DE60113398T2

DE60113398T2 - Polysaccharidester von n-derivaten der glutaminsäure

Info

Publication number: DE60113398T2
Application number: DE60113398T
Authority: DE
Inventors: Giuliana Miglierini; Luca Stucchi; Alessandro Rastrelli
Original assignee: Eurand Pharmaceuticals Ltd
Current assignee: Allergan Pharmaceuticals Holdings Ireland ULC
Priority date: 2000-03-17
Filing date: 2001-03-16
Publication date: 2006-06-29
Anticipated expiration: 2021-03-17
Also published as: US20030158125A1; WO2001068105A1; ITMI20000559A1; MXPA02009057A; KR20020093845A; IL151696A0; US20050065112A1; JP2003526720A; ITMI20000559A0; ATE304363T1; US6844328B2; ES2248322T3; BR0109294A; CN1418103A; AU5828601A; ZA200208299B; IT1318403B1; DE60113398D1; CA2403063A1; AU784655B2

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft neue Produkte, insbesondere Polysaccharidester von N-Derivaten der Glutaminsäure (N-GA). Ihre Verwendung als antiproliferative Pharmazeutika wird hier beschrieben.
STAND DER TECHNIK
Es wurden verschiedene modifizierte Polysaccharide nach dem Stand der Technik beschrieben. Sie werden durch chemische Modifizierung einiger in der Polysaccharidkette vorkommender Gruppen, wie zum Beispiel der Carboxylgruppen, der Amingruppen oder Hydroxygruppen durch die Bildung von Estern, Amiden und Ethern erhalten. Es gibt mehrere Anwendungsgebiete und diese umfassen zum Beispiel Lebensmittel, Lacke, Analytische Chemie, Kosmetika und Pharmazeutika.
Auf pharmazeutischem Gebiet werden Polysaccharide als Verbindungen betrachtet, die für die Herstellung von Verbindungen mit verzögerter Wirkstofffreisetzung geeignet sind. Sie werden tatsächlich äußerst gut vom Organismus vertragen, da sie, zum Beispiel bei Hyaluronsäure und Heparinen, Bestandteile davon sind.
Die Polysaccharide, die für die verzögerte Freisetzung von pharmakologisch aktiven Molekülen verwendet werden, liegen entweder in einer Mischung (WO 99/02151) oder kovalent daran gebunden vor ( US 4 851 521 and US 5 733 891 ), mittels, zum Beispiel, entweder Ester- oder Amidbindungen.
Neben ihrer Funktion als Träger besitzen jedoch einige Polysaccharide ihre eigene biologische Aktivität oder sie sind Bestandteile des Organismus: zum Beispiel sind Heparine Antikoagulantien, Hyaluronsäure ist der Hauptbestandteil des Glaskörpers und der Synovialflüssigkeit und wird darüber hinaus üblicherweise in der klinischen Praxis für die Behandlung von Osteoarthrose und Arthropathien verwendet. Scleroglucan (Sizofiran^®), ein anderes Polysaccharid, wird bei der Behandlung von Tumoren verwendet. Andere sulfatierte Polysaccharide erwiesen sich als wirksam bei der Behandlung von rheumatoider Arthritis, Retinitis und Psoriasis. Über die pharmazeutische Verwendung von N-Derivaten der Glutaminsäure mit inhibierender Wirkung auf das Dihydrofolatreduktaseenzym (DHFR) wird in der Literatur berichtet (Goodman & Gitman, The Pharmacological basis of Therapeutics, McGraw-Hill, 1996, S. 1253). Das Enzym DHFR ist für das Recycling von 7,8-Dihydrofolat in seine reduzierte, physiologisch aktive 6(R)-Tetrahydro-Form verantwortlich. Die Verfügbarkeit von reduzierten Folaten ist für die Unterstützung der Replikation von sich aktiv vermehrenden Zellen essentiell. Die zytotoxische Wirkung von N-Derivaten der Glutaminsäure, welche als wirksame Inhibitoren der DHFR wirken, wurde der Entleerung des intrazellulären Pools an reduzierten Folaten zugeschrieben. Diese Wirkstoffe werden üblicherweise als antiproliferative Mittel bei verschiedenen Arten von Erkrankungen verwendet, wie Neoplasmen, Psoriasis und rheumatoider Arthritis. Ihre therapeutische Verwendung ist jedoch aufgrund ihrer hohen systemischen Toxizität stark eingeschränkt, so dass Systeme oder spezifischere Formulierungen sehr wünschenswert wären, die eine Verabreichung von geringeren Dosen des Wirkstoffes mit einer nachfolgenden Verminderung der Toxizität ermöglichen.
Einige dieser N-GA Derivative wurden mit anderen Molekülen verknüpft, insbesondere mit Makromolekülen wie Serumalbumin, oder synthetischen Polymeren, Gelatine und einigen Polysacchariden. Zum Beispiel wurde ein Polymethotrexat-Dextran hergestellt, indem ein Kondensationsmittel (Carbonylimidazol) ( CA 2 009 695 ) verwendet wurde. Dieser letzte Reaktionsprozess ermöglicht aufgrund mehrerer unterschiedlicher Arten von Carboxyl- und Hydroxygruppen, welche auf zufällige Weise reagieren, nicht die Herstellung von strukturell definierten Produkten. Die Struktur dieses Produktes kann nicht vollständig aufgeklärt werden; es ist daher nur durch die Menge an Methotrexat charakterisiert, das im aus der Reaktionsmischung isoliertem Material anwesend ist. Tatsächlich wurden keinerlei Beweise über die Position der Substitution am Polysaccharid geliefert. Die gleiche Art von Reaktionsprozess wurden angewandt für die Herstellung von anderen Polysaccharidderivaten, die wiederum die Herstellung von zufällig substituierten Polymeren ermöglicht ( US 5 554 386 ). Ein anderer Versuch, Methotrexat in ein Polymer einzuführen, um ein pharmakologisch aktives System herzustellen, ist eine Konjugationsreaktion zwischen dem Polysaccharid Dextran und dem Wirkstoff, welche über eine Spacergruppe abläuft. Wie auch immer, vor der genannten Konjugation wird das Dextran mit Periodat modifiziert und seine ursprüngliche Saccharidstruktur wird so zerstört, was zu einem anderen Polymer führt (Dang et al., Cancer Res., 54, 1729, 1994). Mögliche unterwünschte Quervernetzungsreaktionen zwischen der Carboxyl- und den Aminogruppen des Methotrexats sind in einigen der Reaktionen, die nach dem Stand der Technik verwendet werden, vorgesehen.
ZUSAMMENFASSUNG
Eine Klasse von Polysaccharidestern der Verbindungen der Formel (I), im Allgemeinen als N-GA (N-Derivative der Glutaminsäure) bekannt, sind ein Gegenstand der vorliegenden Erfindung.
Diese N-GA-Verbindungen haben die allgemeine Formel:
in welcher:

– R₂ und R₄ -NH₂, -OH, -OCH₃, C₁-C₅-Alkyl, =O darstellen und der sechsgliedrige die beiden Stickstoffatome enthaltende Ring gegebenenfalls aromatisch ist;
– X und Y -C(R₅)=, -N= darstellen und der diese enthaltende Ring gegebenenfalls aromatisch ist, oder sie -CH(R₅)-, oder -NH- darstellen und der diese enthaltende Ring aliphatisch ist;
– R₅ -H, C₁-C₅-Alkyl
– Z -CH(R₁₀)-, -N(R₁₀)-, -O- darstellt;
– R₁₀ -H, C₁-C₅-Alkyl, C₁-C₅-Alkenyl, C₁-C₅-Alkynyl, einen 5-6-gliedrigen heterocyclischen Ring mit 1–3 Heteroatomen ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Stickstoff, Schwefel und Sauerstoff darstellt;
– Ar eine 1,4-Phenylgruppe darstellt, die gegebenenfalls mit einem oder mehreren 5–6-gliedrigen aromatischen Ringen, gegebenenfalls Heterocyclen und gegebenenfalls mit R₂ substituiert ist.

Die Polysaccharide, die für die Herstellung von Polysaccharidestern verwendet werden, werden aus natürlichen Quellen erhalten und nur die primären in den Monosaccharideinheiten vorkommenden Hydroxygruppen sind entweder ganz oder teilweise mit γ-Carboxylgruppen der Verbindungen mit der Formel (I) verestert.
Die Produkte der vorliegenden Erfindung können im pharmazeutischen Bereich als Inhibitoren der Zellproliferation verwendet werden und sind daher bei der Herstellung von Medikamenten für die Behandlung von neoplastischen, entzündlichen und Autoimmunerkrankungen nützlich.
Die vorliegende Erfindung umfasst weiterhin neue pharmazeutische Zusammensetzungen, die genannte Polysaccharidester als wirksame Verbindungen zusammen mit geeigneten pharmazeutischen Hilfsstoffen und/oder Lösungsmitteln enthalten, und ihre Verwendung bei der Behandlung und Vorbeugung von Krankheiten, die durch eine Hyperproliferation der Zellen gekennzeichnet sind.
Detaillierte Beschreibung der Erfindung
Der Gegenstand der vorliegenden Erfindung betrifft eine Klasse von Polysaccharidestern der Verbindungen mit der Formel (I), im Allgemeinen als N-GA (N-Derivative der Glutaminsäure) bekannt.
Diese N-GA-Verbindungen haben die allgemeine Formel:
in welcher:

– R₂ und R₄ -NH₅, -OH, -OCH₃, C₁-C₅-Alkyl, =O darstellen und der sechsgliedrigen Ring, an welchen R₂ und R₄ gebunden sind, gegebenenfalls aromatisch ist;
– X und Y ausgewählt werden aus der Gruppe bestehend aus -C(R₅)=, -CH(R₅)-, -NH-, -N=, wobei R₅ -H oder einen C₁-C₅-Alkylrest darstellt, und der X und Y enthaltende Ring gegebenenfalls aromatisch ist;
– R₅ -H, C₁-C₅-Alkyl darstellt;
– Z -CH(R₁₀)-, -N(R₁₀)-, -O- darstellt;
– R₁₀ -H, C₁-C₅-Alkyl, C₁-C₅-Alkenyl, C₁-C₅-Alkynyl oder einen 5-6-gliedrigen heterocyclischen Ring mit 1–3 Heteroatomen ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Stickstoff, Schwefel und Sauerstoff darstellt;
– Ar eine 1,4-Phenylgruppe darstellt, die gegebenenfalls mit einem oder mehreren 5-6-gliedrigen aromatischen Ringen, der gegebenenfalls heterocyclisch ist, und gegebenenfalls mit R₂ substituiert ist.

In der Formel (I), abhängig davon, ob die Ringe aromatisch sind oder nicht, können die folgenden Situationen auftreten:

1) wenn der 6-gliedrige zwei Stickstoffatome enthaltende Ring aromatisch ist, sind beide Stickstoffatome: -N= und die durch R₂ und R₄ substituierten Kohlenstoffatome sind jeweils -C(R₂)= und -C(R₄)= und R₂ und R₄ sind von =O verschieden; darüber hinaus sind die mit X und Y verbundenen Kohlenstoffatome, die beiden Ringen gemeinsam sind, jeweils -C(X)= und -C(Y)=;
2) wenn der 6-gliedrige zwei Stickstoffatome enthaltende Ring nicht aromatisch ist, sind beide Stickstoffatome: -NH- und die durch R₂ und R₄ substituierten Kohlenstoffatome sind jeweils -C(R₂)- und -C(R₄)- oder wenn R₂ und/oder R₄ =O sind, ist das entsprechende Kohlenstoffatom nicht durch H substituiert und entweder a) sind die mit X und Y verbundenen Kohlenstoffatome, -C(X)- und -C(Y)-, wenn der X und Y enthaltende Ring nicht aromatisch ist, oder b) sie sind -C(X)= und -C(Y)=, wenn der X und Y enthaltende Ring aromatisch ist;
3) wenn der X und Y enthaltende Ring aromatisch ist, sind X und Y -C(R₅)= oder -N= und die beide Stickstoffatome: -N= und die mit X und Y verbundenen Kohlenstoffatome, die beiden Ringen gemeinsam sind, jeweils -C(X)= und -C(Y)= und das mit X und -CH₂-Z- verbundene Kohlenstoffatom ist nicht durch -H substituiert und das verbleibende mit Y verbundene Kohlenstoffatom ist -CH=;
4) wenn der X und Y enthaltende Ring nicht aromatisch ist, sind X und Y -CH(R₅)= oder -NH- und entweder a) die mit X und Y verbundenen Kohlenstoffatome (die auch zum N-haltigen Ring gehören) sind -C(X)= und -C(Y)=, wenn genannter die beide Stickstoffatome enthaltender Ring aromatisch ist, oder b) sie sind -C(X)= und -C(Y)=, wenn genannter N-haltiger Ring nicht aromatisch ist, und das mit X und -CH₂-Z- verbundene Kohlenstoffatom ist durch -H substituiert und das verbleibende mit Y verbundene Kohlenstoffatom ist -CH₂-;

In den erfindungsgemäßen Polysaccharidestern sind nur die primären in den Monosaccharideinheiten des Polysaccharids vorkommenden Hydroxygruppen entweder ganz oder teilweise mit γ-Carboxylgruppen der Verbindungen mit der Formel (I) verestert. Die γ-Carboxylgruppen von N-GA sind dann direkt mit -(CH₂)₂- verbunden.
Gemäß einer ersten bevorzugten Ausführungsform der Erfindung, wenn R₂ und R₄ -NH₂ oder -OH, stellt R₅, wenn anwesend, -H, -CH₃ dar und der die beiden Stickstoffatome enthaltende Ring (-N=) ist aromatisch; Z wird ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus -CH(R₁₀)-, -N(R₁₀)-, wobei R₁₀ -H, C₁-C₅-Alkyl, C₁-C₅-Alkenyl oder C₁-C₅-Alkynyl darstellt.
In einer zweiten bevorzugten Ausführungsform, wenn R₂ =O und R₄ -NH₂ ist, ist der 6-gliedrige Ring mit den beiden Stickstoffatomen nicht aromatisch; X und Y sind Stickstoffatome (-N=) und der sie enthaltende Ring ist aromatisch; Z ist -N(R₁₀)- wobei R₁₀ -H oder -CH₃ darstellt; Ar ist 1,4-Phenyl.
In einer dritten bevorzugten Ausführungsform, wenn R₂ und R₄ -NH₂ sind, ist der 6-gliedrige Ring mit den beiden Stickstoffatomen (-N=) aromatisch; X und Y sind Stickstoffatome (-N=) und der sie enthaltende Ring ist aromatisch; darüber hinaus ist Z -N(R₁₀)-, wobei R₁₀ -H oder -CH₃ darstellt; Ar ist 1,4-Phenyl.
In einer vierten bevorzugten Ausführungsform, wenn R₂ und R₄ -NH₂ sind, ist der 6-gliedrige Ring mit den beiden Stickstoffatomen (-N=) aromatisch; X und Y sind Stickstoffatome (-N=) und der sie enthaltende Ring ist aromatisch; Z ist -CH(C₂H₅)- und Ar ist 1,4-Phenyl. Die Veresterung zwischen den Verbindungen mit der Formel (I) und den Polysacchariden findet zwischen den primären Hydroxygruppen in den Monosaccharideinheiten der Polysaccharide und den γ-Carboxylgruppen der Verbindungen mit der Formel (I) (N- GA) statt.
Der Substitutionsgrad dieser Polysaccharidester reicht von > 0 bis 1, vorzugsweise von 0,005 bis 1. Der Begriff „Substitutionsgrad" (DS) gibt die Anzahl an Molen der Verbindung mit der Formel (I) (N-GA) pro Anzahl an Molen Monosaccharideinheiten, die eine primäre Hydroxygruppe enthalten, wieder. Ein Substitutionsgrad von 1 entspricht einem Produkt, bei dem alle primären Hydroxygruppen mit N-GA verestert sind.
Die in der vorliegenden Erfindung verwendeten Polysaccharide sind entweder anionisch oder neutral und mindestens einige ihrer Monosaccharideinheiten enthalten primäre Hydroxygruppen. Die Polysaccharide werden aus unterschiedlichen Quellen isoliert: Tiere, Menschen, Pflanzen, Mikroorganismen; und ihr natürliches massegemitteltes Molekulargewicht (MW) reicht von 1·10³ bis 2·10⁶.
Die Polysaccharide haben entweder lineare oder verzweigte Strukturen und bestehen aus Monosaccharideinheiten wie: D-Glucose, D-Xylose, D-Arabinose, D- und L-Mannose, D-Galactose, L-Fucose, D-Fructose, L-Rhamnose, D-Glucuronsäure, D-Mannuronsäure, L-Guluronsäure, L-Iduronsäure, D-Galacturonsäure, N-Acetyl-D-glucosamin, N-Acetyl-D-galactosamin, 3,6-Anhydro-D-galactose, N-Acetyl-D-Galactosamin, 3,6-Anhydro-D-galactose, 3,6-Anhydro-L-galactose. Diese Monosaccharide können gegebenenfalls Sulfat- oder Acetylgruppen enthalten.
Die Hauptpolysaccharidkette hat eine β-(1→3)- oder β-(1→2) oder β-(1→4)-D-glycosidische oder α-(1→3)-, α-(1→4)-, α-(1→6)-glycosidische Struktur; die β-Konfiguration ist bevorzugt. Die Seitenketten bestehen vorzugsweise aus D-Glycosyleinheiten, die mit β-(1→2),β-(1→3),β-(1→4),β-(1→6), oder α-(1→4), α-(1→ 6) oder noch mehr bevorzugt β-(1→6) Bindungen gebunden sind.
Wenn das Polysaccharid neutral ist, ist es vorzugsweise ein Glucan (ein Glucosepolysaccharid), das aus Algen, Pilzen, Pflanzen, Bakterien oder Hefe isoliert wird. Bevorzugte neutrale Polysaccharide gehören zu der Klasse von α-(1→3)-D-Glucanen (Polysaccharide der,β-(1→3)-D-Glucose) und sind entweder linear oder verzweigt. Bevorzugte Beispiele für Glucane, die in der vorliegenden Erfindung verwendet werden können, sind: Scleroglucan, Lentinan, Schizophyllan, Pachimaran, Curdlan, Laminaran, Pullulan. Besagte Polysaccharide werden in großen Mengen von Algen, Hefe und Pilzen hergestellt. Unter diesen ist Scleroglucan das bevorzugte. Scleroglucan ist ein β-(1→3)-D-Glucan mit einer Seitenkette, die aus einer β-(1→6)-D-Glucoseeinheit an jeder dritten Glucose in der Hauptkette besteht. Dieses Polysaccharid wird hauptsächlich aus Pilzen wie Sclerotium glucanicum oder S. rolfsii extrahiert. Pilzfermentation stellt einen weiteren nützlichen Zugang zur ihrer Herstellung dar.
Handelt es sich um anionische Polysaccharide, werden carboxylierte Polysaccharide wie Hyaluronsäure oder ihre Salze (dimere Einheit bestehend aus N-Acetyl-D-glucosamin und D-Glucuronsäure) verwendet. Pektin ist ein anderes Beispiel für ein anionisches Polysaccharid. Pektin ist eine Polysaccharidverbindung der D-Galacturonsäure und der D-Galactose, in welcher Carboxylgruppen teilweise mit Methylgruppen verestert sein können. Eine andere Klasse von anionischen Polysacchariden, die in erfindungsgemäßen Estern verwendet werden, sind durch sulfatierte Polysaccharide dargestellt, wie zum Beispiel Heparin, Chondroitinsulfat oder Dermatansulfat. Andere Beispiele für sulfatierte Polysaccharide, die für die Herstellung von erfindungsgemäßen Estern verwendet werden können, werden aus Algen der Grateloupia doryphora oder G.filicina Arten isoliert, wie in WO 98/23648 beschrieben. Andere sulfatierte Polysaccharide, die aus verschiedenen Algen der Grateloupiaceae- oder der Codiaceae-Familien oder aus Mikroorganismen isoliert wurden, können auch erfolgreich verwendet werden.
Im Falle der anionischen Polysaccharide werden die erfindungsgemäßen Ester gegebenenfalls mit Alkalimetallen (vorzugsweise Na und K), Erdalkalimetallen (vorzugsweise Ca und Mg), oder Übergangsmetallen (vorzugsweise Cu, Zn, Ag, Au, Co) versalzt. Derivatisierte Polysaccharide wie solche, die durch Versalzung der erfindungsgemäßen Verbindung erhalten werden, werden durch Verfahren erhalten, die dem Fachmann wohlbekannt sind.
Gegebenenfalls werden die möglichen freie Hydroxygruppen der Monosaccharideinheit des erfindungsgemäßen Polysaccharidesters weiter modifiziert durch Einführung von einem oder mehreren Substituenten, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus: niederen C₁-C₆-Alkylen, -COOH, NH₂, -NH-COCH₃, -SO₃H, -OPO₃H₂, -COO-(CH₂)_n-COOH, -COOR, -COR, -OR, -O-(CH₂)_n-COOR, wobei n = 1–4 und R = C₁-C₁₀-Alkyl. Diese Substituierungen können leicht durch Verfahren erhalten werden, die im Fachbereich wohlbekannte sind, und werden zum Beispiel ausgewählt, um den hydrophilen Charakter der Polysaccharidester zu modifizieren und somit ihre Löslichkeit zu modulieren.
Die erfindungsgemäßen Polysaccharidester haben eigenartige chemische Merkmale, die sowohl aus der Gegenwart einer doppelten Regioselektivität wie auch in der Erhaltung der ursprünglichen Polysaccharidstrukur bestehen. Weiterhin ist kein Spacerarm oder eine chemische Gruppe zwischen dem N-GA und dem Polysaccharid anwesend.
Was die doppelte Regioselektivität angeht, betrifft der Begriff „doppelt" sowohl die Selektivität des Polysaccharids als auch die des N-GA. Die resultierenden Derivate sind daher einzigartig. Tatsächlich werden unter den verschiedenen im Polysaccharid anwesenden Hydroxygruppen nur die primären Hydroxygruppen der Monosaccharideinheiten mit N-GA verestert. Was die Selektivität am N-GA angeht, so betreffen, obwohl dies Molekül zwei reaktive Carboxylgruppen enthält, die eine recht ähnliche chemische Reaktivität zeigen, die erfindungsgemäßen Derivate Produkte mit nur einer spezifischen Carbonsäure, die in der Reaktion involviert ist, und genauer gesagt die γ-Carbonsäure, wie beispielsweise durch NMR-Spektroskopie bestätigt. Daraus resultiert, dass die erfindungsgemäßen Derivate eine dreidimensionale Struktur aufweisen, welche sehr regelmäßig und hochdefiniert ist. Dieses Merkmal bietet einen deutlichen pharmakologischen Vorteil gegenüber zufällig substituierten Derivaten nach dem Stand der Technik. Tatsächlich führt die zufällige Substituierung der möglichen freien primären oder sekundären Hydroxygruppen zu Produkten mit einer variablen Wirkung, die vom Substitutionsmuster abhängig ist.
Weiterhin behalten die Polysaccharide, im Gegensatz zu den makromolekularen Derivaten von N-GA nach dem Stand der Technik, in den erfindungsgemäßen Estern ihre ursprüngliche chemische Struktur. Das Ausgangspolysaccharid wird hier so modifiziert, dass neue Gruppen an den Monosaccharideinheiten eingefügt werden, aber die strukturelle Identität der Monosaccharideinheit wird nicht verändert. Die Integrität der Polysaccharide wird so erhalten, mit dem Vorteil, dass nach der in vivo-Hydrolyse der Esterbindung nur bekannte bioverträgliche Metabolite hergestellt werden (native Polysaccharide wie Glucan oder Hyaluronan). Gemäß einer weiteren Ausführungsform ist die vorliegende Erfindung mit dem Verfahren zur Herstellung von Polysaccharidestern von N-GA verbunden.
Das Veresterungsverfahren der Verbindungen mit der Formel (I) mit Polysacchariden entsteht durch regioselektive Reaktion der aktivierten primären Hydroxygruppen der Monosaccharideinheiten des Polysaccharids mit γ-Carboxylgruppen der N-GA. Durch Auswahl der geeigneten Mengen an Reagenzien werden Polysaccharidester mit unterschiedlichen Substitutionsgraden erhalten. Das Verfahren umfasst die folgenden Schritte:

a) Aktivierung der primären Hydroxygruppen der Monosaccharideinheiten des Polysaccharids durch Halogenierung, wobei regioselektiv halogenierte Polysaccharide erhalten werden;
b) Bildung der Esterbindung zwischen dem halogenierten Polysaccharid aus Schritt a) und den Carboxylgruppen der N-GA durch Austausch der Halogenatome.

Schritt a) wird ausgeführt, indem das Polysaccharid in einem geeigneten organischen Lösungsmittel unter Rühren für 1–5 Stunden bei 25–100°C suspendiert wird, gefolgt von der Aktivierung der primären Hydroxygruppen, was in Gegenwart eines Alkyl- oder Arylhalogenids in einem organischen Lösungsmittel bei einer Temperatur zwischen –20°C und 70°C unter Rühren für 1–18 Stunden ausgeführt wird; geeignete Halogenide sind Methansulfonylbromid, p-Toluolsulfonylbromid, Methansulfonylchlorid, p-Toluolsulfonylchlorid; geeignete Lösungsmittel sind Dimethylformamid, Dimethylsulfoxid, N-Methylpyrrolidon. Diese Reaktionsmischung kann gegebenenfalls bis zu einem pH-Wert zwischen 9 und 11 alkalisch gemacht werden. Am Ende der Halogenierung wird die Mischung neutralisiert und das halogenierte Polysaccharid wird mittels in der Technik bekannter Verfahren wie Ausfällen, Trocknen, Gefriertrocknen isoliert. Wenn das Polysaccharid ein anionisches ist, kann es entweder in der freien oder in der versalzten Form, vorzugsweise in der versalzten Form verwendet werden.
Schritt b) wird ausgeführt, indem in einem organischen Lösungsmittel oder einer Mischung daraus das in Schritt a) erhaltene halogenierte Polysaccharid suspendiert wird, und dann das N-GA im gleichen organischen aprotischen Lösungsmittel oder einer Mischung daraus in Gegenwart eines basischen Mittels zugegeben wird. Die Reaktion wird unter Rühren bei Raumtemperatur für 0,5–3 Tage ausgeführt. Geeignete Lösungsmittel sind Dimethylformamid, Dimethylsulfoxid, N-Methylpyrrolidon. Am Ende der Reaktion wird der Polysaccharidester des N-Derivates der Glutaminsäure mittels in der Technik bekannter Verfahren wie Ausfällen, Trocknen, Gefriertrocknen isoliert.
Weitere Details über die Halogenierung von Polysacchariden (Schritt a) des Verfahrens der vorliegenden Erfindung sind in WO 99/18133 zu finden; die dort beschriebenen Bedingungen können sowohl für anionische als auch für neutrale Polysaccharide verwendet werden. Andere Veresterungsreaktionen von Polysacchariden mit der Verbindungen mit der Formel (I), welche eine doppelte Regioselektivität ermöglichen, wie Reaktionen, die Schützen und Entschützen von spezifischen chemischen Gruppen umfassen, an denen die selektive Derivatisierung auftritt, können ebenfalls angewandt werden.
Die Ester der vorliegenden Erfindung inhibieren die Hyperproliferation von Zellen und haben eine überraschend geringe systemische Toxizität.
Insbesondere sind die Produkte dieser Erfindung bei der Behandlung all solcher Erkrankungen und Störungen wirksam, die durch eine Hyperproliferation der Zellen gekennzeichnet sind, wie entzündliche, Autoimmun- oder neoplastische Erkrankungen, und insbesondere bei entzündlichen Erkrankungen, die anfällig für neoplastische Degenerationen sind, wie entzündliche Erkrankungen des Darms, d. h. Divertikulitis, Morbus Crohn, Entzündungen des Kolon, Colitis ulcerosa wie bei Levin et al. beschrieben (J. Cell. Biochem. Suppl., 1992, 16G:47–50) Die erfindungsgemäßen Polysaccharidester werden auch bei der Behandlung bei der Proliferation von Synovialzellen verwendet, welche zur einer Degeneration des Gelenkknorpels, des Knochens oder der Sehnen, wie bei Echanet et al. beschrieben (J. Immunol., 1993, 151(9) 4908–4917). Derartige Degenerationen treten bei Gelenkerkrankungen häufig auf, wie zum Beispiel rheumatoider Arthritis, juveniler Arthritis, Arthritis psoriatica. Die erfindungsgemäßen Verbindungen werden auch bei dermatologischen Störungen verwendet, die durch eine abnormale Zellproliferation gekennzeichnet sind, und sogar bei der Kontrolle der sekundären Zellproliferation, zum Beispiel beim chirurgischen Einsetzen von medizinischen Vorrichtungen (zum Beispiel kardiovaskuläre Stents, oder andere Hilfen), oder bei vaskulären Störungen oder bei asthmatischen Attacken, Myokardinfarkt oder pulmonarer Hypertension.
Was antineoplastische Erkrankungen betrifft, kann das erfindungsgemäße Produkt hilfreich bei der Behandlung von einigen Arten von humanen Tumoren angewandt werden, wie zum Beispiel Ovarialkarzinom, Lymphoblastenleukämie, Lymphom, Choriokarzinom, Brustkrebs, Plattenepithelkarzinom, Osteosarkom.
In einer weiteren Ausführungsform stellt die vorliegende Erfindung pharmazeutische Zusammensetzungen bereit, die erfindungsgemäße Esterderivate zusammen mit pharmazeutisch zulässigen Hilfsstoffen und/oder Verdünnungsmitteln enthalten.
Genannte Zusammensetzungen der erfindungsgemäßen Polysaccharidester können gegebenenfalls andere bekannte Wirkstoffe mit antiproliferativer Wirkung enthalten.
Die erfindungsgemäßen pharmazeutischen Zusammensetzungen sind für parenterale, orale oder topische Verabreichung geeignet. Die bevorzugten Arten der parenteralen Verabreichung sind intravenös, intramuskulär, intraartikulär, subkutan. Wenn sie in flüssiger Form vorliegen, können die Zusammensetzungen in Form einer Lösung oder Suspension sowohl in wässrigem als auch im nichtwässrigen Medium vorliegen. Alternativ können die Zusammensetzungen in fester Form formuliert sein, wobei das lyophilisierte oder getrocknete Produkt direkt vor der Verabreichung mittels Zugabe eines geeigneten flüssigen Mediums gelöst oder suspendiert wird. Die pharmazeutischen Zusammensetzungen in einer festen oder halbfesten Form sind Einsätze, Gele, Cremes, Granulate, Pulver, Tabletten, Kapseln, Pilulae oder mikroverkapselte Formulierungen. Andere Arten von Präparaten können mittels Fachleuten bekannten Techniken erstellt werden.
Die Dosen der erfindungsgemäßen Esterderivate können variieren in Abhängigkeit von der Art und Schwere der Erkrankung und hängen vom Alter, dem Gewicht und dem allgemeinen Zustand des Patienten ab.
Experimenteller Teil
Beispiel 1 Verfahren zur Bestimmung des massegemittelten Molekulargewichts (Mw).
Das Molekulargewicht der Polysaccharidreagenzien wurde mittels HP-SEC (Hochleistungs-Größenausschluss-Chromatographie) untersucht. Die Analysebedingungen waren:
Chromatograph: HPLC Jasco PU-980 mit Rheodyne 9125 Injektor; Säule: TSK Pwxl G6000 + G5000 + G3000 (TosoHaas) 300 mm × 7.8 mm ID, 13, 10, 6 μm Partikelgröße;
Temperatur 40°C;
Mobile Phase: NaCl 0,15 M;
Flux: 0.8 ml/min;
Detektor: LALLS CMX-100 (TSP Chromatix), Po = 150 mV; differentieller Brechungsindex 410 (Waters), Empfindlichkeit 128x; Temperatur 32°C;
injiziertes Volumen: 100 μl.
Die zu analysierenden Proben wurden in 0,15 M NaCl mit einer Konzentration von etwa 1,0 mg/ml gelöst und 12 Stunden gerührt. Dann wurden die Lösungen über einen Filter mit 0,45 μm Porosität (Millipore) filtriert und schließlich in den Chromatographen injiziert. Die Analyse ermöglicht die Messung des Mw (massegemitteltes Molekulargewicht), des Mn (Molekulargewicht-Zahlenmittel) und der PI (Polydispersität). Die Konzentrationen der polymeren Probenlösungen wurden mittels des Integrals des Brechungsindex kontrolliert.
Beispiel 2 Herstellung von halogeniertem Scleroglucan
160 ml wasserfreies DMF wurde auf 80°C erhitzt und 1 Stunde unter Stickstoff vermischt. 1 g Scleroglucan mit einem massegemittelten Molekulargewicht von 60.000 (bestimmt wie in Bsp. 1 beschrieben), wurde zugegeben und das System wurde drei Stunden vermischt. Die Lösung wurde auf Raumtemperatur abgekühlt. 9.8 g Methansulfonylbromid wurden dann bei 0°C zu der Lösung gegeben. Die Reaktionsmischung wurde weitere 20 Minuten gerührt und dann 16 Stunden auf 80°C erhitzt. Die Mischung wurde auf Raumtemperatur abgekühlt und die Reaktion wurde durch Zugabe von 30 ml Milli-Q-Wasser gestoppt. Die Mischung wurde mit 3N NaOH neutralisiert, dann unter vermindertem Druck eingeengt und schließlich in 800 ml Aceton gegossen. Das Produkt wurde mittels Filtration gesammelt, mit Aceton gewaschen, in destilliertem Wasser suspendiert und dialysiert. Die Mischung wurde filtriert und das feste Material wurde im Ofen unter Vakuum bei Raumtemperatur getrocknet. Gewicht des Feststoffs: 1 g.
Das Produkt wurde mittels ¹³C-NMR-Spektroskopie (DEPT) in DMSO-d₆/TFA bei 50°C analysiert. Das Signal des CH₂-0 (C6) des Polysaccharids, welches von der Halogenierung betroffen ist, ist bei 34,5 ppm anwesend, während die gleiche Gruppe im underivatisierten Polysaccharid ein Signal bei 61 ppm gibt.. Die Veränderung der chemischen Verschiebung liefert den Beweis, dass die Halogenierungsreaktion an den primären Hydroxygruppen der Glucosereste stattgefunden hat.
Beispiel 3 Veresterung des Scleroglucans mit der Verbindung MT.
Die Verbindung MT mit der Formel (I), welche die folgenden Substituenten trägt: R₂ und R₄: -NH₂, der 6-gliedrige Ring, der zwei Stickstoffatome enthält, war aromatisch; X und Y sind -N= und der Ring, der diese enthält, war aromatisch; Z war -N(CH₃)-; Ar war 1,4-Phenyl, wurde mit dem halogenierten Scleroglucan verestert.
150 mg des halogenierten Scleroglucans, erhalten wie in Beispiel 2, wurden in 15 ml DMSO bei 80°C gelöst. Nach 3 Stunden wurde die Lösung auf Raumtemperatur gekühlt und 512 mg MT in 10 ml DMSO wurden zugegeben. Die Reaktionsmischung wurde, in Gegenwart eines basischen Mittels, bei Raumtemperatur unter Stickstoff und geschützt vor Licht für 48 Stunden unter Rühren gehalten. Dann wurde das Produkt in 250 ml Aceton ausgefällt und mittels Filtration gesammelt, mit Aceton gewaschen, in destilliertem Wasser suspendiert und mit 0,2 N HCl neutralisiert und wieder mit Aceton ausgefällt. Der Feststoff wurde im Ofen unter Vakuum bei Raumtemperatur getrocknet. Gewicht des Feststoffs: 80 mg.
Analyse des Produkts: FT-IR Spektroskopie (Perkin-Elmer, Modell 1750): Bande bei 1730 cm^–1 (KBr-Pellet), typisch für Esterbindungen. ¹H-NMR-Spektroskopie (NMR Varian Inova 500–500 MHz): Diffusionsexperimente an in DMSO-d₆/TFA gelöstem Produkt bei 23°C wiesen die Gegenwart von MT nach, das kovalent an das Polysaccharid gebunden ist. Das Produkt wurde mittels ¹H-NMR-Spektroskopie (DEPT) in DMSO-d₆/TFA bei 50°C analysiert. Aus der Analyse des Spektrum ist die von der γ-Methylengruppe verursachte Veränderung der Signale des MT deutlich sichtbar: die Protonen sind nicht äquivalent und spalten in zwei Multipletts auf (2,35 und 2,45 ppm), während die entsprechende Gruppe im Ausgangs-MT (das heißt, nicht an Polysaccharid gebundenes MT) durch ein Signal in Form eines Tripletts charakterisiert wurde. Die Nichtäquivalenz der γ-Protonen aufgrund der Veresterung der Carbonsäure wird in einem heterobinuklearen Spektrum ¹H-¹³C-HSQC (¹ ³C Signal bei 32 ppm) bestätigt.
Beispiel 4 Herstellung von halogeniertem Scleroglucan
300 mg Scleroglucan mit einem massegemittelten Molekulargewicht von 99.500 (bestimmt wie in Beispiel 1 beschreiben) wurden in 40 ml wasserfreiem DMF bei 80°C suspendiert und in einer Stickstoffatmosphäre für 1 Stunde gerührt. Die Mischung wurde auf Raumtemperatur abgekühlt und dann wurden bei 0°C 2,9 g Methansulfonylbromid zugegeben. Die Reaktionsmischung wurde weitere 30 Minuten gerührt und dann 16 Stunden auf 80°C erhitzt. Die Mischung wurde auf Raumtemperatur abgekühlt und die Reaktion wurde durch Zugabe von 8 ml Milli-Q-Wasser gestoppt. Die Mischung wurde mit 0,1 NaOH neutralisiert, dann unter vermindertem Druck eingeengt und schließlich in 200 ml Aceton gegossen. Das Produkt wurde mittels Filtration gesammelt, mit Aceton gewaschen, in destilliertem Wasser suspendiert und gegen destilliertes Wasser dialysiert und dann gefriergetrocknet. Gewicht des Feststoffs: 290 mg.
Das Produkt wurde mittels ¹³C-NMR-Spektroskopie analysiert, was zeigte, dass die Halogenierungsreaktion an den primären Hydroxygruppen stattfand, wie in Beispiel 2 beschrieben.
Beispiel 5 Veresterung von Scleroglucan mit MT.
90 mg des halogenierten Scleroglucans, erhalten wie in Beispiel 4, wurden in 20 ml DMSO bei 80°C gelöst. Nach 4 Stunden wurde die Mischung auf Raumtemperatur abgekühlt und 293 mg MT, gelöst in 20 ml DMSO, wurden zugegeben. Die Reaktionsmischung wurde bei Raumtemperatur in Gegenwart eines basischen Mittels unter Stickstoff und geschützt vor Licht für 48 Stunden gerührt. Dann wurde die Mischung in 250 ml Aceton gegossen. Das Produkt wurde mittels Filtration gesammelt, ausgiebig mit MeOH gewaschen, abfiltriert, und schließlich unter Vakuum bei Raumtemperatur getrocknet. Gewicht des Feststoffs: 90 mg.
Das Produkt wurde mittels ¹H-NMR-Spektroskopie in DMSO-d₆/TFA analysiert, was die Gegenwart von kovalent an das Polysaccharid gebundenem MT zeigt, wie in Beispiel 3 beschrieben.
Beispiel 6 Herstellung von halogeniertem Scleroglucan
600 mg Scleroglucan mit einem massegemittelten Molekulargewicht von 140.000 (bestimmt wie in Beispiel 1 beschreiben) wurden in 40 ml wasserfreiem DMF bei 80°C suspendiert und in einer Stickstoffatmosphäre für 1 Stunde gerührt. Die Mischung wurde auf Raumtemperatur abgekühlt und dann wurden bei 0°C 5,9 g Methansulfonylbromid zugegeben. Die Reaktionsmischung wurde weitere 30 Minuten gerührt und dann 16 Stunden auf 80°C erhitzt. Die Mischung wurde auf Raumtemperatur abgekühlt und die Reaktion wurde durch Zugabe von 8 ml Milli-Q-Wasser gestoppt. Die Mischung wurde mit 0,1 NaOH neutralisiert, dann unter vermindertem Druck eingeengt und schließlich in 200 ml Aceton gegossen. Das Produkt wurde mittels Filtration gesammelt, mit Aceton gewaschen, in destilliertem Wasser suspendiert und gegen destilliertes Wasser dialysiert und dann gefriergetrocknet. Gewicht 710 mg.
Das Produkt wurde mittels ¹³C-NMR-Spektroskopie analysiert, was zeigte, dass die Halogenierungsreaktion an den primären Hydroxygruppen stattfand, wie bei den in Beispiel 2 beschriebenen Beispielen beobachtet.
Beispiel 7 Veresterung von Scleroglucan mit MT.
500 mg des halogenierten Scleroglucans, erhalten in Beispiel 6, wurden in 110 ml DMSO bei 80°C gelöst. Nach 4 Stunden wurde die Mischung auf Raumtemperatur abgekühlt und 1,63 mg MT, gelöst in 33 ml DMSO, wurden zugegeben. Die Reaktionsmischung wurde in Gegenwart eines basischen Mittels bei Raumtemperatur unter Stickstoff und geschützt vor Licht für 48 Stunden gerührt. Dann wurde das Produkt in 250 ml Aceton ausgefällt und mittels Filtration gesammelt, mit Aceton gewaschen, in destilliertem Wasser suspendiert und mit 0,2N N HCl neutralisiert und wieder mit Aceton ausgefällt. Gewicht des Produkts (RG4900): 470 mg.
Das Produkt wurde mittels ¹H-NMR-Spektroskopie in DMSO-d₆/TFA analysiert, was die Gegenwart von kovalent an das Polysaccharid gebundenem MT zeigt, wie in Beispiel 3 beschrieben.
Beispiel 8 Herstellung von halogeniertem Hyaluronan
1 g Tetrabutylammoniumsalz der Hyaluronsäure mit einem massegemittelten Molekulargewicht von 120.000 (bestimmt wie in Beispiel 1 beschreiben) wurde in 50 ml wasserfreiem DMF bei 80°C suspendiert und in einer Stickstoffatmosphäre für etwa 1 Stunde gerührt. Die Mischung wurde auf Raumtemperatur abgekühlt und dann wurden bei 0°C 1,28 g Methansulfonylbromid zugegeben. Die Reaktionsmischung wurde weitere 30 Minuten gerührt und dann 16 Stunden auf 80°C erhitzt. Die Mischung wurde auf Raumtemperatur abgekühlt und die Reaktion wurde durch Zugabe von etwa 10 ml Milli-Q-Wasser gestoppt. Die Mischung wurde mit 0,1 NaOH neutralisiert, dann unter vermindertem Druck eingeengt und schließlich in 200 ml Aceton gegossen. Das Produkt wurde mittels Filtration gesammelt, mit Aceton gewaschen, in destilliertem Wasser suspendiert und gegen destilliertes Wasser dialysiert und dann gefriergetrocknet. Gewicht des Feststoffs: 480 mg.
Das Produkt wurde mittels ¹³C-NMR-Spektroskopie (DEPT) in DMSO-d₆/TFA bei 50°C analysiert. Das Signal des CH₂-O (C6) des Polysaccharids, welches von der Halogenierung betroffen ist, ist bei 34,5 ppm anwesend, während die gleiche Gruppe im underivatisierten Polysaccharid ein Signal bei 61 ppm gibt.. Die Veränderung der chemischen Verschiebung liefert den Beweis, dass die Halogenierungsreaktion an den primären Hydroxygruppen der Glucosereste stattgefunden hat.
Beispiel 9 Veresterung von Hyaluronan mit MT.
50 mg des halogenierten Hyaluronans, erhalten in Beispiel 8, wurden in 5 ml DMSO bei 80°C gelöst. Nach 2–3 Stunden wurde die Mischung auf Raumtemperatur abgekühlt und 59 mg MT, gelöst in 2 ml DMSO, wurden zugegeben. Die Reaktionsmischung, in Gegenwart eines basischen Mittels, wurde bei Raumtemperatur unter Stickstoff und geschützt vor Licht für 48 Stunden gerührt. Dann wurde die Mischung in 50 ml Aceton gegossen. Das Produkt wurde mittels Filtration gesammelt, ausgiebig mit McOH gewaschen, abfiltriert, und schließlich unter Vakuum bei Raumtemperatur getrocknet. Gewicht des Feststoffs: 70 mg.
Das Produkt wurde mittels ¹H-NMR-Spektroskopie in DMSO-d₆/TFA analysiert, was die Gegenwart von kovalent an das Polysaccharid gebundenem MT zeigt.
Beispiel 10 Wirkung der erfindungsgemäßen Verbindung auf die Aktivität der Diydrofolatreduktase
Reagenzien und Proben wurden zu 3 ml Wegwerf-Küvetten bis zum benötigten Volumen an destilliertem Wasser in der folgenden Reihenfolge gegeben: H₂O (0,1–0 ml), 1,5 M Na-Acetatpuffer (1 ml), 1,8 M KCl (1 ml), 3 mM NADPH (0,15 ml), Testlösung in PBS (0–0,1 ml), Dihydrofolatreduktase (DHFR) (ca. 0,01 Uμl) (5 μl). Alle Reagenzien wurden von Sigma erhalten. Die DHFR wurde zugegeben, vermischt und bei 30°C für 2 min inkubiert. Die Reaktion wurde durch Zugabe von Dihydrofolsäure (3 mM, 0,15 ml) gestartet und die Abnahme der Extinktion bei 340 nm mit der Zeit wurde verfolgt. Die Testlösung enthielt: a) MT (definiert wie in Beispiel 3), 2,2 × 10^–5 M, b) die erfindungsgemäße Verbindung wurde wie in Beispiel 7 erhalten (RG4900) in einer Menge entsprechend zu 2 × 10^–5 M MT Äquivalenten.
Eine Kontrollreaktion, welche 0,1 ml PBS als Testlösung enthielt, wurde eingeschlossen.
Die getestete Konzentration an MT von 2,2 × 10^–5 M inhibierte die Aktivität der Dihydrofolatreduktase vollständig. Die äquimolare Konzentration, bezogen auf MT, der Verbindung RG4900, inhibierte die DHFR Aktivität nicht, wie durch ein ΔA₃₄₀-Äquivalent zu der Kontrollreaktion nachgewiesen. Jedoch ist die Geschwindigkeit der Extinktionsabnahme am Beginn der Reaktion geringfügig langsamer als in Gegenwart der dann die Kontrolle ausübenden Verbindung. Diese beobachtete restliche Inhibitorwirkung der Verbindung RG4900 auf DHFR kann vielleicht einer geringen Menge an freiem MT, das bei der Herstellung anwesend war, zugeschrieben werden. Daher wird das meiste der Inhibitorwirkung auf die DHFR durch MT geleistet, wenn es aus dem Prodrug durch Hydrolyse der Esterbindung im geeigneten Zellkompartiment freigesetzt wurde.
Die Bedingungen der Esterhydrolyse wurden untersucht, indem verschiedene Experimente bei unterschiedlichen pH-Werten durchgeführt wurden. Die Untersuchung der DHFR-Inhibierung, die nach der Hydrolyse ausgeführt wurde, ermöglichte den Nachweis der Inhibitorwirkung des hydrolysierten Systems.
Beispiel 11 In vitro-Assay der antiproliferativen Wirkung der erfindungsgemäßen Verbindungen
Die antiproliferative Wirkung des erfindungsgemäßen Polysaccharidesters der Verbindung RG4900 wurde an mehreren Tumorzelllinien untersucht wie: SK-OV-3 (humane Zelllinie): Ovarialkarzinomzellen, HT29 Kolonkarzinomzellen (humane Zelllinie), NIH-H460 Pulmonarkarzinomzellen (humane Zelllinie), L1210 Leukämiezellen (murine Zelllinie). Die oben genannten Zelllinien wurden als eine Monolayer in RPMI-1640 Medium (Sigma Chemical Co., St. Louis) mit zusätzlichen 10% FCS, bei einer physiologischen Folgt-Konzentration (2 nM), in einer 50 cm² Kunststoffflasche (Corning Industries, Corning, NY), die bei einer Temperatur von 37°C gehalten wurden, unter einer feuchten Atmosphäre mit 5% of CO₂ vermehrt. Sie wurden jede Woche in frisches Medium überführt. Vor dem Beginn der experimentellen Untersuchungen wurden die Zellen in der exponentiellen Wachstumsphase mit einer Trypsinlösung aus den Flaschen entfernt. Die Zellen wurden dann in 6-Lochplatten (30.000 Zellen/Platte) in RPMI-1640 Medium mit zusätzlichen 10% FCS geimpft. Die Zellen wurden 24 Stunden vermehrt, um die Haftung zu fördern, und dann wurde das Medium entfernt und durch das experimentelle Medium ersetzt. Die Zellen wurde für 72 oder 120 Stunden inkubiert. Das experimentelle Medium wurde hergestellt, indem eine Lagerlösung in PBS-Puffer des erfindungsgemäßen Polysaccharidesters mit unterschiedlichen Endkonzentrationen in einem Konzentrationsbereich zwischen 0–5000 μg/ml N-GA Äquivalenten), in RPMI-1640 Medium mit zusätzlichen 10% FCS verdünnt wurde. Es wurde eine Vergleichsuntersuchung mit dem entsprechenden N-GA in einem Konzentrationsbereich von 0–100 μg/ml ausgeführt. Die antiproliferative Wirkung wurde mittels eines Trypanblau-Kolorimetrie-Assays bestimmt, welches proportional zu der Anzahl an lebensfähigen Zellen ist.
Tabelle 1 zeigt den Prozentsatz des Wachstums der Zelllinie SK-VO-3 (Ovarialkarzinom), in Gegenwart der Verbindung aus Beispiel 7 (RG4900) nach 72 und 120 Stunden Behandlung. Jeder Wert ist der Durchschnitt aus 4 unterschiedlichen Untersuchungen. Die Konzentrationen der untersuchten Verbindungen beziehen sich auf die Menge an MT, die in der jeweiligen Verbindung anwesend ist. Die Experimente wurden mit einer Zelldichte von 30.000 Zellen/Platte ausgeführt.
Tabelle 1
Aus den oben gezeigten Daten ist ersichtlich, das die erfindungsgemäßen Polysaccharidester eine hohe antiproliferative Wirkung ausüben, welche Zeit- und Dosisabhängig ist.
Tabelle 2 gibt die Wirkung auf das Zellüberleben von SK-OV-3 Ovarialkarzinom sowohl von dem Polysaccharidester wie auch von dem korrespondierenden underivatisiertem Polysaccharid wieder (Scleroglucan, SC mit MW: 140.000). Die Untersuchungen wurden nach 72 und 120 Stunden Inkubation und bei einer Konzentration an Polysaccharidester entsprechend einer 5 μg/ml Konzentration von MT ausgeführt.
Tabelle 2
Aus den oben genannten Daten kann keine Wirkung durch underivatisiertes Polymer (SC) nachgewiesen werden.
Tabelle 3 gibt die IC₅₀-Werte (notwendige Konzentration, um das Zellwachstum um 50% gegenüber dem Wachstum der Kontrolle zu vermindern) des erfindungsgemäßen Polysaccharidesters und einer Verbindung (AB1) wieder, die durch Derivatisierung von Scleroglucan nach dem Stand der Technik hergestellt wurde.
Das Auszählen der Zellproben der unterschiedlichen Tumorzelllinien wurde nach 120 Stunden Behandlung ausgeführt. Die Konzentrationen der erfindungsgemäßen Ester sind ausgedrückt als Menge an MT, die im Polysaccharidester anwesend ist (ng/ml).
Tabelle 3
Die Daten aus Tabelle 3 zeigen, dass ein zufällig substituiertes MT-Scleroglucan (AB1), hergestellt nach Beispiel 3 von US 5 554 386 und als ein Vergleich untersucht, bezogen auf die erfindungsgemäßen Verbindungen einen sehr hohen IC₅₀ aufweist. Dies liefert einen klaren Nachweis, dass eine starke positive Wirkung auf die antiproliferative Wirkung der erfindungsgemäßen Verbindungen durch eine selektive Substitution von N-GA erhalten wird.

Claims

Polysaccharidester der Verbindung mit der Formel (I)
in welcher: – R₂ und R₄ unabhängig voneinander ausgewählt werden aus der Gruppe bestehend aus -NH₂, -OH, -OCH₃, C₁-C₅-Alkylresten, =O, und der 6-gliedrige Ring mit den beiden Stickstoffatomen gegebenenfalls aromatisch ist; – X und Y ausgewählt werden aus der Gruppe bestehend aus: -C(R₅)=, -CH(R₅)-, -NH-, -N=, wobei R₅ -H oder einen C₁-C₅-Alkylrest darstellt, und der X und Y enthaltende Ring gegebenenfalls aromatisch ist; – Z ausgewählt wird aus der Gruppe bestehend aus -O-, -CH(R₁₀)-, -N(R₁₀)-, wobei R₁₀ -H, einen C₁-C₅-Alkylrest, einen C₁-C₅-Alkenylrest, einen C₁-C₅-Alkinylrest oder einen 5- bis 6-gliedrigen Heterocyclus mit 1 bis 3 Heteroatomen darstellt, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Stickstoff, Schwefel und Sauerstoff; – Ar 1,4-Phenyl ist, gegebenenfalls mit einem oder mehreren 5- bis 6-gliedrigen aromatischen Ringen kondensiert, gegebenenfalls mit Heterocyclen, gegebenenfalls mit R₂ substituiert, das wie oben definiert ist; dadurch gekennzeichnet, dass nur die primäre in den Monosaccharideinheiten des Polysaccharids vorkommenden Hydroxylgruppen entweder ganz oder teilweise mit γ-Carboxylgruppen der Verbindungen mit der Formel (I) verestert sind.
Polysaccharidester der Verbindung mit der Formel (I),
in welcher – R₂ und R₄ unabhängig voneinander ausgewählt werden aus der Gruppe bestehend aus -NH₂, -OH, -OCH₃, C₁-C₅-Alkylresten, =O, und der 6-gliedrige Ring mit den beiden Stickstoffatomen gegebenenfalls aromatisch ist; – X und Y ausgewählt werden aus der Gruppe bestehend aus: -C(R₅)=, -CH(R₅)-, -NH-, -N=, wobei R₅ -H, einen C₁-C₅-Alkylrest darstellt, und der X und Y enthaltende Ring gegebenenfalls aromatisch ist; – Z ausgewählt wird aus der Gruppe bestehend aus -O-, -CH(R₁₀)-, -N(R₁₀)-, wobei R₁₀ -H, einen C₁-C₅-Alkylrest, einen C₁-C₅-Alkenylrest, einen C₁-C₅-Alkinylrest oder einen 5- bis 6-gliedrigen Heterocyclus mit 1 bis 3 Heteroatomen darstellt, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Stickstoff, Schwefel und Sauerstoff; – Ar 1,4-Phenyl ist, gegebenenfalls mit einem oder mehreren 5- bis 6-gliedrigen aromatischen Ringen kondensiert, gegebenenfalls mit Heterocyclen, gegebenenfalls mit R₂ substituiert, das wie oben definiert ist; dadurch gekennzeichnet, dass für pharmazeutische Verwendungen nur die primäre in den Monosaccharideinheiten des Polysaccharids vorkommenden Hydroxylgruppen entweder ganz oder teilweise mit γ-Carboxylgruppen der Verbindungen mit der Formel (I) verestert sind.
Polysaccharidester gemäß Anspruch 1, wobei – R₂ und R₄ unabhängig voneinander ausgewählt werden aus der Gruppe bestehend aus -NH₂, und -OH, und der 6-gliedrige Ring mit den beiden Stickstoffatomen aromatisch ist; – R₅, wenn anwesend, -H oder -CH₃ darstellt; – Z ausgewählt wird aus der Gruppe bestehend aus -CH(R₁₀)- und -N(R₁₀)-, wobei R₁₀ -H, einen C₁-C₅-Alkylrest, einen C₁-C₅-Alkenylrest oder einen C₁-C₅-Alkinylrest darstellt.
Polysaccharidester gemäß Anspruch 1, wobei – R₂ und R₄ unabhängig voneinander ausgewählt werden aus der Gruppe bestehend aus -NH₂, und -OH, und der 6-gliedrige Ring mit den beiden Stickstoffatomen nicht aromatisch ist; – R₅, wenn anwesend, -H oder -CH₃ darstellt; – Z ausgewählt wird aus der Gruppe bestehend aus -CH(R₁₀)- und -N(R₁₀)-, wobei R₁₀ -H, einen C₁-C₅-Alkylrest, einen C₁-C₅-Alkenylrest oder einen C₁-C₅-Alkinylrest darstellt.
Polysaccharidester gemäß Anspruch 1, wobei – R₂ =O und R₄ -NH₂ ist und der 6-gliedrige Ring mit den beiden Stickstoffatomen nicht aromatisch ist; – X und Y -N= sind und der sie enthaltende Ring aromatisch ist; – Z -N(R₁₀)- ist, wobei R₁₀ -H oder -CH₃ darstellt; – Ar 1,4-Phenyl ist.
Polysaccharidester gemäß Anspruch 1, wobei – R₂ und R₄ -NH₂ sind und der 6-gliedrige Ring mit den beiden Stickstoffatomen aromatisch ist; – X und Y -N= sind und der sie enthaltende Ring aromatisch ist; – Z -N(R₁₀)- ist, wobei R₁₀ -H oder -CH₃ darstellt; – Ar 1,4-Phenyl ist.
Polysaccharidester gemäß Anspruch 1, wobei – R₂ und R₄ -NH₂ sind und der 6-gliedrige Ring mit den beiden Stickstoffatomen aromatisch ist; – X und Y -N= sind und der sie enthaltende Ring aromatisch ist; – Z -CH(C₂H₅) ist; – Ar 1,4-Phenyl ist.
Polysaccharidester gemäß einem der Ansprüche 1–7, wobei das Polysaccharid neutral oder anionisch ist.
Polysaccharidester gemäß Anspruch 8, wobei das Polysaccharid entweder linear oder verzweigt ist und aus Monosaccharideinheiten besteht, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus: D-Glucose, D-Xylose, L-Rhamnose, D-Galacturonsäure, D-Glucuronsäure, D-Mannuronsäure, L-Guluronsäure, L-Iduronsäure, D-Fructose, N-Acetyl-D-glucosamin, N-Acetyl-L-galactosamin, 3,6-Anhydro-D-Galactose, 3,6-Anhydro-L-Galactose.
Polysaccharidester gemäß einem der Ansprüche 8–9, wobei die Hauptkette des genannten Polysaccharids eine β-(1→3), β-(1→2), β-(1→4)-D-glycosidische Struktur oder eine α-(1→3), α-(1→4), α-(1→6)-D-glycosidische Struktur hat und mögliche Seitenketten aus Monosacchariden bestehen, die mit β-(1→2), β-(1→3), β-(1→4), β-(1→6), α-(1→4) oder α-(1→6)-Konfiguration gebunden sind.
Polysaccharidester gemäß Anspruch 10, wobei genanntes Polysaccharid ein β-(1→3)-D-Glucan ist.
Polysaccharidester gemäß Anspruch 10, wobei genanntes Polysaccharid ausgewählt wird aus der Gruppe bestehend aus: Scleroglucan, Lentinan, Schizophyllan, Pachimaran, Curdlan, Laminaran.
Polysaccharidester gemäß Anspruch 10, wobei genanntes Polysaccharid Hyaluronsäure oder ein Salz davon ist.
Polysaccharidester gemäß Anspruch 10, wobei genanntes Polysaccharid ein sulfatiertes Polysaccharid ist.
Polysaccharidester gemäß Anspruch 14, wobei genanntes sulfatiertes Polysaccharid aus Algen der Grateloupiaceae- oder Codiaceae-Familien extrahiert wird.
Polysaccharidester gemäß einem der Ansprüche 1–15, wobei mindestens eine Hydroxylgruppe der Monosaccharideinheiten des Polysaccharids mit einem Rest substituiert ist, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus: C₁-C₆-Alkylresten, -COOH, -NH₂, -NHCOCH₃, -SO₃H, -OPO₃H₂, -COO-(CH₂)_n-COOH, -COOR, -COR, -OR, -O-(CH₂)_n-OCOR, und wobei n = 1–4 und R ein C₁-C₁₀-Alkylrest ist.
Pharmazeutische Zusammensetzungen umfassend die Polysaccharidester gemäß einem der Ansprüche 1–16 als aktive Verbindung zusammen mit geeigneten pharmazeutisch zulässigen Hilfsstoffen und/oder Verdünnungsmitteln.
Pharmazeutische Zusammensetzungen gemäß Anspruch 17, die in Form einer Lösung oder einer Suspension vorliegen.
Pharmazeutische Zusammensetzungen gemäß Anspruch 17 für parenterale, orale oder topische Verabreichung.
Pharmazeutische Zusammensetzungen gemäß einem der Ansprüche 17–19, wobei die parenterale Verabreichung intravenös, intramuskulär, intraartikulär oder subkutan erfolgt.
Pharmazeutische Zusammensetzungen gemäß einem der Ansprüche 17–20 in Form von Gel, Creme, Pulver, Granulaten, Tabletten, Pilulae, Kapseln oder Inserten.
Verwendung des Polysaccharidesters gemäß einem der Ansprüche 1–16 zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung und Prävention von Krankheiten, die durch eine Hyperproliferation der Zellen kennzeichnet sind.
Verwendung des Polysaccharidesters gemäß Anspruch 22 zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung und Prävention von Autoimmun- oder entzündlichen Erkrankungen.
Verwendung des Polysaccharidesters gemäß Anspruch 22 zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung und Prävention von rheumatischer Arthritis.
Verwendung des Polysaccharidesters gemäß Anspruch 22 zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung und Prävention von dermatologischen Erkrankungen.
Verwendung des Polysaccharidesters gemäß Anspruch 25, wobei die dermatologische Erkrankung Psoriasis ist.
Verwendung des Polysaccharidesters gemäß Anspruch 22 zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung und Prävention von Tumoren.
Verwendung des Polysaccharidesters gemäß Anspruch 22 zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung und Prävention von intestinalen entzündlichen Erkrankungen.
Verfahren zur Herstellung von Polysaccharidestern nach den Ansprüchen 1–16, umfassend die folgenden Schritte: a) Erhalt eines regioselektiv halogenierten Polysaccharids durch Aktivierung der primären Hydroxylgruppen der Monosaccharideinheiten des Polysaccharids; b) Bildung der Esterbindung zwischen dem regioselektiv halogenierten Polysaccharid und der Carboxylgruppe der Verbindung mit der Formel (I) durch Austausch der Halogenatome.
Verfahren gemäß Anspruch 29, wobei genannte Aktivierung in Schritt a) durch Halogenierung des Polysaccharids erfolgt.
Verfahren gemäß Anspruch 30, wobei genannte Halogenierung in einem organischen Lösungsmittel erfolgt, das weiterhin ein Alkyl- oder Arylhalogenid umfasst.
Verfahren gemäß Anspruch 31, wobei genanntes Alkyl- oder Arylhalogenid ausgewählt wird aus der Gruppe bestehend aus: Methansulfonsäurebromid, p-Toluolsulfonsäurebromid, Methansulfonsäurechlorid und p-Toluolsulfonsäurechlorid.
Verfahren gemäß Anspruch 29, wobei in Schritt b) das in Schritt a) erhaltene halogenierte Polysaccharid in einem organischen Lösungsmittel suspendiert wird und dann mit der Verbindung mit der Formel (I) vermischt wird, welche im gleichen Lösungsmittel suspendiert wurde, in Gegenwart eines basischen Mittels.
Verfahren gemäß einem der Ansprüche 31 und 33, wobei genanntes organisches Lösungsmittel ausgewählt wird aus der Gruppe bestehend aus: Dimethylformamid, Dimethylsulfoxid und N-Methylpyrrolidon.