CN101445543B

CN101445543B - 一种柳珊瑚多羟基甾醇及其制备方法和应用

Info

Publication number: CN101445543B
Application number: CN2008102204281A
Authority: CN
Inventors: 漆淑华; 张偲
Original assignee: South China Sea Institute of Oceanology of CAS
Current assignee: South China Sea Institute of Oceanology of CAS
Priority date: 2008-12-25
Filing date: 2008-12-25
Publication date: 2011-01-19
Anticipated expiration: 2028-12-25
Also published as: CN101445543A

Abstract

本发明涉及一种柳珊瑚多羟基甾醇及其制备方法和应用。特征是其结构由式(1)表示，通过下述方法得到：将细枝竹节柳珊瑚(Isis minorbrachyblasta)的有机溶剂提取物用氯仿或乙酸乙酯萃取，萃取物进行常压硅胶柱层析进行梯度洗脱，用薄层层析追踪，将在薄层层析上能用体积比7∶3的氯仿-甲醇展开的组分，用体积比8∶2到7∶3的氯仿-甲醇进行梯度洗脱，收集在薄层层析上用体积比7∶3氯仿-甲醇展开时比移值为0.6～0.8的组分，纯化。本发明的柳珊瑚多羟基甾醇对肺癌细胞、鼻咽癌细胞、宫颈癌细胞、胃癌细胞和肝癌细胞的生长都有一定的抑制作用，另外这种化合物还能有效地抗海洋污损生物幼虫附着，因此在制备抗癌药物和抗污剂方面都有良好的应用前景。

Description

一种柳珊瑚多羟基甾醇及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及一种柳珊瑚甾醇型多羟基甾醇，具体来说是涉及一种从竹柳珊瑚中提取出的新的柳珊瑚多羟基甾醇，另外还涉及这种甾醇的制备方法及其在抑制癌细胞生长和抗海洋生物污损方面的应用。

背景技术

细枝竹节柳珊瑚(Isisminorbrachyblasta)属于Isis属，该属的柳珊瑚中富含独特的多羟基甾醇，这些甾醇的结构类型主要有螺环结构的多羟基甾醇(hippuristanol)和柳珊瑚甾醇型(gorgosterol)两种骨架，其中部分甾醇有显著的抗肿瘤活性。但是目前国内外还不曾见有关竹柳珊瑚的有效成分的研究报道。

发明内容

本发明的目的在于从细枝竹节柳珊瑚中分离出具有药用价值的多羟基甾醇，另一个目的是开发出这种多羟基甾醇的制备方法，进一步的目的是开发出这种多羟基甾醇在抗癌和抗海洋污损生物幼虫附着方面的应用。

我们通过将细枝竹节柳珊瑚用有机溶剂提取得到的粗提取物用氯仿或乙酸乙酯萃取，再将氯仿萃取物或乙酸乙酯萃取物通过常压硅胶柱层析，并用薄层层析追踪，得到的化合物对人体多种癌症细胞株的生长都有抑制作用，还对海洋污损生物幼虫的附着有强抑制作用，从而实现了本发明的目的。

本发明的柳珊瑚多羟基甾醇，特征是其结构用式(1)表示：

式(1)

所述的式(1)的化合物的分子式是C₃₂H₅₂O₆，化学名称是Gorgost-5-ene-1α，3β，7α，11α，12β-pentaol 12-acetate，外观为白色粉末。

本发明的柳珊瑚多羟基甾醇的制备方法，其特征包括以下的步骤：

(1)将细枝竹节柳珊瑚(Isis minorbrachyblasta)用有机溶剂提取，将提取液浓缩得到粗提取物；

(2)将步骤(1)得到的粗提取物悬溶于水，用氯仿或乙酸乙酯萃取，浓缩得到氯仿萃取物或乙酸乙酯萃取物；

(3)将步骤(3)得到的氯仿萃取物或乙酸乙酯萃取物进行常压硅胶柱层析，以氯仿-丙酮、氯仿-乙酸乙酯、石油醚-丙酮或石油醚-乙酸乙酯溶剂系统为洗脱剂，从体积比100∶0到0∶100进行梯度洗脱，用薄层层析追踪合并组分，将在薄层层析上能用体积比7∶3的氯仿-甲醇溶剂系统展开的组分，用体积比8∶2到7∶3的氯仿-甲醇溶剂系统进行梯度洗脱，收集在薄层层析上用体积比7∶3氯仿-甲醇溶剂系统展开时比移值为0.6～0.8的组分，得到的粗产物再纯化，得到最终产物。

步骤(1)所述的有机溶剂可以是甲醇、乙醇、二氯甲烷、甲醇和二氯甲烷的混合溶剂或乙醇和二氯甲烷的混合溶剂等，所述的浓缩可以采用常规的方法例如减压浓缩等。

步骤(2)所述的浓缩可以采用常规的方法例如减压浓缩等。

步骤(3)所述的纯化可以采用常规的方法例如重结晶等。

通过结构鉴定，证明上述制备方法得到的产物结构用式(1)表示，其中本发明的产物的(+)ESIMS谱在m/z 533处显示分子离子峰，结合高分辨HRESIMS和¹³C NMR(DEPT)谱，推出其分子式为C₃₂H₅₂O₆，其¹³C NMR(DEPT)谱显示32个碳信号，包括30个基本骨架碳：7个甲基、5个亚甲基、8个次甲基、3个季碳、5个被氧化次甲基(δ_C64.5，65.7，72.9，74.1，86.2)、一个三取代双键[δ_C108.8(t)，116.0(d)]和一个乙酰基[(δ_C173.4(s)21.2(q)，δ_H2.10(3H，s))。其¹H NMR谱显示4个三取代甲基(δ_H0.78，0.91，1.08，2.10)、4个二取代甲基(δ_H0.83，0.88，0.90，0.92)、一个烯氢(δ_H5.77，1H，d，J＝4.6Hz)、5个被氧化次甲基[δ_H4.71(1H，d，J＝8.6Hz)，4.22(1H，br s)，3.90(1H，overlap)，3.86(1H，overlap)，3.78(1H，br s)]、和3个属于gorgosterol型甾醇中C-30环丙烷基特征性高场信号[(δ_H0.43(1H，dd，J＝4.3，8.9Hz)，-0.11(1H，t，J＝4.5Hz)，0.21(2H，overlap))(参考文献：1.Tanaka J，Trianto A，Musman M，Issa H.H.，Ohtani I.I.，IchibaT，Higa T，Yoshidac W.Y.，Scheuer P.J.Tetrahedron 2002，58，6259-6266.2.RaoC.B.，Ramana K.V.，Rao D.V.，Fahy E.，Faulkner D.J.J.Nat.Prod.1988，51，954-958.)。这些NMR数据和参考文献报道的化合物gorgost-5-ene-3β，7α，11α，12β--tetrol 12-acetate和gorgostane-1α，3β，5α，6β，11α，12β-hexol 12-acetate(参考文献：Tanaka J，Trianto A，Musman M，Issa H.H.，OhtaniI.I.，Ichiba T，Higa T，YoshidacW.Y.，Scheuer P.J.Tetrahedron 2002，58，6259-6266.)很相似，其中本发明的产物与gorgost-5-ene-3β，7α，11α，12β-tetrol 12-acetate的区别只在于本发明的产物中一个亚甲基被氧化为次甲基。在其HMBC谱中，δ_H1.08(3H，s，H-19)和δ_C74.1(d)，40.8(d，C-9)，43.6(s，C-10)，142.9(s，C-5)相关，这说明本发明的产物与gorgost-5-ene-3β，7α，11α，12β-tetrol 12-acetate的区别是C-1(δ_C74.1，d)被氧化为次甲基。另外，在NOESY谱中，H-1(δ_H4.22，1H，br s)和H-2β(δ_H1.82，m)/H-19(δ_H1.08，3H，s)相关，这表明H-1为β-构型，即C-1位置上的羟基是α-取代。通过将本发明的产物与gorgost-5-ene-3β，7α，11α，12β-tetrol 12-acetate及其它类似化合物的NMR数据比较、以及分析本发明的产物的2D NMR(HSQC，HMBC，and NOESY)谱，将本发明的产物的结构定为gorgost-5-ene-1α，3β，7α，11α，12β-pentaol 12-acetate，其结构式由式(1)表示。

通过体外抗肿瘤活性筛选实验，结果显示：本发明的柳珊瑚多羟基甾醇浓度在100μg/mL时，对数生长期的肺癌细胞株A549、鼻咽癌细胞株HONE1、宫颈癌细胞株HeLa、胃癌细胞株SGC-7901和肝癌细胞株细胞Hep_G2的生长抑制率分别为(67±1.8)％、(56±7.2)％、(59±4.1)％、(11±3.6)％、(10±4.5)％，证明本发明的柳珊瑚多羟基甾醇可以用于制备治疗癌症的药物。

通过抗污损生物附着活性筛选实验，结果显示：本发明的柳珊瑚多羟基甾醇纯产物对多室草苔虫(Bugula neritina)幼虫附着的半数有效抑制浓度EC₅₀为5.8μg/mL，半数有效致死浓度LC50＞100μg/mL，证明本发明的柳珊瑚多羟基甾醇可以用于抗海洋污损生物幼虫附着。

本发明的柳珊瑚多羟基甾醇对肺癌细胞、鼻咽癌细胞、宫颈癌细胞的生长有较强的抑制作用，对胃癌细胞和肝癌细胞的生长也有一定的抑制作用，另外这种化合物还能有效地抗海洋污损生物幼虫附着，在制备抗癌药物和抗污剂方面都有良好的应用前景。

具体实施方法

以下实施例是对本发明的进一步说明，不是对本发明的限制。

实施例1：

将湿重2Kg的细枝竹节柳珊瑚(Isis minorbrachyblasta)冷冻干燥切碎后用10L体积比2∶1的乙醇和二氯甲烷的混合溶剂提取3次，将提取液减压浓缩得粗提取物。

将粗提取物悬溶于水，用氯仿萃取3次，每次用氯仿300mL，收集氯仿层减压浓缩得到氯仿萃取物25g。

用氯仿-甲醇混合溶剂将氯仿萃取物溶解拌硅胶，用1250mL氯仿拌450g硅胶进行湿法装柱，以1000mL氯仿-丙酮溶剂系统为洗脱剂，从体积比100∶0到0∶100进行梯度洗脱，用薄层层析TLC(GF₂₅₄)追踪合并得到8个组分，将在TLC(GF₂₅₄)上能用氯仿-甲醇体积比7∶3溶剂系统展开的组分，用400mL体积比从8∶2到7∶3变化的氯仿-甲醇溶剂系统梯度冲洗(用常压玻璃柱)，收集在TLC(GF₂₅₄)上用体积比7∶3氯仿-甲醇溶剂系统展开时比移值为0.6～0.8的组分，得到粗产品26mg。

将粗产品用氯仿-甲醇的混合溶剂重结晶，得到纯产物18mg，该产物在硅胶GF254薄层层析板上用稀硫酸显色剂显色为红色，根据上述的结构分析证实其结构由式(1)表示。

实施例2：体外抗肿瘤活性筛选实验

分别收集对数生长期的肺癌细胞株A549、鼻咽癌细胞株HONE1、宫颈癌细胞株HeLa、胃癌细胞株SGC-7901和肝癌细胞株Hep_G2，用10％血清1640培养基使其悬浮，再接种于96孔培养板，每孔细胞数为5000/80μL，置于5％，CO₂培养箱37℃培养。用10％血清1640培养基将实施例1得到的纯产物稀释成浓度为25μg/mL，50μg/mL，100μg/mL的实验溶液。次日于实验组1的培养板中加入浓度为25μg/mL的实验溶液20μL，实验组2的培养板中加入浓度为50μg/mL的实验溶液20μL，实验组3的培养板中加入浓度为100μg/mL的实验溶液20μL，并使每孔中的终浓度达到测试(实验组浓度采用对倍稀释)。另外阴性对照组中加入等量的10％血清1640培养基。48h后，吸弃实验组和对照组中的培养液，每孔加入MTT 20μL(2.5mg/mL)，继续培养4h，再每孔加入DMSO 100μL终止反应，37℃放置20min，用酶标仪检测各孔在570nm处的吸光度A值，计算细胞生长抑制率。细胞生长率＝(实验组OD÷对照组OD)×100％。结果见表1。

表1本发明的式(1)的化合物对肿瘤细胞的抑制作用

实施例3：对多室草苔虫(Bugula neritina)幼虫的抗附着活性筛选实验

该实验用的是聚苯乙烯24孔径板，将实施例1得到的多羟基甾醇纯产物作为测试样品溶解于二甲亚砜(DMSO)，然后加入经高压灭菌器过滤(0.22μm)的海水(FSW)配成不同的浓度(0.2μg/mL，1μg/mL，10μg/mL，50μg/mL，100μg/mL)。在每个孔板中加入20个游动的幼虫和1mL配制好的测试样品，每个样品做4个平行孔，用加有DMSO的FSW海水作为阴性对照物。将配有测试样品的24孔径板放于28℃的培养箱中放置1小时后，观察实验结果。通过显微镜计算：1)已附着在板壁上的幼虫个数，2)没有附着在板壁上的幼虫个数，3)已死了的幼虫个数。计算已附着在板壁上的幼虫个数占实验用的总幼虫个数的百分比，再通过EPA PROBIT ANALYSIS PROGRAM Version 1.5软件计算其抑制幼虫附着的半数有效抑制浓度EC₅，结果显示，实施例1得到的多羟基甾醇纯产物对多室草苔虫幼虫附着的半数有效抑制浓度EC₅₀为5.8μg/mL，半数有效致死浓度LC50＞100μg/mL。

Claims

1.用下述式(1)表示的化合物：

2.权利要求1所述的化合物的制备方法，其特征包括以下的步骤：

(1)将细枝竹节柳珊瑚(Isis minorbrachyblasta)用有机溶剂提取，将提取液浓缩得到粗提取物，所述的有机溶剂是甲醇、乙醇、二氯甲烷、甲醇和二氯甲烷的混合溶剂或乙醇和二氯甲烷的混合溶剂；

3.根据权利要求2所述的化合物的制备方法，其特征是步骤(1)所述的浓缩是减压浓缩，步骤(2)所述的浓缩是减压浓缩，步骤(3)所述的纯化是重结晶。

4.权利要求1所述的化合物在制备治疗癌症的药物方面的应用。

5.权利要求1所述的化合物在抗海洋污损生物幼虫附着方面的应用。