CN100591673C - 一种除莠霉素衍生物及其制备方法和抗肿瘤应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种由式(1)表示，其中R1＝OCH3和R2＝R3＝OH除莠霉素衍生物，还涉及这种衍生物的制备方法及其作用于热休克蛋白的抗肿瘤应用。其特征是通过爪哇正青霉(Eupenicillium javanicum)对式(1)表示，其中R1＝R2＝R3＝OCH3的化合物(除莠霉素A)进行微生物转化，经结构修饰后得到的除莠霉素衍生物在水中的溶解度比除莠霉素A大1个数量级，而且具有较强的体外抗Hela癌细胞和Ehrlich癌细胞活性，其IC50分别为5.8μg·mL-1和0.7μg·mL-1。
Description
技术领域
本发明涉及一种除莠霉素的衍生物，具体来说是涉及一种强水溶性，低毒性和高活性的除莠霉素的衍生物，还涉及这种衍生物的制备方法，以及这种衍生物作用于热休克蛋白的抗肿瘤应用。
背景技术
抗肿瘤活性药物除莠霉素(Herbimycin)属于安沙霉素类苯醌型抗生素，是日本Satoshi
研究组在1978年于土壤链霉菌Streptomyces hygroscoplcus菌株AM-3672的发酵液中首次发现的一类抗生素，由于其最初被认为是一种除草剂，具有杀灭草本植物的性能，其中文名由此而来。除莠霉素包括除莠霉素A，除莠霉素B和除莠霉素C，结构式由式(1)表示：
式(1)
当R1＝R2＝R3＝OCH3时是除莠霉素A，当R1＝H，R2＝OH，R3＝OCH3时是除莠霉素B，当R1＝R3＝OCH3，R2＝OH时是除莠霉素C。除莠霉素A开始被认为是一种除草剂，具有对单子叶和双子叶植物的杀灭活性。1980年Satoshi
研究组从同一种发酵液中分离到除莠霉素B，并认为和除莠霉素A一样具有除草作用，同时还具有抗烟叶花斑病毒(anti-tobacco mosaic virus)活性。1986年除莠霉素C被Satoshi研究组发现，并报道了除莠霉素A、B、C具有体外抗Hela癌细胞和Ehrlich癌细胞活性，其IC50分别为3.5μg·mL-1、3.2μg·mL-1、7.3μg·mL-1(对Hela癌细胞)和0.4μg·mL-1、0.8μg·mL-1、1.2μg·mL-1(对Ehrlich癌细胞)。
热休克蛋白90(heat shock protein 90，Hsp90)作为分子伴侣参与调控、维持细胞内多种蛋白的构象和功能，以帮助细胞在应激环境刺激下正常生长。近年来研究表明很多癌基因蛋白均为热休克蛋白90的作用靶点，因此只要能抑制热休克蛋白90就能促进这些癌基因蛋白的降解，从而有效地治疗癌症。体内外实验也证实了热休克蛋白90抑制剂的抗肿瘤活性，目前，17-烯丙胺-17-脱甲氧基-格尔德霉素已在美国癌症研究所(NCI)进行了I期临床实验。研究发现，除莠霉素与其结构类似物格尔德霉素(Geldanamycin)、吗卡贝霉素(Macbecin)、瑞伯拉斯他汀(Reblastatin)等均具有相同的碳骨架结构，因此可作为热休克蛋白90抑制物，同时还是酪氨酸蛋白激酶的不可逆共价抑制物，可用于治疗癌症。
但是除莠霉素属于水难溶性药物，在水中溶解度小，难以被机体吸收，体内消除速度较快，血药浓度容易出现峰谷现象，口服制剂生物利用度低。
发明目的
本发明的目的在于开发出一种水溶性好的除莠霉素衍生物，另一目的是提供这种衍生物的制备方法，还有一个目的是开发其在抗癌症方面的应用。
我们用爪哇正青霉(Eupenicillium javanicum)对除莠霉素A进行微生物转化，得到的除莠霉素衍生物的水溶性明显增强，并且仍具有极好的抗癌活性，从而实现了本发明的目的。
本发明的除莠霉素衍生物由以上述式(1)表示，其中R1＝OCH3和R2＝R3＝OH。
本发明的除莠霉素的制备方法，其特征包括以下的步骤：
(1)在高氏I号液体培养基中加入爪哇正青霉(Eupenicillium javanicum)种子液，26℃～30℃恒温摇床连续振摇，得到发酵液，粉碎菌体后加入硫酸铵盐析出发酵液中含有转化活性酶的蛋白质，透析得到酶液；
(2)在上述得到的酶液中，按每100mL酶液加入式(1)表示，其中R1＝R2＝R3＝OCH3的化合物10～20mg，27℃～29℃温育反应，最后加入乙醇停止反应，用乙酸乙酯萃取，收集乙酸乙酯萃取物浓缩得到粗产物。
步骤(1)所述的爪哇正青霉(Eupenicillium javanicum)保藏在中国普通微生物菌种保藏管理中心(地址：中国，北京)，简称CGMCC，保藏号为CGMCC 3.5706；所述的摇床振摇时间一般5～10天，最好是7天，振摇速度一般200～300r/min，最好是250r/min，所述的酶液可以采用硫酸铵盐析-透析法从发酵液中分离出来。
步骤(2)所述的温育反应的时间一般1～3天，最好是2天，所述的乙酸乙酯萃取的次数最好是3次，所述的浓缩可以采用减压真空浓缩，所述的粗产物还可以用体积比为9∶1的甲醇-氯仿溶液溶解后，用高压液相色谱分离，减压真空浓缩得到纯品。
经光谱检验证实本发明得到的产物是式(1)表示，其中R1＝OCH3和R2＝R3＝OH化合物，光谱数据如下：EI-MS，547[M+H]+；1H NMR(CDCl3，500MHz)δ(ppm)：8.61(1H，H-16)，7.45(1H，H-19)，6.98(1H，H-14)，6.63(1H，H-21)，6.51(1H，H-13)，5.87(1H，H-12)，5.78(1H，H-8)，5.18(1H，H-10)，4.96(2H，OCONH2-10)，4.53(1H，H-11)，4.40(1H，H-2)，3.51(1H，H-5)，3.41(1H，H-6)，3.35(3H，OCH3-2)，3.32(3H，OCH3-5)，2.85(1H，OH-6)，2.76(1H，H-7)，2.62(1H，OH-11)，2.02(3H，CH3-15)，1.95(2H，H-4)，1.76(3H，CH3-9)，1.66(1H，H-3)，1.10(3H，CH3-7)，0.82(3H，CH3-3)；13C NMR(CDCl3，500MHz)δ(ppm)：187.9(C-20)，184.2(C-22)，168.7(C-16)，155.8(OCONH2-10)，143.8(C-1)，138.3(C-18)，136.8(C-12)，134.7(C-15)，132.7(C-21)，131.6(C-9)，130.1(C-8)，128.3(C-14)，125.7(C-13)，113.1(C-19)，83.1(C-10)，81.5(C-5)，80.7(C-2)，72.9(C-6)，66.6(C-11)，58.4(OCH3-2)，57.7(OCH3-5)，34.0(C-4)，32.6(C-7)，32.0(C-3)，16.5(CH3-7)，14.2(CH3-9)，13.6(CH3-3)，12.4(CH3-15)。
实验证明，本发明的除莠霉素衍生物可以作用于热休克蛋白抗肿瘤，应用于制备抗肿瘤的药物中。
本发明通过添加前体的微生物转化方法，用爪哇正青霉对难溶于水的除莠霉素A进行结构修饰，得到的衍生物在水中的溶解度比除莠霉素A大1个数量级，而且具有较强的体外抗Hela癌细胞和Ehrlich癌细胞活性，其IC50分别为5.8μg·mL-1和0.7μg·mL-1。而据期刊The Journalof Antibiotics，1986，39(11)，1630-1633中报道的其前体化合物除莠霉素A体外抗Hela癌细胞和Ehrlich癌细胞的IC50分别为3.5μg·mL-1和0.4μg·mL-1。可见本发明除莠霉素的衍生物与其前体化合物体外抗Hela癌细胞和Ehrlich癌细胞的IC50值都处于同一数量级。
具体实施方式
以下实施例是对本发明的进一步说明，不是对本发明的限制。
实施例1：
在20个500mL三角瓶中分别加入200mL高氏I号液体培养基，121℃湿热高温灭菌，冷至室温后加入爪哇正青霉(CGMCC 3.5706)种子液100μL，于28℃恒温摇床250r/min下连续振摇7天，合并发酵液，超声波破碎菌体后用硫酸铵盐析出发酵液中的蛋白质(含转化活性酶)，透析得到300mL酶液，向酶液中加入用二甲亚砜溶解的浓度为20mg·mL-1的除莠霉素A 2mL，在28℃下温育反应2天，加入200mL乙醇停止反应，然后用等体积的乙酸乙酯萃取三次，减压真空浓缩得到95mg粗产物，将粗产物用9∶1的甲醇-氯仿溶解，经制备型高压液相色谱柱(PHPLC)分离(室温下，在配备10mm×250mm ODS色谱柱的HITCHI L-2000型色谱仪上采用65％CH3OH-H2O于2.0mL/min下进行洗脱)，减压真空浓缩得到纯品23mg，收率为58％。熔点为195～196.5℃(分解)。经光谱分析证实是结构式(1)表示，其中R1＝OCH3和R2＝R3＝OH的化合物。
实施例2：
采用ACD公司ACD/ChemSketch V11.01附带的ACD/LogP软件根据化学结构式计算实施例1得到的除莠霉素衍生物的正辛醇-水分配系数(KOW)的对数值(logP值)，并与除莠霉素A，除莠霉素B，除莠霉素C做对比，结果显示，本发明的除莠霉素衍生物的logP值是1.00，而除莠霉素A，除莠霉素B，除莠霉素C分别是2.12，1.99，1.57。
实施例3：
本发明采用体外细胞毒实验，通过检测离体培养癌细胞加入待测样品(样品用二甲亚砜进行连续梯度稀释)后的存活率，来确定样品的活性程度。选取的肿瘤细胞株主要有人肺癌细胞A549、小鼠腹腔癌细胞Ehrlich和人子宫颈癌细胞Hela。采用四唑盐比色法(见文献Denizot F，Lang R.Rapid colorimetric assay for cell growth and survival modificationsto the tetrazolium dye procedure giving improved sensitivity and reliability.J.Immunol.Methods，1986，89，271-275.)来测定每种癌细胞的存活率(或死亡率)为50％时的半抑制浓度(IC50)。将实施例1得到的除莠霉素衍生物和其前体化合物除莠霉素A同时进行实验，结果表明，实施例1得到的除莠霉素衍生物体外抗A549癌细胞、Hela癌细胞和Ehrlich癌细胞的IC50分别为3540μg·mL-1、5.8μg·mL-1和0.7μg·mL-1，而其前体化合物除莠霉素A体外抗A549癌细胞、Hela癌细胞和Ehrlich癌细胞的IC50分别为2960μg·mL-1、5.6μg·mL-1和0.6μg·mL-1。而据期刊The Journal of Antibiotics，1986，39(11)，1630-1633中报道的其前体化合物除莠霉素A体外抗Hela癌细胞和Ehrlich癌细胞的IC50分别为3.5μg·mL-1和0.4μg·mL-1。
Claims (3)
1.一种由下述式(1)表示的化合物：
式(1)
其中R1＝OCH3和R2＝R3＝OH。
2.一种权利要求1所述化合物的制备方法，其特征包括以下的步骤：
(1)在高氏I号液体培养基中加入爪哇正青霉(Eupenicillium javanicum)种子液，26℃～30℃恒温摇床连续振摇，得到发酵液，粉碎菌体后加入硫酸铵盐析出发酵液中含有转化活性酶的蛋白质，透析得到酶液；
(2)在上述得到的酶液中，按每100mL酶液加入除莠霉素A 10～20mg，27℃～29℃温育反应，最后加入乙醇停止反应，用乙酸乙酯萃取，收集乙酸乙酯萃取物浓缩得到粗产物。
3.一种权利要求1所述化合物在制备抗肿瘤的药物中的应用。
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