CZ33901U1

CZ33901U1 - Prostředek pro použití k přípravě hydrogelu na bázi hydroxyfenylového derivátu hyaluronanu

Info

Publication number: CZ33901U1
Application number: CZ2019-36714U
Authority: CZ
Inventors: Martin Pravda; Lenka Kovářová; Ivana Ščigalková; Julie Bystroňová; Evgeniy Toropitsyn; Vladimír Velebný
Original assignee: Contipro A.S.
Priority date: 2019-06-10
Filing date: 2019-06-10
Publication date: 2020-04-07

Description

Úřad průmyslového vlastnictví v zápisném řízení nezjišťuje, zda předmět užitného vzoru splňuje podmínky způsobilosti k ochraně podle § 1 zák. ě. 478/1992 Sb.

Prostředek pro použití k přípravě hydrogelu na bázi hydroxyfenylového derivátu hyaluronanu

Oblast techniky

Technické řešení se týká prostředku, tzn. sady gelotvomých roztoků, sloužícího pro přípravu hydrogelů na bázi hydroxyfenylového derivátu hyaluronanu (HATA) s obsahem krve nebo transfůzních přípravků s obsahem fibrinogenu, které mohou sloužit jako biomateriály využitelné v oblasti tkáňového inženýrství, regenerativní medicíny a dalších medicínských oborech.

Dosavadní stav techniky

Polymemí hydrogely jsou důležitou skupinou materiálů, které slouží pro vývoj léčebných prostředků v oblasti tkáňového inženýrství a regenerativní medicíny. Polymemí hydrogely jsou v těchto oblastech využívány například jako matrice pro řízené uvolňování biologicky aktivních látek a kultivaci buněk, mohou sloužit k augmentaci měkkých tkání, jako dočasná náhrada mezibuněčné hmoty atd.

Z fyzikálně chemického hlediska je polymemí hydrogel disperzní systém složený z disperzního prostředí - vody a disperzního podílu, který je tvořen trojrozměrnou makromolekulám! sítí. Tato síť vytváří souvislou strukturu, která prostupuje celým disperzním prostředím. Spojité je tedy nejen disperzní prostředí, ale i disperzní podíl. Hydrogely jsou materiály s elastickými vlastnostmi, které jsou důsledkem přítomnosti této spojité trojrozměrné makromolekulám! sítě.

Podle povahy interakcí podílejících se na vzniku polymemí sítě můžeme gely rozdělit na fýzikálně síťované a chemicky síťované (kovalentní gely) [1]. Polymemí síť kovalentních hydrogelů může vznikat např. polymerací monomerů přítomných v roztoku nebo zesítěním původně lineárních řetězců prekurzorových polymerů. K tomu může dojít například vzájemnou reakcí vhodných funkčních skupin polymemích řetězců, nebo pomocí síťovacích činidel obsahujících dvě nebo více funkčních skupin schopných reagovat s výchozím polymerem. Během síťování postupně narůstá velikost polymemí sítě až do okamžiku, kdy prostoupí celý objem disperzní soustavy. Vznik této nekonečné trojrozměrně sítě se označuje jako bod gelace. Nárůst počtu uzlových bodů sítě a počtu zúčastněních polymemích řetězců se ovšem v tomto bodě nemusí zastavit. Hmotnost gelového podílu může i nadále růst na úkor hmotnosti disperzního prostředí. Další průběh síťovací reakce pak vede ke zvýšení hustoty zesítění hydrogelu, která může ovlivňovat např. stabilitu, mechanické vlastnosti a difůsní parametry prostředí hydrogelu.

V řadě medicínských aplikací je výhodné, aby ke vzniku polymemí sítě a zformování hydrogelu došlo přímo v místě určeném pro aplikaci materiálu neboli in sítu [2, 3], Vznik hydrogelu může být vyvolán specifickými podmínkami (teplota, pH) nebo působením externích podnětů (fyzikálních - UV záření, chemických - iniciátor reakce, přídavek síťovacího činidla apod.).

Vhodná metoda využitelná pro přípravu gelu in šitu musí splňovat řadu parametrů:

• proces musí probíhat za fýziologických podmínek • kinetika vzniku gelu a jeho finální vlastnosti (hustota zesítění, mechanické vlastnosti, botnavost, difúze látek matricí gelu) musí být dokonale kontrolovatelné a reprodukovatelné • reaktanty ani produkty reakce nesmí působit toxicky • v případě biodegradabilních hydrogelů nesmí být degradační produkty toxické a musí být schopny podstoupit eliminaci z organismu.

Hyaluronan je polysacharid ze skupiny glykosaminoglykanů, který se skládá z disacharidických

- 1 CZ 33901 U1 jednotek složených z D-glukuronové kyseliny a JV-acetylglukosaminu. Jedná se o polysacharid, který je snadno rozpustný ve vodném prostředí, kde v závislosti na molekulové hmotnosti a koncentraci vytváří viskózní roztoky až viskoelastické hydrogely. Hyaluronan je přirozenou složkou mezibuněčné hmoty tkání. Vazbou na specifické povrchové buněčné receptory je molekula hyaluronanu schopna interagovat s buňkami ve svém okolí a regulovat jejich metabolické procesy [4], Hydrogely na bázi hyaluronanu v organismu podstupují přirozenou degradaci působením specifických enzymů (hyaluronidáz), popř. působením reaktivních forem kyslíku, díky čemuž dochází po jejich implantaci do organismu k jejich postupnému vstřebání [5], Pro dosažení mechanicky odolnějších materiálů a z důvodu zpomalení jejich biodegradace byla vyvinuta řada typů hydrogelů na bázi kovalentně zesítěného hyaluronanu. Takové hydrogely jsou často využívány jako materiály pro viskosuplementaci synoviální tekutiny, augmentaci měkkých tkání, podpůrné struktury pro kultivaci a implantaci buněk apod. [6-9],

V minulosti byly rovněž vyvinuty různé typy derivátů hyaluronanu, které jsou schopny podstupovat přechod sol-gel za fyziologických podmínek in sítu [10, 11], Pro tyto účely lze využít např. fenolické deriváty hyaluronanu. Calabro et al. [12-14] popisují ve spisech EP 1587945 Bl a EP 1773943 B1 postup přípravy fenolických derivátů hyaluronanu reakcí karboxylů přítomných ve struktuře D-glukuronové kyseliny hyaluronanu, s aminoalkyl-deriváty fenolu např. tyraminem. Produktem této reakce jsou amidy hyaluronanu [15],

Zesítění fenolických derivátů hyaluronanu může být iniciováno přídavkem peroxidázy (např. křenové peroxidázy) a zředěného roztoku peroxidu vodíku. Křenová peroxidáza (Horseradish peroxidase, HRP, E.C. 1.11.1.7) je v současné době široce využívána jako katalyzátor organických a biotransformačních reakcí [16-20], Hydrogely na bázi hydroxyfenylových derivátů hyaluronanu mohou být využívány jako injekčně aplikovatelné matrice pro řízené uvolňování látek nebo jako materiály vhodné pro kultivaci a implantaci buněk [21], Wolfová et al. popisují ve spisu CZ 303879 konjugát hyaluronanu a tyraminu obsahující alifatický linker vložený mezi řetězec polymeru a tyramin. Přítomnost alifatického linkeru umožňuje vyšší efektivitu síťovací reakce a dodává síti vyšší elasticitu.

Kurisawa et al. v dokumentu US 8853162 popisují způsob přípravy hydrogelů obsahující vzájemně se prostupující (interpenetrující) sítě na bázi hydroxyfenylového derivátu hyaluronanu a fibrinu. Pro zesítění hydroxyfenylového derivátu hyaluronanu metoda využívá reakci katalyzovanou křenovou peroxidázou. Fibrinová síť vzniká z fibrinogenu působením trombinu. Tento postup poskytuje hydrogely, které jsou ve srovnání s hydrogelem na bázi samotného fibrinu odolnější vůči biodegradačním pochodům. Hydrogely vzniklé kombinací fibrinové sítě a kovalentně zesítěných derivátů hyaluronanu jsou využívány jako matrice pro kultivaci buněk a v budoucnu se mohou uplatnit např. jako součást léčivých přípravků určených pro tkáňové inženýrství [22, 23], Nevýhodou tohoto řešení je využití krevních derivátů - trombinu a fibrinogenu - získaných zpracováním homologní krve. Tento proces je jednak nákladný a rovněž zcela neeliminuje nebezpečí přenosu infekčních chorob.

Zesítění hydrogelů je zprostředkováno reakcí katalyzovanou křenovou peroxidázou, která vede k oxidaci hydroxyfenylových jader tyraminu za vzniku jejich dimerů, popř. oligomerů. Peroxid vodíku je zdrojem hydroxylových radikálů pro reakce katalyzované křenovou peroxidázou a slouží tedy jako iniciátor síťovací reakce. V prostředí krevní plazmy či krve podléhá peroxid vodíku degradaci vlivem interakce s dalšími enzymy (např. kataláza, myeoloperoxidáza) [24, 25], popř. s hematinem přítomným v hemoglobinu [26], Jedná se o reakce, které konkurují křenovou peroxidázou zprostředkované síťovací reakci, což vede ke snížení účinnosti zesítění hydrogelů. Tento jev se v případě využití krevní plazmy projeví delším časem gelace a nižším elastickým modulem vzniklého hydrogelů. V případě přípravy hydrogelů s obsahem plné krve pak tento jev může vést až k selhání procesu formování hydrogelů.

Krev a z ní připravované transfůzní přípravky jsou v oblasti regenerativní medicíny využívány jako zdroje řady biologicky aktivních látek, které se podílejí na hojení tkáňových defektů,

-2CZ 33901 U1 regulaci zánětlivé reakce, diferenciaci progenitorových buněk apod. [27, 28],

Možnost využití kombinace in sítu síťujícího hydrogelu a krve jako materiálu pro podporu hojení tkáňových defektů jez klinického pohledu výhodná, protože nevyžaduje přípravu transfuzního přípravku ani výrobu krevního derivátu. Možnost využití autologní krve zároveň eliminuje riziko přenosu infekčních chorob. Kombinace krve a in situ gelujícího hydrogelu pro podporu hojení tkáňových defektů popisuje např. spis EP 1294414 [29], který využívá směsi krve a chitosanglycerol fosfátu pro výplně tkáňových defektů. Roztoky chitosan-glycerolfosfátu jsou známé pro svou schopnost podstupovat přechod sol-gel při zvýšení teploty roztoku na 37 °C [30, 31], Využití tohoto systému vede k urychlení tvorby krevní sraženiny a ke zrychlení uzavření defektu. Přesto, že je tento proces rychlejší než přirozený vznik krevní sraženiny, v klinické praxi si vyžaduje dočasné přerušení zákroku, které se typicky pohybuje okolo 15 minut [32], a které je nutné k tomu, aby gel dosáhl vhodných mechanických vlastností [29].

Lee et al. [33] popisují využití hydroxyfenylového derivátu želatiny pro přípravu hydrogelů s obsahem frakce krevní plazmy bohaté na krevní destičky, který sloužil jako scaffold pro kultivaci králičích chondrocytů. Implantace tohoto scaffoldu do modelového osteochondrálního defektu vedla k urychlení hojení daného poškození chrupavky. Popsaný systém však nebyl použit k přípravě hydrogelů s obsahem krve.

Podstata technického řešení

Cílem technického řešení je vyvinout prostředek, který umožňuje účinnou přípravu hydrogelu.

Prostředek pro použití k přípravě hydrogelu, jehož podstatou je, že zahrnuje dva oddělené roztoky A a B, z nichž roztok A obsahuje enzym křenovou peroxidázu a roztok B obsahuje peroxid vodíku, přičemž alespoň jeden roztok A nebo B obsahuje vápenaté ionty ve formě farmaceuticky přijatelné soli a dále roztok A a/nebo B obsahuje hydroxyfenylový derivát hyaluronanu obecného vzorce I

(I), kde n je v rozmezí 2 až 7500 a kde R je OH nebo substituent NHFUCONHRi ArOH obecného vzorce II,

O ... E4-: Ar 'ψ 'R. 'OH

MH' ^v' (Π), kde Ar je fenylen a Ri ethylen, nebo Ar je indoly den a R4- je ethylen, nebo Ar je hydroxyfenylen a Ri je karboxyethylen, a R2 je alkylen o počtu uhlíků 3 až 7.

V prostředku podle jednoho provedení technického řešení roztok A obsahuje enzym křenovou peroxidázu o aktivitě 0,5 až 2,25 U/ml, s výhodou 1,8 až 2,2 U/ml, výhodněji 1,0 až 1,3 U/ml a roztok B obsahuje peroxid vodíku 2 až 10 mmol/1, s výhodou 3 až 7 mmol/1, výhodněji 4 až

-3 CZ 33901 U1 mmol/1, přičemž alespoň jeden roztok A nebo B obsahuje vápenaté ionty v koncentraci 0,05 až 0,55 mol/1, s výhodou 0,25 až 0,55 mol/1, výhodněji 0,25 až 0,45 mmol/1, nejlépe 0,25 až 0,32 mmol/1 a hydroxyfenylový derivát hyaluronanu obecného vzorce I o koncentraci 10 až 125 mg/ml, s výhodou 10 až 35 mg/ml, výhodněji 20 až 26 mg/ml.

Prostředek podle technického řešení zahrnuje dva vodné roztoky A a B, z nichž jeden obsahuje křenovou peroxidázu (roztok A) a druhý peroxid vodíku (roztok B), přičemž alespoň jeden z roztoků obsahuje hydroxyfenylový derivát hyaluronanu obecného vzorce I, a zároveň alespoň jeden z roztoků obsahuje vápenaté ionty ve formě farmaceuticky přijatelných a ve vodě dobře rozpustných solí. Farmaceuticky přijatelné vápenaté soli jsou vybrány ze skupiny obsahující chlorid vápenatý, mléčnan vápenatý, octan vápenatý, glukonát vápenatý, hydrogenuhličitan vápenatý nebo dihydrogenfosforečnan vápenatý, s výhodou ze skupiny obsahující chlorid vápenatý, hydrogenuhličitan vápenatý, mléčnan vápenatý, octan vápenatý, hydrogenfosforečnan vápenatý.

Hydroxyfenylový derivát hyaluronanu obecného vzorce I lze připravit podle postupů uvedených v CZ 303879, který je zde zahrnut tímto odkazem.

Polysacharidy, včetně hyaluronanu a z něj připravovaných derivátů, patří mezi polymery tvořené směsí různě dlouhých makromolekul a tvoří tak neuniformní (polydisperzní) systémy. Molámí hmotnost takových polymerů může být vyjádřena jako početně střední molámí hmotnost (Mn) nebo hmotnostně střední molámí hmotnost (Mw). Poměr těchto dvou typů středních molámích hmotností řetězců polymerů (Mw/Mn) vyjadřuje mim neunimorfity (polydisperzity) vzorku polymeru a je označován jako index polydisperzity (PI). Podle dalšího provedení technického řešení je Mw hydroxyfenylového derivátu hyaluronanu podle obecného vzorce I je v rozsahu 4 x 10⁴ až 3 x 10⁶ g/mol, s výhodou 1 x 10⁵ až 1 x 10⁶ g/mol, výhodněji 2 x 10⁵ až 4 x 10⁵ g/mol. Pije v rozsahu 1 až 3.

Podle dalšího provedení technického řešení je stupeň substituce (DS) hydroxyfenylového derivátu hyaluronanu obecného vzorce I v rozsahu 1 až 10 %, s výhodou 2 až 5 %, výhodněji 2 až 4%.

Roztoky A, B nebo prekurzorový roztok A jsou vodné roztoky, s výhodou 0,9% vodné roztoky chloridu sodného, tedy roztoky isotonické, tj. se stejnou osmolaritou (308 mOsmol) jako má krevní plazma.

Roztok A popisovaného prostředku slouží k přípravě prekurzorového roztoku hydrogelu, kdy je roztok A prostředku smísen s krví nebo transfuzním přípravkem s obsahem fibrinogenu za vzniku pA. Smísením roztoků pA a B v objemovém poměm 1 : 1 dochází ke vzniku gelotvomé směsi, která po zesítění hydroxyfenylového derivátu hyaluronanu poskytuje hydrogel obsahující krev nebo transfůzní přípravek s obsahem fíbrinu. Prostředek a způsob přípravy hydrogelů popisovaný v tomto dokumentu umožňuje přípravu hydrogelů, ve kterých krev nebo transfůzní přípravek s obsahem fíbrinu tvoří 1 až 30 obj. % z celkového objemu finálního hydrogelu.

Podle ještě dalšího provedení technického řešení prostředek zahrnuje roztoky A a B, kde roztok A obsahuje:

• Hydroxyfenylový derivát hyaluronanu dle obecného vzorce I o hmotnostně střední molámí hmotnosti v rozmezí 4 x 10⁴ g/mol až 3 x 10⁶ g/mol (a s indexem polydisperzity 1 - 3), ve kterém je DS v rozsahu 1 až 10 %, přičemž je v koncentraci 0 až 125 mg/ml, s výhodou 10 až 125 mg/ml • Křenovou peroxidázu o aktivitě 0,5 až 2,25 U/ml • Vápenaté ionty v koncentraci 0,05 až 0,55 mol/1 a roztok B obsahuje:

-4CZ 33901 U1 • Hydroxyfenylový derivát hyaluronanu obecného vzorce I o hmotnostně střední molámí hmotnosti v rozmezí 4 x 10⁴ g/mol až 3 x 10⁶ g/mol (a s indexem polydisperzity 1 - 3), ve kterém je DS v rozsahu 1 až 10 %, přičemž je v koncentraci 10 až 50 mg/ml • Peroxid vodíku v rozmezí koncentrace 2 až 10 mmol/1.

Podle dalšího výhodného provedení technického řešení prostředek zahrnuje roztoky A a B, kdy roztok A obsahuje:

• Hydroxyfenylový derivát hyaluronanu obecného vzorce I o hmotnostně střední molámí hmotnosti v rozmezí 1 x 10⁵ g/mol až 1 x 10⁶ g/mol (a s indexem polydisperzity 1 - 3), ve kterém DS v rozsahu 2 až 5 %, přičemž je v koncentraci 0 až 35 mg/ml, s výhodou 10 až 35 mg/ml, • Křenovou peroxidázu o aktivitě 0,5 až 2,25 U/ml • Vápenaté ionty v koncentraci 0,05 až 0,55 mol/1 a roztok B obsahuje:

• Hydroxyfenylový derivát hyaluronanu obecného vzorce I o hmotnostně střední molámí hmotnosti v rozmezí 1 x 10⁵ g/mol až 1 x 10⁶ g/mol (a s indexem polydisperzity 1 - 3), ve kterém je DS v rozsahu 2 až 5 %, přičemž je v koncentraci 26 mg/ml • Peroxid vodíku v rozmezí koncentrace 3 až 7 mmol/1.

• Křenovou peroxidázu o aktivitě 1,8 až 2,2 U/ml • Vápenaté ionty v koncentraci 0,45 až 0,55 mol/1 a roztok B obsahuje:

• Hydroxyfenylový derivát hyaluronanu obecného vzorce I o hmotnostně střední molámí hmotnosti v rozmezí 2 x 10⁵ g/mol až 4 x 10⁵ g/mol (a s indexem polydisperzity 1 - 3), ve kterém je DS v rozsahu 2 až 4 %, přičemž je v koncentraci 26 mg/ml • Peroxid vodíku v rozmezí koncentrace 4 až 5 mmol/1.

• Hydroxyfenylový derivát hyaluronanu obecného vzorce I o hmotnostně střední molámí hmotnosti v rozmezí 2 x 10⁵ g/mol až 4 x 10⁵ g/mol (a s indexem polydisperzity 1 - 3), ve kterém DS je v rozsahu výhodněji 2 až 4 %, přičemž je v koncentraci 20 mg/ml • Křenovou peroxidázu o aktivitě 1,0 až 1,3 U/ml • Vápenaté ionty v koncentraci 0,25 až 0,32 mol/1 a roztok B obsahuje:

• Hydroxyfenylový derivát hyaluronanu dle obecného vzorce I o hmotnostně střední molámí hmotnosti v rozmezí 2 x 10⁵ g/mol až 4 x 10⁵ g/mol a s indexem polydisperzity 1 - 3, ve kterém DS je v rozsahu 2 až 4 %, přičemž je, v koncentraci 26 mg/ml • Peroxid vodíku v rozmezí koncentrace 4 až 5 mmol/1.

Podle ještě dalšího výhodného provedení technického řešení prostředek zahrnuje roztoky A a B, kdy roztok A obsahuje:

-5 CZ 33901 U1 • křenovou peroxidázu o aktivitě 0,8 až 2,2 U/ml, • vápenaté ionty v koncentraci 0,02 až 0,5 mol/1, • hydroxyfenylový derivát hyaluronanu obecného vzorce I o hmotnostně střední molámí hmotnosti v rozmezí 9xl0⁴ až 4xl0⁵g/mol, se stupněm substituce 1 až 10% a v koncentraci v rozsahu 10 až 50 mg/ml, a roztok B obsahuje:

• peroxid vodíku v rozmezí koncentrace 4 až 5 mmol/1.

Dále je popsán způsob přípravy hydro gelu obsahujícího kovalentně zesítěný hydroxyfenylový derivát hyaluronanu, přičemž se připraví oddělené roztoky A a B popsané výše, načež se roztok A smíchá s krví nebo s alespoň jedním transfuzním přípravkem s obsahem fibrinogenu za vzniku prekurzorového roztoku A, který se smíchá s roztokem B.

Do roztoku A se s výhodou přidá 10 až 60% (obj./obj.) krve nebo transfuzního přípravku s obsahem fibrinogenu, výhodněji 30 až 60 % (obj./obj.). Prekurzorový roztok A s roztokem B se s výhodou smíchá v objemovém poměru 1:1.

S výhodou je nejprve roztok A prostředku smísen s krví nebo transfuzním přípravkem s obsahem fibrinogenu za vzniku prekurzorového roztoku hydrogelu pA, který obsahuje:

• Hydroxyfenylový derivát hyaluronanu obecného vzorce I o hmotnostně střední molámí hmotnosti v rozmezí 4 x 10⁴ g/mol až 3 x 10⁶ g/mol (a s indexem polydisperzity 1 - 3), se stupněm substituce 1 až 10 %, v koncentraci 0 až 50 mg/ml, s výhodou 10 až 50 mg/ml, • Křenovou peroxidázu o aktivitě 0,2 až 0,9 U/ml, • Vápenaté ionty v koncentraci 0,02 až 0,22 mol/1, • 10 až 60 % (obj ./obj.) krve nebo transfuzního přípravku s obsahem fibrinogenu, který je dále smísen v objemovém poměru 1 : 1 s roztokem B výše popsaného prostředku, který obsahuje:

• Hydroxyfenylový derivát hyaluronanu obecného vzorce I o hmotnostně střední molámí hmotnosti v rozmezí 4 x 10⁴ g/mol až 3 x 10⁶ g/mol (a s indexem polydisperzity 1 - 3), ve kterém je DS je v rozsahu 1 až 10 %, přičemž je v koncentraci 10 až 50 mg/ml, • Peroxid vodíku v rozmezí koncentrace 2 až 10 mmol/1.

Dále je ještě výhodné, když je nejprve roztok A prostředku smísen s krví nebo transfuzním přípravkem s obsahem fibrinogenu za vzniku prekurzorového roztoku hydrogelu pA, který obsahuje:

• Hydroxyfenylový derivát hyaluronanu obecného vzorce I o hmotnostně střední molámí hmotnosti v rozmezí 1 x 10⁵ g/mol až 1 x 10⁶ g/mol (a s indexem polydisperzity 1 - 3), ve kterém je DS 2 až 5 %, přičemž je v koncentraci 0 až 14 mg/ml, s výhodou 10 až 14 mg/ml, • Křenovou peroxidázu o aktivitě 0,2 až 0,9 U/ml • vápenaté ionty v koncentraci 0,02 až 0,22 mol/1 • 10 až 60 % (obj ./obj.) krve nebo transfuzního přípravku s obsahem fibrinogenu, který je dále smísen v objemovém poměru 1 : 1 s roztokem B výše popsaného prostředku, který obsahuje:

• Hydroxyfenylový derivát hyaluronanu obecného vzorce I o hmotnostně střední molámí hmotnosti v rozmezí 1 x 10⁵ g/mol až 1 x 10⁶ g/mol (a s indexem polydisperzity 1 - 3), ve kterém je DS 2 až 5 %, přičemž je v koncentraci 26 mg/ml • Peroxid vodíku v rozmezí koncentrace 3 až 7 mmol/1.

-6CZ 33901 U1

Dále je ještě výhodné, když je nejprve roztok A prostředku smísen s transfuzním přípravkem s obsahem fíbrinogenu za vzniku prekurzorového roztoku hydrogelu pA, který obsahuje:

• Křenovou peroxidázu o aktivitě 0,7 až 0,9 U/ml, • Vápenaté ionty v koncentraci 0,18 až 0,22 mol/1, • 60 % (obj./obj.) krevní plazmy nebo frakce krevní plazmy bohaté na krevní destičky, který je dále smí sen v objemovém poměru 1 : 1 s roztokem B výše popsaného prostředku, který obsahuje • Hydroxyfenylový derivát hyaluronanu obecného vzorce I o hmotnostně střední molámí hmotnosti v rozmezí 2 x 10⁵ g/mol až 4 x 10⁵ g/mol (a s indexem polydisperzity 1 - 3), ve kterém je DS v rozsahu 2 až 4 %, přičemž je v koncentraci 26 mg/ml • Peroxid vodíku v rozmezí koncentrace 4 až 5 mmol/1.

Dále je ještě výhodné, když je nejprve roztok A prostředku smísen s krví za vzniku prekurzorového roztoku hydrogelu pA, který obsahuje:

• Hydroxyfenylový derivát hyaluronanu obecného vzorce I o hmotnostně střední molámí hmotnosti v rozmezí 2 x 10⁵ g/mol až 4 x 10⁵ g/mol (a s indexem polydisperzity 1 - 3), ve které je DS je v rozsahu 2 až 4 %., přičemž je v koncentraci 14 mg/ml • Křenovou peroxidázu o aktivitě 0,7 až 0,9 U/ml • Vápenaté ionty v koncentraci 0,18 až 0,22 mol/1 • 30 % (obj,/obj.) krve, který je dále smísen v objemovém poměru 1 : 1 s roztokem B výše popsaného prostředku, který obsahuje • Hydroxyfenylový derivát hyaluronanu vzorce (I) o hmotnostně střední molámí hmotnosti v rozmezí 2 x 10⁵ g/mol 4 x 10⁵ g/mol (a s indexem polydisperzity 1 - 3), ve kterém je DS je v rozsahu 2 až 4 %, přičemž je v koncentraci 26 mg/ml • Peroxid vodíku v rozmezí koncentrace 4 až 5 mmol/1.

Dále je ještě výhodné, když hydrogely, připravené způsobem, jak je popsaný výše, obsahují enzym křenovou peroxidázu o aktivitě 0,1 až 2,5 U/ml, s výhodou 0,25 až 0,45 U/ml, výhodněji 0,35 až 0,45 U/ml, vápenaté ionty v koncentraci 0,01 až 0,11 mol/1, s výhodou 0,09 až 0,11 mol/1, kovalentně zesítěný hydroxyfenylový derivát hyaluronanu o koncentraci 5 až 50 mg/ml, výhodněji 13 až 20 mg/ml a krev nebo transfusní přípravek s obsahem fíbrinogenu v koncentraci v rozsahu 5 až 30 % (obj./obj.) s výhodou 15 až 30 % (obj./obj.). Elasticita hydrogelu (G') se může pohybovat v rozmezí od 1 Pa až 3 kPa, s výhodou 1 Pa až 2 kPa.

Hydrogel popsaný výše se použije pro výrobu přípravků v kosmetice, medicíně anebo regenerativní medicíně.

S výhodou je takovýto přípravek vybrán ze skupiny přípravků obsahující krytí ran, přípravek pro augmentaci měkkých tkání, přípravky pro viskosuplementaci synoviálních tekutiny, matrice pro řízené uvolňování léčiv, výplně tkáňových defektů, scaffoldy pro tkáňové inženýrství.

Jak již bylo popsáno výše, přípravek podle technického řešení umožňuje přípravu gelotvomé směsi (hydrogelu), která vznikne po smísení hydrogelu prekurzorového roztoku A a roztoku B. Gelotvomá směs (hydrogelu) obsahuje hydroxyfenylový derivát hyaluronanu obecného vzorce I, krev, či transfuzní přípravek obsahující fibrinogen, křenovou peroxidázu, peroxid vodíků a vápenaté ionty ve formě ve vodě rozpustné farmaceuticky přijatelné soli. Tato gelotvomá směs umožňuje vznik hydrogelu na bázi kovalentně zesítěného tyraminováného derivátu hyaluronanu s obsahem krve či transfůzního přípravku obsahujícího fibrin.

-7CZ 33901 U1

K zesítění hydrogelu přispívá reakce katalyzovaná křenovou peroxidázou, která vede k oxidaci hydroxyfenylových jader tyraminu za vzniku jejich dimerů, popř. oligomerů. Peroxid vodíku je zdrojem hydroxylových radikálů pro reakce katalyzované Měnovou peroxidázou a slouží tedy jako iniciátor síťovací reakce.

Překvapivě však bylo zjištěno, že přídavek dostatečného množství vápenatých iontů do alespoň jednoho roztoku A nebo B, jak jsou popsány výše, vede k zefektivnění procesu gelace a navýšení elastického modulu vznikajících hydrogelů. U analogických hydrogelů bez obsahu krve či transfůzního přípravku nebyl tento jev pozorován.

Dále bylo zjištěno, že samotná přítomnost vápenatých iontů v roztoku hydroxyfenylového derivátu nebo jeho směsi s krví či transfůzním přípravkem s obsahem fíbrinogenu nevede, bez iniciace enzymatické síťovací reakce hydroxyfenylového derivátu hyaluronanu, ke vzniku hydrogelů. Nejedená se tedy pouze o projev koagulace krve, která může být zvýšenou koncentrací vápníku podpořena, nebo o důsledek interakce vápenatých iontů s polyanionickým řetězcem hydroxyfenylového derivátu hyaluronanu. Není vyloučeno, že všechny zmíněné procesy v gelotvomé směsi hydrogelu probíhají současně. Ke vzniku hydrogelu pravděpodobně dojde interakcí mezi jednotlivými vznikajícími polymemími sítěmi, takže jejich společná velikost překročí kritickou mez a dojde ke vzniku hydrogelu. Na rozdíl od dosud popsaných systémů [34] tak popsané složení prostředku umožňuje přípravu hydrogelu na bázi hydroxyfenylového derivátu hyaluronanu podle obecného vzorce I i v přítomnosti krve.

V případě využití krve, výše popsané gelotvomé směsi umožňují vznik hydrogelu při koncentracích peroxidu vodíku, které nevedou k poškození biologických struktur, a zároveň umožňují využití křenové peroxidázy o aktivitě, která by samostatně nevedla k efektivnímu vzniku hydrogelu v přítomnosti krve či transfůzního přípravku s obsahem fíbrinogenu. To výrazně zvyšuje možnost využití prostředku v oblasti tkáňového inženýrství, regenerativní medicíny a dalších medicínských oborech.

Podobný jev lze vypozorovat i v případě přípravy hydrogelů s obsahem plazmy. Peroxid je v plazmě stabilnější, takže přítomnost vápenatých iontů není v daném případě pro vznik hydrogelu nezbytně nutná. Nicméně i v tomto případě vede přítomnost vápenatých iontů k urychlení procesu gelace a navýšení elastického modulu připravených hydrogelů. I tento jev se dá vysvětlit paralelním vznikem fibrinové sítě a sítě na bázi hydroxyfenylového derivátu hyaluronanu.

Vyšší koncentrace vápenatých iontů vedou k inhibici proliferace kultivovaných buněk, což by limitovalo využití prostředku v jako materiálu pro medicínské účely. V prostředku podle technického řešení je množství vápenatých iontů optimalizováno tak, aby bylo dostatečné pro podporu vznikajících hydrogelů, ale zároveň aby umožňovalo využití připravených hydrogelů jako matric pro 2D a 3D kultivaci buněk. Možnost využití kombinace krve nebo transfuzních přípravků obsahujících fibrinogen pro přípravu hydrogelů na bázi hydroxyfenylových derivátů hyaluronanu nebyla zatím v literatuře popsána.

Termín „krev“ znamená krev odebraná dárci, člověku nebo zvířeti. Je to surovina pro přípravu transfuzních přípravků.

Termín „transfůzní přípravek s obsahem fíbrinogenu“ znamená transfůzní přípravek, který se připraví z krve obvyklými postupy. Patří sem například krevní plazma, frakce krevní plazmy bohatá na krevní destičky (PRP).

Nejedná se o krevní deriváty, což jsou průmyslově vyráběné přípravky, které zahrnují zejména albumin, koagulační faktory a imunoglobuliny lidského původu.

- 8 CZ 33901 U1

Objasnění výkresů

Obr. 1 Vliv koncentrace vápenatých iontů na rychlost gelace vzorků obsahující transfuzní přípravek - 30 % (obj./obj.) plazmy, 13 mg/ml roztok HATA, HRP 0,4 U/ml, H2O2 2,3 mM, různá koncentrace CaCh ^ELO v hydrogelu.

Obr. 2 Vliv koncentrace Ca²⁺ (mol/1) na proliferaci 3T3 buněk.

Obr.3 Cytotoxicita extraktů hydrogelů obsahujících různou koncentraci vápenatých iontů

Obr.4 Cytotoxicita extraktů hydrogelů obsahujících různý podíl krve/krevní plazmy. Koncentrace vápenatých iontů v gelu je rovna 0,1 mol/1. Uvedená % jsou % (obj./obj.).

Obr. 5 Vliv koncentrace Ca²⁺ iontů v hydrogelech obsahujících 30 % (obj./obj.) podíl krevní plazmy.

Obr. 6 Adheze buněk na povrchu hydrogelů - barvení LIVE/DEAD. Uvedená % jsou % (obj./obj.).

Obr. 7: 3D kultivace buněk - barvení LIVE/DEAD (šipky - adherované buňky). Uvedená % jsou % (obj./obj.).

Příklady uskutečnění technického řešení

DS = stupeň substituce = 100 % * molámí množství modifikovaných disacharadických jednotek hyaluronanu / molámí množství všech disacharadických jednotek derivátu hyaluronanu. Stupeň substituce byla stanoven pomocí Ή NMR spektroskopií.

Hmotnostně střední molámí hmotnost (Mw) a index polydisperzity (PI) byly stanoveny metodou SEC-MALLS.

Příklad 1

Syntéza tyraminovaného derivátu HA (HA-TA)

Syntéza 6-amino-/V-[2(4hydroxyfenyl)ethyl]hexanamidu

6-\(terc. butoxykarbonyl)amino]hexanová kyselina (1,00 g, 4,3 mmol) byla rozpuštěna v 50 ml tetrahydrofůranu (THF). K roztoku kyseliny byl přidán 1, 1 'karbodiimidazol (0,70 g, 4,3 mmol). Směs byla zahřívána na 50 °C po dobu šedesáti minut. Poté byla reakční nádoba promyta inertním plynem. K reakční směsi byl přidán tyramin (0,59 g, 4,3 mmol). Směs byla dále zahřívána další 2 hodiny. Poté byl destilací za sníženého tlaku odstraněn THF. Odparek byl rozpuštěn v 50 ml ethylacetátu. Roztok byl promyt 150 ml čištěné vody (rozděleno do tří dílů). Organická vrstva byla vysušena nad molekulovým sítem. Ethylacetát byl odstraněn destilací za sníženého tlaku. Odparek byl rozpuštěn v 50 ml MeOH a k roztoku byly přidány 2 ml trifluoroctové kyseliny (TFA). Roztok byl zahříván 6 hodin pod zpětným chladičem. Rozpouštědlo bylo odstraněno destilací za sníženého tlaku. Odparek byl rozpuštěn v 50 ml ethylacetátu. Roztok byl promyt 150 ml čištěné vody (rozděleno do tří dílů). Organická vrstva byla vysušena nad molekulovým sítem. Ethylacetát byl odstraněn destilací za sníženého tlaku.

m = 0,75 g (70 % teorie)

Ή NMR (D2O, ppm) δ: 1,17 (m, 2 H, Y-CTE-hcxanovc kyseliny); l,48(m, 2 H, P-CTU-hexanové kyseliny); 1,58 (m, 2 H, 5-CH2-hexanové kyseliny); 2,17 (t, 2 H, -CH2-CO-); 2,73 (m, 2 H, -CH2

-9CZ 33901 U1

Ph); 2,91 (m, 2 H, -CH₂-NH₂); 3,42 (m, 2 H, -CH₂-NH-CO-); 6,83 (d, 2 H, arom); 7,13 (d, 2 H, arom).

¹³C NMR(D₂O, ppm) δ: 24 (γ-C-hexanové kyseliny); 26 (δ-C-hexanové kyseliny); 33 (β-Chexanové kyseliny); 35 (-C-CO-); 39 (-C-NH₂); 40 (C-Ph); 63 (-C-NH-CO-); 115 (C3 arom); 126 (Cl arom); 130 (C2 arom.); 153 (C4 arom); 176 (-CO-).

Příprava aldehydického derivátu (HA-CHO)

Hyaluronan (10,00 g, M_w. = 2 x 10⁶ g.mol¹) byl rozpuštěn v 750 ml 2,5% (w/w) roztoku Na2HPO⁴.12 H2O. Roztok byl vychlazen na 5 °C. K vzniklému roztoku bylo přidáno 2,60 g NaBr a 0,05 g 4-acetamido-2,2,6,6-tetramethylpiperidin-l-oxylu. Po důkladné homogenizaci roztoku byly k reakční směsi přidány 3 ml roztoku NaClO (10-15 % dostupného Cl₂). Reakce pokračovala za stálého míchání 15 min. Reakce byla ukončena přídavkem 100 ml 40% roztoku propan-2-olu. Produkt byl přečištěn ultrafíltrací a izolován precipitací propan-2-olem.

IČ (KBr): 3417, 2886, 2152, 1659, 1620, 1550, 1412, 1378, 1323, 1236, 1204, 1154, 1078, 1038,945 ,893 cm¹.

Ή NMR (D₂O) δ: 2,01 (s, 3 H, CH3-), 3,37 - 3,93 (m, skelet hyaluronanu), 4,46 (s, 1H, anomer), 4,54 (s, 1H anomer., -O-CH(OH)-), 5,27 (geminální glykol -CH-(OH)₂).

a) Příprava tyraminovaného derivátu HA s Ce spacerem (Mw ~ 5 x 10⁴g.mol¹, DS ~ 6 %) Aldehydický derivát HA 6 x 10⁴ g.mol¹, DS = 9 %) (5,00 g) byl rozpuštěn v 500 ml demineralizované vody. Pomocí kyseliny octové bylo pH roztoku upraveno na 3. K roztoku HACHO byl přidán 6-amino-A-[2-(4-hydroxyfenyl)ethyl]hexanamid (meziprodukt (I)) (1,25 g, 5 mmol). Směs byla míchána 2 hodiny při laboratorní teplotě. Poté byl do reakční směsi přidán komplex pikolin-boran (0,270 g, 2,5 mmol). Směs byla míchána dalších 12 hodin při laboratorní teplotě. Produkt byl přečištěn ultrafíltrací a izolován z retentátu precipitací propan-2-olem. Precipitát byl zbaven vlhkosti a zbytkového propan-2-olu sušením v horkovzdušné sušárně (40 °C, 3 dny).

IČ (KBr):: 3425, 2893, 2148, 1660, 1620, 1549, 1412, 1378, 1323, 1236, 1204, 1154, 1078, 1038, 945 ,893 cm¹.

Ή NMR (D₂O) δ: 1,25 (t, 2 Η, γ -CH₂- aminohexanové kyseliny), 1,48 (m, 2 Η, δ -CH₂aminohexanové kyseliny) 1,51 (m, 2 Η, β -CH₂- aminohexanové kyseliny), 2,01 (s, 3 H, CH3-),

2,65 (m, 2H, Ph-CH₂-), 2,73 (m, 2H, e-CH₂- aminohexanové kyseliny), 3,37-3,93 (m, skelet hyaluronanu), 4,46 (s, 1H, anomer), 4,54 (s, 1H anomer., -O-CH(OH)-), 6,59 (d, 2H, arom.), 7,01 (d, 2H. arom).

SEC MALLS: Mw = 5,4x 10⁴ g.mol¹; PI = 1,61

DS (*HNMR): 6,2 %

b) Příprava tyraminovaného derivátu HA s Ce spacerem (Mw » 3 x 10⁵ g.mol¹, DS ~ 2 %) Aldehydický derivát HA (Mw » 3 x 10⁵ g.mol¹, DS ~ 9 %) (5,00 g) byl rozpuštěn v 500 ml demineralizované vody. Pomocí kyseliny octové bylo pH roztoku upraveno na 3. K roztoku HACHO byl přidán 6-amino-A-[2-(4-hydroxyfenyl)ethyl]hexanamid (meziprodukt (I)) (0,625 g,

2,5 mmol). Směs byla míchána 2 hodiny při laboratorní teplotě. Poté byl do reakční směsi přidán komplex pikolin-boran (0,270 g, 2,5 mmol). Směs byla míchána dalších 12 hodin při laboratorní teplotě. Produkt byl přečištěn ultrafíltrací a izolován z retentátu precipitací propan-2-olem. Precipitát byl zbaven vlhkosti a zbytkového propan-2-olu sušením v horkovzdušné sušárně (40 °C, 3 dny).

- 10 CZ 33901 U1

IČ(KBr):: 3425, 2893, 2148, 1660, 1620, 1549, 1412, 1378, 1323, 1236, 1204, 1154, 1078, 1038,945 ,893 cm¹.

Ή NMR (D2O) δ: 1,25 (t, 2 Η, γ -CIT- aminohexanové kyseliny), 1,48 (m, 2 Η, δ -CTLaminohexanové kyseliny) 1,51 (m, 2 Η, β -CH2- aminohexanové kyseliny), 2,01 (s, 3 H, CH3-),

2,65 (m, 2H, PI1-CH2-), 2,73 (m, 2H, e-CIL- aminohexanové kyseliny), 3,37 - 3,93 (m, skelet hyaluronanu), 4,46 (s, 1H, anomer), 4,54 (s, 1H anomer., -O-CH(OH)-), 6,59 (d, 2H, arom.), 7,01 (d, 2H. arom).

SEC MALLS: Mw = 2,81 x 10⁵ g.mol¹ ; PI = 1,49

DS (¹HNMR): 2,2 %

c) Příprava tyraminovaného derivátu HA s Ce spacerem (Mw « 1.5 x 10⁶ g.mol¹, DS = 1 %) Aldehydický derivát HA (»1,5 x 10⁶ g.mol¹, DS = 4 %) (5,00 g) byl rozpuštěn v 500 ml demineralizované vody. Pomocí kyseliny octové bylo pH roztoku upraveno na 3. K roztoku HACHO byl přidán 6-amino-A-[2-(4-hydroxyfenyl)ethyl]hexanamid (meziprodukt (I)) (0,625 g,

2,5 mmol). Směs byla míchána 2 hodiny při laboratorní teplotě. Poté byl do reakční směsi přidán komplex pikolin-boran (0,270 g, 2,5 mmol). Směs byla míchána dalších 12 hodin při laboratorní teplotě. Produkt byl přečištěn ultrafiltrací a izolován z retentátu precipitací propan-2-olem. Precipitát byl zbaven vlhkosti a zbytkového propan-2-olu sušením v horkovzdušné sušárně (40 °C, 3 dny).

IČ(KBr):: 3425, 2893, 2148, 1660, 1620, 1549, 1412, 1378, 1323, 1236, 1204, 1154, 1078, 1038, 945, 893 cm¹.

Ή NMR (D2O) δ: 1,25 (t, 2 Η, γ -CH2- aminohexanové kyseliny), 1,48 (m, 2 Η, δ -QLaminohexanové kyseliny) 1,51 (m, 2 Η, β -CH2- aminohexanové kyseliny), 2,01 (s, 3 H, CH3-),

2,65 (m, 2H, PI1-CH2-), 2,73 (m, 2H, e-Qh- aminohexanové kyseliny), 3,37 - 3,93 (m, skelet hyaluronanu), 4,46 (s, 1H, anomer), 4,54 (s, 1H anomer., -O-CH(OH)-), 6,59 (d, 2H, arom.), 7,01 (d, 2H. arom).

SEC MALLS: Mw = 1,45 x 10⁶ g.mol¹; PI = 1,65

DS (*HNMR): 1,1 %

d) Příprava tyraminovaného derivátu HA s Ce spacerem (Mw » 1 x 10⁵ g.mol¹, DS = 8,5 %) Aldehydický derivát HA (»1 x 10⁵ g.mol¹, DS = 10 %) (5,00 g) byl rozpuštěn v 500 ml demineralizované vody. Pomocí kyseliny octové bylo pH roztoku upraveno na 3. K roztoku HACHO byl přidán 6-amino-A-[2-(4-hydroxyfenyl)ethyl]hexanamid (meziprodukt (I)) (0,625 g,

IČ (KBr):: 3425,2893,2148, 1660, 1620, 1549, 1412, 1378, 1323, 1236, 1204, 1154, 1078, 1038, 945, 893 cm¹.

2,65 (m, 2H, PI1-CH2-), 2,73 (m, 2H, e-CH2- aminohexanové kyseliny), 3,37 - 3,93 (m, skelet hyaluronanu), 4,46 (s, 1H, anomer), 4,54 (s, 1H anomer., -O-CH(OH)-), 6,59 (d, 2H, arom.), 7,01 (d, 2H. arom).

- 11 CZ 33901 U1

SEC MALLS: Mw = 9,5 x 10⁴ g.mol¹; PI = 1,55

DS (*HNMR): 8,6 %

e) Příprava tyraminovaného derivátu HA s Ce, spacerem (Mw » 2,5 x 10⁶ g.mol^-1, PS = 1 %) Aldehydický derivát HA (»2,5 x 10⁶, DS = 4 %) (5,00 g) byl rozpuštěn v 500 ml demineralizované vody. Pomocí kyseliny octové bylo pH roztoku upraveno na 3. K roztoku HACHO byl přidán 6-amino-A-[2-(4-hydroxyfenyl)ethyl]hexanamid (meziprodukt (I)) (0,625 g,

IČ (KBr):: 3425, 2893, 2148, 1660, 1620, 1549, 1412, 1378, 1323, 1236, 1204, 1154, 1078, 1038, 945, 893 cm¹.

Ή NMR (D2O) δ: 1,25 (t, 2 Η, γ -CH2- aminohexanové kyseliny), 1,48 (m, 2 Η, δ -QLaminohexanové kyseliny) 1,51 (m, 2 Η, β -QL- aminohexanové kyseliny), 2,01 (s, 3 H, CH3-),

SEC MALLS: Mw = 2,5 x 10⁶ g.mol¹; PI = 1,65

DS (*HNMR): 1 %

Příklad 2

Vliv přítomnosti vápenatých iontů na vznik hydrogelu v přítomnosti krve

Rychlost gelace byla měřena pomocí rotačního reometru AR-G2 (TA Instrument) za použití geometrie deska-deska (40 mm) a velikostí mezery 400 pm. 525 pl vzorku bylo aplikováno na spodní statickou desku. Pre-shear 2000 1/s za sekundu byl zvolen pro homogenizaci roztoku. Time sweep mód byl zvolen pro stanovení rychlosti gelace při frekvenci 1 Hz a posunu (displacement) 0,001 rad při 37 °C. Elastický a viskózní modul byl stanoven ze závislosti elastického G' a viskózního G modulu na čase t. K přípravě roztoků byl použit tyraminovaný derivát hyaluronanu syntetizovaný postupem dle příkladu 1 (Mw = 2,81 x 10⁵ g.mol¹, DS 2,2 %).

V uvedené tabulce 1 je znázorněn elastický G' a viskózní G modul jednotlivých vzorků odečtený při 300 s.

Tab. 1 Složení testovaných gelotvomých směsí

	Koncentrace roztoku HATA (mg/ml)	Koncentrace CaCl₂.2H₂O (mol/1)	Aktivita HRP (U/ml)	Koncentrace H2O2 (mmol/1)	Podíl krve ve vzorku (%)	G' (Pa)	G (Pa)
1	20	-	-	-	15	0,17	1,23
2	20	0,1	-	-	15	0,34	1,06
3	20	0,1	0,4	-	15	0,20	1,15
4	20	-	0,4	-	15	0,24	1,27
5	20	-	-	2,3	15	0,07	0,92

- 12 CZ 33901 U1

6	20	0,1	0,4	2,3	15	21,80	11,50
7	20		0,4	2,3	15	0,52	1,99

Z uvedených dat je patrné, že pouze u kombinace hydroxyfenylového derivátu hyaluronanu s křenovou peroxidázou, peroxidem vodíku a vápenatých iontů s krví (vzorek 6) dochází ke gelaci - elastický modul G' je vyšší než viskózní modul G. V ostatních případech (vzorky 1-5 a 7) je elastický modul nižší než viskózní a nedochází ke gelaci uvedených směsí ani po 24 hodinách.

Příklad 3

Vliv vápenatých iontů na účinnost gelace v přítomnosti krve a transfuzních přípravků

Viskoelastické vlastnosti hydrogelů byly stanoveny pomocí rotačního reometru AR-G2 (TA Instruments) pomocí metody strain sweep při konstantní hodnotě frekvence 1 Hz a posunu (displacement) v rozmezí 10^-3 až 2 radiány. Aby nedocházelo k vyklouznutí připravených hydrogelů během měření, byla použita geometrie s hrubším povrchem (cross-hatched). Pro stanovení byly připraveny hydrogely o průměru 17,5 mm. Hydrogely byly hodnoceny po uplynutí 60 minut od přípravy. K přípravě roztoků byl použit tyraminovaný derivát hyaluronanu syntetizovaný postupem dle příkladu 1 (Mw = 2,8 1 x 10⁵ g.mol¹, DS 2,2 %).

V tabulce 2 jsou uvedeny viskoelastické vlastnosti (elastický G' a viskózní G modul) hydrogelů připravených bez a s transfuzním přípravkem. Dále je zde demonstrován rozdíl v elastickém modulu u hydrogelů připravených bez a s přítomností vápenatých iontů.

U hydrogelů připravených bez přítomnosti krve či transfuzních přípravků nebyl pozorován nárůst elastického modulu v závislosti na přítomnosti vápenatých iontů. Naopak, hydrogely s obsahem krevní plazmy či krevní plazma bohatá na krevní destičky (PRP) připravené v přítomnosti vápenatých iontů vykazovaly vyšší hodnoty elastického modulu, než analogické gely připravené bez přítomnosti vápníku. Prekurzorové roztoky s obsahem krve, ale bez přítomného vápníku, nebyly schopné hydrogel vůbec vytvořit.

Tab. 2 Složení testovaných gelotvorných směsí a vlastnosti z nich vzniklých hydrogelů

	Konc. HA-TA (mg/ml)	Konc. CaCl₂.2H₂O (mol/1)	Aktivit aHRP (U/ml)	Konc. H₂O₂(mmol/I)	(obj./obj. )	G' (Pa)	SD	G (Pa)	SD
1		0,1			Bez krve	1028,9	48,8	2,08	0,47
	0			1052,6	34,4	4,17	1,53
2	13	0,1			30%	578,3	27,2	2,35	0,18
0			plazmy	433,7	8,5	2,07	0,05
3		0,1			30%	548,2	65,5	2,46	0,27
	0	0,4	2,3 mM	PRP	360,8	11,7	2,94	0,15
4		0,1	Bez krve	1764,0	151,8	1,82	1,06
20	0			1664,8	91,6	1,86	1,01
5	0,1			15 % Krve	59,0	1,9	20,73	1,85
	0			negeluje
6	30	0,1			30%	1,7	0,3	0,41	0,06
0			Krve	negeluje

- 13 CZ 33901 U1

Příklad 4

Vliv koncentrace vápenatých iontů na rychlost vzniku hydrogelu v přítomnosti krevní plazmy

Rychlost gelace byla stanovena metodikou popsanou v příkladu 2.

Na Obr. 1 je znázorněn vliv koncentrace vápenatých iontů na rychlost gelace vzorků obsahujících transfůzní přípravek - 30 %(obj./obj.) plazmy. S rostoucí koncentrací vápenatých iontů klesá čas gelace.

Příklad 5

Vliv koncentrace vápenatých iontů na proliferaci buněk

Na Obr. 2 je uvedena viabilita buněk (fibroblasty linie 3T3) kultivovaných v přítomnosti vápenatých iontů (0,1 až 0,001 mol/1). Buňky byly nasazeny na 24jamkový kultivační panel v hustotě 15 tis. b./jamku. Druhý den bylo buňkám vyměněno médium; nové médium obsahovalo vápenaté ionty v testovaných koncentracích. Proliferace buněk byla sledována v intervalu 24, 48 a 72 h metodou stanovení ATP pomocí CellTiter-Glo assay. Jako kontrola sloužila DEMI voda v objemu 10 % objemu média.

Norma ISO 10993-5-2009 stanovuje jako hranici cytotoxicity snížení viability ovlivněných buněk o více než 30 % ve srovnání s kontrolou. U koncentrací 0,1 mol/1 až 0,05 mol/1 Ca²⁺ ke snížení viability buněk pod tuto hranici došlo. Přítomnost vápenatých iontů v koncentraci < 0,01 mol/1 nemá negativní vliv na viabilitu buněk.

Příklad 6

Cytotoxicita výluhů hydrogelů obsahujících různou koncentraci vápenatých iontů

Hydrogely byly připraveny z gelotvomé směsi, která vznikla smísením prekurzorového roztoku pA a roztoku B v objemovém poměru 1 : 1 (složení roztoků a vznikajících hydrogelů viz tabulka 3). Jako zdroj vápenatých iontů byl použit chlorid vápenatý. K přípravě roztoků byl použit tyraminovaný derivát hyaluronanu syntetizovaný postupem dle příkladu 1 (Mw = 2,81 x 10⁵ g.mol¹, DS 2,2 %).

Sterilně připravené hydrogely byly přeneseny do plastové zkumavky a zality kultivačním médiem v poměru 9 : 1 (9 ml média/1 g gelu). Extrakce probíhala po dobu 72 h při 37 °C. Buňky linie 3T3 byly nasazeny na 24jamkový kultivační panel v hustotě 15 tis. b./jamku.

Drahý den bylo buňkám odsáto médium a místo něj byl přidán testovaný extrakt. Proliferace buněk byla sledována v intervalu 24, 48 a 72 h metodou stanovení ATP pomocí CellTiter-Glo assay. Jako kontrola sloužilo kultivační médium. Obr. 3 popisuje viabilitu buněk v přítomnosti extraktů hydrogelů obsahujících raznou koncentraci vápenatých iontů. Pro viabilitu buněk se jako hraniční ukázala hodnota koncentrace vápenatých iontů v hydrogelů 0,1 mol/1. Při jejím překročení působily extrakty připravené z hydrogelů cytotoxicky.

Tabulka 3: Koncentrace jednotlivých složek v prekurzorového roztoku pA a roztoku Bav gelotvorné směsi vzniklé smísením roztoku pA a roztoku B

Prekurzorový roztok pA	Roztok pB	Gelotvomá směs (hydrogel)
HRP	Ca²⁺	HA-TA	H₂O₂	HRP	Ca²⁺	HA-TA	H2O2
(U/ml)	(mol/1)	(mg/ml)	(mmol/1)	(U/ml)	(mol/1)	(mg/ml)	(mmol/1)

- 14 CZ 33901 U1

0,8	0,1	26	4,6	0,4	0,05	13	2,3
0,14	0,07
0,2	0,1
1	0,5

Příklad 7

Cytotoxicita výluhů hydrogelů obsahujících krev nebo krevní plazmu

Před přípravou hydrogelu byl roztok A smísen s příslušným množstvím krve nebo krevní plazmy za vzniku prekurzorového roztoku pA. Hydrogely byly připraveny z gelotvomé směsi, která vznikla smísením prekurzorového roztoku pA s příměsí krve či krevní plazmy a roztoku B v objemovém poměru 1 : 1 (složení roztoků a vznikajících hydrogelů viz tabulka 4). Jako zdroj vápenatých iontů byl použit chlorid vápenatý. K přípravě roztoků byl použit tyraminovaný derivát hyaluronanu syntetizovaný postupem dle příkladu 1 (Mw = 2,81 x 10⁵ g.mol¹, DS 2,2 %). Sterilně připravené hydrogely byly přeneseny do plastové zkumavky a zality kultivačním médiem v poměru 9 : 1 (9 ml média/1 g gelu). Extrakce probíhala po dobu 72 h při 37 °C. Buňky linie 3T3 byly nasazeny na 24jamkový kultivační panel v hustotě 15 tis. b./jamku. Druhý den bylo buňkám odsáto médium a místo něj byl přidán testovaný extrakt. Proliferace buněk byla sledována v intervalu 24, 48 a 72 h metodou stanovení ATP pomocí CellTiter-Glo assay. Jako kontrola sloužilo kultivační médium. Výsledky prezentované na Obr. 4 dokládají, že extrakty hydrogelů s 15 až 30 % (obj./obj.) podílem plazmy či krve a s obsahem 0,1 mol/1 vápenatých iontů nemají negativní vliv na viabilitu buněk.

Tabulka 4: Vliv přítomnosti krevní plazmy a krve na cytotoxicitu výluhů hydrogelů Koncentrace jednotlivých složek v prekurzorovém roztoku pA a roztoku B a v gelotvorné směsi vzniklé smísením roztoku pA a roztoku B

Prekurzorový roztok pA	roztok B	Gelotvomé směs (hydrogel)
HRP (U/ml)	Ca²⁺ (mol/1)	HA-TA (mg/ml)	(obj./obj. )	HA-TA (mg/ml)	H₂O₂ (mmol/1)	HRP (U/ml)	Ca²⁺ (mol/1)	HA-TA (mg/ml)	H2O2 (mmol/1)	(obj/obj )
0,8	0,2	0		26	4,6	0,4	0,1	13	2,3
0	Plazma 60%	26	4,6	13	2,3	Plazma 30 %
14	Plazma 30%	26	4,6	20	2,3	Plazma 15 %
14	Krev 30%	26	4,6	20	2,3	Krev 15 %

Příklad 8

Cytotoxicita výluhů hydrogelů obsahujících podíl krevní plazmy a různou koncentraci vápenatých iontů

Dále byl sledován vliv koncentrace vápenatých iontů přítomných v hydrogelu s obsahem krevní

- 15 CZ 33901 U1 plazmy na viabilitu buněk. Pro zhodnocení tohoto parametru byly opět připraveny výluhy hydrogelů. Před přípravou hydrogelů byl roztok A smísen s příslušným množstvím krve nebo krevní plazmy za vzniku prekurzorového roztoku pA. Hydrogely byly připraveny z gelotvomé směsi, která vznikla smísením prekurzorového roztoku pA a roztoku B v objemovém poměru 1 : 1 (složení roztoků a vznikajících hydrogelů viz tabulka 5). Jako zdroj vápenatých iontů byl použit chlorid vápenatý. K přípravě roztoků byl použit tyraminovaný derivát hyaluronanu syntetizovaný postupem dle příkladu 1 (Mw = 2,81 x 10⁵ g.mol¹, DS 2,2 %). Sterilně připravené hydrogely byly přeneseny do plastové zkumavky a zality kultivačním médiem v poměru 9 : 1 (9 ml média/1 g gelu). Extrakce probíhala po dobu 72 h při 37 °C. Buňky linie 3T3 byly nasazeny na 24jamkový kultivační panel v hustotě 15 tis. b./jamku. Druhý den bylo buňkám odsáto médium a místo něj byl přidán testovaný extrakt. Proliferace buněk byla sledována v intervalu 24, 48 a 72 h metodou stanovení ATP pomocí CellTiter-Glo assay. Jako kontrola sloužilo kultivační médium. Výsledky prezentované na Obr. 5 dokládají, že extrakty připravené z hydrogelů obsahujících 30 % (obj./obj.) podíl plazmy a vápenaté ionty v koncentračním rozmezí 0 až 0,1 mol/1 nepůsobí cytotoxicky.

Tabulka 5: Vliv koncentrace vápenatých iontů na cytotoxicitu extraktů hydrogelů obsahujících plazmu - Koncentrace jednotlivých složek v prekurzorovém roztoku pA a roztoku Bav gelotvorné směsi vzniklé smísením roztoku pA a roztoku B

Prekurzorový roztok pA	roztok B	Gelotvomá směs (hydrogel)
HRP (U/ml)	< o u S	HA-TA (mg/ml)	(obj./obj. )	HA-TA (mg/ml)	H₂O₂ (mmol/1)	HRP (U/ml)	Ca²⁺ (mol/1)	HA-TA (mg/ml)	H2O2 (mmol/1)	(obj./obj. )
0,8	0	0	Plazma 60%	26	4,6	0,4	0	13	2,3	Plazma 30 %
0,1	0	Plazma 60%	26	4,6	0,05	13	2,3	Plazma 30 %
0,2	0	Plazma 60%	26	4,6	0,1	13	2,3	Plazma 30 %

Příklad 9

Test adheze buněk k hydrogelovým vrstvám

Roztok A byl smísen s příslušným množstvím krve, krevní plazmy, nebo PRP za vzniku prekurzorového roztoku pA. Hydrogely byly připraveny z gelotvomé směsi, která vznikla smísením prekurzorového roztoku pA s přídavkem krve či transfůzního přípravku a roztoku B v objemovém poměru 1 : 1 (složení roztoků a vznikajících hydrogelů viz tabulka 6). Jako zdroj vápenatých iontů byl použit chlorid vápenatý. K přípravě roztoků byl použit tyraminovaný derivát hyaluronanu syntetizovaný postupem dle příkladu 1 (Mw = 2,81 x 10⁵ g.mol¹, DS 2,2 %). Testovanými hydrogely byly povrstveny 24jamkové kultivační panely. Následně byly na povrh hydrogelové vrstvy nasazeny kmenové buňky v hustotě 13 tis. b./jamku. Růst buněk byl sledován v průběhu 4 dní pomocí barvení LIVE/DEAD.

Adheze kmenových buněk k povrchu materiálu se projevuje typickými změnami v morfologie buněk, kdy buňky zaujímají protáhlý tvar. Obr. 6 dokumentuje, že buňky nejsou schopny adheze k hydrogelů bez přídavku krve či transfůzního přípravku. V tomto případě si buňky i po 4 dnech

- 16 CZ 33901 U1 kultivace zachovávají sférický tvar a nejeví známky interakce s povrchem gelu. Rovněž jejich proliferace je potlačena. Hydrogely s obsahem krve nebo transfůzních přípravků s obsahem fíbrinogenu (krevní plazma, PRP) naopak podporují adhezi i proliferaci buněk. Buňky na jejich povrchu zaujímají typický protáhlý tvar jejich počet s dobou kultivace roste. Experiment rovněž 5 prokázal, že přítomnost vápníku ve struktuře hydrogelu není překážkou pro kultivaci na povrchu hydrogelů.

- 17 CZ 33901 U1

Tabulka 6: 2D adheze kmenových buněk k povrchu hydrogelu - Koncentrace jednotlivých složek v prekurzorovém roztoku pA a roztokuB a v gelotvorné směsi vzniklé smísením roztoku pA a roztokuB

Prekurzorový roztok pA	roztok B	Gelotvomá směs (hydrogel)
HRP (U/ml)	< 0 O e	HA-TA (mg/ml)	(obj./obj. )	HA-TA (mg/ml)	H2O2 (mmol/1)	HRP (U/ml)	O e	HA-TA (mg/ml)	H2O2 (mmol/1)	(obj./obj. )
0,8	0,1	0	0	26	4,6	0,4	0,05	13	2,3	0
0	Plazma 60%	26	4,6	13	2,3	Plazma 30%
14	Plazma 30%	26	4,6	20	2,3	Plazma 15 %
0	PRP 60%	26	4,6	13	2,3	PRP 30%
14	PRP 30%	26	4,6	20	2,3	PRP 15 %

Příklad 10

3D kultivace buněk

Pro enkapsulaci byly využity buňky linie 3T3 myších fíbroblastů. Před přípravou hydrogelů byl pelet buněk suspendován v roztoku A. Roztok A byl dále smísen s příslušným množstvím krve, krevní plazmy, nebo PRP za vzniku prekurzorového roztoku pA. Hydrogely byly následně připraveny smísením prekurzorového roztoku A a roztoku B v objemovém poměru 1 : 1 (složení roztoků a vznikajících hydrogelů viz tabulka 7). Jako zdroj vápenatých iontů byl použit chlorid vápenatý. K přípravě roztoků byl použit tyraminovaný derivát hyaluronanu syntetizovaný postupem dle příkladu 1 (Mw = 2,81x 10⁵g.mol¹, DS 2,2%). Sterilně připravené hydrogely byly převedeny do kultivačního panelu a zality kultivačním médiem, kde byly inkubovány po dobu 4 dnů při 37 °C, 5 % CO2. Růst buněk byl sledován pomocí barvení LIVE/DEAD. Výsledky prezentované na Obr. 7 dokládají, že systém umožňuje enkapsulaci viabilních buněk do hydrogelů a jejich následnou 3D kultivaci. Buňky v hydrogelech obsahujících transfuzní přípravek jsou schopny adheze.

Tabulka 7: 3D kultivace buněk - Koncentrace jednotlivých složek v prekurzorovém roztoku A a roztoku Bav hydrogelu po smísením roztoků pA a roztoku B.

Prekurzorový roztok pA	roztok B	Gelotvomá směs (hydrogel)
HRP (U/ml)	O E	HA-TA (mg/ml)	(obj./obj. )	HA-TA (mg/ml)	H2O2 (mmol/1)	HRP (U/ml)	O E	HA-TA (mg/ml)	H2O2 (mmol/1)	(obj./obj. )

- 18 CZ 33901 U1

0,8	0,2	0		26	4,6	0,4	0,1	13	2,3
0	Plazma 60%	26	4,6	13	2,3	Plazma 30 %
0	PRP 60%	26	4,6	13	2,3	PRP 30 %
14	Krev 30%	26	4,6	20	2,3	Krev 15 %

Příklad 11

Příprava hydrogelů s obsahem krve (5 % obj ./obj.)

K přípravě roztoků prostředku pro přípravu hydrogelů byl použit derivát HA-TA (Mw = 5,4 x 10⁴ g.mol-¹, DS 6,2%). Z roztoku A (1,8 ml) prostředku pro přípravu hydrogelů o složení:

HRP......................................1 U/ml

CaCl₂ 2H₂O.......................0,223 mol/1

HA-TA.........................55,556 mg/ml, byl přídavkem 0,2 ml krve připraven prekurzorový roztok hydrogel pA. Dále byly použity 2 ml roztoku B prostředku pro přípravu hydrogelů. Složení prekurzorového roztoku pA a roztoku B popisuje tabulka 8.

Roztok pA		Roztok B
HRP.....................	...........0,9 U/ml	H₂O₂..................	.........9,2 mmol/1
CaCI₂-2H₂O...........	...........0,2 mol/1	HA-TA...............	.........50 mg/ml
HA-TA..................	...........50 mg/ml
Krev.....................	...........10 % (obj./obj.)

Tabulka 8: Složení prekurzorového roztoku pA a roztoku B pro přípravu hydrogelu s obsahem krve 5 % (obj./obj.).

Hydrogel s obsahem 5 % (obj./obj.) krve byl připraven smísením roztoku pA a roztoku B v objemovém poměru 1:1.

Takto připravený hydrogel obsahuje enzym křenovou peroxidázu, vápenaté ionty, kovalentně zesítěný hydroxyfenylový derivát hyaluronanu (crossHA-TA) a krev v těchto koncentracích:

HRP...............................0,45U/ml

CaCl₂ 2H₂O........................0,1mol/1 crossHA-TA.......................50mg/ml

Krev..........................5 % (obj./obj.)

- 19 CZ 33901 U1

Příklad 12

Příprava hydrogelů s obsahem krve (5 % obj ./obj.)

K přípravě roztoků prostředku pro přípravu hydrogelů byl použit derivát HA-TA (Mw = 2,81 x 10⁵ g.mol¹, DS 2,2 %). Z roztoku A (1,8 ml) prostředku pro přípravu hydrogelů o složení:

HRP.............................0,889 U/ml

CaCl₂-2H₂O....................0,223 mol/1

HA-TA.....................15,556 mg/ml, byl přídavkem 0,2 ml krve připraven prekurzorový roztok hydrogelu pA. Byly použity 2 ml roztoku B prostředku pro přípravu hydrogelů. Složení prekurzorového roztoku pA a roztoku B popisuje tabulka 9.

Roztok pA		Roztok B
HRP.....................	...........0,8 U/ml	H₂O₂..................	.........4,6 mmol/l
CaCI₂-2H₂O...........	...........0,2 mol/1	HA-TA...............	.........26 mg/ml
HA-TA..................	...........14 mg/ml
Krev.....................	...........10 % (obj./obj.)

Tabulka 9: Složení prekurzorového roztoku pA a roztoku B pro přípravu hydrogelu s obsahem krve 5 % (obj./obj.).

HRP.................................0,4 U/ml

CaCl₂ 2H₂O......................0,1 mol/1 crossHA-TA.....................20 mg/ml

Krev.........................5 % (obj ./obj.)

Příklad 13

Příprava hydrogelů s obsahem krve (5 %)

K přípravě roztoků prostředku pro přípravu hydrogelů byl použit derivát HA-TA (Mw = 1,45 x 10⁶ g.mol¹, DS 1,1 %). Z roztoku A (1,8 ml) prostředku pro přípravu hydrogelů o složení:

HRP..............................0,556 U/ml

CaCl₂-2H₂O.....................0,223 mol/1

HA-TA......................11,112 mg/ml, byl přídavkem 0,2 ml krve připraven prekurzorový roztok hydrogel pA. Byly použity 2 ml roztoku B prostředku pro přípravu hydrogelů. Složení prekurzorového roztoku pA a roztoku B popisuje tabulka 10.

-20 CZ 33901 U1

Roztok pA		Roztok B
HRP.....................	...........0,5 U/ml	H₂O₂..................	.........2,3 mmol/l
CaCI₂-2H₂O...........	...........0,2 mol/1	HA-TA...............	.........10 mg/ml
HA-TA..................	...........10 mg/ml
Krev.....................	...........10 % (obj./obj.)

Tabulka 10: Složení prekurzorového roztoku pA a roztoku B pro přípravu hydrogelů s obsahem krve 5 % (obj./obj.).

HRP...............................0,25 U/ml

CaCl₂-2H₂O.......................0,1 mol/1 crossHA-TA......................10 mg/ml

Krev..........................5 % (obj ./obj.)

Příklad 14

Přípravahydrogelů s obsahem krve (15 % obj./obj.)

K přípravě roztoků prostředku pro přípravu hydrogelů byl použit derivát HA-TA (Mw = 2,81 x 10⁵ g.mol¹, DS 2,2 %). Z roztoku A (1,4 ml) prostředku pro přípravu hydrogelů o složení:

HRP............................1,143 U/ml

CaCl₂ 2H₂O..................0,286 mol/1

HA-TA.........................20 mg/ml, byl přídavkem 0,6 ml krve připraven prekurzorový roztok hydrogel pA. Byly použity 2 ml roztoku B prostředku pro přípravu hydrogelů. Složení prekurzorového roztoku pA a roztoku B popisuje tabulka 11.

Roztok pA		Roztok B
HRP.....................	...........0,8 U/ml	H₂O₂..................	.........4,6 mmol/l
CaCI₂‘2H₂O...........	...........0,2 mol/1	HA-TA...............	.........26 mg/ml
HA-TA..................	...........14 mg/ml
Krev.....................	...........30 % (obj./obj.)

Tabulka 11 Složení prekurzorového roztoku pA a roztoku B pro přípravu hydrogelů s obsahem krve 15 % (obj./obj.).

Hydrogel s obsahem 15 % (obj ./obj.) krve byl připraven smísením roztoku pA a roztoku B v objemovém poměru 1:1.

HRP

0,4 U/ml

-21 CZ 33901 U1

CaCl₂ 2H₂O......................0,1 mol/1 crossHA-TA....................20 mg/ml

Krev.......................15% (obj ./obj.)

Příklad 15

Příprava hydrogelů s obsahem krve (30 %obj./obj.)

K přípravě roztoků prostředku pro přípravu hydrogelů byl použit derivát HA-TA (Mw = 5,4 x 10⁴ g.mol¹, DS 6,2 %). Z roztoku A (0,8 ml) prostředku pro přípravu hydrogelů o složení:

HRP................................2,25 U/ml

CaCl₂-2H₂O.....................0,5 mol/1

HA-TA.........................125 mg/ml, byl přídavkem 1,2 ml krve připraven prekurzorový roztok hydrogel pA. Byly použity 2 ml roztoku B prostředku pro přípravu hydrogelů. Složení prekurzorového roztoku pA a roztoku B popisuje tabulka 12.

Roztok pA		Roztok B
HRP.....................	...........0,9 U/ml	H₂O₂..................	.........9,3 mmol/1
CaCI₂-2H₂O...........	...........0,2 mol/1	HA-TA...............	.........50 mg/ml
HA-TA..................	...........50 mg/ml
Krev.....................	...........60 % (obj./obj.)

Tabulka 12 Složení prekurzorového roztoku pA a roztoku B pro přípravu hydrogelů s obsahem krve 15 % (obj./obj.).

Hydrogel s obsahem 30 % (obj ,/obj.) krve byl připraven smísením roztoku pA a roztoku B v objemovém poměru 1:1.

HRP..............................0,45 U/ml

CaCl₂-2H₂O......................0,1 mol/1 crossHA-TA......................50 mg/ml

Krev......................30 % (obj./obj.)

Příklad 16

Přípravahydrogelů s obsahem krve (30 % obj ./obj.)

K přípravě roztoků prostředku pro přípravu hydrogelů byl použit derivát HA-TA (Mw = 2,81 x 10⁵ g.mol¹, DS 2,2 %). Z roztoku A (0,8 ml) prostředku pro přípravu hydrogelů o složení:

HRP..........

CaCl₂ 2H₂O

HA-TA.......

...2 U/ml .0,5 mol/1 mg/ml

-22 CZ 33901 U1 byl přídavkem 1,2 ml krve připraven prekurzorový roztok hydrogelu pA. Byly použity 2 ml roztoku B prostředku pro přípravu hydrogelů. Složení prekurzorového roztoku pA a roztoku B popisuje tabulka 13.

Roztok pA		Roztok B
HRP.....................	...........0,8 U/ml	H₂O₂..................	.........4,6 mmol/1
CaCI₂-2H₂O...........	...........0,2 mol/1	HA-TA...............	.........26 mg/ml
HA-TA..................	...........14 mg/ml
Krev.....................	...........60 % (obj./obj.)

Tabulka 13: Složení prekurzorového roztoku pA a roztoku B pro přípravu hydrogelu s obsahem krve 30 % (obj./obj.).

Hydrogel s obsahem 30 % (obj./obj.) krve byl připraven smísením roztoku pA a roztoku B v objemovém poměru 1:1.

HRP...............................0,4 U/ml

CaCl₂-2H₂O......................0,1 mol/1 crossHA-TA.....................20 mg/ml

Krev...........................30% (obj ./obj.)

Příklad 17

Příprava hydrogelu s obsahem krevní plazmy (5 % obj ./obj.)

HRP.............................0,889 U/ml

Ca(HCO₃)₂...................0,223 mol/1 byl přídavkem 0,2 ml krevní plazmy připraven prekurzorový roztok hydrogelu pA. Byly použity ml roztoku B prostředku pro přípravu hydrogelů. Složení prekurzorového roztoku pA a roztoku B popisuje tabulka 14.

Roztok pA		Roztok B
HRP.......................	.........0,8 U/ml	H₂O₂..................	.........4,6 mmol/1
Ca(HCO₃)₂..............	.........0,2 mol/1	HA-TA...............	.........26 mg/ml
Krevní plazma.........	.........10 % (obj./obj.)

Tabulka 14: Složení prekurzorového roztoku pA a roztoku B pro přípravu hydrogelu s obsahem krevní plazmy 5 % (obj./obj.).

Hydrogel s obsahem 5 % (obj ./obj.) krevní plazmy byl připraven smísením roztoku pA a roztoku B v objemovém poměru 1:1.

Takto připravený hydrogel obsahuje enzym křenovou peroxidázu, vápenaté ionty, kovalentně zesítěný hydroxyfenylový derivát hyaluronanu (crossHA-TA) a krevní plazmu v těchto

-23 CZ 33901 U1 koncentracích:

HRP...............................0,4 U/ml

Ca(HCO₃)₂........................0,1 mol/1 crossHA-TA......................13 mg/ml

Krevní plazma..................5 % (obj./obj.)

Příklad 18

Přípravahydrogelů s obsahem krevní plazmy (15 % obj./obj.)

HRP............................

CaCl₂ 2H₂O...................

1,143 U/ml

0,286 mol/1 byl přídavkem 0,6 ml krevní plazmy připraven prekurzorový roztok hydrogel pA. Jako prekurzorový roztok pB byly použity 2 ml roztoku B prostředku pro přípravu hydrogelů. Složení prekurzorového roztoku pA a roztoku B popisuje tabulka 15.

Roztok pA	Roztok B
HRP.......................	.........0,8 U/ml	H₂O₂..................	.........4,6 mmol/1
CaCI₂-2H₂O.............	.........0,2 mol/1	HA-TA...............	.........26 mg/ml
Krevní plazma.........	.........30 % (obj./obj.)

Tabulka 15: Složení prekurzorového roztoku pA a roztoku B pro přípravu hydrogelu s obsahem krevní plazmy 15 % (obj./obj.).

Hydrogel s obsahem 15 % (obj./obj.) krevní plazmy byl připraven smísením roztoků pA a roztoku B v objemovém poměru 1:1.

Takto připravený hydrogel obsahuje enzym křenovou peroxidázu, vápenaté ionty, kovalentně zesítěný hydroxyfenylový derivát hyaluronanu (crossHA-TA) a krevní plazmu v těchto koncentracích:

HRP................................0,4 U/ml

CaCl₂ 2H₂O.......................0,1 mol/1 crossHA-TA.....................13 mg/ml

Krevní plazma...............15 % (obj./obj.)

Příklad 19

Přípravahydrogelu s obsahem krevní plazmy (30 % obj./obj.)

HRP................................2 U/ml

CaCl₂ 2H₂O

0,5 mol/1

-24 CZ 33901 U1 byl přídavkem 1,2 ml krve připraven prekurzorový roztok hydrogelu pA. Byly použity 2 ml roztoku B prostředku pro přípravu hydrogelů. Složení prekurzorového roztoku pA a roztoku B popisuje tabulka 16.

Roztok pA		Roztok B
HRP.......................	.........0,8 U/ml	H₂O₂..................	.........4,6 mmol/l
CaCI₂-2H₂O.............	.........0,2 mol/1	HA-TA...............	.........26 mg/ml
Krevní plazma.........	.........60 % (obj./obj.)

Tabulka 16 Složení prekurzorového roztoku pA a roztoku B pro přípravu hydrogelu s obsahem krevní plazmy 30 % (obj./obj.).

Hydrogel s obsahem 30 % (obj./obj.) krve byl připraven smísením roztoků pA a roztoku B v objemovém poměru 1:1.

0,4 U/ml

0,1 mol/1

HRP................................

CaCl₂-2H₂O.......................

crossHA-TA.......................

Krevní plazma....................

mg/ml % (obj./obj.)

Příklad 20

Příprava hydrogelů s obsahem frakce krevní plazmy bohaté na krevní destičky (PRP, 5 % obj./obj.)

HRP............................0,889 U/ml

Octan vápenatý................0,223 mol/1 byl přídavkem 0,2 ml PRP připraven prekurzorový roztok hydrogelu pA. Byly použity 2 ml roztoku B prostředku pro přípravu hydrogelů. Složení prekurzorového roztoku pA a roztoku B popisuje tabulka 17.

Roztok pA	Roztok B
HRP........................	........0,8 U/ml	H₂O₂..................	.........4,6 mmol/l
Octan vápenatý.......	........0,2 mol/1	HA-TA...............	.........26 mg/ml
PRP........................	........10 % (obj./obj.)

Tabulka 17: Složení prekurzorového roztoku pA a roztoku B pro přípravu hydrogelu s obsahem PRP 5 % (obj./obj.).

Hydrogel s obsahem 5 % (obj./obj.) PRP byl připraven smísením roztoku pA a roztoku B v objemovém poměru 1:1.

-25 CZ 33901 U1

Takto připravený hydrogel obsahuje enzym křenovou peroxidázu, vápenaté ionty, kovalentně zesítěný hydroxyfenylový derivát hyaluronanu (crossHA-TA) a PRP v těchto koncentracích:

HRP................................0,4 U/ml

Octan vápenatý...................0,1 mol/1 crossHA-TA.....................13 mg/ml

PRP...............................5 % (obj./obj.)

Příklad 21

HRP...............................0,889 U/ml

Mléčnan vápenatý...............0,023 mol/1 byl přídavkem 0,2 ml PRP připraven prekurzorový roztok hydrogelů pA. Byly použity 2 ml roztoku B prostředku pro přípravu hydrogelů. Složení prekurzorového roztoku pA a roztoku B popisuje tabulka 18.

Roztok pA HRP.......................	.........0,8 U/ml	Roztok B H2O2..................	.........4,6 mmol/l
Mléčnan vápenatý... PRP..........................	.........0,02 mol/1 ...10 % (obj./obj.)	HA-TA...............	.........26 mg/ml

Tabulka 18: Složení prekurzorového roztoku pA a roztoku B pro přípravu hydrogelu s obsahem PRP 5 % (obj./obj.).

.0,4 U/ml

0,1 mol/1

HRP..............................

Mléčnan vápenatý..............

crossHA-TA....................

PRP...............................

mg/ml % (obj./obj.)

Příklad 22

Příprava hydrogelů s obsahem frakce krevní plazmy bohaté na krevní destičky (PRP, 15 %)

K přípravě roztoků prostředku pro přípravu hydrogelů byl použit derivát HA-TA (Mw = 1,45 x 10⁶ g.mol¹, DS 1,1 %). Z roztoku A (1,4 ml) prostředku pro přípravu hydrogelů o složení:

HRP............................1,143 U/ml

-26 CZ 33901 U1

CaCl₂ 2H₂O

0,286 mol/1 byl přídavkem 0,6 ml PRP připraven prekurzorový roztok hydrogel pA. Byly použity 2 ml roztoku B prostředku pro přípravu hydrogelů. Složení prekurzorového roztoku pA a roztoku B popisuje tabulka 19.

Roztok pA	Roztok B
HRP.....................	...........0,8 U/ml	H₂O₂..................	.........4,6 mmol/l
CaCI₂-2H₂O...........	...........0,2 mol/1	HA-TA...............	.........26 mg/ml
PRP.....................	...........30 % (obj./obj.)

Tabulka 19: Složení prekurzorového roztoku pA a roztoku B pro přípravu hydrogelu s obsahem PRP 15 % (obj./obj.).

Hydrogel s obsahem 15 % (obj./obj.) PRP byl připraven smísením roztoku pA a roztoku B v objemovém poměru 1:1.

0,4 U/ml

0,1 mol/1

HRP.................................

CaCl₂-2H₂O.........................

crossHA-TA........................

PRP..................................

mg/ml % (obj./obj.)

Příklad 23

Příprava hydrogelů s obsahem frakce krevní plazmy bohaté na krevní destičky (PRP, 30 %)

HRP...................................2 U/ml

CaCl₂ 2H₂O...........................0,5 mol/1 byl přídavkem 1,2 ml PRP připraven prekurzorový roztok hydrogelu pA. Byly použity 2 ml roztoku B prostředku pro přípravu hydrogelů. Složení prekurzorového roztoku pA a roztoku B popisuje tabulka 20.

Roztok pA		Roztok B
HRP.....................	...........0,8 U/ml	H₂O₂..................	.........4,6 mmol/l
CaCI₂‘2H₂O...........	...........0,2 mol/1	HA-TA...............	.........26 mg/ml
PRP.....................	...........60 % (obj./obj.)

Tabulka 20 Složení prekurzorového roztoku pA a roztoku B pro přípravu hydrogelu s obsahem PRP 30 % (obj./obj.).

-27 CZ 33901 U1

Hydrogel s obsahem 30 % (obj./obj.) PRP byl připraven smísením roztoku pA a roztoku B v objemovém poměru 1:1.

.0,4 U/ml

0,1 mol/1

HRP.................................

CaCl₂-2H₂O.......................

crossHA-TA......................

PRP.................................

mg/ml % (obj./obj.)

Příklad 24

K přípravě roztoků prostředku pro přípravu hydrogelů byl použit derivát HA-TA (Mw = 1,45 x 10⁶ g.mol¹ kDa, DS 1,1 %). Z roztoku A (0,8 ml) prostředku pro přípravu hydrogelů o složení:

HRP .2 U/ml

Ca(H₂PO₄)₂.........................0,05 mol/1 byl přídavkem 1,2 ml PRP připraven prekurzorový roztok hydrogelu pA. Byly použity 2 ml roztoku B prostředku pro přípravu hydrogelů. Složení prekurzorového roztoku pA a roztoku B popisuje tabulka 21.

Roztok pA	Roztok B
HRP.....................	...........0,8 U/ml	H2O2..................	.........4,6 mmol/1
Ca(H₂PO₄)2...........	...........0,02 mol/1	HA-TA...............	.........26 mg/ml
PRP.....................	...........60 % (obj./obj.)

Tabulka 21 Složení prekurzorového roztoku pA a roztoku B pro přípravu hydrogelu s obsahem PRP 30 % (obj./obj.).

HRP..............................0,4 U/ml

Ca(H₂PO₄)₂....................0,01 mol/1 crossHA-TA...................13 mg/ml

PRP..............................30 % (obj./obj.)

Příklad 25

Příprava hydrogelů s obsahem frakce krevní plazmy bohaté na krevní destičky (PRP, 30 % obj./obj.)

K přípravě roztoků prostředku pro přípravu hydrogelů byl použit derivát HA-TA (Mw = 9,5 x 10⁴ g.mol¹, DS 8,6 %). Z roztoku A (0,8 ml) prostředku pro přípravu hydrogelů

-28 CZ 33901 U1 o složení:

HRP..................................2 U/ml

Ca(H₂PO₄)₂........................

HA-TA.............................

0,05 mol/1

100 mg/ml byl přídavkem 1,2 ml PRP připraven prekurzorový roztok hydrogelu pA. Byly použity 2 ml roztoku B prostředku pro přípravu hydrogelů. Složení prekurzorového roztoku pA a roztoku B popisuje tabulka 22.

Roztok pA		Roztok B
HRP.......................	.........0,8 U/ml	H2O2..................	.........4,6 mmol/l
Ca(H₂PO₄)2.............	.........0,02 mol/1
HA-TA....................	.........40 mg/ml
Krevní plazma.........	.........60 % (obj./obj.)

Tabulka 22 Složení prekurzorového roztoku pA a roztoku B pro přípravu hydrogelu s obsahem PRP 30 % (obj./obj.).

HRP..................................0,4 U/ml

Ca(H₂PO₄)₂.........................0,01 mol/1 crossHA-TA........................20 mg/ml

Krevní plazma........................30 % (obj./obj.)

Příklad 26

Příprava hydrogelů s obsahem krve (5 % obj ./obj.)

HRP..........

CaCl₂ 2H₂O

HA-TA......

0,889 U/ml

0,223 mol/1

15,556 mg/ml.

byl přídavkem 0,2 ml krve připraven prekurzorový roztok hydrogel pA. Byly použity 2 ml roztoku B prostředku pro přípravu hydrogelů. Složení prekurzorového roztoku pA a roztoku B popisuje tabulka 23.

Roztok pA		Roztok B
HRP.....................	...........0,8 U/ml	H2O2..................	.........4,6 mmol/l
CaCI₂-2H₂O...........	...........0,2 mol/1
HA-TA..................	...........14 mg/ml
Krev.....................	...........10 % (obj./obj.)

Tabulka 23: Složení prekurzorového roztoku pA a roztoku B pro přípravu hydrogelu

-29 CZ 33901 U1 s obsahem krve 5 % (obj./obj.).

Hydrogel s obsahem 5 % (obj./obj.) PRP byl připraven smísením roztokupA aroztokuB v objemovém poměru 1:1.

HRP...............................0,4 U/ml

CaCl₂ 2H₂O.....................0,1 mol/1 crossHA-TA.....................7 mg/ml krev..............................5 % (obj ./obj.).

Odkazy [1] Jin R. In-Situ Forming Biomimetic Hydrogels for Tissue Regeneration. In: Lin C, editor. Biomedicine: InTech; 2012.

[2] Sun S, Cao H, Su H, Tan T. Preparation and characterization of a novel injectable in situ cross-linked hydrogel. Polym Bull. 2009;62:699-711.

[3] Sklubalova Z. [In situ gelling polymers for ophthalmic drops]. Česka Slov Farm. 2005;54:410.

[4] Xu X, Jha AK, Harrington DA, Farach-Carson MC, Jia X. Hyaluronic Acid-Based Hydrogels: from a Natural Polysaccharide to Complex Networks. Soft matter. 2012;8:3280-94.

[5] Stem R, Kogan G, Jedrzejas MJ, Soltés L. The many ways to cleave hyaluronan. Biotechnology advances. 2007;25:537-57.

[6] Salwowska NM, Bebenek A, Zadlo DA, Wcislo-Dziadecka DL. Physiochemical properties and application of hyaluronic acid: a systematic review. Journal of Cosmetic Dermatology. 2016;15:520-6.

[7] Tognana E, Borrione A, De Luca C, Pavesio A. Hyalograft C: hyaluronan-based scaffolds in tissue-engineered cartilage. Cells, tissues, organs. 2007;186:97-103.

[8] Buck li DW, Alam M, Kim JYS. Injectable fillers for facial rejuvenation: a review. Journal of Plastic, Reconstructive & Aesthetic Surgery. 2009;62:11-8.

[9] Li P, Raitcheva D, Hawes M, Moran N, Yu X, Wang F, et al. Hylan G-F 20 maintains cartilage integrity and decreases osteophyte formation in osteoarthritis through both anabolic and anti-catabolic mechanisms. Osteoarthritis and cartilage. 2012;20:1336-46.

[10] Prestwich GD. Hyaluronic acid-based clinical biomaterials derived for cell and molecule delivery in regenerative medicine. Journal of controlled release : official journal of the Controlled Release Society. 2011;155:193-9.

[11] Burdick JA, Prestwich GD. Hyaluronic Acid Hydrogels for Biomedical Applications. Advanced Materials. 2011;23:H41-H56.

[12] Calabro A, Akst L, Alam D, Chan J, Darr AB, Fukamachi K, et al. Hydroxyphenyl crosslinked macromolecular network and applications thereof. United States: The Cleveland Clinic Foundation (Cleveland, OH, US); 2008.

[13] Kurisawa M, Lee F, Chung JE. Formation of Hydrogel in the Presence of Peroxidase and Low Concentration of Hydrogen Peroxide 2009.

[14] Lee F, Chung JE, Kurisawa M. An injectable enzymatically crosslinked hyaluronic acidtyramine hydrogel system with independent tuning of mechanical strength and gelation rate. Soft Matter. 2008;4:880-7.

[15] Darr A, Calabro A. Synthesis and characterization of tyramine-based hyaluronan hydrogels. Journal of Materials Science: Materials in Medicine. 2009;20:33-44.

[16] Akkara JA, Senecal KJ, Kaplan DL. Synthesis and characterization of polymers produced by horseradish peroxidase in dioxane. Journal of Polymer Science Part A: Polymer Chemistry. 1991;29:1561-74.

[17] Shutava T, Zheng Z, John V, Lvov Y. Microcapsule modification with peroxidase-catalyzed phenol polymerization. Biomacromolecules. 2004;5:914-21.

-30 CZ 33901 U1 [18] Ghan R, Shutava T, Patel A, John VT, Lvov Y. Enzyme-Catalyzed Polymerization of Phenols within Polyelectrolyte Microcapsules. Macromolecules. 2004;37:4519-24.

[19] Higashimura H, Kobayashi S. Oxidative Polymerization: John Wiley & Sons, Inc.; 2002.

[20] Veitch NC. Horseradish peroxidase: a modem view of a classic enzyme. Phytochemistry. 2004;65:249-59.

[21] Kurisawa M, Lee F, Wang L-S, Chung JE. Injectable enzymatically crosslinked hydrogel system with independent tuning of mechanical strength and gelation rate for drug delivery and tissue engineering. Journal of Materials Chemistry. 2010;20:5371-5.

[22] Snyder TN, Madhavan K, Intrator M, Dregalla RC, Park D. A fibrin/hyaluronic acid hydrogel for the delivery of mesenchymal stem cells and potential for articular cartilage repair. Journal of Biological Engineering. 2014;8.

[23] Li Z, Kaplan KM, Wertzel A, Peroglio M, Amit B, Alini M, et al. Biomimetic fibrinhyaluronan hydrogels for nucleus pulposus regeneration. Regenerative medicine. 2014;9:309- 26.

[24] Chance B. An intermediate compound in the catalase-hydrogen peroxide reaction. Acta chem scand. 1947;1:236-67.

[25] Odajima T, Yamazaki I. Myeloperoxidase of the leukocyte of normal blood. I. Reaction of myeloperoxidase with hydrogen peroxide. Biochimica et Biophysica Acta (BB A)-Enzymology. 1970;206:71-7.

[26] Giulivi C, Davies KJA. [30] Hydrogen peroxide-mediated ferrylhemoglobin generation in Vitro and in red blood cells. Methods in Enzymology: Academic Press; 1994. p. 490-6.

[27] Gasparro R, Qorri E, Valletta A, Masucci M, Sammartino P, Amato A, et al. NonTransfiisional Hemocomponents: From Biology to the Clinic—A Literature Review. Bioengineering. 2018;5:27.

[28] Sell SA, Ericksen JJ, Bowlin GL. The incorporation and controlled release of platelet-rich plasma-derived biomolecules from polymeric tissue engineering scaffolds. Polymer International. 2012;61:1703-9.

[29] Caroline D. Hoemann MDB, Marc D. Mckee. Composition and method for the repair and regeneration of cartilage and other tissues 2001.

[30] Ahmadi R, Bruijn JDd. Biocompatibility and gelation of chitosan-glycerol phosphate hydrogels. Journal of Biomedical Materials Research Part A. 2008;86A: 824-32.

[31] Zan J, Chen H, Jiang G, Lin Y, Ding F. Preparation and properties of crosslinked chitosan thermosensitive hydrogel for injectable drug delivery systems. Journal of Applied Polymer Science. 2006;101:1892-8.

[32] Shive MS, Hoemann CD, Restrepo A, Hurtig MB, Duval N, Ranger P, et al. BST-CarGel: in situ chondroinduction for cartilage repair. Operative Techniques in Orthopaedics. 2006;16:271-8.

[33] Lee H-R, Park KM, Joung YK, Park KD, Do SH. Platelet-rich plasma loaded hydrogel scaffold enhances chondrogenic differentiation and maturation with up-regulation of CB1 and CB2. Journal of Controlled Release. 2012;159:332-7.

[34] Lee F, Kurisawa M. Formation and stability of interpenetrating polymer network hydrogels consisting of fibrin and hyaluronic acid fortissue engineering. Acta Biomaterialia. 2013;9:514352.

Claims

NÁROKY NA OCHRANU

1. Prostředek pro použití k přípravě hydrogelů, vyznačující se tím, že zahrnuje dva oddělené roztoky A a B, z nichž roztok A obsahuje enzym křenovou peroxidázu a roztok B obsahuje peroxid vodíku, přičemž alespoň jeden roztok A nebo B obsahuje vápenaté ionty ve formě farmaceuticky přijatelné soli a dále roztok A a/nebo B obsahuje hydroxyfenylový derivát hyaluronanu obecného vzorce I

-31 CZ 33901 U1

Ac (I) kde n je v rozmezí 2 až 7500 a kde R je OH nebo substituent NHR₂CONHRiArOH obecného vzorce II, (Π) kde Ar je fenylen a Ri ethylen, nebo Ar je indoly den a Ri je ethylen, nebo Ar je hydroxyfenylen a Ri je karboxyethylen, a R> je alkylen o počtu uhlíků 3 až 7.

2. Prostředek podle nároku 1, vyznačující se tím, že roztok A obsahuje enzym křenovou peroxidázu o aktivitě 0,5 až 2,25 U/ml, s výhodou 1,8 až 2,2 U/ml, výhodněji 1,0 až 1,3 U/ml a roztok B obsahuje peroxid vodíku 2 až 10 mmol/l, s výhodou 3 až 7 mmol/l, výhodněji 4 až

3 x 10⁶ g/mol, s výhodou 1 x 10⁵ až 1 x 10⁶ g/mol, výhodněji 2 x 10⁵ až 4 x 10⁵ g/mol, stupeň substituce hydroxyfenylového derivátu hyaluronanu obecného vzorce I je v rozsahu 1 až 10 %, s výhodou v rozsahu 2 až 5 %, výhodněji 2 až 4 %.

3. Prostředek podle nároku 1 nebo nároku 2, vyznačující se tím, že hmotnostně střední molámí hmotnost hydroxyfenylového derivátu hyaluronanu obecného vzorce I je v rozsahu 4 x 10⁴ až

4. Prostředek podle kteréhokoliv z nároků 1 až 3, vyznačující se tím, že roztok A obsahuje:

• hydroxyfenylový derivát hyaluronanu obecného vzorce I o hmotnostně střední molámí hmotnosti v rozmezí 4x10⁴ až 3x10⁶ g/mol se stupněm substituce 1 až 10 % a koncentraci 10 až 125 mg/ml, • křenovou peroxidázu o aktivitě 0,5 až 2,25 U/ml, • vápenaté ionty v koncentraci 0,05 až 0,55 mol/1, a roztok B obsahuje:

• hydroxyfenylový derivát hyaluronanu obecného vzorce I o hmotnostně střední molámí hmotnosti v rozmezí 4 x 10⁴ až 3 x 10⁶ g/mol, se stupněm substituce 1 až 10 % a koncentraci 10 až 50 mg/ml • peroxid vodíku v rozmezí koncentrace 2 až 10 mmol/l.

5. Prostředek podle kteréhokoliv z nároků 1 až 4, vyznačující se tím, že roztok A obsahuje:

• hydroxyfenylový derivát hyaluronanu obecného vzorce I o hmotnostně střední molámí hmotnosti v rozmezí 1 x 10⁵ až 1 x 10⁶ g/mol, se stupněm substituce 2 až 5 %, v koncentraci 10 až 35 mg/ml,

-32 CZ 33901 U1 • křenovou peroxidázu o aktivitě 0,5 až 2,25 U/ml, • vápenaté ionty v koncentraci 0,05 až 0,55 mol/1, a roztok B obsahuje:

• hydroxyfenylový derivát hyaluronanu podle obecného vzorce (I) o hmotnostně střední molámí hmotnosti v rozmezí v rozmezí 1x10⁵ až 1x10⁶ g/mol se stupněm substituce 2 až 5 % a v koncentraci 26 mg/ml, • peroxid vodíku v rozmezí koncentrace 3 až 7 mmol/1.

5 mmol/l, přičemž alespoň jeden roztok A nebo B obsahuje vápenaté ionty v koncentraci 0,05 až 0,55 mol/1, s výhodou 0,25 až 0,55 mol/1, výhodněji 0,25 až 0,45 mmol/l, nejlépe 0,25 až 0,32 mmol/l a hydroxyfenylový derivát hyaluronanu obecného vzorce I o koncentraci 10 až 125 mg/ml, s výhodou 10 až 35 mg/ml, výhodněji 20 až 26 mg/ml.

6. Prostředek podle kteréhokoliv z nároků 1 až 5, vyznačující se tím, že roztok A obsahuje:

• hydroxyfenylový derivát hyaluronanu obecného vzorce I o hmotnostně střední molámí hmotnosti v rozmezí 2 x 10⁵ až 4 x 10⁵ g/mol, se stupněm substituce 2 až 5 % a v koncentraci 20 mg/ml, • křenovou peroxidázu o aktivitě 1,0 až 1,3 U/ml, • vápenaté ionty v koncentraci 0,25 až 0,32 mol/1 a roztok B obsahuje:

• hydroxyfenylový derivát hyaluronanu obecného vzorce I o hmotnostně střední molámí hmotnosti v rozmezí 2 x 10⁵ až 4 x 10⁵ g/mol, stupněm substituce 2 až 5 % a v koncentraci 26 mg/ml, • peroxid vodíku v rozmezí koncentrace 4 až 5 mmol/1.

7. Prostředek podle kteréhokoliv z nároků 1 až 3, vyznačující se tím, že roztok A obsahuje:

• křenovou peroxidázu o aktivitě 1,8 až 2,2 U/ml, • vápenaté ionty v koncentraci 0,45 až 0,55 mol/1, a roztok B obsahuje:

• hydroxyfenylový derivát hyaluronanu podle obecného vzorce (I) o hmotnostně střední molámí hmotnosti v rozmezí v rozmezí 2 x 10⁵ až 4 x 10⁵ g/mol se stupněm substituce 2 až 4 % a v koncentraci 26 mg/ml, • peroxid vodíku v rozmezí koncentrace 4 až 5 mmol/1.

8. Prostředek podle kteréhokoliv z nároků 1 až 3, vyznačující se tím, že roztok A obsahuje:

• křenovou peroxidázu o aktivitě 0,8 až 2,2 U/ml, • vápenaté ionty v koncentraci 0,02 až 0,5 mol/1, • hydroxyfenylový derivát hyaluronanu podle obecného vzorce (I) o hmotnostně střední molámí hmotnosti v rozmezí v rozmezí 9 x 10⁴ až 4 x 10⁵ g/mol se stupněm substituce 1 až 10 % a v koncentraci v rozsahu 10 až 50 mg/ml,