CN1673225A - 羟基喜树碱及其衍生物的碳酸酯前药、制备方法与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了通式(I)化合物、通式(II)化合物及通式(III)化合物，其制备方法，及其在体外血浆和酶中的稳定性与在肿瘤治疗中的应用。其中R表示C1～30直链或含支链烷基，C1～30含有不饱和键的烷基。R1表示H、C1～5直链或含支链烷基。R2表示H、CH2NR3R4，其中NR3R4的R3和R4表示H、C1～5烷基如甲基、乙基等，或者NR3R4表示含氮杂环，如哌啶、吗啉、哌嗪、甲基哌嗪等。
Description
技术领域
羟基喜树碱及其衍生物的10，20-双碳酸酯及10-碳酸酯和20-碳酸酯，其制备方法，及其在体外血浆和酶中的稳定性与在肿瘤治疗中的应用。
背景技术
喜树碱类药物自1994年上市第一个品种以来，由于其疗效确切，作用靶独特，已成为临床上使用最多的五大类抗肿瘤药物之一。喜树碱是由Wall等在1966年首次从中国特有的喜树中分离到的生物碱，因其独特的化学结构和显著的抗肿瘤活性，引起全世界相关人员的的重视。七十年代，喜树碱以其开环结构水溶性钠盐的形式进入临床研究，结果出现严重的骨髓抑制、呕吐、腹泻和严重出血等副作用，而且开环形式活性大大降低，使临床研究难以继续。1985年，John Hopkins大学的Hsiang等的研究结果表明，喜树碱是DNA拓扑异构酶I的特异性抑制剂，而拓扑异构酶I是细胞的一种核酶，与DNA的复制、转录、修复以及重组有关，其在细胞周期的任何阶段都有表达，且已知肿瘤细胞中拓扑异构酶I的含量比正常细胞中的含量高，因而这类抗肿瘤化合物具有一定的选择性。这一重大发现使喜树碱重新成为抗肿瘤药物研究的热点。研究的重点是增加该类化合物的水溶性。
1994年，美国FDA批准喜树碱的水溶性伊立替康(Irinotecan，CPT-11)上市，用于治疗结直肠癌。1996年，用作卵巢癌病人的二线治疗药物的拓扑替康(Topotecan)又获准上市，美国FDA又于1999年批准其作为小细胞肺癌(SCLC)的二线冶疗药物。羟基喜树碱在我国广泛使用多年，主治结肠癌、胃癌、肝癌和胰腺癌等消化系统肿瘤，以及慢性粒细胞性白血病、急性淋巴性白血病和卵巢癌等。处于临床研究阶段的有9-硝基喜树碱等数十个化合物及制剂。
但是，由于喜树碱及其衍生物的活性内酯环形式在人血浆中易被水解开环为相应的羧酸形式，而血浆中的白蛋白(HSA)一般优先与其羧酸形式结合，使得水解平衡向右移动，从而大大降低药物的生物利用度。另外，与白蛋白结合的羧酸形式被缓慢释放出来，产生滞后毒性。还由于药物和血浆白蛋白结合，导致药物在血浆中的有效浓度降低，使得药物不能有效达到病灶部位，这是其抗肿瘤谱狭窄的一个重要原因。因此，通过结构修饰增加内酯环的稳定性，改善其溶解性以利于制剂的制备，或者减少药物在血浆中的停留时间，使药物被快速吸收以及采用特殊的制剂，使药物有效到达靶组织就显得尤为重要。其中，酯类衍生物，尤其是脂溶性的酯类衍生物，不仅可以增加内酯环的稳定性，而且可以加快体内吸收速度，减少其在血液中的停留时间，吸收到靶组织后被裂解释放出活性原药，从而也减少了毒性。
近五年来，有关制备喜树碱及其衍生物的各种酯前药的文献大量涌现。归纳起来，包括以下几大类：喜树碱及其衍生物的20(S)脂肪酸酯、芳酸酯、芳或芳杂氧脂肪酸酯、氨基取代的羧酸酯、轭和物(conjugates)和高分子给药系统等。虽然国外学者在喜树碱类前药方面作了很多探索工作，但是他们大多以喜树碱作为母体化合物，如进入临床研究的Afeletecan、Prothecan以及camptothecin polyglutamate等，它们在血浆中被水解后释放出的活性成份是喜树碱。然而，喜树碱本身并无临床使用价值，目前临床使用的是10-羟基喜树碱、伊立替康和拓扑替康。这三个药物的10位都有羟基(10-羟基喜树碱和拓扑替康)或者其酯(伊立替康)。
发明内容
本发明要解决的技术问题是，提供在我国广泛使用的羟基喜树碱及其衍生物的10，20-双碳酸酯及10-碳酸脂和20-碳酸脂作为前药，同时提供其相应的制备方法以及在肿瘤治疗药物中的应用。
本发明要解决的技术问题包括用羟基喜树碱及其衍生物为起始原料，与相应的合适的氯甲酸酯反应，制备10，20-双碳酸酯及10-碳酸脂。选择性地脱除10，20-双碳酸酯的10位碳酸酯，得20-碳酸脂。这些化合物可以有效地增加内酯环的稳定性，延长活性内酯形式在血液中的半衰期，提高生物利用度，还可以降低毒性，同时有利于制剂的制备。
本发明的技术方案为：
下述通式(I)化合物、通式(II)化合物及通式(III)化合物
其中R表示C1～30直链或含支链烷基，C1～30含有不饱和键的烷基。R1表示H、C1-5直链或含支链烷基。R2表示H、CH2NR3R4，其中NR3R4的R3和R4表示H、C1～5烷基如甲基、乙基等，或者NR3R4表示含氮杂环，如哌啶、吗啉、哌嗪、甲基哌嗪等。
根据上述通式(I)化合物、通式(II)化合物及通式(III)化合物中，R代表的C1～30含有一个或多个不饱和键的烷基，是指含有一个或多个双键或三键的烷基。
当R2为CH2NR3R4时，则可以制成其相应的盐，如盐酸盐、磺酸盐、醋酸盐等。
前述任意一项的化合物可在肿瘤治疗药物中应用。
上述通式(I)化合物及通式(II)化合物的制备方法，该方法包括以下步骤：
a.羟基喜树碱及其衍生物与氯甲酸酯在碱的催化下以非极性溶剂二氯甲烷、氯仿、甲苯作溶剂，得通式(I)化合物；如果氯甲酸酯量是羟基喜树碱及其衍生物的1-2倍时，可以得到通式(I)化合物和通式(II)化合物的混合物；如果氯甲酸酯量是羟基喜树碱及其衍生物的2倍以上时，所得产物以通式(I)化合物为主。以极性溶剂，DMF、吡啶、三乙胺作反应溶剂，得通式(II)化合物，反应的温度为室温。得通式(I)化合物及通式(II)化合物：
方法A
b.通式(I)化合物选择性水解一个酯基，以水、甲醇、乙醇作溶剂，以碳酸钠、碳酸钾、氢氧化钠、氢氧化钾水溶液作碱，在-30℃～50℃反应1-24小时，稀酸调至中性，过滤；
c.通式(III)中R2＝H的化合物经过与Topotecan制备方法相同的Mannich反应，得到R2为NR3R4取代基的化合物。当R2＝N(CH3)2时，以R2＝H时的通式(III)化合物与CH2[N(CH3)2]2在正丙醇中室温反应得到。
方法A中其中R表示C1～30直链或含支链烷基，C1～30含有不饱和键的烷基。R1表示H、C1～5直链或含支链烷基。其中NR3R4的R3和R4表示H、C1～5烷基如甲基、乙基等，或者NR3R4表示含氮杂环，如哌啶、吗啉、哌嗪、甲基哌嗪等。
在不同的反应条件下可得到通式(I)化合物或通式(II)化合物，其中，当羟基喜树碱及其衍生物与过量氯甲酸酯反应时，如以非极性溶剂，如二氯甲烷、氯仿、甲苯等作溶剂，得通式(I)化合物；如果氯甲酸酯量是羟基喜树碱及其衍生物的1-2倍时，可以得到通式(I)化合物和通式(II)化合物的混合物；如以极性溶剂，如DMF、吡啶、三乙胺等作反应溶剂，得通式(II)化合物。
通式(I)化合物选择性水解一个酯基，可以以水、甲醇、乙醇等作溶剂，以碳酸钠、碳酸钾、氢氧化钠、氢氧化钾水溶液等作碱，在-30℃～50℃反应1-24小时，然后以稀酸调至中性产生沉淀，过滤即可。
前药是指在体外无生物活性或活性低，在体内裂解为活性成分发挥治疗作用的药物。其中，对于酯类前药而言，一般在体内经化学或者酶水解，释放出活性药物成分。因而，我们一般在体外考察所制备的酯类前药在血浆以及酶中的水解情况。
体外考察所制备前药在小鼠血浆以及pH7.4磷酸缓冲液中的稳定性
储备液：50μg/ml乙腈溶液
小鼠血浆：取普通昆明种小鼠(雌雄不分)血(加肝素)，离心，取上清液，分装后置冰箱中冷冻备用；
人血浆：取健康人血(加肝素)，离心，取上清液，分装后置冰箱中冷冻备用；pH7.4磷酸缓冲液：精密称取磷酸二氢钾1.36克，加0.1mol/l氢氧化钠溶液79毫升，用水稀释至200毫升，即得。
方法：将人血浆、小鼠血浆以及pH7.4的磷酸缓冲液0.8毫升分别加到三个2ml Appendorf塑料管中，放入37℃恒温水浴中保温半小时，加入以上储备液0.2ml，涡旋20s后，取样0.1ml，此三种溶液继续在37℃恒温水浴中保温。向所取0.1ml样品中加0.4ml冷冻(-30℃)乙腈，涡漩20s，离心3min(10000转/min)，取上清液进行HPLC分析得t＝0时积分面积。此后分别在0.5h，1h，2h，4h，6h，8h和24h分别取样，后处理同前。
百分含量的计算
色谱条件：MeOH/H2O
仪器：Hewlett HP1100
色谱柱：RP-C18，4.6*250mm
流速：1.0ml/min
进样量：10μl
样品：HCPTE1(羟基喜树碱-10，20-双异丁醇碳酸酯)、HCPTSIB10(羟基喜树碱-10-异丁醇碳酸酯)、HCPTSIB20(羟基喜树碱-20-异丁醇碳酸酯)以及TPTSIB(拓扑替康-20-异丁醇碳酸酯)。
(1)样品：HCPTE1
wave length 254nm
| t(h) | Human plasma | Mouse plasma | PH7.4 phosphate buffer | |||
| Area | ％ | Area | ％ | Area | ％ | |
| 0 | 212.6 | 100 | 16.7 | 100 | 89.4 | 100 |
| 0.5 | 143.4 | 67.45 | 7.2 | 43.11 | 71.8 | 80.31 |
| 1 | 105 | 49.39 | 0 | 0 | 70.7 | 79.08 |
| 2 | 72 | 33.87 | 0 | 0 | 69.9 | 78.19 |
| 4 | 16.4 | 7.71 | 0 | 0 | 55.9 | 62.53 |
| 6 | 0 | 0.00 | 0 | 0 | 48.9 | 54.70 |
| 8 | 0 | 0.00 | 0 | 0 | 48.8 | 54.59 |
| 24 | 0 | 0.00 | 0 | 0 | 43.3 | 48.43 |
测HCPTE1时，血浆中产生的羟基喜树碱-10-异丁醇碳酸酯(HCPTSIB10)的量wave length 254nm
| t(h) | Human plasma | Mouse plasma | PH7.4 phosphate buffer | |||
| Area | ％ | Area | ％ | Area | ％ | |
| 0 | 10.5 | / | 8.9 | 7.5 | / | |
| 0.5 | 7.6 | / | 7.9 | 7.4 | / | |
| 1 | 7.8 | / | 8.2 | 7.5 | / | |
| 2 | 8 | / | 7.2 | 7.1 | / | |
| 4 | 8.3 | / | 8.6 | 7.8 | / | |
| 6 | 7.3 | / | 8.4 | 7.7 | / | |
| 8 | 7.6 | / | 8.1 | 7.6 | / | |
| 24 | 8.5 | / | 7.6 | 6.8 | / | |
测HCPTE1时，血浆中产生的羟基喜树碱-20-异丁醇碳酸酯(HCPTSIB20)的量wave length 268nm]
| t(h) | Human plasma | Mouse plasma | PH7.4 phosphate buffer | |||
| Area | ％ | Area | ％ | Area | ％ | |
| 0 | 2.3 | / | 89.4 | 0 | / | |
| 0.5 | 17.7 | / | 87.2 | 0 | / | |
| 1 | 33.5 | / | 81.8 | 0 | / | |
| 2 | 51.1 | / | 81.2 | 0 | / | |
| 4 | 58.8 | / | 79.7 | 1.8 | / | |
| 6 | 88.2 | / | 74.7 | 1.8 | / | |
| 8 | 74.8 | / | 62.2 | 1.95 | / | |
| 24 | 43.2 | / | 41.2 | 4 | / | |
从以上数据可以看出，HCPTE1在小鼠血中的代谢速度比在人血中的快，与文献(J.Med.Chem.，1999，42：221-228)报道的一致。代谢产物羟基喜树碱-20-异丁醇碳酸酯维持了较高水平，而另外一个代谢产物羟基喜树碱-10-异丁醇碳酸酯的水平一直低很多(见积分面积)。
(2)样品：HCPTSIB10
wave length 254nm
| t(h) | Human plasma | Mouse plasma | PH7.4 phosphate buffer | |||
| Area | ％ | Area | ％ | Area | ％ | |
| 0 | 91 | 100 | 39.1 | 100 | 143.6 | 100 |
| 0.5 | 40 | 43.96 | 11.5 | 29.41 | 73.3 | 51.04 |
| 1 | 29.2 | 32.09 | 9.9 | 25.32 | 72.7 | 50.63 |
| 2 | 17 | 18.68 | 9.5 | 24.30 | 60.4 | 42.06 |
| 4 | 10.6 | 11.65 | 8.2 | 20.97 | 42.9 | 29.87 |
| 6 | 8.7 | 9.56 | 8.1 | 20.72 | 40.3 | 28.06 |
(3)样品：HCPTSIB20
wave length 254nm
| t(h) | Human plasma | Mouse plasma | PH7.4 phosphate buffer | |||
| Area | ％ | Area | ％ | Area | ％ | |
| 0 | 32.3 | 100 | 51.5 | 100 | 64.1 | 100 |
| 0.5 | 29.7 | 91.95 | 47.5 | 92.23 | 59.6 | 92.98 |
| 1 | 29.5 | 91.33 | 45 | 87.38 | 58.9 | 91.89 |
| 2 | 29.4 | 91.02 | 44.7 | 86.80 | 56.5 | 88.14 |
| 4 | 29.1 | 90.09 | 35.5 | 68.93 | 57 | 88.92 |
| 6 | 29.3 | 90.71 | 30.2 | 58.64 | 47.2 | 73.63 |
| 8 | 29.1 | 90.09 | 29.2 | 56.70 | 40.2 | 62.71 |
(4)样品：TPTSIB
wave length 268nm
| t(h) | Human plasma | Mouse plasma | PH7.4 phosphate buffer | |||
| Area | ％ | Area | ％ | Area | ％ | |
| 0 | 13.9 | 100 | 9.8 | 100 | 5.8 | 100 |
| 0.5 | 13.0 | 93.53 | 9.2 | 93.88 | 5.3 | 91.38 |
| 1 | 11.5 | 82.73 | 9.1 | 92.86 | 5.2 | 89.66 |
| 2 | 10.7 | 76.98 | 8.8 | 89.80 | 5.1 | 87.93 |
| 4 | 9.5 | 68.35 | 8.5 | 86.73 | 5.2 | 89.66 |
| 6 | 8.9 | 64.03 | 7.2 | 73.47 | 4.8 | 82.76 |
| 8 | 8.3 | 59.71 | 7.4 | 75.51 | 5.0 | 86.21 |
总之，20-位碳酸酯(HCPTSIB20和TPTSIB)的代谢速度比10-位碳酸酯慢的多。化合物在体外酯酶中的稳定性研究
Pork liver esterase in 3.2M ammonium sulfate(142U/mg)：从Flucka公司购买。
储备液：精密称取HCPTE1(2.5mg)、HCPTSIB20(2.5mg)和TPTSIB(3.5mg)，置50ml容量瓶中，加入配药用DMSO(0.5ml)和Tween 80(0.5ml)，微热使溶解后，以蒸馏水稀释至刻度备用。(注：HCPTE1、HCPTSIB20溶液有固体析出，且前者析出更多)。
酶脱盐(desalt)：取以上猪肝溶液1.0ml，用500ml Tris-HCl缓冲液(0.01M，pH8.0)于4℃冰柜中透析6小时，然后更换新鲜500ml Tris-HCl缓冲液，隔6小时后再更换一次过夜。第二天，取出透析袋，将酶转移到Appendorf中，约2.5ml。于4℃离心机中离心15min(10000转/min)，除去沉淀物，将上清液分装到小塑料管(200μl/管)中，带回，置-20℃冰箱保存。此时活性约为50U/mg。
实验方案：
将以上储备液(0.75ml)、0.01M Tris-HCl缓冲液(pH8.0)和冷冻过的酶置30℃恒温水浴中预热10min。然后将0.74ml 0.01M Tris-HCl缓冲液(pH8.0)和40μl酶加到储备液中，涡旋混匀后置30℃恒温水浴中保温，10min、20min、40min和80min后分别取样进行HPLC分析(甲醇/水60/40)，分别得到t＝10min、t＝20min、t＝40min和t＝80min时的积分面积。
为了消除由于pH8.0的Tris-HCl缓冲液对酯的降解，在做了酶降解之后，按照同样的比例，将酶换为蒸馏水，按照相同的方法，涡旋混匀后立即进行HPLC分析，得到t＝0min时的积分面积。取样后将溶液放回恒温水浴继续保温，分别于t＝10min、t＝20min、t＝40min和t＝80min进行HPLC分析，得到相应的积分面积，作为对照。这样可以扣除化学降解的贡献。
另外，由于HCPTE1为双酯，故酶的量加倍，为80μl。
原药百分含量的计算
具体结果如下：
表1实施例3化合物被猪肝酯酶的裂解研究结果(检测波长254nm)
| 加酶 | 不加酶 | |||
| Area | ％ | Area | ％ | |
| t＝0min | 228 | 100 | 228 | 100 |
| t＝10min | 3 | 1.3 | 221 | 96.9 |
| t＝20min | 4.2 | 1.8 | 220 | 96.5 |
| t＝40min | 2.2 | 1 | 223 | 97.8 |
| t＝80min | 0 | 0 | 220 | 96.5 |
表2实施例5化合物被猪肝酯酶的裂解研究结果(检测波长268nm)
| 加酶 | 不加酶 | |||
| Area | ％ | Area | ％ | |
| t＝0min | 98.6 | 100 | 98.6 | 100 |
| t＝10min | 0 | 0 | 92.1 | 93.4 |
| t＝20min | 0 | 0 | 84 | 85.2 |
| t＝40min | 0 | 0 | 79 | 80.1 |
| t＝80min | 0 | 0 | 81 | 82.2 |
表3实施例6化合物被猪肝酯酶的裂解研究结果(检测波长268nm)
| 加酶 | 不加酶 | |||
| Area | ％ | Area | ％ | |
| t＝0min | 380 | 100 | 380 | 100 |
| t＝10min | 16.4 | 43.2 | 348.5 | 91.7 |
| t＝20min | 0 | 0 | 232 | 61.1 |
| t＝40min | 0 | 0 | 204 | 53.7 |
| t＝80min | 0 | 0 | 104.7 | 27.6 |
结论：羟基喜树碱-20-异丁醇碳酸酯(HCPTSIB20)、拓扑替康-20-异丁醇碳酸酯(TPTSIB)和羟基喜树碱-10，20-双异丁醇碳酸酯(HCPTE1)能被猪肝酯酶以较快速降解，符合前药的原理。
体外抗肿瘤活性筛选
实施例3～6化合物对P388肿瘤细胞生长的抑制率％
实施例3～6化合物对A549肿瘤细胞生长的抑制率％
从以上数据可以看出，羟基喜树碱和拓扑替康的10位或20位成碳酸酯后，毒性降低，符合前药原理。
具体实施方式
下面的实施例可使本专业技术人员更全面地理解本发明，但不以任何方式限制本发明。
实施例1 10-乙氧羰氧基-20-乙氧羰基喜树碱的制备
将羟基喜树碱(200mg)混悬在二氯甲烷(15ml)中，加入无水吡啶(2ml)，在冰水浴冷却下缓慢加入氯甲酸乙酯(1.5ml)，室温搅拌6小时，加入二氯甲烷(40ml)稀释，分别以水、稀盐酸、水、饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥。柱层析，得淡黄色固体250mg，收率89.2％。1HNMR(δ，ppm，CDCl3)：0.99(t，3H)，1.28(t，3H)，1.43(t，3H)，1.96(q，2H)，4.16(q，2H)，4.39(q，2H)，5.28(s，2H)，5.41(d，1H，J＝17Hz)，5.68(d，1H，J＝17Hz)，7.32(s，1H)，7.67(dd，1H，J＝9.2 and 2.6Hz)，7.78(d，1H，J＝2.6Hz)，8.23(d，1H，J＝9.2Hz)，8.35(s，1H)。EIMS(m/z)：508。
实施例2 10-正丁氧羰氧基-20-正丁氧羰基喜树碱的制备
将羟基喜树碱(200mg)混悬在二氯甲烷(15ml)中，加入无水吡啶(2ml)，在冰水浴冷却下缓慢加入氯甲酸丁酯(1.5ml)，室温搅拌6小时，加入二氯甲烷(40ml)稀释，分别以水、稀盐酸、水、饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥。柱层析，得淡黄色固体255mg，收率81％。1HNMR(δ，ppm，CDCl3)：0.90(t，3H)，1.00(m，6H)，1.25-1.80(m，8H)，1.96(m，1H)，2.15(m，1H)，4.14(q，2H)，4.33(q，2H)，5.30(s，2H)，5.38(d，1H，J＝17Hz)，5.68(d，1H，J＝17Hz)，7.32(s，1H)，7.68(dd，1H，J＝9.3 and 2.6Hz)，7.79(d，1H，J＝2.6Hz)，8.24(d，1H，J＝9.3Hz)，8.36(s，1H)。EIMS(m/z)：564。
实施例3 10-异丁氧羰氧基-20-异丁氧羰基喜树碱的制备
将羟基喜树碱(500mg)混悬在二氯甲烷(50ml)中，加入无水吡啶(6ml)，在冰水浴冷却下缓慢加入氯甲酸异丁酯(4ml)，室温搅拌过夜，加入二氯甲烷(100ml)稀释，分别以水、稀盐酸、水、饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥。柱层析，得淡黄色固体620mg，收率80％。1HNMR(δ，ppm，CDCl3)：0.91-1.05(m，15H)，1.97(m，1H)，2.13(m，2H)，2.28(m，1H)，3.86(m，2H)，3.95(d，2H)，5.29(s，2H)，5.42(d，1H，J＝17.4Hz)，5.68(d，1H，J＝17.4Hz)，7.26(s，1H)，7.67(dd，1H，J＝9.0 and 2.7Hz)，7.78(d，1H，J＝2.6Hz)，8.24(d，1H，J＝9.0Hz)，8.36(s，1H)。EIMS(m/z)：564。
实施例4 10-异丁氧羰氧基喜树碱的制备
将羟基喜树碱(200mg)溶于DMF(30ml)中，加入无水吡啶(2ml)，在冰水浴冷却下缓慢加入氯甲酸异丁酯(4ml)，室温搅拌过夜。蒸干DMF后，加入二氯甲烷(100ml)稀释，分别以水、稀盐酸、水、饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥。柱层析，得淡黄色固体140mg，收率55％。1HNMR(δ，ppm，DMSO-d6)：0.86(t，3H)，0.96(d，6H)，1.87(m，2H)，2.01(m，1H)，4.06(d，2H)，5.29(s，2H)，5.41(s，2H)，7.35(s，1H)，7.76(dd，1H，J＝9.1 and 2.7Hz)，8.02(d，1H，J＝2.7Hz)，8.21(d，1H，J＝9.1Hz)，8.67(s，1H)。EIMS(m/z)：464。
实施例5 20-异丁氧羰基喜树碱的制备
将实施例3化合物(300mg)加到反应瓶中，冰浴冷却下加入1N氢氧化钠水溶液(30ml)，反应4小时后，以稀盐酸中和至中性，过滤，干燥，柱层析，得淡黄色固体178mg，收率71％。1HNMR(δ，ppm，DMSO-d6)：0.84(t，9H)，1.88(m，1H)，2.16(m，2H)，3.88(d，2H)，5.25(s，2H)，5.49(s，2H)，6.95(s，1H)，7.29(d，1H，J＝2.7Hz)，7.42(dd，1H，J＝9.2 and 2.7 Hz)，8.01(1H，d，J＝9.2Hz)，8.46(1H，s)。EIMS(m/z)：464。
实施例6 9-二甲氨甲基-20-异丁氧羰基喜树碱的制备
将实施例5化合物(100mg)加到反应瓶中，加入二氯甲烷(10ml)和正丙醇(20ml)，然后加入双二甲氨基甲烷(0.5ml)，室温搅拌过夜。蒸干后，加入二氯甲烷(100ml)稀释，分别以水、稀盐酸、水、饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥。柱层析，得淡黄色固体60mg，收率53.6％。1HNMR(δ，ppm，DMSO-d6)：0.80-0.92(m，9H)，1.87(m，1H)，2.13(m，2H)，2.33(m，2H)，2.49(s，6H)，3.86(d，2H)，5.26(s，2H)，5.47(s，2H)，6.94(s，1H)，7.50(d，1H，J＝9.2Hz)，7.95(d，1H，J＝9.2Hz)，8.71(s，1H)。ESI-MS(m/z)：521。
实施例7 7-乙基-10-异丁氧羰氧基-20-异丁氧羰基喜树碱的制备
将7-乙基-10-羟基喜树碱(100mg)混悬在二氯甲烷(10ml)中，加入无水吡啶(0.6ml)，在冰水浴冷却下缓慢加入氯甲酸异丁酯(0.8ml)，室温搅拌过夜，加入二氯甲烷(10ml)稀释，分别以水、稀盐酸、水、饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥。柱层析，得淡黄色固体121 mg，收率80.1％。1HNMR(δ，ppm，CDCl3)：0.90-1.05(m，15H)，1.39(t，3H)，1.95-2.18(m，4H)，3.17(q，2H)，3.91(m，2H)，4.11(d，2H)，5.26(s，2H)，5.39(d，1H，J＝17.4Hz)，5.69(d，1H，J＝17.4Hz)，7.31(s，1H)，7.67(dd，1H)，7.94(d，1H)，8.24(d，1H)；EIMS(m/z)：592。
实施例8 7-乙基-10-乙氧羰氧基-20-乙氧羰基喜树碱的制备
将7-乙基-10-羟基喜树碱(100mg)混悬在二氯甲烷(10ml)中，加入无水吡啶(0.6ml)，在冰水浴冷却下缓慢加入氯甲酸乙酯(0.8ml)，室温搅拌过夜，加入二氯甲烷(10ml)稀释，分别以水、稀盐酸、水、饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥。柱层析，得淡黄色固体115mg，收率84.1％。1HNMR(δ，ppm，CDCl3)：0.99(t，3H)，1.28-1.47(m，8H)，2.05-2.18(m，2H)，3.17(m，2H)，4.18(m，2H)，4.42(q，2H)，5.26(s，2H)，5.39(d，1H)，5.69(d，1H)，7.33(s，1H)，7.67(dd，1H)，7.94(d，1H)，8.26(d，1H)。EIMS(m/z)：536。
实施例9 7-乙基-10-正丁氧羰氧基-20-正丁氧羰基喜树碱的制备
将7-乙基-10-羟基喜树碱(100mg)混悬在二氯甲烷(10ml)中，加入无水吡啶(1ml)，在冰水浴冷却下缓慢加入氯甲酸正丁酯(0.5ml)，室温搅拌6小时，加入二氯甲烷(30ml)稀释，分别以水、稀盐酸、水、饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥。柱层析，得淡黄色固体117mg，收率81％。1HNMR(δ，ppm，CDCl3)：0.90(t，3H)，1.00(m，6H)，1.25-1.80(m，8H)，1.96-2.18(m，4H)，3.17(q，2H)，4.14(q，2H)，4.33(q，2H)，5.30(s，2H)，5.38(d，1H，J＝17Hz)，5.68(d，1H，J＝17Hz)，7.32(s，1H)，7.68(dd，1H，J＝9.3 and 2.6Hz)，7.79(d，1H，J＝2.6Hz)，8.24(d，1H，J＝9.3Hz)，8.36(s，1H)。EIMS(m/z)：592。
实施例10 7-乙基-10-乙氧羰氧基喜树碱的制备
将7-乙基-10-羟基喜树碱(100mg)溶于DMF(15ml)中，加入无水吡啶(2ml)，在冰水浴冷却下缓慢加入氯甲酸乙酯(0.6ml)，室温搅拌过夜。蒸干DMF后，加入二氯甲烷(100ml)稀释，分别以水、稀盐酸、水、饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥。柱层析，得淡黄色固体90mg，收率76％。1HNMR(δ，ppm，DMSO-d6)：0.86-0.98(m，6H)，1.42(t，3H)，1.87-2.15(m，4H)，3.96(d，2H)，5.29(s，2H)，5.41(s，2H)，7.33(s，1H)，7.67(dd，1H)，7.94(d，1H)，8.26(d，1H)。EIMS(m/z)：464。
实施例11 7-乙基-20-乙氧羰基喜树碱的制备
将实施例8化合物(100mg)加到反应瓶中，冰浴冷却下加入1N氢氧化钠水溶液(10ml)，反应4小时后，以稀盐酸中和至中性，过滤，干燥，柱层析，得淡黄色固体52mg，收率60.5％。1HNMR(δ，ppm，DMSO-d6)：0.84-0.97(m，6H)，1.44(t，3H)，1.88-2.16(m，4H)，3.88(d，2H)，5.25(s，2H)，5.49(s，2H)，7.33(s，1H)，7.67(dd，1H)，7.94(d，1H)，8.26(d，1H)。EIMS(m/z)：464。
Claims (10)
1、羟基喜树碱衍生物下述通式(I)化合物、通式(II)化合物及通式(III)化合物
其中R表示C1～30直链或含支链烷基，C1～30含有不饱和键的烷基；R1表示H、C1～5直链或含支链烷基；R2表示H、CH2NR3R4，其中NR3R4的R3和R4表示H、C1～5烷基如甲基、乙基，或NR3R4表示含氮杂环，如哌啶、吗啉、哌嗪、甲基哌嗪。
2.根据权利要求1所述的羟基喜树碱衍生物通式(I)化合物、通式(II)化合物及通式(III)化合物，其特征在于：R代表的C1～30含有一个或多个不饱和键的烷基，是指含有一个或多个双键或三键的烷基。
3.根据权利要求1所述的羟基喜树碱衍生物通式(III)化合物，其特征在于：R2代表的CH2NR3R4的R3和R4表示H、C1～5烷基如甲基、乙基，或NR3R4表示含氮杂环，如哌啶、吗啉、哌嗪、甲基哌嗪。
4.根据权利要求1所述的羟基喜树碱衍生物通式(III)化合物，其特征在于：当R2为CH2NR3R4时，则其相应的盐为盐酸盐、磺酸盐、醋酸盐。
5.如权利要求1所述的羟基喜树碱衍生物通式(I)化合物、通式(II)化合物及通式(III)化合物的制备方法，其特征在于该方法包括以下步骤：
a.羟基喜树碱及其衍生物与氯甲酸酯在碱的催化下在合适的溶剂中反应，得通式(I)化合物及通式(II)化合物；
方法A
b.通式(I)化合物经选择性水解一个酯基得到通式(III)中R2＝H的化合物；
c.通式(III)中R2＝H的化合物经过与Topotecan制备方法相同的Mannich反应，得到R2为NR3R4取代基的化合物；
方法A中，R表示C1～30直链或含支链烷基，C1～30含有不饱和键的烷基；R1表示H、C1～5直链或含支链烷基；其中NR3R4的R3和R4表示H、C1～5烷基如甲基、乙基，或NR3R4表示含氮杂环，如哌啶、吗啉、哌嗪、甲基哌嗪。
6.根据权利要求5所述的羟基喜树碱衍生物通式(I)化合物及通式(II)化合物的制备方法，其特征在于，以非极性溶剂二氯甲烷、氯仿、甲苯作溶剂，得通式(I)化合物；如果氯甲酸酯量是羟基喜树碱及其衍生物的1-2倍时，可以得到通式(I)化合物和通式(II)化合物的混合物；如果氯甲酸酯量是羟基喜树碱及其衍生物的2倍以上时，所得产物以通式(I)化合物为主。以极性溶剂，DMF、吡啶、三乙胺作反应溶剂，得通式(II)化合物。
7.根据权利要求5所述的羟基喜树碱衍生物通式(I)化合物及通式(II)化合物的制备方法，其特征在于，反应的温度为室温。
8.根据权利要求5所述的羟基喜树碱衍生物通式(III)化合物的制备方法，其特征在于，通式(I)化合物选择性水解一个酯基，以水、甲醇、乙醇作溶剂，以碳酸钠、碳酸钾、氢氧化钠、氢氧化钾水溶液作碱，在-30℃～50℃反应1-24小时，稀酸调至中性，过滤。
9.根据权利要求5所述的羟基喜树碱衍生物通式(III)化合物的制备方法，其特征在于，当R2＝N(CH3)2时，以R2＝H时的通式(III)化合物与CH2[N(CH3)2]2在正丙醇中室温反应得到。
10.如权利要求1～4所述的羟基喜树碱通式(I)化合物、通式(II)化合物、通式(III)化合物中任意一项的化合物在肿瘤治疗药物中的应用。
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