CN103642887B - 一种雷公藤红素衍生物的制备方法及其产品和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种雷公藤红素衍生物的制备方法及其产品和应用，该制备方法以雷公藤红素为微生物代谢药物，通过特殊诱导子对微生物代谢雷公藤红素，同时得到多种、高产率的基于雷公藤红素的羟基、还原或羧基化等取代修饰的雷公藤红素衍生物。本发明方法绿色环保、选择性强、产率高，能够大规模利用微生物制备雷公藤红素衍生物，且制备的雷公藤红素衍生物具有高效、低毒等特点，能够实际地用于肿瘤、病毒性疾病和神经损伤性疾病的治疗，为雷公藤红素衍生物提供了广阔的应用前景。
Description
【技术领域】
本发明涉及一种雷公藤红素衍生物的制备方法及其产品和应用。
【背景技术】
卫矛科植物雷公藤（TripterygiumwilfordiiHook.F.），收载于《滇南本草》，其产地主要分布在中国南部，包括浙江、湖南、安徽、云南、福建和台湾等地，其中以福建泰宁产的雷公藤质量为最优[1]。而雷公藤红素（celastrol，CS），属醌甲基三萜类化合物，是雷公藤主要的活性成分之一，其在抗癌、抗炎、特别是治疗神经系统疾病包括：阿尔兹海默病（早老性痴呆，AD）、帕金森病（PD）、亨延顿氏退行性疾病（HD）和脊髓损伤、肌萎缩性侧索硬化（ALS）疾病等方面表现出了突出的药理活性，特别是对“全长变异亨延顿神经元细胞显型的逆转作用十分突出，其对其聚合谷氨酸调节积累的半数抑制率为（IC50=2.5um)，这一抑制率与美国国立神经疾病研究所(NINDS)，所列出的全部1040个治疗HD的药物中排列于前10位，而在另一方面，雷公藤红素作为有效的蛋白酶体抑制剂，通过抑制伴侣蛋白（Hsp90）表达，发挥诱导肿瘤凋亡，显示了非常突出的抗肿瘤作用，为此，雷公藤红素在抑制肿瘤和神经系统保护的药物开发方面，显示了巨大的应用前景。然而，雷公藤红素极低的水溶性所引起制剂困难、对酸碱敏感而引发的分解、还原和重排，聚合不稳定性等都限制了其研发进程和临床应用（引用文献如下：孙红莉.雷公藤红素衍生物的化学合成及其活性研究[博士论文].暨南大学，2010）。
鉴于上述问题，国内外学者成功运用化学法对雷公藤红素进了多种修饰改造，其中化学合成法合成的衍生物包括：二氢雷公藤红素及多种雷公藤红素类似物（公开文献如下：（NagaseM,OtoJ,SugiyamaS,etal.ApoptosisinductioninHL-60cellsandinhibitionoftopoisomeraseIIbytriterpenecelastrol.Bioscience,biotechnology,andbiochemistry,2003,67(9):1883-1887）、（Devlin,JP.Derivativesofpentacyclicnortriterpenequinonemethidesascompoundsusefulinthetreatmentofinflammatoryneurodegenerativeandneoplasticdiseases,USpatent2004/0220267A1,2004-11-04）），雷公藤红素有机酯类衍生物（雷公藤红素甲酯、雷公藤红素乙酯、雷公藤红素丙酯、雷公藤红素丁酯、雷公藤红素卞酯、14N-甲基-哌嗪酸-雷公藤红素酯、3-乙基雷公藤红素、3-丁基雷公藤红素、3-丙基雷公藤红素、3-异丁基雷公藤红素、3-川芎嗪酸雷公藤红素、28--川芎嗪酸雷公藤红素、a-硫辛酸雷公藤红素酯（公开专利为：王玉强，孙红莉，徐立朋，等。一种雷公藤红素衍生物及其用途，中国专利201010150428.6.2010-04-23）、雷公藤红素磺酸钠类衍生物（2,3羟基-6-磺酸钠-雷公藤红素，2,3羟基-6-磺酸钠-雷公藤红素甲酯，2,3羟基-6-磺酸钠-雷公藤红素丁酯，2,3,7羟基-6磺酸钠-雷公藤红素，2-羟基-3乙酰基-6磺酸钠-雷公藤红素，2,3羟基-6磺胺-雷公藤红素甲酯）（公开专利为：（ZengJF,PanJF,LiBYetal.Water-solubletriterpenephenolcompoundhavingantitumoractivityandthepreparationthereof,USpatent2010/0267983,2010-10-21），（ZengJF,PanJF,LiBYetal.Water-solubletriterpenephenolcompoundhavingantitumoractivityandthepreparationthereof,Europeanpatent,EP,2012/2213679B1,2012-06-06））和雷公藤红素酰胺类衍生物（28-（4，-甲氧基）-苄基酰胺雷公藤红素，28-苄基酰胺雷公藤红素，28-（3，-吡啶）甲酰胺基雷公藤红素，28-异丙基酰胺雷公藤红素、28-（N-甲基）-甲酰胺雷公藤红素，28-吡咯烷酰胺雷公藤红素、28-甲氧基乙基酰胺雷公藤红素、28-吗啉酰胺雷公藤红素、28-N-甲基酰胺雷公藤红素、雷公藤红素28-N-甲基哌嗪酰胺、雷公藤红素苯甲酸酯、雷公藤红素异丙酯）（公开专利为：Ze’evA，R,Anindita,B,NicholasDP,Cetal.Compositionsandmethodsforinhibitinggrowthandmetastasismelanoma.USpatent2011/7888355B2,2011-02-15）。虽然化学修饰为大规模制备雷公藤红素相关衍生物提供了广阔的前景，但是但化学合成法存在得率低、选择性差、副产品多、过程较繁杂等缺点，而且目前大多数衍生物的作用与雷公藤红素相比，还相对较弱，为此，具有一定的局限性。
由于雷公藤红素水溶性极差，其在体内发挥最用的应该以其体内代谢产物为主，虽然雷公藤红素体内代谢产物已经部分阐明，但是利用化学方法直接得到与雷公藤代谢相同的成分，比较少，而在另一方面，利用具有仿生代谢能力的微生物直接通过微生物特殊的酶促作用直接转化生物雷公藤红素产生多种体内代谢、减毒后的雷公藤红素的衍生物已经取得了很好的效果，但该代谢的方法在雷公藤红素方面的应用极少，目前尚未见到系统的报道结果。因此，需要利用生物工程的这项技术，以此得到更多的雷公藤红素衍生物。
【发明内容】
本发明要解决的技术问题之一，在于提供一种雷公藤红素衍生物的制备方法，该方法绿色环保、选择性强、产率高，能够大规模利用微生物制备雷公藤红素衍生物。
本发明是这样实现上述技术问题之一的：
一种雷公藤红素衍生物的制备方法，包括以下步骤：
步骤一：取保存于4℃、土豆斜面培养基培养的、转化菌种一支，置于25℃恒温培养箱中培养7天后，以适量无菌水将斜面上的孢子充分吹打下来，使单孢子悬液的浓度调整至107～108个/mL，既得种子孢子液；
步骤二：以100mL，5mL的接种量，在土豆液体培养基上接种步骤一所得孢子液，在pH至6.0，温度30℃±1℃，振荡速度为200r/min条件下培养12h后；按0.1～4ug的接种量，加入各种不同比例的联合诱导子，继续培养12h后，再按1～10ug的接种量加入雷公藤红素，然后继续培养5天，每天检测各种雷公藤红素衍生物的含量和转化率，当产物转化率低至0.5～3%时，停止培养，过滤后收集菌丝体，然后将滤液于8000r/min,离心10min去除沉淀既得到发酵提取液；
步骤三：将步骤二所得提取液过滤，滤液用等体积的乙酸乙酯萃取3遍，合并萃取液；而菌丝体则用重量比为1：3～1：10的乙酸乙酯超声提取30min，然后滤去菌丝体，所得滤液与萃取液合并，既得分离提取液，提取液浓缩至干，得到提取后残渣；
步骤四：将经过步骤三处理所得的残渣，用1mg：1～10mL的比例用丙酮溶解后，采用硅胶拌样后挥干，称取20倍于样品量的硅胶，使用湿法进行填柱（硅胶柱，欣维尔，MCT-G-05；装样量为每mL为20g硅胶）和上样；首先用5倍柱体积的100%石油醚将样品中低极性油类物质洗脱干净，然后依次用体积比为：5:2，2:3，2:5，0:5的石油醚：二氯甲烷的洗脱液，体积比为10:0，8:1，6:1，4:1，2:1，1:1，1:2，1:4，1:6，1:8的二氯甲烷：乙酸乙酯洗脱液，以及100%乙酸乙酯洗脱液，依次对柱子进行洗脱，TLC控制收集主馏分，最后使用旋转蒸发仪将各个馏分的流动相蒸干后，用适量色谱纯的甲醇溶解后，用0.22μm的有机膜过滤后，得到分离液。
步骤五：将经过步骤四处理所得的分离液，采用高效液相半制备法分离纯化，HPLC梯度洗脱法控制收集不同的雷公藤红素衍生物洗脱液，减压蒸去溶剂后，用甲醇结晶后所得到的化合物，即为所述的雷公藤红素衍生物。
进一步地，所述土豆培养基为：土豆200g/L，葡萄糖20g/L；配置时将土豆去皮后将其切成小块，加水加热煮沸30min，过滤，取滤液定容至1L，加入葡萄糖20g，搅拌溶解后，121℃灭菌30min，即得；
斜面培养基为：取上述土豆培养基1L，加入琼脂粉各20g，加热溶解后分装于玻璃试管中，于121℃下灭菌30min后取出，倾斜45度，静置、冷却既得。
进一步地，所述转化菌种为下述微生物中任意一种：
短刺小克银汉霉（Cunninghamellablakesleana)AS3.970;AS3.153;AS3.910；AS3.954,AS3.2016;AS3.2017;AS3.2018;AS3.3401;或者刺孢小克银汉霉（Cunninghamellaechinulata)AS3.154;AS3.952;AS3.953;AS3.1969;AS3.1970;AS3.1971;AS3.1977;AS3.1978;AS3.1979;AS3.1980;AS3.1981;AS3.1987;AS3.1988;AS3.1989;AS3.1990;AS3.2000;AS3.2004;AS3.2005;AS3.2006;AS3.2011;AS3.2015;AS3.2473;AS3.2474;AS3.2475;AS3.2716;AS3.400;或者雅致小克银汉霉（Cunninghamellaelegans.）AS3.156;AS3.1207;AS3.1659;AS3.2028;AS3.2031;AS3.2032;AS3.2033;AS3.2041;AS3.2476;AS3.2477;AS3.2717;AS3.3402;AS3.2476;小克银汉霉CFCC5029;或者Cunninghamellaechinulatavar.elegans(Lendner)LunnetShipton,teleomorphATCC9245；ATCC8688a；ATCC8983；或者Cunninghamellaechinulata(Thaxter)Thaxtervar.echinulata,teleomorphATCC11585a；ATCC36190；ATCC11585b；ATCC9244；或者Cunninghamellaechinulatavar.elegans(Lendner)LunnetShipton,teleomorphATCC11064；ATCC10028a；或者CunninghamellaelegansATCC36112；ATCC26269；ATCC10028b；黑曲霉AspergillusnigerAS3.40;AS3.315;AS3.316;AS3.350;AS3.429;AS3.739;AS3.879;AS3.939;AS3.940;AS3.1858;AS3.2931;AS3.3882;AS3.3883;AS3.4303;AS3928;AS3.4304;AS3.4309;AS3.4463;AS3.4304;AS3.4523；黄曲霉、刺囊毛霉、细孢毛霉、链格孢、微紫青霉和荨麻青霉。
进一步地，所述的联合诱导子为下述三组物质中的至少两组中的任意一种物质组成：
A组：A1为α-环糊精，A2为β-环糊精，A3为2,6-二甲基-β-环糊精，A4为2-羟丙基-β-环糊精，A5为甲基化-β-环糊精、A6为羟乙基-β-环糊精，A7为葡萄糖-β-环糊精，A8为磺丁基-β-环糊精，A9为γ-环状糊精，A10为羧甲基-β-环糊精；
B组：B1为茉莉酸甲酯，B2为水杨酸，B3为壳聚糖，B4为茉莉酸，B5为真菌聚糖类，B6为β-葡聚糖，B7为谷胱甘肽，B8为2-羟乙基茉莉，B9为油菜素内酯，B10为云酯，B11为甲壳素；B12为小克银汉霉属AL4粗诱导子；
C组：C1为卡马西平，C2为莫达非尼，C3为奈韦拉平，C4为利福平，C5为贯叶连翘，C6为异烟肼，C7为胰岛素，C8为奥美拉唑，C9为苯巴比妥，C10为泼尼松，C11为泼尼松龙,C12为地塞米松，C13为倍他米松，C14为倍氯米松，C15为戊酸倍他米松，C16为醋酸地塞米松，C17为9-氟-16α-甲基11β，17-二羟基-3-氧-1，4-雄二烯-17β-羧酸等。
进一步地，TLC控制收集主馏分，用体积比为70：12的氯仿和甲醇为展开剂；
所述产物转化率的高效液相色谱检测方法为：色谱柱AgilentZORBAXEclipseXDB-C18柱，其中分析柱内径乘以长度为4.6mm×250mm，粒径为5μm；雷公藤红素检测波长：427nm，室温；进样量：10μL；
所述梯度洗脱法控制不同的雷公藤红素衍生物的高效液相色谱检测方法为：色谱柱AgilentZORBAXEclipseXDB-C18柱，其中分析柱内径乘以长度为4.6mm×250mm，粒径为5μm；吸收波长：427nm；
流动相：甲醇：0.1%磷酸水的体积比和洗脱时间分别如下：27：73、洗脱时间0min；5：95、洗脱时间20min；17：83、洗脱时间25min；27：73、洗脱时间28min，27：73、洗脱时间30min；
上述对应的流速为：0.5ml/min；0.5ml/min；1ml/min；1ml/min；0.5ml/min；柱稳：25℃、进样量：20μl。
进一步地，所述方法可用于制备的雷公藤红素衍生物如下：二氢雷公藤红素，二氢扁塑藤素，二氢雷公藤酚B6，二氢tingenineB4，二氢雷公藤酸A、二氢雷公藤酸C、二氢pristimerol、雷公藤红素甲酯、雷公藤红素乙酯、雷公藤红素丙酯、雷公藤红素丁酯、雷公藤红素卞酯、14N-甲基-哌嗪酸-雷公藤红素酯、3-乙基雷公藤红素、3-丁基雷公藤红素、3-丙基雷公藤红素、3-异丁基雷公藤红素、3-川芎嗪酸雷公藤红素、28--川芎嗪酸雷公藤红素、a-硫辛酸雷公藤红素酯、2,3羟基-6-磺酸钠-雷公藤红素，2,3羟基-6-磺酸钠-雷公藤红素甲酯，2,3羟基-6-磺酸钠-雷公藤红素丁酯，2,3,7羟基-6磺酸钠-雷公藤红素，2-羟基-3乙酰基-6磺酸钠-雷公藤红素，2,3羟基-6磺胺-雷公藤红素甲酯、28-（4’-甲氧基）-苄基酰胺雷公藤红素，28-苄基酰胺雷公藤红素，28-（3’-吡啶）甲酰胺基雷公藤红素，28-异丙基酰胺雷公藤红素、28-（N-甲基）-甲酰胺雷公藤红素，28-吡咯烷酰胺雷公藤红素、28-甲氧基乙基酰胺雷公藤红素、28-吗啉酰胺雷公藤红素、28-N-甲基酰胺雷公藤红素、雷公藤红素28-N-甲基哌嗪酰胺、雷公藤红素苯甲酸酯、雷公藤红素异丙酯等雷公藤红素衍生物。
本发明要解决的技术问题之二，在于提供一种雷公藤红素衍生物，其具有高效、低毒等特点，能够实际地用于肿瘤、病毒性疾病和神经损伤性疾病的治疗，为雷公藤红素衍生物提供了广阔的应用前景。
本发明是这样实现上述技术问题之二的：
一种雷公藤红素衍生物，所述雷公藤红素衍生物的结构式a如下：
其中R1为氢、烷基、酰基或者有机酸根、，且可以由烷氧基、烷基或者羟基取代，其中所述烷基或者烷氧基包括至多10个碳原子；所述酰基为带含有硫杂环、含氮杂环和含氧杂环的酰基；所述有机酸根为脂肪酸根或者芳香酸根；所述脂肪酸根为、乙酸根、丙酸根、丁酸根、丙二酸根、磺酸根、丙酮酸根、肉桂酸根、琥珀酸根、柠檬酸根、乳酸根、葡萄糖酸根、硫辛酸根、N-乙酰半胱氨酸或者氨基酸根；所述芳香酸根为苯甲酸根或者吡嗪酸根；其中，基团X1和X2可以为羟基或氢；结构中连接基团R1及基团X1和X2的“—”键可代表或
进一步地，当R1是甲基时，基团X1和X2中一个为羟基，一个为氢，或者均为羟基；
当R1是羟甲基时，基团X1和X2一个为羟基，一个为氢，或者均为羟基；
当R1是羧基时，基团X1和X2均为羟基，或者均为氢。
进一步地，所述雷公藤红素衍生物具体为：6-羟基雷公藤红素、7-羟基雷公藤红素、6，7-二羟基雷公藤红素、23-羟基雷公藤红素、6，23-双羟基雷公藤红素、7，23-双羟基雷公藤红素、6，7，23-三羟基雷公藤红素、6，7-二羟基-23-羧基-雷公藤红素、23-羧基雷公藤红素。
进一步地，所述雷公藤红素衍生物可以用于制备治疗与肿瘤相关疾病的药物，包括用于制备治疗肺癌、肝癌、前列腺癌、人卵巢癌、腺癌、乳腺癌、粒细胞白血病、结肠癌、阿霉素敏感的肺癌、乳腺癌、肝癌、阿霉素抗药的肺癌、乳腺癌、肝癌等肿瘤系统疾病的药物。
进一步地，所述雷公藤红素衍生物可以用于制备治疗与病毒相关疾病的药物，包括用于制备治疗艾滋病、乙肝、疱疹、流感病毒的药物。
进一步地，所述雷公藤红素衍生物可以用于制备治疗与神经损伤相关疾病的药物，包括用于制备治疗阿尔兹海默病、帕金森病、亨延顿氏退行性疾病和脊髓损伤和肌萎缩性侧索硬化疾病的药物。
本发明要解决的技术问题之三，在于提供另一种雷公藤红素衍生物，其具有高效、低毒等特点，能够实际地用于肿瘤、病毒性疾病和神经损伤性疾病的治疗，为雷公藤红素衍生物提供了广阔的应用前景。
本发明是这样实现上述技术问题之三的：
一种雷公藤红素衍生物，所述雷公藤红素衍生物的结构式b如下：
其中R1′为氢或烷基，且可以由烷氧基、烷基或者羟基取代，其中所述烷基或者烷氧基包括至多2个碳原子；其中基团X1′和X2′可以为羟基、氢、酰基或者有机酸根；所述酰基为带含有硫杂环、含氮杂环和含氧杂环的酰基；所述有机酸根为脂肪酸根或者芳香酸根；所述脂肪酸根为、乙酸根、丙酸根、丁酸根、丙二酸根、磺酸根、丙酮酸根、肉桂酸根、琥珀酸根、柠檬酸根、乳酸根、葡萄糖酸根、硫辛酸根、N-乙酰半胱氨酸或者氨基酸根；所述芳香酸根为苯甲酸根或者吡嗪酸根；结构式b中连接R1′及基团X1′和X2′的“—”键可代表或
进一步地，当R1′是氢时，基团X1′和X2′中，一个为羟基，一个为氢；或基团X1′和X2′均为羟基；
当R1′是羟基时，基团X1′和X2′中，一个为羟基，一个为氢；或基团X1′和X2′均为氢；
进一步地，所述雷公藤红素衍生物具体为：6-氢-7-羟基雷公藤红素、6-氢-23-羟基雷公藤红素、6-氢-7，23-二羟基雷公藤红素、6-氢-6，7-二羟基雷公藤红素、6，7，8-三氢-6，7-二羟基雷公藤红素、6-氢-6，23-二羟基雷公藤红素。
进一步地，所述雷公藤红素衍生物可以用于制备治疗与肿瘤相关疾病的药物，包括用于制备治疗肺癌、肝癌、前列腺癌、人卵巢癌、腺癌、乳腺癌、粒细胞白血病、结肠癌、阿霉素敏感的肺癌、乳腺癌、肝癌、阿霉素抗药的肺癌、乳腺癌、肝癌等肿瘤系统疾病的药物。
进一步地，所述雷公藤红素衍生物可以用于制备治疗与病毒相关疾病的药物，包括用于制备治疗艾滋病、乙肝、疱疹、流感病毒的药物。
进一步地，所述雷公藤红素衍生物可以用于制备治疗与神经损伤相关的疾病，包括用于制备治疗阿尔兹海默病、帕金森病、亨延顿氏退行性疾病和脊髓损伤和肌萎缩性侧索硬化疾病的药物。
本发明具有如下优点：
本发明首次利用茉莉酸甲酯（MeJA）、地塞米松、β-环糊精等生物或者非生物诱导子联合作用，同时得到了短刺小克银汉霉（Cunninghamellablakesleeana）对雷公藤红素的转化的多种与体内代谢相同的雷公藤红素衍生物，并将6-氢雷公藤红素、23-羧基雷公藤红素、23-羟基雷公藤红素、6-羟基雷公藤红素、7-羟基雷公藤红素、6，7-二羟基雷公藤红素、6-氢-6，7-二羟基雷公藤红素、6，7，8-三氢-6，7-二羟基雷公藤红素产率提高了1.15至7.51倍。与以往的制备技术相比，本发明技术，具有绿色、环保、选择性强，产率高等特点，为大规模利用生物技术制备雷公藤红素衍生物提供了广阔的应用前景。
本发明的雷公藤红素衍生物可用于制备预防和/或治疗肿瘤、爱滋病、乙肝和神经细胞损伤等疾病，具有良好的用于治疗肺癌、肝癌、前列腺癌、人卵巢癌、人乳腺癌、粒细胞白血病、结肠癌、阿霉素敏感的乳腺癌、阿霉素抗药的乳腺癌、阿霉素抗药的白血病、神经细胞损伤等疾病（包括阿尔兹海默病（早老性痴呆，AD）、帕金森病（PD）、亨延顿氏退行性疾病（HD）和脊髓损伤和肌萎缩性侧索硬化（ALS）等疾病）的应用前景。
【具体实施方式】
本发明涉及一种雷公藤红素衍生物的制备方法，包括以下步骤：
步骤一：取保存于4℃、土豆斜面培养基培养的、转化菌种一支，置于25℃恒温培养箱中培养7天后，以适量无菌水将斜面上的孢子充分吹打下来，使单孢子悬液的浓度调整至107～108个/mL，既得种子孢子液；
步骤二：以100mL，5mL的接种量，在土豆液体培养基上接种步骤一所得孢子液，在pH至6.0，温度30℃±1℃，振荡速度为200r/min条件下培养12h后；按0.1～4ug的接种量，加入各种不同比例的联合诱导子，继续培养12h后，再按1～10ug的接种量加入雷公藤红素，然后继续培养5天，每天检测各种雷公藤红素衍生物的含量和转化率，当产物转化率低至0.5～3%时，停止培养，过滤后收集菌丝体，然后将滤液于8000r/min,离心10min去除沉淀既得到发酵提取液；
步骤三：将步骤二所得提取液过滤，滤液用等体积的乙酸乙酯萃取3遍，合并萃取液；而菌丝体则用重量比为1：3～1：10的乙酸乙酯超声提取30min，然后滤去菌丝体，所得滤液与萃取液合并，既得分离提取液，提取液浓缩至干，得到提取后残渣；
步骤四：将经过步骤三处理所得的残渣，用1mg：1～10mL的比例用丙酮溶解后，采用硅胶拌样后挥干，称取20倍于样品量的硅胶，使用湿法进行填柱（硅胶柱，欣维尔，MCT-G-05；装样量为每mL为20g硅胶）和上样；首先用5倍柱体积的100%石油醚将样品中低极性油类物质洗脱干净，然后依次用体积比为：5:2，2:3，2:5，0:5的石油醚：二氯甲烷的洗脱液，体积比为10:0，8:1，6:1，4:1，2:1，1:1，1:2，1:4，1:6，1:8的二氯甲烷：乙酸乙酯洗脱液，以及100%乙酸乙酯洗脱液，依次对柱子进行洗脱，TLC控制收集主馏分，最后使用旋转蒸发仪将各个馏分的流动相蒸干后，用适量色谱纯的甲醇溶解后，用0.22μm的有机膜过滤后，得到分离液。
步骤五：将经过步骤四处理所得的分离液，采用高效液相半制备法分离纯化，HPLC梯度洗脱法控制收集不同的雷公藤红素衍生物洗脱液，减压蒸去溶剂后，用甲醇结晶后所得到的化合物，即为所述的雷公藤红素衍生物。
所述土豆培养基为：土豆200g/L，葡萄糖20g/L；配置时将土豆去皮后将其切成小块，加水加热煮沸30min，过滤，取滤液定容至1L，加入葡萄糖20g，搅拌溶解后，121℃灭菌30min，即得；
斜面培养基为：取上述土豆培养基1L，加入琼脂粉各20g，加热溶解后分装于玻璃试管中，于121℃下灭菌30min后取出，倾斜45度，静置、冷却既得。
所述转化菌种为下述微生物中任意一种：
短刺小克银汉霉（Cunninghamellablakesleana)AS3.970;AS3.153;AS3.910；AS3.954,AS3.2016;AS3.2017;AS3.2018;AS3.3401;或者刺孢小克银汉霉（Cunninghamellaechinulata)AS3.154;AS3.952;AS3.953;AS3.1969;AS3.1970;AS3.1971;AS3.1977;AS3.1978;AS3.1979;AS3.1980;AS3.1981;AS3.1987;AS3.1988;AS3.1989;AS3.1990;AS3.2000;AS3.2004;AS3.2005;AS3.2006;AS3.2011;AS3.2015;AS3.2473;AS3.2474;AS3.2475;AS3.2716;AS3.400;或者雅致小克银汉霉（Cunninghamellaelegans.）AS3.156;AS3.1207;AS3.1659;AS3.2028;AS3.2031;AS3.2032;AS3.2033;AS3.2041;AS3.2476;AS3.2477;AS3.2717;AS3.3402;AS3.2476;小克银汉霉CFCC5029;或者Cunninghamellaechinulatavar.elegans(Lendner)LunnetShipton,teleomorphATCC9245；ATCC8688a；ATCC8983；或者Cunninghamellaechinulata(Thaxter)Thaxtervar.echinulata,teleomorphATCC11585a;ATCC36190;ATCC11585b；ATCC9244；或者Cunninghamellaechinulatavar.elegans(Lendner)LunnetShipton,teleomorphATCC11064；ATCC10028a；或者CunninghamellaelegansATCC36112；ATCC26269；ATCC10028b；黑曲霉AspergillusnigerAS3.40;AS3.315;AS3.316;AS3.350;AS3.429;AS3.739;、AS3.879;AS3.939;AS3.940;AS3.1858;AS3.2931;AS3.3882;AS3.3883;AS3.4303;AS3928;AS3.4304;AS3.4309;AS3.4463;AS3.4304;AS3.4523；黄曲霉、刺囊毛霉、细孢毛霉、链格孢、微紫青霉和荨麻青霉。
所述的联合诱导子为下述三组物质中的至少两组中的任意一种物质组成：
A组：A1为α-环糊精，A2为β-环糊精，A3为2,6-二甲基-β-环糊精，A4为2-羟丙基-β-环糊精，A5为甲基化-β-环糊精、A6为羟乙基-β-环糊精，A7为葡萄糖-β-环糊精，A8为磺丁基-β-环糊精，A9为γ-环状糊精，A10为羧甲基-β-环糊精；
B组：B1为茉莉酸甲酯，B2为水杨酸，B3为壳聚糖，B4为茉莉酸，B5为真菌聚糖类，B6为β-葡聚糖，B7为谷胱甘肽，B8为2-羟乙基茉莉，B9为油菜素内酯，B10为云酯，B11为甲壳素；B12为小克银汉霉属AL4粗诱导子；
C组：C1为卡马西平，C2为莫达非尼，C3为奈韦拉平，C4为利福平，C5为贯叶连翘，C6为异烟肼，C7为胰岛素，C8为奥美拉唑，C9为苯巴比妥，C10为泼尼松，C11为泼尼松龙,C12为地塞米松，C13为倍他米松，C14为倍氯米松，C15为戊酸倍他米松，C16为醋酸地塞米松，C17为9-氟-16α-甲基11β，17-二羟基-3-氧-1，4-雄二烯-17β-羧酸等。所述的联合诱导子为以下配比中的任意一种或者其他比例：A1:B1=1:1、A8:B1=1:6、A2:B2=5:4、B1:C1=1:1、B1:C16=1:9、B2:C11=8:7、A1:C1=1:1、A2:C13=7:4、A3:C12=9:2、A1:B1:C1=1:1:1、A3:B1:C13=5:3:4、A10:B4:C12=1:5:1，上述各成分之间的配比均为摩尔比。
TLC控制收集主馏分，用体积比为70：12的氯仿和甲醇为展开剂；
所述产物转化率的高效液相色谱检测方法为：色谱柱AgilentZORBAXEclipseXDB-C18柱，其中分析柱内径乘以长度为4.6mm×250mm，粒径为5μm；雷公藤红素检测波长：427nm，室温；进样量：10μL；
所述梯度洗脱法控制不同的雷公藤红素衍生物的高效液相色谱检测方法为：色谱柱AgilentZORBAXEclipseXDB-C18柱，其中分析柱内径乘以长度为4.6mm×250mm，粒径为5μm；吸收波长：427nm；
流动相：甲醇：0.1%磷酸水的体积比和洗脱时间分别如下：27：73、洗脱时间0min；5：95、洗脱时间20min；17：83、洗脱时间25min；27：73、洗脱时间28min，27：73、洗脱时间30min；
上述对应的流速为：0.5ml/min；0.5ml/min；1ml/min；1ml/min；0.5ml/min；柱稳：25℃、进样量：20μl。
所述方法可用于制备的雷公藤红素衍生物如下：二氢雷公藤红素，二氢扁塑藤素，二氢雷公藤酚B6，二氢tingenineB4，二氢雷公藤酸A、二氢雷公藤酸C、二氢pristimerol、雷公藤红素甲酯、雷公藤红素乙酯、雷公藤红素丙酯、雷公藤红素丁酯、雷公藤红素卞酯、14N-甲基-哌嗪酸-雷公藤红素酯、3-乙基雷公藤红素、3-丁基雷公藤红素、3-丙基雷公藤红素、3-异丁基雷公藤红素、3-川芎嗪酸雷公藤红素、28--川芎嗪酸雷公藤红素、a-硫辛酸雷公藤红素酯、2,3羟基-6-磺酸钠-雷公藤红素，2,3羟基-6-磺酸钠-雷公藤红素甲酯，2,3羟基-6-磺酸钠-雷公藤红素丁酯，2,3,7羟基-6磺酸钠-雷公藤红素，2-羟基-3乙酰基-6磺酸钠-雷公藤红素，2,3羟基-6磺胺-雷公藤红素甲酯、28-（4’-甲氧基）-苄基酰胺雷公藤红素，28-苄基酰胺雷公藤红素，28-（3’-吡啶）甲酰胺基雷公藤红素，28-异丙基酰胺雷公藤红素、28-（N-甲基）-甲酰胺雷公藤红素，28-吡咯烷酰胺雷公藤红素、28-甲氧基乙基酰胺雷公藤红素、28-吗啉酰胺雷公藤红素、28-N-甲基酰胺雷公藤红素、雷公藤红素28-N-甲基哌嗪酰胺、雷公藤红素苯甲酸酯、雷公藤红素异丙酯等雷公藤红素衍生物。
本发明还涉及上述一种雷公藤红素衍生物的制备方法制得雷公藤红素衍生物，所述雷公藤红素衍生物的结构式a如下：
其中R1为氢、烷基、酰基或者有机酸根、，且可以由烷氧基、烷基或者羟基取代，其中所述烷基或者烷氧基包括至多10个碳原子；所述酰基为带含有硫杂环、含氮杂环和含氧杂环的酰基；所述有机酸根为脂肪酸根或者芳香酸根；所述脂肪酸根为、乙酸根、丙酸根、丁酸根、丙二酸根、磺酸根、丙酮酸根、肉桂酸根、琥珀酸根、柠檬酸根、乳酸根、葡萄糖酸根、硫辛酸根、N-乙酰半胱氨酸或者氨基酸根；所述芳香酸根为苯甲酸根或者吡嗪酸根；其中，基团X1和X2可以为羟基或氢；结构中连接基团R1及基团X1和X2的“—”键可代表或
当R1是甲基时，基团X1和X2中一个为羟基，一个为氢，或者均为羟基；
当R1是羟甲基时，基团X1和X2一个为羟基，一个为氢，或者均为羟基；
当R1是羧基时，基团X1和X2均为羟基，或者均为氢。
本发明还涉及上一种雷公藤红素衍生物的制备方法制得的另一种雷公藤红素衍生物：所述雷公藤红素衍生物的结构式b如下：
其中R1′为氢或烷基，且可以由烷氧基、烷基或者羟基取代，其中所述烷基或者烷氧基包括至多2个碳原子；其中基团X1′和X2′可以为羟基、氢、酰基或者有机酸根；所述酰基为带含有硫杂环、含氮杂环和含氧杂环的酰基；所述有机酸根为脂肪酸根或者芳香酸根；所述脂肪酸根为、乙酸根、丙酸根、丁酸根、丙二酸根、磺酸根、丙酮酸根、肉桂酸根、琥珀酸根、柠檬酸根、乳酸根、葡萄糖酸根、硫辛酸根、N-乙酰半胱氨酸或者氨基酸根；所述芳香酸根为苯甲酸根或者吡嗪酸根；结构式b中连接R1′及基团X1′和X2′的“—”键可代表或
当R1′是氢时，基团X1′和X2′中，一个为羟基，一个为氢；或基团X1′和X2′均为羟基；
当R1′是羟基时，基团X1′和X2′中，一个为羟基，一个为氢；或基团X1′和X2′均为氢；
所述结构式a雷公藤红素衍生物具体为：6-羟基雷公藤红素、7-羟基雷公藤红素、6，7-二羟基雷公藤红素、23-羟基雷公藤红素、6，23-双羟基雷公藤红素、7，23-双羟基雷公藤红素、6，7，23-三羟基雷公藤红素、6，7-二羟基-23-羧基-雷公藤红素、23-羧基雷公藤红素。
所述结构式b雷公藤红素衍生物具体为：6‐氢‐7‐羟基雷公藤红素、6‐氢‐23‐羟基雷公藤红素、6‐氢‐7，23‐二羟基雷公藤红素、6‐氢‐6，7‐二羟基雷公藤红素、6，7，8‐三氢‐6，7‐二羟基雷公藤红素、6‐氢‐6，23‐二羟基雷公藤红素。
结构式a和b所述的雷公藤红素衍生物可以用于制备治疗与肿瘤相关疾病的药物，包括用于制备治疗肺癌、肝癌、前列腺癌、人卵巢癌、腺癌、乳腺癌、粒细胞白血病、结肠癌、阿霉素敏感的肺癌、乳腺癌、肝癌、阿霉素抗药的肺癌、乳腺癌、肝癌等肿瘤系统疾病的药物。
结构式a和b所述的雷公藤红素衍生物可以用于制备治疗与病毒相关疾病的药物，包括用于制备治疗艾滋病、乙肝、疱疹、流感病毒的药物。
结构式a和b所述的雷公藤红素衍生物可以用于制备治疗与神经损伤相关疾病的药物，包括用于制备治疗阿尔兹海默病、帕金森病、亨延顿氏退行性疾病和脊髓损伤和肌萎缩性侧索硬化疾病的药物。
本发明提供雷公藤红素衍生物是结构式a和b所示的化合物或其药学上可接受的盐和它们的光学异构体：
所述“药学上可接受的盐”具体可列举结构式a和b所示的化合与丙酸、草酸丙二酰、琥珀酸、富马酸、马来酸、乳酸、苹果酸、酒石酸、柠檬酸等有机酸和天冬氨酸、古氨酸等酸性氨基酸形成酯后再与无机碱形成的盐，如钠、钾、钙、铝盐和铵盐或与有机碱形成的盐，如甲胺盐乙胺盐、乙醇胺盐等，或与赖氨酸、精氨酸、鸟氨酸等碱性氨基酸形成酯后的盐酸、氢溴酸、氢氟酸，硫酸、硝酸、磷酸等无机酸的盐，或与甲酸、乙酸、苦味酸、甲磺酸、乙磺酸等有机酸的盐；
“光学异构体”包含对眏异构体、非对眏异构体、光学异构体的混合物及纯光学异构体。
本发明的雷公藤红素衍生物，其药学上可接受的盐或光学异构体可制成含活性成分0.001～99.9%(重量)以及适量药学上可接受的载体的各种制剂，如适合口服、注射或肠道给药使用的制剂形式。
以下结合具体实施例对本发明作进一步的说明。
实施例一：雷公藤红素衍生物的制备
1、6-氢雷公藤红素的制备
在100mL土豆液体培养基中接种5mL（108个/mL）短刺小克银汉霉（Cunninghamellablakesleana)AS3.970孢子液，在pH至6.0，温度30℃±1℃，振荡速度为200r/min条件下培养12h后；按0.2ug的接种量，加入各重量比为（10：3：2）的茉莉酸甲酯（MeJA，0.78mmol/mL）、戊酸倍他米松（5mg/L）以及为羧甲基-β-环糊精（BCD，1.79mmol/mL），继续培养12h后，再按5%的接种量加入雷公藤红素，然后继续培养5天，停止培养，然后将滤液于8000r/min,离心10min去除沉淀，滤液用等体积的乙酸乙酯萃取3遍，萃取液蒸干后用2mL丙酮溶解后，再用层析硅胶柱分离,首先用5倍柱体积的100%石油醚将样品中低极性油类物质洗脱干净，然后依次然后依次用体积比为：5:2，2:3，2:5，0:5的石油醚：二氯甲烷的洗脱液，体积比为10:0，8:1，6:1，4:1，2:1，1:1，1:2，1:4，1:6，1:8的二氯甲烷：乙酸乙酯洗脱液，以及100%乙酸乙酯洗脱液（每个比例为200ml）进行洗脱，使用旋转蒸发仪将洗脱液蒸干后，用适量甲醇溶解后，再用0.22μm的滤膜过滤后，经高效液相半制备法采用流动相：甲醇：0.1%磷酸水（27：73（0min）；5：95（20min）；17：83（25min）；27：73（28min），27：73（30min）梯度洗脱、收集保留时间为9.440min～9.446min洗脱液，减压干燥后，用甲醇重结晶，得到淡红色粉末，6-氢雷公藤红素，其转化率为84.09%。
高分辨质谱给出分子离子峰[M+1]+在m/z451.1。13C-NMR谱和1H-NMR如下：
13CNMR(300MHz，DMSO)δ181.04(s，C-29)，150.65(s，C-8)，142.36(s，C-3)，141.21(s，C-2)，134.02(s，C-10)，132.20(s，C-5)，126.87(s，C-4)，114.92(d，C-7)，113.84(d，C-1)，44.96(d，C-18)，42.24(d，C-14)，39.94(s，C-13)，39.54(t，C-20)，38.90(t，C-11)，36.54(d，C-9)，31.57(q，C-12)，31.46(q，C-16)，30.54(t，C-22)，30.45(q，C-17)，28.29(q，C-19)，28.10(q，C-21)，27.31(t，C-6)，26.73(t，C-15)，24.21(q，C-24)，22.86(q，C-27)，19.85(q，C-28)，18.59(q，C-26)，18.41(t，C-25)，15.61(q，C-23)。
1HNMR(600MHz，DMSO)δ12.31(1H，s，-COOH)，δ7.95(1H，s，3-OH)，7.16(1H，s，2-OH)，6.12(1H，d，J=3.5Hz，H-1)，5.68(1H，d，J=3.2Hz，H-7)，3.22(2H，t，m，H-6)，2.35(3H，s，23-CH3)，1.59(2H，J=3.5Hz，H-19)，1.54，1.29，1.26，1.16(4×3H，s，24-CH3，28-CH3，25-CH3，26-CH3)。
2、23-羧基雷公藤红素的制备
在100mL土豆液体培养基中接种5mL（108个/mL）短刺小克银汉霉（Cunninghamellablakesleana)AS3.970孢子液，在pH至6.0，温度30℃±1℃，振荡速度为200r/min条件下培养12h后；按0.2ug的接种量，加入各重量比为（10：3：2）的茉莉酸甲酯（MeJA，0.78mmol/mL）、戊酸倍他米松（5mg/L）以及为羧甲基-β-环糊精（BCD，1.79mmol/mL），继续培养12后，再按5%的接种量加入雷公藤红素，然后继续培养5天，停止培养，然后将滤液于8000r/min,离心10min去除沉淀，滤液用等体积的乙酸乙酯萃取3遍，萃取液蒸干后用2mL丙酮溶解后，再用层析硅胶柱分离,首先用5倍柱体积的100%石油醚将样品中低极性油类物质洗脱干净，然后依次然后依次用体积比为：5:2，2:3，2:5，0:5的石油醚：二氯甲烷的洗脱液，体积比为10:0，8:1，6:1，4:1，2:1，1:1，1:2，1:4，1:6，1:8的二氯甲烷：乙酸乙酯洗脱液，以及100%乙酸乙酯洗脱液（每个比例为200ml）洗脱，使用旋转蒸发仪将洗脱液蒸干后，用适量甲醇溶解后，再用0.22μm的滤膜过滤后，经高效液相半制备法采用流动相：甲醇：0.1%磷酸水（27：73（0min）；5：95（20min）；17：83（25min）；27：73（28min），27：73（30min）梯度洗脱，收集保留时间为6.120min～6.128min洗脱液，减压干燥后，用甲醇重结晶，得到淡红色粉末，23-羧基雷公藤红素，其转化率为54.67%。
高分辨质谱给出分子离子峰[M+1]+在m/z479.1。13C-NMR谱和1H-NMR如下：
13CNMR(300MHz，DMSO)δ187.12(s，C-2)，181.09(s，C-29)，173.36(s，C-23)，168.71(s，C-10)，153.92(s，C-3)，150.91(s，C-8)，143.59(s，C-5)，125.52(s，C-4)，124.74(d，C-1)，122.96(d，C-6)，119.24(d，C-7)，44.94(d，C-18)，43.14(s，C-14)，40.12(s，C-13)，39.54(s，C-20)，38.01(s，C-9)，34.56(t，C-11)，32.44(t，C-12)，31.54(t，C-16)，30.59(t，C-22)，30.10(s，C-17)，28.27(t，C-19)，28.13(t，C-21)，26.91(t，C-15)，22.86(q，C-27)，19.85(q，C-28)，18.59(q，C-26)，18.41(t，C-25)。
1HNMR(600MHz，DMSO)δ15.31(1H，s，3-OH)，δ12.95(1H，s，4-COOH)，11.16(1H，s，20-COOH)，6.46(1H，d，J=6.5Hz，H-6)，6.32(1H，s，H-1)，5.86(1H，d，J=6.5Hz，H-7)，1.59(2H，J=3.5Hz，H-19)，1.40(2H，m，H-15)，1.39(2H，m，H-18)，1.36(2H，m，H-16)，1.34，1.29，1.26，1.16(4×3H，s，24-CH3，28-CH3，25-CH3，26-CH3)。
3、23-羟基雷公藤红素的制备
在100mL土豆液体培养基中接种5mL（108个/mL）短刺小克银汉霉（Cunninghamellablakesleana)AS3.970孢子液，在pH至6.0，温度30℃±1℃，振荡速度为200r/min条件下培养12h后；按0.2ug的接种量，加入各重量比为（10：3：2）的茉莉酸甲酯（MeJA，0.78mmol/mL）、戊酸倍他米松（5mg/L）以及为羧甲基-β-环糊精（BCD，1.79mmol/mL），继续培养12后，再按5%的接种量加入雷公藤红素，然后继续培养5天，停止培养，然后将滤液于8000r/min,离心10min去除沉淀，滤液用等体积的乙酸乙酯萃取3遍，萃取液蒸干后用2mL丙酮溶解后，再用层析硅胶柱分离,首先用5倍柱体积的100%石油醚将样品中低极性油类物质洗脱干净，然后依次然后依次用体积比为：5:2，2:3，2:5，0:5的石油醚：二氯甲烷的洗脱液，体积比为10:0，8:1，6:1，4:1，2:1，1:1，1:2，1:4，1:6，1:8的二氯甲烷：乙酸乙酯洗脱液，以及100%乙酸乙酯洗脱液（每个比例为200ml）洗脱，使用旋转蒸发仪将洗脱液蒸干后，用适量甲醇溶解后，再用0.22μm的滤膜过滤后，经高效液相半制备法采用流动相：甲醇：0.1%磷酸水（27：73（0min）；5：95（20min）；17：83（25min）；27：73（28min），27：73（30min）梯度洗脱、收集保留时间为7.085min～7.088min洗脱液，减压干燥后，用甲醇重结晶，得到淡红色粉末，23-羟基雷公藤红素。（转化率49.23%）。
高分辨质谱给出分子离子峰[M+1]+在m/z465.2。13C-NMR谱和1H-NMR如下：
13CNMR(300MHz，DMSO)δ186.43(s，C-2)，180.34(s，C-29)，167.61(s，C-10)，153.43(s，C-3)，150.23(s，C-8)，144.11(s，C-5)，125.52(s，C-4)，123.65(d，C-1)，122.96(d，C-6)，118.84(d，C-7)，58.36(t，C-23)，44.56(d，C-18)，43.65(s，C-14)，40.12(s，C-13)，39.54(s，C-20)，38.01(s，C-9)，34.56(t，C-11)，32.44(t，C-12)，31.54(t，C-16)，30.78(t，C-22)，30.10(s，C-17)，28.27(t，C-19)，27.13(t，C-21)，25.89(t，C-15)，22.45(q，C-27)，19.87(q，C-28)，18.57(q，C-26)，19.32(t，C-25)。
1HNMR(600MHz，DMSO)δ14.45(1H，s，3-OH)，δ11.36(1H，s，4-COOH)，6.46(1H，d，J=6.5Hz，H-6)，6.32(1H，s，H-1)，5.86(1H，d，J=6.5Hz，H-7)，4.20(2H，m，H-23)，1.59(2H，J=3.5Hz，H-19)，1.43(2H，m，H-15)，1.36(2H，m，H-18)，1.32(2H，m，H-16)，1.34，1.29，1.26，1.16(4×3H，s，24-CH3，28-CH3，25-CH3，26-CH3)。
4、6-羟基雷公藤红素的制备
在100mL土豆液体培养基中接种5mL（108个/mL）短刺小克银汉霉（Cunninghamellablakesleana)AS3.970孢子液，在pH至6.0，温度30℃±1℃，振荡速度为200r/min条件下培养12h后；按0.2ug的接种量，加入各重量比为（10：3：2）的茉莉酸甲酯（MeJA，0.78mmol/mL）、戊酸倍他米松（5mg/L）以及为羧甲基-β-环糊精（BCD，1.79mmol/mL），继续培养12后，再按5%的接种量加入雷公藤红素，然后继续培养5天，停止培养，然后将滤液于8000r/min,离心10min去除沉淀，滤液用等体积的乙酸乙酯萃取3遍，萃取液蒸干后用2mL丙酮溶解后，再用层析硅胶柱分离,首先用5倍柱体积的100%石油醚将样品中低极性油类物质洗脱干净，然后依次然后依次用体积比为：5:2，2:3，2:5，0:5的石油醚：二氯甲烷的洗脱液；体积比为10:0，8:1，6:1，4:1，2:1，1:1，1:2，1:4，1:6，1:8的二氯甲烷：乙酸乙酯洗脱液，以及100%乙酸乙酯洗脱液（每个比例为200ml）洗脱，使用旋转蒸发仪将洗脱液蒸干后，用适量甲醇溶解后，再用0.22μm的滤膜过滤后，经高效液相半制备法采用流动相：甲醇：0.1%磷酸水（27：73（0min），5：95（20min），17：83（25min），27：73（28min），27：73（30min）梯度洗脱，收集保留时间为12.315min～12.329min洗脱液，减压干燥后，用甲醇重结晶，得到淡红色粉末，6-羟基雷公藤红素，其转化率为71.07%。
高分辨质谱给出分子离子峰[M+1]+在m/z465.2。13C-NMR谱和1H-NMR如下：
13CNMR(300MHz，DMSO)δ187.05(s，C-2)，181.16(s，C-29)，168.73(s，C-10)，153.90(s，C-3)，150.95(s，C-8)，150.61(s，C-6)，125.52(s，C-4)，124.65(d，C-1)，119.14(d，C-7)，108.21(s，C-5)，44.96(d，C-18)，43.65(s，C-14)，40.12(s，C-13)，39.54(s，C-20)，38.01(s，C-9)，34.56(t，C-11)，32.44(t，C-12)，31.54(t，C-16)，30.78(t，C-22)，30.10(s，C-17)，28.27(t，C-19)，27.13(t，C-21)，25.89(t，C-15)，22.45(q，C-27)，19.87(q，C-28)，18.57(q，C-26)，19.32(t，C-25)，11.06(q，C-23)。
1HNMR(600MHz，DMSO)δ15.15(1H，s，3-OH)，δ15.01(1H，s，6-OH)，δ11.03(1H，s，4-COOH)，6.32(1H，s，H-1)，5.86(1H，d，J=6.5Hz，H-7)，1.73(3H，s，23-CH3)，1.59(2H，J=3.5Hz，H-19)，1.43(2H，m，H-15)，1.36(2H，m，H-18)，1.32(2H，m，H-16)，1.34，1.29，1.26，1.16(4×3H，s，24-CH3，28-CH3，25-CH3，26-CH3)。
5、7-羟基雷公藤红素的制备
在100mL土豆液体培养基中接种5mL（108个/mL）短刺小克银汉霉（Cunninghamellablakesleana)AS3.970孢子液，在pH至6.0，温度30℃±1℃，振荡速度为200r/min条件下培养12h后；按0.2ug的接种量，加入各重量比为（10：3：2）的茉莉酸甲酯（MeJA，0.78mmol/mL）、戊酸倍他米松（5mg/L）以及为羧甲基-β-环糊精（BCD，1.79mmol/mL），继续培养12后，再按5%的接种量加入雷公藤红素，然后继续培养5天，停止培养，然后将滤液于8000r/min,离心10min去除沉淀，滤液用等体积的乙酸乙酯萃取3遍，萃取液蒸干后用2mL丙酮溶解后，再用层析硅胶柱分离,首先用5倍柱体积的100%石油醚将样品中低极性油类物质洗脱干净，然后依次然后依次用体积比为：5:2，2:3，2:5，0:5的石油醚：二氯甲烷的洗脱液，体积比为10:0，8:1，6:1，4:1，2:1，1:1，1:2，1:4，1:6，1:8的二氯甲烷：乙酸乙酯洗脱液，以及100%乙酸乙酯洗脱液（每个比例为200ml）洗脱，使用旋转蒸发仪将洗脱液蒸干后，用适量甲醇溶解后，再用0.22μm的滤膜过滤后，经高效液相半制备法采用流动相：甲醇：0.1%磷酸水（27：73（0min），5：95（20min），17：83（25min），27：73（28min），27：73（30min）梯度洗脱、收集保留时间为11.139min～11.145min洗脱液，减压干燥后，用甲醇重结晶，得到淡红色粉末，7-羟基雷公藤红素，其转化率为38.65%。
高分辨质谱给出分子离子峰[M+1]+在m/z465.2。13C-NMR谱和1H-NMR如下：
13CNMR(300MHz，DMSO)δ188.12(s，C-2)，181.16(s，C-29)，168.73(s，C-10)，153.90(s，C-3)，146.80(s，C-7)，143.51(s，C-5)，125.52(s，C-4)，124.65(d，C-1)，122.91(d，C-6)，115.65(s，C-8)，44.96(d，C-18)，43.65(s，C-14)，40.12(s，C-13)，39.54(s，C-20)，38.01(s，C-9)，34.56(t，C-11)，32.44(t，C-12)，31.54(t，C-16)，30.78(t，C-22)，30.10(s，C-17)，28.27(t，C-19)，27.13(t，C-21)，25.89(t，C-15)，22.45(q，C-27)，19.87(q，C-28)，18.57(q，C-26)，19.32(t，C-25)，11.76(q，C-23)。
1HNMR(600MHz，DMSO)δ15.15(1H，s，3-OH)，δ15.01(1H，s，7-OH)，δ11.03(1H，s，4-COOH)，6.46(1H，d，J=6.5Hz，H-6)，6.32(1H，s，H-1)，1.71(3H，s，23-CH3)，1.59(2H，J=3.5Hz，H-19)，1.43(2H，m，H-15)，1.36(2H，m，H-18)，1.32(2H，m，H-16)，1.34，1.29，1.26，1.16(4×3H，s，24-CH3，28-CH3，25-CH3，26-CH3)。
6、6，7-二羟基雷公藤红素的制备
在100mL土豆液体培养基中接种5mL（108个/mL）短刺小克银汉霉（Cunninghamellablakesleana)AS3.970孢子液，在pH至6.0，温度30℃±1℃，振荡速度为200r/min条件下培养12h后；按0.2ug的接种量，加入各重量比为（10：3：2）的茉莉酸甲酯（MeJA，0.78mmol/mL）、戊酸倍他米松（5mg/L）以及为羧甲基-β-环糊精（BCD，1.79mmol/mL），继续培养12后，再按5%的接种量加入雷公藤红素，然后继续培养5天，停止培养，然后将滤液于8000r/min,离心10min去除沉淀，滤液用等体积的乙酸乙酯萃取3遍，萃取液蒸干后用2mL丙酮溶解后，再用层析硅胶柱分离,首先用5倍柱体积的100%石油醚将样品中低极性油类物质洗脱干净，然后依次然后依次用体积比为：5:2，2:3，2:5，0:5的石油醚：二氯甲烷的洗脱液，体积比为10:0，8:1，6:1，4:1，2:1，1:1，1:2，1:4，1:6，1:8的二氯甲烷：乙酸乙酯洗脱液，以及100%乙酸乙酯洗脱液（每个比例为200ml）洗脱，使用旋转蒸发仪将洗脱液蒸干后，用适量甲醇溶解后，再用0.22μm的滤膜过滤后，经高效液相半制备法采用流动相：甲醇：0.1%磷酸水（27：73（0min），5：95（20min），17：83（25min），27：73（28min），27：73（30min）梯度洗脱、收集保留时间为5.870min～5.878min洗脱液，减压干燥后，用甲醇重结晶，得到淡红色粉末，6，7-二羟基雷公藤红素，其转化率为42.01%。
高分辨质谱给出分子离子峰[M+1]+在m/z481.2。13C-NMR谱和1H-NMR如下：
13CNMR(300MHz，DMSO)δ187.02(s，C-2)，181.09(s，C-29)，169.73(s，C-10)，153.90(s，C-3)，150.61(d，C-6)，146.80(s，C-7)，125.52(s，C-4)，124.75(d，C-1)，115.65(s，C-8)，108.61(s，C-5)，44.96(d，C-18)，43.65(s，C-14)，40.12(s，C-13)，39.54(s，C-20)，38.01(s，C-9)，34.56(t，C-11)，32.44(t，C-12)，31.54(t，C-16)，30.78(t，C-22)，30.10(s，C-17)，28.27(t，C-19)，27.13(t，C-21)，25.89(t，C-15)，22.45(q，C-27)，19.87(q，C-28)，18.57(q，C-26)，19.32(t，C-25)，11.76(q，C-23)。
1HNMR(600MHz，DMSO)δ15.15(1H，s，3-OH)，δ15.01(1H，s，7-OH)，δ14.87(1H，s，6-OH)，δ11.03(1H，s，4-COOH)，6.32(1H，s，H-1)，1.71(3H，s，23-CH3)，1.59(2H，J=3.5Hz，H-19)，1.43(2H，m，H-15)，1.36(2H，m，H-18)，1.32(2H，m，H-16)，1.34，1.29，1.26，1.16(4×3H，s，24-CH3，28-CH3，25-CH3，26-CH3)。
7、6-氢-6，7-二羟基雷公藤红素的制备
在100mL土豆液体培养基中接种5mL（108个/mL）短刺小克银汉霉（Cunninghamellablakesleana)AS3.970孢子液，在pH至6.0，温度30℃±1℃，振荡速度为200r/min条件下培养12h后；按0.2ug的接种量，加入各重量比为（10：3：2）的茉莉酸甲酯（MeJA，0.78mmol/mL）、戊酸倍他米松（5mg/L）以及为羧甲基-β-环糊精（BCD，1.79mmol/mL），继续培养12后，再按5%的接种量加入雷公藤红素，然后继续培养5天，停止培养，然后将滤液于8000r/min,离心10min去除沉淀，滤液用等体积的乙酸乙酯萃取3遍，萃取液蒸干后用2mL丙酮溶解后，再用层析硅胶柱分离,首先用5倍柱体积的100%石油醚将样品中低极性油类物质洗脱干净，然后依次然后依次用体积比为：5:2，2:3，2:5，0:5的石油醚：二氯甲烷的洗脱液，体积比为10:0，8:1，6:1，4:1，2:1，1:1，1:2，1:4，1:6，1:8的二氯甲烷：乙酸乙酯洗脱液，以及100%乙酸乙酯洗脱液（每个比例为200ml）洗脱，使用旋转蒸发仪将洗脱液蒸干后，用适量甲醇溶解后，再用0.22μm的滤膜过滤后，经高效液相半制备法采用流动相：甲醇：0.1%磷酸水（27：73（0min）；5：95（20min）；17：83（25min）；27：73（28min），27：73（30min）梯度洗脱、收集保留时间为4.123min～4.128min洗脱液，减压干燥后，用甲醇重结晶，得到淡红色粉末，6-氢-6，7-二羟基雷公藤红素，其转化率为51.09%。
高分辨质谱给出分子离子峰[M+1]+在m/z483.3。13C-NMR谱和1H-NMR如下：
13CNMR(300MHz，DMSO)181.09(s，C-29)，147.43(s，C-6)，δ143.12(s，C-2)，142.64(s，C-3)，135.41(s，C-5)，132.17(s，C-10)，124.92(s，C-4)，115.65(s，C-8)，114.17(d，C-1)，71.96(s，C-7)，44.96(d，C-18)，43.65(s，C-14)，40.12(s，C-13)，39.54(s，C-20)，38.01(s，C-9)，34.56(t，C-11)，32.44(t，C-12)，31.54(t，C-16)，30.58(t，C-22)，30.10(s，C-17)，28.27(t，C-19)，28.13(t，C-21)，25.89(t，C-15)，22.45(q，C-27)，19.87(q，C-28)，18.57(q，C-26)，19.32(t，C-25)，5.57(q，C-23)。
1HNMR(600MHz，DMSO)δ15.15(1H，s，7-OH)，δ11.03(1H，s，4-COOH)，6.12(1H，s，H-1)，δ5.21(1H，s，3-OH)，4.32(1H，s，2-OH)，2.35(3H，s，23-CH3)，δ2.07(1H，s，6-OH)，1.59(2H，J=3.5Hz，H-19)，1.43(2H，m，H-15)，1.36(2H，m，H-18)，1.32(2H，m，H-16)，1.34，1.29，1.26，1.16(4×3H，s，24-CH3，28-CH3，25-CH3，26-CH3)。
8、6，7，8-三氢-6，7-二羟基雷公藤红素的制备
在100mL土豆液体培养基中接种5mL（108个/mL）短刺小克银汉霉（Cunninghamellablakesleana)AS3.970孢子液，在pH至6.0，温度30℃±1℃，振荡速度为200r/min条件下培养12h后；按0.2ug的接种量，加入各重量比为（10：3：2）的茉莉酸甲酯（MeJA，0.78mmol/mL）、戊酸倍他米松（5mg/L）以及为羧甲基-β-环糊精（BCD，1.79mmol/mL），继续培养12后，再按5%的接种量加入雷公藤红素，然后继续培养5天，停止培养，然后将滤液于8000r/min,离心10min去除沉淀，滤液用等体积的乙酸乙酯萃取3遍，萃取液蒸干后用2mL丙酮溶解后，再用层析硅胶柱分离,首先用5倍柱体积的100%石油醚将样品中低极性油类物质洗脱干净，然后依次然后依次用体积比为：5:2，2:3，2:5，0:5的石油醚：二氯甲烷的洗脱液；体积比为10:0，8:1，6:1，4:1，2:1，1:1，1:2，1:4，1:6，1:8的二氯甲烷：乙酸乙酯洗脱液，以及100%乙酸乙酯洗脱液（每个比例为200ml）洗脱，使用旋转蒸发仪将洗脱液蒸干后，用适量甲醇溶解后，再用0.22μm的滤膜过滤后，经高效液相半制备法采用流动相：甲醇：0.1%磷酸水（27：73（0min）；5：95（20min）；17：83（25min）；27：73（28min），27：73（30min）梯度洗脱、收集保留时间为3.760min～3.768min洗脱液，减压干燥后，用甲醇重结晶，得到淡红色粉末，6，7，8-三氢-6，7-二羟基雷公藤红素，其转化率为71.89%。
高分辨质谱给出分子离子峰[M+1]+在m/z485.3。13C-NMR谱和1H-NMR如下：
13CNMR(300MHz，DMSO)181.09(s，C-29)，142.64(s，C-3)，δ141.12(s，C-2)，138.57(s，C-10)，132.31(s，C-5)，125.82(s，C-4)，112.17(d，C-1)，75.16(s，C-7)，68.93(s，C-6)，51.65(s，C-8)，44.96(d，C-18)，40.22(s，C-13)，39.54(s，C-20)，34.16(t，C-11)，33.35(s，C-14)，31.54(t，C-16)，30.58(t，C-22)，30.10(s，C-17)，28.27(t，C-19)，28.13(t，C-21)，27.08(t，C-15)，26.34(t，C-12)，24.51(s，C-9)，22.85(q，C-27)，19.87(q，C-28)，18.72(t，C-25)，18.47(q，C-26)，5.47(q，C-23)。
1HNMR(600MHz，DMSO)δ11.03(1H，s，4-COOH)，6.12(1H，s，H-1)，δ5.21(1H，s，3-OH)，4.32(1H，s，2-OH)，2.35(3H，s，23-CH3)，δ2.15(1H，s，7-OH)，δ2.07(1H，s，6-OH)，1.59(2H，J=3.5Hz，H-19)，1.43(2H，m，H-15)，1.36(2H，m，H-18)，1.32(2H，m，H-16)，1.31，1.29，1.26，1.16(4×3H，s，24-CH3，28-CH3，25-CH3，26-CH3)。
9、其他雷公藤红素衍生物
根据本发明的实施例一的6-氢雷公藤红素的制备方法，也可分别收集保留时间为14.2～15.9、17.1～18.6min、24.5～26.8min、28.2～28.8min、29.5～30.15min和32.2～32.8min洗脱液，再经减压干燥后，用甲醇重结晶，分别得到2,3羟基-6-磺酸钠-雷公藤红素、2,3羟基-6-磺酸钠-雷公藤红素甲酯、雷公藤红素28-N-甲基哌嗪酰胺、雷公藤红素苯甲酸酯、雷公藤红素异丙酯和28-苄基酰胺雷公藤红素等红色结晶产物。
本发明实施例所述的雷公藤红素衍生物，既可以单独使用，也可以和其他抗肿瘤药物联合治疗，其药学上可接受的盐或水合物的含量占所制成的药物为0.001～99.9%(重量百分比)，因此本发明的药物组合物可以进一步包括一种或多种其他的抗肿瘤药物，例如，影响肿瘤细胞核酸生物合成的药物可以为5-氟尿嘧啶（5-fluorouracil)、阿糖胞苷（Cytarabine）、雄黄等，所述直接破坏肿瘤细胞DNA阻止其复制的药物可以为顺铂(Cisplatin)、喜树碱（camptot-hecin）、依托泊苷（Etoposide）等，所述嵌入肿瘤细胞DNA中干扰转录过程的药物可以为阿红霉素（ADM），所述干扰有丝分裂影响肿瘤细胞蛋白质合成的药物可以为长春碱（VLB）、长春新碱（VCR）、紫杉醇（Taxol），内分泌药物包括糖皮质激素、肾上腺皮质激素、激素等，细胞因子包括肿瘤坏死因子（tumornecrosisfactor，TNF）、白细胞介素（interleukin，IL-6）、干扰素（interferon，IFN）、转化生长因子-β(Transforminggrowthfactorbeta,TGF-β)、脂多糖（lipopolysaccharide）、即佛波酯(12-Ｏ-tetra-decanoy1-phorbol-13-acetate,TPA)、腺苷酸环化酶激活剂（Forskolin）等；
本发明的雷公藤红素衍生物可以口服、静脉注射、肌肉注射、呼吸道、皮肤或者粘膜给药，包括溶液剂、乳剂、胶囊剂、片剂、注射剂、喷雾剂、气雾剂、外用洗剂、擦剂、贴剂、滴眼剂、滴鼻剂、眼用软膏、含漱剂、舌下片剂、软膏剂、栓剂等。
本发明制备了高效、高产率的雷公藤红素衍生物，使其能够实际地用于肿瘤、病毒性疾病和神经损伤性疾病的治疗，其在治疗肿瘤、艾滋病乙肝方面和神经损伤性疾病方面具有良好的应用前景。
实施例二、药效学评价实验例
以下实验例中，受试样品由本发明制备方法实施例提供，以前体化合物雷公藤红素作为阳性对照。
1、本发明的8个化合物对体外培养的人肺癌细胞A549细胞的生长抑制作用
方法：人A549肺癌细胞用含10%胎牛血清的DMEM培养基（Gibco，美国）培养，培养条件为37℃，5%CO2，肿瘤细胞0.7x104/孔接种于96孔板中，24小时后，加入用二甲基亚砜配置的（200uM)、PBS溶液稀释的化合物，使培养基终浓度为10-4、10-5、10-6、10-7、10-8M，作用72h后，弃去培养液，用10%冷三氯醋酸固定细胞，用黄酰罗丹明B（sulforhodamineB，SRB）溶液染色，洗去未结合SRB后，Tris溶解与蛋白结合的SRB，用酶标仪在560nm处测定吸光值（OD）。采用下列公式计算细胞的生长率：抑制率=（OD值对照孔-OD值给药孔）/OD值对照孔X100%，结果判定标准：无效10-5M<50%，有效10-5M>50%。根据各浓度的抑制率，采用logit法计算半数抑制浓度IC50。
结果：在本发明的8个化合物中HQC-1、HQC-2、HQC-3、HQC-4、HQC-5、HQC-6、HQC-7和HQC-8剂量依赖性地抑制体外培养的人肺癌细胞A549，细胞生长，显示其具有有效的体外抗肿瘤作用，其中HQC-2、HQC-3，IC50值小于阳性对照雷公藤红素，显示了比雷公藤红素强的抑制肿瘤效应。具体结果见表1。
表18种化合物对人肺癌A549细胞的生长抑制作用
2、本发明的8个化合物，对体外感染艾滋病HIV-1IIIB病毒的TZM-bl细胞的生长抑制作用
取对数生长期的TZM-BL细胞，按2×104/mL孔密度接种于96孔细胞培养板中，100μL/孔，置于细胞培养箱(37℃，5%CO2)中培养。隔日待细胞贴壁且生长良好，吸去培养液，将用无血清培养基稀释的雷公藤红素或者其他化合物，分别加入96孔培养板，设置三个平行孔，37℃，5%CO2培养3h后，加入1000×TCID50的HIV-1IIIB病毒100μL感染细胞，然后继续培养24h后，利用Bright-GloLuciferaseAssay试剂(Promega)测定每孔的相对荧光单位(RLU)，根据PrismGraphruan软件计算化合物的半数抑制浓度IC50，结果判定标准：有效IC50<10uM，无效IC50>10uM。IC50结果见表2所示：
结果：在本发明的8个化合物中HQC-1、HQC-2、HQC-3、HQC-5、HQC-7、HQC-8和CSL能够抑制体外感染艾滋病HIV-1IIIB病毒的TZM-bl细胞的生长，显示其具有有效的体外抗艾滋病病毒作用，具体结果表2。其HQU-2和HQC-3的IC50值与CSL接近，显示了与雷公藤红素相同的抑制艾滋病病毒效应。
表28种化合物对体外感染艾滋病HIV-1IIIB病毒的TZM-bl细胞的生长抑制作用
| 样品编号 | IC50（uM） | 评价 |
| HQC-1 | 4.5 | 有效 |
| HQC-2 | 1.5 | 有效 |
| HQC-3 | 1.5 | 有效 |
| HQC-4 | >10 | 无效 |
| HQC-5 | 2.5 | 有效 |
| HQC-6 | >10 | 无效 |
| HQC-7 | 5.5 | 有效 |
| HQC-8 | 6.5 | 有效 |
| CSL | 1.5 | 有效 |
3、本发明8个化合物，对HepG2.2.15细胞的体外HBV抗原抑制的作用
取对数生长期的HepG2.2.15细胞，按2×104/mL孔密度接种于24孔细胞培养板中，1000μL/孔，每个浓度共设3个复孔，置细胞培养箱(37℃，5%CO2)中培养。隔日待细胞贴壁且生长良好，吸去培养液，然后分别加入按表3中药物配制的各浓度的完全培养液1000μL，每个浓度设3个复孔，置细胞培养箱(37℃，5%CO2)中培养。等量的完全培养液作空白对照，用同浓度的雷公藤红素培养液作阳性对照，在连续培养72h后，吸取细胞培养液分别加于1.5mL无菌Eppnedorf管中，于-20℃保存待检。将-20℃保存的细胞培养液用同时同批乙型肝炎病毒表面抗原、E抗原酶联免疫试剂盒检测HBsAg和HBeAg的效价。采用下列公式计算抗原的的抑制百分率=[l-实验孔抗原OD值/对照孔抗原OD值]×100%。结果判定标准：有效，化合物浓度为10uM时，其抑制HBsAg、HBeAg的抑制率>50%，无效化合物浓度为10uM时，其抑制HBsAg、HBeAg的抑制率<50%。其结果见表3所示：
表38种化合物对HepG2.2.15细胞系HBsAg、HBeAg表达的抑制作用n=3）
结果：在本发明的8个化合物中HQC-1、HQC-2、HQC-3、HQC-5、HQC-6、HQC-7、HQC-8和CSL均能具有剂量依赖性地抑制HepG2.2.15细胞的HBV抗原（HBsAg、HBeAg）的作用，显示其具有有效的体外抗乙肝病毒作用，具体结果表3。其HQC-3、HQC-6和HQC-7的抑制作用与CSL接近，显示了与雷公藤红素相同的抑制乙肝病毒效应。
4、本发明的8个化合物，对t-BHP诱导的细胞损伤的抑制作用
大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤细胞PC12用含3%胎牛血清和15%马血清的Ham'sF12K培养基（Gibco，美国）培养，培养条件为37℃，5%CO2细胞培养箱中培养24h后，细胞按照0.7x104/孔接种于96孔板中，加入用二甲基亚砜配置的（200uM)、PBS溶液稀释的化合物，使培养基终浓度为10-4、10-5、10-6、10-7、10-8M，作用1h后，然后置换100ul/孔含叔丁基过氧化氢（t-BHP）的培养基（t-BHP的终浓度为200uM），再置于37℃，5%CO2细胞培养箱中继续培养24h后，加入5mg/L的MTT（20ul/孔），混匀后，在继续孵育4小时后，加入DMSO（150ul/孔），溶解紫蓝色的结晶，用酶标仪在570/490nm处测定吸光值（OD）。采用下列公式计算细胞的抑制率：抑制率=（OD值对照孔-OD值给药孔）/OD值对照孔X100%，结果判定标准：根据各浓度的抑制率，采用logit法计算半数抑制浓度IC50。结果判定标准：无效IC50<10uM，有效IC50>10um。IC50结果见表4所示：
在本发明的8个化合物中HQC-1、HQC-2、HQC-3、HQC-5、HQC-7、HQC-8和CSL能够抑制t-BHP对PC12诱导的细胞损伤作用，显示其具有有效保护神经细胞损伤的作用，显示了与雷公藤红素相同的保护神经细胞损伤的效应具体结果表4。
表48种化合物对对t-BHP诱导的细胞损伤的抑制作用
| 样品编号 | IC50（uM） | 评价 |
| HQC-1 | >10 | 有效 |
| HQC-2 | >10 | 有效 |
| HQC-3 | >10 | 有效 |
| HQC-4 | 1.5 | 无效 |
| HQC-5 | >10 | 有效 |
| HQC-6 | 3.8 | 无效 |
| HQC-7 | >10 | 有效 |
| HQC-8 | >10 | 有效 |
| CSL | >10 | 有效 |
其中，表1-4中，HQC-1为6，7，8-三氢-6，7-二羟基雷公藤红素;HQC-2为6-氢-6，7-二羟基雷公藤红素;HQC-3为6，7-二羟基雷公藤红素;HQC-4为23-羧基雷公藤红素;HQC-5为3-羟基雷公藤红素;;HQC-6为6-氢雷公藤红素;HQC-7为7-羟基雷公藤红素;HQC-8为6-羟基雷公藤红素；CSL为雷公藤红素。
本发明以雷公藤红素为前体药物，提供了新型雷公藤红素以及相关衍生物的新的制备方法。
本发明的雷公藤红素衍生物，除少数的化合物在体外抑制肿瘤、艾滋病病毒、乙肝炎病毒、神经细胞损伤无效外，其他化合物均能显著抑制多种体外培养的肿瘤、爱滋病、乙肝病毒细胞和神经细胞损伤的生长，抑制作用具有明显的剂量依赖性，表明上述化合物多种肿瘤、爱滋病、乙肝和神经细胞损伤最有效。
本发明首次利用茉莉酸甲酯（MeJA）、地塞米松、β-环糊精等生物或者非生物诱导子联合作用，同时得到了短刺小克银汉霉（Cunninghamellablakesleeana）对雷公藤红素的转化的多种与体内代谢相同的雷公藤红素衍生物，并将6-氢雷公藤红素、23-羧基雷公藤红素、23-羟基雷公藤红素、6-羟基雷公藤红素、7-羟基雷公藤红素、6，7-二羟基雷公藤红素、6-氢-6，7-二羟基雷公藤红素、6，7，8-三氢-6，7-二羟基雷公藤红素产率提高了1.15至7.51倍。与以往的制备技术相比，本发明技术，具有绿色、环保、选择性强，产率高等特点，为大规模利用生物技术制备雷公藤红素衍生物提供了广阔的应用前景。
本发明的雷公藤红素衍生物可用于制备预防和/或治疗肿瘤、爱滋病、乙肝和神经细胞损伤等疾病，具有良好的用于治疗肺癌、肝癌、前列腺癌、人卵巢癌、人乳腺癌、粒细胞白血病、结肠癌、阿霉素敏感的乳腺癌、阿霉素抗药的乳腺癌、阿霉素抗药的白血病、神经细胞损伤等疾病（包括阿尔兹海默病（早老性痴呆，AD）、帕金森病（PD）、亨延顿氏退行性疾病（HD）和脊髓损伤和肌萎缩性侧索硬化（ALS）等疾病）的应用前景。
虽然以上描述了本发明的具体实施方式，但是熟悉本技术领域的技术人员应当理解，我们所描述的具体的实施例只是说明性的，而不是用于对本发明的范围的限定，熟悉本领域的技术人员在依照本发明的精神所作的等效的修饰以及变化，都应当涵盖在本发明的权利要求所保护的范围内。
Claims (4)
1.一种雷公藤红素衍生物的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：
步骤一：取保存于4℃、土豆斜面培养基培养的、转化菌种一支，置于25℃恒温培养箱中培养7天后，以适量无菌水将斜面上的孢子充分吹打下来，使单孢子悬液的浓度调整至107～108个/mL，即得种子孢子液；所述转化菌种为短刺小克银汉霉(Cunninghamellablakesleana)AS3.970；
步骤二：以100mL，5mL的接种量，在土豆液体培养基上接种步骤一所得孢子液，在pH值6.0，温度30℃±1℃，振荡速度为200r/min条件下培养12h后；按0.1～4μg的接种量，加入重量比为10:3:2的茉莉酸甲酯0.78mmol/mL、戊酸倍他米松5mg/L以及羧甲基-β-环糊精1.79mmol/mL的联合诱导子，继续培养12h后，再按1～10μg的接种量加入雷公藤红素，然后继续培养5天，每天检测各种雷公藤红素衍生物的含量和转化率，当产物转化率低至0.5～3％时，停止培养，过滤后收集菌丝体，然后将滤液于8000r/min,离心10min去除沉淀即得到发酵提取液；
步骤三：将步骤二所得提取液过滤，滤液用等体积的乙酸乙酯萃取3遍，合并萃取液；而菌丝体则用重量比为1：3～1：10的乙酸乙酯超声提取30min，然后滤去菌丝体，所得滤液与萃取液合并，即得分离提取液，提取液浓缩至干，得到提取后残渣；
步骤四：将经过步骤三处理所得的残渣，用1mg：1～10mL的比例用丙酮溶解后，采用硅胶拌样后挥发干，称取20倍于样品量的硅胶，使用湿法进行填柱和上样；首先用5倍柱体积的100％石油醚将样品中低极性油类物质洗脱干净，然后依次用体积比为：5:2，2:3，2:5，0:5的石油醚：二氯甲烷的洗脱液，体积比为10:0，8:1，6:1，4:1，2:1，1:1，1:2，1:4，1:6，1:8的二氯甲烷：乙酸乙酯洗脱液，以及100％乙酸乙酯洗脱液，依次对柱子进行洗脱，TLC控制收集主馏分，最后使用旋转蒸发仪将各个馏分的流动相蒸干后，用适量色谱纯的甲醇溶解后，用0.22μm的有机膜过滤后，得到分离液；
步骤五：将经过步骤四处理所得的分离液，采用高效液相半制备法分离纯化，HPLC梯度洗脱法控制收集不同的雷公藤红素衍生物洗脱液，减压蒸去溶剂后，用甲醇结晶后所得到的化合物，即为所述的雷公藤红素衍生物。
2.如权利要求1所述的一种雷公藤红素衍生物的制备方法，其特征在于：所述土豆培养基为：土豆200g/L，葡萄糖20g/L；配制时将土豆去皮后将其切成小块，加水加热煮沸30min，过滤，取滤液定容至1L，加入葡萄糖20g，搅拌溶解后，121℃灭菌30min，即得；
斜面培养基为：取上述土豆培养基1L，加入琼脂粉20g，加热溶解后分装于玻璃试管中，于121℃下灭菌30min后取出，倾斜45度，静置、冷却即得。
3.如权利要求1所述的一种雷公藤红素衍生物的制备方法，其特征在于：TLC控制收集主馏分，用体积比为70：12的氯仿和甲醇为展开剂；
所述产物转化率的高效液相色谱检测方法为：色谱柱AgilentZORBAXEclipseXDB-C18柱，其中分析柱内径乘以长度为4.6mm×250mm，粒径为5μm；雷公藤红素检测波长：427nm，室温；进样量：10μL；
所述梯度洗脱法控制不同的雷公藤红素衍生物的高效液相色谱检测方法为：色谱柱AgilentZORBAXEclipseXDB-C18柱，其中分析柱内径乘以长度为4.6mm×250mm，粒径为5μm；吸收波长：427nm；
流动相：甲醇：0.1％磷酸水的体积比和洗脱时间分别如下：27：73、洗脱时间0min；5：95、洗脱时间20min；17：83、洗脱时间25min；27：73、洗脱时间28min，27：73、洗脱时间30min；
上述对应的流速为：0.5ml/min；0.5ml/min；1ml/min；1ml/min；0.5ml/min；柱温：25℃、进样量：20μl。
4.如权利要求1～3任一项所述的一种雷公藤红素衍生物的制备方法，其特征在于：
所述方法可用于制备的雷公藤红素衍生物如下：6-氢雷公藤红素、23-羧基雷公藤红素、23-羟基雷公藤红素、6-羟基雷公藤红素、7-羟基雷公藤红素、6，7-二羟基雷公藤红素、6-氢-6，7-二羟基雷公藤红素、6，7，8-三氢-6，7-二羟基雷公藤红素、2,3羟基-6-磺酸钠-雷公藤红素、2,3羟基-6-磺酸钠-雷公藤红素甲酯、雷公藤红素28-N-甲基哌嗪酰胺、雷公藤红素苯甲酸酯、雷公藤红素异丙酯和28-苄基酰胺雷公藤红素。
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