialuronatos reticulados de bajo peso molecular, la bibliografía no divulga hidrogeles de HA reticulados de bajo peso molecular sólidos, sino viscoelásticos y transparentes a partir de un hialuronato de 50.000-100.000 Da para su uso como materiales de carga de viscosuplementación en seres humanos para ser utilizados también en formas inyectables.

Por ejemplo, el documento WO 2005/066215 da a conocer soluciones de gel a base de un polímero de PM ultrabajo de diversos HA de PM ultrabajo (< 500 KDa), incluyendo una solución de HA de 60 KDa, pero no describe ningún gel sólido y transparente de un hA reticulado de 60.000 Da.

Junju Kim et al. (J Materials Science: Materials in Medicine, 2008, 19/11, 3311-3318) dan a conocer un ácido hialurónico reticulado de 50.000 Da, preparado a partir de un HA acrilado utilizando un polipéptido como agente reticulante, como un hidrogel para experimentos científicos, pero no describen ningún hidrogel de HA reticulado no derivado viscoelástico, sólido y transparente de 50.000 Da adecuado como material de carga de suplementación.

El documento GB 2401043 da a conocer la preparación de un gel degradable por ácido hialurónico reticulante junto con un fármaco, que incluye la reticulación de un HA de 90 KDa utilizando éter diglicidílico de etilenglicol como agente reticulante, en presencia de danazol, pero no describe ningún hidrogel de HA reticulado viscoelástico, sólido y transparente de 90.000 Da adecuado como material de carga de suplementación. Por el contrario, este documento hace hincapié en la degradabilidad del sistema simplemente en vista de su uso como vehículo de un fármaco. El documento WO 2010/029344 da a conocer la preparación de un criogel a partir de gel hialurónico de distinto peso molecular, incluyendo un sustrato de 50.000 Da, reticulado con 3-glicidoxipropiltrimetoxisilano y un sustrato de 100.000 Da, reticulado con metacrilato glicidílico, N,N-metilen-bis-acrilamida y N,N,N',N'-tetrametilendiamina utilizando el procedimiento clásico utilizado para fabricar el gel de poliacrilamida para la electroforesis, pero dicho documento no da a conocer ningún hidrogel de HA reticulado viscoelástico, sólido y transparente de 50.000 Da o 100.000 Da. Por el contrario, el producto obtenido es un criogel esponjoso.

El documento WO 90/09401 da a conocer un procedimiento para reticular ácido hialurónico sometiendo a una solución de ácido hialurónico utilizando un reactivo que contiene fósforo y la preparación de un hialuronato de sodio de 100.000 Da reticulado con POCh, es decir con un agente explosivo potencialmente peligroso, pero el documento no describe ningún hidrogel de HA reticulado viscoelástico, sólido y transparente de 100.000 Da adecuado como material de carga de suplementación, debido a que el producto obtenido es un gel opalescente quebradizo. Según este documento, los geles obtenidos según el documento EP 272300 mencionado anteriormente, que da a conocer la reticulación mediante BDDE, no pueden ser preparados en forma inyectable.

Al aplicar el procedimiento del documento US 2005/0281880 mencionado anteriormente, es decir haciendo reaccionar hialuronato de sodio (Na-HA) con BDDE en las condiciones descritas en el mismo, no se obtiene ningún hidrogel debido a que bien no se forma un producto reticulado o bien el producto posiblemente formado permanece en solución.

En realidad, la bibliografía no da a conocer hidrogeles de HA reticulados viscoelásticos, semisólidos y transparentes (claros) de bajo peso molecular (50.000-100.000 kDa).

Ahora, se ha descubierto que, al aplicar la reacción reticulante a hialuronato de sodio de bajo peso molecular, pero no a hialuronato de sodio de peso molecular muy bajo para prolongar la vida media del compuesto evitando cualquier toxicidad, utilizando, en particular, un sustrato de hialuronato de sodio que tiene un peso molecular medio desde 50.000 Da hasta 100.000 Da, utilizando éter diglicidílico de 1,4-butanodiol (BDDE) como agente reticulante en condiciones precisas, se obtiene un hidrogel de hialuronato de sodio reticulado viscoelástico, semisólido y transparente (claro) que es muy resistente a la degradación por la hialuronidasa bacteriana.

De hecho, se ha descubierto que, al llevar a cabo la reacción reticulante en condiciones particulares, es decir utilizando un sustrato de hialuronato de sodio de peso molecular medio de 100.000 Da en hidróxido de sodio al 1% a una concentración de desde un 18% hasta un 22% y el agente reticulante en una relación molar de HA-Na/agente reticulante desde 1:55 hasta 1:60 es posible obtener un hidrogel para su uso para la viscosuplementación que tiene una resistencia a la degradación por la hialuronidasa mucho mayor que la del hialuronato de sodio reticulado de alto peso molecular, confirmando, por lo tanto, la hipótesis que los presentes inventores ilustran en los Antecedentes de la invención.

Además, se ha descubierto que es posible obtener hidrogeles de hialuronatos reticulados viscoelásticos, semisólidos y transparentes de bajo peso molecular haciendo reaccionar una solución al 8-40% de un hialuronato de sodio que tiene un peso molecular medio de desde 50.000 hasta 100.000 Da en una solución acuosa al 0,75%-1,5% de hidróxido de sodio con una cantidad de éter diglicidílico de 1,4-butanodiol correspondiente a desde 180 moles hasta 500 moles por mol del hialuronato de sodio.

Sorprendentemente, también se ha descubierto que los HA reticulados con BDDE de desde 50.000 Da hasta 100.000 Da obtenidos de esta manera no son en ningún caso esponjosos o muy porosos como los descritos en la bibliografía, en particular como el correspondiente hialuronano nativo reticulado, reticulado con BDDE, descrito por G. D. Prestwich en la reseña “Biomaterials from Chemically-Modified Hyaluronan” Glycoforum.gr.jp/science/hyaluronan/HA18/HA18E.html, sino que son productos viscoelásticos, semisólidos y claros que están particularmente adaptados como materiales de carga de viscosuplementación.

Breve descripción de los dibujos

- La Figura 1 ilustra la cinética enzimática del hidrogel de hialuronato de sodio reticulado de 1.000 KDa de la PREPARACIÓN 1 en comparación con la del hialuronato de sodio nativo.

- La Figura 2 ilustra la cinética enzimática del hidrogel de hialuronato de sodio reticulado de 100 KDa del Ejemplo 1 en comparación con la del hialuronato de sodio nativo de 1.000 KDa y con la del hialuronato de sodio nativo de 100 KDa.

- La Figura 3 ilustra la cinética enzimática del hidrogel de hialuronato de sodio reticulado de 100 KDa del Ejemplo 1 en comparación con la del hialuronato de sodio reticulado comercial.

- La Figura 4 ilustra la cinética enzimática de hidrogeles de hialuronato de sodio nativo de 100 KDa y de hialuronato de sodio reticulado de 100 KDa de los Ejemplos 1-3.

- La Figura 5 ilustra la cinética enzimática de hidrogeles de hialuronato de sodio nativo de 50 KDa y de hialuronato de sodio reticulado de 50 KDa de los Ejemplos 5-6 y del hidrogel de hialuronato de sodio reticulado de 100 KDa del Ejemplo 1.

- La Figura 6 ilustra el perfil de HPLC-GPC de ácido hialurónico con un peso molecular de 1.000 Kd despolimerizado con hialuronidasa de mamífero tras 7 horas de reacción. Se indican en el cromatograma las señales de dodeca (14,09 min), octa (14,84 min), hexa (15,22 min) y tetrasacáridos (15,68).

- La Figura 7 ilustra el perfil de HPLC-GPC de un producto reticulado comercial (Durolane) despolimerizado con hialuronidasa de mamífero tras 7 horas de reacción. Se indican en el cromatograma las señales de oligómeros de alto peso molecular superior a (10,46 min) e inferior a 25.000 Da (11,24 min) y las señales de dodeca (14,09 min), octa (14,84 min), hexa (15,22 min) y tetrasacáridos (15,69 min).

- La Figura 8 ilustra el perfil de HPLC-GPC de ácido hialurónico reticulado con peso molecular de 1.000 Kd despolimerizado con hialuronidasa de mamífero tras 7 horas de reacción. Se indican en el cromatograma las señales de deca (14,17 min), octa (14,80 min), hexa (15,22 min) y tetrasacáridos (15,88 min).

- La Figura 9 ilustra el perfil de HPLC-GPC de ácido hialurónico reticulado con peso molecular de 100 Kd despolimerizado con hialuronidasa de mamífero tras 7 horas de reacción. Se indican en el cromatograma las señales de tetrasacáridos (15,88 min).

- La Figura 10 ilustra el perfil de HPLC-GPC de ácido hialurónico con peso molecular de 1.000 Kd despolimerizado con hialuronidasa de mamífero tras 48 horas de reacción. Se indican en el cromatograma las señales de octa (14,90 min), hexa (15,22 min) y tetrasacáridos (15,66 min).

- La Figura 11 ilustra el perfil de HPLC-GPC de un producto reticulado comercial (Durolane) despolimerizado con hialuronidasa de mamífero tras 48 horas de reacción. Se indican en el cromatograma las señales de octa (14,91 min), hexa (15,21 min) y tetrasacáridos (15,66 min).

- La Figura 12 ilustra el perfil de HPLC-GPC de ácido hialurónico reticulado con peso molecular de 1.000 Kd despolimerizedo con hialuronidasa de mamífero tras 48 horas de reacción. Se indican en el cromatograma las señales de deca (14,42 min), octa (14,81 min), hexa (15,18 min) y tetrasacáridos (15,65 min).

- La Figura 13 ilustra el perfil de HPLC-GPC de ácido hialurónico con peso molecular de 100 Kd tratado con hialuronidasa de mamífero tras 48 horas de reacción. Se indican en el cromatograma las señales de octa (14,93 min), hexa (15,18 min) y tetrasacáridos (15,65 min).

- La Figura 14 ilustra el hidrogel sólido claro del ejemplo 1.

- La Figura 15 ilustra el hidrogel sólido claro del ejemplo 4.

Descripción detallada

De esta manera, la presente invención proporciona un procedimiento para la preparación de un hidrogel de hialuronato de sodio reticulado viscoelástico, sólido y transparente formado por un sustrato de hialuronato de sodio que tiene un peso molecular medio de desde 50.000 Da hasta 100.000 Da, reticulado con BDDE.

La invención también proporciona el hidrogel de ácido hialurónico reticulado de bajo peso molecular obtenido mediante el procedimiento.

Los hialuronatos de sodio de bajo peso molecular reticulados con BDDE se preparan haciendo reaccionar un sustrato de hialuronato de sodio que tiene un peso molecular medio entre 50.000 y 100.000 con éter diglicidílico de 1,4-butanodiol, en una relación molar de desde 1/180 hasta 1/500, en una solución acuosa de hidróxido de sodio. La reacción reticulante es llevada a cabo haciendo reaccionar una solución al 8%-40% de hialuronato de sodio con un peso molecular medio de desde 50.000 hasta 100.000 en una solución acuosa de hidróxido de sodio al 0,75%-1,5% con una cantidad de agente reticulante de desde 180 moles hasta 500 moles por mol de hialuronato de sodio.

Por lo tanto, un objeto de la presente invención es proporcionar un hidrogel de hialuronato viscoelástico, sólido y transparente de bajo peso molecular que puede obtenerse mediante un procedimiento que comprende hacer reaccionar una solución al 8%-40% de un hialuronato de sodio que tiene un peso molecular medio de desde 50.000 hasta 100.000 Da en una solución acuosa de hidróxido de sodio con una cantidad de éter diglicidílico de 1,4-butanodiol de desde 180 moles hasta 500 moles por mol de hialuronato de sodio.

Según una realización particular, el procedimiento que da los hialuronatos reticulados de la presente invención es llevado a cabo en las anteriores condiciones, a partir de un hialuronato de sodio que tiene un peso molecular medio de desde 50.000 hasta 100.000 Da, a una temperatura de desde 45 hasta 60 °C durante un periodo de tiempo desde 3 hasta 8 horas.

También es un objeto de la presente invención proporcionar un procedimiento para la preparación de hidrogel de hialuronato de sodio reticulado viscoelástico, sólido y transparente de bajo peso molecular, que comprende hacer reaccionar una solución al 8-40% de un hialuronato de sodio que tiene un peso molecular medio de desde 50.000 hasta 100.000 Da en una solución acuosa al 0,75%-1,5% de hidróxido de sodio con una cantidad de éter diglicidílico de 1,4-butanodiol correspondiente a desde 180 moles hasta 500 moles por mol del sustrato de hialuronato de sodio a una temperatura de desde 45 hasta 60 °C durante un periodo de tiempo desde 3 hasta 8 horas.

Sin embargo, también puede obtenerse un hidrogel de HA (hialuronato) reticulado viscoelástico, sólido y transparente a partir de un sustrato de hialuronato de sodio que tiene un peso molecular medio de 100.000 Da operando en una gama más amplia de condiciones, en particular utilizando un intervalo más amplio de relación de agente reticulante/HA. De hecho, también puede obtenerse tal hidrogel haciendo reaccionar una solución al 8-40% de un hialuronato de sodio que tiene un peso molecular medio de 100.000 Da en una solución acuosa al 0,75%-1,5% de hidróxido de sodio con una cantidad de éter diglicidílico de 1,4-butanodiol correspondiente a desde 55 moles hasta 500 moles por mol del sustrato de hialuronato de sodio a una temperatura de desde 42 hasta 60 °C durante un periodo de tiempo desde 3 hasta 8 horas.

Según una realización preferida, un hialuronato de sodio que tiene que tiene un peso molecular medio de 100.000 Da se disuelve a concentraciones desde 18% hasta 22% en una solución de hidróxido de sodio al 0,75 - 1,25%, se añade la solución obtenida al éter diglicidílico de 1,4-butanodiol como agente reticulante en una cantidad molar de desde 55 hasta 80 moles de agente reticulante por mol de hialuronato y se calienta la solución a 45-55°C durante 4-6 horas.

Al final de la reacción, se purifica el hidrogel de hialuronato de sodio reticulado con BDDE obtenido de esta manera a partir de reactivos que no han reaccionado y de sales mediante procedimientos conocidos de lavado, en particular utilizando tampón fosfato y agua, y es aislado como un hidrogel transparente, viscoelástico semisólido.

Según otra realización, se disuelve un hialuronato de sodio que tiene un peso molecular medio de 100.000 Da a concentraciones desde 18% hasta 22% en una solución de hidróxido de sodio al 0,75 a 1,25%, se añade la solución obtenida al éter diglicidílico de 1,4-butanodiol como el agente reticulante en una cantidad molar de desde 55 hasta 60 moles de agente reticulante por mol de hialuronato y se calienta la solución a 42-55°C durante 4-6 horas.

De esta manera, la presente invención también proporciona un procedimiento para la preparación de un hialuronato reticulado viscoelástico, semisólido y transparente que comprende hacer reaccionar una solución al 18%-22% de hialuronato de sodio que tiene un peso molecular medio de 100.000 Da en una solución acuosa de hidróxido de sodio al 0,75%-1,25% con éter diglicidílico de 1,4-butanodiol, en una cantidad molar de desde 55 moles hasta 65 moles por mol de hialuronato de sodio, a una temperatura de 42-55 °C durante un periodo de tiempo desde 4 hasta 6 horas.

Los HA reticulados de la presente invención pueden ser utilizados como materiales de carga de viscosuplementación para tratar enfermedades articulares o como material de carga para un tratamiento de relajación tisular (arrugas). Para tal uso, el hidrogel de hialuronato de sodio reticulado purificado de bajo peso molecular puede ser micronizado, esterilizado y presentado como una forma unitaria, tal como en una jeringa.

De esta manera, la presente invención proporciona, además, un material de carga de viscosuplementación que comprende un hidrogel de hialuronato de sodio reticulado que puede obtenerse haciendo reaccionar un hialuronato de sodio que tiene un peso molecular medio de 100.000 Da, disuelto a una concentración de desde 18% hasta 22% en una solución de hidróxido de sodio al 0,75 - 1,25%, con éter diglicidílico de 1,4-butanodiol (BDDE), en una cantidad molar de desde 55 hasta 60 moles por mol de hialuronato de sodio, a 42-55 °C, preferiblemente a 45-55°C durante 4 6 horas, purificado y opcionalmente micronizado y esterilizado.

El uso de los HA reticulados de la invención para su uso en aplicaciones biomédicas, farmacéuticas y cosméticas constituye otro aspecto de la invención.

El uso del HA reticulado de la invención como material de carga de viscosuplementación constituye otro aspecto de la invención.

Los siguientes ejemplos ilustran la invención.

PREPARACIÓN I (Ejemplo comparativo)

Se disolvió una cantidad de 1 g de polvo de hialuronato de sodio con un peso molecular medio de 1.000 KDa (Shiseido) en 4,5 ml de NaOH al 1% (solución al 11% en peso en NaOH 0,25M). Se mantuvo la solución a temperatura ambiente durante 4 horas bajo agitación y luego fue reticulada a 50°C durante 5 horas en presencia de 60 ml de éter diglicidílico de butanodiol (BDDe ). Se dejó el hialuronato de sodio reticulado en tampón fosfato 0,067 M con un pH de 7,4 y luego fue lavado tres veces con el mismo tampón y tres veces con agua. Se obtuvo, de esta manera, un hidrogel semisólido transparente constituido por un hialuronato de sodio reticulado de 1.000 KDa.

PREPARACIÓN ESTÁNDAR A

Solución de HA nativo de 1000 KDa

Se disolvió una cantidad de 10 mg de hialuronato de sodio con un peso molecular medio de 1.000 KDa utilizado como sustrato en la PREPARACIÓN I en 10 ml de tampón acetato 0,2 M con un pH de 5,6 que contenía 140 mM de NaCl y se dejó para que se hidratara durante la noche a temperatura ambiente.

PREPARACIÓN ESTÁNDAR B

Solución de HA nativo de 100 KDa

Se disolvió una cantidad de 10 mg de hialuronato de sodio con un peso molecular medio de 100 KDa (Shiseido) en 10 ml de tampón acetato 0,2 M con un pH de 5,6 que contenía 140 mM de NaCl y se dejó para que se hidratara durante la noche a temperatura ambiente.

PREPARACIÓN ESTÁNDAR C

Solución de HA nativo de 50 KDa

Se disolvió una cantidad de 10 mg de hialuronato de sodio con un peso molecular medio de 50 KDa (Shiseido) en 10 ml de tampón acetato 0,2 M con un pH de 5,6 que contenía 140 mM de NaCl y se dejó para que se hidratara durante la noche a temperatura ambiente.

PREPARACIÓN DE MUESTRA D

Solución de HA reticulado de 1000 KDa

Se disolvió una cantidad de 10 mg de muestra preparada según se ha descrito en la PREPARACIÓN I en 10 ml de tampón acetato 0,2 M con un pH de 5,6 que contenía 140 mM de NaCl.

PREPARACIÓN DE MUESTRA E

Solución de HA reticulado de 100 KDa

Se disolvió una cantidad de 10 mg de muestra preparada según se describe en el siguiente Ejemplo 1 en 10 ml de tampón acetato 0,2 M con un pH de 5,6 que contenía 140 mM de NaCl.

PREPARACIÓN DE MUESTRA F

Solución de HA reticulado de 100 KDa

Se disolvió una cantidad de 10 mg de muestra preparada según se describe en el siguiente Ejemplo 2 en 10 ml de tampón acetato 0,2 M con un pH de 5,6 que contenía 140 mM de NaCl.

PREPARACIÓN DE MUESTRA G

Solución de HA reticulado de 100 KDa

Se disolvió una cantidad de 10 mg de muestra preparada según se describe en el siguiente Ejemplo 3 en 10 ml de tampón acetato 0,2 M con un pH de 5,6 que contenía 140 mM de NaCl.

PREPARACIÓN DE MUESTRA H

Solución de HA reticulado de 50 KDa

Se disolvió una cantidad de 10 mg de muestra preparada según se describe en el siguiente Ejemplo 5 en 10 ml de tampón acetato 0,2 M con un pH de 5,6 que contenía 140 mM de NaCl.

PREPARACIÓN DE MUESTRA J

Solución de HA reticulado de 50 KDa

Se disolvió una cantidad de 10 mg de muestra preparada según se describe en el siguiente Ejemplo 6 en 10 ml de tampón acetato 0,2 M con un pH de 5,6 que contenía 140 mM de NaCl.

PREPARACIÓN K

Solución de HA reticulado comercial

Se disolvió una cantidad de 14 mg de un HA reticulado comercial líquido en 14 ml de tampón acetato 0,2M con un pH de 5,6 que contenía 140 mM de NaCl.

EJEMPLO 1

Preparación de NaHA reticulado a partir de un sustrato de NaHA de 100 KDa

Se disolvió una cantidad de 500 mg de hialuronato de sodio en polvo con un peso molecular medio de 100 KDa (Shiseido) en 2,5 ml de NaOH al 1% (solución al 20% en peso en NaOH 0,25M). Se mantuvo la solución a temperatura ambiente durante 4 horas bajo agitación y luego fue reticulada a 50°C durante 5 horas en presencia de 60 |il de éter diglicidílico de butanodiol (BDDE), correspondiente a 58 moles de BDDE por mol de HA-Na. Se dejó el ácido hialurónico reticulado en tampón fosfato 0,067 M con un pH de 7,4 y luego fue lavado tres veces con el mismo tampón y tres veces con agua para dar un hidrogel transparente sólido constituido por un hialuronato de sodio reticulado de 100 KDa.

EJEMPLO 2

Preparación de NaHA reticulado a partir de un sustrato de NaHA de 100 KDa

Se disolvió una cantidad de 1,1 g de hialuronato de sodio en polvo con un peso molecular medio de 100 KDa como el usado en el Ejemplo 1 en 10 ml de NaOH al 1% (solución al 11% en peso en NaOH 0,25M). Se mantuvo la solución a temperatura ambiente durante 4 horas bajo agitación y luego fue reticulada a 50°C durante 5 horas en presencia de 1 ml de éter diglicidílico de butanodiol (BDDE), correspondiente a 445 moles de BDDE por mol de HA-Na. Se dejó el ácido hialurónico reticulado en tampón fosfato 0,067 M con un pH de 7,4 y luego fue lavado tres veces con el mismo tampón y tres veces con agua para dar un hidrogel transparente sólido constituido por un hialuronato de sodio reticulado de 100 KDa.

EJEMPLO 3

Preparación de NaHA reticulado a partir de un sustrato de NaHA de 100 KDa

Se disolvió una cantidad de 400 mg de hialuronato de sodio en polvo con un peso molecular medio de 100 KDa como el usado en el Ejemplo 1 en 1 ml de NaOH al 1,3% (solución al 40% en peso). Se mantuvo la solución a temperatura ambiente durante 4 horas bajo agitación y luego fue reticulada a 50°C durante 5 horas en presencia de 300 |il de éter diglicidílico de butanodiol (BDDE), correspondiente a 408 moles de BDDE por mol de HA-Na. Se dejó el ácido hialurónico reticulado en tampón fosfato 0,067 M con un pH de 7,4 y luego fue lavado tres veces con el mismo tampón y tres veces con agua para dar un hidrogel transparente sólido constituido por un hialuronato de sodio reticulado de 100 KDa.

EJEMPLO 4

Se disolvió una cantidad de 500 mg de hialuronato de sodio en polvo con un peso molecular medio de 100 KDa (Shiseido) en 2,5 ml de NaOH al 1% (solución al 20% en peso en NaOH 0,25M). Se mantuvo la solución a temperatura ambiente durante 4 horas bajo agitación y luego fue reticulada a 42°C durante 5 horas en presencia de 60 |il de éter diglicidílico de butanodiol (BDDE), correspondiente a 58 moles de BDDE por mol de HA. Se dejó el ácido hialurónico reticulado en tampón fosfato 0,067 M con un pH de 7,4 y luego fue lavado tres veces con el mismo tampón y tres veces con agua para dar un hidrogel transparente sólido constituido por un hialuronato de sodio reticulado de 100 KDa. Se obtuvo un hidrogel sólido transparente.

EJEMPLO 5

Preparación de NaHA reticulado a partir de un sustrato de NaHA de 50 KDa

Se disolvió una cantidad de 1,1 mg de hialuronato de sodio en polvo con un peso molecular medio de 50 KDa en 10 ml de NaOH al 1% (solución al 11% en peso). Se mantuvo la solución a temperatura ambiente durante 4 horas bajo agitación y luego fue reticulada a 50°C durante 4 horas en presencia de 1 ml de éter diglicidílico de butanodiol (BDDE), correspondiente a 222 moles de BDDE por mol de HA-Na. Se dejó el ácido hialurónico reticulado en tampón fosfato 0,067 M con un pH de 7,4 y luego fue lavado tres veces con el mismo tampón y tres veces con agua para dar un hidrogel transparente sólido constituido por un hialuronato de sodio reticulado de 50 KDa.

EJEMPLO 6

Preparación de NaHA reticulado a partir de un sustrato de NaHA de 50 KDa

Se disolvió una cantidad de 400 mg de hialuronato de sodio en polvo con un peso molecular medio de 50 KDa en 1 ml de NaOH al 1,3% (solución al 40% en peso). Se mantuvo la solución a temperatura ambiente durante 4 horas bajo agitación y luego fue reticulada a 50°C durante 4 horas en presencia de 300 |il de éter diglicidílico de butanodiol (BDDE), correspondiente a 185 moles de BDDE por mol de HA-Na. Se dejó el ácido hialurónico reticulado en tampón fosfato 0,067 M con un pH de 7,4 y luego fue lavado tres veces con el mismo tampón y tres veces con agua para dar un hidrogel transparente sólido constituido por un hialuronato de sodio reticulado de 50 KDa.

EJEMPLO 7

Procedimiento para determinar la cinética enzimática

Se vertió un volumen de 1 ml de cada una de las diez Preparaciones A-K (sustrato) en un vial a oscuras. Se llevó la solución hasta 37°C en un baño de agua bajo agitación lenta. Por separado, se preparó una solución de hialuronidasa (solución enzimática) disolviendo el contenido de un vial de hialuronidasa de Streptomyces hyalurolyticus (SIGMA cat. N H1136) en 1 ml de tampón acetato 0,2 M con un pH de 5,6 que contiene 1 mg/ml de albúmina de suero bovino (BSA, por sus siglas en inglés) como estabilizador. Se añadió un volumen de 200 |il de la solución enzimática obtenida de esta manera al vial de reacción del sustrato y se tomaron alícuotas de 100 |il a intervalos regulares y se detuvo la reacción con la adición de 1 ml de KCl 50 mM con un pH de 1,8. Después de una centrifugación a 3000 rpm durante 20 minutos a 4°C, se detectó la absorbancia de la solución a 235 nm.

EJEMPLO 8

Comparación de cinéticas enzimáticas

En la Tabla 1, se documentan las absorbancias del ácido hialurónico de la Preparación estándar A y de la Preparación reticulada de muestra D, determinadas según el procedimiento del Ejemplo 7 en los distintos intervalos de tiempo.

Tabla 1

Horas HA estándar 1000 KDa (A) Reticulado 1000 KDa (D)

0 0,0 0

1 230,9 40,9

2 290,0 52,6

3 291,3 53,7

18 306,5 91,2

20 310,1 93,4

23 313,4 99,8

En la Figura 1 se da la cinética de degradación por la hialuronidasa de los dos productos de la Tabla 1. Esta comparación muestra que, a la hora 23a, la degradación de los HA reticulados de 1000 KDa es aproximadamente tres veces menor que la del HA estándar de 1000 KDa.

EJEMPLO 9

Comparación de cinéticas enzimáticas

En la Tabla 2, se documentan las absorbancias del ácido hialurónico de la Preparación estándar A, de la Preparación estándar B y de la Preparación reticulada de muestra E de la presente invención, determinadas según el procedimiento del Ejemplo 7 en los distintos intervalos de tiempo.

Tabla 2

Horas HA estándar 1000 KDa (A) HA estándar 100 KDa (B) Reticulado 100 KDa (E)

0 0,0 0 0

1 230,9 138,8 16,2

2 290,0 181,6 17,7

3 296,1 189,2 18,0

23 313,4 200,5 23,4

25 316,5 201,3 22,4

En la Figura 2 se da la cinética de degradación por la hialuronidasa de los tres productos de la Tabla 2. Esta comparación muestra que, a la hora 25a, la degradación de los HA reticulados de 100 KDa del ejemplo 1 de la presente invención es aproximadamente catorce veces menor que la del HA estándar de 1000 KDa y aproximadamente nueve veces menor que la del HA estándar de 100 KDa.

EJEMPLO 10

Comparación de cinéticas enzimáticas

En la Tabla 3, se documentan las absorbancias del ácido hialurónico reticulado comercial de la Preparación K y de la Preparación reticulada de muestra E de la presente invención, determinadas según el procedimiento del Ejemplo 7 en los distintos intervalos de tiempo.

Tabla 3

Horas HA reticulado comercial (K) HA reticulado 100 KDa (E)

0 0 0

1 24,8 4,7

2 30,0 8,1

3 35,6 11,1

4 37,7 13,0

24 39,9 13,5

26 40,2 13,7

28 40,4 13,4

En la Figura 3 se da la cinética de degradación por la hialuronidasa de los dos productos de la Tabla 3. Esta comparación muestra que, a la hora 28a, la degradación de los HA reticulados de 100 KDa del ejemplo 1 de la presente invención es aproximadamente tres veces menor que la del HA comercial de 1000 KDa.

EJEMPLO 11

Comparación de cinéticas enzimáticas

En la Tabla 4, se documentan las absorbancias del HA nativo de 100 KDa de la Preparación B y de las Preparaciones reticuladas de muestra E, F, G de la presente invención, determinadas según el procedimiento del Ejemplo 7 en los distintos intervalos de tiempo.

Tabla 4

horas HA 100K (B) 100 KDa 11% (F) 100 KDa 40% (G) 100 KDa 20% (E)

0 0 0 0 0

1 164,9 19,2 25,4 9,2

2 197,2 23,4 27,1 15,9

3 223,3 24,9 29,1 22

4 240,4 28,3 35,4 24,5

24 242 28,7 36 26,9

26 243,2 28,3 38,1 28,5

28 241,9 27,8 37 29,2

En la Figura 4 se da la cinética de degradación por la hialuronidasa de los cuatro productos de la Tabla 4. Esta comparación muestra que, a la hora 28a, la cinética de degradación del HA reticulado de 100 KDa de los Ejemplos 1, 2 y 3 de la presente invención es desde 6 hasta 8 veces menor que la del material nativo de 100 KDa de la PREPARACIÓN B.

EJEMPLO 12

Comparación de cinéticas enzimáticas

En la Tabla 5, se documentan las absorbancias del HA nativo de 50 KDa de la Preparación C y de las Preparaciones reticuladas de muestra H y J de la presente invención, determinadas según el procedimiento del Ejemplo 7 en los distintos intervalos de tiempo.

Tabla 5

horas HA estándar 50 50 KDa 11% (H) 50 KDa 40% (J) 100 KDa 20% (E)

KDa (C)

0 0 0 0 0

1 88,6 9 19,7 10,7

2 120,3 10,2 20,6 12,9

3 133,2 13,4 21,5 17,1

4 145,2 17,5 24,4 20,1

24 145,3 17,5 33,3 26,8

26 145,8 17,7 34,8 27,5

28 145,6 17,7 34,5 28

30 146 17,8 34,7 29,2

En la Figura 5 se da la cinética de degradación por la hialuronidasa de los cuatro productos de la Tabla 5. Esta comparación muestra que, a la hora 30a, la cinética de degradación del HA reticulado de 50 KDa de los ejemplos 5 y 6 de la presente invención es desde 4 hasta 8 veces menor que la del material de partida de 50 KDa de la PREPARACIÓN C. También tienen la misma resistencia o una vida media más resistente a la despolimerización enzimática que la muestra reticulada de 1000 KDa del ejemplo 1.

EJEMPLO 13

Despolimerización con hialuronidasa de mamífero

Para investigar in vitro la resistencia a las enzimas del hidrogel en la situación patológica de pacientes artrósicos en los que hay una sobreproducción de hialuronidasa, se despolimerizó el hidrogel semisólido del ejemplo 1 en presencia de exceso de hialuronidasa de mamífero en comparación con un ácido hialurónico reticulado comercial, un ácido hialurónico de 1.000.000 Da y un ácido hialurónico reticulado de 1.000.000 Da sintetizados con la misma reacción del producto del ejemplo 1 y los productos de reacción fueron analizados mediante HPLC-GPC.

Se disolvió una cantidad de 6 mg de muestra en 2 ml de tampón fosfato 0,3 M con un pH de 5,5 y se dejó durante la noche a temperatura ambiente. Entonces, se diluyó 1:10 la solución con el mismo tampón y se añadieron 0,5 ml de tampón fosfato 20 mM que contenía 77 mM de NaCl con un pH 7,0 a 2 ml de muestra que había de ser despolimerizada. Se mantuvo la solución a 37°C.

Se disolvió una cantidad de 10 mg de hialuronidasa tipo IV procedente de un testículo bovino (SIGMA-ALDRICH) en 14,92 ml de tampón fosfato 20 mM que contenía 77 mM de NaCl con un pH de 7,0 y se diluyó 1:25 con el mismo tampón para contar con 40 U/ml. Se mantuvo la solución enzimática a 37°C durante 10 minutos. Entonces, se añadieron 1,5 ml de solución enzimática a la solución de muestra a 37°C y se dejó que reaccionasen durante 7 horas. Se retiró un volumen de 1 ml de la mezcla de reacción y se detuvo la reacción mediante ebullición a 100°C. Antes del análisis por HPLC, se filtró la muestra con una membrana de 0,2 |im.

Tras 8 horas de reacción, se añadieron 750 |il de enzima a cada muestra y se continuó la reacción durante 40 horas adicionales. Al final, se detuvo la reacción mediante ebullición a 100°C, filtrada con una membrana de 0,2 |im y analizada mediante HPLC.

El ensayo se llevó a cabo por medio de un instrumento de HPLC con autoinyector, bomba y detector de radiación UV, con una columna GPC (Cosmosil Diol 120 II 5 um 7,5 x 300 mm con precolumna de Nacalai - EE. UU.) y tampón sulfato sódico 0,15 M como fase móvil isocrática con un flujo de 0,6 ml/min. Se filtraron las muestras a través de un filtro de 0,45 |im y se inyectaron 100 |il de solución en el sistema de HPLC. Se detectaron las señales a 205 nm durante todo el tiempo del ensayo (25 minutos). Se compararon los tiempos de retención (RT, por sus siglas en inglés) de las señales con los RT de estándares calibrados de oligosacáridos con los siguientes intervalos de RT:

Dodecasacárido : 13,80-14,05 min

Decasacárido : 14,05-14,45 min

Octasacárido : 14,70-15,00 min

Hexasacárido : 15,05-15,25 min

Tetrasacárido : 15,50-15,90 min

EJEMPLO 14

(Actividad biológica)

Se sometieron a ensayo sobre condrocitos dos muestras de ácido hialurónico reticulado, una muestra comercial (Durolane®, un Na-HA reticulado de alto peso molecular) y el hidrogel del Ejemplo 1 (GL 2570). Se recogieron condrocitos de 3 pacientes con osteoartritis, por lo tanto con una sobreproducción de enzimas de HA de degradación (hialuronidasas). Se añadieron cantidades crecientes de muestras (200, 500 y 1000 |ig/ml) a los cultivos celulares con distintas concentraciones celulares (12.000 y 22.500 células) y fueron sometidas a ensayo en distintos intervalos de tiempo (24, 48 y 72 horas). En el primer análisis, se analizó mediante microscopio la morfología de las células tras la adición de las muestras. La forma de las células parecía inalterada a todas las concentraciones. Entonces, se sometieron a ensayo células vivas y muertas con el equipo LIVE/DEAD Viability/Cytotoxicity n° cat L3224 (Invitrogen), en el que las células vivas tienen un color verde mientras que las células muertas tienen un color rojo. En ambos casos (Durolane y GL 2570) no se detectaron células rojas en todas las concentraciones en todos los momentos. El compuesto del Ejemplo 1 (GL 2570) no induce una muerte celular.

Para someter a ensayo el metabolismo celular correlacionado con la proliferación celular, se aplicó la prueba MTT (MTT n° cat. M-5655, SIGMA). No se detectaron diferencias tras la adición de la muestra a los condrocitos en todas las concentraciones y en todos los momentos.

Para evaluar la toxicidad celular de los productos, se midió la formación de LDH mediante el equipo Cytotoxicity Detection (LDH) n° cat. 11644793001 (ROCHE). LDH es un índice de la integridad de la membrana celular y es sobreproducido en presencia de un agente tóxico. En todas las muestras recogidas de condrocitos no se detectó ninguna toxicidad para ninguna de las dos muestras.

La proliferación fue sometida a ensayo midiendo la incorporación de timidina tritiada. La timidina es incorporada por las células para sintetizar nuevo a Dn para la nueva generación de células. En este ensayo, las dos muestras parecieron distintas. Al menos en un paciente la incorporación de timidina tritiada por células tratadas con Durolane aumenta a las 24 horas mientras que en células tratadas con GL 2570 la timidina tritiada no se incorpora hasta las 48 horas y luego aumenta ligeramente a las 72 horas, pero sin alcanzar el valor del Durolane. Esta diferencia se correlaciona con la resistencia a la acción de la hialuronidasa. En particular, en las primeras 24 horas el GL 2570 no es despolimerizado por la hialuronidasa y la capa del compuesto reticulado bloquea la incorporación de diversos agentes biológicos y químicos, incluyendo timidina tritiada. En cambio, el Durolane es degradado inmediatamente y no puede inhibir la penetración de sustancias en las células.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un procedimiento para la preparación de un hidrogel de hialuronato de sodio reticulado viscoelástico, sólido y transparente de bajo peso molecular, que comprende hacer reaccionar una solución al 8-40% de un sustrato de hialuronato de sodio que tiene un peso molecular medio de desde 50.000 Da hasta 100.000 Da en una solución acuosa al 0,75%-1,5% de hidróxido de sodio con una cantidad de éter diglicidílico de 1,4-butanodiol correspondiente a desde 180 moles hasta 500 moles por mol del sustrato de hialuronato de sodio a una temperatura de desde 45 hasta 60 °C durante un periodo de tiempo desde 3 hasta 8 horas.

2. Un procedimiento para la preparación de un hidrogel de hialuronato de sodio reticulado viscoelástico, sólido y transparente de bajo peso molecular, que comprende hacer reaccionar una solución al 8-40% de un sustrato de hialuronato de sodio que tiene un peso molecular medio de 100.000 Da en una solución acuosa al 0,75%-1,5% de hidróxido de sodio con una cantidad de éter diglicidílico de 1,4-butanodiol correspondiente a desde 55 moles hasta 500 moles por mol de dicho sustrato a una temperatura de desde 42°C hasta 60°C durante un periodo de tiempo desde 3 hasta 8 horas.

3. El procedimiento de la reivindicación 2, en el que la cantidad de éter diglicidílico de 1,4-butanodiol se corresponde a desde 55 moles hasta 60 moles por mol de dicho sustrato y la reacción se lleva a cabo a 45-55 °C durante 4-6 horas.

4. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado porque dicho procedimiento también comprende un procedimiento de lavado final utilizando tampón fosfato y agua.

5. El procedimiento de la reivindicación 1, caracterizado porque el hialuronato de sodio de partida tiene un peso molecular medio de 50.000 Da.

6. El procedimiento de la reivindicación 5, que comprende hacer reaccionar una solución acuosa al 11% de un hialuronato de sodio que tiene un peso molecular medio de 50.000 Da en una solución acuosa al 1% de hidróxido de sodio con una cantidad de éter diglicidílico de 1,4-butanodiol correspondiente a 222 moles por mol del sustrato de hialuronato de sodio a 50°C durante 4 horas.

7. Un hidrogel de hialuronato de sodio reticulado viscoelástico, sólido y transparente de bajo peso molecular, obtenido mediante el procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6.

8. El hidrogel de hialuronato de sodio de la reivindicación 7, para su uso en aplicaciones biomédicas, farmacéuticas y cosméticas.

9. El hidrogel de hialuronato de sodio para su uso según la reivindicación 8, como un material de carga de viscosuplementación.