CN1203071C - 谷氨酸n－衍生物的多糖酯 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及谷氨酸N-衍生物(N-GA衍生物)的多糖酯。这些多糖酯具有抗增生活性和特征为低全身毒性。本发明的酯用于预防和治疗由细胞过度增生引起的疾病，特别是银屑病、肿瘤、类风湿性关节炎或肠内炎症性病状。

Description

谷氨酸N-衍生物的多糖酯
发明领域
本发明涉及新产物，即谷氨酸N-衍生物(N-GA)的多糖酯。在此描述了它们作为药物的抗增生的用途。
现有技术
在本领域已经描述过几种改性的多糖。它们通过如下方式获得：在多糖链上存在的一些基团，例如羧基、胺基、或羟基的化学改性，形成酯、酰胺、醚。应用领域有几种和包括例如食品、清漆、分析化学、化妆品和药物。
在药物领域，认为多糖是适于制备可控药物释放化合物的化合物。它们事实上特别容易被生物体所耐受，这是由于例如透明质酸和肝素，它们是它的一部分。
用于药用活性分子的可控释放的多糖可以如下方式存在：与药物混合(WO99/02151)或通过，例如酯或酰胺键，共价结合到其上(US4851521和US5733891)。
然而，除它们作为载体的功能以外，一些多糖具有它们自身的生物活性或它们是有机体的组分：例如，肝素是抗凝剂；透明质酸是玻璃体液和滑膜液的主要组分，此外通常用于治疗骨关节病和关节病的临床实践。硬葡聚糖(Sizofiran)，另一种多糖，用于肿瘤的治疗。其它硫酸化多糖证明可有效治疗类风湿性关节炎、视网膜炎和银屑病。
具有二氢叶酸还原酶(DHFR)抑制活性的谷氨酸N衍生物的药物用途报导在文献(Goodman&Gilman，治疗学的药理学基础，McGraw-Hill，1996，1253页)中。酶DHFR负责7，8-二氢叶酸盐循环到它的还原的，生理学活性的6(R)-四氢形式。还原叶酸盐的可利用性对于支持活跃增生细胞的复制是必须的。谷氨酸N衍生物，它作为DHFR的有效抑制剂的细胞毒性效果，已经可归因于还原叶酸盐细胞内池的缺失。这些药物通常用作几类病状如肿瘤、银屑病和类风湿性关节炎中的抗增生剂。然而它们的药物用途强烈地受到它们的高全身毒性限制，因此非常需要允许更低剂量药物的给药从而降低毒性的体系或更具体的制剂。
这些N-GA衍生物的一些已经连接到其它分子上，特别是连接到大分子，如血清白蛋白，或合成聚合物，明胶和一些多糖上。例如，已经使用缩合剂(羰基咪唑)制备聚-氨甲喋呤-葡聚糖(CA2,009,695)。此最后的反应方法并不允许制备结构确定的产物，这是由于几种不同类型的羧基和羟基它们的无规反应。不能深刻说明此产物的结构，因此特征仅为在从反应混合物分离的材料中存在的氨甲喋呤的数量。事实上，没有给出关于在多糖上取代位置的证据。相同类型的反应方法已经应用于制备其它的多糖衍生物，它们再次允许制备无规取代的聚合物(US5,554,386)。在聚合物上引入氨甲喋呤以制备药理活性体系的尝试是在多糖葡聚糖和药物之间的共轭反应，它通过间隔基团进行。至少，在该共轭之前将葡聚糖采用高磺酸盐改性且因此它的原始糖结构被破坏，导致不同的聚合物(Dang等人，Cancer Res.，54，1729，1994)。在用于现有技术的一些反应中，设想在氨甲喋呤羧基和氨基之间的可能不希望的交联反应。
概述
一类通式(I)化合物的多糖酯，通常称为N-GA(谷氨酸的N衍生物)，表示本发明的目的。
这些N-GA化合物具有如下通式：
Figure C0180664600071
式(I)
其中：
-R2和R4表示：-NH2、-OH、-OCH3、C1-C5烷基、＝O和包含两个氮原子的6元环任选地是芳族的；
-X和Y表示：-C(R5)＝、-N＝和包含它们的环任选地是芳族的，或它们表示：-CH(R5)-或-NH-和包括它们的环是脂族的；
-R5表示：-H、C1-C5烷基；
-Z表示：-CH(R10)-、-N(R10)-、-O-；
-R10表示-H、C1-C5烷基、C1-C5烯基、C1-C5炔基、含有1-3个选自氮、硫和氧的杂原子的5-6元杂环，
-Ar表示可能与一个或多个5-6元芳族环稠合的1，4-苯基，可能的杂环，可能被R2取代。用于制备多糖酯的多糖从天然来源获得和在单糖单元上存在的它们伯羟基与通式(I)化合物的γ-羧基完全或部分酯化。
本发明的产物可用于药物领域作为细胞增生的抑制剂和因此用于制备治疗瘤、炎症性或自身免疫疾病的药剂。
本发明进一步包括新药物组合物，该组合物包含作为活性化合物的该多糖酯，多糖酯与合适的药物赋形剂和/或溶剂结合，和它们在治疗和预防特征为细胞过度增生的疾病中的用途。
发明详述
本发明的目的涉及一类通常称为N-GA(谷氨酸的N衍生物)的通式(I)化合物的多糖酯。
这些N-GA化合物具有如下通式：
Figure C0180664600081
式(I)
其中：
-R2和R4表示：-NH2、-OH、-OCH3、C1-C5烷基、＝O和R2和R4连接到其上的6元环任选地是芳族的；
-X和Y选自：-C(R5)＝、-CH(R5)-、-NH-、-N＝，其中R5表示：-H、C1-C5烷基，和包括X和Y的环任选地是芳族的；
-R5表示：-H、C1-C5烷基；
-Z表示：-CH(R10)-、-N(R10)-、-O-；
-R10表示-H、C1-C5烷基、C1-C5烯基、C1-C5炔基、含有1-3个选自氮、硫和氧的杂原子的5-6元杂环，
-Ar表示：可能与一个或多个5-6元芳族环稠合的1，4-苯基，可能的杂环，可能被R2取代。
在通式(I)中，根据环是否是芳族的，可发生如下状况：
1)当包含两个氮原子的6元环是芳族的时，则两个氮原子是：-N＝和被R2和R4取代的碳原子分别是：-C(R2)＝和-C(R4)＝和R2和R4不同于＝O；此外连接X和Y和通常连接到两者环上的碳原子，分别是：-C(X)＝和-C(Y)＝；
2)当包含两个氮原子的6元环不是芳族的时，则两个氮原子的形式是：-NH，和被R2和R4取代的碳原子分别是：-CH(R2)＝和-CH(R4)＝或当R2和/或R4是＝O时，相应的碳原子不被H取代，和：a)当包含X和Y的环不是芳族的时，连接到X和Y的碳原子是：-CH(X)-和-CH(Y)-；或b)当包含X和Y的环是芳族的时，它们是：-C(X)＝和-C(Y)＝；
3)当包含X和Y的环是芳族的时则X和Y是：-C(R5)＝、-N＝和连接X和Y和通常连接到两者环上的碳原子，是-C(X)＝和-C(Y)＝和连接到X和连接到-CH2-Z-上的碳原子不被-H取代和连接到Y上的剩余碳原子是-CH＝；
4)当包含X和Y的环不是芳族的时，则X和Y是：-CH(R5)-、-NH-和：a)当该两个包含N的环是芳族的时，连接到X和Y的碳原子(也属于包含N的环)是-C(X)＝和-C(Y)＝，或b)当该包含N的环不是芳族的时，它们是-CH(X)-和-CH(Y)-，和连接到X和连接到-CH2-Z-上的碳原子被-H取代和连接到Y上的剩余碳原子是-CH2-。
在根据本发明的多糖酯中，多糖的伯羟基与通式(I)化合物的γ-羧基部分或完全酯化。N-GA的γ-羧基直接连接到-(CH2)2-上的基团。
根据本发明的第一优选实施方案，当R2和R4是-NH2或-OH时，R5当存在时表示：-H、-CH3，包含两个氮原子(-N＝)的6元环是芳族的；Z选自：-CH(R10)、-N(R10)-，其中R10表示-H、C1-C5烷基、C1-C5烯基、C1-C5炔基。
在第二优选实施方案中，当R2是＝O和R4是-NH2时，包含两个氮原子的6元环不是芳族的；X和Y是氮原子(-N＝)和包含它们的环是芳族的；Z是-N(R10)-，其中R10表示：-H或-CH3；Ar是1，4苯基。
在第三优选实施方案中，当R2和R4是-NH2时，包含两个氮原子(-N＝)的6元环是芳族的；X和Y是氮原子(-N＝)和包含它们的环是芳族的，Z是-N(R10)-，其中R10是-CH3或-H；Ar是1，4苯基。
在第四优选实施方案中，当R2和R4是-NH2时，包含两个氮原子(-N＝)的6元环是芳族的；X和Y是氮原子(-N＝)和包含它们的环是芳族的，Z是-CH(C2H5)-和Ar是1，4-苯基。在通式(I)化合物和多糖之间的酯化发生在多糖的单糖单元的伯羟基和通式(I)化合物(N-GA)的γ-羧基之间。
这些多糖酯的取代程度为＞0-1，优选0.005-1。术语“取代程度”(DS)表示每摩尔数包含伯羟基的单糖单元的通式(I)化合物(N-GA)的数目。相应于1的取代程度表示所有伯羟基和N-GA酯化的产物。
用于本发明的多糖是阴离子的或中性的和至少一些的它们单糖单元包含伯羟基。多糖分离自不同的来源：动物、人体、植物、微生物和它们的天然重均分子量(MW)为1×103-2×106。
多糖含有线性或支化结构和由如下单糖单元组成：D-葡萄糖、D-木糖、D-阿拉伯糖、D-和L-甘露糖、D-半乳糖、L-岩藻糖、D-果糖、L-鼠李糖、D-葡萄糖醛酸、D-甘露糖醛酸、L-古洛糖醛酸、L-艾杜糖醛酸、D-半乳糖醛酸、N-乙酰基-D-葡糖胺、N-乙酰基-D-半乳糖胺，3，6-脱水-D-半乳糖、N-乙酰基-D-半乳糖胺、3，6-脱水-D-半乳糖、3，6-脱水-L-半乳糖。这些单糖可任选地包含硫酸盐或乙酰基。
主多糖链含有β-(1→3)或β-(1→2)或β-(1→4)-D-糖苷或α-(1→3)、α-(1→4)、α-(1→6)-糖苷结构；优选是β-构型。侧链优选由与如下结合的D-糖基单元组成：β-(1→2)、β-(1→3)、β-(1→4)、β-(1→6)、或α-(1→4)、α-(1→6)或甚至更优选β-(1→6)键。
当多糖是中性的时，它优选是从藻类、真菌、植物、细菌或酵母菌分离的葡聚糖(葡萄糖多糖)。优选的中性多糖属于β-(1→3)-D-葡聚糖(β-(1→3)-D-葡萄糖的多糖)类和是线性或支化的。可用于本发明的葡聚糖的优选例子是：硬葡聚糖、蘑菇多糖、裂裥菌素、茯苓多糖(pachimaran)、产碱杆菌多糖、昆布多糖、芽霉菌糖。该多糖由藻类、酵母菌和真菌大量生产。在它们之中，优选是硬葡聚糖。硬葡聚糖是在主链中每三个葡萄糖处侧链由β-(1→6)-D-葡萄糖单元构成的β-(1→3)-D-葡聚糖。此多糖主要从真菌，如葡糖酸小核菌(Sclerotiumglucanicum)或齐整小核菌(S.rolfsii)提取。真菌发酵表示它们生产的进一步有用方式。
当多糖是阴离子时，使用羧化多糖，如透明质酸或它的盐(二聚体单元由N-乙酰基-D-葡糖胺和D-葡萄糖醛酸组成)。果胶是阴离子多糖的另一种例子。果胶是由D-半乳糖醛酸和D-半乳糖组成的多糖，其中羧基可与甲基部分酯化。用于本发明酯的另一类阴离子多糖，由硫酸化多糖，例如肝素、硫酸软骨素或硫酸皮肤素表示。用于本发明酯制备的硫酸化多糖的其它例子，是如在WO98/23648中描述的从Grateloupia doryphora或G.filicina种类的藻类提取。也可以有利地使用从属于Grateloupiaceae或Codiaceae科的不同的藻类或从其它微生物分离的其它硫酸化多糖。
在阴离子多糖的情况下，任选地将本发明的酯与如下物质成盐：碱金属(优选Na和K)、碱土金属(优选Ca和Mg)、过渡金属(优选Cu、Zn、Ag、Au、Co)。通过熟练技术人员用已知的方法获得衍生多糖，如通过本发明化合物成盐而获得的那些。
任选地，将在本发明多糖酯的单糖单元上的游离羟基，进一步通过引入选自如下的一种或多种取代基改性：低级C1-C6烷基、-COOH、NH2、-NH-COCH3、-SO3H、-OPO3H2、-COO-(CH2)n-COOH、-COOR、-COR、-OR、-O-(CH2)n-OCOR，其中n＝1-4和R＝C1-C10烷基。这些取代物可以容易地通过本领域已知的方法获得，和选择例如用于改性多糖酯的亲水特征，调节它们的溶解度。
本发明的多糖酯具有特有化学特征，该特征在于如下两者：存在双区域选择性和天然多糖结构的保持。此外，在N-GA和多糖之间不存在间隔臂或化学基团。
至于涉及的双区域选择性，术语“双”表示在多糖和在N-GA两者上的选择性。因此获得的衍生物是独特的。事实上，在多糖上存在的几个羟基之中，仅有单糖单元的伯羟基与N-GA酯化。关于在N-GA上的选择性，尽管此分子包含两个显示相当相似化学反应性的反应性羧基，本发明的衍生物涉及仅含有涉及反应的一个特定羧酸和更精确地γ-羧酸的产物，例如由NMR光谱确认。结果是，本发明的衍生物具有高度规则和确定的三维结构。相对于现有技术的无规取代衍生物此特征提供明确的药理学优点。事实上可能游离伯或仲羟基的无规取代导致具有依赖于取代类型的可变活性的产物。
此外，不同于现有技术的N-GA的大分子衍生物，在本发明的酯中，多糖保持原始天然化学结构。在此将起始多糖改性的意义在于在单糖单元上引入新基团但并不改进单糖单元的结构特性。因此保存多糖的整体性的优点在于在酯键的体内水解之后，仅产生已知的生物相容性代谢物(天然多糖如葡聚糖或透明质)。根据进一步的实施方案，本发明涉及N-GA多糖酯的制备方法。
通式(I)化合物和多糖的酯化工艺通过如下物质的区域选择性反应而发生：多糖单糖单元的的活化伯羟基和N-GA的γ-羧基。通过选择合适的反应物数量，获得具有不同取代程度的多糖酯。方法包括如下步骤：
a)通过卤化，多糖的单糖单元的伯羟基的活化，获得区域选择性卤代多糖；
b)通过卤素原子的置换，在步骤a)的卤代多糖和N-GA羧基之间酯键的形成。
步骤a)通过如下方式进行：在合适的有机溶剂中，在搅拌下在25-100℃下将多糖悬浮1-5小时，随后活化伯羟基，该活化在烷基或芳基卤化物存在下，在有机溶剂中，在-20℃到70℃的温度下在搅拌下进行1-18小时；合适的卤化物是甲磺酰溴、对甲苯磺酰溴、甲磺酰氯、对甲苯磺酰氯；合适的溶剂是二甲基甲酰胺、二甲亚砜、N-甲基吡咯烷酮。可以任选地将此反应混合物碱化到9-11的pH值。在卤化结束时，将混合物中和及通过已知技术如沉淀，干燥，冷冻干燥将卤代多糖回收。当多糖是阴离子多糖时，它可以游离或成盐的形式，优选以成盐的形式使用。
步骤b)通过如下方式进行：将a)中获得的卤代多糖悬浮在有机溶剂或其混合物中，随后在碱性试剂存在下，加入在相同有机非质子溶剂或其混合物中的N-GA。将反应在室温下，在搅拌下进行0.5-3天。合适的溶剂是二甲基甲酰胺、二甲亚砜、N-甲基吡咯烷酮。在反应结时，通过已知技术如沉淀，干燥，冷冻干燥，回收谷氨酸N衍生物的多糖酯。
关于本发明方法多糖卤化(步骤a)的进一步详细情况在WO99/18133中找到，在此描述的条件可以适用于阴离子和中性多糖两者。也可以应用多糖和通式(I)化合物的其它酯化反应，它允许双区域选择性，如包括在其上发生选择性衍生的特定化学基团的保护和解保护的反应。
本发明的酯抑制细胞过度增生和具有令人惊奇地低全身毒性。
特别地，本发明的产物在特征为细胞过度增生的如下所有那些病状和障碍的治疗中有活性：如炎症性、自身免疫性或瘤疾病和特别是在容易发生肿瘤恶化的炎症性病状中，如肠内炎症性疾病，即憩室炎、克隆病、结肠炎、溃疡性结肠炎，如在Levin等人中描述的那样(J.Cell.Biochem.Suppl.，1992，16G：47-50)。本发明的多糖酯也用于治疗骨头或腱的滑膜细胞增生，它导致关节软骨的退化，如在Echanet等人中描述的那样(J.Immunol.，1993，151(9)4908-4917)。这样的退化在关节疾病例如类风湿性关节炎、幼态关节炎、银屑病关节炎中经常发生。根据本发明的化合物也用于特征为异常细胞增生的皮肤疾病和甚至用于继发性细胞增生的控制，例如用于假体医用装置(例如心血管支架、或其它辅助器)的外科插入或血管病症或用于哮喘发作、心肌梗塞或肺动脉高压。
至于涉及的抗肿瘤疾病，本发明的产物也可适用于治疗几种类型的人体肿瘤，例如卵巢癌、淋巴细胞白血病、淋巴瘤、绒毛膜癌、乳腺癌、鳞状细胞癌、骨肉瘤。
在进一步的实施方案中，本发明提供药物组合物，该组合物包含与适当的药用赋形剂和/或稀释剂结合的本发明酯衍生物。包含本发明多糖酯的该组合物可任选地包括具有抗增生活性的其它已知药物。
根据本发明的药物组合物适于胃肠外、口服或局部给药。优选的胃肠外给药方式是静脉内、肌内、关节内和皮下。当它们为液体形式时，组合物可以为溶液或悬浮液的形式，均可以在含水或非含水介质中。或者，可以按固体形式配制组合物，其中就在给药之前，通过加入合适的液体介质，将冻干或干燥的产物溶解或悬浮。以固体或半固体形式的药物组合物是插入物、凝胶、乳膏、颗粒剂、粉末、片剂、胶囊、丸剂或微囊包封的制剂。其它类型的制剂可以由专家已知的技术设定。
本发明的酯衍生物的剂量可依赖于病状和种类和严重程度，以及依赖于患者的年龄、体重和一般状况而变化。
试验部分
实施例1.测量重均分子量(Mw)的方法。
多糖试剂的分子量由HP-SEC(高效尺寸排阻色谱)分析。分析条件是：
色谱：带有Rheodyne 9125注射器的HPLC Jasco PU-980。柱：TSK PwxlG6000+G5000+G3000(TosoHaas)300mm×7.8mmID，13，10，6μm粒径；温度40℃
流动相：NaCl 0.15M
通量：0.8ml/min
检测器LALLS CMX-100(TSP Chromatix)，Po＝150mV；差示折光指数410(Waters)，灵敏度128x；温度32℃。
注射体积：100μl
将要分析的样品在大约1.0mg/ml的浓度下溶于0.15M NaCl中和在搅拌下保持12小时。然后，将溶液在0.45μm多孔过滤器(Millipore)上过滤和最后注入色谱。分析允许Mw(重均分子量)，Mn(数均分子量)，PI(多分散性)的测量。通过折光率的积分控制聚合物样品溶液的浓度。
实施例2.卤代硬葡聚糖的制备
将160mL的无水DMF在80℃下加热和在氮气下混合1小时。将1g重均分子量为60000(如在实施例1中所述测量的)的硬葡聚糖，加入和将系统混合三小时。将溶液冷却到室温。然后将9.8g甲磺酰溴在0℃下加入到溶液中。将反应混合物在混合下保持另外20分钟和然后在80℃下加热16小时。将混合物冷却到室温和通过加入30mL的Milli-Q水而终止反应。将混合物采用3N NaOH中和，然后在减压下浓缩和最后倾入800mL丙酮中。将产物通过过滤收集，采用丙酮洗涤，在蒸馏水中悬浮和透析。将混合物过滤和将固体材料在烘箱中、在真空、室温下干燥。固体重量：1g。
将产物采用13C NMR光谱(DEPT)，在DMSO-d6/TFA中在50℃下分析。参与卤化的多糖的CH2-O(C6)的信号为34.5ppm，然而在未衍生多糖中的相同基团得到61ppm的信号。化学位移中的变化提供在葡萄糖残基的伯羟基上发生卤化反应的证据。
实施例3.硬葡聚糖与化合物MT的酯化
将带有如下取代基的通式(I)化合物MT与卤代硬葡聚糖酯化：R2和R4：-NH2，包含两个氮原子的6元环是芳族的；X和Y是-N＝和包含它们的环是芳族的；Z是-N(CH3)-；Ar是1，4-苯基。
在80℃下，将如在实施例2中获得的150mg卤代硬葡聚糖溶于15mL的DMSO。在3小时之后，将溶液冷却到室温和加入在10mL DMSO中的512mg的MT。将反应混合物在室温下，在碱性试剂存在下，在氮气下和避光保护48小时条件下混合。然后将产物在250mL丙酮中沉淀和通过过滤收集，采用丙酮洗涤，悬浮在蒸馏水中和采用0.2N HCl中和，和再次采用丙酮沉淀。将固体在烘箱中在真空、室温下干燥。固体重量：80mg。
产物的分析：FT-IR光谱(Perkin-Elmer mod.1750)：在1730cm-1的谱带(KBr粒料)典型的酯键。1H NMR光谱(NMR Varian Inova500-500MHz)：在23℃下对溶于DMSO-d6/TFA的产物的扩散试验显示共价结合到多糖上的MT的存在。将产物采用1H NMR光谱，在DMSO-d6/TFA中在50℃下分析。从光谱的分析来看是显然的是由于MT的γ-亚甲基对信号的改进：质子不是当量的和它们分裂成两个多重峰(2.35e2.45ppm)，然而起始MT(即未键合到多糖上的MT)的相应基团特征为信号为三重峰的形式。由于羧酸的酯化的γ-质子的非当量，在杂双核光谱1H-13C HSQC(在32ppm的13C信号)中确认。
实施例4.卤代硬葡聚糖的制备
在80℃下，将300mg重均分子量为995000(如在实施例1中所述测量的)的硬葡聚糖悬浮在40mL无水DMF中和在80℃、氮气气氛下1小时保持混合。将混合物冷却到室温和然后将2.9g甲磺酰溴在0℃下加入到溶液中。将反应混合物在混合下保持另外30分钟和然后在80℃下加热16小时。将混合物冷却到室温和通过加入8mL的Milli-Q水而停止反应。将混合物采用0.1N NaOH中和，然后在减压下浓缩和倾入200mL丙酮中。将产物通过过滤收集，采用丙酮洗涤，在蒸馏水中悬浮，然后对蒸馏水透析和冷冻干燥。固体重量：290mg。
将产物采用13C NMR光谱分析，它显示如在实施例2中所述在伯羟基上发生卤化反应。
实施例5.硬葡聚糖与MT的酯化
在80℃下，将如在实施例4中获得的90mg卤代硬葡聚糖悬浮于20mL的DMSO。在4小时之后，将溶液冷却到室温和加入溶于20mL DMSO中的293mg的MT。在碱性试剂存在下，在混合下，在氮气下将反应混合物保持到室温，和避光保护48小时。然后将混合物倾入250mL丙酮中。将产物通过过滤收集，采用MeOH充分洗涤，过滤和最后在烘箱中在真空、室温下干燥。固体重量：90mg。
将产物采用1H NMR光谱在DMSO-d6/TFA中分析，它显示如在实施例3中共价结合到多糖上的MT的存在。
实施例6.卤代硬葡聚糖的制备
在80℃下，在混合下和在氮气下将600mg重均分子量为140000(如在实施例1中所述测量的)的硬葡聚糖悬浮在40mL无水DMF中1小时。将混合物冷却到室温和然后将5.9g甲磺酰溴在0℃下加入到溶液中。将反应混合物在混合下保持30分钟，然后在80℃下加热16小时。将混合物冷却到室温和通过加入8mL的Milli-Q水而停止反应。将混合物采用0.1N NaOH中和，在减压下浓缩和在200mL丙酮中沉淀。将产物通过过滤收集，采用丙酮洗涤，在蒸馏水中悬浮，然后对蒸馏水透析和冷冻干燥。重量：710mg。
将产物采用13C NMR光谱分析，它显示如在实施例2中所述化合物中观察到的在伯羟基上发生卤化反应。
实施例7.硬葡聚糖与MT的酯化
在80℃下，将在实施例6中获得的500mg卤代硬葡聚糖悬浮于110mL的DMSO中。在4小时之后，将溶液冷却到室温和加入在33mL DMSO中的1.63g的MT。在碱性试剂存在下，在混合下，在氮气下将反应混合物保持到室温，和避光保持48小时。然后将混合物在250mL丙酮中沉淀和通过过滤收集，采用丙酮洗涤，悬浮在蒸馏水中和采用0.2N HCl中和，再次采用丙酮沉淀。产物的重量(RG4900)：470mg。
将产物采用1H NMR光谱在DMSO-d6/TFA中分析，它显示如在实施例3中所述共价结合到多糖上的MT的存在。
实施例8.卤代硬葡聚糖的制备
在80℃下，将1g重均分子量为120000(如在实施例1中所述测量的)的透明质酸的四丁基铵盐悬浮在50mL DMF中，并在混合下和在氮气气氛下保持约1小时。将混合物冷却到室温。然后将1.28g甲磺酰溴在0℃下加入到溶液中。将反应混合物在混合下保持另外30分钟，然后在80℃下加热16小时。将混合物冷却到室温和通过加入约10mL的Milli-Q水而停止反应。将混合物采用0.1N NaOH中和，然后在减压下浓缩和倾入200mL丙酮中。将产物通过过滤收集，采用丙酮洗涤，悬浮在蒸馏水中，然后对蒸馏水中透析和冷冻干燥。固体重量：480mg。
将产物采用13C NMR光谱(DEPT)，在DMSO-d6/TFA中在50℃下分析。参与卤化的多糖的CH2-O(C6)的信号为34.5ppm，然而在未衍生多糖中的相同基团得到61ppm的信号。化学位移中的变化提供在葡萄糖残基的伯羟基上发生卤化反应的证据。
实施例9.透明质与MT的酯化
在80℃下，将如在实施例8中获得的50mg卤代透明质悬浮于5mL的DMSO。在2-3小时之后，将混合物冷却到室温和加入溶于2mL DMSO中的59mg的MT。在碱性试剂存在下，在混合下，在氮气气氛下将反应混合物保持到室温，和避光保护48小时。然后将混合物倾入50mL丙酮中。将产物通过过滤收集，采用MeOH充分洗涤，过滤和最后在烘箱中在真空、室温下干燥。固体重量：70mg。
将产物采用1H NMR光谱在DMSO-d6/TFA中分析，它显示共价结合到多糖上的MT的存在。
实施例10.本发明化合物对二氢叶酸还原酶活性的影响
向所需体积的蒸馏水中，以如下顺序，将试剂和测试样品加入到3ml一次性比色杯中：H2O(0.1-0ml)，1.5M乙酸钠缓冲剂(1ml)，1.8MKCl(1ml)，3mM NADPH(0.15ml)，在PBS中的测试溶液(0-0.1ml)，二氢叶酸还原酶(DHFR)(约0.01Uμl)(5ml)。所有的试剂均购自Sigma。将DHFR引入，混合和在30℃下培养2min。通过加入二氢叶酸(3mM，0.15ml)引发反应，随后是在340nm处吸光度随时间减少。测试溶液包含：a)MT(在实施例3中定义)，2.2×10-5M，b)数量相应于2×10-5M MT当量，如在实施例7中获得的本发明化合物(RG4900)。
包括对照溶液，它包含作为测试溶液的0.1ml PBS。
2.2×10-5M的MT测试浓度完全抑制二氢叶酸还原酶的活性。如称为MT的化合物RG4900的等摩尔浓度，并不抑制DHFR活性，如由等于对照反应的ΔA340证明。然而在反应开始时，在化合物存在下吸光度降低的速率略微低于对照反应。此观察到的化合物RG4900对DHFR的残余抑制作用可能是由于在制剂中存在的较低量的游离MT。最后，一旦酯键在合适细胞隔室中水解之后从前药中释放，大多数DHFR抑制活性由MT进行。
已经通过在不同pH下进行的几个试验研究酯水解的条件。在水解之后进行的DHFR抑制的测试证明水解体系的抑制活性。
实施例11.本发明化合物抗增生活性的体外分析
在如下几种肿瘤细胞系上进行本发明化合物RG4900多糖酯的抗增生活性：如SK-OV-3(人体细胞系)：卵巢癌细胞，HT29结肠癌细胞(人体细胞系)，NIH-H460肺癌细胞(人体细胞系)，L1210白血病细胞(鼠细胞系)。在添加有10％FCS的RPMI-1640介质(Sigma Chemical Co.，St.Louis)中，在生理叶酸盐浓度(2nM)下，在保持于37℃的50cm2塑料瓶(CorningIndustries，Corning，NY)中，在包含5％CO2的潮湿气氛下，将上述细胞系生长为单层。每周将它们传代到新鲜的介质中。在试验测试开始之前，采用胰蛋白酶的溶液将指数生长相从烧瓶中除去。然后将细胞接种到添加有10％FCS的RPMI-1640介质中的6孔盘中(30.000细胞/盘)。将细胞生长24小时，以促进粘合，然后将介质除去和采用试验介质置换。将细胞培养72或120小时。通过如下方式制备试验介质：在添加有10％FCS的RPMI-1640介质中，在0-5000μg/ml N-GA当量的不同最终浓度下，在本发明多糖酯的PBS缓冲剂中，稀释原液。采用在0-100μg/ml浓度范围的相应N-GA，进行对比测试。通过台盘蓝比色测定，它与有活力细胞的数目成比例，确定抗增生活性。
表1显示在实施例7化合物(RG4900)存在下，在治疗72和120小时之后，细胞系SK-OV-3(卵巢癌)的生长百分比。每个值是4个不同测试的平均值。被测试化合物的浓度称为在相应化合物中存在的MT数量。采用等于30.000细胞/盘的细胞密度进行试验。
表1
    化合物   浓度(ng/ml)   ％存活(72h)   ％存活(120h)
    RG4900     0     100     100.0
    ″     2.28     n.d.     106.5
    ″     6.58     83     76.0
    ″     20.5     84.5     45.0
    ″     60     55     13.0
    ″     185     46.5     5.5
    ″     550     38.5     3.0
    ″     1670     38.5     2.0
    ″     5000     32.5     1.0
从以上所示的数据，显然的是根据本发明的多糖酯发挥高的抗增生活性，它是时间和剂量依赖性的。
表2报导多糖酯和相应未衍生多糖(硬葡聚糖，MW的SC：140000)对SK-OV-3卵巢癌细胞存活的效果。在培养72和120小时之后，和在相应于MT的5μg/ml浓度的多糖酯浓度下，进行测试。
表2
    化合物     浓度(μg/ml)     ％存活
    RG4900(72小时)     0.34     32.5
    ″(120小时)     0.34     1.0
    SC(72小时)     0.34     95
    SC(120小时)     0.34     99
从以上数据看出未衍生聚合物(SC)没有效果。
表3显示本发明多糖酯和根据现有技术通过硬葡聚糖衍生制备的化合物(AB1)的IC50(必须将细胞生长降低到对照样生长50％的浓度)数值。
在治疗120小时之后进行不同肿瘤细胞系细胞样品的计数。本发明酯的浓度表达为在多糖酯上存在的MT数量(ng/ml)。
表3
    细胞系     化合物RG4900(ng/ml)   化合物AB1(ng/ml)
    SK-OV-3     18     800
    L1210     24     820
    HT29     20     410
    NIH-H460     430     Nd
表3显示的数据说明，相对于本发明的化合物，根据US5,554,386的实施例3制备的和测试为对比样的无规取代的MT-硬葡聚糖(AB1)，呈现非常高的IC50。这提供清楚的指示，即通过N-GA的选择取代，可获得本发明化合物抗增生活性的强烈积极效果。

Claims (30)

1.通式(I)化合物的多糖酯
                             式(I)
其中：
-R2和R4彼此独立地选自：-NH2、-OH、C1-C5烷基和包含两个氮原子的6元环是芳族的；
-X和Y选自：-C(R5)＝、-CH(R5)-、-N＝，其中R5表示：-H或C1-C5烷基；
-Z选自：-CH(R10)-、-N(R10)-，其中R10表示-H、C1-C5烷基；
-Ar是1，4-苯基；
其特征在于仅有多糖的单糖单元上存在的伯羟基与通式(I)化合物的γ-羧基部分或完全酯化。
2.根据权利要求1的多糖酯，其中：
-R2和R4彼此独立地选自-NH2或-OH；
-R5表示-H或-CH3。
3.根据权利要求1的多糖酯，其中：
-R2和R4是-NH2；
-X和Y是-N＝；
-Z是-N(R10)-，其中R10表示：-H或-CH3。
4.根据权利要求1的多糖酯，其中：
-R2和R4是-NH2；
-X和Y是-N＝；
-Z是-CH(C2H5)-。
5.根据权利要求1-4任一项的多糖酯，其中多糖是中性或阴离子的。
6.根据权利要求5的多糖酯，其中多糖是线性或支化的和由选自如下的单糖单元组成：D-葡萄糖、D-木糖、L-鼠李糖、D-半乳糖醛酸、D-葡萄糖醛酸、D-甘露糖醛酸、L-古洛糖醛酸、L-艾杜糖醛酸、D-果糖、N-乙酰基-D-葡糖胺、N-乙酰基-L-半乳糖胺、3，6-脱水-D-半乳糖、3，6-脱水-L-半乳糖。
7.根据权利要求5的多糖酯，其中该多糖的主链含有β-(1→3)、β-(1→2)、β-(1→4)-D-糖苷结构或α-(1→3)、α-(1→4)、α-(1→6)-糖苷结构和侧链，当存在时，由与如下构型结合的单糖组成：β-(1→2)、β-(1→3)、β-(1→4)、β-(1→6)、α-(1→4)或α-(1→6)。
8.根据权利要求7的多糖酯，其中该多糖是β-(1→3)-D-葡聚糖。
9.根据权利要求7的多糖酯，其中该多糖选自：硬葡聚糖、蘑菇多糖、裂裥菌素、茯苓多糖(pachimaran)、产碱杆菌多糖、昆布多糖。
10.根据权利要求7的多糖酯，其中该多糖是透明质酸或它的盐。
11.根据权利要求7的多糖酯，其中该多糖是硫酸化多糖。
12.根据权利要求11的多糖酯，其中该硫酸化多糖从Grateloupiaceae或Codiaceae科的藻类提取。
13.根据权利要求1-4任一项的多糖酯，其中多糖的单糖单元的至少一个羟基被选自如下的残基取代：C1-C6烷基、-COOH、-NH2、-NHCOCH3、-SO3H、-OPO3H2、-COO-(CH2)n-COOH、-COOR、-COR、-OR、-O-(CH2)n-OCOR，其中n＝1-4和R＝C1-C10烷基。
14.一种药物组合物，包括作为活性化合物的根据权利要求1-4任一项的多糖酯，与合适的药用赋形剂和/或稀释剂结合。
15.根据权利要求14的药物组合物，形式为溶液或悬浮液。
16.根据权利要求14的药物组合物，用于胃肠外、口服或局部给药。
17.根据权利要求16的药物组合物，其中胃肠外给药通过静脉内、肌内、关节内或皮下方式进行。
18.根据权利要求14的药物组合物，形式为凝胶、乳膏、粉末、粒状粉末、片剂、丸剂、胶囊或插入物。
19.根据权利要求1-4任一项的多糖酯用于制备治疗或预防类风湿性关节炎的药物的用途。
20.根据权利要求1-4任一项的多糖酯用于制备治疗和预防皮肤疾病的药物的用途。
21.根据权利要求1-4任一项的多糖酯用于制备治疗或预防银屑病的药物的用途。
22.根据权利要求14任一项的多糖酯用于制备治疗或预防肿瘤的药物的用途。
23.根据权利要求1-4任一项的多糖酯用于制备治疗和预防肠内炎症性病状的药物的用途。
24.一种根据权利要求1-4任一项的多糖酯的制备方法，包括如下步骤：
a)通过多糖的单糖单元的伯羟基的活化，获得区域选择性卤代多糖；
b)通过卤素原子的置换，在区域选择性卤代多糖和通式(I)化合物的羧基之间形成酯键。
25.根据权利要求24的方法，其中在步骤a)中的该活化通过多糖的卤化而进行。
26.根据权利要求25的方法，其中该卤化在进一步包括烷基或芳基卤化物的有机溶剂中进行。
27。根据权利要求26的方法，其中该烷基或芳基卤化物选自：甲磺酰溴、对甲苯磺酰溴、甲磺酰氯、对甲苯磺酰氯。
28.根据权利要求24的方法，其中在步骤b)中，在碱性试剂存在下，将在步骤a)中获得的卤代多糖悬浮在有机溶剂中，然后与悬浮在相同的有机溶剂中的通式(I)的化合物混合。
29.根据权利要求26的方法，其中该有机溶剂选自：二甲基甲酰胺、二甲亚砜、N-甲基吡咯烷酮。
30.根据权利要求28的方法，其中该有机溶剂选自：二甲基甲酰胺、二甲亚砜、N-甲基吡咯烷酮。
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