CN104086522B - 一种螺二萘类化合物及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及喜树植物内生真菌<i>Lasiodiplodia</i><i>pseudotheobromae</i>发酵产物中提取分离的一种新的螺二萘类化合物及其在制备人急性早幼粒白血病细胞株HL-60抑制剂中的应用。该化合物具有式I化学结构式，实验研究表明，它对人急性早幼粒白血病细胞株HL-60具有较强的生长抑制作用，且其制备方法简单易行，重现性好，有利于对进行进一步的药理和临床研究，开发其在制备治疗白血病药物的应用。

Description

一种螺二萘类化合物及其制备方法
技术领域
本发明属于医药技术领域，涉及从喜树来源植物内生真菌Lasiodiplodiapseudotheobromae发酵液中提取分离得到的一种新的螺二萘类化合物及其制备方法及其在制备人急性早幼粒白血病细胞株HL-60抑制剂中的用途。
背景技术
螺二萘类化合物是一类结构独特的天然产物，文献报道其主要从植物内生真菌Nattrassiamangiferae、海洋真菌Ascochytasp.NGB4以及一些植物的茎干如Jatrophacurcas和Bruguieragymnorrhiza中分离得到，而本发明所涉及的真菌Lasiodiplodiapseudotheobromae代谢产物中尚未有该类化合物的报道。
根据文献记载，该类化合物具有抗肿瘤、抗菌、免疫抑制等作用。例如从Nattrassiamangiferae中分离得到的Sch50673和Sch50676对人纤维肉瘤细胞HT1080具有细胞毒作用，其IC50值分别为6.2和2.8μM；从海洋真菌Ascochytasp.NGB4中分得的Ascochytatin对人肺癌细胞A549和白血病Jurkat细胞均表现出明显的生长抑制作用，其IC50值分别为4.8和6.3μM，且其具有非常强的抗革兰氏阳性菌和白色念珠菌的作用；从植物Bruguieragymnorrhiza的茎干中分离得到的palmarumycinBG5对人乳腺癌细胞MCF-7和人白血病细胞HL-60均具有强的细胞毒作用，其IC50值分别为7.6和3.1μM。本发明所涉及的螺二萘类化合物迄今在国内外尚未见有相关专利或文献报道。
发明内容
本发明提供一种从喜树植物内生真菌Lasiodiplodiapseudotheobromae发酵液中提取分离的新螺二萘类化合物，其结构如式I所示：
本发明还提供所述化合物在制备治疗白血病药物中的应用。
本发明的制备技术方案包括如下步骤：
将分离自四川攀枝花喜树植物树枝部分的内生真菌Lasiodiplodiapseudotheobromae进行大量发酵，发酵产物经过滤得到发酵液和菌丝体。发酵液经浓缩后，用乙酸乙酯萃取；菌丝体用80％丙酮水溶液超声提取，浓缩除去丙酮后，再用乙酸乙酯萃取。将发酵液乙酸乙酯萃取物和菌丝体乙酸乙酯萃取物合并后，经硅胶柱色谱，用体积配比为100:0-0:100的二氯甲烷-甲醇或三氯甲烷-甲醇溶液进行梯度洗脱，其中二氯甲烷-甲醇体积配比为100:1-100:2的洗脱物再经SephadexLH-20凝胶柱色谱，用甲醇-水洗脱，并经半制备ODS高效液相色谱进行纯化，以体积配比为70:30-50:50的甲醇-水溶液为流动相洗脱，得式I化合物。
式I化合物为灰色粉末(甲醇)。10％硫酸乙醇溶液(v/v)显色呈深灰色。-35°(c0.4,MeOH)；UV(MeOH):219,309,325,340nm；IR(KBr):3399,2927,2833,1642,1450,1384,1118,1030cm-1；.ECD(MeOH)λ[nm](△ε)：221(-38.5),311(1.49),363(-2.14)。HR-ESI-MS中给出准分子离子峰[M+H]+m/z367.0808(Calcdfor367.0812)，结合其核磁共振波谱数据，确定式I化合物的分子式为C20H14O7。1H-NMR(600MHz,DMSO-d6)谱中，给出三个酚羟基质子信号δH12.00(1H,s)、9.88(1H,s)和9.00(1H,s)，和七个芳香氢信号δH7.69(1H,d,J＝8.5Hz)、7.39(1H,dd,J＝8.5,7.4Hz)、7.25(1H,d,J＝9.1Hz)、7.01(1H,d,J＝9.1Hz)、6.95(1H,d,J＝7.4Hz)、6.89(1H,d,J＝8.1Hz)、6.86(1H,d,J＝8.2Hz)，一个活泼质子信号δH5.66(1H,d,J＝3.0Hz)，一个次甲基质子信号δH4.23(1H,m)和两个亚甲基质子信号δH3.16(1H,dd,J＝16.2,2.3Hz)、2.64(1H,dd,J＝16.4,4.1Hz)。13C-NMR(150MHz,DMSO-d6)谱给出20个碳信号，其中包括1个酮羰基碳信号δC203.5；1个缩酮碳信号δC100.4；16个sp2杂化的碳信号δC154.5、149.8、148.1、147.9、138.5、128.6、126.4、124.9、120.7、119.9、115.8、115.6、113.9、110.7、109.7、109.3和2个sp3杂化的碳信号δC65.6、43.4。
将式I化合物的1H-NMR、13C-NMR信号通过HSQC和HMBC谱进行归属。在HMBC谱中，芳香质子信号δ7.69(1H,d,J＝8.5Hz,H-9’)与δ148.1(C-1’)、113.9(C-5’)、109.3(C-7’)相关，δ7.39(1H,dd,J＝8.5,7.4Hz,H-8’)与δ124.9(C-10’)相关，δ6.95(1H,d,J＝7.4Hz,H-7’)与δ147.9(C-6’)、115.8(C-9’)、113.9(C-5’)相关，δ6.89(1H,d,J＝8.1Hz,H-3’)与δ148.1(C-1’)、138.5(C-4’)、113.9(C-5’)相关，δ6.86(1H,d,J＝8.2Hz,H-2’)与δ148.1(C-1’)、138.5(C-4’)、124.9(C-10’)相关，提示存在萘环结构片段；芳香质子信号δ7.25(1H,d,J＝9.1Hz,H-7)与δ154.5(C-9)、149.8(C-6)、119.9(C-5)、100.4(C-4)相关，δ7.01(1H,d,J＝9.1Hz,H-8)与δ154.5(C-9)、149.8(C-6)、115.6(C-10)相关，δ12.00(1H,s,9-OH)与δ154.5(C-9)、120.7(C-8)、115.6(C-10)相关，δ9.00(1H,s,6-OH)与δ149.8(C-6)、128.6(C-7)、119.9(C-5)相关，饱和碳上质子信号δ3.16(1H,dd,J＝16.2,2.3Hz,H-2)与δ203.5(C-1)、65.6(C-3)相关，δ5.66(1H,d,J＝3.0Hz,3-OH)与δ100.4(C-4)相关，提示存在四氢化萘环结构片段；根据化合物不饱和度为14，提示结构中除了上述两个片段外，还有1个环状结构存在，δ100.4(C-4)通过2个氧原子将两个片段连接起来。
通过以上解析，最终确定式I化合物即为本发明的螺二萘类化合物。
表1：式I化合物的1H-NMR(600MHz,DMSO-d6)和13C-NMR(125MHz,DMSO-d6)数据以及主要的HMBC相关
对所得到的式I化合物进行肿瘤细胞生长抑制方面的研究。体外实验结果表明，式I化合物在体外对人急性早幼粒白血病细胞株HL-60的具有显著的生长抑制作用，其IC50值为2.39μM，与阳性对照药物5-氟尿嘧啶(5-FU)相当。因此，本发明所述的新螺二萘类化合物具有制备临床预防和治疗白血病药物的前景。
本发明的优点在于，所得到的化合物结构新颖，且具有显著抑制肿瘤细胞生长的活性，其提取分离方法简易，重现性好，可通过微生物发酵培养大量获得，也可通过化学方法合成该类化合物，便于对其进行进一步的药理和临床研究，为开发疗效好且毒副作用小的新型抗白血病药物提供物质基础。
具体实施方式：
下面所列实施例有助于本领域技术人员更好地理解本发明，但不以任何方式限制本发明。
实施例1：式I化合物的发酵生产及分离精制
1发酵生产
生产菌的发酵培养：喜树植物内生真菌Lasiodiplodiapseudotheobromae菌株经复苏后，从斜面转接到装有125mL培养液[培养基组成：甘露醇2％，葡萄糖2％，酵母膏0.5％，蛋白胨1％，KH2PO40.05％，MgSO4·7H2O0.03％，玉米浆0.1％，陈自来水配制]的三角瓶(500mL)中，于28℃摇床上180rpm振荡培养2天后，获得种子培养液。然后将种子液按5％的接种量接种到含有200mL新鲜、灭菌的真菌4号液体培养基的500mL三角瓶中，在室温条件下静置培养30天,获得发酵培养物约75L。
2粗提物的获得
发酵培养物用16层纱布过滤，将菌丝体和发酵液分离。发酵液减压浓缩至10L，用等体积的乙酸乙酯萃取4次，减压浓缩得到发酵液乙酸乙酯萃取物。菌丝体菌丝体用80％丙酮超声提取3次，每次1小时，浓缩除去丙酮后，再用乙酸乙酯萃取4次，浓缩后得到菌丝体乙酸乙酯萃取物。将发酵液乙酸乙酯萃取物和菌丝体乙酸乙酯萃取物合并后，得到总粗提物60.0g。
3化合物的分离精制
总粗提取物(60.0g)经硅胶柱色谱，用体积配比为100:0-0:100的二氯甲烷-甲醇进行梯度洗脱，其中二氯甲烷-甲醇体积配比为100:1-100:2的洗脱物Fr.4再经SephadexLH-20凝胶柱色谱，用甲醇-水洗脱，并经半制备高效液相色谱进行纯化，使用长度为250mm，内径为10mm的色谱柱，以内径为5mm的ODS为填料，以体积配比为58:42的甲醇-水为流动相洗脱，，得式I化合物(6.0mg，tR38min)。
实施例2：式I化合物在体外对人急性早幼粒白血病细胞株HL-60的生长抑制实验：
HL-60细胞培养于含有10％经加热灭活的胎牛血清、100IU/mL青霉素、100mg/mL链霉素及1mmol/LL-谷氨酰胺RPMI1640培养液中，37℃、5％CO2饱和湿度培养箱中孵育。称取台盼蓝，加少量蒸馏水研磨，加双蒸水稀释到4％的储存浓度，用滤纸过滤，4℃保存。使用时，将该储存液用PBS稀释至0.4％工作浓度。取上述细胞(5×104/mL)接种于12孔板，每孔2mL。加入不同浓度药物孵育后制备单个细胞悬液，取50μL细胞悬液加入50μL的0.4％台盼蓝溶液，混匀，在3分钟内，于显微镜下观察，死细胞被染成蓝色，而活细胞拒染。用血球计数板分别计数活细胞和死细胞。化合物对HL-60细胞的生长抑制作用通过细胞计数测得。取HL-60细胞(5×104/mL)接种于12孔板，每孔2mL。加入不同浓度式I化合物孵育后制备单个细胞悬液，用血球计数板分别计数对照孔和加药孔的细胞数。利用下列公式求得细胞生长抑制率：1–(加药孔细胞数/对照孔细胞数)×100％。按相同方法对阳性对照药5-氟尿嘧啶进行测试。其IC50结果如表2所示。
表2：式I化合物在体外对人急性早幼粒白血病细胞株HL-60的生长抑制作用
Compounds IC50(μM)
式I化合物 2.39
5-FU 1.87
体外实验结果表明，式I化合物在体外显示出较强的抑制人急性早幼粒白血病细胞株HL-60生长的活性，其IC50为2.39μM，与阳性对照药物5-氟尿嘧啶(5-FU)相当，有望开发其在制备人急性早幼粒白血病细胞株HL-60抑制剂中的用途。

Claims (5)

1.如式（I）所示的螺二萘类化合物：
。
2.如权利要求1所述的螺二萘类化合物的制备方法，其特征在于：将植物内生真菌Lasiodiplodiapseudotheobromae进行大量发酵，发酵产物经过滤得到发酵液和菌丝体，发酵液经浓缩后，用乙酸乙酯萃取；菌丝体用80%丙酮水溶液超声提取，浓缩除去丙酮后，再用乙酸乙酯萃取，将发酵液乙酸乙酯萃取物和菌丝体乙酸乙酯萃取物合并后，从提取物中分离纯化出式（I）化合物。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于：将合并的乙酸乙酯萃取物经硅胶柱色谱，用体积配比为100:0-0:100的二氯甲烷-甲醇溶液或三氯甲烷-甲醇溶液进行梯度洗脱，其中二氯甲烷-甲醇或三氯甲烷-甲醇体积配比为100:1-100:2的洗脱物再经SephadexLH-20凝胶柱色谱，用甲醇洗脱，并经半制备ODS高效液相色谱进行纯化，以体积配比为70:30-50:50的甲醇-水溶液为流动相洗脱，得式I化合物。
4.一种药物组合物，其特征在于，包含权利要求1所述的螺二萘类化合物。
5.权利要求1所述的螺二萘类化合物或权利要求4所述的组合物在制备治疗白血病药物中的应用。
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