CN101227906A - 包含透明质酸和谷氨酸的n-衍生物的抗增生共轭物 - Google Patents

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安东内拉·弗拉伊巴尼
马西莫·贝尔加明
斯特凡诺·诺尔贝多
克洛迪娅·索尔比
里亚·艾哈迈德·卡恩
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Abstract

透明质酸和谷氨酸的N－衍生物之间的共轭物，在透明质酸的残伯羟基上与氨基酸、肽、脂肪酸、芳基脂肪酸和/或芳香酸进一步进行酯化，观测到它们的抗增生活性显著不可预料地增加，并且它们的毒性降低。

Description

包含透明质酸和谷氨酸的N-衍生物的抗增生共轭物
发明领域
本发明涉及具有抗增生活性的透明质酸的酯化共轭物。
背景技术
已经测试了几种有机分子，已知其作为抗增生剂是有用的，但它们中的多种由于其高毒性、低溶解性和/或不合适的药物动力学参数而临床应用有限。
其中这些化合物是对二氢叶酸还原酶(DHFR)具有抑制活性的谷氨酸的N-衍生物，这些化合物组成了一族具有氨甲蝶呤作为母代化合物的抗增生剂。
这些药在几种疾病例如肿瘤、牛皮癣和类风湿性关节炎中是有效的。不过，它们的治疗用途强烈地受它们的高全身性毒性所限制。
在WO01/68105中发现，以上DHFR抑制剂的毒性问题可以通过使它们与多糖共轭而解决。实际上，由此获得的共轭物仍然被赋予抗增生活性，但同时具有表现出令人惊讶的较低毒性的优点。
发明内容
本发明人现在发现，当透明质酸和WO01/68105中所述的谷氨酸的N-衍生物之间的共轭物在透明质酸的剩余伯羟基上被氨基酸、肽、脂肪酸、芳基脂肪酸和/或芳香酸进一步酯化时，观察到它们的抗增生活性显著且出人意料地大大提高，并且其毒性降低。
附图说明
图1表示实施例4中获得的HA-6-Br的13C-NMR谱；
图2表示实施例5中获得的HA-Cl的13C-NMR谱；
图3表示实施例19中获得的HA-MTX的13C-NMR谱。
具体实施方式
本发明的第一目的在于透明质酸的新共轭物，其中，透明质酸的N-乙酰基-D-葡糖胺单元的伯羟基被选自氨基酸、肽、脂肪酸、芳基-脂肪酸和芳香酸的化合物A的羧基和式(I)的谷氨酸的N-衍生物的α-或γ-羧基两者所酯化：
Figure S2006800161505D00021
式(I)
其中：
R2和R4彼此独立地表示：-NH2，-OH，-OCH3，C1-C5烷基，＝O；
X和Y表示：-C(R5)＝，-CH(R5)-，-NH-，-N＝，其中R5表示：-H，C1-C5烷基；
Z表示：-CH(R10)-，-N(R10)-，-O-，其中R10表示：-H，C1-C5烷基，C1-C5烯基，C1-C5炔基，带有1-3个选自氮、硫和氧的杂原子的5-6元杂环；
Ar表示：1，4-苯基，与一个或多个5-6元芳香环稠合的1，4-苯基，与一个或多个5-6元杂环稠合的1，4-苯基，其中所述基团可以被以上定义的R2取代，
环A和B彼此独立地可以是芳香或非芳香性的。
这些化合物在WO01/68105中已经有所描述。
优选地，式(I)的化合物是式(I)所表示的氨甲蝶呤(MTX)，其中R2和R4是-NH2；环A是芳香性的；环B是芳香性的，并且X和Y是：-N＝；Z是-N(CH3)-；Ar是1，4-苯基。
更优选的式(I)化合物是属于以下子集的那些：
-式(I)所示的子集1，其中R2和R4是-NH2或-OH；
此时R5表示：-H，-CH3；环A是芳香性的；Z选自：-CH(R10)-，-N(R10)-；R10表示：-H，C1-C5烷基，C1-C5烯基，C1-C5炔基。
-式(I)所示的子集2，其中R2是＝O和R4是-NH2；环A不是芳香性的；环B是芳香性的，并且X和Y是-N＝；Z是-N(R10)-，其中R10表示：-H或-CH3；Ar是1，4-苯基。
-式(I)所示的子集3，其中R2和R4是-NH2；环A是芳香性的：环B是芳香性的，并且X和Y是-N＝；Z是-N(R10)-；其中R10是-CH3或-H；Ar是1，4-苯基。
-式(I)所示的子集4，其中R2和R4是-NH2；环A是芳香性的；环B是芳香性的，并且X和Y是-N＝；Z是-CH-(C2H5)-；Ar是1，4-苯基。
式(I)的化合物通过其γ-或者α-羧酸基连接到透明质酸。化合物A选自氨基酸、肽、脂肪酸、芳基-脂肪酸和芳香酸，并且通过其羧基连接到透明质酸。该化合物通过利用相应羧酸产生的酰基-亲核性而引入到多糖上。
所述脂肪酸、芳基-脂肪酸和芳香酸可以是直链或支链的，饱和或不饱和的，并且可以包含杂环。
根据本发明的脂肪酸具有多至24个的碳原子，是一元或多元羧酸，是饱和或不饱和的，并且可以被选自直链或支链C1-C5烷基、卤素、硝基、氰基、羟基、氨基、甲氧基、羰基、硫醇基和羧基的取代基所取代。根据本发明的脂肪酸还可以是环脂族或脂族环脂肪酸。
根据本发明优选的脂肪酸选自乙酸、丁酸、丙酸、视黄酸、n-丙基乙酸、琥珀酸、环己烷羧酸、环己烷乙酰基的酸(cyclohexaneacetylic acid)和环丙烷羧酸。
根据本发明优选的氨基酸选自丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、蛋氨酸、甘氨酸、丝氨酸、半胱氨酸、天冬酰胺、谷酰胺、天冬氨酸、谷氨酸、脯氨酸、组氨酸、苯丙氨酸、triptophane和酪氨酸。根据本发明优选的肽是由以上氨基酸不同组合所构成的肽。
根据本发明的芳基-脂肪酸具有C1-C4脂族链，并且芳基可以被直链或支链C1-C5烷基、卤素、硝基、氰基、羟基、氨基、甲氧基所取代。
根据本发明优选的芳基-脂肪酸选自苯基乙酸、苯氧基乙酸、萘基乙酸、2-(4-异丁基苯基)丙酸、2-(6-甲氧基-2-萘基)丙酸和肉桂酸。
根据本发明的芳香酸可以具有被直链或支链C1-C5烷基、卤素、硝基、氰基、羟基和甲氧基所取代的芳基。
优选的芳香酸选自未取代或取代的苯甲酸。优选所述取代的苯甲酸选自卤代苯甲酸、烷基苯甲酸、硝基苯甲酸和2-乙酰氧基苯甲酸。
所述脂肪酸或芳基-脂肪酸或芳香酸可以被芳香性或非芳香性的杂环所取代，可以与芳香性或非芳香性环稠合，其中所述杂环基团优选具有3-20个碳原子，并且可以被直链或支链C1-C5烷基、卤素、硝基、氰基、羟基、氨基、甲氧基所取代。
根据本发明特别优选的实施方式，化合物A选自乙酸、丁酸、丙氨酸、甘氨酸和包含丙氨酸和/或甘氨酸的肽。
透明质酸(在本申请中也表示为HA)由二糖重复单元组成，所述单元包含通过β(1→3)配糖键结合的D-葡糖醛酸和2-乙酰胺基-2-脱氧-D-葡萄糖(N-乙酰基-D-葡糖胺)；D-葡糖醛酸基可以是酸形式或盐形式。各个重复单元通过β(1→4)配糖键与下一个单元结合形成直链聚合物。
本申请中使用的术语″透明质酸″包括酸形式和盐化的形式。
术语透明质酸一般用于描述具有可变分子量的HA的分子片段的一般基团，或者还描述所述化合物的水解片段。对本发明的目的而言，所述透明质酸的平均分子量优选为5000和100000之间，更优选为10000和50000之间。
本发明透明质酸优选的共轭物是6-O-乙酰基-6-O-氨甲蝶呤基-透明质酸和6-O-丁酰基-6-O-氨甲蝶呤基-透明质酸和它们的盐。
本发明的共轭物是酸形式或盐形式。当它们是盐形式时，它们可以被碱金属(优选Na或K)、碱土金属(优选Ca或Mg)、过渡金属(优选Cu、Zn、Ag、Au、Co)盐化。通过技术人员已知的方法实现盐化。
任选地，本发明共轭物上的仲羟基也可以被衍生化以形成选自以下的基团：-OR，-OCOR，-SO2H，-OPO3H2，-O-CO-(CH2)n-COOH，-O-(CH2)n-OCOR，其中n是1-4和R是C1-C10烷基。
或者，仲羟基可以被-NH2或-NHCOCH3基团所取代。
这些取代易于通过本领域已知的方法实现，可以对它们进行选择以调节共轭物的亲水性。
式(I)化合物和化合物A在共轭物中的总量被定义为″取代度″(DS％)，这表示式(I)化合物和化合物A相对于共轭物总重量的重量％。
具体而言，在本发明的共轭物中，式(I)化合物和化合物A的量(DS％)优选为在0.1％和60％w/w之间，相对于共轭物总重量而言。而且，式(I)化合物的存在量优选为1％到40％w/w，而化合物A的量优选为0.1到30％w/w，两者都相对于共轭物的总重量而言。
当化合物A是乙酸时，相对于共轭物的总重量而言，其在本发明共轭物中的量优选占0.1％到10％w/w。
根据本发明的共轭物的特征在于，存在有两个直接连接到所述透明质酸的N-乙酰基-D-葡糖胺单元的伯羟基的不同酯基。
HA的其它羟基没有涉及与药物的化学键，因此形成化学结构中的一致性，这对确保功效是尤其重要的。
如这里提出的实验证据所表明的，本发明的共轭物保留着式(I)化合物抑制细胞增殖的能力。而且，与WO01/68105中所述的相应共轭物相比，这些衍生物出乎意料地被赋予远更有效的抗增生活性，并被赋予甚至更低的毒性。
因此，它们可以被成功地用于治疗以细胞过多增殖为特征的所有疾病。
因此，本发明的另一目的是以上共轭物在制备用于治疗以细胞过多增殖为特征的疾病的药物中的用途。优选所述疾病选自肿瘤、皮肤病变、牛皮癣、炎性疾病和类风湿性关节炎。
优选所述肿瘤选自白血病、癌科病(例如腺癌、结肠癌、胰腺癌)、乳癌、卵巢癌和胃肠肿瘤。
本发明的又一目的是含有本发明的共轭物并混合有药物可接受的赋形剂和/或稀释剂的药物组合物。该药物组合物可以是液体形式或固体形式；可以通过口服、肠胃外、直肠或局部路径给药。
本发明的另一目的是一种用于制备上述共轭物的方法。
具体而言，本发明人已开发出能够获得本发明共轭物的特殊方法，全无卤代副产物以及会致使所述共轭物不适于药物应用的其它副产物。所述方法包括以所示顺序进行的以下步骤：
(a)使游离形式或盐形式透明质酸的N-乙酰基-D-葡糖胺单元的伯羟基氯化；
(b)通过取代氯原子而形成氯化的透明质酸和式(I)化合物的羧基之间的酯键；
(c)借助化合物A合适的酰基亲核性而取代残余的氯原子，从而形成步骤(b)的产物和化合物A的羧基之间的酯键。
起始HA可以是游离形式或盐形式，其中，抗衡离子优选是碱金属或碱土金属，或者是含氮的抗衡离子。后一种情况下，所述抗衡离子可以包含杂环。含氮的抗衡离子优选的实例是铵、四丁基铵(TBA)、吡啶鎓或sym-可力丁鎓离子(sym-collidiniumions)。
步骤(a)是选择性氯化，该步骤在将HA混入非质子有机溶剂后进行。关键在于，步骤(a)中的反应是氯化反应，而不是一般性的卤化反应。
实际上，如实验部分所示，该氯化反应能够获得最终的共轭物，该共轭物是稳定的，并且不含有不希望的副产物和会有害于其实际药物应用的杂质。
优选的氯化试剂是在N，N-二甲基甲酰胺中的甲磺酰氯(Vilsmeir试剂)。
该氯化反应优选按照以下过程进行。
在-20℃到-10℃，优选在-10℃的温度下，将氯化试剂加入到盐形式(钠形式，或有机碱形式，例如TBA、吡啶或sym-可力丁)，优选钠形式的HA在N，N-二甲基甲酰胺(DMF)里的溶液或悬浮液中。反应温度在2h的时间内，从-10℃升高到40℃-65℃之间，优选60℃。
然后氯化反应在40℃和65℃之间，优选在60℃的温度下进行10和24小时之间的一段时间，优选进行16h。
通过用饱和NaHCO3水溶液处理以使pH为8，然后通过用NaOH水溶液处理成pH9，从而使反应完成；该步骤能够除去在反应过程中，在HA分子的仲羟基上形成的甲酸酯基团。然后通过加入稀HCl来中和该反应混合物。然后通过标准技术回收所希望的6-氯-6-脱氧-透明质酸(也称为HA-6-Cl或HA-Cl)。
在这些条件下，在N-乙酰基-D-葡糖胺基的C-6位上的氯化度可以为1.0到8.3％w/w，优选为1.4-5.0％w/w。
步骤(b)通常按照以下过程进行。
HA-6-Cl以TBA形式或者以钠盐形式，优选以TBA形式，悬浮在非质子有机溶剂或其混合物中，然后加入在相同溶剂(在碱金属盐或碱土金属盐，例如碳酸铯存在下)中的式(I)化合物。
在持续搅拌下，该反应在50℃和80℃之间，优选70℃下进行24-52小时，优选进行40小时。然后通过标准技术回收所希望的产物。
当式(I)化合物是MTX时，该共轭物被称为6-脱氧-6-O-氨甲蝶呤基-透明质酸(HA-6-MTX或HA-MTX)。
在该步骤中获得的产物是HA的中间共轭物，其包含式(I)化合物和氯。在该共轭物中，式(I)化合物的总量低于40％w/w，并且残余的氯(在该步骤中没有被取代的氯)低于3％w/w。
借助化合物A的酰基亲核性，步骤(c)能够完全取代步骤(b)中所获得的产物中残余的氯。
可以使用碱金属或碱土金属盐形式的任何合适的酰基亲核性。在乙酸、丁酸或氨基酸情况下，优选它们的钠盐或铯盐。当(b)产物是钠盐形式时，优选使用乙酸钠；而乙酸铯优选用来从有机碱形式的(b)产物，例如sym-可力丁鎓或TBA盐，优选TBA形式中取代氯。
然后通过标准技术，例如沉淀、超滤、干燥或冻干可以回收所获得的共轭物。
该共轭物不含任何残余的氯。
当式(I)化合物是氨甲蝶呤时，则共轭物是6-O-酰基-6-O-氨甲蝶呤基-透明质酸(HA-6-MTX-6-酰基或HA-MTX-酰基)。
如实验部分所示，本发明人还令人惊讶地发现，以上方法也能够获得含有少于3％剩余氯的WO01/68105的共轭物，因此，与用现有技术中描述的方法所制得的共轭物相比，被赋予改善的性能。
因此，本发明还涉及透明质酸和式(I)化合物之间的共轭物，如上所定义，所述共轭物包含低于3％w/w，优选低于0.1％w/w的化学连接于HA聚合链上的残余氯。
本发明还涉及获得包含小于3％w/w卤代副产物的以上共轭物的方法，包括以下步骤：
(a)使游离形式或盐形式的透明质酸的N-乙酰基-D-葡糖胺单元的伯羟基氯化；和
(b)通过取代氯原子而形成氯化的透明质酸和式(I)化合物的羧基之间的酯键；
其中步骤a)和步骤b)如上定义。
本发明的另一目的是获得如上定义的透明质酸和式(I)化合物之间的共轭物的方法，所述共轭物包含低于0.1％w/w的化学连接于HA聚合链上的残余氯，该方法包括以下步骤：
a)使游离形式或盐形式的透明质酸的N-乙酰基-D-葡糖胺单元的伯羟基氯化；
(b)通过取代氯原子而形成氯化的透明质酸和式(I)化合物的羧基之间的酯键；
(c)借助合适的酰基亲核性与步骤(b)的剩余产物形成酯键而取代残余的氯原子；和
d)使从步骤(c)获得的共轭物选择性地脱酰基化。
该反应可以通过已知的化学脱酰基化反应或酶脱酰基化反应来进行。
现在通过以下实验实施例来非限定性地描述本发明。
实验部分
实施例1：确定HA-Cl和HA共轭物中的氯含量
通过13CNMR(Spectrometer Varian Mercury 200)，采用13C-谱捕获的标准顺序(std13C顺序)来确定共轭物中的氯含量在室温下，5mm管中，将20mg共轭物样品溶于650μL D2O中。采用温和加热(50℃)，以排除溶液中的气泡。在30℃下24hr小时后收集谱图，并通过积分HA-Cl的CH2OH信号(61ppm)和CH2Cl信号(44ppm)进行分析。对于HA-MTX-Cl衍生物，除了这两个信号外，还对CH2OMTX信号(64ppm)进行积分。以含有6-氯基团的HA重复单元数和HA重复单元的总数之比来确定氯含量。然后将该比值转化为氯的重量％。
实施例2：通过HPLC确定氨甲蝶呤含量
HA共轭物的氨甲蝶呤含量通过HPLC来确定，按照有关氨甲蝶呤公认的专著(USP 23-p 984)来分析碱性水解之前和之后的样品。分析条件为，色谱仪：DionexDX-600.柱：Column Phenomenex Synergi 4μHydro-RP80，柱尺寸：150×460mm，柱颗粒尺寸：4μ，温度：40℃，洗脱液：90％0.2M磷酸氢二钠/0.1M柠檬酸(630∶270)，10％CH3CN，等度条件：0.5mL/min.检测器：二极管阵列(范围200-780nm)，用于定量测定的选择波长：302nm，注入体积：25μl，运行时间30分钟。用于游离氨甲蝶呤测定的溶液是将HA-MTX以合适浓度直接溶于MilliQ水中而制得的。总氨甲蝶呤含量是在NaOH 0.1M、室温下进行碱性水解2小时后测得的。用盐酸1M中和后，在注射到HPLC系统中之前，通过0.45μm(Sartorius Minisart RC2517795Q)过滤溶液。通过使用含有已知浓度的氨甲蝶呤的标准溶液测定校准曲线。该方法给出样品溶液中的MTX浓度，用样品浓度对其进行归一化，得到DSMTX％w/w。
HA-MTX共轭物的结构得到NMR支持：1H-NMR和1H-DOESY NMR谱证实，制得的所有共轭物的N-乙酰基-D-葡糖胺的C6位上确实有MTX分子的共价键。
实施例3：测定重均分子量(Mw)
通过HP-SEC(高效尺寸排除色谱，High Performance Size ExclusionChromatography)测量透明质酸共轭物的分子量。分析条件为，色谱仪：HPLC pump980-PU(Jasco序列号B3901325)，带有Rheodyne 9125注射器。柱：TSK PWxI(TosoBioscience)G6000+G5000+G3000 6，10，13μm颗粒尺寸；温度：40℃流动相：NaCl0.15M+0.01％NaN3.流量：0.8mL/min.检测器：MALLS(WYATT DAWNEOS-WYATT，USA)，λ＝690nm，(dn/dc＝0.167mL/g)，UV分光光度计检测器875-UV(Jasco，序列号D3693916)，λ＝305nm，干涉计的折光指数参考OPTILABREX(WYATT，USA)；λ＝690nm，灵敏度：128x；温度：35℃；注入体积：100μl，运行时间60分钟要分析的HA-Cl和HA-MTX的样品在0.9％NaCl中配制成浓度约1.0mg/ml的溶液，并在搅拌下保持12小时。然后，在0.45μm多孔过滤器(SartoriusMinisart RC25 17795Q)上过滤该溶液，最后注入色谱仪中。该分析法能够测量Mw(重均分子量)、Mn(数均分子量)、PI(多分散性)。通过对折射率积分来控制聚合物样品溶液的浓度。
实施例4：6-溴-6-脱氧-透明质酸(HA-Br)
1g透明质酸的四丁基铵盐(MW 120000)在80℃下悬浮于50mL无水DMF中，并在混合和氮气氛下保持约1小时。将混合物冷却到室温，然后在0℃下加入1.28g甲磺酰溴。该反应混合物在混合下再保持30分钟，然后在80℃下加热16小时。将混合物冷却到室温，通过加入约10mL Milli-Q水来停止反应。用0.1N NaOH中和该混合物，在低压下浓缩，并倒入200mL丙酮中。通过过滤收集产物，用丙酮洗涤，悬浮在蒸馏水中，然后以蒸馏水渗析，并冻干，固体重量：480mg。
从13C-NMR(图1)、通过积分在60ppm的峰(CH2OH)和在33ppm的峰(CH2Br)确定Br含量，结果等于14％w/w；MW：11800；PI：1.4。13CNMR谱显示存在多个不能被指认为HA或溴化HA的小峰，例如在51、53、91、93 ppm的峰。信号的这种NMR图案表明存在由溴化反应得到的副产物。
实施例5：6-氯-6-脱氧-透明质酸(HA-6-Cl或HA-Cl)
在搅拌下，在-10℃和在N2保护气氛下，向10g HA(MW 20,000)的钠盐在180ml二甲基甲酰胺的悬浮液中，在30分钟内滴加甲磺酰氯(10eq)。该混合物在此温度下保持30分钟，然后在2小时后达到60℃。然后在60℃和搅拌下下保持该反应16小时。然后将其冷却到室温，倒入冰与饱和NaHCO3的混合物中，然后用NaOH溶液处理到pH9。在此pH下一天后，该悬浮液变成溶液，用稀HCl进行中和。然后对该溶液进行超滤，浓缩并冻干，从而回收到白色固体(6g)。
产物的13C-NMR谱(图2)显示存在有在44ppm的信号(CH2Cl)，积分在61ppm和44ppm的峰，得到氯取代度为3.4％w/w。
比较图2中的谱和图1中的谱(HA-Br)表明，氯化反应产生纯净的产物。实际上，对于在HA-Br谱中见到的更高数量的峰而言，此处仅看到21个峰，并可指认为未衍生的HA重复单元(14个碳原子)，或者被指认为6-Cl-(N-乙酰基-D-葡糖胺)糖单元(7个碳原子)。
实施例6：HA-Cl
如实施例5那样进行反应，区别在于使用15cq甲磺酰氯。回收4.4g产物。
13C-NMR谱类似于实施例5化合物的谱，显示氯取代度为4.3％w/w。
实施例7：HA-Cl
如实施例5所述进行反应，区别在于使用50g HA的钠盐。回收36g白色固体。13C-NMR数据类似于在实施例5中制得的化合物的数据；氯含量为3.4％w/w(13C-NMR)。
实施例8：HA-Cl
如实施例5所述进行反应，区别在于反应混合物在60℃下维持20.5小时。回收36g白色固体。
13C-NMR数据类似于在实施例5中制得的化合物的数据；氯含量为4.9％w/w(13C-NMR)。
实施例9：HA-Cl
如实施例5所述进行反应，区别在于反应混合物在60℃下维持24.5小时。回收36g白色固体。
13C-NMR数据类似于在实施例5中制得的化合物的数据；氯含量为5.8％w/w(13C-NMR)。
实施例10：HA-Cl
在搅拌下，在-10℃和在N2流下，向HA TBA(2g，Mw 70000)在40ml无水二甲基甲酰胺的溶液中，在30分钟时间内滴加甲磺酰氯(5eq)。该混合物在-10℃下维持30分钟，并在室温下维持1小时，然后在60℃下加热16小时。然后使反应回到室温，加入10％TBAOH溶液，达到pH9-10，维持该pH达4天，直到悬浮液变成褐色溶液。通过超滤纯化，使用截止分子量为10KD的膜。然后冻干该水溶液，得到1g所希望的产物。
13C-NMR数据类似于在实施例5中制得的化合物的数据；氯含量为1.75％w/w(13C-NMR)。
实施例11：HA-Cl
如实施例10那样进行反应，区别在于反应温度为50℃，时间为18小时，并使用8当量的甲磺酰氯。回收1.4g所希望的产物，13C-NMR数据类似于在实施例5中制得的化合物的数据；氯含量为3.1％w/w(13C-NMR)。
实施例12：HA-Cl
如实施例10那样进行反应，区别在于使用10克HA，反应温度为55℃，时间为6小时，并使用10当量的甲磺酰氯。回收8.9g所希望的产物。13C-NMR数据类似于在实施例5中制得的化合物的数据；氯含量为1.4％w/w(13C-NMR)。
实施例13：HA-Cl
如实施例10那样进行反应，区别在于使用20g HA，反应温度为50℃，并使用8当量的甲磺酰氯。回收16g所希望的产物，13C-NMR数据类似于在实施例5中制得的化合物的数据；氯含量为2.6％w/w(13C-NMR)。
实施例14：HA-Cl TBA盐
在搅拌下，在-10℃和在N2流下，向HATBA(50g，Mw 70000)在1000ml无水DMF的溶液中，在1小时的时间内滴加甲磺酰氯(10eq)。该混合物在室温下维持1小时，然后在60℃下加热16小时。如实施例10那样进行处理，获得46.9g产物。13C-NMR数据类似于在实施例5中制得的化合物的数据；氯含量为4.2％w/w(13C-NMR)。
实施例15：HA-Cl
通过装填有Amberlite IR-120树脂的阳离子交换柱制备HA-Cl TBA盐。该柱(72cm×4cm)带有可调节温度的外夹套，将200g干燥树脂置于700mL 1M盐酸中，在温和搅拌下调理1小时，用蒸馏水洗涤，并倒入该柱中。用更多蒸馏水冲洗该柱。将200mL TBA-OH 40％加入该柱中，并在40℃的温度下，以流速为30mL/min再循环TBAOH下维持72小时。最后，用几升水冲洗树脂，直到最终pH为8.5-9。将5.65g HA-Cl Na溶于160mL milliQ水中。然后将该溶液倒入预先排干水的柱中，并通过蠕动泵在柱中以4mL/min的流速再循环24小时。然后通过冲洗柱来回收HA-Cl TBA，得到7.7g HA-Cl TBA。
实施例16：6-脱氧-6-O-氨甲蝶呤基-透明质酸(HA-6-MTX或HA-MTX)
在搅拌和氮气下，向来自实施例12的3.5g HA-Cl TBA盐在175ml无水DMSO的溶液中加入2eq(HA骨架的每个重复单元)氨甲蝶呤(5.14g)在DMSO(51ml)中的溶液；然后分批加入2eq(每个重复单元)固体碳酸铯(3.68g)。搅拌所得的混合物，并在65℃下加热40h。此时间后，将该混合物冷却到室温，并倒入冰水中。用稀HCl溶液将pH调节到7，在室温下搅拌混合物达4小时。然后对1M NaCl(2×2.5L)进行渗析，通过烧结的玻璃过滤器(IV级)过滤不溶的物质，以10KDa膜超滤该溶液，然后通过1.2μm、0.45μm和0.22μm孔径过滤器进行过滤。在真空中浓缩黄色的溶液，并冻干，获得黄色的蓬松固体(0.8g)。
13C-NMR谱确认在D-葡糖胺基的6位出现键合：在64ppm的峰被指认为CH2O-MTX，与母代氯衍生物相比，其强度相当于在44ppm(CH2Cl)的峰的降低。MTX含量为4.2％w/w(HPLC)；游离MTX的含量低于0.5％w/w(HPLC)；水含量：10.5％w/w；MW：63000；PI：2.8。剩余氯：0.8％w/w。
实施例17：HA-MTX
如实施例16那样制备共轭物，区别在于，HA-Cl TBA盐(1g，来自实施例10)在50ml无水DMSO中的溶液用氨甲蝶呤(1.65g)和碳酸铯(1.13g)在70℃下处理40小时，在如实施例12中所述处理后，得到黄色固体(0.7g)。
1H-NMR DOESY和13C-NMR数据类似于在实施例16中制得的化合物的数据，确认在HA的C-6上存在共价键合的MTX。MTX含量为10.0％w/w(HPLC)；游离MTX为0.17％w/w(HPLC)；水含量为10％w/w，MW：94000；PI：5.2。
实施例18：HA-MTX
如实施例16那样制备共轭物，区别在于，在70℃下用2.4g MTX和1.63g碳酸铯处理在DMSO(75ml)中的1.52g来自实施例11的HA-Cl-TBA盐40h，按通常的方法处理后得到450mg黄色固体。
通过1H-NMR DOESY和13C-NMR确认结构。MTX含量为16％w/w(HPLC)；游离MTX＜0.5％(HPLC)；水含量：12％w/w，MW：63000，PI：3.2。
实施例19：HA-MTX
如实施例16那样制备共轭物，区别在于，在80℃下用MTX(29.3g)和碳酸铯(21g)处理HA-Cl TBA盐(20g，来自实施例14)在DMSO(1.25L)中的溶液40h，得到5.6g黄色固体。
NMR确认该共轭物的结构。13C-NMR谱(图3)确认在N-乙酰基-D-葡糖胺的6位出现了键合：在64ppm的峰被指认为CH2O-MTX，与母代氯衍生物相比，其强度相当于在44ppm(CH2Cl)的峰的降低。MTX含量为18.8％w/w(HPLC)；游离MTX为0.1％w/w，水含量：8.2％w/w；MW：11000；PI：1.4；残余氯含量：1.76％w/w(NMR)。
实施例20：HA-MTX
在搅拌和氮气下，向5g来自实施例5的HA-Cl TBA盐在150ml无水DMSO的溶液中加入9g MTX在100ml DMSO中的溶液；然后分批加入6.43g固体碳酸铯。搅拌所得的混合物，并在70℃下加热40h。在该时间后，在室温下冷却混合物，并倒入200ml冰水中。用HCl 1N将pH降低到4.75，然后用饱和NaHCO3溶液调节到7(最终体积为500ml)。然后对1M NaCl(2×2.5L)进行渗析，通过烧结的玻璃过滤器(级II，III，然后IV)过滤不溶的物质，以10KDa膜超滤该溶液，然后通过1.2微米、0.45微米和0.22微米孔径过滤器进行过滤。在真空中浓缩该黄色的溶液，并冻干，获得黄色的蓬松固体(0.8g)。
1H NMR DOSY和13C-NMR数据确认MTX在D-葡糖胺残基的6位上有键合。MTX含量为20％w/w(HPLC)；游离MTX低于0.5％w/w(HPLC)；水含量：11.7％w/w。MW：39000；PI：3.3。
实施例21：6-O-乙酰基-6-O-氨甲蝶呤基-透明质酸(HA-6-MTX-6-Ac或 HA-MTX-Ac)
如实施例10所述获得HA-Cl，但从50g在1L DMF中的HA TBA、8eq甲磺酰氯、50℃开始。获得36g HA-Cl，氯含量为2％w/w。30克所述HA-Cl与MTX进行如实施例19中所述的反应。所得的15g HA-MTX衍生物包含7.5％w/w MTX和1.25％w/w残余氯基团。1g HA-MTX-Cl Na盐在100ml无水DMSO中的悬浮液在60℃下处理1h。在100℃下，在搅拌下，用10当量无水固体乙酸铯(CsAcO)处理该均一的悬浮液24h。该混合物在室温下冷却后通过超滤进行纯化，然后冻干，得到0.63g HA-MTX-Ac Na。
MTX含量为5％w/w(HPLC)Mw：31000，PI 2.2，水含量17％w/w。通过积分在20.8ppm相应于乙酸盐的甲基的峰和在23ppm相应于HA的乙酰胺基的CH3的峰来估计乙酸盐含量，结果等于1％w/w。HA-MTX-Ac的结构得到13C-NMR谱支持：在44ppm处信号消失确认完全取代了氯基团，在63.8ppm(CH2-OAc)和在20.8ppm(乙酸盐基团的CH3)存在信号确认在葡糖胺的6位存在乙酸盐基团。
实施例22：HA-MTX-Ac
在100℃下，在搅拌下，用10当量无水固体乙酸铯(CsAcO)处理2g来自实施例20的HA-MTX Na在200ml无水DMSO中的悬浮液达19h。如实施例21所述完成该反应，得到1.46g HA-MTX-Ac Na盐。
MTX含量：13％w/w(HPLC)。Mw＝27600，PI 2.9，水含量：13％w/w。乙酸盐含量为0.3％w/w。(如实施例21那样测定)。13C-NMR谱类似于在实施例21中制得的化合物的谱。
实施例23：HA-MTX-Ac
在100℃下，在搅拌下，用10当量无水固体乙酸铯(CsAcO)处理2.5g来自实施例19的HA-MTX Na在250ml无水DMSO中的悬浮液达19h。如实施例21所述完成该反应，得到1.6g HA-MTX-Ac Na盐，MTX含量11％w/w(HPLC)。水含量：12.6％w/w。乙酸盐含量为1.3％w/w。(如实施例21那样测定)。
13C-NMR数据类似于在实施例21中制得的化合物的数据。
实施例24：6-O-丁酰基-6-O-氨甲蝶呤基-透明质酸(HA-6-MTX-6-But或 HA-MTX-But)
21g来自实施例14的HA-Cl与2.67eq MTX和2.67eq Cs2CO3在80℃下反应40小时。在5eq丁酸铯(CsBut)存在下，将200mg所得的HA-MTX-Cl(MTX含量为30％w/w)在80℃下悬浮于20ml DMSO中达21小时。如实施例22所述完成该反应，得到0.195g HA-MTX-But，MTX含量为20％w/w(HPLC)。Mw＝13000，PI＝1.5，水含量：11.5％w/w。通过积分在23ppm(乙酰胺基的CH3)和在13.3ppm(丁酰基的CH3)的信号来确定丁酸盐含量，结果为3.5％w/w。
HA-MTX-But:Na的结构得到13C-NMR谱支持。在44ppm处信号消失确认完全取代了氯基团，在63.8ppm(CH2-OBut)和在13.3ppm(丁酸盐的CH3)存在信号确认在葡糖胺的6位存在丁酸根。
实施例25：HA-MTX-But
10g来自实施例8的HA-Cl与2eq MTX和2eq Cs2CO3在80℃下反应40小时。在2.5eq CsBut存在下，将1.7g所得的HA-MTX-Cl(MTX含量为24％w/w)在85℃下悬浮于150ml无水DMSO中达21小时。如实施例22所述完成该反应，得到1.2g HA-MTX-But。MTX含量为12.7％w/w(HPLC)。水含量：11.5％w/w。通过积分在23ppm(乙酰胺基的CH3)和13.3ppm(丁酰基的CH3)的信号来确定丁酸盐含量，结果等于1.7％w/w。
实施例26：体外抗增生活性
以2种人乳腺癌细胞系(MCF-7，MDA-MB-231)，和以2种具有不同还原叶酸盐载体(RFC)表达的人卵巢癌细胞系(SK-OV-3，IGR-OV-1)，以及来自健康的乳腺管上皮细胞的非肿瘤细胞系(HBL-100系)测定共轭物的抗增生活性。所述细胞在96孔板的完全培养基中，于37℃和受控的气氛(5％CO2)下，与MTX-Na或与共轭物一起培育5天，对于MCF-7、IGR-OV-1和MDA-MB-231细胞而言，所述完全培养基由DMEM/F12组成，含有10％FBS、胎牛血清、1％L-谷酰胺100x(200mM)和1％盘尼西林-链霉素(Euroclone)；对SK-OV-3细胞而言，该完全培养基由RPMI-1640组成，含有10％FBS、胎牛血清、1％L-谷酰胺100x(200mM)和1％盘尼西林-链霉素(Euroclone)；而对HBL-100细胞而言，该完全培养基由McCoy′s组成，含有10％FBS、胎牛血清、1％L-谷酰胺100x(200mM)和1％盘尼西林-链霉素(Sigma)中。共轭物与MTX-Na以等摩尔的剂量进行测试，其范围为1-30nM。采用MTT测试法，通过线粒体脱氢酶转化带蓝色甲臜(formazan)的MTT四唑鎓盐，来测定作为细胞新陈代谢能力的细胞存活力，从而测定第6天(经5天处理后)的细胞毒性；用分光光度计读出在570nm的蓝色。测试以下共轭物。
实施例  共轭物  共轭物类型
Ex21  HA-MTX-Ac  MTX5％  Ac1％
Ex22  HA-MTX-Ac  MTX13％  Ac0.3％
Ex24  HA-MTX-But  MTX20％  But3.5％
Ex16  HA-MTX  MTX4.2％
Ex17  HA-MTX  MTX10％
Ex18  HA-MTX  MTX16％
表A和B记录本发明共轭物对多种肿瘤细胞的抗肿瘤效果；这些共轭物的效果与实施例16-18的HA-MTX(是用于制备本发明共轭物的中间共轭物)的效果进行了比较。将乳癌细胞的生长降低到对照物生长的50％所必需的共轭物的浓度值(IC50，μM)表示于表A中。
表A
化合物  MDA-MB-231
MXT  1.80
Ex21  2.7
Ex24  2.18
Ex22  3.03
Ex17  12.0
Ex18  12.0
Ex16  18.8
以上数据表明，透明质酸和氨甲蝶呤之间的共轭物产生与10倍高浓度的非共轭氨甲蝶呤相同的抑制％.而且，所述数据还出人意料地表明，所述共轭物在透明质酸的伯羟基上进一步酯化导致抗增生活性显著升高。实际上，实施例21、22和24的共轭物以比实施例16-18的共轭物低4-5倍的浓度使用，仍产生与非共轭氨甲蝶呤相同的抑制％。
表B表示将多种肿瘤细胞系生长降低到对照物生长的50％所必需的共轭物和MTX的浓度值(IC50，μM)。
表B
细胞系  MTX  Ex.21  Ex24  Ex22
MCF-7  0.081  1.97  1.70  1.23
IGR-OV1  0.14  2.74  2.16  1.98
SK-OV-3  0.041  1.82  1.67  1.57
HBL-100  0.50  2.05  2.11  2.19
这些更多的数据表明，所述共轭物对很宽范围的肿瘤细胞系有显著的抗增生活性。实际上，IC50值也是非常低的，并与本发明共轭物对表A的细胞系所测得的值差不多。
实施例27：体内抗增生活性
在0天，在无菌和Zoletil(70mg/kg)条件下，向重18-20g的BD2F1鼠的脾内(i.s)植入100.000B16/F10黑素瘤细胞，麻醉，然后手术打开腹膜和脾并固定。该肿瘤细胞是悬浮于稀Matrigel(150μg/ml)中被脾内注入0.05ml体积。所述B16/F10黑素瘤细胞在改性的Eagle培养基中培养过。细胞在37℃下维持在潮湿的5％CO2气氛中。然后随机将动物分成5组(每组7-8只雌性)，在第0天脾内植入100.000B16/F10黑素瘤细胞，用HA-MTX以2、1和0.50mg/kg/天之量或MTX-Na以8.5、6和3mg/kg/天之量静脉注射处理这些鼠(在第3、6和9天进行)。剂量为MTX的等当量。数据来自4个单独的实验。
在21天，在配备有校准栅格的低功率立体显微镜下评价肝脏，并计数肝脏转移瘤(metastases)。然后将肝脏存放在甲醛中，准备用来光学显微观察。
实施例18的HA-MTX，在静脉注射(i.v.)和腹膜注射(i.p.)给药后，有效预防了肝脏转移瘤的形成
表10中记录了其结果。
Figure S2006800161505D00171
^表示存在带有多于3个可见的肝性肿瘤块的鼠；
°表示存在具有大于3mm转移瘤的鼠。
Figure S2006800161505D00174
：第21天时的脾重(为了比较，相同种类和体重的健康鼠的脾为117±11mg)。
Figure S2006800161505D00175
：没有宏观可检测的肝转移瘤的鼠数目对每组鼠的总数。
相对对照物的统计学差异：*p＜0.01；**p＜0.001；***p＜0.0001§：与所有其他的都不同(Fisher′s测试)。
以上数据表明，在肿瘤植入后3、6、9天，以剂量2mg/kg/天(MTX等当量)静脉注射进行治疗后，HA-MTX致使B16/F10黑素瘤的肝脏转移瘤完全消失。而且，HA-MTX以1和0.5mg/kg/天的较低剂量给药时，肝脏转移瘤的减少分别与6和3mg/kg/天剂量的MTX-Na给药的情况差不多，而此剂量只相当于MTX-Na剂量的1/6。
实施例28：亚急性毒性
连续5天对3或7个组的CBA/Lac雄鼠重复i.p.注射共轭物。计算剂量使其给动物的MTX量为1.5和3.0mg/kg/天MTX。每只动物用每剂药物溶于不超过250μl的体积进行治疗。结束治疗后的21天后续期之后评估死亡率。对同一动物，其治疗前一天和治疗4天后之间的体重变化也被测量。
表C
化合物 剂量(mg/kg MTX) 致死率死亡数/总数 体重变化(g)
Ex19 3(mg/kg)*5天 7/7 -0.40
Ex19 1.5(mg/kg)*5天 0/3 -0.10
Ex23 3(mg/kg)*5天 0/3 +0.10
Ex23 1.5(mg/kg)*5天 0/3 +0.20
Ex25 3(mg/kg)*5天 0/3 +0.10
Ex25 1.5(mg/kg)*5天 0/3 +0.20
从亚急性毒性的数据可清楚看到，已被进一步酯化的共轭物(实施例23和25)的毒性小于没有进一步酯化的共轭物(Ex19)。

Claims (28)

1.酸形式或盐形式的透明质酸的共轭物，其中，透明质酸的N-乙酰基-D-葡糖胺单元的伯羟基被选自氨基酸、肽和饱和或不饱和、直链或支链C1-C24脂肪酸、C1-C24芳基-脂肪酸或芳香酸的化合物A的羧基和式(I)化合物的α-或γ-羧基两者所酯化：
式(I)
其中：
R2和R4彼此独立地表示：-NH2，-OH，-OCH3，C1-C5烷基，＝O；
X和Y表示：-C(R5)＝，-CH(R5)-，-NH-，-N＝，其中R5表示：-H，C1-C5烷基；
Z表示：-CH(R10)-，-N(R10)-，-O-；
R10表示：-H，C1-C5烷基，C1-C5烯基，C1-C5炔基，带有1-3个选自氮、硫和氧的杂原子的5-6元杂环；
Ar表示：1，4-苯基，与一个或多个5-6元芳香环稠合的1，4-苯基，与一个或多个5-6元杂环稠合的1，4-苯基，其中所述基团可以被R2取代；
环A和B彼此独立地可以是芳香性或非芳香性的环。
2.如权利要求1所述的共轭物，其中，所述的式(I)化合物是氨甲蝶呤。
3.如权利要求1或2所述的共轭物，其中，相对于共轭物的总重量而言，式(I)化合物和化合物A的总量占0.1％和60％w/w之间。
4.如权利要求1-3所述的共轭物，其中，相对于共轭物的总重量而言，所述式(I)化合物的量占1％到40％w/w，所述化合物A的量占0.1到30％w/w。
5.如权利要求4所述的共轭物，其中，所述化合物A是乙酸，相对于共轭物的总重量而言，其量占0.1％到10％w/w。
6.如权利要求1-5所述的共轭物，其中，所述脂肪酸被选自以下的取代基所取代：直链或支链C1-C5烷基、卤素、硝基、氰基、羟基、氨基、甲氧基、羰基、硫醇基和羧基。
7.如权利要求1-4所述的共轭物，其中，所述化合物A是选自乙酸、丁酸、丙酸、视黄酸、n-丙基乙酸、琥珀酸、环己烷羧酸、环己烷乙酰基的酸和环丙烷羧酸的脂肪酸。
8.如权利要求1-4所述的共轭物，其中，所述化合物A是选自丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、蛋氨酸、甘氨酸、丝氨酸、半胱氨酸、天冬酰胺、谷酰胺、天冬氨酸、谷氨酸、脯氨酸、组氨酸苯丙氨酸、triptophane和酪氨酸的氨基酸。
9.如权利要求1-4所述的共轭物，其中，所述化合物A是由选自丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、蛋氨酸、甘氨酸、丝氨酸、半胱氨酸、天冬酰胺、谷酰胺、天冬氨酸、谷氨酸、脯氨酸、组氨酸苯丙氨酸、triptophane和酪氨酸的氨基酸的组合所构成的肽。
10.如权利要求1-4所述的共轭物，其中，所述芳基脂肪酸其芳基上被选自直链或支链C1-C5烷基、卤素、硝基、氰基、羟基和甲氧基的取代基所取代。
11.如权利要求1-4所述的共轭物，其中，所述化合物A是选自苯基乙酸、苯氧基乙酸、萘基乙酸、2-(4-异丁基苯基)丙酸、2-(6-甲氧基-2-萘基)丙酸和肉桂酸的芳基脂肪酸。
12.如权利要求1-4所述的共轭物，其中，所述化合物A是取代或未取代的苯甲酸。
13.如权利要求12所述的共轭物，其中，所述取代的苯甲酸选自卤代苯甲酸、烷基苯甲酸、硝基苯甲酸和2-乙酰氧基苯甲酸。
14.如权利要求1-4所述的共轭物，其中，所述化合物A选自乙酸、丁酸、丙氨酸、甘氨酸和包含丙氨酸和/或甘氨酸的肽。
15.如权利要求1-14所述的共轭物，被选自碱金属、碱土金属和过渡金属的金属所盐化。
16.如权利要求15所述的共轭物，被选自Na+、K+、Ca++、Mg++、Cu++、Zn++、Ag++、Au++和Co++的金属所盐化。
17.如权利要求1-16所述的共轭物，其中，透明质酸的仲羟基被衍生化以形成选自以下的基团：-OR，-OCOR，-SO2H，-OPO3H2，-O-CO-(CH2)n-COOH和-O-(CH2)n-OCOR，其中n是1-4和R是C1-C10烷基。
18.如权利要求1-16所述的共轭物，其中，透明质酸的仲羟基被衍生化以形成选自-NH2和-NHCOCH3的基团。
19.如权利要求1-18所述的共轭物在制备用于治疗以细胞过多增殖为特征的疾病的药物中的用途。
20.如权利要求19所述的用途，其中，所述疾病选自肿瘤、皮肤病变、牛皮癣、炎性疾病和类风湿性关节炎。
21.含有如权利要求1-18所述的共轭物并混合有药物可接受的赋形剂和/或稀释剂的药物组合物。
22.制备如权利要求1到18所述的共轭物的方法。
23.如权利要求22所述的方法，其包括按所示顺序进行的以下步骤：
(a)将游离形式或盐形式透明质酸的N-乙酰基-D-葡糖胺单元的伯羟基氯化；
(b)通过取代氯原子而使氯化的透明质酸和式(I)化合物的羧基之间形成酯键；
(c)借助化合物A合适的酰基亲核性而取代剩余的氯原子，从而形成步骤(b)的产物和化合物A之间的酯键。
24.如权利要求23所述的方法，其中，用于氯化的试剂是在N，N-二甲基甲酰胺中的甲磺酰氯。
25.透明质酸和式(I)化合物之间的共轭物
Figure S2006800161505C00031
式(I)
其中：
R2和R4表示：-NH2，-OH，-OCH3，C1-C5烷基，＝O；
X和Y表示：-C(R5)＝，-CH(R5)-，-NH-，-N＝，其中R5表示：-H，C1-C5烷基；
Z表示：-CH(R10)-，-N(R10)-，-O-；其中R10表示：-H，C1-C5烷基，C1-C5烯基，C1-C5炔基，带有1-3个选自氮、硫和氧的杂原子的5-6元杂环；
Ar表示：1，4-苯基，与一个或多个5-6元芳香环稠合的1，4-苯基，与一个或多个5-6元杂环稠合的1，4-苯基，其中所述基团可以被R2取代；
环A和B是芳香或非芳香性的环；
其特征在于，它们包含低于3％w/w的化学连接于透明质酸的聚合链上的残余氯。
26.如权利要求25所述的共轭物，包含低于0.1％w/w的残余氯。
27.用于获得如权利要求25所述的共轭物的方法，包括按所示顺序进行的以下步骤：
(a)使游离形式或盐形式的透明质酸的N-乙酰基-D-葡糖胺单元的伯羟基氯化；和
(b)通过取代氯原子而使氯化的透明质酸和式(I)化合物的羧基之间形成酯键。
28.用于获得如权利要求26所述的共轭物的方法，包括按所示顺序进行的以下步骤：
a)使游离形式或盐形式的透明质酸的N-乙酰基-D-葡糖胺单元的伯羟基氯化；
(b)通过取代氯原子而使氯化的透明质酸和式(I)化合物的羧基之间形成酯键；
(c)借助合适的酰基亲核性而取代步骤(b)的产物上残余的氯原子，并形成酯键；和
d)使从步骤(c)获得的共轭物选择性地脱酰基化。
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PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
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WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication

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