CN103627772A

CN103627772A - 一种雷公藤内酯醇衍生物的制备方法及其产物和应用

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Publication number: CN103627772A
Application number: CN201310598500.5A
Authority: CN
Inventors: 张景红; 谢深霞; 唐圆圆
Original assignee: Huaqiao University
Current assignee: Huaqiao University
Priority date: 2013-11-21
Filing date: 2013-11-21
Publication date: 2014-03-12
Anticipated expiration: 2033-11-21
Also published as: CN103627772B

Abstract

本发明提供一种雷公藤内酯醇衍生物的制备方法及其产物和应用，该制备方法以雷公藤内酯醇为微生物代谢药物，通过特殊诱导子对微生物代谢雷公藤内酯醇，同时得到多种、高产率的基于雷公藤内酯醇的羟基和或甲基化修饰的雷公藤内酯醇衍生物，这些雷公藤内酯醇衍生物具有抑制肿瘤、艾滋病和乙肝病毒的良好作用。本发明方法绿色环保、选择性强、产率高，能够大规模利用微生物制备雷公藤内酯醇衍生物。

Description

一种雷公藤内酯醇衍生物的制备方法及其产物和应用

【技术领域】

本发明涉及一种雷公藤内酯醇衍生物的制备方法及其产物和应用。

【背景技术】

卫矛科植物雷公藤（Tripterygium wilfordii Hook.F.），收载于《滇南本草》，其产地主要分布在中国南部，包括浙江、湖南、安徽、云南、福建和台湾等地，其中以福建泰宁产的雷公藤质量为最优（Zhou ZL,Yang YX,DingJ.et al Triptolide:structural modifications,structure–activity relationships,bioactivities,clinical development and mechanisms,Nat.Prod.Rep.,2012,29,457–475.）。而雷公藤甲素（Triptolide，TP，雷公藤内酯醇）属二萜环氧类化合物，是雷公藤主要的活性成分之一，其在抗癌、抗炎、抗生育、抗血管生成以及免疫抑制等方面表现出了突出的药理活性，其对美国国家癌症研究所(National Cancer Institute,NCI)，所列出的全部60种癌细胞均具有良好的抗肿瘤活性，为此，雷公藤甲素在肿瘤和免疫抑制药物开发方面，显示了巨大的应用前景。然而，雷公藤内酯醇在消化系统、血液循环系统以及泌尿生殖系统中严重的毒副作用和极低的水溶性，限制了其研发进程和临床应用。

国内外学者成功运用化学法对雷公藤内酯醇进行羟基化和甲基化的修饰改造，其中化学合成法合成的衍生物包括：15、16-羟基雷公藤内酯醇、1β、2β-羟基雷公藤内酯醇（分别由以下专利公开（Michel J,J,Mahinda,W,Michael,H,et al,Triptolide derivatives useful in the treatment of autoimmunediseases,US Patent1999/6004999,1999-12-21），（Yuan,HW,John H,W,Dai,DC,et al,Triptolide lactone derivatives as immunomodulators and anticanceragent,US Patent2010/0331554,2010-12-30.），（Dai,DC and John H,W,Triptolide derivatives as immunomodulators and anticancer agents,PCTWO2004/058246A1,2004-07-15.））;5α-羟基雷公藤内酯醇（由以下文献公开：LLDT-8;（Li,YC,Zou JP,Zhang F,Triptolide derivatives and their uses,US Patent US2009/7626044B2,2009-12-01.）,（李援朝，左建平，张凡，周茹，丁健。雷公藤内酯醇衍生物及其应用。中国专利，ZL03102976.02003-01-23）），5α，6α、5β，6β–双羟基雷公藤内酯醇（分别由以下专利公开：（Li,YC,Zou JP,Zhang F,Triptolide derivatives and their uses,US PatentUS2009/7626044B2,2009-12-01.），（Dai,DC and John H,W,Yuan,HW,Triptolide5,6derivatives as immunomodulators and anticancer agents andtheir uses,US Patent US2010/7820834B2,2010-10-26.））；19-甲基雷公藤内酯醇（由以下专利公开：.H.袁，J.H.马瑟,D.戴。用作免疫调节药和抗癌药的雷公藤内酯醇环衍生物，中国专利号，200580006875.1,2005-03-02.），修饰后的产物提高了水溶性，其中LLDT-8正在中国进行治疗关节炎的临床一期实验。虽然化学修饰为大规模制备雷公藤内酯醇相关衍生物提供了广阔的前景，但是但化学合成法存在得率低、选择性差、副产品多、过程较繁杂等缺点，具有一定的局限性。

而在另一方面，利用具有仿生代谢能力的微生物直接通过微生物特殊的酶促作用直接转化生物雷公藤内酯醇产生多种体内代谢、减毒后的雷公藤内酯醇的衍生物也取得了一定的效果，例如，Ning等用短刺小克银汉霉（Cunninghamella blakesleeana）生物转化雷公藤甲素，可以同时得到1β、2β、5α、15、16、19α、19β位羟基化7种羟基化产物，而且各种产物抑制肿瘤的活性显著，其毒性均小于雷公藤甲素，通过比较也不难发现虽然小克银汉霉菌属对雷公藤类化合物的转化虽然比较完全，但其转化率都较低，其中转化率最大的代谢产物5α-羟基雷公藤甲素也只有18%。因此，需要利用生物工程技术优化和完善该技术，进而提高转化产物的产率，以此得到更多的雷公藤内酯醇衍生物。

【发明内容】

本发明要解决的技术问题之一，在于提供一种雷公藤内酯醇衍生物的制备方法，该方法绿色环保、选择性强、产率高，能够大规模利用微生物制备雷公藤内酯醇衍生物。

本发明是这样实现的上述技术问题之一的：

一种雷公藤内酯醇衍生物的制备方法，包括以下步骤：

步骤一：取保存于4℃、土豆斜面培养基培养的、转化菌种一支，置于25℃恒温培养箱中培养7天后，以适量无菌水将斜面上的孢子充分吹打下来，使单孢子悬液的浓度调整至10⁷～10⁸个/mL，既得种子孢子液；

步骤二：以100ml，5mL的接种量，在土豆液体培养基上接种步骤一所得孢子液，在pH至6.0，温度30℃±1℃，振荡速度为200r/min条件下培养12h后；按0.1～4ug的接种量，加入各种不同比例的联合诱导子，继续培养12h后，再按1～10ug的接种量加入雷公藤内酯醇，然后继续培养5天，每天检测各种雷公藤内酯醇衍生物的含量和转化率，当产物转化率低至0.5～3%时，停止培养，过滤后收集菌丝体，然后将滤液于8000r/min,离心10min去除沉淀既得到发酵提取液；

步骤三：将步骤二所得提取液过滤，滤液用等体积的乙酸乙酯萃取3遍，合并萃取液；而菌丝体则用重量比为1：3～1：10的乙酸乙酯超声提取30min，然后滤去菌丝体，所得滤液与萃取液合并，既得分离提取液，提取液浓缩至干，得到提取后残渣；

步骤四：将经过步骤三处理所得的残渣，用1mg：1～10mL的比例用丙酮溶解后，采用硅胶拌样后挥干，称取20倍于样品量的硅胶，使用湿法进行填柱和上样；首先用5倍柱体积的100%石油醚将样品中低极性油类物质洗脱干净，然后依次用体积比为：10:1，8:1，6:1，4:1，2:1，1:1，1:2，1:4，1:6，1:8的石油醚：乙酸乙酯洗脱液，依次对柱子进行洗脱，最后用100%乙酸乙酯再洗脱柱子，TLC控制收集主馏分，最后使用旋转蒸发仪将各个馏分的流动相蒸干后，用适量色谱纯的甲醇溶解后，用0.22μm的有机膜过滤后，得到分离液；

步骤五：将经过步骤四处理所得的分离液，采用高效液相半制备法分离纯化，HPLC梯度洗脱法控制收集不同的雷公藤内酯醇衍生物洗脱液，减压蒸去溶剂后，用甲醇结晶后所得到的化合物，即为所述的雷公藤内酯醇衍生物。

进一步地，所述的土豆培养基为：土豆200g/L，葡萄糖20g/L；配置时将土豆去皮后将其切成小块，加水加热煮沸30min，过滤，取滤液定容至1L，加入葡萄糖20g，搅拌溶解后，121℃灭菌30min，即得；斜面培养基为：取上述土豆培养基1L，加入琼脂粉各20g，加热溶解后分装于玻璃试管中，于121℃下灭菌30min后取出，倾斜45度，静置、冷却既得。

进一步地，所述的转化菌种为下述微生物中任意一种：

短刺小克银汉霉（Cunninghamella blakesleana)AS 3.970;AS 3.153;AS 3.910；AS 3.954,AS 3.2016;AS 3.2017;AS 3.2018;AS 3.3401;或者刺孢小克银汉霉（Cunninghamella echinulata)AS 3.154;AS 3.952;AS 3.953;AS3.1969;AS3.1970;AS3.1971;AS3.1977;AS3.1978;AS3.1979;AS3.1980;AS3.1981;AS3.1987;AS3.1988;AS3.1989;AS3.1990;AS3.2000;AS3.2004;AS3.2005;AS3.2006;AS3.2011;AS3.2015;AS3.2473;AS3.2474;AS3.2475;AS3.2716;AS3.400;或者雅致小克银汉霉（Cunninghamella elegans.）AS3.156;AS3.1207;AS3.1659;AS3.2028;AS3.2031;AS3.2032;AS3.2033;AS3.2041;AS3.2476;AS3.2477;AS3.2717;AS3.3402;AS3.2476;小克银汉霉CFCC5029;或者Cunninghamella echinulata var.elegans(Lendner)Lunn etShipton,teleomorph ATCC 9245；ATCC 8688a；ATCC 8983；或者Cunninghamella echinulata(Thaxter)Thaxter var.echinulata,teleomorph ATCC11585a；ATCC36190；ATCC 11585b；ATCC9244；或者Cunninghamellaechinulata var.elegans(Lendner)Lunn et Shipton,teleomorph ATCC 11064；ATCC10028a；或者Cunninghamella elegans ATCC36112；ATCC26269；ATCC10028b；黑曲霉Aspergillus niger AS3.40;AS3.315;AS3.316;AS3.350;AS3.429;AS3.739;、AS3.879;AS3.939;AS3.940;AS3.1858;AS3.2931;AS3.3882;AS3.3883;AS3.4303;AS3928;AS3.4304;AS3.4309;AS3.4463;AS3.4304;AS3.4523;黄曲霉、刺囊毛霉、细孢毛霉、链格孢、微紫青霉和荨麻青霉。

进一步地，所述的联合诱导子为下述三组物质的至少两组中的任意一种物质组成：

A组：A1为α-环糊精，A2为β-环糊精，A3为2,6-二甲基-β-环糊精，A4为2-羟丙基-β-环糊精，A5为甲基化-β-环糊精、A6为羟乙基-β-环糊精，A7为葡萄糖-β-环糊精，A8为磺丁基-β-环糊精，A9为γ-环状糊精，A10为羧甲基-β-环糊精；

B组：B1为茉莉酸甲酯，B2为水杨酸，B3为壳聚糖，B4为茉莉酸，B5为真菌聚糖类，B6为β-葡聚糖，B7为谷胱甘肽，B8为2-羟乙基茉莉，B9为油菜素内酯，B10为云酯，B11为甲壳素；B12为小克银汉霉属AL4粗诱导子；

C组：C1为卡马西平，C2为莫达非尼，C3为奈韦拉平，C4为利福平，C5为贯叶连翘，C6为异烟肼，C7为胰岛素，C8为奥美拉唑，C9为苯巴比妥，C10为泼尼松，C11为泼尼松龙,C12为地塞米松，C13为倍他米松，C14为倍氯米松，C15为戊酸倍他米松，C16为醋酸地塞米松，C17为9-氟-16α-甲基11β，17-二羟基-3-氧-1，4-雄二烯-17β-羧酸。

进一步地，所述TLC控制收集主馏分，用体积比为85：5的氯仿和甲醇为展开剂；

所述产物转化率的高效液相色谱检测方法为：色谱柱Agilent ZORBAXEclipse XDB-C18柱，其中分析柱内径乘以长度为4.6mm×250mm，粒径为5μm；雷公藤内酯醇检测波长：218nm；温度：室温；进样量：10μL；

所述梯度洗脱法控制不同的雷公藤衍生物的高效液相色谱检测方法为：色谱柱Agilent ZORBAX Eclipse XDB-C18柱，其中分析柱内径乘以长度为4.6mm×250mm，粒径为5μm；吸收波长：218nm；

流动相：乙腈：水的体积比和洗脱时间分别如下：10：90、洗脱时间0min；16：84、洗脱时间10min；30：70、洗脱时间36min；30：70、洗脱时间50min，10：90、洗脱时间53min；10：90、洗脱时间60min；

上述对应的流速为：0.5ml/min；0.5ml/min；1ml/min；1ml/min；0.5ml/min；0.5ml/min；

柱稳：25℃，进样量：20μl。

进一步地，所述方法可用于制备的雷公藤内酯醇衍生物如下：16-羟基雷公藤内酯醇、15-羟基雷公藤内酯醇、2β-羟基雷公藤内酯醇、1β-羟基雷公藤内酯醇、5α-羟基雷公藤内酯醇、19α-羟基雷公藤内酯醇、19β-羟基雷公藤内酯醇、5α-羟基-14表雷公藤甲素、5β、6β–双羟基雷公藤内酯醇、5α、6α-双羟基雷公藤内酯醇、和14-甲基雷公藤内酯醇。

本发明要解决的技术问题之二，在于提供一种雷公藤内酯醇衍生物，其具有高效、低毒等特点，具有抑制肿瘤、艾滋病和乙肝病毒的良好作用，为雷公藤内酯醇衍生物提供了广阔的应用前景。

本发明是这样实现的上述技术问题之二的：

一种雷公藤内酯醇衍生物，所述雷公藤内酯醇衍生物结构式a如下：

其中R₁、R₂、R₃和R₄独立地是氢或烷基其中的任何一个，可以由烷氧基、烷基或者羟基取代，其中每个所述的烷基或者烷氧基包括至多两个碳原子，基团X，即X₁，X₂，X₅，X₆，X₁₁，X₁₂，X₁₉，X₂₀中至多有两个羟基，其余的为氢，结构中连接R₁、R₂、R₃、R₄及基团X₁，X₂，X₅，X₆，X₁₁，X₁₂，X₁₉，X₂₀的“—”键可代表

或

进一步地，CR₁R₂为CH₃H时，其中X₅为α-羟基，X₂为β-羟基,其余的基团X是氢；或者X₅为β-羟基，X₂为α-羟基，其余的基团X是氢；或者X₅为α-羟基，X₂为α-羟基，其余的基团X是氢；或者X₅为β-羟基，X₂为β-羟基，其余的基团X是氢；或者其中X₅为α-羟基，X₁为β-羟基,其余的基团X是氢；或者X₅为β-羟基，X₁为α-羟基，其余的基团X是氢；或者X₅为α-羟基，X₁为α-羟基，其余的基团X是氢；或者X₅为β-羟基，X₁为β-羟基，其余的基团X是氢。

进一步地，当CR₃R₄为CH₃H时，其中X₅为α-羟基，X₁₉为β-羟基，或者X₅为β-羟基，X₁₉为α--羟基，或者X₅为α-羟基，X₁₉为α-羟基；或者X₅为β-羟基，X19为β--羟基，其余的基团X是氢。

进一步地，其中X₂₀为羟基时，其余为氢，或者X₆为羟基，其余的基团X是氢。

进一步地，所述雷公藤内酯醇衍生物具体为：

6α-羟基雷公藤内酯醇、6β-羟基雷公藤内酯醇、20α-羟基雷公藤内酯醇、20β-羟基雷公藤内酯醇、2β,5α-二羟基-14-甲基雷公藤内酯醇、2α,5β-二羟基-14-甲基雷公藤内酯醇、2α,5α-二羟基-14-甲基雷公藤内酯醇、2β,5β-二羟基-14-甲基雷公藤内酯醇、1β,5α-二羟基-14-甲基雷公藤内酯醇、1α,5β-二羟基-14-甲基雷公藤内酯醇、1α,5α-二羟基-14-甲基雷公藤内酯醇、1β,5β-二羟基-14-甲基雷公藤内酯醇、19β,5α-二羟基-16-甲基雷公藤内酯醇、19α,5β-二羟基-16-甲基雷公藤内酯醇、19α,5α-二羟基-16-甲基雷公藤内酯醇、19β,5β-二羟基-16-甲基雷公藤内酯醇。

本发明要解决的技术问题之三，在于提供一种雷公藤内酯醇衍生物的应用，所述雷公藤内酯醇衍生物可用于治疗与肿瘤和病毒相关的疾病。

本发明是这样实现的上述技术问题之三的：

所述的雷公藤内酯醇衍生物的应用，所述雷公藤内酯醇衍生物可以用于治疗与肿瘤相关的疾病，包括肺癌、肝癌、前列腺癌、人卵巢癌、腺癌、乳腺癌、粒细胞白血病、结肠癌、阿霉素敏感的肺癌、乳腺癌、肝癌、阿霉素抗药的肺癌、乳腺癌、肝癌等肿瘤系统疾病。

所述雷公藤内酯醇衍生物可以用于治疗与病毒相关的疾病，包括艾滋病、乙肝、疱疹、流感病毒。

进一步地，所述雷公藤内酯醇衍生物用于治疗艾滋病和乙肝病毒性疾病。

本发明具有如下优点：

本发明首次利用茉莉酸甲酯（MeJA）、地塞米松、β-环糊精等生物或者非生物诱导子联合作用，提高了短刺小克银汉霉（Cunninghamellablakesleeana）对雷公藤内酯醇的转化率，从原来的18%提高96.29%，同时得到了多种个雷公藤内酯醇衍生物，并将19α-羟基雷公藤甲素的产率提高1.8倍，2β-羟基雷公藤甲素和5α-羟基雷公藤甲素的产率分别提高了1.32倍和3.51倍。与以往的制备技术相比，本发明技术，具有绿色、环保、选择性强，产率高等特点，具有抑制肿瘤、艾滋病和乙肝病毒的良好作用，为大规模利用生物技术制备雷公藤内酯醇衍生物提供了广阔的应用前景。

【具体实施方式】

本发明涉及一种雷公藤内酯醇衍生物的制备方法，包括以下步骤：

步骤一：取保存于4℃、土豆斜面培养基培养的、转化菌种一支，置于25℃恒温培养箱中培养7天后，以适量无菌水将斜面上的孢子充分吹打下来，使单孢子悬液的浓度调整至107～108个/mL，既得种子孢子液；

步骤四：将经过步骤三处理所得的残渣，用1mg：1～10ML的比例用丙酮溶解后，采用硅胶拌样后挥干，称取20倍于样品量的硅胶，使用湿法进行填柱（硅胶柱，欣维尔，MCT-G-05；装样量为每mL为20g硅胶）和上样；首先用5倍柱体积的100%石油醚将样品中低极性油类物质洗脱干净，然后依次用体积比为：10:1，8:1，6:1，4:1，2:1，1:1，1:2，1:4，1:6，1:8的石油醚：乙酸乙酯洗脱液（每个比例为200ml），依次对柱子进行洗脱，最后用100%乙酸乙酯再洗脱柱子，TLC控制收集主馏分，最后使用旋转蒸发仪将各个馏分的流动相蒸干后，用适量色谱纯的甲醇溶解后，用0.22μm的有机膜过滤后，得到分离液；

所述的土豆培养基为：土豆200g/L，葡萄糖20g/L；配置时将土豆去皮后将其切成小块，加水加热煮沸30min，过滤，取滤液定容至1L，加入葡萄糖20g，搅拌溶解后，121℃灭菌30min，即得；斜面培养基为：取上述土豆培养基1L，加入琼脂粉各20g，加热溶解后分装于玻璃试管中，于121℃下灭菌30min后取出，倾斜45度，静置、冷却既得。

所述的转化菌种为下述微生物中任意一种：

所述的联合诱导子为下述三组物质中的至少两组中的任意一种物质组成：

C组：C1为卡马西平，C2为莫达非尼，C3为奈韦拉平，C4为利福平，C5为贯叶连翘，C6为异烟肼，C7为胰岛素，C8为奥美拉唑，C9为苯巴比妥，C10为泼尼松，C11为泼尼松龙,C12为地塞米松，C13为倍他米松，C14为倍氯米松，C15为戊酸倍他米松，C16为醋酸地塞米松，C17为9-氟-16α-甲基11β，17-二羟基-3-氧-1，4-雄二烯-17β-羧酸；

所述的联合诱导子为以下配比中的任意一种或者其他比例：A1:B1=1:1、A3:B1=1:4、A2:B2=2:3、B1:C1=1:1、B1:C12=1:6、B3:C17=3:5、A1:C1=1:1、A2:C12=2:5、A4:C17=5:3、A1:B1:C1=1:1:1、A3:B1:C12=2:3:5、A7:B6:C3=1:3:1，上述各成分之间的配比均为摩尔比。

所述TLC控制收集主馏分，用体积比为85：5的氯仿和甲醇为展开剂；

柱稳：25℃，进样量：20μl。

所述方法可用于制备的雷公藤内酯醇衍生物如下：16-羟基雷公藤内酯醇、15-羟基雷公藤内酯醇、2β-羟基雷公藤内酯醇、1β-羟基雷公藤内酯醇、5α-羟基雷公藤内酯醇、19α-羟基雷公藤内酯醇、19β-羟基雷公藤内酯醇、5α-羟基-14表雷公藤甲素、5β、6β–双羟基雷公藤内酯醇、5α、6α-双羟基雷公藤内酯醇、和14-甲基雷公藤内酯醇。

本发明还涉及一种雷公藤内酯醇衍生物，所述雷公藤内酯醇衍生物是利用上述一种雷公藤内酯醇衍生物的制备方法制得，所述雷公藤内酯醇衍生物结构式a如下：

其中R₁、R₂、R₃和R₄独立地是氢或烷基其中的任何一个，可以由烷氧基、烷基或者羟基取代，其中每个所述的烷基或者烷氧基包括至多两个碳原子，基团X，即X₁，X₂，X₅，X₆，X₁₁，X₁₂，X₁₉，X₂₀中至多有两个羟基，其余的为氢，结构中连接R₁、R₂、R₃、R₄及基团X₁，X₂，X₅，X₆，X₁₁，X₁₂，X₁₉，X₂₀的“—”键可代表或

CR₁R₂为CH₃H时，其中X₅为α-羟基，X₂为β-羟基,其余的基团X是氢；或者X₅为β-羟基，X₂为α-羟基，其余的基团X是氢；或者X₅为α-羟基，X₂为α-羟基，其余的基团X是氢；或者X₅为β-羟基，X₂为β-羟基，其余的基团X是氢；或者其中X₅为α-羟基，X₁为β-羟基,其余的基团X是氢；或者X₅为β-羟基，X₁为α-羟基，其余的基团X是氢；或者X₅为α-羟基，X₁为α-羟基，其余的基团X是氢；或者X₅为β-羟基，X₁为β-羟基，其余的基团X是氢。

当CR₃R₄为CH₃H时，其中X₅为α-羟基，X₁₉为β-羟基，或者X₅为β-羟基，X₁₉为α--羟基，或者X₅为α-羟基，X₁₉为α-羟基；或者X₅为β-羟基，X₁₉为β--羟基，有没有其余的基团X是氢。

其中X₂₀为羟基时，其余为氢，或者X₆为羟基，其余的基团X是氢。

所述雷公藤内酯醇衍生物具体为：6α-羟基雷公藤内酯醇、6β-羟基雷公藤内酯醇、20α-羟基雷公藤内酯醇、20β-羟基雷公藤内酯醇、2β,5α-二羟基-14-甲基雷公藤内酯醇、2α,5β-二羟基-14-甲基雷公藤内酯醇、2α,5α-二羟基-14-甲基雷公藤内酯醇、2β,5β-二羟基-14-甲基雷公藤内酯醇、1β,5α-二羟基-14-甲基雷公藤内酯醇、1α,5β-二羟基-14-甲基雷公藤内酯醇、1α,5α-二羟基-14-甲基雷公藤内酯醇、1β,5β-二羟基-14-甲基雷公藤内酯醇、19β,5α-二羟基-16-甲基雷公藤内酯醇、19α,5β-二羟基-16-甲基雷公藤内酯醇、19α,5α-二羟基-16-甲基雷公藤内酯醇、19β,5β-二羟基-16-甲基雷公藤内酯醇。

所述雷公藤内酯醇衍生物可以用于治疗与肿瘤相关的疾病，包括肺癌、肝癌、前列腺癌、人卵巢癌、腺癌、乳腺癌、粒细胞白血病、结肠癌、阿霉素敏感的肺癌、乳腺癌、肝癌、阿霉素抗药的肺癌、乳腺癌、肝癌等肿瘤系统疾病。

较优的，所述雷公藤内酯醇衍生物用于治疗艾滋病和乙肝病毒性疾病。

本发明提供雷公藤内酯醇衍生物是结构式a所示的化合物或其药学上可接受的盐和它们的光学异构体：

所述“药学上可接受的盐”具体可列举结构式a所示的化合与丙酸、草酸丙二酰、琥珀酸、富马酸、马来酸、乳酸、苹果酸、酒石酸、柠檬酸等有机酸和天冬氨酸、古氨酸等酸性氨基酸形成酯后再与无机碱形成的盐，如钠、钾、钙、铝盐和铵盐或与有机碱形成的盐，如甲胺盐乙胺盐、乙醇胺盐等，或与赖氨酸、精氨酸、鸟氨酸等碱性氨基酸形成酯后的盐酸、氢溴酸、氢氟酸，硫酸、硝酸、磷酸等无机酸的盐，或与甲酸、乙酸、苦味酸、甲磺酸、乙磺酸等有机酸的盐；

“光学异构体”包含对眏异构体、非对眏异构体、光学异构体的混合物及纯光学异构体。

本发明的雷公藤内酯醇衍生物，其药学上可接受的盐或光学异构体可制成含活性成分0.001～99.9%(重量)以及适量药学上可接受的载体的各种制剂，如适合口服、注射或肠道给药使用的制剂形式。

以下结合具体实施例对本发明作进一步的说明。

实施例一：雷公藤内酯醇衍生物的制备

1、6α-羟基雷公藤内酯醇的制备

在100mL土豆液体培养基中接种5mL（108个/mL）短刺小克银汉霉（Cunninghamella blakesleana)AS3.970孢子液，在pH至6.0，温度30℃±1℃，振荡速度为200r/min条件下培养12h后；按0.2ug的接种量，加入各重量比为（3：2：1）的茉莉酸甲酯（MeJA，0.35m mol/mL）、地塞米松（DXM）以及β-环糊精（BCD，0.51mmol/mL），继续培养12h后，再按5%的接种量加入雷公藤内酯醇，然后继续培养5天，停止培养，然后将滤液于8000r/min,离心10min去除沉淀，滤液用等体积的乙酸乙酯萃取3遍，萃取液蒸干后用2m L丙酮溶解后，再用层析硅胶柱分离,洗脱液依次用石油醚、体积比为10:1，8:1，6:1，4:1，2:1，1:1，1:2，1:4，1:6，1:8的石油醚：乙酸乙酯、100%乙酸乙酯洗脱，使用旋转蒸发仪将洗脱液蒸干后，用适量甲醇溶解后，再用0.22μm的滤膜过滤后，经高效液相半制备法采用乙腈：水（10：90（0min）；16：84（10min）；30：70（36min）；30：70（50min），10：90（53min）；10：90（60min）梯度洗脱、收集保留时间为35.5～36.2min洗脱液，减压干燥后，用甲醇重结晶，得到淡黄色粉末，6-羟基雷公藤内酯醇；其转化率为81.77%。

高分辨质谱给出分子离子峰[M+1]⁺在m/z377.1673。¹³C-NMR谱和¹H-NMR如下：

¹³C NMR(151MHz，DMSO)δ171.17(s，C-18)，151.46(s，C-4)，130.65(s，C-3)，71.82(s，C-13),71.01(t，C-19)，69.65(s，C-9)，69.08(d，C-14)，62.45(s，C-8)，60.46(d，C-6)，58.71(d，C-7)，55.57(d，C-12)，53.67(d，C-11)，40.51(d，C-5)，31.81(t，C-1)，26.17(d，C-15)，25.04(s，C-10)，23.82(t，C-2)，16.69(q，C-20)，16.39(q，C-17)，16.32(q，C-16)。

¹H NMR(600MHz，DMSO)δ5.12(1H，d，6-OH)，4.92(2H，s，H-19)，3.79(1H，s，J=7.6Hz，H-14)，3.70(1H，d，J=7.2Hz，14-OH)，3.52(1H，d，J=8.4Hz，H-6)，3.18(1H，d，J=3.2Hz，H-11)，3.15(1H，d，J=2.6Hz，H-12)，2.18(1H，m，H-5)，2.14(1H，brd，H-15)，1.96(1H，m，H-2)，1.5(1H，dd，J=14.9，13.4Hz，H-1)，1.30(1H，ddd，J=11.2，5.8Hz，H-1)，1.25(1H，sept，J=12.1，5.8Hz，H-2)，1.16(3H，s，20-CH₃)，1.09(3H，d，J=6.9Hz，17-CH₃)，1.01(3H，d，J=6.9Hz，16-CH₃)。

2、20β-羟基雷公藤内酯醇的制备

在100mL土豆液体培养基中接种5mL（108个/mL）短刺小克银汉霉（Cunninghamella blakesleana)AS3.970孢子液，在pH至6.0，温度30℃±1℃，振荡速度为200r/min条件下培养12h后；按0.2ug的接种量，加入各重量比为（3：2：1）的茉莉酸甲酯（MeJA，0.35m mol/mL）、地塞米松（DXM）以及β-环糊精（BCD，0.51m mol/mL），继续培养12h后，再按5%的接种量加入雷公藤甲素，然后继续培养5天，停止培养，然后将滤液于8000r/min,离心10min去除沉淀，滤液用等体积的乙酸乙酯萃取3遍，萃取液蒸干后用2m L丙酮溶解后，再用层析硅胶柱分离,洗脱液依次用石油醚，体积比为10:1，8:1，6:1，4:1，2:1，1:1，1:2，1:4，1:6，1:8的石油醚：乙酸乙酯，以及100%乙酸乙酯洗脱，使用旋转蒸发仪将洗脱液蒸干后，用适量甲醇溶解后，再用0.22μm的滤膜过滤后，经高效液相半制备法采用乙腈：水（10：90（0min）；16：84（10min）；30：70（36min）；30：70（50min），10：90（53min）；10：90（60min）梯度洗脱、收集保留时间为55-56min

洗脱液，减压干燥后，用丙酮-乙醚重结晶，得到淡黄色粉末，20β-羟基雷公藤雷公藤内酯醇；其转化率为55.80%。

高分辨质谱给出分子离子峰[M+1]⁺在m/z377.1656。¹³C-NMR谱和¹H-NMR如下：

¹³C NMR(151MHz，DMSO)δ173.20(s，C-18)，152.35(s，C-4)，133.06(s，C-3)，71.80(s，C-13),70.71(t，C-19)，68.99(s，C-8)，68.71(d，C-14)，63.11(s，C-9)，62.79(t，C-20)，55.35(d，C-12)，53.92(d，C-11)，49.17(d，C-7)，34.89(s，C-10)，29.06(d，C-5)，26.15(d，C-15)，25.39(t，C-1)，24.16(t，C-2)，23.77(t，C-6)，14.01(q，C-20)，12.56(q，C-17)。

¹H NMR(600MHz，DMSO)δ4.92(2H，q，J=7.4Hz，H-19)，4.58(20-OH)，4.56(1H，ddd,J=4.6Hz，14-OH)，3.79(1H，s，H-14)，3.45(1H，m，H-20)，3.18(1H，d，J=3.6Hz，H-11)，3.06(1H，d，J=3.6Hz，H-12)，2.86(1H，d，J=4.9Hz，H-7)，2.14(1H，m，H-15)，2.10(1H，ddd，H-5)，1.96(1H，m,H-2)，1.81(2H，t，H-1)，1.57(2H，m，H-6)，0.91(3H，d，16-CH₃)，0.81(3H，d，J=7.4Hz，17-CH₃)。

3、5α,19β–二羟基-16-甲基雷公藤内酯醇的制备

在100mL土豆液体培养基中接种5mL（10⁸个/mL）短刺小克银汉霉（Cunninghamella blakesleana)AS3.970孢子液，在pH至6.0，温度30℃±1℃，振荡速度为200r/min条件下培养12h后；按0.2ug的接种量，加入各重量比为（3：2：1）的茉莉酸甲酯（MeJA，0.35m mol/mL）、地塞米松（DXM）以及β-环糊精（B-CD，0.51m mol/mL），继续培养12h后，再按5%的接种量加入雷公藤甲素，然后继续培养5天，停止培养，然后将滤液于8000r/min,离心10min去除沉淀，滤液用等体积的乙酸乙酯萃取3遍，萃取液蒸干后用2m L丙酮溶解后，再用层析硅胶柱分离,洗脱液依次用石油醚，体积比为10:1，8:1，6:1，4:1，2:1，1:1，1:2，1:4，1:6，1:8的石油醚：乙酸乙酯，以及100%乙酸乙酯进行洗脱，使用旋转蒸发仪将洗脱液蒸干后，用适量甲醇溶解后，再用0.22μm的滤膜过滤后，经高效液相半制备法采用乙腈：水（10：90（0min）；16：84（10min）；30：70（36min）；30：70（50min），10：90（53min）；10：90（60min）梯度洗脱、收集保留时间为38-39.7min洗脱液，减压干燥后，用甲醇重结晶，得到无色结晶，即为5α,19β–二羟基-16-甲基雷公藤内酯醇；其转化率为85.98%。

高分辨质谱给出分子离子峰[M+1]⁺在m/z407.1736。¹³C-NMR谱和¹H-NMR如下：

¹³C NMR(151MHz，DMSO)δ170.58(s，C-18)，160.46(s，C-4)，126.76(s，C-3)，97.23（d，C-19），71.14(d，C-14)，69.64(s，C-5)，64.73(s，C-13)，64.13(s，C-9)，60.95(s，C-8)，59.92(s，C-7)，55.11(d，C-11)，54.23(d，C-12)，35.26(s，C-10)，29.12(t，C-6)，27.38(d，C-15)，24.39(t，C-1)，22.20(t，C-2)，17.48(t，C-16)，16.30(q，C-17)，13.69(q，C-20)，12.54(q，C-21)。

¹H NMR(600MHz，DMSO)δ7.80(1H，s，19-OH)，7.61(1H，s，5-OH)，6.03(H，d，J=7.5Hz，H-19)，4.82(1H，d，J=7.5Hz，14-OH)，3.37(1H，d，J=3.3Hz，H-11)，3.55(1H，d，J=3Hz，H-12)，3.38(1H，d，J=5.5Hz，H-7)，3.34(d，J=5.5Hz，H-14)，2.24(1H，dd，J=15，13Hz，H-6)，2.16(1H，m，H-15)，2.14(1H，brd)，2.01(1H，m，H-2)，1.90(1H，m，H-6)，1.27(1H，td，J=12.1，6.4Hz，H-1)，1.20(1H，dd，J=12.3，5.6Hz，H-1)，0.97(3H，s，20-CH₃)，0.89(3H，d，J=6.9Hz，17-CH₃)，0.86(3H，t，J=6.9Hz，21-CH₃)，0.76(2H，d，J=6.9Hz，16-CH₂)。

4、2β，5α–二羟基-14-甲基雷公藤内酯醇的制备

在100mL土豆液体培养基中接种5mL（10⁸个/mL）短刺小克银汉霉（Cunninghamella blakesleana)AS3.970孢子液，在pH至6.0，温度30℃±1℃，振荡速度为200r/min条件下培养12h后；按0.2ug的接种量，加入各重量比为（3：2：1）的茉莉酸甲酯（MeJA，0.35m mol/mL）、地塞米松（DXM）以及β-环糊精（BCD，0.51m mol/mL），继续培养12h后，再按5%的接种量加入雷公藤甲素，然后继续培养5天，停止培养，然后将滤液于8000r/min,离心10min去除沉淀，滤液用等体积的乙酸乙酯萃取3遍，萃取液蒸干后用2mL丙酮溶解后，再用层析硅胶柱分离,洗脱液依次用石油醚，体积比为10:1，8:1，6:1，4:1，2:1，1:1，1:2，1:4，1:6，1:8的石油醚：乙酸乙酯，以及乙酸乙酯进行洗脱，使用旋转蒸发仪将洗脱液蒸干后，用适量甲醇溶解后，再用0.22μm的滤膜过滤后，经高效液相半制备法采用乙腈：水（10：90（0min）；16：84（10min）；30：70（36min）；30：70（50min），10：90（53min）；10：90（60min）梯度洗脱、收集保留时间为40-40.5min洗脱液，减压干燥后，用甲醇重结晶，得到无色结晶，即为2β，5α–二羟基-14-甲基雷公藤内酯醇，（转化率44.89%）。

高分辨质谱给出分子离子峰[M+1]⁺在m/z407.1959。¹³C-NMR谱和¹H-NMR如下：

¹³C NMR(151MHz，DMSO)δ172.24(s，C-18)，149.56(s，C-4)，131.36(s，C-3)，74.45(d，C-14)，74.78(s，C-5)，69.34(s，C-13)，66.45(s，C-8)，64.83（t，C-19），63.73(s，C-9)，63.42(d，C-2)，55.83(d，C-12)，53.91(d，C-11)，51.74(q，C-21)，43.22(s，C-7)，32.90(t，C-1)，32.67(s，C-10)，30.32(t，C-6)，26.48(d，C-15)，16.48(t，C-16)，16.30(q，C-17)，13.99(q，C-20)。

¹H NMR(600MHz，DMSO)δ7.15(1H，s，2-OH)，7.02(1H，s，5-OH)，4.73(2H，d，J=7.5Hz，H-19)，3.41(d，J=5.5Hz，H-14)，3.69(1H，t，J=6.4Hz，H-2)，3.24(3H，s，J=6.9Hz，21-CH₃)，3.18(1H，d，J=3.3Hz，H-11)，3.17(1H，d，J=3.4Hz，H-12)，2.86(1H，d，J=5.5Hz，H-7)，2.14(1H，m，H-15)，1.98(2H，m，H-1)，1.83(2H，m，H-6)，1.09(3H，s，20-CH₃)，1.04(3H，d，J=6.9Hz，17-CH₃)，1.01(3H，d，J=6.9Hz，16-CH₃)。

5、1β，5α–二羟基-14-甲基雷公藤内酯醇的制备

在100mL土豆液体培养基中接种5mL（10⁸个/mL）短刺小克银汉霉（Cunninghamella blakesleana)AS3.970孢子液，在pH至6.0，温度30℃±1℃，振荡速度为200r/min条件下培养12h后；按0.2ug的接种量，加入各重量比为（3：2：1）的茉莉酸甲酯（MeJA，0.35m mol/mL）、地塞米松（DXM）以及β-环糊精（BCD，0.51m mol/mL），继续培养12h后，再按5%的接种量加入雷公藤甲素，然后继续培养5天，停止培养，然后将滤液于8000r/min,离心10min去除沉淀，滤液用等体积的乙酸乙酯萃取3遍，萃取液蒸干后用2m L丙酮溶解后，再用层析硅胶柱分离,洗脱液依次用石油醚，体积比为10:1，8:1，6:1，4:1，2:1，1:1，1:2，1:4，1:6，1:8的石油醚：乙酸乙酯，以及乙酸乙酯进行洗脱，使用旋转蒸发仪将洗脱液蒸干后，用适量甲醇溶解后，再用0.22μm的滤膜过滤后，经高效液相半制备法采用乙腈：水（10：90（0min）；16：84（10min）；30：70（36min）；30：70（50min），10：90（53min）；10：90（60min）梯度洗脱、收集保留时间为43-43.7min洗脱液，减压干燥后，用甲醇重结晶，得到无色结晶，即为1β，5α–二羟基-14-甲基雷公藤内酯醇；其转化率为77.92%。

高分辨质谱给出分子离子峰[M+1]⁺在m/z407.1932。¹³C-NMR谱和¹H-NMR如下：

¹³C NMR(151MHz，DMSO)δ171.08(s，C-18)，151.46(s，C-4)，130.67(s，C-3)，74.44(d，C-14)，69.73(s，C-13)，68.24(s，C-5)，66.69(d，C-1)，65.75(s，C-8)，64.53（t，C-19），57.23(s，C-9)，55.83(d，C-12)，54.21(d，C-11)，51.74(q，C-21)，46.96(s，C-10)，43.22(s，C-7)，31.70(t，C-2)，30.32(t，C-6)，26.48(d，C-15)，16.48(t，C-16)，16.30(q，C-17)，13.99(q，C-20)。

¹H NMR(600MHz，DMSO)δ7.48(1H，s，1-OH)，7.31(1H，s，5-OH)，4.92(2H，d，J=7.5Hz，H-19)，3.41(d，J=5.5Hz，H-14)，3.36(1H，t，J=6.4Hz，H-1)，3.24(3H，s，J=6.9Hz，21-CH₃)，3.17(1H，d，J=3.3Hz，H-11)，3.15(1H，d，J=3.4Hz，H-12)，2.86(1H，d，J=5.5Hz，H-7)，2.14(1H，m，H-15)，2.11(2H，m，H-2)，1.72(2H，m，H-6)，1.16(3H，s，20-CH₃)，1.08(3H，d，J=6.9Hz，17-CH₃)，1.01(3H，d，J=6.9Hz，16-CH₃)。

6、其他羟基雷公藤内酯醇衍生物的制备

根据本发明的实施例一的6α-羟基雷公藤内酯醇所述的制备方法，也可分别收集保留时间为18.2、18.4～19min、20.5～21min、23.5～24.5min、26～26.8min、27.5～28.5min和34.6～35.4min洗脱液，再经减压干燥后，用甲醇重结晶，分别得到16、15、1β、2β、5α、19β得和19α-羟基雷公藤内酯醇无色结晶产物。

本发明实施例所述的的雷公藤内酯醇衍生物，可以单独使用，也可以和其他抗肿瘤药物联合治疗，其药学上可接受的盐或水合物的含量占所制成的药物为0.001～99.9%(重量百分比)，因此本发明的药物组合物可以进一步包括一种或多种其他的抗肿瘤药物，例如，影响肿瘤细胞核酸生物合成的药物可以为5-氟尿嘧啶（5-fluorouracil)、阿糖胞苷（Cytarabine）、雄黄等，所述直接破坏肿瘤细胞DNA阻止其复制的药物可以为顺铂(Cisplatin)、喜树碱（camptot-hecin）、依托泊苷（Etoposide）等，所述嵌入肿瘤细胞DNA中干扰转录过程的药物可以为阿红霉素（ADM），所述干扰有丝分裂影响肿瘤细胞蛋白质合成的药物可以为长春碱（VLB）、长春新碱（VCR）、紫杉醇（Taxol），内分泌药物包括糖皮质激素、肾上腺皮质激素、激素等，细胞因子包括肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor，TNF）、白细胞介素（interleukin，IL-6）、干扰素（interferon，IFN）、转化生长因子-β(Transforming growth factorbeta,TGF-β)、脂多糖（lipopolysaccharide）、即佛波酯(12-Ｏ-tetra-decanoyl-pho rbol-13-acetate,TPA)、腺苷酸环化酶激活剂（Forskolin）等；

本发明的雷公藤内酯醇衍生物或者组合物可以用于与肿瘤相关的疾病、包括肺癌、肝癌、前列腺癌、人卵巢癌、腺癌、乳腺癌、粒细胞白血病、结肠癌、阿霉素敏感的肺癌、乳腺癌、肝癌、阿霉素抗药的肺癌、乳腺癌、肝癌等肿瘤系统疾病。

本发明雷公藤内酯醇衍生物或者组合物可以用于与病毒相关的疾病，包括艾滋病、乙肝、疱疹、流感病毒等，优选地，本发明用于治疗艾滋病和乙肝病毒性疾病。

本发明的雷公藤内酯醇衍生物或者组合物可以口服、静脉注射、肌肉注射、呼吸道、皮肤或者粘膜给药，包括溶液剂、乳剂、胶囊剂、片剂、注射剂、喷雾剂、气雾剂、外用洗剂、擦剂、贴剂、滴眼剂、滴鼻剂、眼用软膏、含漱剂、舌下片剂、软膏剂、栓剂等。

本发明制备了高效、低毒的雷公藤内酯醇衍生物，使其能够实际地用于肿瘤和病毒性疾病的治疗，其在治疗肿瘤、艾滋病和乙肝方面具有良好的应用前景。

实施例二、药效学评价实验例

以下实验例中，受试样品由本发明制备方法实施例提供，以前体化合物雷公藤内酯醇作为阳性对照。

1、本发明的12个化合物对体外培养的人肺癌细胞A549细胞的生长抑制作用

方法：人A549肺癌细胞用含10%胎牛血清的DMEM培养基（Gibco，美国）培养，培养条件为37℃，5%CO₂，肿瘤细胞0.7x10⁴/孔接种于96孔板中，24小时后，加入用二甲基亚砜配置的（200uM)、PBS溶液稀释的化合物，使培养基终浓度为10^-4、10^-5、10^-6、10^-7、10^-8M，作用72h后，弃去培养液，用10%冷三氯醋酸固定细胞，用黄酰罗丹明B（sulforhodamine B，SRB）溶液染色，洗去未结合SRB后，Tris溶解与蛋白结合的SRB，用酶标仪在560nm处测定吸光值（OD）。采用下列公式计算细胞的生长率：抑制率=（OD值对照孔-OD值给药孔）/OD值对照孔X100%，结果判定标准：无效10-⁵M<50%，有效10-⁵M>50%。根据各浓度的抑制率，采用logit法计算半数抑制浓度IC₅₀。

结果：在本发明的12个化合物中HQU-1、HQU-2、HQU-3、HQU-4、HQU-5、HQU-6、HQU-7、HQU-8、HQU-9、HQU-10、HQU-11、HQU-12剂量依赖性地抑制体外培养的人肺癌细胞A549，细胞生长，显示其具有有效的体外抗肿瘤作用，其中HQU-2、HQU-3、HQU-4、HQU-5、HQU-6，HQU-8和HQU-12，IC₅₀值与TP接近，显示了与雷公藤甲素相同的抑制肿瘤效应。具体结果表1:

表1 12种化合物对人肺癌A549细胞的生长抑制作用

2、本发明的12个化合物，对体外感染艾滋病HIV-1IIIB病毒的TZM-bl细胞的生长抑制作用

取对数生长期的TZM-BL细胞，按2×10⁴/mL孔密度接种于96孔细胞培养板中，100μL/孔，置于细胞培养箱(37℃，5%CO2)中培养。隔日待细胞贴壁且生长良好，吸去培养液，将用无血清培养基稀释的雷公藤内酯醇或者其他化合物，分别加入96孔培养板，设置三个平行孔，37℃，5%CO2培养3h后，加入1000×TCID50的HIV-1IIIB病毒100μL感染细胞，然后继续培养24h后，利用Bright-Glo Luciferase Assay试剂(Promega)测定每孔的相对荧光单位(RLU)，根据Prism Graphruan软件计算化合物的半数抑制浓度IC₅₀，结果判定标准：有效IC₅₀<50nM，无效IC₅₀>50nM。IC₅₀结果见表2所示：

表2 12种化合物对体外感染艾滋病HIV-1IIIB病毒的TZM-bl细胞的生长抑制作用

样品编号	IC50（nM）	评价
			HQU-1	1.5	有效
HQU-2	1.5	有效
			HQU-3	>50	无效
HQU-4	>50	无效
			HQU-5	>50	无效
HQU-6	>50	无效
			HQU-7	1.5	有效
HQU-8	1.5	有效
			HQU-9	2.5	有效
HQU-10	>50	无效
			HQU-11	>50	无效

HQU-12	1.50	有效
			TP	1	有效

结果：在本发明的12个化合物中HQU-1、HQU-2、HQU-7、HQU-8、HQU-9、HQU-12能够抑制体外感染艾滋病HIV-1IIIB病毒的TZM-bl细胞的生长，显示其具有有效的体外抗艾滋病病毒作用，具体结果表2。其HQU-1、HQU-2、HQU-7、HQU-8、HQU-12的IC₅₀值与TP接近，显示了与雷公藤甲素相同的抑制艾滋病病毒效应。

3、本发明12个化合物，对HepG2.2.15细胞的体外HBV抗原抑制的作用

取对数生长期的HepG2.2.15细胞，按2×104/mL孔密度接种于24孔细胞培养板中，1000μL/孔，每个浓度共设3个复孔，置细胞培养箱(37℃，5%CO2)中培养。隔日待细胞贴壁且生长良好，吸去培养液，然后分别加入按表3中药物配制的各浓度的完全培养液1000μL，每个浓度设3个复孔，置细胞培养箱(37℃，5%CO2)中培养。等量的完全培养液作空白对照，用同浓度的雷公藤内酯醇培养液作阳性对照，在连续培养72h后，吸取细胞培养液分别加于1.5mL无菌Eppnedorf管中，于-20℃保存待检。将-20℃保存的细胞培养液用同时同批乙型肝炎病毒表面抗原、E抗原酶联免疫试剂盒检测HBsAg和HBeAg的效价。采用下列公式计算抗原的的抑制百分率=[l-实验孔抗原OD值/对照孔抗原OD值]×100%。结果判定标准：有效，化合物浓度为100nM时，其抑制HBsAg、HBeAg的抑制率>50%，无效化合物浓度为100nM时，其抑制HBsAg、HBeAg的抑制率<50%。其结果见表3所示：

表3 12种化合物对HepG2.2.15细胞系HBsAg、HBeAg表达的抑制作用（

n=3）

结果：在本发明的12个化合物中HQU-1、HQU-2、HQU-4、HQU-5、HQU-6、HQU-9、HQU-10、HQU-11均能具有剂量依赖性地抑制HepG2.2.15细胞的HBV抗原（HBsAg、HBeAg）的作用，显示其具有有效的体外抗乙肝病毒作用，具体结果表3。其HQU-5、HQU-11、的IC₅₀值与TP接近，显示了与雷公藤内酯醇相同的抑制乙肝病毒效应。

4、本发明的12个化合物，对小鼠的急性毒性实验

设置雷公藤甲素阳性对照组、化合组各自试验组。每组取小鼠50只，雌雄各半，体重18－20g，把小鼠随机分为5小组，每小组10只，实验前小鼠禁食（不禁水）14小时后，腹腔注射或灌胃给小鼠给药，给药体积均为每20g体重0.2mL。给药后于常温下观察动物行为活动，记录死亡情况，观察至7天，进行大体解剖，肉眼观察。采用LD50数据处理软件1.0进行数据处理，计算各组LD50，结果见表4。

结果：在本发明的12个化合物中HQU-3、HQU-6、HQU-7、HQU-8、HQU-9、HQU-10、HQU-11、HQU-12其LD50明显大于阳性对照雷公藤内酯醇，显示部分化合物对小鼠的急性毒性明显低于雷公藤内酯醇，具体结果表4。

表4 12种化合物对小鼠的急性毒性作用

样品编号	LD₅₀（mg/kg）
		HQU-1	2.3912±0.2167
HQU-2	1.6423±0.2398

HQU-3	32.1509±0.2194
		HQU-4	1.3261±0.0135
HQU-5	1.0602±0.1901
		HQU-6	12.3821±0.3149
HQU-7	68.2312±0.3564
		HQU-8	92.3802±0.2164
HQU-9	74.0619±0.3954
		HQU-10	23.7639±0.1864
HQU-11	18.0845±0.0019
		HQU-12	121.0521±0.5672
TP	0.9121±0.0236

上述四个表格中，HQU-1为16-羟基雷公藤内酯醇；HQU-2为15-羟基雷公藤藤内酯醇；HQU-3为1β-羟基雷公藤藤内酯醇；HQU-4为2β-羟基雷公藤藤内酯醇；HQU-5为5α-羟基雷公藤藤内酯醇；HQU-6为19β-羟基雷公藤藤内酯醇；HQU-7为19α-羟基雷公藤藤内酯醇；HQU-8为6-羟基雷公藤藤内酯醇；HQU-9为19β,5α-二羟基-16-甲基雷公藤藤内酯醇；HQU-10为2β,5α-二羟基-14-甲基雷公藤藤内酯醇；HQU-11为1β,5α-二羟基-14-甲基雷公藤藤内酯醇；HQU-12为20-羟基雷公藤藤内酯醇，TP，雷公藤甲素。

本发明的雷公藤内酯醇衍生物，除少数的化合物在体外抑制肿瘤、艾滋病病毒和乙肝炎病毒无效外，其他化合物均能显著抑制多种体外培养的肿瘤、爱滋病和乙肝病毒细胞的生长，抑制作用具有明显的剂量依赖性，表明上述化合物多种肿瘤、爱滋病和乙肝最有效。

本发明的雷公藤内酯醇衍生物可用于制备预防和/或治疗肿瘤、爱滋病和乙肝等疾病，具有良好的用于治疗肺癌、肝癌、前列腺癌、人卵巢癌、人乳腺癌、粒细胞白血病、结肠癌、阿霉素敏感的乳腺癌、阿霉素抗药的乳腺癌、阿霉素抗药的白血病等疾病的应用前景。

本发明以雷公藤内酯醇为前体药物，提供了新型雷公藤内酯醇衍生物以及相关衍生物的新的制备方法。

虽然以上描述了本发明的具体实施方式，但是熟悉本技术领域的技术人员应当理解，我们所描述的具体的实施例只是说明性的，而不是用于对本发明的范围的限定，熟悉本领域的技术人员在依照本发明的精神所作的等效的修饰以及变化，都应当涵盖在本发明的权利要求所保护的范围内。

Claims

1.一种雷公藤内酯醇衍生物的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：

2.如权利要求1所述的一种雷公藤内酯醇衍生物的制备方法，其特征在于：

3.如权利要求1或2所述的一种雷公藤内酯醇衍生物的制备方法，其特征在于：所述的转化菌种为下述微生物中任意一种：

4.如权利要求3所述的一种雷公藤内酯醇衍生物的制备方法，其特征在于：所述的联合诱导子为下述三组物质中的至少两组中的任意一种物质组成：

5.如权利要求1所述的一种雷公藤内酯醇衍生物的制备方法，其特征在于：所述TLC控制收集主馏分，用体积比为85：5的氯仿和甲醇为展开剂；

柱稳：25℃，进样量：20μl。

6.如权利要求1所述的一种雷公藤内酯醇衍生物的制备方法，其特征在于：所述方法可用于制备的雷公藤内酯醇衍生物如下：16-羟基雷公藤内酯醇、15-羟基雷公藤内酯醇、2β-羟基雷公藤内酯醇、1β-羟基雷公藤内酯醇、5α-羟基雷公藤内酯醇、19α-羟基雷公藤内酯醇、19β-羟基雷公藤内酯醇、5α-羟基-14表雷公藤甲素、5β、6β–双羟基雷公藤内酯醇、5α、6α-双羟基雷公藤内酯醇、和14-甲基雷公藤内酯醇。

7.一种雷公藤内酯醇衍生物，所述雷公藤内酯醇衍生物是利用权利要求1所述的一种雷公藤内酯醇衍生物的制备方法制得，其特征在于：所述雷公藤内酯醇衍生物结构式a如下：

8.根据权利要求7所述的雷公藤内酯醇衍生物，其特征在于：CR₁R₂为CH₃H时，其中X₅为α-羟基，X₂为β-羟基,其余的基团X是氢；或者X₅为β-羟基，X₂为α-羟基，其余的基团X是氢；或者X₅为α-羟基，X₂为α-羟基，其余的基团X是氢；或者X₅为β-羟基，X₂为β-羟基，其余的基团X是氢；或者其中X₅为α-羟基，X₁为β-羟基,其余的基团X是氢；或者X₅为β-羟基，X₁为α-羟基，其余的基团X是氢；或者X₅为α-羟基，X₁为α-羟基，其余的基团X是氢；或者X₅为β-羟基，X₁为β-羟基，其余的基团X是氢。

9.根据权利要求7所述的雷公藤内酯醇衍生物，其特征在于：当CR₃R₄为CH₃H时，其中X₅为α-羟基，X₁₉为β-羟基，或者X₅为β-羟基，X₁₉为α--羟基，或者X₅为α-羟基，X₁₉为α-羟基；或者X₅为β-羟基，X₁₉为β--羟基，其余的基团X是氢。

10.根据权利要求7所述的雷公藤内酯醇衍生物，其特征在于：其中X₂₀为羟基时，其余为氢，或者X₆为羟基，其余的基团X是氢。

11.根据权利要求7所述的雷公藤内酯醇衍生物，其特征在于：所述雷公藤内酯醇衍生物具体为；

12.根据权利要求7～11所述的雷公藤内酯醇衍生物的应用，其特征在于：所述雷公藤内酯醇衍生物可以用于治疗与肿瘤相关的疾病，包括肺癌、肝癌、前列腺癌、人卵巢癌、腺癌、乳腺癌、粒细胞白血病、结肠癌、阿霉素敏感的肺癌、乳腺癌、肝癌、阿霉素抗药的肺癌、乳腺癌、肝癌等肿瘤系统疾病。

13.根据权利要求7～11所述的雷公藤内酯醇衍生物的应用，其特征在于：所述雷公藤内酯醇衍生物可以用于治疗与病毒相关的疾病，包括艾滋病、乙肝、疱疹、流感病毒。

14.根据权利要求13所述的雷公藤内酯醇衍生物的应用，其特征在于：所述雷公藤内酯醇衍生物用于治疗艾滋病和乙肝病毒性疾病。