KR20220106283A

KR20220106283A - 자가 가교형 히알루론산 유도체 기반 창상피복재

Info

Publication number: KR20220106283A
Application number: KR1020210009030A
Authority: KR
Inventors: 이종승
Original assignee: (주)앰틱스바이오
Priority date: 2021-01-22
Filing date: 2021-01-22
Publication date: 2022-07-29

Abstract

본 발명은 갈롤기로 수식된 히알루론산 유도체를 기재로 하는 자가 가교형 하이드로젤 및 이의 용도에 관한 것이다. 또한 본 발명은 상기 가가 가교형 하이드로젤 및 표피생성인자를 포함하는 창상피복재에 관한 것이다.

Description

자가 가교형 히알루론산 유도체 기반 창상피복재 {A wound dressing based on auto crosslinking hyalironic acid derivatives}

본 발명은 자가 가교형 히알루론산 유도체 기반 창상피복재에 관한 것이다.

의료 및 바이오 산업, 화장품 등의 산업의 시장이 급격하게 확대됨에 따라 기능성 생체 재료에 대한 관심이 증가되고 있다. 특히, 독성이나 부작용을 유발할 수 있는 화학적 합성 고분자보다 안정성이 확보된 천연 고분자를 이용한 생체 소재에 대한 개발이 각광받고 있는 실정이다.

다양한 천연 고분자 중에서도 히알루론산은 생체유래 고분자로서 환자에 적용하였을때 부작용이 거의 발생하지 않으며, 당의 화학 구조식으로 인하여 친수성 특성을 지닌다. 또한, 수분을 많이 함유하여 관절에서 물리적 완충효과 및 마찰에 대한 윤활효과를 가지며, 피부의 유연성에 관여하는 것으로 알려져 있다. 아울러, 외부로부터의 세균 침입에 대한 보호 특성이 있고, 생체 내의 히알루론산 효소 (hyaluronidase)에 의해 생체 내 이식시 생분해되며, 다양한 약물을 히알루론산과 결합시킴으로써 약물 전달 시스템의 중요한 소재로 활용되고 있다. 특히, 히알루론산이 미국 식품의약품안전청의 승인을 받은 이후로, 의료용 생체재료, 조직 공학용 지지체의 소재 및 약물 전달용 고분자로 폭넓게 활용하고 있다.

종래의 히알루론산 관련 기술로서, 비스에폭사이드, 비스할라이드, 포름알데히드 등과 같이 작용기가 두 개인 화합물을 사용하여 가교 결합된 불용성 히알루론산 유도체를 합성한 예가 여러 문헌에 보고되었다. 특히, 미국특허 제4,582,865호는 히알루론산의 가교를 위해서 디비닐술폰을 사용한 예를 개시하고 있으며, 미국특허 제4,713,448호에는 포름알데히드를 이용한 가교반응, 미국특허 제5,356,883호는 다양한 카르보디이미드를 사용하여 O-아실우레아 또는 N-아실우레아로 카르복실기가 변형된 히알루론산 유도체 젤의 합성예를 개시하고 있다. 그러나 이들 특허에서의 방법으로 제조된 히알루론산 가교물은 히알루론산 분해효소에 대한 안정성이 낮고 미반응 화학 물질의 함량이 높기 때문에 생체 독성을 유발할 우려가 있었다. 또한, 사용하고자 하는 용도에 맞는 가교의 조절이나 물성 조절이 용이하지 않아 다양한 의료용 소재로 적용함에는 한계가 있었다.

이러한 배경하에서, 우수한 생체 적합성과 함께 히알루론산 하이드로젤의 물성을 손쉽게 조절할 수 있는 기술에 대한 개발이 절실히 요구되고 있으나, 아직은 미비한 실정이다.

미국특허 제4,582,865호 미국특허 제5,356,883호 미국특허 제4,713,448호

본 발명은 상기와 같은 문제점을 해결하기 위해 안출된 것으로서, 본 발명자들은 생체 적합성 물질인 히알루론산의 기능성을 향상시킬 수 있는 기술을 개발하고자 예의 노력한 결과, 갈롤기로 수식된 히알루론산 유도체 기반의 하이드로젤의 제조 기술을 개발하고, 이에 기초하여 본 발명을 완성하게 되었다.

이에, 본 발명의 목적은, 갈롤기로 수식된 히알루론산 유도체를 가교시키는 단계를 포함하는, 기능성이 강화된 히알루론산 하이드로젤의 제조방법을 제공하는데 있다.

또한, 본 발명의 다른 목적은 갈롤기로 수식된 히알루론산 유도체를 가교시켜 제조된, 기능성이 강화된 히알루론산 하이드로젤을 제공하는데 있다.

또한, 본 발명의 또 다른 목적은 상기 히알루론산 하이드로젤과 표피생장인자 (Epidermal Growth Factor (EGF))를 조직수복용 생체 재료를 제공하는 것이다.

그러나 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.

상기와 같은 본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 갈롤기로 수식된 히알루론산 유도체를 가교시키는 단계를 포함하며, 상기 히알루론산 유도체는 히알루론산과 5'-하이드록시도파민간 반응에 의해 갈롤기로 수식되어 있는, 히알루론산 하이드로젤의 제조방법을 제공한다.

본 발명의 일 구현예로서, 상기 히알루론산 유도체는 하기 화학식 1일 수 있으며, 여기서, 상기 히알루론산 유도체의 분자량은 10,000Da 내지 2,000,000Da일 수 있고, 상기 히알루론산 유도체의 갈롤기 치환율은 2% 내지 15%일 수 있다.

[화학식 1]

(상기 화학식 1에서, R₁은 하이드록시기 또는

이고, n은 1 내지 1,000의 정수이다.)

본 발명의 다른 구현예로서, 상기 가교시키는 단계는 산화제 또는 pH 조절제를 첨가하여 가교시킬 수 있고, 상기 산화제는 과요오드산나트륨, 과산화수소, 겨자무과산화효소 또는 타이로시나아제일 수 있고, 상기 pH 조절제는 수산화나트륨, 수산화리튬, 수산화칼륨, 수산화루비듐, 수산화세슘, 수산화마그네슘, 수산화칼슘, 수산화스트론튬 또는 수산화바륨일 수 있다.

본 발명의 또 다른 구현예로서, 상기 산화제를 첨가하여 가교시키는 단계는, 히알루론산 유도체간 하기 화학식 2의 가교 결합을 형성할 수 있다.

[화학식 2]

(상기 화학식 2에서, HA'는 카르복시기가 아마이드기로 치환된 히알루론산을 나타낸다.)

본 발명의 또 다른 구현예로서, 상기 pH 조절제를 첨가하여 가교시키는 단계는, 히알루론산 유도체간 하기 화학식 3의 가교 결합을 형성할 수 있다.

[화학식 3]

(상기 화학식 3에서, HA'는 카르복시기가 아마이드기로 치환된 히알루론산을 나타낸다.)

또한, 본 발명은 상기 화학식 1의 히알루론산 유도체를 가교시켜 제조된 히알루론산 하이드로젤로서, 히알루론산 유도체간 상기 화학식 2 또는 화학식 3의 가교 결합이 형성되어 있는 히알루론산 하이드로젤; 및 상기 히알루론산 하이드로젤을 포함하는 약물 전달용 담체를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 화학식 1의 히알루론산 유도체를 가교시켜 제조된 히알루론산 하이드로젤로서, 히알루론산 유도체간 상기 화학식 2 또는 화학식 3의 가교 결합이 형성되어 있는 히알루론산 하이드로젤; 및 상기 히알루론산 하이드로젤을 포함하는 조직 공학용 지지체를 제공한다.

본 발명의 일 구현예로서, 상기 히알루론산 유도체의 분자량은 10,000Da 내지 2,000,000Da일 수 있고, 상기 히알루론산 유도체의 갈롤기 치환율은 1% 내지 15%일 수 있다.

본 발명에 따른 히알루론산 하이드로젤의 제조 기술은, 갈롤기로 수식된 히알루론산 유도체를 기초로 하여, 적절한 산화 또는 특정 pH 조건 하에서 이를 가교시키는 단계를 포함한다. 하이드로젤의 우수한 생체 적합성과 함께, 각각의 가교 방식에 따라 가교 속도, 탄성, 접착력 등의 물리적 특성을 효율적으로 조절할 수 있었는바, 본 발명의 하이드로젤은 이러한 우수한 안정성과 기능성을 바탕으로 의료, 화장품 등 다양한 분야에 활용될 수 있을 것이다.

도 1은, 본 발명에 따른 히알루론산 유도체의 합성 과정을 나타낸 도이다.
도 2는, 본 발명에 따른 히알루론산 유도체의 구조를 (a) FT-IR 또는 (b) H-NMR으로 분석한 결과이다.
도 3은, 가교 방식에 의한 히알루론산 하이드로젤의 외관 및 가교 결합의 변화를 개략적으로 나타낸 모식도이다.
도 4는, NaIO₄를 이용한 히알루론산 하이드로젤의 제조 과정에서, (a) 화학 구조의 변화를 UV-vis으로 분석한 결과, 및 (b) 상기 결과에 기초한 가교 메커니즘을 나타낸 도이다.
도 5는, NaOH를 이용한 히알루론산 하이드로젤의 제조 과정에서, (a) 화학 구조의 변화를 UV-vis으로 분석한 결과, 및 (b) 상기 결과에 기초한 가교 메커니즘을 나타낸 도이다.
도 6은 본 발명의 히알루론산 하이드로젤에 있어서 히알루론한 (HA)의 분자량에 따른 저장탄성률 (G')의 변화를 나타낸 것이다.
도 7은 본 발명의 히알루론산 하이드로젤을 창상부위에 적용한 후 방수력을 확인한 결과이다.
도 8은 본 발명에 따른 히알루론산 하이드로젤의 세포 독성 및 염증 반응 유발 여부를 확인한 것으로서, (a) 히알루론산 하이드로젤 내에서의 세포 생존율 변화, 및 (b) 히알루론산 하이드로젤과 면역세포의 공배양시 면역세포에서 분비되는 TNF-α의 양을 평가한 결과이다.
도 9는 본 발명에 따른 히알루론산 하이드로젤의 생체 내 적합성을 확인한 것으로서, 쥐 피하에 이식한 후 수거된 히알루론산 하이드로젤의 (a) H&E 염색 결과, 및 (b) Toluidine blue 염색 결과이다.
도 10은, 본 발명에 따른 히알루론산 하이드로젤의 생체내 분해 양상을 확인한 것으로서, 쥐 피하에 이식한 후 (a) 육안으로 하이드로젤의 부피 변화를 확인한 결과, 및 (b) 잔존 하이드로젤의 중량을 확인한 결과이다.

이하, 본 발명을 상세히 설명하기로 한다.

본 발명은 갈롤기로 수식된 히알루론산 유도체를 가교시키는 단계를 포함하며, 상기 히알루론산 유도체는 히알루론산과 5'-하이드록시도파민간 반응에 의해 갈롤기로 수식되어 있는, 히알루론산 하이드로젤의 제조방법을 제공한다.

본 발명에서 사용되는 용어, "히알루론산(Hyaluronic acid, HA)"은 D-글루쿠론산(D-glucuronic acid, GlcA) 및 N-아세틸-D-글루코사민(GlcNAc)기 β 1,3-글라이코시드 결합(β 1,3-glycosidic bond)에 의해 연결되어 있는 다이사카라이드를 반복단위로 포함하는 고분자량의 선형 폴리사카라이드로서, 히알루론산과 그의 염을 모두 지칭하고, 이에 제한되는 것은 아니나, 상기 염으로는 나트륨염, 칼륨염, 마그네슘염, 칼슘염, 알루미늄염 등이 예시된다.

히알루론산의 다이사카라이드 반복단위(repeating unit)는 하기 화학식 4와 같으며, 상기 반복단위는 1 내지 1,000개일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

[화학식 4]

히알루론산은 안구의 유리액, 관절의 활액, 닭벼슬 등으로부터 발견되고 있으며, 생체 적합성이 높은 생체 재료로 알려져 있다. 히알루론산 하이드로젤은 바이오 소재로의 높은 적용 가능성에도 불구하고, 천연 고분자 자체로부터 기인하는 기계적 특성의 한계점으로 인하여, 생체 재료(예, 약물 전달체, 조직 공학용 지지체)로 적용함에 어려움을 겪고 있는 실정이다. 이에, 본 발명자들은 높은 산화능을 갖는 갈롤기를 히알루론산에 도입하여 히알루론산 유도체를 제조하였으며(제조예 1), 이러한 히알루론산 유도체를 적절한 산화 또는 특정 pH 조건 (pH 8-9) 하에서 가교시켜 하이드로젤을 제조함으로써(제조예 2), 가교 속도, 탄성, 접착력 등의 물리적 특성을 효율적으로 조절할 수 있었다는 점에 기술적 의의가 있다(실시예 1 및 3).

본 발명에서 사용되는 용어, "히알루론산 유도체"는 히알루론산 또는 그의 염의 글루쿠론산의 골격에 갈롤기가 도입되어 있는 히알루론산 또는 그의 염을 모두 포함하는 것으로 해석된다.

한 구체예로서, 상기 화학식 4의 다이사카라이드 반복단위의 말단, 구체적으로, 이의 카르복시기와 5'-하이드록시도파민간 반응에 의해 제조될 수 있다. 상기의 반응에 의해 제조된 히알루론산 유도체는 하기 화학식 5의 반복단위를 하나 이상 포함하며, 하기 화학식 1과 같이 나타낼 수 있다.

[화학식 5]

[화학식 1]

(상기 화학식 1에서, R₁은 하이드록시기 또는

이고, n은 1 내지 1,000의 정수이다.)

또한, 상기 히알루론산 유도체의 분자량은 10,000Da 내지 2,000,000Da 일 수 있고, 상기 히알루론산 유도체의 갈롤기 치환율은 0.5% 내지 15%일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 "치환율"은 히알루론산 또는 그의 염의 특정 기능기가 갈롤기로 대체되거나 수식되는 것을 의미한다. 갈롤기로의 치환율은 전체 히알루론산 반복단위 중 갈롤기가 도입된 반복단위의 비율로 정의되며, 정의상 0 초과 1 이하의 수치, 또는 0% 초과 100% 이하의 수치, 또는 0몰% 초과 100몰% 이하의 수치로 표현될 수 있다.

본 발명에서 사용되는 용어, "하이드로젤"은 충분한 양의 수분을 보유하고 있는 친수성 고분자의 3차원적 구조를 의미하며, 본 발명의 목적상, 상기 하이드로젤은 갈롤기로 수식된 히알루론산 유도체 간에 형성된 하이드로젤을 나타낸다.

상기 히알루론산 하이드로젤의 제조 과정은, 상기 히알루론산 유도체의 가교 반응에 의해 진행될 수 있으며, 상기 가교 반응을 위하여 상기 히알루론산 유도체와 PBS 등과 혼합하여 히알루론산 하이드로젤 전구체 용액을 제조하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 이러한 가교는 UV 조사에 의한 화학적 가교, 물리학적 가교 또는 생물학적 가교에 의해 하이드로젤로 형성될 수 있다. 여기서, UV 조사에 의한 화학적 가교로는 광가교(photo-crosslinking) 또는 반응성 가교제(reactive crosslinker)를 활용한 가교 등이 있고, 생물학적 가교로는 헤파린과 성장인자의 결합력을 활용한 가교 또는 DNA 등의 상보적 결합을 이용한 가교 등이 있으며, 물리적 가교로는 수소결합에 의한 가교, 소수성(hydrophobic) 상호작용에 의한 가교 또는 정전기적 상호작용을 활용한 가교 등이 있으나, 가장 바람직하게는, 산화제 또는 pH 조절제를 첨가하여 가교시킬 수 있다. 상기 산화제는 과요오드산나트륨, 과산화수소, 겨자무과산화효소 또는 타이로시나아제일 수 있고, 상기 pH 조절제는 수산화나트륨, 수산화리튬, 수산화칼륨, 수산화루비듐, 수산화세슘, 수산화마그네슘, 수산화칼슘, 수산화스트론튬 또는 수산화바륨일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

한 구체예로서, 상기 산화제를 첨가하여 가교시키는 경우, 히알루론산 유도체간 하기 화학식 2의 가교 결합을 형성한다. 화학식 2에서, HA'는 카르복시기가 아마이드기로 치환된 히알루론산을 나타낸다.

[화학식 2]

다른 구체예로서, 상기 pH 조절제를 첨가하여 가교시키는 경우, 히알루론산 유도체간 하기 화학식 3의 가교 결합을 형성한다. 화학식 3에서, HA'는 카르복시기가 아마이드기로 치환된 히알루론산을 나타낸다.

[화학식 3]

본 발명의 일 실시예에서는, 갈롤기로 수식된 히알루론산 유도체의 가교 단계에서 각각 산화제인 과요오드산나트륨 또는 pH 조절제인 수산화나트륨을 이용하여 히알루론산 하이드로젤을 제조하였으며(제조예 2 참조), 그 결과, 각각의 가교 방식에 따라 제조된 히알루론산 하이드로젤은 우수한 생체 적합성과 함께 가교 속도, 강도, 탄성, 접착력, 분해 양상 등 물리적 특성의 현격한 차이를 확인할 수 있었다(실시예 1 내지 3 참조).

이에, 본 발명의 다른 양태로서, 상기 화학식 1의 히알루론산 유도체를 가교시켜 제조된 히알루론산 하이드로젤로서, 히알루론산 유도체간 상기 화학식 2의 가교 결합이 형성되어 있는 히알루론산 하이드로젤; 및 상기 히알루론산 하이드로젤을 포함하는 약물 전달용 담체 또는 조직 공학용 지지체를 제공한다.

또한, 본 발명의 또 다른 양태로서, 상기 화학식 1의 히알루론산 유도체를 가교시켜 제조된 히알루론산 하이드로젤로서, 히알루론산 유도체간 상기 화학식 3의 가교 결합이 형성되어 있는 히알루론산 하이드로젤; 및 상기 히알루론산 하이드로젤을 포함하는 약물 전달용 담체 또는 조직 공학용 지지체를 제공한다.

본 발명의 히알루론산 하이드로젤은 약물 전달용 유효 골격으로서의 인공 세포외 기질로 사용될 수 있으며, 상기 갈롤기가 수식된 히알루론산 유도체의 뛰어난 산화능에 의해 나노 또는 마이크로 단위의 극미립자 형태를 구현할 수 있다는 점에 기술적 의의가 있다. 상기 약물은 특별하게 제한되지 않으나, 바람직하게 화학물질, 소분자, 펩타이드, 단백질 의약품, 핵산, 바이러스, 항균제, 항암제, 항염증제, 또는 이들의 혼합물 등을 포함할 수 있다.

또한, 본 발명의 히알루론산 하이드로젤은 우수한 탄성 및 접착력을 바탕으로 조직 공학용 지지체로 사용될 수 있다. 조직 공학이란, 환자의 조직으로부터 분리된 세포를 지지체에 배양하여 세포-지지체 복합체를 제조한 후, 제조된 세포-지지체 복합체를 다시 생체 내에 이식하는 것을 일컬으며, 상기 히알루론산 하이드로젤은 생체조직 및 장기의 재생을 최적화하기 위하여, 생체 조직과 유사한 지지체로 구현될 수 있고, 이 뿐만 아니라, 화장품, 상처 피복재, 치과용 매트릭스 등의 의료용 소재로도 활용될 수 있다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.

[제조예]

제조예 1. 갈롤기로 수식된 히알루론산 유도체의 제조

도 1에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 갈롤기로 수식된 히알루론산 유도체를 제조하였다. 구체적으로, 히알루론산을 물에 완전히 용해시키고, 1 당량의 NHS 와 1.5 당량의 EDC를 첨가하였으며, 이로부터 30분 후, 1 당량의 5'-하이드록시도파민을 첨가하여 pH 4~4.5에서 24시간 동안 반응시켰다. 이후, EDC, NHS, 5'-하이드록시도파민을 PBS 및 물 기반의 투석으로 제거하고, 동결 건조를 통해 용매를 증발시켜 본 발명의 히알루론산 유도체를 제조하였다.

상기 히알루론산 유도체의 합성을 확인하고자, FT-IR(Fourier transform-infrared spectroscopy) 및 H-NMR(proton Nuclear magnetic Resonance)로 분석한 결과, 도 2a에 나타낸 바와 같이, 약 1580cm^-1에서 1700cm^-1 파수 영역에서의 강한 피크를 통해 새롭게 형성된 아마이드 결합을 확인할 수 있었으며, 도 2b에 나타낸 바와 같이, 6.5ppm 및 3ppm 부근의 피크를 통해 각각 5'-하이드록시도파민의 방향족의 벤젠고리 및 -CH₂CH₂-의 구조를 확인할 수 있었다. 상기 결과로부터 본 발명의 히알루론산 유도체는, 히알루론산의 카르복시기와 5'-하이드록시도파민의 아민기간 형성된 아마이드 결합으로 5'-하이드록시도파민이 도입됨을 알 수 있었다.

제조예 2. 히알루론산 하이드로젤의 제조

상기 제조예 1의 히알루론산 유도체를 가교(Cross-linking)시켜 히알루론산 하이드로젤을 제조하였으며, 이때, 가교 방식은 산화제인 과요오드산나트륨(NaIO₄) 또는 pH 조절제(pH 8-9)인 수산화나트륨(NaOH)을 각각 이용하였다. 구체적으로, 상기 히알루론산 유도체를 PBS에 용해시킨 뒤 (1% (w/v), 2% (w/v)), 4.5mg/ml의 NaIO₄또는 0.08M의 NaOH를 히알루론산 유도체 용액 부피 대비 3:1의 비율로 혼합시키면서 가교를 진행하였으며, 도 3에 나타낸 바와 같이, 이들 각각을 통해 밝은 갈색 또는 푸른색을 띄는 히알루론산 하이드로젤을 제조하였다.

상기 히알루론산 하이드로젤의 가교를 구체적으로 확인하고자, UV-vis(Ultraviolet-visible spectroscopy)으로 분석하였다. NaIO₄를 이용한 경우, 도 4에 나타낸 바와 같이, 시간의 경과에 따라 350-400nm 파장 영역이 변화됨을 확인할 수 있었으며(도 4a), 이는 산화 과정에서 중간체인 라디컬의 순간적인 형성과 감소를 의미하는 것으로, 이후 라디컬 중합반응에 의해 바이페놀 (biphenol)이 형성됨을 알 수 있었다(도 4b). 또한, NaOH를 이용한 경우, 도 5에 나타낸 바와 같이, 시간의 경과에 따라 600nm 파장 영역이 변화됨을 확인할 수 있었으며(도 5a), 이는 산화 과정에서 [5+2] tautomerization에 의해 전하 이동 복합체 및 벤조트로폴론 (benzotropolone)이 형성됨을 알 수 있었다(도 5b).

[실시예]

실시예 1. 가교 방식에 따른 히알루론산 하이드로젤의 물성 변화

본 실시예에서는, 상기 제조예 2의 가교 방식의 차이에 따른 히알루론산 하이드로젤의 물성 변화를 비교하였다. 한편, 상기 하이드로젤의 제조 단계에서, 히알루론산 대비 5'-하이드록시도파민의 몰 농도비(0.5X(HA : EDC : NHS : 5'-hydroxydopamine = 2 : 1.5 : 1 : 1), 1X(HA : EDC : NHS : 5'-hydroxydopamine = 1 : 1.5 : 1 : 1))에 의해 갈롤기의 치환율을 4-5% (0.5X), 또는 8-9% (1X)로 조절할 수 있었으며(미도시), 5'-하이드록시도파민의 치환 정도에 따른 하이드로젤의 물성 변화도 비교하였다.

구체적으로, 시간의 경과에 따른 하이드로젤 형성 및 탄성계수의 변화를 가교 방식에 따라 비교하였고, 가교 방식 및 5'-하이드록시도파민의 치환 정도에 따른 탄성, 접착력, 팽윤, 및 분해 양상을 각각 비교 분석하였다.

1-1. 히알루론산 (HA)의 분자량 및 갈롤기 (PG) 수식 비율에 따른 G'의 변화

히알루론산 (HA)의 분자량에 다른 G'의 변화를 측정하였다. 레오미터 ((Thermo Scientfic Haake MARS-40))를 이용해 G`(Shear Storage Modulus, 저장탄성률)과 G``(Shear Loss Modulus, 손실탄성률)을 측정하고 이 둘의 비율인

을 측정하였다. HA 크기에 따른 HA-PG 하이드로겔의 물성을 측정하기 위해 HA 크기를 20K~1M Da으로 달리해가면서 측정하였으며, 그 결과를 도 6 및 아래 표 1에 나타냈다. 도 6은 측정 주파수 (frequency)를 달리하면서 측정한 결과를 니티낸 것으로서, 하이드로젤의 제조에 사용된 히알루론산의 분자량(20K ~ 1M)의 크기에 비례하여 G'이 증가하고 tanδ는 감소하는 것이 확인되었으며, G'은 0.1 내지 10 Hz의 주파수 범위 내에서 안정적인 것으로 나타났다. 이 때, 상기 히알루론산 하이드로젤은 갈롤기의 치환율이 1X (r=1)가 되도록 제조하여 사용하였다.

HA 크기	G'(Pa)	G''(Pa)	tanδ
20K	264.87	2.73	0.010
60K	793.34	9.13	0.012
100K	672.25	6.93	0.010
200K	955.65	8.50	0.009
500K	1371.21	12.74	0.009
700K	1274.77	12.82	0.010
1M	1298.42	9.60	0.007

또한, 갈롤기(PG)의 수식 비율에 따른 G’의 변화를 측정하였으며, 표 2에 나타낸 것과 같이 갈롤기의 수식 비율에 비례하여 G'이 증가하는 것을 확인하였다. 이는 HA 분자량 뿐만 아니라 PG 수식 비율을 조절함으로써 다양한 물성의 히알루론산 하이드로겔을 제조할 수 있음을 제시한다.

f=1Hz	G'(Pa)	G''(Pa)	tanδ
190617 20K r=0.5	158.17	2.53	0.017
190617 20K r=1	264.87	2.73	0.010
190619 200K r=0.5	320.72	5.66	0.009
190619 200K r=1	1491.58	18.15	0.009
190619 200K r=1.5	1869.52	25.67	0.010

1-2. 점도 변화

HA의 분자량 및 PG의 수식 비율을 달리하면서 제조한 히알루론산 하이드로젤의 점도 및 점착력을 비요하였다. 히알루론산 하이드로젤을 PBS 완충액에 녹이고 레오미터 측정 플레이트에 도포 하였다. in vivo 모사조건을 구현하기 위하여 산화제(NaIO₄)를 첨가하여 하이드로젤화를 유도 후, 레오미터를 이용하여 G’(저장탄성율), G’’(손실탄성율), Tanδ(손실탄성율/저장탄성율 비율), η(점도), 및 Fn(접착성)을 측정하고 이를 표 3에 나타냈다. 또한, 항상화 효능의 유무를 ABTS assay 법으로 분석하였다.

	G’(Pa)	G" (Pa)	Tanδ	η(Pa x S)		항산화 효능	Fn(N)
	G’(Pa)	G" (Pa)	Tanδ	Gelation 전	Gelation 후	항산화 효능	Fn(N)
HA-PG_20K_r=1	264.87	2.73	0.010	1.2x10^-2	212.9	O	-8.47
HA-PG_100K_r=1	672.25	6.93	0.010	2.0x10^-2	263.0	O	-13.83
HA-PG_200K_r=1	955.65	8.50	0.009	7.8x10^-2	324.4	O	-10.86
HA-PG_1M_r=1	1451.35	12.19	0.008	17.1	917.4	O	측정불가

HA-PG를 상처부위에 도포 할 경우 피부조직과 강하여 접착하여 지속적인 상처 치유가 가능할 것으로 기대된다.

1-3. 점착력 확인

SD 래트(암컷, 7주령, ㈜중아바이오)를 사용하여 점착력의 변화를 확인하였다. SD 래트를 실험동물센터(성균관대학교)에 반입 한 후 순화를 위해 일주일 동안 사료 및 물을 자유롭게 급식하여 적응시켰다. 이소플루란(isoflurane)으로 마취한 후, 등 부위의 털을 제모하고 직경 2 x 2 cm의 크기로 진피층을 포함하여 전층 결손 창상을 유발하였다. PBS에 상기 제조한 HA-PG (200K, 1X)를 최종 농도가 2%가 되도록 용해시켜 제조한 용액 0.5 ㎖로 상기 유발한 창상 부위를 도포한 후, NaOH 1M용액 20 ㎕를 가하여 젤화를 유도하였다. 완전히 겔화된 부위 및 정상 피부 조직(원형, 35 ㎜)을 절취 하고 레오미터로 측정하였다. 피부조직에 메디폼 0.5 ㎖를 도포하고 대조군으로 사용하였다. P35/Ti rotor를 천천히 내려서 레오미터 플레이트에 고정된 피부조직에 접촉시킨 후 Rotor를 3 ㎜/분의 속도로 올리면서 점착력 (Fn)을 측정하였다.

1-4. 방수력 확인

상기 1-3과 같은 방법으로 SD래트의 등부위에 창상을 유발하였다. PBS에 HA-PG를 2%로 녹여 준비한 뒤, 창상 부위에 액체 상태의 HA-PG (200K)를 0.3 ㎖ 도포하였다. 핀셋을 이용하여 도포된 HA-PG를 5~ 10분 간격으로 들어올려 겔화가 진행되는 시점을 확인하였다. 겔화된 HA-PG 위에 브로모페놀블루 (bromophenol blue) 용액 100 ㎕를 가하고 물방울 형태 형성 유무를 확인하였다. 도 7은 그 결과를 나타낸다.

실시예 2. 창상 회복 효능 확인

SD 래트 (7주령, 수컷 오리엔트바이오(주))의 등 부위에 상기와 같은 방법으로 창상을 유발한 후 본 발명에 따라 제조한 히알루론산 하이드로젤에 hEGF(ProSpec, CYT-217)을 혼합하고 단회 도포하여 창상 치료에 대한 효력 평가하였다. 본 실시예를 위한 시험군은 다음과 같이 구성하였다.

G1: 대조군(PBS); G2: hEGF(20 ug/0.2 ml); G3: HA-PG/hEGF(200K, 2%, 0.2 ml); G4: HA-PG/hEGF/Mg(OH)2; G5: 양성 대조군 (메디폼 리퀴드 ((㈜제네웰)

실시예 3. 세포 독성 및 생체 적합성 분석

본 실시예에서는, 상기 제조예 2의 히알루론산 하이드로젤의 세포 독성 및 생체 적합성을 평가하고자 하였다. 우선, 3D 세포 배양에서의 독성 및 염증반응 유발 여부를 확인하기 위하여, 하이드로젤에 줄기세포(human adipose-derived stem cell, hADSC)를 배양하고 각 time point에서 Live/Dead 염색을 실시하였으며, 이와는 별개로, 면역세포(Raw 264.7)를 하이드로젤에 공생 배양한 후, 염증 반응에 의해 분비되는 종양괴사인자(TNF-α)의 양을 ELISA(enzyme-linked immunosorbent assay)를 이용해 측정하였다. 한편, 마우스의 피하에 상기 하이드로젤을 이식하고, 7일째 이식 부위의 조직을 채취하였다. 이후, 제작된 OCT 동결 절편을 H&E 또는 Toluidine blue으로 염색하고, 조직병리학적 변화를 관찰함으로써, in vivo에서의 생체 적합성을 평가하였다. 그 결과, 도 8에 나타낸 바와 같이, 가교 방식에 따른 두 형태의 하이드로젤 모두, 배양 7일 후까지 세포 독성을 나타내지 않았다(도 8a). LPS에 의해 증가된 TNF-α는 상기 두 형태의 하이드로젤을 처리한 경우, 소량만이 검출되었고, 아무런 처리를 하지 않은 대조군(NT)과도 큰 차이가 없었다(도 8b). 또한, 도 9에 나타낸 바와 같이, 상기 하이드로젤을 마우스에 이식한 경우에도, 특이적 염증 소견은 관찰되지 않았으며(도 9a), 이식된 하이드로젤 부근, 대식세포 등 염증 관련 세포의 증식없이 그 구조가 잘 유지되고 있음을 확인할 수 있었다(도 9b).

실시예 3. 생체 내 분해 양상 분석

본 실시예에서는, 가교 방식(NaIO₄/NaOH) 및 반응시킨 5'-하이드록시도파민의 몰비(0.5X, 1X)에 차이가 있는 히알루론산 하이드로젤을 마우스에 피하에 이식하였다. 이식한 당일, 이로부터 1주, 4주, 및 12주 후에 마우스를 희생시키고 각각의 하이드로젤을 채취하여 이들의 팽윤 정도를 육안으로 확인하고, 생체 내 잔존량을 산출함으로써, 생체 내 분해 양상 등을 분석하였다. 그 결과, 도 10에 나타낸 바와 같이, NaIO₄를 이용하여 가교시킨 하이드로젤은 보다 팽윤의 정도가 적음을 확인할 수 있었고, 보다 빠르게 생체 내 분해가 이루어짐을 알 수 있었다. 또한, 동일한 가교 방식일 경우, 5'-하이드록시도파민(갈롤기)의 치환율이 증가한 경우, 분해 속도는 감소되는 경향을 보였다.

전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다.

Claims

하기 화학식 1의 히알루론산 유도체를 가교시켜 제조된 히알루론산 하이드로젤로서, 하기 화학식 2 또는 화학식 3의 가교 결합이 형성된 히알루론산 하이드로젤 및 및 표피생성인자 (EGF)를 포함하는, 창상피복재.
[화학식 1]

(상기 화학식 1에서, R₁은 하이드록시기 또는
이고, n은 1 내지 500의 정수이다.)
[화학식 2]

(상기 화학식 2에서, HA'는 카르복시기가 아마이드기로 치환된 히알루론산을 나타낸다.)
[화학식 3]

(상기 화학식 3에서, HA'는 카르복시기가 아마이드기로 치환된 히알루론산을 나타낸다.).
제1항에 있어서, 상기 히알루론산 유도체의 분자량은 10,000Da 내지 2,000,000Da인 것을 특징으로 하는, 창상피복재.
제1항에 있어서, 상기 히알루론산 유도체는, 1% 내지 15%의 갈롤기 치환율을 갖는 것을 특징으로 하는, 창상피복재.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, Mg(OH)₂를 더 포함하는 것인, 창상피복재.