JP2008540790A - ヒアルロン酸、及びグルタミン酸のｎ−誘導体を有する抗増殖性のコンジュゲート - Google Patents

Abstract

ヒアルロン酸と、グルタミン酸のＮ−誘導体とのコンジュゲートは、ヒアルロン酸の残存する一級水酸基を、アミノ酸、ペプチド、脂肪酸、アリール脂肪酸及び／又はアリール酸でさらにエステル化され、抗増殖活性の有意且つ予期しない増加、及び毒性の低下が観察される。

Description

本発明は、抗増殖活性を有するヒアルロン酸のエステル化されたコンジュゲートに関する。

複数の有機分子が試験され、抗増殖剤として有用であることが知られているが、これらの多くは、高い毒性、低い溶解性及び／又は不適当な薬物動態パラメーター故、限定された治療的用途を有する。

これらの化合物のうち、親物質としてメトトレキサートを有する抗増殖剤のファミリーを構成するジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）に対して阻害活性を有するグルタミン酸のＮ−誘導体がある。

これらの薬物は、新生物、乾癬及び関節リューマチなどの複数の病態に有効である。しかしながら、全身性の毒性により、その治療用途は、非常に限定されている。

特許文献１において、上記のＤＨＦＲの阻害剤の毒性に関する問題が多糖類とのコンジュゲートにより解決され得ることが、見出された。事実、このようにして得たコンジュゲートは、抗増殖活性を未だ有しているが、同時に、驚くべきことに、低い毒性を示すという利点を有する。
国際公開第０１／６８１０５号パンフレット メトトレキサートの公的なモノグラフ（ＵＳＰ２３）、ｐ．９８４

本発明者らは、特許文献１に記載のヒアルロン酸とグルタミン酸のＮ−誘導体との間のコンジュゲートは、ヒアルロン酸の残存する一級水酸基を、アミノ酸、ペプチド、脂肪酸、アリール脂肪酸及び／又はアリール酸でさらにエステル化すると、有意且つ予期しない抗増殖活性の増加と、毒性の低下とが観察されることを、見出した。

本発明の第１の目的は、ヒアルロン酸の新規のコンジュゲートであって、ヒアルロン酸のＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミン単位の第一級水酸基は、アミノ酸、ペプチド、脂肪酸、アリール脂肪酸及びアリール酸からなる群から選択される化合物Ａのカルボキシル基と、下記式（Ｉ）のグルタミン酸のＮ−誘導体のα−又はγ−カルボキシル基との両方でエステル化される。

ここで、Ｒ_２及びＲ_４は、互いに独立に、−ＮＨ_２、−ＯＨ、−ＯＣＨ_３、Ｃ１〜Ｃ５のアルキル、＝Ｏを示し；
Ｘ及びＹは、−Ｃ（Ｒ_５）＝、−ＣＨ（Ｒ_５）−、−ＮＨ−、−Ｎ＝を示し、Ｒ_５は、−Ｈ、Ｃ１〜Ｃ５のアルキルを示し；
Ｚは、−ＣＨ（Ｒ_１０）−、−Ｎ（Ｒ_１０）−、−Ｏ−を示し、Ｒ_１０は、−Ｈ、Ｃ１〜Ｃ５のアルキル、Ｃ１〜Ｃ５のアルケニル、若しくはＣ１〜Ｃ５のアルキニル、又は窒素、硫黄及び酸素からなる群から選択された１〜３のヘテロ原子を有する５若しくは６員の複素環を示し；
Ａｒは、１，４−フェニル基、１つ以上の５又は６員の芳香族環で縮合された１，４−フェニル基、１つ以上の５又は６員の複素環で縮合された１，４−フェニル基を示し、この置換基は、上記のＲ_２で可能に置換され；
環Ａ及びＢは、芳香性を有しても、芳香性を有していなくてもよい。

これらの化合物は、既に、特許文献１に述べられている。

好ましくは、式（Ｉ）の化合物は、式（Ｉ）で示すメトトレキサート（ＭＴＸ）であって、Ｒ_２及びＲ_４は、−ＮＨ_２であり、環Ａは、芳香性を有し、環Ｂは、芳香性を有し、Ｘ及びＹは、−Ｎ＝であり、Ｚは、−Ｎ（ＣＨ_３）−であり、Ａｒは、１，４−フェニル基である。

式（Ｉ）のさらに好ましい化合物は、下記のサブクラスに属するものである。

−サブクラス１は、式（Ｉ）に示す化合物であって、Ｒ_２及びＲ_４が、−ＮＨ_２又は−ＯＨであり、Ｒ_５が、存在する場合、−Ｈ、−ＣＨ_３を示し、環Ａが、芳香性を有し、Ｚが、−ＣＨ（Ｒ_１０）−、−Ｎ（Ｒ_１０）−からなる群から選択され、Ｒ_１０が、−Ｈ、Ｃ１〜５のアルキル、Ｃ１〜Ｃ５のアルケニル、Ｃ１〜Ｃ５のアルキニルを示すものである。

−サブクラス２は、式（Ｉ）に示す化合物であって、Ｒ_２が、＝Ｏであり、Ｒ_４が、−ＮＨ_２であり、環Ａが、芳香性を有さず、環Ｂが、芳香性を有し、Ｘ及びＹが、−Ｎ＝であり、Ｚが、−Ｎ（Ｒ_１０）−であり、Ｒ_１０が、−Ｈ、−ＣＨ_３であり、Ａｒが、１，４−フェニルであるものである。

−サブクラス３は、式（Ｉ）に示す化合物であって、Ｒ_２及びＲ_４が、−ＮＨ_２であり、環Ａが、芳香性を有し、環Ｂが、芳香性を有し、Ｘ及びＹが、−Ｎ＝であり、Ｚが、−Ｎ（Ｒ_１０）−であり、Ｒ_１０が、−ＣＨ_３又は−Ｈであり、Ａｒが、１，４−フェニルであるものである。

−サブクラス４は、式（Ｉ）に示す化合物であって、Ｒ_２及びＲ_４が、−ＮＨ_２であり、環Ａが、芳香性を有し、環Ｂが、芳香性を有し、Ｘ及びＹが、−Ｎ＝であり、Ｚが、−ＣＨ−（Ｃ_２Ｈ_５）−であり、Ｒ_１０が、−ＣＨ_３又は−Ｈであり、Ａｒが、１，４−フェニルであるものである。

式（Ｉ）の化合物は、？又はカルボン酸基のいずれかを介してヒアルロン酸にリンク（ｌｉｎｋ）される。化合物Ａは、アミノ酸、ペプチド、脂肪酸、アリール脂肪酸及びアリール酸からなる群から選択され、そのカルボキシル基を介してヒアルロン酸にリンクされる。この化合物は、対応するカルボン酸に由来するアシル求核試薬を用いることにより、多糖類に導入される。

脂肪酸、アリール脂肪酸及びアリール酸は、直鎖でも分岐でもよく、また飽和でも不飽和でもよく、また、複素環を有してもよい。

本発明における脂肪酸は、２４を限度とした炭素原子を有し、モノカルボン酸若しくはポリカルボン酸、又は飽和のもの若しくは不飽和のものである。また、脂肪酸は、直鎖又は不飽和のＣ１〜Ｃ５のアルキル、ハロゲン、ニトロ基、シアノ基、水酸基、アミノ基、メトキシル基、カルボニル基、チオール基及びカルボキシル基からなる群から選択される置換基で可能に置換されてもよい。本発明による脂肪酸は、脂環式の酸、又は脂肪族の脂環式の酸であってもよい。

本発明における好適な脂肪酸は、酢酸、ブチル酸、プロピオン酸、レチノイン酸、ｎ−プロピル酢酸、コハク酸、シクロヘキサンカルボン酸、シクロヘキサンアセチル基の酸及びシクロプロパンカルボン酸からなる群から選択される。

本発明における好適なアミノ酸は、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、メチオニン、グリシン、セリン、システイン、アスパラギン、グルタミン、アスパラギン酸、グルタミン酸、プロリン、ヒスチジン、フェニルアラニン、トリプトファン及びチロシンからなる群から選択される。本発明における好適なペプチドは、上記のアミノ酸の異なる組み合わせからなるペプチドである。

本発明におけるアリール脂肪酸は、Ｃ１〜Ｃ４の脂肪族鎖を有し、そのアリール残基は、直鎖又は分岐のＣ１〜Ｃ５のアルキル、ハロゲン、ニトロ基、シアノ基、水酸基、アミノ基、メトキシル基で可能に置換されてもよい。

本発明における好適なアリール脂肪酸は、フェニル酢酸、フェノキシ酢酸、ナフチル酢酸、２−（４−イソブチルフェニル）プロピオン酸、２−（６−メトキシ−２−ナフチル）プロピオン酸及び桂皮酸からなる群から選択される。

本発明におけるアリール酸は、直鎖又は分岐のＣ１〜Ｃ５のアルキル、ハロゲン、ニトロ基、シアノ基、水酸基及びメトキシル基で置換されたアリール残基を有してもよい。

好適なアリール酸は、無置換又は置換の安息香酸から選択される。

好ましくは、上記の置換の安息香酸は、ハロ安息香酸、アルキル安息香酸、ニトロ安息香酸及び２−アセトキシ安息香酸からなる群から選択される。

脂肪酸、アリール脂肪酸又はアリール酸は、芳香環又は非芳香族性の環で可能に縮合された、芳香性又は非芳香性のいずれかの複素環で置換されてもよく、この複素環基は、好ましくは３〜２０の炭素原子を有し、直鎖又は分岐のＣ１〜Ｃ５のアルキル、ハロゲン、ニトロ基、シアノ基、水酸基、アミノ基、メトキシル基で可能に置換されてもよい。

本発明の特に好適な実施例によると、化合物Ａは、酢酸、ブチル酸、アラニン、グリシン、並びにアラニン及び／又はグリシンを有するペプチドからなる群から選択される。

ヒアルロン酸（本願においてＨＡとも示す）は、Ｄ−グルクロン酸と、β（１→３）グリコシド結合により結合された２−アセトアミド−２−デオキシ−Ｄ−グルコース（Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン）とからなる二糖の繰り返し単位からなる；Ｄ−グルクロン酸残基は、酸の形態又は塩の形態であってもよい。各繰り返し単位は、直鎖のポリマーを形成するβ（１→４）グリコシド結合により、次のものに結合される。

本願において使用する用語「ヒアルロン酸」は、酸の形態又は塩の形態の両方を包含する。

用語ヒアルロン酸は、種々の分子量を有するＨＡの一般的な群の分子量の画分、又はこの化合物の加水分解画分をいうのに一般的に用いられる。本発明の目的に関して、ヒアルロン酸は、５０００〜１０００００の平均分子量を好ましく有し、さらに好ましくは１００００〜５００００である。

本発明のヒアルロン酸の好適なコンジュゲートは、６−Ｏ−アセチル−６−Ｏ−メトトレキシル−ヒアルロン酸、及び６−Ｏ−ブチリル−６−Ｏ−メトトレキシルヒアルロン酸並びにこれらの塩である。

本発明のコンジュゲートは、酸の形態又は塩の形態である。

塩の形態の場合、アルカリ金属（好ましくは、Ｎａ又はＫ）、アルカリ土類金属（好ましくは、Ｃａ又はＭｇ）、遷移金属（好ましくは、Ｃｕ、Ｚｎ、Ａｇ、Ａｕ、Ｃｏ、Ａｇ）で塩化されてもよい。この塩化は、公知の方法により得られる。

任意に、本発明のコンジュゲートにおける第２級の水酸基は、下記の置換基を形成するように、誘導体化されてもよい：−ＯＲ、−ＯＣＯＲ、−ＳＯ_２Ｈ、−ＯＰＯ_３Ｈ_２，−Ｏ−ＣＯ−（ＣＨ_２）_ｎ−ＣＯＯＨ、−Ｏ−（ＣＨ_２）_ｎ−ＯＣＯＲであって、ｎは、１〜４であり、Ｒは、Ｃ１〜Ｃ１０のアルキルである。

また、上記の第２級水酸基は、−ＮＨ_２又はＮＨＣＯＣＨ_３で置換されてもよい。

これらの置換基は、当業者公知の方法により容易に得られてもよく、コンジュゲートの親水特性を調節するように、選択されてもよい。

コンジュゲートにおける、式（Ｉ）の化合物及び化合物Ａの全量は、「置換度」（ＤＳ％）と定義し、これは、コンジュゲートの全重量に対する、式（Ｉ）の化合物の重量及び化合物Ａの重量の百分率（％）を示す。

特に、本発明のコンジュゲートにおいて、式（Ｉ）の化合物及び化合物Ａの量（ＤＳ％）は、コンジュゲートの全重量に対して、０．１〜６０％ｗ／ｗから好ましくなる。さらに、好ましくは、コンジュゲートの全重量に対して、式（Ｉ）の化合物は、１〜４０％ｗ／ｗの範囲の量で存在する一方、化合物Ａは、０．１〜３０％ｗ／ｗの範囲の量で存在する。

化合物Ａが酢酸である場合、コンジュゲートの全重量に対して、０．１〜１０％ｗ／ｗの範囲の量で、本発明のコンジュゲートに好ましく存在する。

本発明によるコンジュゲートは、ヒアルロン酸のＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミンの第一級水酸基に直接結合された２つの異なるエステル基が存在することを特徴とする。

ＨＡのその他の水酸基は、薬物との化学結合に関連せず、有効性を確保するのに非常に重要な化学構造における規則性を提供する。

提供される実験事実に示されるように、本発明のコンジュゲートは、細胞増殖を阻害する式（Ｉ）の化合物の能力を保持する。さらに、予期せず、上記の誘導体には、特許文献１開示の対応するコンジュゲートと比較して、さらに大きな抗増殖活性及びより低い毒性が付与される。

従って、細胞の過増殖を特徴全ての病態に首尾よく使用されてもよい。

よって、本発明のさらなる目的は、細胞の過増殖を特徴とする病態の処置のための医薬の製造への、上記のコンジュゲートの使用である。好ましくは、この病態は、腫瘍、皮膚病、乾癬、炎症及び関節リューマチからなる群から選択される。

好ましくは、上記の腫瘍は、白血病、癌腫（腺癌、結腸直腸癌、膵臓癌）、乳癌、卵巣癌及び胃腸の腫瘍から選択される。

また、本発明の目的は、本発明のコンジュゲートと、医薬的に許容な賦形剤及び／又は希釈剤と混合して含有する医薬組成物である。この医薬組成物は、液体の形態又は固体の形態であってもよい；経口、非経口、経直腸又は局所で、投与されてもよい。

本発明のさらなる目的は、上記のコンジュゲートの調製方法である。

特に、本発明者は、医薬用途に適当でないハロゲン化副産物及びその他の副産物の除く本発明のコンジュゲートを得ることを可能とする特定の方法を開発した。

この方法は、下記に示す順序で、下記の各ステップを有する。つまり：
（ａ）フリーの形態又は塩の形態のヒアルロン酸のＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミン単位の第一級水酸基を塩素化するステップと；
（ｂ）塩素原子を置き換えることにより、塩素化されたヒアルロン酸と、式（Ｉ）の化合物のカルボキシル基との間にエステル結合を形成するステップと；
（ｃ）適当なアシル求核試薬による残存する塩素原子を置き換えることにより、ステップ（ｂ）の生成物と、化合物Ａのカルボキシル基との間にエステル結合を形成するステップと；
を有する。

出発物質であるＨＡは、フリーの形態であっても、塩の形態であってもよく、その対イオンは、好ましくはアルカリ金属若しくはアルカリ土類金属であり、又は窒素を含有する対イオンである。後者の場合、対イオンは、複素環を含んでもよい。窒素を含有する対イオンの好適な例としては、アンモニウム、テトラブチルアンモニウム（ＴＢＡ）、ピリジニウム又はｓｙｍ−コリジニウムイオン（ｓｙｍ−ｃｏｌｌｉｄｉｎｉｕｍ ｉｏｎ）である。

ステップ（ａ）は、ＨＡを非プロトン性有機溶媒中で混合した後実行される選択的な塩素化反応である。本質的には、ステップ（ａ）は、一般的なハロゲン化反応に代わる塩素化反応である。

事実、実験部に示すように、塩素化反応により、安定であり、且つ実用的な医薬用途に有害であり得る所望しない副産物や不純物がない、最終的なコンジュゲートを得ることが可能となる。

好適な塩素化試薬は、メタンスルフォニルクロライドを有するジメチルホルムアミド（Ｖｉｌｓｍｅｉｒ Ｒｅａｇｅｎｔ）である。

塩素化反応は、下記の方法に従って、好ましく実行される。

塩素化試薬は、塩の形態（ナトリウムの形態、又はＴＢＡなどの有機塩基の形態）、好ましくは、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）のナトリウムの形態のＨＡの溶液又は懸濁液に、−２０〜−１０℃の範囲、好ましくは−１０℃で、添加される。この反応温度は、−１０℃から、４０〜６５℃、好ましくは６０℃に、２時間かけて、昇温される。

この塩素化反応は、その後、４０〜６５℃、好ましくは、６０℃の温度で、１０〜２４時間、好ましくは１６時間、行われる。

この反応は、ｐＨ８とするように、飽和ＮａＨＣＯ_３水溶液で処理し、その後ｐＨ９とするようにＮａＯＨ水溶液で処理することにより、行われる；このステップにより、ＨＡ分子の第二級水酸基における反応中に形成されたギ酸のエステル基を除去することが可能となる。この反応混合物を、その後、希ＨＣｌを添加することにより、中和する。その後、標準的な方法により、所望の６−クロロ−６−デオキシヒアルロン酸（ＨＡ−６−Ｃｌ又はＨＡ−Ｃｌとも称する。）を回収する。

これらの条件において、Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン残基のＣ−６の位置における塩素化の度合いは、１．０〜８．３％ｗ／ｗの範囲であってもよく、好ましくは、１．４〜５．０％ｗ／ｗの範囲である。

ステップ（ｂ）は、下記の方法に従って、通常実行される。

ＨＡ−６−Ｃｌは、ＴＢＡ又はナトリウム塩の形態のいずれか、好ましくはＴＢＡの形態で、非プロトン性溶媒又はこの混合物中で懸濁され、その後、アルカリ金属又はアルカリ土類金属の塩、例えば、炭酸セシウムの存在下、式（Ｉ）の化合物を有する上記と同様の溶媒に添加する。

この反応は、一定の攪拌下、５０〜８０℃の範囲、好ましくは、７０℃で、２４〜５２時間の範囲、好ましくは４０時間、行われる。その後、所望の生成物を、標準的な方法で、回収する。

式（Ｉ）の化合物がＭＴＸである場合、コンジュゲートは、６−デオキシ−６−Ｏ−メトトレキシル−ヒアルロン酸（ＨＡ−６−ＭＴＸ又はＨＡ−ＭＴＸ）と称される。

このステップで得た生成物は、式（Ｉ）の化合物及び塩素の両方を含有するＨＡの中間コンジュゲートである。このコンジュゲートにおいて、式（Ｉ）の化合物の量は、４０％ｗ／ｗ未満であり、残存する塩素（このステップ中で置換されない塩素）の量は、３％ｗ／ｗ未満である。

ステップ（ｃ）により、ステップ（ｂ）で得られる生成物において、化合物Ａのアシル求核試薬により、残存する塩素を完全に置換することが可能である。

アルカリ金属又はアルカリ土類金属の塩の形態の種々の適当なアシル求核試薬を使用し得る。酢酸、ブチル酸又はアミノ酸の場合、ナトリウム塩又はセシウム塩が好ましい。酢酸ナトリウムは、ステップ（ｂ）の生成物がナトリウム塩の場合、好ましく使用されるが；酢酸セシウムは、ｓｙｍ−コリジウム塩又はＴＢＡ塩、好ましくはＴＢＡの形態などの有機塩基の形態のステップ（ｂ）の生成物から、塩素を置換するのに、好適である。

得られるコンジュゲートは、沈殿、限外濾過、乾燥又は凍結乾燥などの標準的な方法により、その後、回収されてもよい。

このコンジュゲートは、種々の残存する塩素を有さない。

式（Ｉ）の化合物がメトトレキサートである場合、コンジュゲートは、６−Ｏ−アシル−６−Ｏ−メトトレキシル−ヒアルロン酸（ＨＡ−６−ＭＴＸ−アシル又はＨＡ−ＭＴＸ−アシル）である。

実験部に示すように、本発明者は、上記の方法により、残存する塩素が３％未満の特許文献１のコンジュゲートを得ることが可能となり、従って、先行技術に述べる方法で調製したものと比較して、向上した特性が付与されることを驚くべきことに見出した。

従って、本発明は、ＨＡのポリマー鎖に化学的に結合した残存する塩素が３％ｗ／ｗ未満、好ましくは０．１％ｗ／ｗ未満である、ヒアルロン酸と式（Ｉ）の化合物とのコンジュゲートをも参照する。

本発明は、３％ｗ／ｗ未満のハロゲン化副産物を含有する上記のコンジュゲートを得る方法にも関し、下記のステップを有する。つまり：
（ａ）フリーの形態又は塩の形態のヒアルロン酸のＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミン単位の第一級水酸基を塩素化するステップと；
（ｂ）塩素原子を置き換えることにより、塩素化されたヒアルロン酸と、式（Ｉ）のカルボキシル基との間にエステル結合を形成するステップと；
を有し、ステップ（ａ）及び（ｂ）は、上記の通りのものである。

本発明のその他の目的は、ＨＡのポリマー鎖に化学的に結合した残存する塩素が０．１％ｗ／ｗ未満である、ヒアルロン酸と式（Ｉ）の化合物とのコンジュゲートを取得する方法であり、下記のステップを有する。つまり：
（ａ）フリーの形態又は塩の形態のヒアルロン酸のＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミン単位の第一級水酸基を塩素化するステップと；
（ｂ）塩素原子を置き換えることにより、塩素化されたヒアルロン酸と、式（Ｉ）の化合物のカルボキシル基との間にエステル結合を形成するステップと；
（ｃ）適当なアシル求核試薬によるステップ（ｂ）の残存する生成物にエステル結合を形成することにより、残存する塩素原子を置き換えるステップと；
（ｄ）ステップ（ｃ）で得たコンジュゲートの選択的な脱アセチル化を行うステップと；
を有する。

この反応は、公知の化学的な脱アセチル化反応、又は酵素的な脱アセチル化反応により、行われてもよい。

下記の実験例の通り、本発明について、非限定的に述べる。

（実験部）
（例１）
ＨＡ−Ｃｌ及びＨＡコンジュゲートにおける塩素含量の同定
コンジュゲートにおける塩素含量の同定は、^１３Ｃ−スペクトルの取得に関する標準化シークエンス（ｓｔｄ^１３Ｃシークエンス）を適合した^１３ＣＮＭＲ（Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｅｒ Ｖａｒｉａｎ Ｍｅｒｃｕｒｙ ２００）により、行った。２０ｍｇのコンジュゲートのサンプルを、６５０μＬのＤ_２Ｏを有する５ｍｍ試験管中で室温にて溶解した。この溶液中の気泡を消去するように、緩徐に加熱した（５０℃）。３０℃で２４時間後、スペクトルを収集し、ＨＡ−Ｃｌについて、ＣＨ_２ＯＨシグナル（６１ｐｐｍ）及びＣＨ_２Ｃｌシグナル（４４ｐｐｍ）を積分することにより、分析した。ＨＡ−ＭＴＸ−Ｃｌについては、これらの２つのシグナルに加えて、ＣＨ_２ＯＭＴＸシグナル（６４ｐｐｍ）についての積分も行った。塩素含量は、６−塩素基を含有するＨＡの繰り返し単位の数と、ＨＡの繰り返し単位の全数との比率として、同定した。この比率は、塩素の単位重量％当たりに変換した。

（例２）
ＨＰＬＣによるメトトレキサートの同定
ＨＡコンジュゲートのメトトレキサートの含量は、非特許文献１により、アルカリ加水分解の前後のサンプルを分析することにより、ＨＰＬＣで同定した。分析の条件は、下記の通りである。

クロマトグラフ：Ｄｉｏｎｅｘ ＤＸ−６００
カラム：カラムＰｈｅｎｏｍｅｎｅｘ Ｓｙｎｅｒｇｉ ４μＨｙｄｒｏ−ＲＰ８０
カラムの寸法：１５０×４６０ｍｍ
カラムの粒子径：４μ
温度：４０℃
溶離液：９０％の０．２Ｍ第二リン酸ナトリウム／０．１Ｍクエン酸（６３０：２７０）、１０％のＣＨ_３ＣＮ
定常的条件：０．５ｍＬ／分
検出器：ダイオードアレイ（範囲２００〜７８０ｎｍ）
定量的同定に関して選択した波長：３０２ｎｍ
注入容量：２５μＬ
実行時間：３０分

フリーのメトトレキサートの同定用の溶液は、ＨＡ−ＭＴＸを、適当な濃度で、ミリＱ水に直接溶解することにより、調製した。メトトレキサートの全量は、室温で２時間、０．１ＭのＮａＯＨ中でアルカリ加水分解を行った後に同定した。１Ｍの塩酸で中和した後、ＨＰＬＣ系に注入する前に、溶液を、０．４５μｍのフィルター（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ Ｍｉｎｉｓａｒｔ社製のＲＣ２５ １７７９５Ｑ）で濾過した。既知のメトトレキサートの濃度の標準溶液を用いて、較正曲線を同定した。この方法により、上記のサンプル溶液中のＭＴＸの濃度を得て、サンプル濃度で標準化することにより、上記のＤＳ_ＭＴＸ％ｗ／ｗを得る。

ＨＡ−ＭＴＸコンジュゲートの構造は、ＮＭＲにより、支持された：^１Ｈ−ＮＭＲ及び^１Ｈ−ＤＯＥＳＹ ＮＭＲスペクトルにより、調製した全てのコンジュゲートに関するＣ６の位置のＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミンのＭＴＸ分子の共有結合を確認された。

（例３）
平均分子量（Ｍｗ）の同定
ヒアルロン酸コンジュゲートの分子量は、ＨＰ−ＳＥＣ（高速サイズ排除クロマトグラフィー）により、測定した。分析条件は、下記の通りである。

クロマトグラフ：Ｒｈｅｏｄｙｎｅ社製９１２５インジェクターを有するＨＰＬＣポンプ ９８０−ＰＵ（Ｊａｓｃｏ社製製造番号Ｂ３９０１３２５）
カラム：ＴＳＫ ＰＷｘｌ（ＴｏｓｏＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製）Ｇ６０００＋Ｇ５０００＋Ｇ３０００ ６、１０及び１３μｍの粒子径
温度：４０℃
移動相：０．１５ＭのＮａＣｌ＋０．０１％のＮａＮ_３
流速：０．８ｍＬ／分
検出器：ＭＡＬＬＳ（ＷＹＡＴＴ ＤＡＷＮ ＥＯＳ−ＷＹＡＴＴ，米国）
λ＝６９０ｎｍ（ｄｎ／ｄｃ＝０．１６７ｍＬ／ｇ）ＵＶ分光光度検出器８７５−ＵＶ（Ｊａｓｃｏ社製製造番号Ｄ３６９３９１６）
？＝３０５ｎｍ、Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｍｅｔｒｉｃ Ｒｅｆｒａｃｔｉｖｅ Ｉｎｄｅｘ ＯＰＴＩＬＡＢ ＲＥＸ（ＷＹＡＴＴ社製、米国）
λ＝６９０ｎｍ
感度：１２８×
温度：３５℃
注入容量：１００μＬ
実行時間：６０分

分析されるべきＨＡ−Ｃｌ及びＨＡ−ＭＴＸのサンプルを、約１．０ｍｇ／ｍＬの濃度で、０．９％のＮａＣｌに溶解し、１２時間、攪拌しながら保持した。その後、この溶液を、０．４５μｍの空隙率のフィルター（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ Ｍｉｎｉｓａｒｔ社製ＲＣ２５ １７７９５Ｑ）上で濾過し、最終的に、クロマトグラフィーに注入した。この分析により、Ｍｗ（重量平均分子量）、Ｍｎ（数平均分子量）、ＰＩ（多分散性）を測定した。ポリマーのサンプル溶液の濃度は、屈折率の積分（ｉｎｔｅｇｒａｌ ｏｆ ｔｈｅ ｒｅｆｒａｃｔｉｖｅ ｉｎｄｅｘ）により、調節した。

（例４）
６−ブロモ−６−デオキシ−ヒアルロン酸（ＨＡ−Ｂｒ）
１ｇのヒアルロン酸のテトラブチルアンモニウム塩（ＭＷ１２００００）を、８０℃で５０ｍＬの無水ＤＭＦに懸濁し、攪拌下、窒素下で、約１時間保持した。この混合物を室温に冷却し、１．２８ｇのメタンスルフォニルブロマイドを０℃で添加した。この反応混合物を、さらに３０分間、攪拌下で保持し、その後、８０℃で１６時間加熱した。この混合物を、室温に冷却し、約１０ｍＬのミリＱ水を添加してこの反応を停止した。この混合物を、０．１のＮａＯＨで中和し、減圧下で濃縮し、２００ｍＬのアセトンに注入した。その産物を、濾過により収集し、アセトンで洗浄し、水に懸濁し、その後、蒸留水に対して透析し、且つ凍結乾燥した。固体物の重量：４８０ｍｇ。

６０ｐｐｍにおけるピーク（ＣＨ_２ＯＨ）及び３３ｐｐｍのピーク（ＣＨ_２Ｂｒ）を積分することにより、^１３Ｃ−ＮＭＲ（図１）から、Ｂｒの含量を同定した結果、１４％ｗ／ｗであり、ＭＷ：１１８００；ＰＩ：１．４であった。^１３Ｃ−ＮＭＲスペクトルが示すように、例えば５１、５３、９１、９３ｐｐｍにおいて、ＨＡ又は臭素化ＨＡのいずれにも同定し得ない多くの小さなピークが存在した。このＮＭＲのシグナルのパターンは、臭素化反応に由来する副産物の存在を示唆するものである。

（例５）
６−クロロ−６−デオキシ−ヒアルロン酸（ＨＡ−６−Ｃｌ又はＨＡ−Ｃｌ）
１０ｇのＨＡのナトリウム塩（ＭＷ２０，０００）を有する１８０ｍＬのジメチルホルムアミドの懸濁液に、攪拌しながら、メシルクロライド（１０当量）を、Ｎ_２ブランケット下で、−１０℃において３０分間で滴下して添加した。この混合物を、この温度で３０分間保持し、２時間かけて６０℃とした。その後、この反応を、攪拌しながら、１６時間、６０℃で保持した。その後、室温に冷却し、氷及び飽和ＮａＨＣＯ_３の混合物に注入し、その後、ＮａＯＨ溶液で処理して、ｐＨ９とした。この温度において１日後、この懸濁液を、希ＨＣｌで中和した溶液とした。その後、この溶液を、限外濾過し、濃縮し、凍結乾燥して、白色の固形物（６ｇ）を得た。

産物の^１３Ｃ−ＮＭＲのスペクトル（図２）で明らかとなったように、４４ｐｐｍ（ＣＨ_２Ｃｌ）におけるシグナルが存在し、６１ｐｐｍ及び４４ｐｐｍにおけるピークを積分したところ、３．４％ｗ／ｗの塩素置換度であった。

図２のスペクトルと、図１のスペクトル（ＨＡ−Ｂｒ）とを比較して示されるように、塩素化反応は、清浄な産物を生じる。事実、２１のピークのみ可視であり、ＨＡ−Ｂｒスペクトルに可視のピークの最も大きい数に対して、誘導体化されていないＨＡの繰り返し単位（１４の炭素原子）、又は６−Ｃｌ−（Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン）糖単位（７の炭素原子）を指定され得るものである。

（例６）
ＨＡ−Ｃｌ
１５当量のメシルクロライドを使用したことを除いては、例５と同様に反応を行った。４．４ｇを回収した。

^１３Ｃ−ＮＭＲのスペクトルは、例５と同様であって、４．３％ｗ／ｗの塩素置換度であった。

（例７）
ＨＡ−Ｃｌ
５０ｇのＨＡのナトリウム塩を使用したことを除いては、例５と同様に反応を行った。３６ｇの白色の固体物を回収した。^１３Ｃ−ＮＭＲのデータは、例５で調製した化合物と同様であって、３．４％ｗ／ｗの塩素置換度であった（^１３Ｃ−ＮＭＲ）。

（例８）
ＨＡ−Ｃｌ
反応混合物を、６０℃で２０．５時間保持したことを除いては、例５と同様に反応を行った。３６ｇの白色の固体物を回収した。

^１３Ｃ−ＮＭＲのデータは、例５で調製した化合物と同様であって、４．９％ｗ／ｗの塩素置換度であった（^１３Ｃ−ＮＭＲ）。

（例９）
ＨＡ−Ｃｌ
反応混合物を、６０℃で２４．５時間保持したことを除いては、例５と同様に反応を行った。３６ｇの白色の固体物を回収した。

^１３Ｃ−ＮＭＲのデータは、例５で調製した化合物と同様であって、５．８％ｗ／ｗの塩素置換度であった（^１３Ｃ−ＮＭＲ）。

（例１０）
ＨＡ−Ｃｌ
ＨＡのＴＢＡ（２ｇ、ＭＷ７０，０００）を有する４０ｍＬの乾ジメチルホルムアミドの攪拌下の溶液に、Ｎ_２流入下、メシルクロライド（５当量）を、−１０℃で３０分、滴下で添加した。この混合物を、−１０℃で３０分間保持し、室温で１時間保持し、その後、６０℃で１６時間加熱した。この反応をその後、室温で行い、１０％のＴＢＡＯＨの溶液を添加してｐＨ９〜１０とし、懸濁液が茶色の溶液となるまで、このｐＨを４日間保持した。１０ｋＤのカットオフ分子量のメンブレンを用いた限外濾過により、精製した。その溶液を、その後、凍結乾燥して、１ｇの所望の産物を得た。

^１３Ｃ−ＮＭＲのデータは、例５で調製した化合物と同様であって、１．７５％ｗ／ｗの塩素置換度であった（^１３Ｃ−ＮＭＲ）。

（例１１）
ＨＡ−Ｃｌ
反応温度を、５０℃とし、時間を１８時間とし、８当量のメシルクロライドを使用したことを除いては、例１０と同様に反応を行った。１．４ｇの所望の産物を回収し、^１３Ｃ−ＮＭＲのデータは、例５で調製した化合物と同様であって、３．１％ｗ／ｗの塩素置換度であった（^１３Ｃ−ＮＭＲ）。

（例１２）
ＨＡ−Ｃｌ
１０ｇのＨＡを使用し、反応温度を、５５℃とし、時間を６時間とし、１０当量のメシルクロライドを使用したことを除いては、例１０と同様に反応を行った。８．９ｇの所望の産物を回収した。^１３Ｃ−ＮＭＲのデータは、例５で調製した化合物と同様であって、１．４％ｗ／ｗの塩素置換度であった（^１３Ｃ−ＮＭＲ）。

（例１３）
ＨＡ−Ｃｌ
２０ｇのＨＡを使用し、反応温度を、５０℃とし、８当量のメシルクロライドを使用したことを除いては、例１０と同様に反応を行った。１６ｇの所望の産物を回収し、^１３Ｃ−ＮＭＲのデータは、例５で調製した化合物と同様であって、２．６％ｗ／ｗの塩素置換度であった（^１３Ｃ−ＮＭＲ）。

（例１４）
ＨＡ−ＣｌのＴＢＡ塩
ＨＡのＴＢＡ（５０ｇ、ＭＷ７０，０００）を有する１０００ｍＬの乾ＤＭＦの攪拌下の溶液に、Ｎ_２流入下、メシルクロライド（１０当量）を、−１０℃で１時間、滴下で添加した。この混合物を、１時間、室温で保持し、その後、６０℃で１６時間加熱した。例１０と同様に検討を行い、４６．９ｇのものを得た。^１３Ｃ−ＮＭＲのデータは、例５で調製した化合物と同様であって、４．２％ｗ／ｗの塩素置換度であった（^１３Ｃ−ＮＭＲ）。

（例１５）
ＨＡ−Ｃｌ
Ａｍｂｅｒｌｉｔｅ社製のＩＲ−１２０樹脂を充填した陽イオン交換カラムにより、ＨＡ−ＣｌのＴＢＡ塩を調製した。このカラム（７２ｃｍ×４ｃｍ）に、温度自動調節可能な外部ジャケットを設け、２００ｇの乾燥樹脂を、７００ｍＬの１Ｍの塩酸で、１時間、緩徐に攪拌しながら、条件付けし、蒸留水で洗浄し、カラムに注入した。このカラムを、より多くの蒸留水でリンスした。２００ｍＬのＴＢＡ−ＯＨ（４０％）を、カラムに添加し、ＴＢＡＯＨを、再循環下で、室温において、７２時間、３０ｍＬ／分の流率で、４０℃において保持した。最終的なｐＨが８．５〜９となるまで、最終的に、樹脂を、数リットルの水でリンスした。５．６５ｇのＨＡ−Ｃｌのナトリウムを、１６０ｍＬのミリＱ水に溶解した。この溶液を、その後、前もって水を排出し、再循環させたカラムに、ペリスタポンプにより、４ｍＬ／分の流率で２４時間かけて、注入した。その後、カラムをリンスすることにより、ＨＡ−ＣｌのＴＢＡを回収し、７．７ｇのＨＡ−ＣｌのＴＢＡを得た。

（例１６）
６−デオキシ−６−Ｏ−メトトレキシル−ヒアルロン酸（ＨＡ−６−ＭＴＸ又はＨＡ−ＭＴＸ）
例１２からの３．５ｇのＨＡ−ＣｌのＴＢＡ塩を有する１７５ｍＬの無水ＤＭＳＯの攪拌下、窒素下の溶液に、２当量（ＨＡの骨格の繰り返し単位当たり）のメトトレキサート（５．１４ｇ）を有するＤＭＳＯ（５１ｍＬ）の溶液を添加した；その後、２当量（繰り返し単位当たり）の固形の炭酸セシウム（３．６８ｇ）を添加した。得た混合物を攪拌し、４０時間、６５℃に加熱した。その後、この混合物を、室温に冷却し、氷水に注入した。希ＨＣｌでｐＨを７に調節し、室温で４時間攪拌した。その後、１ＭのＮａＣｌ（２×２．５Ｌ）に対して透析し、焼結ガラスフィルター（クラスＩＶ）を介して、不溶性物質を濾過し、その溶液を、１０ＫＤａのメンブレンに対して限外濾過し、その後、１．２μｍ、０．４５μｍ及び０．２２μｍのポアサイズのフィルターを介して濾過した。吸引下で黄色の溶液を濃縮し、凍結乾燥して、黄色のふわふわした固形物（０．８ｇ）を得た。

^１３Ｃ−ＮＭＲのスペクトルにより、Ｄ−グルコサミン残基の６位の位置の結合があることを確認した：６４ｐｐｍのピークを、ＣＨ_２Ｏ−ＭＴＸと同定し、その強度は、元の塩素の誘導体と比較して、４４ｐｐｍのピーク（ＣＨ_２Ｃｌ）の減少と対応するものである。ＭＴＸの含量は、４．２％ｗ／ｗ（ＨＰＬＣ）であり；フリーのＭＴＸの含量は、０．５％ｗ／ｗ（ＨＰＬＣ）未満であり；水の含量は、１０．５％ｗ／ｗであり、ＭＷは、６３，０００であり、ＰＩは、２．８であり、残存する塩素は、０．８％ｗ／ｗであった。

（例１７）
ＨＡ−ＭＴＸ
ＨＡ−ＣｌのＴＢＡ塩（１ｇ、例１０に由来のもの）を有する５０ｍＬの無水ＤＭＳＯの溶液を、メトトレキサート（１．６５ｇ）及び炭酸セシウム（１．１３ｇ）で、７０℃において４０時間処理したことを除いては、例１６と同様にコンジュゲートを調製し、例１２と同様の検討を行った後、黄色の固形物（０．７ｇ）を得た。

^１Ｈ−ＮＭＲのＤＯＥＳＹ及び^１３Ｃ−ＮＭＲのデータは、例１６で調製した化合物と同様であって、ＨＡのＣ−６に共有結合したＭＴＸが存在することを確認した。ＭＴＸの含量は、１０％ｗ／ｗ（ＨＰＬＣ）であり；フリーのＭＴＸは、０．１７％ｗ／ｗ（ＨＰＬＣ）であり；水分含量は、１０％ｗ／ｗであり；ＭＷは、９４，０００であり；ＰＩは、５．２であった。

（例１８）
ＨＡ−ＭＴＸ
例１１に由来する１．５２ｇのＨＡ−ＣｌのＴＢＡ塩を有するＤＭＳＯ（７５ｍＬ）の溶液を、２．４ｇのＭＴＸ及び１．６３ｇの炭酸セシウムで、７０℃において４０時間処理したことを除いては、例１６と同様にコンジュゲートを調製し、通常の検討を行った後、４５０ｍｇの黄色の固形物を得た。

^１Ｈ−ＮＭＲのＤＯＥＳＹ及び^１３Ｃ−ＮＭＲにより、その構造を確認した。ＭＴＸの含量は、１６％ｗ／ｗ（ＨＰＬＣ）であり；フリーのＭＴＸは、０．５％（ＨＰＬＣ）未満であり；水分含量は、１２％ｗ／ｗであり；ＭＷは、６３，０００であり；ＰＩは、３．２であった。

（例１９）
ＨＡ−ＭＴＸ
ＨＡ−ＣｌのＴＢＡ塩（２０ｇ、例１４に由来するもの）を有するＤＭＳＯ（１．２５Ｌ）の溶液を、ＭＴＸ（２９．３ｇ）及び炭酸セシウム（２１ｇ）で、８０℃において４０時間処理したことを除いては、例１６と同様にコンジュゲートを調製し、５．６ｇの黄色の固形物を得た。

このコンジュゲートの構造を、ＮＭＲにより支持した。^１３Ｃ−ＮＭＲのスペクトル（図３）により、Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミンの６位に結合が生じていることを、確認した：６４ｐｐｍのピークを、ＣＨ_２Ｏ−ＭＴＸと同定し、その強度は、元の塩素の誘導体と比較して、４４ｐｐｍのピーク（ＣＨ_２Ｃｌ）の減少と対応するものである。ＭＴＸの含量は、１８．８％ｗ／ｗ（ＨＰＬＣ）であり；フリーのＭＴＸの含量は、０．１％ｗ／ｗ（ＨＰＬＣ）であり；水の含量は、８．２％ｗ／ｗであり、ＭＷは、１１，０００であり、ＰＩは、１．４であり、残存する塩素は、１．７６％ｗ／ｗ（ＮＭＲ）であった。

（例２０）
ＨＡ−ＭＴＸ
例５に由来する５ｇのＨＡ−ＣｌのＴＢＡを有する１５０ｍＬの無水ＤＭＳＯの攪拌下、窒素下の溶液に、９ｇのＭＴＸを有する１００ｍＬのＤＭＳＯの溶液を添加した；その後、６．４３ｇの固形の炭酸セシウムを添加した。得た混合物を、攪拌し、７０℃で４０時間加熱した。その後、この混合物を室温に冷却し、２００ｍＬの氷水に注入した。１ＮのＨＣｌにより、ｐＨを４．７５とし、飽和ＮａＨＣＯ_３溶液（終容量５００ｍＬ）を用いて、ｐＨを７に調節した。その後、１ＭのＮａＣｌ（２×２．５Ｌ）に対して透析し、焼結ガラスフィルター（クラスＩＩ、ＩＩＩ及びＩＶ）を介して、不溶性物質を濾過し、その溶液を、１０ＫＤａのメンブレンに対して限外濾過し、その後、１．２μｍ、０．４５μｍ及び０．２２μｍのポアサイズのフィルターを介して濾過した。吸引下で黄色の溶液を濃縮し、凍結乾燥して、黄色のふわふわした固形物（０．８ｇ）を得た。

^１Ｈ−ＮＭＲのＤＯＳＹ及び^１３Ｃ−ＮＭＲのスペクトルにより、Ｄ−グルコサミン残基の６位の位置にＭＴＸの結合があることを確認した。ＭＴＸの含量は、２０％ｗ／ｗ（ＨＰＬＣ）であり；フリーのＭＴＸの含量は、０．５％ｗ／ｗ（ＨＰＬＣ）未満であり；水の含量は、１１．７％ｗ／ｗであり、ＭＷは、３９，０００であり、ＰＩは、３．３であった。

（例２１）
６−Ｏ−アセチル−６−Ｏ−メトトレキシル−ヒアルロン酸（ＨＡ−６−ＭＴＸ−６−Ａｃ又はＨＡ−ＭＴＸ−Ａｃ）
５０ｇのＨＡのＴＢＡを有する１ＬのＤＭＦ、８当量のメシルクロライドから始めて、５０℃において、例１０と同様にＨＡ−Ｃｌを得た。２％ｗ／ｗの塩素含量を有する３６ｇのＨＡ−Ｃｌを得た。例１９と同様に、３０ｇのこのＨＡ−Ｃｌを、ＭＴＸと反応した。得た１５ｇのＨＡ−ＭＴＸ誘導体は、７．５％ｗ／ｗのＭＴＸ及び１．２５％ｗ／ｗの残存する塩素基を含有した。１ｇのＨＡ−ＭＴＸ−Ｃｌのナトリウム塩を有する１００ｍＬの無水ＤＭＳＯの懸濁液を、１時間、６０℃で加熱した。この均一な懸濁液を、攪拌下、１００℃において、１０当量の固形の無水酢酸セシウム（ＣｓＡｃＯ）で２４時間処理した。室温に冷却した後、この混合物を、限外濾過により精製し、凍結乾燥して、０．６３ｇのＨＡ−ＭＴＸ−Ａｃのナトリウム塩を得た。

ＭＴＸの含量は、５％ｗ／ｗ（ＨＰＬＣ）であり；ＭＷは、３１，０００であり、ＰＩは、２．２であり、水の含量は、１７％ｗ／ｗであった。酢酸のメチル基に対応する２０．８ｐｐｍのピーク、及びＨＡのアセタミド基のＣＨ_３に対応する２３ｐｐｍのピークを積分することで、酢酸含量を算出し、その結果、１％ｗ／ｗであった。

ＨＡ−ＭＴＸコンジュゲートの構造は、^１３Ｃ−ＮＭＲのスペクトルにより、支持された：４４ｐｐｍのシグナルが消失し、これにより、塩素基が完全に置換されたことが確認され、６３．８ｐｐｍのシグナル（ＣＨ_２−ＯＡｃ）が存在し、２０．８ｐｐｍのシグナル（酢酸基のＣＨ_３）のシグナルが存在することで、グルコサミンの６位に酢酸基が存在することが確認された。

（例２２）
ＨＡ−ＭＴＸ−Ａｃ
例２０に由来の２ｇのＨＡ−ＭＴＸのナトリウム塩を有する２００ｍＬの無水ＤＭＳＯの懸濁液を、攪拌下、１００℃において、１０当量の固形の無水酢酸セシウム（ＣｓＡｃＯ）で、１９時間処理した。この反応を例２１と同様に行い、１．４６ｇのＨＡ−ＭＴＸ−Ａｃのナトリウム塩を得た。

ＭＴＸの含量は、１３％ｗ／ｗ（ＨＰＬＣ）であり；ＭＷは、２７，６００であり、ＰＩは、２．９であり、水の含量は、１３％ｗ／ｗであり、酢酸含量は、０．３％ｗ／ｗである（例２１の通り同定した）。^１３Ｃ−ＮＭＲのスペクトルは、例２１で調製した化合物と同様である。

（例２３）
ＨＡ−ＭＴＸ−Ａｃ
例１９に由来の２．５ｇのＨＡ−ＭＴＸのナトリウム塩を有する２５０ｍＬの無水ＤＭＳＯの懸濁液を、攪拌下、１００℃において、１０当量の固形の無水酢酸セシウム（ＣｓＡｃＯ）で、１９時間処理した。この反応を例２１と同様に行い、ＭＴＸの含量が１１％ｗ／ｗ（ＨＰＬＣ）の１．６ｇのＨＡ−ＭＴＸ−Ａｃのナトリウム塩を得た。水の含量は、１２．６％ｗ／ｗであり、酢酸含量は、１．３％ｗ／ｗである（例２１の通り同定した）。

^１３Ｃ−ＮＭＲのスペクトルは、例２１で調製した化合物と同様である。

（例２４）
６−Ｏ−ブチリル−６−Ｏ−メトトレキシル−ヒアルロン酸（ＨＡ−６−ＭＴＸ−６−Ｂｕｔ又はＨＡ−ＭＴＸ−Ｂｕｔ）
例１４に由来の２１ｇのＨＡ−Ｃｌを、８０℃において、２．６７当量のＭＴＸ及び２．６７ｇのＣｓ_２ＣＯ_３と、４０時間、反応した。３０％ｗ／ｗのＭＴＸ含量を有する２００ｍｇの得たＨＡ−ＭＴＸ−Ｃｌを、５当量のブチル酸セシウム（ＣｓＢｕｔ）の存在下、８０℃で２１時間、２０ｍＬのＤＭＳＯに懸濁した。この反応を、例２２と同様に検討して、２０％ｗ／ｗのＭＴＸ含量の０．１９５ｇのＨＡ−ＭＴＸ−Ｂｕｔを得た。ＭＷは、１３０００であり、ＰＩは、１．５であり、水分含量は、１１．５％ｗ／ｗであった。２３ｐｐｍのシグナル（アセタミド基のＣＨ_３）及び１３．３ｐｐｍ（ブチル基のＣＨ_３）のシグナルを積分することにより、ブチル酸の含量を同定し、その結果、３．５％ｗ／ｗであった。

ＨＡ−ＭＴＸ−Ｂｕｔのナトリウム塩の構造を、^１３Ｃ−ＮＭＲスペクトルで支持した。４４ｐｐｍのシグナルが消失し、これにより、塩素基が完全に置換したことが確認され、６３．８ｐｐｍのシグナル（ＣＨ_２−ＯＢｕｔ）及び１３．３ｐｐｍ（ブチル酸基のＣＨ_３）が存在することにより、グルコサミンの６位にブチル酸基が存在することが確認された。

（例２５）
ＨＡ−ＭＴＸ−Ｂｕｔ
例８に由来の１０ｇのＨＡ−Ｃｌを、８０℃において、２当量のＭＴＸ及び２当量のＣｓ_２ＣＯ_３と、４０時間、反応した。２４％ｗ／ｗのＭＴＸ含量を有する１．７ｇの得たＨＡ−ＭＴＸ−Ｃｌを、２．５当量のＣｓＢｕｔの存在下、８５℃で２１時間、１５０ｍＬの乾ＤＭＳＯに懸濁した。この反応を、例２２と同様に検討して、１．２ｇのＨＡ−ＭＴＸ−Ｂｕｔを得た。ＭＴＸの含量は、１２．７％ｗ／ｗ（ＨＰＬＣ）であった。水分含量は、１１．５％ｗ／ｗであった。２３ｐｐｍのシグナル（アセタミド基のＣＨ_３）及び１３．３ｐｐｍ（ブチル基のＣＨ_３）のシグナルを積分することにより、ブチル酸の含量を
同定し、その結果、１．７％ｗ／ｗであった。

（例２６）
ｉｎ ｖｉｔｒｏでの抗増殖活性
ヒトの乳癌腫の２株（ＭＣＦ−７、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１）について、異なる還元型葉酸キャリアを発現する、ヒト卵巣癌腫（ＳＫ−ＯＶ−３、ＩＧＲ−ＯＶ１）について、及び健常な乳管上皮細胞（ＨＢＬ−１００株）について、コンジュゲートの抗増殖活性を同定した。ＭＣＦ−７、ＩＧＲＯＶ−１及びＭＤＡ−ＭＢ−２３１については、完全培地中（ＤＭＥＭ／Ｆ１２、１０％ＦＢＳ（ウシ胎仔血清）、１％Ｌ−グルタミン（１００×、２００ｍＭ）及び１％ペニシリン−ストレプトマイシン（Ｅｕｒｏｃｌｏｎｅ社製）からなる）で、ＳＫＯＶ−１については、１０％ＦＢＳ（ウシ胎仔血清）、１％Ｌ−グルタミン（１００×、２００ｍＭ）及び１％ペニシリン−ストレプトマイシン（Ｅｕｒｏｃｌｏｎｅ社製）を有するＲＰＭＩ−１６４０中で、ＨＢＬ−１００については、１０％ＦＢＳ（ウシ胎仔血清）、１％Ｌ−グルタミン（１００×、２００ｍＭ）及び１％ペニシリン−ストレプトマイシン（Ｓｉｇｍａ社製）を有するＭａｃｃｏｙの培地中で、ＭＴＸ−ナトリウム又はコンジュゲートと、それぞれ５日間、３７℃で、制御された雰囲気下（５％ＣＯ_２）でインキュベートした；１〜３０ｎＭのＭＴＸ−ナトリウムと同等の投与量で、コンジュゲートについて、検討した。

６日目（５日の処理の後）の細胞毒性について、ＭＴＴ試験、つまり、ミトコンドリアの脱水素酵素によってＭＴＴのテトラゾリウム塩が青色のフォルマザンに変換し得る細胞代謝能として細胞のバイアビリティーを測定することにより、同定した；この青色を、５７０ｎｍの分光光度計で測定した。下記のコンジュゲートについて、試験した。

例 コンジュゲート コンジュゲートのタイプ
例２１ ＨＡ−ＭＴＸ−Ａｃ ＭＴＸ５％、Ａｃ１％
例２２ ＨＡ−ＭＴＸ−Ａｃ ＭＴＸ１３％、Ａｃ０．３％
例２４ ＨＡ−ＭＴＸ−Ｂｕｔ ＭＴＸ２０％、Ｂｕｔ３．５％
例１６ ＨＡ−ＭＴＸ ＭＴＸ４．２％
例１７ ＨＡ−ＭＴＸ ＭＴＸ１０％
例１８ ＨＡ−ＭＴＸ ＭＴＸ１６％

種々の腫瘍細胞に対する本発明のコンジュゲートの抗腫瘍効果について、下記の表Ａ及びＢに示す；これらのコンジュゲートの効果は、本発明のコンジュゲートの調製に使用される中間コンジュゲートである例１６乃至１８のＨＡ−ＭＴＸと比較した。乳癌の成長がコントロールの成長と比較して５０％に低下するのに必要なコンジュゲートの濃度（ＩＣ_５０、μＭ）を、表Ａに示す。

表Ａ
化合物 ＭＤＡ−ＭＢ−２３１
ＭＸＴ １．８０
例２１ ２．７
例２４ ２．１８
例２２ ３．０３
例１７ １２．０
例１８ １２．０
例１６ １８．８

上記のデータが示すように、ヒアルロン酸とメトトレキサートとのコンジュゲートは、コンジュゲートされていない同濃度のメトトレキサートと比較して、１０倍高い阻害率を生じた。さらに、データが示すように、驚くべきことに、ヒアルロン酸の第一級水酸基をコンジュゲートとさらにエステル化すると、抗増殖活性が有意に増加する。事実、例２１、２２及び２４のコンジュゲートは、例１６乃至１８のコンジュゲートよりも４〜５倍低いコンジュゲートされていないメトトレキサートと同程度の阻害率を生じる。

表Ｂは、種々の腫瘍細胞株の細胞成長がコントロールの成長の５０％となるのに必要なコンジュゲート及びＭＴＸの濃度（ＩＣ_５０、μＭ）を示す。

表Ｂ
細胞株 ＭＴＸ 例２１ 例２４ 例２２
ＭＣＦ−７ ０．０８１ １．９７ １．７０ １．２３
ＩＧＲ−ＯＶ１ ０．１４ ２．７４ ２．１６ １．９８
ＳＫ−ＯＶ−３ ０．０４１ １．８２ １．６７ １．５７
ＨＢＬ−１００ ０．５０ ２．０５ ２．１１ ２．１９

これらのデータが示すように、コンジュゲートは、幅広い腫瘍細胞株に対して有意な活性を有する。事実、ＩＣ_５０値は、非常に低く、表Ａの細胞株に対して得た本発明のコンジュゲートの値に匹敵するものである。

（例２７）
ｉｎ ｖｉｖｏでの抗増殖活性
１８〜２０ｇの重量のＢＤ２Ｆ１マウスを、滅菌条件下で、Ｚｏｌｅｔｉｌ（登録商標（７０ｍｇ／ｋｇ）の麻酔下で、腹膜を切開し、脾臓を固定化して、１００，０００個のＢ１６／Ｆ１０メラノーマ細胞を脾臓内（ｉｎｔｒａｓｐｌｅｅｎ；ｉ．ｓ．）に０日目に移植した。希釈したＭａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）（１５０μｇ／ｍＬ）に懸濁した腫瘍細胞を、０．０５ｍＬの容量で、ｉ．ｓ．で注入した。Ｂ１６Ｆ１０メラノーマ細胞を、改変イーグル培地で培養した。細胞を、３７℃で５％ＣＯ_２雰囲気で保持した。その後、動物を、ランダムに５つの群（それぞれ７〜８匹のメス）に分け、０日目において、１００，０００個のＢ１６／Ｆ１０メラノーマ細胞を、ｉ．ｓ．で移植し、２、１及び０．５０ｍｇ／ｋｇ／日でＨＡ−ＭＴＸを、８．５、６及び３ｍｇ／ｋｇ／日でＭＴＸ−ナトリウムを、それぞれｉ．ｖ．（３、６及び９日目）で処理した。容量は、ＭＴＸと等価である。データは、４つの異なる実験に由来するものである。

較正グリッドを装着した低出力の実体顕微鏡下での肝臓の評価、及び肝臓の転移の計数は、２１日目に行った。その後、光学顕微鏡による観察用に、肝臓を、ホルムアルデヒド中で保存した。

例１８のＨＡ−ＭＴＸの投与は、ｉ．ｖ．及びｉ．ｐ．のいずれの投与形態の後であっても、肝臓の転移の形成を阻害するのに、効果的であった。

表１０にその結果を示す。

処理 脾臓重量† 肝転移
（単位死亡数当たり （ｍｇ） 関連する転移 無しの動物††
単位ｋｇ当たり）
コントロール １９４±６９ ＋＋＋＋＋ ０／２５
８４％＾；３２％°
３、６及び９日における １４９±２４ ＋ ８／１６^＊＊
ＭＴＸ−Ｎａ（８．５） １３％＾；０％°
３、６及び９日における １５９±７ ＋＋ ７／１４^＊＊
ＭＴＸ−Ｎａ（６） ２１％＾；０％°
３、６及び９日における ２２７±３６ ＋＋＋ ６／１６^＊
ＭＴＸ−Ｎａ（３） ３８％＾；１９％°
３、６及び９日における １５０±３７ − １４／１４^＊＊＊§
ＨＡ−ＭＴＸ（例１８）（２） ０％＾；０％°
３、６及び９日における １９９±２７ ＋＋ ９／１６^＊＊＊
ＨＡ−ＭＴＸ（例１８）（１） ３１％＾；０％°
３、６及び９日における １５５±１６ ＋＋＋ ６／１５^＊＊
ＨＡ−ＭＴＸ（例１８）（０．５） ２７％＾；１３％°

＾印は、肝臓に３つ以上の可視な腫瘍の塊を有するマウスが存在することを示し；
°印は、３ｍｍ以上の転移を有するマウスが存在することを示し；
†印は、２１日目の脾臓の重量（同じ種の健常なマウスの脾臓であって、重量が１１７±１１ｍｇのものとの比較用）を示し、
††印は、群当たりマウスの総数に対する、顕微鏡で検知可能な肝臓の転移がないマウスの数を示す。

コントロールに対する統計学差異：＊ｐ＜０．０１；＊＊ｐ＜０．００１；＊＊＊ｐ＜０．０００１及び§は、他の全てに対して異なることを示す（フィッシャーの検定）。

上記のデータが示すように、ＨＡ−ＭＴＸは、腫瘍の移植後、３、６及び９日目に２ｍｇ／ｋｇ／日の容量（ＭＴＸと等価なもの）でｉ．ｖ．処理した後に、Ｂ１６／Ｆ１０メラノーマ細胞の肝臓への転移を完全に消失させた。さらに、１及び０．５ｍｇ／ｋｇ／日というより低い容量での肝臓の転移の低下は、６及び３ｍｇ／ｋｇ／日のＭＴＸ−ナトリウムのものに匹敵するものであって、ＭＴＸ−ナトリウムの容量の１／６に対応するものである。

（例２８）
亜急性毒性
３又は７のＣＢＡ／Ｌａｃのオスのマウスの各群に、５日間連続して、コンジュゲートを繰り返しｉ．ｐ．投与した。容量は、１．５及び３．０ｍｇ／ｋｇ／日のＭＴＸの量を動物に与えるように、算出した。２５０μＬ／動物を越えない容量で溶解した各容量で、処理を行った。処理終了後、２１日の追跡期間について、致死率を評価した。同じ動物について、処理前の日と４日目のそれぞれの体重変化を測定した。

表Ｃ
化合物 投与量 致死率 体重
（ｍｇ／ｋｇ ＭＴＸ） （死亡数／全数） （ｇ）
例１９ ３（ｍｇ／ｋｇ）＊５死亡 ７／７ −０．４０
例１９ １．５（ｍｇ／ｋｇ）＊５死亡 ０／３ −０．１０
例２３ ３（ｍｇ／ｋｇ）＊５死亡 ０／３ ＋０．１０
例２３ １．５（ｍｇ／ｋｇ）＊５死亡 ０／３ ＋０．２０
例２５ ３（ｍｇ／ｋｇ）＊５死亡 ０／３ ＋０．１０
例２５ １．５（ｍｇ／ｋｇ）＊５死亡 ０／３ ＋０．２０

亜急性毒性のデータから明らかなように、さらにエステル化されたコンジュゲート（例２３及び２５）は、さらにエステル化していないコンジュゲート（例１９）よりも毒性が低い。

例４で得たＨＡ−６−Ｂｒの^１３Ｃ−ＮＭＲのスペクトルを示す。 例５で得たＨＡ−Ｃｌの^１３Ｃ−ＮＭＲのスペクトルを示す。 例１９で得たＨＡ−ＭＴＸの^１３Ｃ−ＮＭＲのスペクトルを示す。

Claims (28)

1. 酸および塩の形態のいずれかのヒアルロン酸のコンジュゲートであって、
   前記ヒアルロン酸のＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミン単位の第一級水酸基は、化合物Ａのカルボキシル基、及び下記式（Ｉ）のａ−又は？−のカルボキシル基の両方でエステル化されており、
   
   ここで、Ｒ_２及びＲ_４は、互いに独立に、−ＮＨ_２、−ＯＨ、−ＯＣＨ_３、Ｃ１〜Ｃ５のアルキル、＝Ｏから選択され；
   Ｘ及びＹは、−Ｃ（Ｒ_５）＝、−ＣＨ（Ｒ_５）−、−ＮＨ−、−Ｎ＝を示し、ここで、Ｒ_５は、−Ｈ、Ｃ１〜Ｃ５のアルキルであり；
   Ｚは、−ＣＨ（Ｒ_１０）−、−Ｎ（Ｒ_１０）−、−Ｏ−を示し；
   Ｒ_１０は、−Ｈ、Ｃ１〜Ｃ５のアルキル、Ｃ１〜Ｃ５のアルケニル、若しくはＣ１〜Ｃ５のアルキニル、又は窒素、硫黄及び酸素からなる群から選択された１〜３のヘテロ原子を有する５若しくは６員の複素環を示し；
   Ａｒは、１，４−フェニル基、１つ以上の５若しくは６員の芳香族環で縮合された１，４−フェニル基、又は１つ以上の５若しくは６員の複素環で縮合された１，４−フェニル基を示し、この置換基は、上記のＲ_２で可能に置換され、
   環Ａ及びＢは、互いに独立に、芳香族又は非芳香族であってもよいことを特徴とするコンジュゲート。
2. 前記式（Ｉ）の化合物は、メトトレキサートであることを特徴とする請求項１に記載のコンジュゲート。
3. 式（Ｉ）及び化合物Ａの全量は、コンジュゲートの全重量に対して、０．１〜６０％ｗ／ｗであることを特徴とする請求項１又は２に記載のコンジュゲート。
4. コンジュゲートの全重量に対して、
   前記の式（Ｉ）の化合物は、１〜４０％ｗ／ｗの範囲の量で、
   前記化合物Ａは、０．１〜３０％ｗ／ｗの範囲の量で、存在することを特徴とする請求項１乃至３のいずれか一項に記載のコンジュゲート。
5. 前記化合物Ａは、酢酸であり、
   コンジュゲートの全重量に対して、０．１〜１０％ｗ／ｗの範囲の量で存在することを特徴とする請求項４に記載のコンジュゲート。
6. 前記脂肪酸は、直鎖又は分岐のＣ１〜Ｃ５のアルキル、ハロゲン、ニトロ基、シアノ基、水酸基、アミノ基、メトキシル基、カルボニル基、チオール基及びカルボキシル基からなる群から選択される置換基で置換されることを特徴とする請求項１乃至５のいずれか一項に記載のコンジュゲート。
7. 前記化合物Ａは、酢酸、ブチル酸、プロピオン酸、レチノイン酸、ｎ−プロピル酢酸、コハク酸、シクロヘキサンカルボン酸、シクロヘキサンアセチル酸及びシクロプロパンカルボン酸からなる群から選択される脂肪酸であることを特徴とする請求項１乃至４のいずれか一項に記載のコンジュゲート。
8. 前記化合物Ａは、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、メチオニン、グリシン、セリン、システイン、アスパラギン、グルタミン、アスパラギン酸、グルタミン酸、プロリン、ヒスチジン、フェニルアラニン、トリプトファン及びチロシンからなる群から選択されるアミノ酸であることを特徴とする請求項１乃至４のいずれか一項に記載のコンジュゲート。
9. 前記化合物Ａは、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、メチオニン、グリシン、セリン、システイン、アスパラギン、グルタミン、アスパラギン酸、グルタミン酸、プロリン、ヒスチジン、フェニルアラニン、トリプトファン及びチロシンからなる群から選択されるアミノ酸の組み合わせからなるペプチドであることを特徴とする請求項１乃至４のいずれか一項に記載のコンジュゲート。
10. 前記アリール脂肪酸は、直鎖又は分岐のＣ１〜Ｃ５のアルキル、ハロゲン、ニトロ基、シアノ基、水酸基及びメトキシル基からなる群から選択される置換基でアリール基が置換されることを特徴とする請求項１乃至４のいずれか一項に記載のコンジュゲート。
11. 前記化合物Ａは、フェニル酢酸、フェノキシ酢酸、ナフチル酢酸、２−（４−イソブチルフェニル）プロピオン酸、２−（６−メトキシ−２−ナフチル）プロピオン酸及び桂皮酸からなる群から選択されるアリール脂肪酸であることを特徴とする請求項１乃至４のいずれか一項に記載のコンジュゲート。
12. 前記化合物Ａは、置換又は無置換の安息香酸であることを特徴とする請求項１乃至４のいずれか一項に記載のコンジュゲート。
13. 前記の置換の安息香酸は、ハロ安息香酸、アルキル安息香酸、ニトロ安息香酸及び２−アセトキシ安息香酸からなる群から選択されることを特徴とする請求項１２に記載のコンジュゲート。
14. 前記化合物Ａは、酢酸、ブチル酸、アラニン、グリシン、並びにアラニン及び／又はグリシンを含有するペプチドからなる群から選択されることを特徴とする請求項１乃至４のいずれか一項に記載のコンジュゲート。
15. アルカリ金属、アルカリ土類金属及び遷移金属からなる群から選択される金属で塩化されたことを特徴とする請求項１乃至１４のいずれか一項に記載のコンジュゲート。
16. Ｎａ^＋、Ｋ^＋、Ｃａ^＋＋、Ｍｇ^＋＋、Ｃｕ^＋＋、Ｚｎ^＋＋、Ａｇ^＋＋、Ａｕ^＋＋及びＣｏ^＋＋からなる群から選択される金属で塩化されたことを特徴とする請求項１５に記載のコンジュゲート。
17. 前記ヒアルロン酸の第二級水酸基は、−ＯＲ、−ＯＣＯＲ、−ＳＯ_２Ｈ、−ＯＰＯ_３Ｈ_２、−Ｏ−ＣＯ−（ＣＨ_２）_ｎ−ＣＯＯＨ及び−Ｏ−（ＣＨ_２）_ｎ−ＯＣＯＲを形成するように、誘導体化され、
    ｎは、１〜４であり、
    Ｒは、Ｃ１〜Ｃ１０のアルキルであることを特徴とする請求項１乃至１６のいずれか一項に記載のコンジュゲート。
18. 前記ヒアルロン酸の第二級水酸基は、−ＮＨ_２及び−ＮＨＣＯＣＨ_３から選択される置換基を形成するように、誘導体化されることを特徴とする請求項１乃至１６のいずれか一項に記載のコンジュゲート。
19. 細胞の過増殖を特徴とする病態を処置する医薬を調製することへの、請求項１乃至１８のいずれか一項に記載のコンジュゲートの使用。
20. 前記病態は、腫瘍、皮膚疾患、乾癬、炎症及び関節リューマチからなる群から選択されることを特徴とする請求項１９に記載の使用。
21. 医薬的に許容な賦形剤及び／又は希釈剤と組み合わせた、請求項１乃至１８のいずれか一項に記載のコンジュゲートを含有することを特徴とする医薬組成物。
22. 請求項１乃至１８のいずれか一項に記載のコンジュゲートを調製する方法。
23. 下記に示す順序で実行される各ステップを有する請求項２２に記載の方法であって、
    （ａ）フリーの形態又は塩の形態のヒアルロン酸のＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミン単位の第一級水酸基を塩素化するステップと；
    （ｂ）塩素原子を置き換えることにより、塩素化されたヒアルロン酸と、式（Ｉ）の化合物のカルボキシル基との間にエステル結合を形成するステップと；
    （ｃ）適当なアシル求核試薬による残存する塩素原子を置き換えることにより、ステップ（ｂ）の生成物と、化合物Ａとの間にエステル結合を形成するステップと；
    を有することを特徴とする方法。
24. 塩素化に使用する試薬は、メタンスルフォニルクロライドを有するＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミドであることを特徴とする請求項２３に記載の方法。
25. ヒアルロン酸と、下記式（Ｉ）の化合物
    
    とのコンジュゲートであって、
    ここで、Ｒ_２及びＲ_４は、−ＮＨ_２、−ＯＨ、−ＯＣＨ_３、Ｃ１〜Ｃ５のアルキル、＝Ｏを示し；
    Ｘ及びＹは、−Ｃ（Ｒ_５）＝、−ＣＨ（Ｒ_５）−、−ＮＨ−、−Ｎ＝を示し、ここで、Ｒ_５は、−Ｈ、Ｃ１〜Ｃ５のアルキルを示し；
    Ｚは、−ＣＨ（Ｒ_１０）−、−Ｎ（Ｒ_１０）−、−Ｏ−を示し、ここで、Ｒ_１０は、−Ｈ、Ｃ１〜Ｃ５のアルキル、Ｃ１〜Ｃ５のアルケニル、若しくはＣ１〜Ｃ５のアルキニル、又は窒素、硫黄及び酸素からなる群から選択された１〜３のヘテロ原子を有する５若しくは６員の複素環を示し；
    Ａｒは、１，４−フェニル基、１つ以上の５若しくは６員の芳香族環で縮合された１，４−フェニル基、又は１つ以上の５若しくは６員の複素環で縮合された１，４−フェニル基を示し、この置換基は、上記のＲ_２で可能に置換され；
    環Ａ及びＢは、互いに独立に、芳香族又は非芳香族であり；
    ヒアルロン酸のポリマー鎖に化学的に結合された残存する塩素が、３％ｗ／ｗ未満で含有することを特徴とするコンジュゲート。
26. 残存する塩素が０．１％ｗ／ｗ未満で含有することを特徴とする請求項２５に記載のコンジュゲート。
27. 下記に示す順序で実行される各ステップを有する請求項２５に記載のコンジュゲートを取得する方法であって、
    （ａ）フリーの形態又は塩の形態のヒアルロン酸のＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミン単位の第一級水酸基を塩素化するステップと；
    （ｂ）塩素原子を置き換えることにより、塩素化されたヒアルロン酸と、式（Ｉ）の化合物のカルボキシル基との間にエステル結合を形成するステップと；
    を有することを特徴とする方法。
28. 下記に示す順序で実行される各ステップを有する請求項２６に記載のコンジュゲートを取得する方法であって、
    （ａ）フリーの形態又は塩の形態のヒアルロン酸のＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミン単位の第一級水酸基を塩素化するステップと；
    （ｂ）塩素原子を置き換えることにより、塩素化されたヒアルロン酸と、式（Ｉ）の化合物のカルボキシル基との間にエステル結合を形成するステップと；
    （ｃ）適当なアシル求核試薬によるステップ（ｂ）の残存する生成物にエステル結合を形成することにより、残存する塩素原子を置き換えるステップと；
    （ｄ）ステップ（ｃ）で得たコンジュゲートの選択的な脱アセチル化を行うステップと；
    を有することを特徴とする方法。