CN103627748B - 一种靛玉红衍生物的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种靛玉红衍生物的制备方法,该方法通过特殊诱导子提高微生物对靛玉红的生物转化,同时得到多种、高产率的基于靛玉红的羟基、甲基和或磺酸化修饰的化合物。本发明方法绿色环保、选择性强、产率高,能够大规模利用微生物制备雷公藤红素衍生物,且制备的靛玉红衍生物具有高效、低毒等特点,具有抑制肿瘤、抑制艾滋病和乙肝病毒、抑制心肌缺血再灌注和扩张性心肌病损伤的良好作用。
Description
【技术领域】
本发明涉及一种靛玉红衍生物的制备方法。
【背景技术】
青黛是中国药典收载的中重要药物之一,是由爵床科植物马蓝(Baphicacanthuscusia(Nees)Bremek.)、蓼科植物蓼蓝(PolygonumtinctoriumAit)或十字花科植物菘蓝(IsatisindigoticaFort)的叶或茎叶经加工制得的干燥粉末或团块,主产于福建、云南、江苏、安徽等地,尤以福建所产的品质最佳,称建青黛。而靛玉红(indirubin)属双吲哚生物碱类化合物,是青黛的主要的活性成分之一,最近的研究表明,靛玉红及其衍生物对乳腺癌、肝癌、胰腺癌和肺癌等实体瘤和血液系统肿瘤均具有抗癌活性,与此同时,在炎症、神经系统疾病、自身免疫性疾病、银屑病等诸多疾病的研究中都显示很好的药理作用,为此,靛玉红在抑制肿瘤、抗炎、抑制缺血再灌注损伤和神经系统疾病药物开发方面,显示了巨大的应用前景[2]。然而在另一方面,靛玉红水溶性和脂溶性较差,体内吸收困难,生物利用度低,一定程度上限制了它在临床上的应用。为此,国内外的学者对靛玉红的结构进行了修饰和优化,以期得到溶解性好、疗效佳的靛玉红类似物(公开文献如下:张娜,蒋勇军,邹建卫,等.CDK4与靛玉红及其衍生物复合物结构的模建.化学学报,2005,63(9):809-813)。
国内外学者成功运用化学法对靛玉红1位、3`位、5位、5’位、6位、6’位、苯环和母核进行修饰和优化后得到一些抗癌作用更显著的靛玉红类似物及衍生物。例如,5-磺酸靛玉红,5-磺酸钠-3`肟基-靛玉红(公开专利如下:(kimyc,kimsw,kimts,etal.indirubinderivativeshavinganticancerpropertyagainsthumancancercellme:PCT,WOPatent2005/070416A1,2005-08-05)、(kimyc,kimsw,kimts,etal.indirubinderivativeshavinganticancerpropertyagainsthumancancercellline:USPatent2009/7572923B2,2009-08-11.)、(EisenbrandG,HeinzHF,DorisMetal.Useofcellmembranepenetratingofindigoidbisindolederivatives,USPatent2003/6664285B1,2003-12-16.)、(OlafP,Andreas,S,GerhardS,etal.sulfurcontainingindirubinderivatives,theirproductionanduse:USPatent20020107404A1,2002-08-08)、(EisenbrandGandGuatavK.Useofindigoidbisindolederivativesforthemanufactureofamedicamenttoinhibitcyclindependentkinaseinhibitors:PCT,WO99/62503Patent,1999-12-09))5-甲基靛玉红,5-磺酸甲基靛玉红,5-磺酸甲基-3`肟基-靛玉红(EP1079826B1,US20020107404A1),5-氟、氯、溴、碘-1-甲基靛玉红,1-甲基-3’-肟基-靛玉红;1-甲基-6-溴-靛玉红,1-甲基-6-溴-3’-肟基(US20100331327A1,WO2005/041954A1),6-羟基-5甲基-靛玉红(EP1476426B1),5’-羟基-5-硝基-3’-肟基-靛玉红,5’-氯-5-硝基-3’-肟基-靛玉红(US20120295948A1),6-溴-靛玉红;6,6’-二溴-靛玉红;6-溴-3’-肟基-靛玉红;6,6’-二溴-3’-肟基-靛玉红,6-溴-3’-甲肟基-靛玉红(WO2005/041954A1)等,其中以3`位的取代肟基、5位取代磺酸基和磺酸甲基研究最多,例如5-磺酸钠-3`肟基-靛玉红,修饰后的产物提高了水溶性,抗肿瘤活性增强,具有显著地抑制周期蛋白依赖性激酶(cyclin-dependentkinase,CDKs)和糖原合成酶激酶3(Pharmacologicalinhibitorsofglycogensynthasekinase-3,GSK-3β)活性,有望成为理想的抑制肿瘤、阿尔兹海默病(Alzheimer'sdisease,AD)的候选药物,虽然化学修饰为大规模制备靛玉红相关衍生物提供了广阔的前景,但是但化学合成法存在得率低、选择性差、副产品多、过程较繁杂等缺点,具有一定的局限性,无法得到更多的磺酸或者肟基取代的靛玉红衍生物。
而在另一方面,梅乐和等(梅乐和.细胞色素P450BM-3D168R变体酶以及应用其制备靛玉红的方法[硕士学位论文].浙江大学,2008)利用定向进化技术,以(F87V/A74G/L188Q/E435T)为父本,通过定点饱和突变得到P450BM-3D168R变体酶,可催化吲哚合成多种靛玉红衍生物,部分产物靛玉红-5,5`-二甲酸甲酯、靛玉红-5`-甲酸-5-甲酸甲酯和5,5`-二苄氧基-靛玉红对GSK-3α/β、CDK1/cyclinB、CDK5/p25等靶点蛋白表现出突出的抑制效应。其中GSK-3α/β有明显的抑制效应,但是生物合成方法,仍旧存在生产产率低、技术成本高、副产物多,分离难度大等缺陷,因此,需要利用微生物仿生代谢生产发酵优化,提高靛玉红衍生物产物的产率,直接得到多种与体内代谢活性相同或者不同的靛玉红羟基化或者磺基化靛玉红衍生物(公开文献为:杨波.靛玉红体内外代谢研究[硕士学位论文].第三军医大学,2009)。
【发明内容】
本发明要解决的技术问题之一,在于提供一种靛玉红衍生物的制备方法,该方法绿色环保、选择性强、产率高,能够大规模利用微生物制备靛玉红衍生物。
本发明是这样实现上述技术问题之一的:
一种靛玉红衍生物的制备方法,包括以下步骤:
步骤一:取靛玉红15~20mg,溶解于150~200mL乙酸乙酯,使靛玉红浓度为0.1mg/mL;另取磷脂550~572mg,使靛玉红与磷脂摩尔比为1:10混合,60℃搅拌反应2.0h,反应完毕,除去乙酸乙酯,残余物用适量正己烷溶解后,离心后取上清液,将上清液转移至真空干燥器中减压干燥,所得紫红色半固体产物即为靛玉红磷脂复合物;
步骤二:取保存于4℃、土豆斜面培养基培养的、转化菌种一支,置于25℃恒温培养箱中培养7天后,以适量无菌水将斜面上的孢子充分吹打下来,使单孢子悬液的浓度调整至107~108个/mL,既得种子孢子液;
步骤三:以100ml,5mL的接种量,在土豆液体培养基上接种步骤二所得孢子液,在pH至6.0,温度30℃±1℃,振荡速度为200r/min条件下培养12h后;按0.1~4ug的接种量,加入各种不同比例的联合诱导子,继续培养12h后,再按1~10ug的接种量加入步骤一所得的靛玉红磷脂复合物,然后继续培养5天,每天检测各种靛玉红衍生物的含量和转化率,当产物转化率低至0.5~3%时,停止培养,过滤后收集菌丝体,然后将滤液于8000r/min,离心10min去除沉淀既得到发酵提取液;
步骤四:将步骤三提取液过滤,滤液用等体积的乙酸乙酯萃取3遍,合并萃取液;而菌丝体则用与其重量比为1:3~1:10的乙酸乙酯超声提取30min,然后滤去菌丝体,所得滤液与萃取液合并,既得分离提取液;
步骤五:将经过步骤四处理所得的分离提取液,先用1mg:1~10mL的乙醇溶解后,采用硅胶拌样后挥干,称取20倍于样品量的硅胶,使用湿法进行填柱(欣维尔,MCT-G-05;装样量为每mL为20g硅胶)和上样;首先用5倍柱体积的100%石油醚将样品中低极性油类物质洗脱干净,再依次用以下6种洗脱液进行洗脱:体积比为5:3、5:4、1:1、1:2的石油醚:二氯甲烷洗脱液,二氯甲烷洗脱液,体积比为5:1、5:2、1:1、1:3、1:5的二氯甲烷:乙酸乙酯洗脱液,乙酸乙酯洗脱液,体积比为5:2、5:4、1:1、1:2的乙酸乙酯:甲醇洗脱液,以及甲醇洗脱液;然后TLC控制收集主馏分,使用旋转蒸发仪将各个馏分溶液蒸干后,用适量甲醇溶解,再用0.22μm的滤膜过滤后,即得各种靛玉红衍生物分离液;
步骤六:将经过步骤五处理所得的各种靛玉红衍生物分离液,采用高效液相半制备法分离纯化,HPLC梯度洗脱法控制收集不同的靛玉红衍生物洗脱液,减压蒸去溶剂后,用甲醇结晶,即得靛玉红衍生物。
进一步地,所述土豆培养基为:土豆200g/L,葡萄糖20g/L;配置时将土豆去皮后将其切成小块,加水加热煮沸30min,过滤。取滤液定容至1L,加入葡萄糖20g,搅拌溶解后,121℃灭菌30min,即得;
所述斜面培养基为:取上述土豆培养基1L,加入琼脂粉各20g,加热溶解后分装于玻璃试管中,于121℃下灭菌30min后取出,倾斜45度,静置、冷却既得。
进一步地,所述转化菌种为下述微生物中任意一种:
短刺小克银汉霉(Cunninghamellablakesleana)包括:AS3.970;AS3.153;AS3.910;AS3.954,AS3.2016;AS3.2017;AS3.2018;AS3.3401;或者刺孢小克银汉霉(Cunninghamellaechinulata)包括:AS3.154;AS3.952;AS3.953;AS3.1969;AS3.1970;AS3.1971;AS3.1977;AS3.1978;AS3.1979;AS3.1980;AS3.1981;AS3.1987;AS3.1988;AS3.1989;AS3.1990;AS3.2000;AS3.2004;AS3.2005;AS3.2006;AS3.2011;AS3.2015;AS3.2473;AS3.2474;AS3.2475;AS3.2716;AS3.400;或者雅致小克银汉霉(Cunninghamellaelegans.)包括:AS3.156;AS3.1207;AS3.1659;AS3.2028;AS3.2031;AS3.2032;AS3.2033;AS3.2041;AS3.2476;AS3.2477;AS3.2717;AS3.3402;AS3.2476;小克银汉霉CFCC5029;或者Cunninghamellaechinulatavar.elegans(Lendner)LunnetShipton,teleomorphATCC9245;ATCC8688a;ATCC8983;或者Cunninghamellaechinulata(Thaxter)Thaxtervar.echinulata,teleomorphATCC11585a;ATCC36190;ATCC11585b;ATCC9244;或者Cunninghamellaechinulatavar.elegans(Lendner)LunnetShipton,teleomorphATCC11064;ATCC10028a;或者CunninghamellaelegansATCC36112;ATCC26269;ATCC10028b;黑曲霉Aspergillusniger包括:AS3.40;AS3.315;AS3.316;AS3.350;AS3.429;AS3.739;、AS3.879;AS3.939;AS3.940;AS3.1858;AS3.2931;AS3.3882;AS3.3883;AS3.4303;AS3928;AS3.4304;AS3.4309;AS3.4463;AS3.4304;AS3.4523;黄曲霉、刺囊毛霉、细孢毛霉、链格孢、微紫青霉和荨麻青霉。
进一步地,所述的联合诱导子为下述三组物质中的至少两组中的任意一种物质组成:
A组:A1为水杨酸,A2为乙酰水杨酸,A3为磺基水杨酸,A4为苯甲酸,A5为水杨酸甲酯、A6为对氨基水杨酸、A7为3,5-二硝基水杨酸酯、A8为3,5-二硝基水杨酸、A9为硫代水杨酸、A10为5-[对-(2-吡啶胺磺酰基)苯]偶氮水杨酸醇/异莰醇酯、A11为5-[对-(2-吡啶胺磺酰基)苯]偶氮水杨酸、A12为水杨酸4-庚烯-2-基酯、A13为水杨酸辛酯、A14为水杨酸锌、A15为水杨酰胺、A16为水杨酸钠、A17为乙酰水杨酸钠、A18为5-磺基水杨酸、A19为5-磺基水杨酸钠、A20为苯甲酸钠、A21为水杨酸乙酯、A21为对氨基水杨酸钠、A22为水杨酸镁;
B组:B1为茉莉酸甲酯,B2为β-环糊精,B3为壳聚糖,B4为茉莉酸,B5为为羧甲基-β-环糊精,B6为2,6-二甲基-β-环糊精,B7为谷胱甘肽,B8为2-羟乙基茉莉,B9为磺丁基-β-环糊精,B10为羟乙基-β-环糊精,B11为甲壳素;B12为小克银汉霉属AL4粗诱导子,B13为α-环糊精,B14为2-羟丙基-β-环糊精,B15为甲基化-β-环糊精;
C组:C1为卡马西平,C2为莫达非尼,C3为奈韦拉平,C4为利福平,C5为贯叶连翘,C6为异烟肼,C7为胰岛素,C8为奥美拉唑,C9为苯巴比妥,C10为泼尼松,C11为泼尼松龙,C12为地塞米松,C13为倍他米松,C14为倍氯米松,C15为戊酸倍他米松,C16为醋酸地塞米松,C17为9-氟-16α-甲基11β,17-二羟基-3-氧-1,4-雄二烯-17β-羧酸。
进一步地,TLC控制收集主馏分,用体积比为5:4:4的石油醚、二氯甲烷和乙酸乙酯为展开剂;
所述产物转化率的高效液相色谱检测方法为:色谱柱AgilentZORBAXEclipseXDB-C18柱,其中分析柱内径乘以长度为4.6mm×250mm,粒径为5μm;吸收波长:292nm,流动相体积比:甲醇:水=75:25,流速:0.5ml/min、柱温:25℃、进样量100μl。
进一步地,所述方法可用于制备以下靛玉红衍生物:
A类:1`-(2-甲基-5-磺酸)环戊烷-靛玉红、1`-(2-甲基-4-磺酸)环戊烷-靛玉红、1`-(2-甲基-3-磺酸)环戊烷-靛玉红、1`-(2-甲基-2-磺酸)环戊烷-靛玉红;1`-(3-甲基-5-磺酸)环戊烷-靛玉红、1`-(3-甲基-4-磺酸)环戊烷-靛玉红、1`-(3-甲基-3-磺酸)环戊烷-靛玉红、1`-(3-甲基-2-磺酸)环戊烷-靛玉红;1`-(4-甲基-5-磺酸)环戊烷-靛玉红、1`-(4-甲基-4-磺酸)环戊烷-靛玉红、1`-(4-甲基-3-磺酸)环戊烷-靛玉红、1`-(4-甲基-2-磺酸)环戊烷-靛玉红;1`-(5-甲基-5-磺酸)环戊烷-靛玉红、1`-(5-甲基-4-磺酸)环戊烷-靛玉红、1`-(5-甲基-3-磺酸)环戊烷-靛玉红、1`-(5-甲基-2-磺酸)环戊烷-靛玉红;或者1`-(2-磺酸-4-甲基酸)环戊烷-靛玉红、1`-(2-磺酸-3-甲基)环戊烷-靛玉红、1`-(2-磺酸-2-甲基)环戊烷-靛玉红;1`-(3-磺酸-5-甲基)环戊烷-靛玉红、1`-(3-磺酸-4-甲基)环戊烷-靛玉红、1`-(3-磺酸-3-甲基)环戊烷-靛玉红、1`-(3-磺酸-2-甲基)环戊烷-靛玉红;1`-(4-磺酸-5-甲基)环戊烷-靛玉红、1`-(4-磺酸-4-甲基)环戊烷-靛玉红、1`-(4-磺酸-3-甲基)环戊烷-靛玉红、1`-(4-磺酸-2-甲基)环戊烷-靛玉红;1`-(5-磺酸-5-甲基)环戊烷-靛玉红、1`-(5-磺酸-4-甲基)环戊烷-靛玉红、1`-(5-磺酸-3-甲基)环戊烷-靛玉红、1`-(5-磺酸-2-甲基)环戊烷-靛玉红;
B类:与A类化合物取代基相同的1位的取代的靛玉红衍生物;
C类:在A类或者B类化合物各种取代位置上增加5或者5’羟基取代的靛玉红衍生物。
D类:1,1′-二磺酸基-3`--羟基-靛玉红、1,5-二磺酸基-3`--羟基-靛玉红、1,5′-二磺酸基-3`--羟基-靛玉红、1,6-二磺酸基-3`--羟基-靛玉红,1,6′-二磺酸基-3`--羟基-靛玉红、1,7-二磺酸基-3`--羟基-靛玉红、1,7′-二磺酸基-3`--羟基-靛玉红、1-二磺酸基-3`--羟基-靛玉红、1′-二磺酸基-3`--羟基-靛玉红、4-二磺酸基-3`--羟基-靛玉红、4′-二磺酸基-3`--羟基-靛玉红、5-二磺酸基-3`--羟基-靛玉红、5′-二磺酸基-3`--羟基-靛玉红、6-二磺酸基-3`--羟基-靛玉红、6′-二磺酸基-3`--羟基-靛玉红、7-二磺酸基-3`--羟基-靛玉红、7′-二磺酸基-3`--羟基-靛玉红、4,1′-二磺酸基-3`--羟基-靛玉红、5,1′-二磺酸基-3`--羟基-靛玉红、6,1′-二磺酸基-3`--羟基-靛玉红、7,1′-二磺酸基-3`--羟基-靛玉红、4′,1′-二磺酸基-3`--羟基-靛玉红、5′,1′-二磺酸基-3`--羟基-靛玉红、6′,1′-二磺酸基-3`--羟基-靛玉红、7′,1′-二磺酸基-3`--羟基-靛玉红,4,4′-二磺酸基-3`--羟基-靛玉红、5,5′-二磺酸基-3`--羟基-靛玉红、6,6′-二磺酸基-3`--羟基-靛玉红和7,7′-二磺酸基-3`--羟基-靛玉红。
本发明要解决的技术问题之二,在于提供一种靛玉红衍生物,其具有高效、低毒等特点,能够用于治疗肿瘤、病毒以及心肌缺血再灌注损伤等相关疾病。
本发明是这样实现上述技术问题之二的:
一种靛玉红衍生物,所述靛玉红衍生物的结构式Ⅰ如下:
其中R1和R2独立地是氢、烷基,其中的任何一个,可以由烷基、磺基或者烷磺基取代,其中所述烷基、或者烷磺基包括至多六个碳原子;基团X中,即X1,X2,X3,X4,X5,X6中至多有两个烷基、羟基、磺基或者烷磺基,其余为氢,结构式Ⅰ中连接R1、R2及基团X的“—”键可代表或
进一步地,当R1为SO3H时,R2,X1,X2,X3,X4,X5,X6,中有一个为(CH2)nCH3,其余为氢;或者其中一个为(CH2)nCH3,一个为CH3,其余为氢;或者其中一个为(CH2)nCH3,一个为OH,其余为氢;或者其中一个为(CH2)n,一个为OH和一个为CH3,其余为氢;
当R1为(CH2)nCH3,R2,X1,X2,X3,X4,X5,X6其中其中有一个为SO3H,其余为氢;或者其中有一个为SO3H,一个为OH,其余为氢;
当R1为CH3时R2,X1,X2,X3,X4,X5,X6中有一个为(CH2)nSO3H,其余为氢;或者其中一个为SO3H,一个为(CH2)n,其余为氢;或者其中一个为(CH2)nSO3H,一个为OH,其余为氢;或者其中一个为SO3H,一个为(CH2)n,一个为OH,其余为氢;
当R1为(CH2)n,R2,X1,X2,X3,X4,X5,X6其中一个为SO3H,一个为CH3,其余为氢;或者其中一个为SO3H、一个为CH3、一个为OH,其余为氢;
当R1为(CH2)nSO3H,R2,X1,X2,X3,X4,X5,X6其中一个为CH3,其余为氢;
或者其中一个为CH3,一个为OH,其余为氢;
或者R1和R2均为H时,X1,X2,X3,X4,X5,X6中至多两个为羟基,其余为氢;
其中,所述n=1~6。
进一步地,所述靛玉红衍生物具体为:1`-(2-磺酸基-5-甲基)环戊烷-靛玉红、1-(2-磺酸基-5-甲基)环戊烷-靛玉红、1`-(2-磺酸基-5-甲基)环戊烷-5-羟基-靛玉红、1`-(2-磺酸基-5-甲基)环戊烷-5`-羟基-靛玉红、1-(2-磺酸基-5-甲基)环戊烷-5`-羟基-靛玉红、1-(2-磺酸基-5-甲基)环戊烷-5-羟基-靛玉红、5-羟基-靛玉红、5`-羟基-靛玉红。
进一步地,所述一种靛玉红衍生物可用于治疗与肿瘤相关的疾病,包括肺癌、肝癌、前列腺癌、人卵巢癌、腺癌、乳腺癌、粒细胞白血病、结肠癌、阿霉素敏感的肺癌、乳腺癌、肝癌、阿霉素抗药的肺癌、乳腺癌、肝癌。
进一步地,所述的一种靛玉红衍生物可用于治疗与病毒相关疾病,包括艾滋病、乙肝、疱疹、流感病毒。
进一步地,所述一种靛玉红衍生物可用于治疗与心肌缺血再灌注损伤相关的疾病,包括冠心病、心肌病、心衰和心肌梗塞。
本发明要解决的技术问题之三,在于提供另一种靛玉红衍生物,其具有高效、低毒等特点,能够用于治疗肿瘤、病毒以及心肌缺血再灌注损伤等相关疾病。
本发明是这样实现上述技术问题之三的:
一种靛玉红衍生物,所述靛玉红衍生物的结构式II如下:
其中R1′和R2′独立地是氢或者磺基或者双磺基取代,基团X′中,即X1′,X2′,X3′,X4′,X5′,X6′中至多有两个磺基或者羟基,其余为氢;结构式II中连接R1′、R2′及基团X′的“—”键可代表或
进一步地,当R1′为SO3H时,R2′,X1′,X2′,X3′,X4′,X5′,X6′其中有一个为SO3H,其余为氢;
或者R1′为SO3SO3H时,R2′,X1′,X2′,X3′,X4′,X5′,X6′均为氢;
或者R1′为H时,R2′,X1′,X2′,X3′,X4′,X5′,X6′其中有两个为SO3H,其余为氢;
或者R1′为H时,R2′,X1′,X2′,X3′,X4′,X5′,X6′其中有一个为SO3SO3H,其余为氢。
进一步地,所述靛玉红衍生物具体为:1,1′-二磺酸基-3`--羟基-靛玉红、1,5′-二磺酸基-3`--羟基-靛玉红、1,5-二磺酸基-3`--羟基-靛玉红、1,双磺酸基-3`--羟基-靛玉红、1′,双磺酸基-3`--羟基-靛玉红、5,双磺酸基-3`--羟基-靛玉红和5′,双磺酸基-3`--羟基-靛玉红。
进一步地,所述一种靛玉红衍生物可用于治疗与肿瘤相关的疾病,包括肺癌、肝癌、前列腺癌、人卵巢癌、腺癌、乳腺癌、粒细胞白血病、结肠癌、阿霉素敏感的肺癌、乳腺癌、肝癌、阿霉素抗药的肺癌、乳腺癌、肝癌。
进一步地,所述一种靛玉红衍生物可用于治疗与病毒相关疾病,包括艾滋病、乙肝、疱疹、流感病毒。
进一步地,所述一种靛玉红衍生物可用于治疗与心肌缺血再灌注损伤相关的疾病,包括冠心病、心肌病、心衰和心肌梗塞。
本发明具有如下优点:
本发明首次利用具有仿生代谢能力的短刺小克银汉霉(Cunninghamellablakesleeana)直接代谢靛玉红,结合茉莉酸甲酯(MeJA)、地塞米松、β-环糊精等生物或者非生物诱导子对其代谢过程的诱导调控技术,同时得到新的靛玉红衍生物,而且各种产物抑制肿瘤的活性显著,提高了短刺小克银汉霉(Cunninghamellablakesleeana)对靛玉红的转化率,并将1-(2-磺酸基-5-甲基)环戊烷-靛玉红的产率提高5.8倍,1`-(2-磺酸基-5-甲基)环戊烷-5-羟基-靛玉红和1-(2-磺酸基-5-甲基)环戊烷-5`-羟基-靛玉红的产率分别提高了3.32倍和1.51倍。与以往的制备技术相比,本发明技术,具有绿色、环保、选择性强,产率高等特点,为大规模利用生物技术制备靛玉红衍生物提供了广阔的应用前景。
本发明的靛玉红衍生物可用于制备预防和治疗肿瘤、病毒相关疾病、心肌缺血再灌注损伤、扩张性心肌病等疾病,具有良好的用于治疗上述疾病的应用前景。
【具体实施方式】
本发明涉及一种靛玉红衍生物的制备方法,包括以下步骤:
步骤一:取靛玉红15~20mg,溶解于150~200mL乙酸乙酯,使靛玉红浓度为0.1mg/mL;另取磷脂550~572mg,使靛玉红与磷脂摩尔比为1:10混合,60℃搅拌反应2.0h,反应完毕,除去乙酸乙酯,残余物用适量正己烷溶解后,离心后取上清液,将上清液转移至真空干燥器中减压干燥,所得紫红色半固体产物即为靛玉红磷脂复合物;
步骤二:取保存于4℃、土豆斜面培养基培养的、转化菌种一支,置于25℃恒温培养箱中培养7天后,以适量无菌水将斜面上的孢子充分吹打下来,使单孢子悬液的浓度调整至107~108个/mL,既得种子孢子液;
步骤三:以100ml,5mL的接种量,在土豆液体培养基上接种步骤二所得孢子液,在pH至6.0,温度30℃±1℃,振荡速度为200r/min条件下培养12h后;按0.1~4ug的接种量,加入各种不同比例的联合诱导子,继续培养12h后,再按1~10ug的接种量加入步骤一所得的靛玉红磷脂复合物,然后继续培养5天,每天检测各种靛玉红衍生物的含量和转化率,当产物转化率低至0.5~3%时,停止培养,过滤后收集菌丝体,然后将滤液于8000r/min,离心10min去除沉淀既得到发酵提取液;
步骤四:将步骤三提取液过滤,滤液用等体积的乙酸乙酯萃取3遍,合并萃取液;而菌丝体则用与其重量比为1:3~1:10的乙酸乙酯超声提取30min,然后滤去菌丝体,所得滤液与萃取液合并,既得分离提取液;
步骤五:将经过步骤四处理所得的分离提取液,先用1mg:1~10mL的乙醇溶解后,采用硅胶拌样后挥干,称取20倍于样品量的硅胶,使用湿法进行填柱(欣维尔,MCT-G-05;装样量为每mL为20g硅胶)和上样;首先用5倍柱体积的100%石油醚将样品中低极性油类物质洗脱干净,再依次用以下6种洗脱液进行洗脱:体积比为5:3、5:4、1:1、1:2的石油醚:二氯甲烷洗脱液,二氯甲烷洗脱液,体积比为5:1、5:2、1:1、1:3、1:5的二氯甲烷:乙酸乙酯洗脱液,乙酸乙酯洗脱液,体积比为5:2、5:4、1:1、1:2的乙酸乙酯:甲醇洗脱液,以及甲醇洗脱液;然后TLC控制收集主馏分,使用旋转蒸发仪将各个馏分溶液蒸干后,用适量甲醇溶解,再用0.22μm的滤膜过滤后,即得各种靛玉红衍生物分离液;
步骤六:将经过步骤五处理所得的各种靛玉红衍生物分离液,采用高效液相半制备法分离纯化,HPLC梯度洗脱法控制收集不同的靛玉红衍生物洗脱液,减压蒸去溶剂后,用甲醇结晶,即得靛玉红衍生物。
所述土豆培养基为:土豆200g/L,葡萄糖20g/L;配置时将土豆去皮后将其切成小块,加水加热煮沸30min,过滤。取滤液定容至1L,加入葡萄糖20g,搅拌溶解后,121℃灭菌30min,即得;
所述斜面培养基为:取上述土豆培养基1L,加入琼脂粉各20g,加热溶解后分装于玻璃试管中,于121℃下灭菌30min后取出,倾斜45度,静置、冷却既得。
所述转化菌种为下述微生物中任意一种:
短刺小克银汉霉(Cunninghamellablakesleana)包括:AS3.970;AS3.153;AS3.910;AS3.954,AS3.2016;AS3.2017;AS3.2018;AS3.3401;或者刺孢小克银汉霉(Cunninghamellaechinulata)包括:AS3.154;AS3.952;AS3.953;AS3.1969;AS3.1970;AS3.1971;AS3.1977;AS3.1978;AS3.1979;AS3.1980;AS3.1981;AS3.1987;AS3.1988;AS3.1989;AS3.1990;AS3.2000;AS3.2004;AS3.2005;AS3.2006;AS3.2011;AS3.2015;AS3.2473;AS3.2474;AS3.2475;AS3.2716;AS3.400;或者雅致小克银汉霉(Cunninghamellaelegans.)包括:AS3.156;AS3.1207;AS3.1659;AS3.2028;AS3.2031;AS3.2032;AS3.2033;AS3.2041;AS3.2476;AS3.2477;AS3.2717;AS3.3402;AS3.2476;小克银汉霉CFCC5029;或者Cunninghamellaechinulatavar.elegans(Lendner)LunnetShipton,teleomorphATCC9245;ATCC8688a;ATCC8983;或者Cunninghamellaechinulata(Thaxter)Thaxtervar.echinulata,teleomorphATCC11585a;ATCC36190;ATCC11585b;ATCC9244;或者Cunninghamellaechinulatavar.elegans(Lendner)LunnetShipton,teleomorphATCC11064;ATCC10028a;或者CunninghamellaelegansATCC36112;ATCC26269;ATCC10028b;黑曲霉Aspergillusniger包括:AS3.40;AS3.315;AS3.316;AS3.350;AS3.429;AS3.739;、AS3.879;AS3.939;AS3.940;AS3.1858;AS3.2931;AS3.3882;AS3.3883;AS3.4303;AS3928;AS3.4304;AS3.4309;AS3.4463;AS3.4304;AS3.4523;黄曲霉、刺囊毛霉、细孢毛霉、链格孢、微紫青霉和荨麻青霉。
所述的联合诱导子为下述三组物质中的至少两组中的任意一种物质组成:
A组:A1为水杨酸,A2为乙酰水杨酸,A3为磺基水杨酸,A4为苯甲酸,A5为水杨酸甲酯、A6为对氨基水杨酸、A7为3,5-二硝基水杨酸酯、A8为3,5-二硝基水杨酸、A9为硫代水杨酸、A10为5-[对-(2-吡啶胺磺酰基)苯]偶氮水杨酸醇/异莰醇酯、A11为5-[对-(2-吡啶胺磺酰基)苯]偶氮水杨酸、A12为水杨酸4-庚烯-2-基酯、A13为水杨酸辛酯、A14为水杨酸锌、A15为水杨酰胺、A16为水杨酸钠、A17为乙酰水杨酸钠、A18为5-磺基水杨酸、A19为5-磺基水杨酸钠、A20为苯甲酸钠、A21为水杨酸乙酯、A21为对氨基水杨酸钠、A22为水杨酸镁;
B组:B1为茉莉酸甲酯,B2为β-环糊精,B3为壳聚糖,B4为茉莉酸,B5为为羧甲基-β-环糊精,B6为2,6-二甲基-β-环糊精,B7为谷胱甘肽,B8为2-羟乙基茉莉,B9为磺丁基-β-环糊精,B10为羟乙基-β-环糊精,B11为甲壳素;B12为小克银汉霉属AL4粗诱导子,B13为α-环糊精,B14为2-羟丙基-β-环糊精,B15为甲基化-β-环糊精;
C组:C1为卡马西平,C2为莫达非尼,C3为奈韦拉平,C4为利福平,C5为贯叶连翘,C6为异烟肼,C7为胰岛素,C8为奥美拉唑,C9为苯巴比妥,C10为泼尼松,C11为泼尼松龙,C12为地塞米松,C13为倍他米松,C14为倍氯米松,C15为戊酸倍他米松,C16为醋酸地塞米松,C17为9-氟-16α-甲基11β,17-二羟基-3-氧-1,4-雄二烯-17β-羧酸。
所述的联合诱导子为以下配比中的任意一种或者其他比例:A1:B1=1:1、A3:B1=1:4、A6:B6=2:3、B1:C1=1:1、B1:C12=1:6、B9:C17=3:5、A1:C1=1:1、A3:C12=2:5、A8:C17=5:3、A1:B1:C1=1:1:1、A3:B1:C12=2:3:5、A8:B6:C13=1:3:1。上述各成分之间的配比均为摩尔比。
TLC控制收集主馏分,用体积比为5:4:4的石油醚、二氯甲烷和乙酸乙酯为展开剂;
所述产物转化率的高效液相色谱检测方法为:色谱柱AgilentZORBAXEclipseXDB-C18柱,其中分析柱内径乘以长度为4.6mm×250mm,粒径为5μm;吸收波长:292nm,流动相体积比:甲醇:水=75:25,流速:0.5ml/min、柱温:25℃、进样量100μl。
所述方法可用于制备以下靛玉红衍生物:
A类:1`-(2-甲基-5-磺酸)环戊烷-靛玉红、1`-(2-甲基-4-磺酸)环戊烷-靛玉红、1`-(2-甲基-3-磺酸)环戊烷-靛玉红、1`-(2-甲基-2-磺酸)环戊烷-靛玉红;1`-(3-甲基-5-磺酸)环戊烷-靛玉红、1`-(3-甲基-4-磺酸)环戊烷-靛玉红、1`-(3-甲基-3-磺酸)环戊烷-靛玉红、1`-(3-甲基-2-磺酸)环戊烷-靛玉红;1`-(4-甲基-5-磺酸)环戊烷-靛玉红、1`-(4-甲基-4-磺酸)环戊烷-靛玉红、1`-(4-甲基-3-磺酸)环戊烷-靛玉红、1`-(4-甲基-2-磺酸)环戊烷-靛玉红;1`-(5-甲基-5-磺酸)环戊烷-靛玉红、1`-(5-甲基-4-磺酸)环戊烷-靛玉红、1`-(5-甲基-3-磺酸)环戊烷-靛玉红、1`-(5-甲基-2-磺酸)环戊烷-靛玉红;或者1`-(2-磺酸-4-甲基酸)环戊烷-靛玉红、1`-(2-磺酸-3-甲基)环戊烷-靛玉红、1`-(2-磺酸-2-甲基)环戊烷-靛玉红;1`-(3-磺酸-5-甲基)环戊烷-靛玉红、1`-(3-磺酸-4-甲基)环戊烷-靛玉红、1`-(3-磺酸-3-甲基)环戊烷-靛玉红、1`-(3-磺酸-2-甲基)环戊烷-靛玉红;1`-(4-磺酸-5-甲基)环戊烷-靛玉红、1`-(4-磺酸-4-甲基)环戊烷-靛玉红、1`-(4-磺酸-3-甲基)环戊烷-靛玉红、1`-(4-磺酸-2-甲基)环戊烷-靛玉红;1`-(5-磺酸-5-甲基)环戊烷-靛玉红、1`-(5-磺酸-4-甲基)环戊烷-靛玉红、1`-(5-磺酸-3-甲基)环戊烷-靛玉红、1`-(5-磺酸-2-甲基)环戊烷-靛玉红;
B类:与A类化合物取代基相同的1位的取代的靛玉红衍生物;
C类:在A类或者B类化合物各种取代位置上增加5或者5’羟基取代的靛玉红衍生物。
D类:1,1′-二磺酸基-3`--羟基-靛玉红、1,5-二磺酸基-3`--羟基-靛玉红、1,5′-二磺酸基-3`--羟基-靛玉红、1,6-二磺酸基-3`--羟基-靛玉红,1,6′-二磺酸基-3`--羟基-靛玉红、1,7-二磺酸基-3`--羟基-靛玉红、1,7′-二磺酸基-3`--羟基-靛玉红、1-二磺酸基-3`--羟基-靛玉红、1′-二磺酸基-3`--羟基-靛玉红、4-二磺酸基-3`--羟基-靛玉红、4′-二磺酸基-3`--羟基-靛玉红、5-二磺酸基-3`--羟基-靛玉红、5′-二磺酸基-3`--羟基-靛玉红、6-二磺酸基-3`--羟基-靛玉红、6′-二磺酸基-3`--羟基-靛玉红、7-二磺酸基-3`--羟基-靛玉红、7′-二磺酸基-3`--羟基-靛玉红、4,1′-二磺酸基-3`--羟基-靛玉红、5,1′-二磺酸基-3`--羟基-靛玉红、6,1′-二磺酸基-3`--羟基-靛玉红、7,1′-二磺酸基-3`--羟基-靛玉红、4′,1′-二磺酸基-3`--羟基-靛玉红、5′,1′-二磺酸基-3`--羟基-靛玉红、6′,1′-二磺酸基-3`--羟基-靛玉红、7′,1′-二磺酸基-3`--羟基-靛玉红,4,4′-二磺酸基-3`--羟基-靛玉红、5,5′-二磺酸基-3`--羟基-靛玉红、6,6′-二磺酸基-3`--羟基-靛玉红和7,7′-二磺酸基-3`--羟基-靛玉红。
本发明还涉及上述一种靛玉红衍生物的制备方法制得的靛玉红衍生物,所述靛玉红衍生物的结构式Ⅰ如下:
其中R1和R2独立地是氢、烷基,其中的任何一个,可以由烷基、磺基或者烷磺基取代,其中所述烷基、或者烷磺基包括至多六个碳原子;基团X中,即X1,X2,X3,X4,X5,X6中至多有两个烷基、羟基、磺基或者烷磺基,其余为氢,结构式Ⅰ中连接R1、R2及基团X的“—”键可代表或
当R1为SO3H时,R2,X1,X2,X3,X4,X5,X6,中有一个为(CH2)nCH3,其余为氢;或者其中一个为(CH2)nCH3,一个为CH3,其余为氢;或者其中一个为(CH2)nCH3,一个为OH,其余为氢;或者其中一个为(CH2)n,一个为OH和一个为CH3,其余为氢;
当R1为(CH2)nCH3,R2,X1,X2,X3,X4,X5,X6其中其中有一个为SO3H,其余为氢;或者其中有一个为SO3H,一个为OH,其余为氢;
当R1为CH3时R2,X1,X2,X3,X4,X5,X6中有一个为(CH2)nSO3H,其余为氢;或者其中一个为SO3H,一个为(CH2)n,其余为氢;或者其中一个为(CH2)nSO3H,一个为OH,其余为氢;或者其中一个为SO3H,一个为(CH2)n,一个为OH,其余为氢;
当R1为(CH2)n,R2,X1,X2,X3,X4,X5,X6其中一个为SO3H,一个为CH3,其余为氢;或者其中一个为SO3H、一个为CH3、一个为OH,其余为氢;
当R1为(CH2)nSO3H,R2,X1,X2,X3,X4,X5,X6其中一个为CH3,其余为氢;
或者其中一个为CH3,一个为OH,其余为氢;
或者R1和R2均为H时,X1,X2,X3,X4,X5,X6中至多两个为羟基,其余为氢;其中,所述n=1~6。
本发明还涉及上述一种靛玉红衍生物的制备方法制得的另一种靛玉红衍生物,所述靛玉红衍生物的结构式II如下:
其中R1′和R2′独立地是氢或者磺基或者双磺基取代,基团X′中,即X1′,X2′,X3′,X4′,X5′,X6′中至多有两个磺基或者羟基,其余为氢;结构式II中连接R1′、R2′及基团X′的“—”键可代表或
当R1′为SO3H时,R2′,X1′,X2′,X3′,X4′,X5′,X6′其中有一个为SO3H,其余为氢;
或者R1′为SO3SO3H时,R2′,X1′,X2′,X3′,X4′,X5′,X6′均为氢;
或者R1′为H时,R2′,X1′,X2′,X3′,X4′,X5′,X6′其中有两个为SO3H,其余为氢;
或者R1′为H时,R2′,X1′,X2′,X3′,X4′,X5′,X6′其中有一个为SO3SO3H,其余为氢。
结构式Ⅰ所述靛玉红衍生物具体为:1`-(2-磺酸基-5-甲基)环戊烷-靛玉红、1-(2-磺酸基-5-甲基)环戊烷-靛玉红、1`-(2-磺酸基-5-甲基)环戊烷-5-羟基-靛玉红、1`-(2-磺酸基-5-甲基)环戊烷-5`-羟基-靛玉红、1-(2-磺酸基-5-甲基)环戊烷-5`-羟基-靛玉红、1-(2-磺酸基-5-甲基)环戊烷-5-羟基-靛玉红、5-羟基-靛玉红、5`-羟基-靛玉红
结构式II所述靛玉红衍生物具体为:1,1′-二磺酸基-3`--羟基-靛玉红、1,5′-二磺酸基-3`--羟基-靛玉红、1,5-二磺酸基-3`--羟基-靛玉红、1,双磺酸基-3`--羟基-靛玉红、1′,双磺酸基-3`--羟基-靛玉红、5,双磺酸基-3`--羟基-靛玉红和5′,双磺酸基-3`--羟基-靛玉红。
结构式Ⅰ和II所述的靛玉红衍生物可用于治疗与肿瘤相关的疾病,包括肺癌、肝癌、前列腺癌、人卵巢癌、腺癌、乳腺癌、粒细胞白血病、结肠癌、阿霉素敏感的肺癌、乳腺癌、肝癌、阿霉素抗药的肺癌、乳腺癌、肝癌。
结构式Ⅰ和II所述的靛玉红衍生物可用于治疗与病毒相关疾病,包括艾滋病、乙肝、疱疹、流感病毒。
结构式Ⅰ和II所述的靛玉红衍生物可用于治疗与心肌缺血再灌注损伤相关的疾病,包括冠心病、心肌病、心衰和心肌梗塞。
本发明提供靛玉红衍生物是结构式Ⅰ和Ⅱ所示的化合物或其药学上可接受的盐和它们的光学异构体;
所述“药学上可接受的盐”具体可列举结构式Ⅰ和Ⅱ所示的化合与丙酸、草酸丙二酰、琥珀酸、富马酸、马来酸、乳酸、苹果酸、酒石酸、柠檬酸等有机酸和天冬氨酸、古氨酸等酸性氨基酸形成酯后再与无机碱形成的盐,如钠、钾、钙、铝盐和铵盐或与有机碱形成的盐,如甲胺盐乙胺盐、乙醇胺盐等,或与赖氨酸、精氨酸、鸟氨酸等碱性氨基酸形成酯后的盐酸、氢溴酸、氢氟酸,硫酸、硝酸、磷酸等无机酸的盐,或与甲酸、乙酸、苦味酸、甲磺酸、乙磺酸等有机酸的盐;
“光学异构体”包含对眏异构体、非对眏异构体、光学异构体的混合物及纯光学异构体。
本发明的靛玉红衍生物,其药学上可接受的盐或光学异构体可制成含活性成分0.001~99.9%(重量)以及适量药学上可接受的载体的各种制剂,如适合口服、注射或肠道给药使用的制剂形式。
本发明所述的靛玉红衍生物可以口服、静脉注射、肌肉注射、呼吸道、皮肤或者粘膜给药,包括溶液剂、乳剂、胶囊剂、片剂、注射剂、喷雾剂、气雾剂、外用洗剂、擦剂、贴剂、滴眼剂、滴鼻剂、眼用软膏、含漱剂、舌下片剂、软膏剂、栓剂等。
以下结合具体实施例对本发明作进一步的说明。
实施例一:靛玉红衍生物的制备
1、1`-(2-磺酸基-5-甲基)环戊烷-靛玉红的制备
在100mL土豆液体培养基中接种5mL(108个/mL)短刺小克银汉霉(Cunninghamellablakesleana)AS3.970孢子液,在pH至6.0,温度30℃±1℃,振荡速度为200r/min条件下培养12h后;按0.2ug的接种量,加入各重量比为(9:3:7)的水杨酸(SA,9.23mmol/mL),地塞米松(5mg/mL,DXM)以及β-环糊精(BCD,0.78mmol/mL),继续培养12h后,再按5%的接种量加入靛玉红,然后继续培养5天,停止培养,然后将滤液于8000r/min,离心10min去除沉淀,滤液用等体积的乙酸乙酯萃取3遍,萃取液蒸干后用石油醚2mL溶解后,再用层析硅胶柱分离,依次用体积比为5:3、5:4、1:1、1:2的石油醚:二氯甲烷洗脱液,二氯甲烷洗脱液,体积比为5:1、5:2、1:1、1:3、1:5二氯甲烷:乙酸乙酯洗脱液,乙酸乙酯洗脱液;体积比为5:2、5:4、1:1、1:2的乙酸乙酯:甲醇洗脱液,甲醇洗脱液洗脱,使用旋转蒸发仪将洗脱液蒸干后,用适量甲醇溶解后,再用0.22μm的滤膜过滤后,经高效液相半制备法采用体积比为75:25的甲醇:水洗脱、收集保留时间为3.2~3.7min洗脱液,减压干燥后,用甲醇重结晶,得到淡黄色粉末,1`-(2-磺酸基-5-甲基)环戊烷-靛玉红。(转化率45%)。
高分辨质谱给出分子离子峰[M+1]+在m/zm/z=424.1。13C-NMR谱和1H-NMR如下:
13C-NMR(600MHz,DMSO-d6):188.62(s,C3`),168.99(s,C2),152.48(s,C8`),142.11(s,C8),138.82(s,C2`),137.33(d,C6`),129.97(d,C6),124.56(d,C4),124.45(s,C4`),121.92(s,C9),121.56(d,C5),121.07(d,C5`),119.09(s,C9`),113.60(d,C7`),108.34(d,C7),105.56(s,C3),80.13(s,C1``),77.43(s,C4``),68.70(s,C3``),61.15(s,C5``),29.09(s,C2``),14.03(s,C6``)
1H-NMR(600MHz,DMSO-d6):11.342(1H,s),11.133(1H,s,H-1),8.772(1H,d,H-4`),7.66(1H,d,H-4),7.588(1H,dd,H-6),7.420(1H,d,H-7),7.266(1H,dd,H-6`),7.030(2H,m,H-5,H-5`),6.907(1H,d,H-7`),3.262(1H,t,H-4``),2.612(1H,d,H-1``),2.384(1H,t,H-5``),1.970(1H,t,H-2``),1.229(1H,m,H-3``),1.033(1H,d,H-6``)。
2、1-(2-磺酸基-5-甲基)环戊烷-靛玉红的制备
在100mL土豆液体培养基中接种5mL(108个/mL)短刺小克银汉霉(Cunninghamellablakesleana)AS3.970孢子液,在pH至6.0,温度30℃±1℃,振荡速度为200r/min条件下培养12h后;按0.2ug的接种量,加入各各重量比为(15:4:7)的硫代水杨酸(SA,7.65mmol/mL),戊酸倍他米松(4mg/mL,DXM)以及2-羟丙基-β-环糊精(1.29mmol/mL),继续培养12h后,再按5%的接种量加入靛玉红,然后继续培养5天,停止培养,然后将滤液于8000r/min,离心10min去除沉淀,滤液用等体积的乙酸乙酯萃取3遍,萃取液蒸干后用石油醚2mL溶解后,再用层析硅胶柱分离,依次用体积比为5:3、5:4、1:1、1:2的石油醚:二氯甲烷洗脱液,二氯甲烷洗脱液,体积比为5:1、5:2、1:1、1:3、1:5二氯甲烷:乙酸乙酯洗脱液,乙酸乙酯洗脱液,体积比为5:2、5:4、1:1、1:2的乙酸乙酯:甲醇洗脱液,甲醇洗脱液洗脱,使用旋转蒸发仪将洗脱液蒸干后,用适量甲醇溶解后,再用0.22μm的滤膜过滤后,经高效液相半制备法采用体积比为75:25的甲醇:水洗脱、收集保留时间为3.0~3.5min洗脱液,减压干燥后,用甲醇重结晶,得到淡黄色粉末,1-(2-磺酸基-5-甲基)环戊烷-靛玉红。(转化率62%)。
高分辨质谱给出分子离子峰[M+1]+在m/z424.1。13C-NMR谱和1H-NMR如下:
13C-NMR(600MHz,DMSO-d6):187.62(s,C3`),161.72(s,C2),147.78(s,C8`),135.92(s,C8),145.58(s,C2`),135.63(d,C6`),127.84(d,C6),126.46(d,C4),124.48(s,C4`),125.94(s,C9),123.86(d,C5),120.02(d,C5`),123.27(s,C9`),116.70(d,C7`),119.94(d,C7),120.41(s,C3),80.13(s,C1``),77.43(s,C4``),68.70(s,C3``),61.15(s,C5``),29.09(s,C2``),14.03(s,C6``)
1H-NMR(600MHz,DMSO-d6):11.43(1H,s),10.827(1H,s,H-1),8.76(1H,d,H-4`),7.64(1H,d,H-4),7.61(1H,dd,H-6),7.425(1H,d,H-7),7.23(1H,dd,H-6`),7.101(2H,m,H-5,H-5`),6.911(1H,d,H-7`),3.259(1H,t,H-4``),2.622(1H,d,H-1``),2.387(1H,t,H-5``),1.968(1H,t,H-2``),1.232(1H,m,H-3``),1.15(1H,d,H-6``)。
3、1`-(2-磺酸基-5-甲基)环戊烷-5-羟基-靛玉红的制备
在100mL土豆液体培养基中接种5mL(108个/mL)短刺小克银汉霉(Cunninghamellablakesleana)AS3.970孢子液,在pH至6.0,温度30℃±1℃,振荡速度为200r/min条件下培养12h后;按0.2ug的接种量,加入各重量比为(5:3:2:5)的茉莉酸甲酯(MeJA,0.35mmol/mL),水杨酸(SA,5.46mmol/mL),地塞米松(5mg/mL,DXM)以及2-羟丙基-β-环糊精(1.38mmol/mL),继续培养12h后,再按5%的接种量加入靛玉红,然后继续培养5天,停止培养,然后将滤液于8000r/min,离心10min去除沉淀,滤液用等体积的乙酸乙酯萃取3遍,萃取液蒸干后用石油醚2mL溶解后,再用层析硅胶柱分离,依次用体积比为5:3、5:4、1:1、1:2的石油醚:二氯甲烷洗脱液,二氯甲烷洗脱液,体积比为5:1、5:2、1:1、1:3、1:5二氯甲烷:乙酸乙酯洗脱液;乙酸乙酯洗脱液;体积比为5:2、5:4、1:1、1:2的乙酸乙酯:甲醇洗脱液;甲醇洗脱液洗脱,使用旋转蒸发仪将洗脱液蒸干后,用适量甲醇溶解后,再用0.22μm的滤膜过滤后,经高效液相半制备法采用体积比为75:25的甲醇:水洗脱、收集保留时间为2.80~3.10min洗脱液,减压干燥后,用甲醇重结晶,得到淡黄色粉末,1`-(2-磺酸基-5-甲基)环戊烷-5-羟基-靛玉红。(转化率33.54%)。
高分辨质谱给出分子离子峰[M+1]+在m/z440.1。13C-NMR谱和1H-NMR如下:
13C-NMR(600MHz,DMSO-d6):187.02(s,C3`),163.89(s,C2),144.47(s,C8`),128.51(s,C8),138.82(s,C2`),137.33(d,C6`),115.17(d,C6),114.66(d,C4),124.45(s,C4`),128.21(s,C9),152.56(d,C5),121.07(d,C5`),119.09(s,C9`),113.60(d,C7`),121.54(d,C7),120.56(s,C3),80.13(s,C1``),77.43(s,C4``),68.70(s,C3``),61.15(s,C5``),29.09(s,C2``),14.03(s,C6``)
1H-NMR(600MHz,DMSO-d6):11.234(1H,s)11.133(1H,s,H-1),8.772(1H,d,H-4`),7.66(1H,d,H-4),7.588(1H,dd,H-6),7.420(1H,d,H-7),7.266(1H,dd,H-6`),7.030(2H,m,H-5),6.907(1H,d,H-7`),3.262(1H,t,H-4``),2.612(1H,d,H-1``),2.384(1H,t,H-5``),1.970(1H,t,H-2``),1.229(1H,m,H-3``),1.033(1H,d,H-6``)。
4、1`-(2-磺酸基-5-甲基)环戊烷-5`-羟基-靛玉红的制备
在100mL土豆液体培养基中接种5mL(108个/mL)短刺小克银汉霉(Cunninghamellablakesleana)AS3.970孢子液,在pH至6.0,温度30℃±1℃,振荡速度为200r/min条件下培养12h后;按0.2ug的接种量,加入各重量比为(10:3:2:9)的茉莉酸甲酯(MeJA,0.35mmol/mL),乙酰水杨酸(9.25mmol/mL),泼尼松龙(5mg/mL,DXM)以及2-羟丙基-β-环糊精(1.38mmol/mL),继续培养12h后,再按5%的接种量加入靛玉红,然后继续培养5天,停止培养,然后将滤液于8000r/min,离心10min去除沉淀,滤液用等体积的乙酸乙酯萃取3遍,萃取液蒸干后用石油醚2mL溶解后,再用层析硅胶柱分离,依次用体积比为5:3、5:4、1:1、1:2的石油醚:二氯甲烷洗脱液,二氯甲烷洗脱液,体积比为5:1、5:2、1:1、1:3、1:5二氯甲烷:乙酸乙酯洗脱液,乙酸乙酯洗脱液,体积比为5:2、5:4、1:1、1:2的乙酸乙酯:甲醇洗脱液,甲醇洗脱液洗脱,使用旋转蒸发仪将洗脱液蒸干后,用适量甲醇溶解后,再用0.22μm的滤膜过滤后,经高效液相半制备法采用体积比为75:25的甲醇:水洗脱、收集保留时间为2.85~3.15min洗脱液,减压干燥后,用甲醇重结晶,得到淡黄色粉末,即为1`-(2-磺酸基-5-甲基)环戊烷-5`-羟基-靛玉红.(转化率46.57%)。
高分辨质谱给出分子离子峰[M+1]+在m/z440.1。13C-NMR谱和1H-NMR如下:
13C-NMR(600MHz,DMSO-d6):187.01(s,C3`),163.82(s,C2),137.34(s,C8`),135.92(s,C8),145.81(s,C2`),122.35(d,C6`),127.87(d,C6),126.49(d,C4),117.71(s,C4`),126.82(s,C9),124.06(d,C5),146.27(d,C5`),121.09(s,C9`),114.20(d,C7`),138.02(d,C7),120.36(s,C3),80.15(s,C1``),77.41(s,C4``),68.73(s,C3``),61.12(s,C5``),29.13(s,C2``),14.21(s,C6``)
1H-NMR(600MHz,DMSO-d6):11.342(1H,s),11.133(1H,s,H-1),8.772(1H,d,H-4`),7.66(1H,d,H-4),7.588(1H,dd,H-6),7.420(1H,d,H-7),7.266(1H,dd,H-6`),7.030(2H,m,H-5`),6.907(1H,d,H-7`),3.262(1H,t,H-4``),2.612(1H,d,H-1``),2.384(1H,t,H-5``),1.970(1H,t,H-2``),1.229(1H,m,H-3``),1.033(1H,d,H-6``)。
5、1-(2-磺酸基-5-甲基)环戊烷-5`-羟基-靛玉红的制备
在100mL土豆液体培养基中接种5mL(108个/mL)短刺小克银汉霉(Cunninghamellablakesleana)AS3.970孢子液,在pH至6.0,温度30℃±1℃,振荡速度为200r/min条件下培养12h后;按0.2ug的接种量,加入各重量比为(8:6:2:7:1)的茉莉酸甲酯(MeJA,0.35mmol/mL),乙酰水杨酸(9.25mmol/mL),泼尼松龙(5mg/mL,DXM)、2-羟丙基-β-环糊精(1.38mmol/mL),以及Ag+(10mM/L)继续培养12h后,再按5%的接种量加入靛玉红,然后继续培养5天,停止培养,然后将滤液于8000r/min,离心10min去除沉淀,滤液用等体积的乙酸乙酯萃取3遍,萃取液蒸干后用石油醚2mL溶解后,再用层析硅胶柱分离,依次用体积比为5:3、5:4、1:1、1:2的石油醚:二氯甲烷洗脱液,二氯甲烷洗脱液,体积比为5:1、5:2、1:1、1:3、1:5二氯甲烷:乙酸乙酯洗脱液,乙酸乙酯洗脱液,体积比为5:2、5:4、1:1、1:2的乙酸乙酯:甲醇洗脱液,甲醇洗脱液洗脱,使用旋转蒸发仪将洗脱液蒸干后,用适量甲醇溶解后,再用0.22μm的滤膜过滤后,经高效液相半制备法采用体积比为75:25的甲醇:水洗脱、收集保留时间为2.78~3.10min洗脱液,减压干燥后,用甲醇重结晶,得到淡黄色粉末,即为1-(2-磺酸基-5-甲基)环戊烷-5`-羟基-靛玉红。(转化率39.5%)。
高分辨质谱给出分子离子峰[M+1]+在m/z440.1。13C-NMR谱和1H-NMR如下:
13C-NMR(600MHz,DMSO-d6):187.62(s,C3`),161.75(s,C2),147.78(s,C8`),136.02(s,C8),145.58(s,C2`),122.33(d,C6`),127.91(d,C6),127.01(d,C4),117.78(s,C4`),126.04(s,C9),123.72(d,C5),147.81(d,C5`),124.76(s,C9`),117.04(d,C7`),120.04(d,C7),120.41(s,C3),80.11(s,C1``),77.45(s,C4``),68.81(s,C3``),61.21(s,C5``),29.12(s,C2``),14.01(s,C6``)
1H-NMR(600MHz,DMSO-d6):11.43(1H,s),10.83(1H,s,H-1),8.69(1H,d,H-4`),7.62(1H,d,H-4),7.57(1H,dd,H-6),7.43(1H,d,H-7),7.25(1H,dd,H-6`),7.11(2H,m,H-5`),6.93(1H,d,H-7`),3.26(1H,t,H-4``),2.63(1H,d,H-1``),2.377(1H,t,H-5``),1.978(1H,t,H-2``),1.24(1H,m,H-3``),1.12(1H,d,H-6``)。
6、1-(2-磺酸基-5-甲基)环戊烷-5-羟基-靛玉红的制备
在100mL土豆液体培养基中接种5mL(108个/mL)短刺小克银汉霉(Cunninghamellablakesleana)AS3.970孢子液,在pH至6.0,温度30℃±1℃,振荡速度为200r/min条件下培养12h后;按0.2ug的接种量,加入各重量比为(5:4:3:5:1)的茉莉酸甲酯(MeJA,0.89mmol/mL),5-磺基水杨酸(15.25mmol/mL),戊酸(5mg/mL,DXM)、2-羟丙基-β-环糊精(4.15mmol/mL),以及Ag+(10mM/L)继续培养12h后,再按5%的接种量加入靛玉红,然后继续培养5天,停止培养,然后将滤液于8000r/min,离心10min去除沉淀,滤液用等体积的乙酸乙酯萃取3遍,萃取液蒸干后用石油醚2mL溶解后,再用层析硅胶柱分离,依次用体积比为5:3、5:4、1:1、1:2的石油醚:二氯甲烷洗脱液,二氯甲烷洗脱液,体积比为5:1、5:2、1:1、1:3、1:5二氯甲烷:乙酸乙酯洗脱液,乙酸乙酯洗脱液,体积比为5:2、5:4、1:1、1:2的乙酸乙酯:甲醇洗脱液,甲醇洗脱液洗脱,使用旋转蒸发仪将洗脱液蒸干后,用适量甲醇溶解后,再用0.22μm的滤膜过滤后,经高效液相半制备法采用体积比为75:25的甲醇:水洗脱、收集保留时间为2.78~3.10min洗脱液,减压干燥后,用甲醇重结晶,得到淡黄色粉末,即为1-(2-磺酸基-5-甲基)环戊烷-5-羟基-靛玉红。(转化率48.3%)。
高分辨质谱给出分子离子峰[M+1]+在m/z440.1。13C-NMR谱和1H-NMR如下:
13C-NMR(600MHz,DMSO-d6):187.01(s,C3`),145.75(s,C2),128.58(s,C8`),147.91(s,C8),161.78(s,C2`),115.11(d,C6`),135.14(d,C6),130.54(d,C4),113.64(s,C4`),123.34(s,C9),119.02(d,C5),152.82(d,C5`),128.21(s,C9`),121.72(d,C7`),115.96(d,C7),120.33(s,C3),80.11(s,C1``),77.42(s,C4``),68.72(s,C3``),61.19(s,C5``),29.21(s,C2``),14.24(s,C6``)
1H-NMR(600MHz,DMSO-d6):11.44(1H,s),10.831(1H,s,H-1),8.61(1H,d,H-4`),7.71(1H,d,H-4),7.58(1H,dd,H-6),7.43(1H,d,H-7),7.241(1H,dd,H-6`),7.112(2H,m,H-5),6.92(1H,d,H-7`),3.26(1H,t,H-4``),2.623(1H,d,H-1``),2.39(1H,t,H-5``),1.972(1H,t,H-2``),1.235(1H,m,H-3``),1.17(1H,d,H-6``)。
7、5-羟基-靛玉红的制备
在100mL土豆液体培养基中接种5mL(108个/mL)短刺小克银汉霉(Cunninghamellablakesleana)AS3.970孢子液,在pH至6.0,温度30℃±1℃,振荡速度为200r/min条件下培养12h后;按0.2ug的接种量,加入各各重量比为(6:3:1)的茉莉酸甲酯(MeJA,1.56mmol/mL);地塞米松(4mg/mL,DXM)以及羟乙基-β-环糊精(1.78mmol/mL),继续培养12h后,再按5%的接种量加入靛玉红,然后继续培养5天,停止培养,然后将滤液于8000r/min,离心10min去除沉淀,滤液用等体积的乙酸乙酯萃取3遍,萃取液蒸干后用石油醚2mL溶解后,再用层析硅胶柱分离,依次用体积比为5:3、5:4、1:1、1:2的石油醚:二氯甲烷洗脱液,二氯甲烷洗脱液,体积比为5:1、5:2、1:1、1:3、1:5二氯甲烷:乙酸乙酯洗脱液,乙酸乙酯洗脱液,体积比为5:2、5:4、1:1、1:2的乙酸乙酯:甲醇洗脱液,甲醇洗脱液洗脱,使用旋转蒸发仪将洗脱液蒸干后,用适量甲醇溶解后,再用0.22μm的滤膜过滤后,经高效液相半制备法采用体积比为75:25的甲醇:水洗脱、收集保留时间为4.0~4.5min洗脱液,减压干燥后,用甲醇重结晶,得到淡黄色粉末,5-羟基-靛玉红。(转化率52.8%)。
高分辨质谱给出分子离子峰[M+1]+在m/z277。13C-NMR谱和1H-NMR如下:
13C-NMR(600MHz,DMSO-d6):188.57(s,C3`),168.99(s,C2),152.42(s,C8`),129.53(s,C8),138.72(s,C2`),137.35(d,C6`),115.12(d,C6),114.24(d,C4),124.35(s,C4`),128.76(s,C9),152.56(d,C5),121.07(d,C5`),119.09(s,C9`),113.52(d,C7`),128.74(d,C7),108.01(s,C3)
1H-NMR(600MHz,DMSO-d6):11.032(1H,s,H-1`),10.913(1H,s,H-1),9.97(1H,s,OH),8.772(1H,d,H-4`),7.66(1H,d,H-4),7.588(1H,dd,H-6),7.426(1H,d,H-7),7.266(1H,dd,H-6`),7.099(2H,m,H-5),7.027(1H,d,H-7`)。
8、5’-羟基-靛玉红的制备
在100mL土豆液体培养基中接种5mL(108个/mL)短刺小克银汉霉(Cunninghamellablakesleana)AS3.970孢子液,在pH至6.0,温度30℃±1℃,振荡速度为200r/min条件下培养12h后;按0.2ug的接种量,加入各各重量比为(6:3:1)的乙酰水杨酸(9.25mmol/mL);地塞米松(4mg/mL,DXM)以及羟乙基-β-环糊精(0.89mmol/mL),继续培养12h后,再按5%的接种量加入靛玉红,然后继续培养5天,停止培养,然后将滤液于8000r/min,离心10min去除沉淀,滤液用等体积的乙酸乙酯萃取3遍,萃取液蒸干后用石油醚2mL溶解后,再用层析硅胶柱分离,依次用体积比为5:3、5:4、1:1、1:2的石油醚:二氯甲烷洗脱液,二氯甲烷洗脱液,体积比为5:1、5:2、1:1、1:3、1:5二氯甲烷:乙酸乙酯洗脱液,乙酸乙酯洗脱液,体积比为5:2、5:4、1:1、1:2的乙酸乙酯:甲醇洗脱液,甲醇洗脱液洗脱,使用旋转蒸发仪将洗脱液蒸干后,用适量甲醇溶解后,再用0.22μm的滤膜过滤后,经高效液相半制备法采用体积比为75:25的甲醇:水洗脱、收集保留时间为4.4~4.8min洗脱液,减压干燥后,用甲醇重结晶,得到淡黄色粉末,5’-羟基-靛玉红。(转化率51.5%)。
高分辨质谱给出分子离子峰[M+1]+在m/z277。13C-NMR谱和1H-NMR如下:
13C-NMR(600MHz,DMSO-d6):188.57(s,C3`),167.87(s,C2),142.51(s,C8`),142.23(s,C8),148.15(s,C2`),122.32(d,C6`),129.15(d,C6),124.71(d,C4),117.73(s,C4`),122.03(s,C9),121.61(d,C5),147.87(d,C5`),124.79(s,C9`),117.02(d,C7`),108.37(d,C7),106.51(s,C3)1H-NMR(600MHz,DMSO-d6):11.027(1H,s,H-1`),10.817(1H,s,H-1),9.27(1H,s,OH),8.768(1H,d,H-4`),7.66(1H,d,H-4),7.587(1H,dd,H-6),7.431(1H,d,H-7),7.268(1H,dd,H-6`),7.087(2H,m,H-5`),7.031(1H,d,H-7`)。
9、1,1′-二磺酸基-3`--羟基-靛玉红的制备
在100mL土豆液体培养基中接种5mL(108个/mL)短刺小克银汉霉(Cunninghamellablakesleana)AS3.970孢子液,在pH至6.0,温度30℃±1℃,振荡速度为200r/min条件下培养12h后;按0.2ug的接种量,加入各重量比为(7:6:3:8)的茉莉酸甲酯(MeJA,0.35mmol/mL),磺基水杨酸(SA,10.98mmol/mL),地塞米松(5mg/mL,DXM)以及2-羟丙基-β-环糊精(1.38mmol/mL),继续培养12h后,再按5%的接种量加入靛玉红,然后继续培养5天,停止培养,然后将滤液于8000r/min,离心10min去除沉淀,滤液用等体积的乙酸乙酯萃取3遍,萃取液蒸干后用石油醚2mL溶解后,再用层析硅胶柱分离,依次用体积比为5:3、5:4、1:1、1:2的石油醚:二氯甲烷洗脱液,二氯甲烷洗脱液,体积比为5:1、5:2、1:1、1:3、1:5二氯甲烷:乙酸乙酯洗脱液;乙酸乙酯洗脱液;体积比为5:2、5:4、1:1、1:2的乙酸乙酯:甲醇洗脱液;甲醇洗脱液洗脱,使用旋转蒸发仪将洗脱液蒸干后,用适量甲醇溶解后,再用0.22μm的滤膜过滤后,经高效液相半制备法采用体积比为90:60的甲醇:水洗脱、收集保留时间为2.15~2.30min洗脱液,减压干燥后,用甲醇重结晶,得到淡黄色粉末,1,1′-二磺酸基-3`--羟基-靛玉红。(转化率39.18%)。
高分辨质谱给出分子离子峰[M+1]+在m/z439.1。13C-NMR谱和1H-NMR如下:
13C-NMR(600MHz,DMSO-d6):76.03(s,C3`),168.80(s,C2),145.51(s,C8`),135.90(s,C8),148.72(s,C2`),128.40(d,C6`),128.13(d,C6),123.24(d,C4),125.22(s,C4`),122.62(s,C9),124.21(d,C5),115.93(d,C5`),127.54(s,C9`),116.52((d,C7`),121.53(d,C7),105.12(s,C3)
1H-NMR(600MHz,DMSO-d6):4.200(1H,s,H-1`),4.201(1H,s,H-1``)7.132(1H,d,H-4`),8.741(1H,d,H-4),7.311(1H,dd,H-6),7.603(1H,d,H-7),7.152(1H,dd,H-6`),6.795(1H,dd,H-5`),6.831(1H,d,H-7`),5.121(1H,s,H-3``)。
本发明实施例所述的靛玉红衍生物,既可以单独使用,也可以和其他抗肿瘤药物联合治疗,其药学上可接受的盐或水合物的含量占所制成的药物为0.001~99.9%(重量百分比),因此本发明的药物组合物可以进一步包括一种或多种其他的抗肿瘤药物,所述的抗肿瘤药物为影响肿瘤细胞核酸生物合成的药物;直接破坏肿瘤细胞DNA阻止其复制的药物;嵌入肿瘤细胞DNA中干扰转录过程的药物;干扰有丝分裂影响肿瘤蛋白质合成的药物;内分泌药物、或者细胞因子,其中影响肿瘤细胞核酸生物合成的药物可以为5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil)、阿糖胞苷(Cytarabine)、雄黄等,所述直接破坏肿瘤细胞DNA阻止其复制的药物可以为顺铂(Cisplatin)、喜树碱(camptot-hecin)、依托泊苷(Etoposide)等,所述嵌入肿瘤细胞DNA中干扰转录过程的药物可以为阿红霉素(ADM),所述干扰有丝分裂影响肿瘤细胞蛋白质合成的药物可以为长春碱(VLB)、长春新碱(VCR)、紫杉醇(Taxol),内分泌药物包括糖皮质激素、肾上腺皮质激素、激素等,细胞因子包括肿瘤坏死因子(tumornecrosisfactor,TNF)、白细胞介素(interleukin,IL-6)、干扰素(interferon,IFN)、转化生长因子-β(Transforminggrowthfactorbeta,TGF-β)、脂多糖(lipopolysaccharide)、即佛波酯(12-O-tetra-decanoyl-phorbol-13-acetate,TPA)、腺苷酸环化酶激活剂(Forskolin)等;
本发明制备了多种高产率的靛玉红代谢衍生物,使其能够实际地用于肿瘤、病毒性和心肌疾病的治疗,其在治疗肿瘤、艾滋病、乙肝和心肌缺血再灌注损伤方面具有良好的应用前景。
实施例二、药效学评价实验例
以下实验例中,受试样品由本发明制备方法实施例提供,以前体化合物靛玉红作为阳性对照。
1、本发明的9个化合物对体外培养的人肺癌细胞A549细胞的生长抑制作用
方法:人A549肺癌细胞用含10%胎牛血清的DMEM培养基(Gibco,美国)培养,培养条件为37℃,5%CO2,肿瘤细胞0.7x104/孔接种于96孔板中,24小时后,加入用二甲基亚砜配置的(200uM)、PBS溶液稀释的化合物,使培养基终浓度为10-4、10-5、10-6、10-7、10-8M,作用72h后,弃去培养液,用10%冷三氯醋酸固定细胞,用黄酰罗丹明B(sulforhodamineB,SRB)溶液染色,洗去未结合SRB后,Tris溶解与蛋白结合的SRB,用酶标仪在560nm处测定吸光值(OD)。采用下列公式计算细胞的生长率:抑制率=(OD值对照孔-OD值给药孔)/OD值对照孔X100%,结果判定标准:无效10-5M<50%,有效10-5M>50%。根据各浓度的抑制率,采用logit法计算半数抑制浓度IC50。
结果:在本发明的9个化合物中HQD-1、HQD-2、HQD-3、HQD-4、HQD-5、HQD-6、HQD-7、HQD-8和HQD-9剂量依赖性地抑制体外培养的人肺癌细胞A549,细胞生长,显示其具有有效的体外抗肿瘤作用,其中HQD-1、HQD-2、HQD-3、HQD-4、HQD-5和HQD-6、IC50值小于靛玉红阳性对照,HQD-7和HQD-8与靛玉红接近,显示了与靛玉红相同的抑制肿瘤效应,部分衍生物抑制效应强于靛玉红具体结果见表1。
表19种化合物对人肺癌A549细胞的生长抑制作用
2、本发明的9个化合物,对体外感染艾滋病HIV-1IIIB病毒的TZM-bl细胞的生长抑制作用
取对数生长期的TZM-BL细胞,按2×104/mL孔密度接种于96孔细胞培养板中,100μL/孔,置于细胞培养箱(37℃,5%CO2)中培养。隔日待细胞贴壁且生长良好,吸去培养液,将用无血清培养基稀释的雷公藤甲素或者化合物,分别加入96孔培养板,设置三个平行孔,37℃,5%CO2培养3h后,加入1000×TCID50的HIV-1IIIB病毒100μL感染细胞,然后继续培养24h后,利用Bright-GloLuciferaseAssay试剂(Promega)测定每孔的相对荧光单位(RLU),根据PrismGraphruan软件绘制浓度和荧光吸收强度曲线,结果见表1,采用logit法计算半数抑制浓度IC50。结果判定标准:有效IC50<10uM,无效IC50>10uM。IC50结果见表2所示:
结果:在本发明的9个化合物中HQD-3、HQD-4、HQD5、HQD-6、HQD-7、HQD-8和HQD-9剂量依赖性地抑制体外感染艾滋病HIV-1IIIB病毒的TZM-bl细胞的生长,显示其能有效的体外抗艾滋病病毒作用,具体结果表2,其HQD-3、HQD-4、HQD5、HQD-6、HQD-7、HQD-8和HQD-9有效,而HQD-1、HQD-2与靛玉红无效,显示了与靛玉红不同的抑制艾滋病病毒效应,部分衍生物抑制效应强于靛玉红。
表29种化合物对体外感染艾滋病HIV-1IIIB病毒的TZM-bl细胞的生长抑制作用
样品编号 | IC50(uM) | 评价 |
HQD-1 | >10 | 无效 |
HQD-2 | >10 | 无效 |
HQD-3 | 6.16 | 有效 |
HQD-4 | 3.49 | 有效 |
HQD-5 | 5.06 | 有效 |
HQD-6 | 7.14 | 有效 |
HQD-7 | 8.23 | 有效 |
HQD-8 | 9.12 | 有效 |
HQD-9 | 9.58 | 有效 |
DY | >10 | 无效 |
3、本发明的9个化合物,对HepG2.2.15细胞的体外HBV抗原抑制的作用
取对数生长期的HepG2.2.15细胞,按2×104/mL孔密度接种于24孔细胞培养板中,1000μL/孔,每个浓度共设3个复孔,置细胞培养箱(37℃,5%CO2)中培养。隔日待细胞贴壁且生长良好,吸去培养液,然后分别加入按表3中药物配制的各浓度的完全培养液1000μL,每个浓度设3个复孔,置细胞培养箱(37℃,5%CO2)中培养。等量的完全培养液作空白对照,用同浓度的靛玉红培养液作阳性对照,在连续培养72h后,吸取细胞培养液分别加于1.5mL无菌Eppnedorf管中,于-20℃保存待检。将-20℃保存的细胞培养液用同时同批乙型肝炎病毒表面抗原、E抗原酶联免疫试剂盒检测HBsAg和HBeAg的效价。采用下列公式计算抗原的的抑制百分率=[l-实验孔抗原OD值/对照孔抗原OD值]×100%。结果判定标准:有效,化合物浓度为10uM时,其抑制HBsAg、HBeAg的抑制率>50%,无效化合物浓度为10uM时,其抑制HBsAg、HBeAg的抑制率<50%。其结果见表3所示:
表39种化合物对HepG2.2.15细胞系HBsAg、HBeAg表达的抑制作用(n=3)
结果:在本发明的9个化合物中HQD-3、HQD-4、HQD5、HQD-6均能具有剂量依赖性地抑制HepG2.2.15细胞的HBV抗原(HBsAg、HBeAg)的作用,显示其具有有效的体外抗乙肝病毒作用,HQD-1、HQD-2、HQD-7、HQD-8和HQD-9与靛玉红无效,显示了与靛玉红不同的抑抑制乙肝病毒效应,部分衍生物抑制效应强于靛玉红,具体结果见表3。
4、本发明的9个化合物,抑制心肌缺血再灌注损伤的作用
设置靛玉红阳性对照组、化合组各自试验组。每组取雄性大鼠3只,建立Langendorff大鼠离体心肌缺血再灌注损伤模型,假手术组(Sham):以K-H液持续灌流80min;心肌缺血/再灌注实验组(MIRI),以K-H液稳定灌流20min后,停灌30min,再恢复K-H液灌流30min,然后再以0.15mg/L的每种化合物/K-H液再灌注30min。分别留取停灌前,缺血再灌注后30min的冠状动脉流出液2ml,检测冠脉流出液中AST、CK、LDH的释放量,计算各种酶的降低率,降低率=(停灌前值-MIRI给药后值)/停灌前值X100%
结果判定标准:无效,降低率<10%,有效,降低率>10%;再通过PowerLab数据采集分析,分别采集的压力换能器记录并测定停灌前后各组心脏的左心室发展压(LVDP)、缺血再灌注前后左心室内压最大上升速率(+dp/dtmax)、左心室内压最大下降速率(-dp/dtmax)和心率(HR)的数据,计算各指标灌流前后的恢复率,恢复率=MIRI给药后值/假手术组(Sham)的值,假手术组(Sham)=100%,结果判定标准:无效,恢复率<10%,有效,恢复率率>10%;计算结果结果见表4。
表49种化合物对大鼠心肌缺血再灌注损伤的抑制作用
结果:在本发明的9个化合物中均能可以显著降低心肌缺血再灌注的大鼠的与心肌损伤相关心肌酶包括CK、AST和LDH量的水平;而且显著促进心肌冠脉流出液中LVDP、±dp/dtmax的恢复水平提升,9种化合物均具有修复心肌缺血再灌注损伤作用,部分衍生物(HQD-3、HQD-4、HQD-5、HQD-6)抑制效应强于靛玉红,具体结果见表4。
5、本发明化合物抑制扩张性心肌病(DCM)评价试验:
设置靛玉红阳性对照组、化合组各自试验组。每组取小鼠10只,阿霉素3.5mg/kg剂量,腹腔注射给药建立小鼠扩张性心肌病模型,将DCM模型组小鼠随机分为三组,1组为模型组(DCM):予以蒸馏水灌胃,以造模组(DCM)为对照,另外两组分别以以0.15mg/L的每种化合物或者靛玉红,连续三周腹腔注射给药,每周两次,药物干预3周后,所有小鼠均经内眦取血,静置30min后,4℃、3000r/min离心10min,吸取上层血清液,检测各个给药组血清中AST、CK、LDH的释放量,计算各种酶的降低率,降低率=(造模组值-给药组值)/造模组值X100%结果判定标准:无效,降低率<10%,有效,降低率>10%;计算结果结果见表5。
表59种化合物对扩张心肌病小鼠心肌损伤的抑制作用
组别 | AST | CK | LDH | 评价 |
HQD-1 | 15.48% | 18.23% | 19.78% | 有效 |
HQD-2 | 17.91% | 11.43% | 21.95% | 有效 |
HQD-3 | 28.54% | 29.51% | 30.12% | 有效 |
HQD-4 | 37.16% | 33.01% | 51.06% | 有效 |
HQD-5 | 29.73% | 26.23% | 35.31% | 有效 |
HQD-6 | 25.06% | 24.59% | 28.04% | 有效 |
HQD-7 | 12.16% | 15.13% | 20.70% | 有效 |
HQD-8 | 10.34% | 13.27% | 17.53% | 有效 |
HQD-9 | 11.09% | 14.33% | 12.98% | 有效 |
DY | 17.45% | 16.39% | 21.06% | 有效 |
结果:在本发明的9个化合物中均能可以显著降低扩张性心肌病所致损伤小鼠的与心肌损伤相关心肌酶包括CK、AST和LDH量的水平;9种化合物均具有修复扩张性心肌病损伤作用,部分衍生物(HQD-3、HQD-4、HQD-5、HQD-6)抑制效应强于靛玉红,具体结果见表5。
其中,表1~5中,HQD-1为1`-(2-磺酸基-5-甲基)环戊烷-靛玉红;HQD-2为1-(2-磺酸基-5-甲基)环戊烷-靛玉红;HQD-3为1`-(2-磺酸基-5-甲基)环戊烷-5-羟基-靛玉红;HQD-4为1`-(2-磺酸基-5-甲基)环戊烷-5`-羟基-靛玉红;HQD-5为1-(2-磺酸基-5-甲基)环戊烷-5`-羟基-靛玉红;HQD-6为1-(2-磺酸基-5-甲基)环戊烷-5-羟基-靛玉红;HQD-7为5-羟基-靛玉红;HQD-8为5`-羟基-靛玉红;HQD-9为1,1′-二磺酸基-3`--羟基-靛玉红;DY为靛玉红。
综上所述,本发明化合物可同时抑制心肌缺血再灌注损伤、扩张性心肌病所致损伤的作用。
本发明以靛玉红为前提药物,提供了新型靛玉红衍生物的及相关的新的制备方法。
本发明的靛玉红衍生物,除少数的化合物在体外抑制肿瘤、艾滋病病毒和乙肝炎病毒无效外,其他化合物均能显著抑制多种体外培养的肿瘤、爱滋病、乙肝病毒细胞抑制作用以及可同时抑制心肌缺血再灌注损伤、扩张性心肌病所致损伤的作用,表明上述化合物多种肿瘤、爱滋病、乙肝、心肌缺血再灌注损伤、扩张性心肌病最有效。
本发明的靛玉红衍生物可用于制备预防和/或治疗肿瘤、爱滋病、乙肝、心肌缺血再灌注损伤、扩张性心肌病等疾病,具有良好的用于治疗肺癌、肝癌、前列腺癌、人卵巢癌、人乳腺癌、粒细胞白血病、结肠癌、阿霉素敏感的乳腺癌、阿霉素抗药的乳腺癌、阿霉素抗药的白血病、爱滋病、乙肝、心肌缺血再灌注损伤、扩张性心肌病等疾病等疾病的应用前景。
虽然以上描述了本发明的具体实施方式,但是熟悉本技术领域的技术人员应当理解,我们所描述的具体的实施例只是说明性的,而不是用于对本发明的范围的限定,熟悉本领域的技术人员在依照本发明的精神所作的等效的修饰以及变化,都应当涵盖在本发明的权利要求所保护的范围内。
Claims (4)
1.一种靛玉红衍生物的制备方法,其特征在于:包括以下步骤:
步骤一:取靛玉红15~20mg,溶解于150~200mL乙酸乙酯,使靛玉红浓度为0.1mg/mL;另取磷脂550~572mg,使靛玉红与磷脂摩尔比为1:10混合,60℃搅拌反应2.0h,反应完毕,除去乙酸乙酯,残余物用适量正己烷溶解后,离心后取上清液,将上清液转移至真空干燥器中减压干燥,所得紫红色半固体产物即为靛玉红磷脂复合物;
步骤二:取保存于4℃、土豆斜面培养基培养的、短刺小克银汉霉CunninghamellablakesleanaAS3.970一支,置于25℃恒温培养箱中培养7天后,以适量无菌水将斜面上的孢子充分吹打下来,使单孢子悬液的浓度调整至107~108个/mL,即得种子孢子液;
步骤三:以100ml,5mL的接种量,在土豆液体培养基上接种步骤二所得孢子液,在pH至6.0,温度30℃±1℃,振荡速度为200r/min条件下培养12h后;按0.1~4ug的接种量,加入各种不同比例的联合诱导子,继续培养12h后,再按1~10ug的接种量加入步骤一所得的靛玉红磷脂复合物,然后继续培养5天,每天检测各种靛玉红衍生物的含量和转化率,当产物转化率低至0.5~3%时,停止培养,过滤后收集菌丝体,然后将滤液于8000r/min,离心10min去除沉淀既得到发酵提取液;
步骤四:将步骤三提取液过滤,滤液用等体积的乙酸乙酯萃取3遍,合并萃取液;而菌丝体则用与其重量比为1:3~1:10的乙酸乙酯超声提取30min,然后滤去菌丝体,所得滤液与萃取液合并,即得分离提取液;
步骤五:将经过步骤四处理所得的分离提取液,先用1mg:1~10mL的乙醇溶解后,采用硅胶拌样后蒸干,称取20倍于样品量的硅胶,使用湿法进行填柱和上样;首先用5倍柱体积的100%石油醚将样品中低极性油类物质洗脱干净,再依次用以下6种洗脱液进行洗脱:体积比为5:3、5:4、1:1、1:2的石油醚:二氯甲烷洗脱液,二氯甲烷洗脱液,体积比为5:1、5:2、1:1、1:3、1:5的二氯甲烷:乙酸乙酯洗脱液,乙酸乙酯洗脱液,体积比为5:2、5:4、1:1、1:2的乙酸乙酯:甲醇洗脱液,以及甲醇洗脱液;然后TLC控制收集主馏分,使用旋转蒸发仪将各个馏分溶液蒸干后,用适量甲醇溶解,再用0.22μm的滤膜过滤后,即得各种靛玉红衍生物分离液;
步骤六:将经过步骤五处理所得的各种靛玉红衍生物分离液,采用高效液相半制备法分离纯化,HPLC梯度洗脱法控制收集不同的靛玉红衍生物洗脱液,减压蒸去溶剂后,用甲醇结晶,即得靛玉红衍生物;
其中,步骤三中所用的联合诱导子采用下述9组物质中的任一组:
重量比为9:3:7的水杨酸、地塞米松以及β-环糊精;
重量比为15:4:7的硫代水杨酸、戊酸倍他米松以及2-羟丙基-β-环糊精;
重量比为5:3:2:5的茉莉酸甲酯、水杨酸、地塞米松以及2-羟丙基-β-环糊精;
重量比为10:3:2:9的茉莉酸甲酯、乙酰水杨酸、泼尼松龙以及2-羟丙基-β-环糊精;
重量比为8:6:2:7:1的茉莉酸甲酯、乙酰水杨酸、泼尼松龙、2-羟丙基-β-环糊精以及Ag+;
重量比为5:4:3:5:1的茉莉酸甲酯、5-磺基水杨酸、戊酸、2-羟丙基-β-环糊精以及Ag+;
重量比为6:3:1的茉莉酸甲酯、地塞米松以及羟乙基-β-环糊精;
重量比为6:3:1的乙酰水杨酸、地塞米松以及羟乙基-β-环糊精;
重量比为7:6:3:8的茉莉酸甲酯、磺基水杨酸、地塞米松以及2-羟丙基-β-环糊精。
2.如权利要求1所述的一种靛玉红衍生物的制备方法,其特征在于:所述土豆培养基为:土豆200g/L,葡萄糖20g/L;配置时将土豆去皮后将其切成小块,加水加热煮沸30min,过滤;取滤液定容至1L,加入葡萄糖20g,搅拌溶解后,121℃灭菌30min,即得;
所述斜面培养基为:取上述土豆培养基1L,加入琼脂粉各20g,加热溶解后分装于玻璃试管中,于121℃下灭菌30min后取出,倾斜45度,静置、冷却既得。
3.如权利要求1所述的一种靛玉红衍生物的制备方法,其特征在于:
TLC控制收集主馏分,用体积比为5:4:4的石油醚、二氯甲烷和乙酸乙酯为展开剂;
所述产物转化率的高效液相色谱检测方法为:色谱柱AgilentZORBAXEclipseXDB-C18柱,其中分析柱内径乘以长度为4.6mm×250mm,粒径为5μm;吸收波长:292nm,流动相体积比:甲醇:水=75:25,流速:0.5ml/min、柱温:25℃、进样量100μl。
4.如权利要求1~3所述的一种靛玉红衍生物的制备方法,其特征在于:所述方法可用于制备以下靛玉红衍生物:1`-(2-磺酸基-5-甲基)环戊烷-靛玉红;1-(2-磺酸基-5-甲基)环戊烷-靛玉红;1`-(2-磺酸基-5-甲基)环戊烷-5-羟基-靛玉红;1`-(2-磺酸基-5-甲基)环戊烷-5`-羟基-靛玉红;1-(2-磺酸基-5-甲基)环戊烷-5`-羟基-靛玉红;1-(2-磺酸基-5-甲基)环戊烷-5-羟基-靛玉红;5-羟基-靛玉红;5’-羟基-靛玉红;1,1′-二磺酸基-3`--羟基-靛玉红。
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