CN103694247A - 化合物Chaetomugilide A及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

对银杏内生球毛壳菌0510-TY1进行发酵培养和次生代谢产物的分离，获得单体化合物，鉴定为ChaetomugilideA，属于嗜氮酮类生物碱，其在30μg/片滤纸（直径6mm）的情况下，对大肠杆菌的抑菌直径达到21.0mm，能够用于抗大肠杆菌药物的制备。

Description

化合物Chaetomugilide A及其制备方法和应用
技术领域
利用银杏内生球毛壳菌0510-TY1发酵液分离制备Chaetomugilide A，能够用于抗大肠杆菌药物的制备。
背景技术
植物内生真菌（Endophytic fungi）是指生活史的一定阶段或全部阶段在健康植物的各种组织或器官内部的真菌。自从1993年，美国蒙大拿州立大学的Strobel小组在短叶红豆杉（Taxus brevifolia）内生真菌Taxomyces andreanae中发现抗癌药物紫杉醇，并应用于开发，国内外掀起药用植物内生真菌的研究热潮，很多新颖结构的成分被发现。近年来，从内生真菌中寻找和发现新的具有抗菌、抗肿瘤、抗病毒、提高免疫力、抗炎等活性化合物已成为开发新型药物的重要途径。
球毛壳菌（Chaetomium globosum）属于子囊菌门(Ascomycota)，粪壳菌纲（Sordariomycetes），粪壳菌目（Sordariales），毛壳菌科（Chaetomiaceae），毛壳菌属(Chaetomiumsp.)。球毛壳菌不但分布广泛，而且已被认为是各种结构多样性次生代谢产物的丰富来源。现在已经发现了大量结构不同的新的具有生物活性的次生代谢产物，如球毛壳素类化合物，azaphilones，蒽醌，色酮，萜类化合物，甾体化合物。其中有许多化合物都具有显著的生物活性，如抗肿瘤、抗炎、细胞毒性、酶抑制活性、抗菌活性等。
发明内容
本发明的目的在于从银杏内生球毛壳菌0510-TY1发酵液中分离制备结构新颖的azaphilones类生物碱Chaetomugilide A，并进行抗大肠杆菌的应用。
为实现上述任务，本发明采用如下技术方案：
1. 化合物Chaetomugilide A，其结构式为：
。
2. 权利要求1所述的化合物在制备大肠杆菌药物中的应用。
3. 权利要求1所述化合物的制备方法，其特征在于包括以下步骤：
步骤（1）首先将球毛壳菌株0510-TYI在PDA培养基上活化5d，然后接种在种子PD液体培养基，180 rpm、28℃大型恒温振荡摇床培养5d，培养后的种子PD液体培养基按照体积比为10%的比例转接入装有燕麦液体培养基1.2L的2L三角瓶中，28℃静置发酵培养60d；
步骤（2）过滤掉三角瓶液体发酵液中的菌丝体，得到红色发酵滤液，发酵滤液缓慢流经大孔吸附树脂D101柱，然后用蒸馏水冲洗分离柱至流出液为无色，随后用50%的甲醇冲洗分离柱至流出液为基本无色，接着用70%的甲醇冲洗分离柱至流出液基本无色，收集70%的甲醇洗脱液，50℃减压蒸馏除去甲醇，剩余水溶液用乙酸乙酯萃取三次，并将乙酸乙酯萃取液浓缩至干得到红色浸膏；步骤（3）将红色浸膏用适量甲醇溶解，通过凝胶Sephadex LH-20柱层析，用甲醇洗脱，收集最下边的红色条带洗脱液，并在50℃下将该部分洗脱液浓缩至20%体积，然后在30℃下利用旋转蒸发仪进一步缓慢蒸发至10%体积，然后将其放在烧杯中静置敞口挥发，挥发至1%体积时除去残留液，并收集在烧杯中析出的红色针状晶体，即化合物Chaetomugilide A。
 4. 根据权利要求3的制备方法，其特征在于，所述活化PDA培养基的组成为土豆200 g，葡萄糖20 g，琼脂粉20 g和水 1000 mL；所述种子PD液体培养基的组成为土豆200 g，葡萄糖 20 g，水1000mL；所述的燕麦液体培养基的组成为燕麦片20 g，麦芽糖20 g，水1000mL。
首先对球毛壳菌0510-TY1进行发酵培养，然后对发酵液采用大孔吸附树脂D101吸附和分极性洗脱，对目的化合物所在的极性段采用凝胶色谱结合重结晶方法分离纯化得到目的化合物。采用核磁共振、质谱等辅助数据库系统antibase确定化合物的结构。并通过体外抑菌实验对化合物的抗大肠杆菌活性进行评价。 
具体实施方案
（1）菌株0510-TYI 首先在PDA培养基上活化5d，然后接种在种子PD液体培养基，180 rpm、28℃大型恒温振荡摇床培养5d，种子培养基按照10%的比例转接入装有燕麦液体培养基1.2L的2L三角瓶，28℃静置发酵培养60d。
（2）液体发酵液过滤掉菌丝体，得到红色发酵液，发酵液缓慢流经大孔吸附树脂D101柱，之后用蒸馏水冲洗柱子至流出液无色，然后用50%的甲醇冲洗柱子至流出液基本无色，然后用70%的甲醇冲洗柱子至流出液基本无色，收集70%的甲醇洗脱液，50℃蒸馏除去甲醇，水液用乙酸乙酯萃取三次，乙酸乙酯萃取液浓缩至干得到红色浸膏。
（3）红色乙酸乙酯萃取浸膏用甲醇溶解，通过凝胶Sephadex LH-20柱层析，用甲醇洗脱，在柱子上除了其他黄色条带外，还有三条刚好分开的红色条带，收集最下边的红色条带，50℃浓缩该部分收集液体至20%体积，然后在30℃下利用旋转蒸发仪缓慢蒸发至10%体积，然后将其放在烧杯中敞口静置，至残留1%左右的甲醇，除去残留液，将烧杯中的红色针状晶体收集，即得到化合物Chaetomugilide A。
（4）运用质谱、核磁共振等现代波谱技术对其结构进行鉴定。
采用琼脂扩散法，通过观察是否产生抑菌圈及测量抑菌圈直径大小来对单体化合物进行了体外抗细菌（大肠杆菌）活性的评价。
（5）细菌涂布接种于牛肉膏蛋白胨平板培养基上37℃培养24h，加入2 mL无菌的生理盐水洗涤培养物，用生理盐水将菌悬液稀释至0.5麦氏浊度（相当于1.5×108 CFU/mL），并进一步稀释至106 CFU/mL。将化合物配制成1 mg·mL-1（DMSO溶解）。无菌条件下，用移液枪移取一定量溶液(最终浓度为 30μg/片滤纸)于直径为6.0 mm 的圆形滤纸片上，DMSO作为空白对照，用同等浓度的氯霉素的DMSO溶液作为抗细菌的阳性对照。待有机溶剂完全挥发后，用无菌镊子将加有样品的滤纸片贴在已涂布上述菌液的带菌平板上。置于37℃静置培养24 h，观察实验结果，测量其抑菌圈直径，并做三个平行样，取平均值。
结果表明：分离得到的化合物具有光学活性，呈红色针状晶体。同位素峰强度比率（MH+/[MH+2]+）=3:1可以判断分子式中含有一个Cl原子，并通过HR-ESI-MS m/z：500.1838[M+H] +，13C NMR最终确定分子式为：C27H31ClO6N。
1HNMR（600MHz，MeOD）δ:7.70（1H，s，H-1），6.80（1H，s，H-4），6.60（1H，d，J=3.5Hz，H-9），6.49（1H，dd，H-10），2.34（1H，m，H-11），1.24-1.44（2H，m，H-12），0.87（1H，t，H-13），1.08（1H，d，H-14），1.57（1H，s，H-15），1.83（1H，d，H-21），1.81（1H，s，H-22），4.04（1H，m，H-23），1.75-1.86（2H，m，H-24），2.25-2.34（1H，m，H-25）；13CNMR（125MHz，MeOD）δ:139.3（d，C-1），148.7（s，C-3），109.3（d，C-4），145.0（s，C-4a），111.2（s，C-5），179.7（s，C-6），88.7（s，C-7），162.5（s，C-8），97.6（s，C-8a），120.3（d，C-9），149.0（d，C-10），38.9（d，C-11），28.9（t，C-12），12.0（q，C-13），19.6（q，C-14），26.5（q，C-15），168.3（s，C-16），123.3（s，C-17），190.5（s，C-18），137.4（s，C-19），146.7（d，C-20），15.6（q，C-21），10.9（q，C-22），53.2（t，C-23），25.4（t，C-24），30.3（t，C-25），174.0（s，C-26）。
该化合物被鉴定为Chaetomugilide A，结构式为：
Figure 979244DEST_PATH_IMAGE002
 
Chaetomugilide A在30 μg/片滤纸的情况下，对大肠杆菌的抑菌直径达到21.0 mm，阳性对照氯霉素，对大肠杆菌的抑菌直径为30 mm。以上结果表明Chaetomugilide A对大肠杆菌有较好的抑制效果，有被开发为抗菌药物的潜力。
综上所述，本发明从银杏内生球毛壳菌0510-TY1发酵液分离制备的化合物Chaetomugilide A能够用于抗大肠杆菌药物的制备。

Claims (4)

1.化合物Chaetomugilide A，其结构式为：
Figure 820302DEST_PATH_IMAGE001
。
2.权利要求1所述的化合物在制备大肠杆菌药物中的应用。
3.权利要求1所述化合物的制备方法，其特征在于包括以下步骤：
步骤（1）首先将球毛壳菌株0510-TY1在PDA培养基上活化5d，然后接种在种子PD液体培养基，180 rpm、28℃大型恒温振荡摇床培养5d，培养后的种子PD液体培养基按照体积比为10%的比例转接入装有燕麦液体培养基1.2L的2L三角瓶中，28℃静置发酵培养60d；
步骤（2）过滤掉三角瓶液体发酵液中的菌丝体，得到红色发酵滤液，发酵滤液缓慢流经大孔吸附树脂D101柱，然后用蒸馏水冲洗分离柱至流出液为无色，随后用50%的甲醇冲洗分离柱至流出液为基本无色，接着用70%的甲醇冲洗分离柱至流出液基本无色，收集70%的甲醇洗脱液，50℃减压蒸馏除去甲醇，剩余水溶液用乙酸乙酯萃取三次，并将乙酸乙酯萃取液浓缩至干得到红色浸膏；步骤（3）将红色浸膏用适量甲醇溶解，通过凝胶Sephadex LH-20柱层析，用甲醇洗脱，收集最下边的红色条带洗脱液，并在50℃下将该部分洗脱液浓缩至20%体积，然后在30℃下利用旋转蒸发仪进一步缓慢蒸发至10%体积，然后将其放在烧杯中静置敞口挥发，挥发至1%体积时除去残留液，并收集在烧杯中析出的红色针状晶体，即化合物Chaetomugilide A。
4.根据权利要求3的制备方法，其特征在于，所述活化PDA培养基的组成为土豆200 g，葡萄糖20 g，琼脂粉20 g和水 1000 mL；所述种子PD液体培养基的组成为土豆200 g，葡萄糖 20 g，水1000mL；所述的燕麦液体培养基的组成为燕麦片20 g，麦芽糖20 g，水1000mL。
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